DE69317433T2

DE69317433T2 - Ungesättigte aliphatische dicarbonsäuren

Info

Publication number: DE69317433T2
Application number: DE69317433T
Authority: DE
Inventors: John Casey; Nigel Lindner
Original assignee: Uniqema BV
Current assignee: Corda International Plc Goole East Yorkshire Gb
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 1998-08-20
Anticipated expiration: 2013-09-28
Also published as: SK40595A3; CA2144312A1; EP0662946A1; WO1994007837A1; HUT70587A; HU9500913D0; US5753704A; JP3533218B2; JPH08502054A; PL308222A1; ATE163913T1; DE69317433D1; EP0662946B2; DE69317433T3; GB9220667D0; BR9307142A; CZ288838B6; SK281584B6; HU226010B1; CA2144312C

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ungesättigte Dicarbonsäuren, d.h. ungesattigte aliphatische Dicarbonsäuren, insbesondere C&sub8;- C&sub2;&sub2;-Verbindungen, speziell, aber nicht ausschließlich, ungesättigte C&sub1;&sub6;- und C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäuren (nämliche solche mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen), ein Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren und deren Verwendung zur Behandlung der Haut zu medizinischen und kosmetischen Zwecken, wie Aknebehandlung und Hautklärung.

Hintergrund der Erfindung

Es ist bekannt, ungesättigte Dicarbonsäuren (der allgemeinen Formel COOH(CH&sub2;)nCOOH) zur Behandlung der Haut zu medizinischen und kosmetischen Zwecken zu verwenden. Zum Beispiel offenbart die US 4386104 (Nazzaro-Porro) gesättigte Dicarbonsäuren, die 7 bis 13 Kohlenstoffe enthalten, zur Behandlung von Akne und anderen Hautleiden.
Insbesondere wird die ungesättigte C&sub9;-Dicarbonsäure ("Azelainsäure") mit der Strukturformel COOH(CH&sub2;)&sub7;COOH häufig als wirksam bei der Behandlung von Akne und anderen Hautleiden und der Klärung der Haut befunden.
Bislang sind ungesättigte Dicarbonsäuren nicht einfach kommerziell erhältlich gewesen, obwohl ein Verfahren zur Synthese bestimmter ungesättigter Dicarbonsäuren in der EP 0 229 252 offenbart ist. Tatsächlich sind einige dieser Molekülklassen bislang nicht beschrieben worden. Es ist jedoch bekannt, daß bestimmte ungesättigte Dicarbonsäuren, insbesondere bestimmte einfach ungesättigte C&sub6;-, C&sub8;-, C&sub1;&sub0;- und C&sub1;&sub2;-Dicarbonsäuren, im Urin von Patienten mit einer Defizienz der Acyl-CoA-Dehydrogenase einer mittleren Kettenlänge (Jin & Tserng (1989) Journal of Lipid Research 30, 1612-1619 und Tserng et al., (1990) Journal of Lipid Research 31, 763-771) nachgewiesen werden können. Bestimmte andere ungesättigte Dicarbonsäuren sind in verschiedenen anderen Publikationen offenbart.
Die EP 0341796 offenbart einen mikrobiellen Weg zur Herstellung gesattigter Dicarbonsäuren aus längerkettigen gesättigten Fettsäuren (Monocarbonsäuren) oder Triglyceriden unter Verwendung von Candida cloacae beta-Oxidationsmutanten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun, unter Verwendung der Mutanten, die in der EP 0 341 796 offenbart sind, bestimmte ungesattigte Dicarbonsäuren, von welchen manche an sich neu sind, und die überraschend verbesserte Eigenschaften bei der Verwendung zur Behandlung der Haut zu medizinischen und kosmetischen Zwecken zeigten, hergestellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Überraschenderweise ist von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden worden, daß ungesättigte Dicarbonsuren im allgemeinen (insbesondere ungesättigte C&sub1;&sub6;- und C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäuren) eine weitaus bessere Wirksamkeit als antimikrobielle und kosmetische Mittel zeigen als deren gesättigte Dicarbonsäuren-Counterparts.
Der Stand der Technik lehrt, daß folgende Leiden durch die Behandlung mit Dicarbonsäuren beeinflußbar sind: Akne (US 4386104); Falten (EP 336880); maligne Melanome (US 4818 768); Dermatosen (EP 229654); hyperpigmentäre Dermatose und Ekzeme (US 4292326); Rosacea (EP 8903081; Lentigo (Jp 91024412) und Seborrhoea (DE 3133425) und Impetigo.
Ebenso lehrt der Stand der Technik, daß einige Dicarbonsäurederivate auch zur Behandlung von bestimmten Leiden wirksam sind. Solche Verbindungen schließen Ester und Salze (US 4818768) und Mercaptoderivate von Dicarbonsäuren (US 4292326) ein. Andere Literaturstellen zur Nützlichkeit von Dicarbonsäurederivaten können z.B. in der JP 58170713, EP 0297436 und der EP 0305407 gefunden werden. Die deutsche Patentanmeldung DE 4033567 offenbart u.a. Monoesterderivate von C&sub3;-C&sub1;&sub4;- (Kohlenwasserstoffhauptkette) Dicarbonsäuren (die gesättigt und ungesättigt sein können) als sebosuppressive Mittel zur Verwendung in kosmetischen oder pharmazeutischen Anwendungen zur topischen Verwendung auf dem Haar und der Haut.
So stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Behandlung menschlicher Haut für kosmetische Zwekke, umfassend die Verwendung einer ungesättigten Dicarbonsäure und/oder eines Derivates einer ungesättigten Dicarbonsäure, welches Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt, zur Verfügung.
Der Ausdruck "Kohlenwasserstoffhauptkette", der im Hinblick auf Dicarbonsäurederivate verwendet wird, bezieht sich auf den Teil des Moleküls, der sich zwischen den Sauerstoffatomen und den beiden carboxylischen Säureresten (oder den derivatisierten Resten davon) befindet. So würden z.B. Derivate der Strukturformel R-OOC-CH&sub2;-COO-R¹ und R-OOC-CH&sub2;- CH&sub2;-COO-R¹ so beschrieben werden, daß diese C&sub3;-, bzw. C&sub4;- Kohlenwasserstoffhauptketten haben.
Die Derivate können z.B. Alkohole, substituierte oder unsubstituierte Amide, Mono- oder Diester (Aryl- oder Alkyl-, insbesondere niedere Alkylester) sein.
Vorzugsweise enthalten die ungesättigten Dicarbonsäuren, die hinsichtlich dieses Verfahrensaspekts der Erfindung verwendet werden, 8 bis 22 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 16 oder 18 Kohlenstoffatome. Die ungesättigten Dicarbonsäurederivate enthalten vorzugsweise 16 oder 18 Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette.
Bestimmte ungesättigte Dicarbonsäuren wurden insbesondere gegen Propionibacterium-acnes (P. acnes) und Staphylococcus aureus (Staph. aureus) als wirksam befunden. So kann sich im allgemeinen das erfindungsgemäße Verfahren auch als nützlich bei der Behandlung eines Leidens erweisen, wobei von P. acnes und/oder Staph. aureus bekannt ist oder vermutet wird, daß diese bei dem Verursachen, dem Aufrechterhalten oder dem Verschlimmern dieses Leidens beteiligt sind.
Erfindungsgemäß können ungesättigte Dicarbonsäuren bei der Behandlung einer großen Bandbreite von Leiden der Haut, wie Akne usw., und wie oben in Verbindung mit dem Stand der Technik diskutiert, verwendet werden. Ebenso sollen sich Bezugnahmen, wie in Zusammenhang mit dem Stand der Technik diskutiert, auf Derivate wie Ester und Salze beziehen.
Andere Leiden, die durch die Verwendung von ungesättigten Dicarbonsäuren positiv beeinflußbar sein können, schließen die Haarschuppenkrankheit und das Vorhandensein von Körpergeruch ein.
Zusätzlich ist von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gezeigt worden, daß ungesättigte Dicarbonsäuren als Inhibitoren der Tyrosinase und als Inhibitoren der Melaninsynthese durch kultivierte Melanomzellen bei Tests, die zum Auffinden von Verbindungen mit Aktivität als Hautklärungsmittel verwendet werden, überraschend wirksam sind.
Deshalb stellt die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Hautklärung, umfassend die Verwendung einer ungesättigten Dicarbonsäure oder eines Derivates davon, zur Verfügung.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine ungesättigte Dicarbonsäure und/oder ein Derivat einer ungesättigten Dicarbonsäure, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenstoffhauptkette umfaßt, zur Verfügung.
Üblicherweise werden solche Zusammensetzungen zur topischen Anwendung auf die Haut zubereitet. Die ungesättigten Dicarbonsäuren und deren Derivate werden einfach in solche Zusammensetzungen inkorporiert, die z.B. die Form von Cremes, Lotionen oder Gelen haben können. Geeignete Zubereitungen sind dem Fachmann sehr gut bekannt und z.B. in der US 4818768 offenbart.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer antimikrobiellen oder hautklärenden Zusammensetzung zum topischen Anwenden auf die Haut zur Verfügung, umfassend das Mischen einer wirksamen Menge einer ungesättigten Dicarbonsäure oder eines Derivates davon mit einem dermatologisch akzeptablen kosmetischen oder pharmazeutischen Träger, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt.
Die Erfindung stellt weiter eine ungesättigte Dicarbonsäure und/oder ein Derivat einer ungesättigten Dicarbonsäure zur Verwendung als therapeutischen oder kosmetischen Wirkstoff zur Verfügung, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffkette umfaßt.
Die Erfindung stellt auch eine ungesättigte Dicarbonsäure oder ein Derivat davon zur Verwendung als hautklärendes und/oder antimikrobielles Mittel zur Verfügung.
Die Dicarbonsäuren, die in solchen Zusammensetzungen verwendet werden, können durch das neue, nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt werden. Alternativ dazu können sie unter Verwendung bekannter Verfahren, z.B. wie in der EP 0296506 offenbart, oder wie von Uemura et al. (1988, Proceedings of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oil Industry, American Oil Chemists Society), Buhler & Schindler (1984, in "Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, Rehm & Reed (Eds.) 169, Verlag Chemie, Weinheim) oder Picataggio et al. (1992, Biotechnology 10, 894- 898) gelehrt, hergestellt werden.
Bestimmte ungesättigte Dicarbonsäuren können vorteilhaft aus längerkettigen ungesättigten Substraten, die bisher zum Herstellen gesättigter Verbindungen verwendet worden sind, unter Verwenden der Mutanten, die in der EP 0341796 offenbart sind, hergestellt werden. Deshalb stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Herstellen ungesättigter Dicarbonsäuren durch begrenzte, kettenverkürzende beta-Oxidation ungesättigter Substrate unter Verwendung einer Hefe, die in einem Wachstumsmedium vermehrt wurde, zur Verfügung.
Vorzugsweise sind die hergestellten ungesättigten Dicarbonsäuren C&sub8;- bis C&sub2;&sub2;-, stärker bevorzugt C&sub1;&sub6;- oder C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäuren.
Zu diesem Zweck geeignete Hefen sind in der EP 0341796 und in Casey et al., (1990) Journal of General Microbiology 136, 1197-1202) offenbart. Solche Stämme (z.B. Candida cloacae 5GLA12, abgekürzt "LA12") zeigen begrenzte oder verminderte beta-Oxidationsaktivität.
Vorzugsweise werden die Hefen mit ungesättigten Fettsäuren in Form von Estern, insbesondere von Triglyceridestern, wie Öl, versorgt. Besonders geeignete Beispiele schließen ungesättigte Öle, wie Sonnenblumenöl und Olivenöl, ein.
Vorzugsweise sind Öle, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden, Triglyceride, in welchen die überwiegend langkettige Fettsäure einen C&sub1;&sub6;- bis C&sub2;&sub2;- oder stärker bevorzugt eine C&sub2;&sub0;- oder C&sub1;&sub8;-Verbindung ist. Vorzugsweise ist das Substratmaterial überwiegend mehrfach ungesättigt. Die Fermentation durch Hefestämme wie LA12 kann zur Herstellung von Mischungen aus ungesättigten Dicarbonsäuren mit ver kürzten Ketten (üblicherweise C&sub8;- bis C&sub1;&sub8;-Verbindungen) führen. Diese gemischten Produkte können z.B. durch differentielle Lösungsmittelextraktion in Fraktionen aufgetrennt werden.
Wird angenommen, daß es während der beta-Oxidation zu zufallsweisem Abtrennen von C&sub2;-Einheiten kommt und daß keine Isomerisierung der Produkte eintritt, kann die Bildung der folgenden Produkte, sofern Oleinsäure als ein Substrat verwendet wird, vorhergesagt werden:
cis-7-Hexadecendicarbonsäure, cis-5-Tetradecendicarbonsäure; cis-7-Tetradecendicarbonsäure; cis-3-Dodecendicarbonsäure; cis-5-Dodencendicarbonsäure; cis-3-Decendicarbonsäure; cis-5-Decendicarbonsäure und cis-3-Octendicarbonsäure.
Von Linolsäure können die folgenden Produkte erwartet werden:
cis-6,9-Hexadecadiendicarbonsäure, cis-4,7-Hexadecadiendicarbonsäure, cis-5,8-Tetradecadiendicarbonsäure, cis-4,7- Tetradecadiendicarbonsäure, cis-2,5-Tetradecadiendicarbonsäure, cis-3,6-Dodecadiendicarbonsäure, cis-4,7-Dodecadiendicarbonsäure, cis-2,5-Dodecadiendicarbonsäure, cis-3,6-Decadiendicarbonsäure, cis-2,5-Decadiendicarbonsäure, cis- 2,5-Octadiendicarbonsäure, cis-4-Decendicarbonsäure und cis-2-Octendicarbonsäure.
Analog dazu sind die vorhergesagten Produkte bei Verwenden von Linolensäure als Ausgangsmaterial die folgenden:
cis-4,7,10-Hexadecatriendicarbonsäure, cis-6,9,12-Hexadecatriendicarbonsäure, cis-2,5,8-Tetradecatriendicarbonsäure, cis-4,7,10-Tetradecatriendicarbonsäure, cis-2,5,8-Dodecatriendicarbonsäure, cis-3,6-Dodecadiendicarbonsäure, cis- 2,5,8-Decatriendicarbonsäure, cis-3,6-Decadiendicarbonsäure, cis-4-Decendicarbonsäure, cis-2,5-Octadiendicarbonsäure, cis-4-Octendicarbonsäure und cis-2-Octendicarbonsäure.
In allen Fällen wird die Produktmischung Produkte der gleichen Kettenlänge wie die Ausgangsverbindung in kleinen Mengen enthalten.
Während die bevorzugten Substrate Fettsäureester (insbesondere C&sub1;&sub8;-Fettsäureester) sind, hängen die Produkte der Fermentation tatsächlich von dem Ausgangssubstrat ab. So kann durch Variieren des Substrats eine ganze Bandbreite an ungesättigten Dicarbonsäuren hergestellt werden.
Einige geeignete Substrate sind in der EP 0229252 identifiziert und schließen C&sub1;&sub0;- bis C&sub2;&sub4;-Alkene und andere un gesättigte Kohlenwasserstoffe, wie ungesättigte Alkanole (insbesondere ungesättigte C&sub1;&sub6;-, C&sub1;&sub8;- und C&sub2;&sub2;-Alkanole), die korrespondierenden Monocarbonsäuren oder deren Hydroxycarbonsäurederviate ein.
Naturgemäß werden aus trans-ungesättigten Ausgangsverbindungen trans-ungesättigte Produkte resultieren.
Es ist ein stark bevorzugtes Merkmal, daß die für das Verfahren verwendete Hefe nicht unter Bedingungen einer Stickstoffbegrenzung vermehrt wird. Statt dessen (anders als bei dem Verfahren, das in der EP 0341796 beschrieben ist), wird die Hefe unter verhältnismäßig stickstoffreichen Bedingungen gezüchtet, wobei eine Veränderung des pH-Wertes die kettenverkürzende beta-Oxidationsaktivität des Organismus beeinflußt.
Es ist eine Tatsache, daß das Produktprofil des Fermentationsverfahrens vorteilhafterweise durch die Veränderung des pH-Wertes des Fermentationsmediums während der Herstellung der ungesättigten Dicarbonsäuren modifiziert werden kann. Insbesondere ist es möglich, die relativen Konzentrationen der verschiedenen Längen der Dicarbonsäuremoleküle auf diese Weise zu verändern. Z.B. ist es möglich, die relative Menge der ungesättigten C&sub1;&sub2;-Dicarbonsäure während der Fermentation von Olivenöl durch Vermindern des pH-Wertes von 7,5 auf 7,1 zu erhöhen.
Das ist signifikant, weil bestimmte Fraktionen des Fermentationsproduktes insbesondere vorteilhafte Eigenschaften für speziell beabsichtigte Verwendungen haben können.
Die verschiedenen Fraktionen der verschiedenen Produkte können aus dem Kulturmedium durch Extraktion mit Diethylether, nachdem mehrere verschiedene saure pH-Werte der wäßrigen Phase eingestellt worden sind, gewonnen werden.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung können durch die folgenden erläuternden Beispiele und Zeichnungen besser verstanden werden, in welchen:
Fig. 1 eine Darstellung der Dicarbonsäurekonzentration (Gramm pro Liter) gegen die Zeit, unter Verwenden von Sonnenblumenöl als ein Substrat, ist,
Fig. 2 eine Darstellung der Dicarbonsäurekonzentration (Gramm pro Liter), unter Verwenden von Olivenöl als ein Substrat, ist,
Fig. 3 eine Darstellung der Dicarbonsäurekonzentration (Gramm pro Liter), unter Verwenden von Olivenöl als ein Substrat unter veränderten pH-Bedingungen ist, und
Fig. 4 ein Schaubild, das die prozentuale Melaninreduktion für aus Sonnenblumenöl erhaltene Dicarbonsäuren mittlerer Kettenlänge zeigt, ist.

Beispiel I - Herstellung von ungesättigten Dicarbonsäuren mittlerer Kettenlänge durch Fermentation

Eine beta-Oxidationsmutante von Candida cloacae, hergestellt durch Mutagenese unter Verwendung von Nitrosoguanidin (Mutante LA12, siehe EP0341796 und auch Casey et al., J. Gen Microbiol (1990), 136, 1197-1202), wurde verwendet, um ungesättigte C&sub8;- bis C&sub1;&sub4;-Dicarbonsäuren aus Triglyceriden, wie Olivenöl und Sonnenblumenöl, die hohe Gehalte an ungesättigten Fettsäuren aufweisen, herzustellen.
Folgendes chemisch definierte Medium wurde verwendet:
Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt:
Das Medium (2,5 l) wurde mit 2% (v/v) einer 24 Stunden alten Kultur von Candida cloacae beta-Oxidationsmutante LA12, die in einem Hefeextrakt (5g/l), Saccharose (10g/l) und Pepton (5g/l) enthaltenden Medium gezüchtet wurde, angeimpft. Die Kultur wurde 20 Stunden lang bei einem pH-Wert von 6,8 gezüchtet und dann wurden 20 ml/l Öl hinzugegeben und der pH-Wert auf 7,4 bis 7,6 erhöht, um die Herstellung der ungesättigten Dicarbonsuren einer mittleren Kettenlänge zu initiieren. Das öl war entweder Sonnenblumenöl oder Silika-gereinigtes Olivenöl. Während der Herstellung der Dicarbonsäuren sank der RQ-Wert (respiratory quotient; respiratorischer Quotient) auf etwa 0,6. Täglich wurden Ahquote (10-20 ml) des Fermenternährmediums zur Lipidanalyse entnommen und zusätzliches öl wurde je nach Bedarf zugegeben.
Die Fermentation wurde geerntet, wenn sich die Herstellung nach 8 bis 12 Tagen einstellte.
Ungesättigte Dicarbonsäuren einer mittleren Kettenlänge wurden aus den Fermenternährmedien durch Ansäuern mit HCl auf einen pH-Wert von 6 isoliert und dann mit Diethylether extrahiert, um C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub4;-reiche Fraktionen abzutrennen. Das Nährmedium wurde dann weiter mit HCl auf einen pH-Wert von etwa 2,0 angesäuert und weiter mit Diethylether extrahiert, um eine C&sub8;-C&sub1;&sub2;-reiche Fraktion abzutrennen. Zum Abtrennen der gemischten Säuren wurde der pH-Wert in einem Schritt von 7,5 auf etwa 2,0 gesenkt und danach wurde mit Diethylether extrahiert.
Das Lösungsmittel wurde von den Dicarbonsäuren durch Rotationsverdampfen abgetrennt.
Ein Zeitverlauf der Herstellung von ungesättigten Dicarbonsäuren aus Sonnenblumenöl (SFO) und Silika-gereinigtem Olivenöl (OO) ist in den Figuren 1 bzw. 2 dargestellt.
Fig. 1 zeigt die Herstellung von ungesättigten C&sub8;-C&sub1;&sub4;-Dicarbonsäuren sowohl einzeln als auch in Gesamtheit unter Verwenden von Sonnenblumenöl als Substrat. Die Herstellungsgeschwindigkeit von ungesättigten Dicarbonsäuren einer mittleren Kettenlänge stieg rapide zwischen den Tagen 3 und 4, ging jedoch am 8. Tag eigentlich auf 0 zurück, so daß die Konzentration der Dicarbonsäuren in Abhängigkeit der Zeit mehr oder weniger konstant blieb.
Fig. 2 zeigt die Herstellung von ungesättigten C&sub8;-C&sub1;&sub4;-Dicarbonsäuren sowohl einzeln als auch in Gesamtheit unter Verwenden von Olivenöl als das Substrat. In diesem Fall zeigte die Herstellungsgeschwindigkeit der Dicarbonsäuren einen weniger plötzlichen Anstieg, stieg jedoch am 8. Tag weiter.
In beiden Fällen machten die längeren Dicarbonsäuren (C&sub1;&sub4;, C&sub1;&sub2;) einen größeren Prozentsatz der Gesamtheit aus als die Dicarbonsäuren einer kürzeren Kettenlänge (C&sub1;&sub0;, C&sub8;), obwohl das genaue Produktprofil zwischen den beiden Substraten variierte (z.B. verhältnismäßig mehr C&sub1;&sub0;-Produkt wurde unter Verwenden von Sonnenblumenöl als das Substrat erhalten).
Diese Daten sind auch in tabellarischer Form in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel II - Verwenden des pH-Wertes, um das Produktprofil zu verändern

Bei einem pH-Wert von 7,4 bis 7,6 während der Herstellung ist die ungesättigte C&sub1;&sub4;-Dicarbonsäure die dominante Spezies aus Ölen (z.B. Olivenöl), die ungesättigte C&sub1;&sub8;-Fettsäuren enthalten.
Wird jedoch der pH-Wert während der Herstellung von 7,4 bis 7,6 auf etwa 7,1 gesenkt, wird die ungesättigte C&sub1;&sub2;-Dicarbonsäure die dominante Spezies. Die Fermentation wurde, wie in den obigen Beispielen detailliert angegeben, bis zum 8. Fermentationstag durchgeführt, sofern der pH-Wert auf 7,1 gesenkt wurde, was dazu führte, daß die C&sub1;&sub4;-Spezies "umkippte" und die Herstellung der C&sub1;&sub2;-Spezies stieg. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Tabelle 1
Fig. 3 zeigt die Herstellung von ungesättigten C&sub8;- bis C&sub1;&sub6;- Dicarbonsäuren sowohl einzeln als auch in Gesamtheit, unter Verwenden von Olivenöl als das Substrat, wobei der pH-Wert am 8. Tag von 7,5 auf 7,1 eingestellt wird. Wie unter Fig. 2 bemerkt, steigt die Gesamtherstellung von Dicarbonsäuren nach dem 8. Tag weiter, sofern Olivenöl als ein Substrat verwendet wird. Jedoch wird das Produktprofil wesentlich beeinflußt. Bis zum 8. Tag stieg die Konzentration der C&sub1;&sub4;- Dicarbonsäure weiter und diese war das am höchsten konzentrierte Dicarbonsäureprodukt. An diesem Punkt, sofern die Bedingungen des verminderten pH-Wertes galten, begann die Konzentration abzunehmen, während das C&sub1;&sub2;-Produkt weiter stieg, so daß nach dem 10. Tag die C&sub1;&sub2;-Dicarbonsäure das Hauptprodukt war.
Diese Daten werden auch in tabellarischer Form in Tabelle II gezeigt.
Das Experiment zeigt, daß das Produktprofil in einem gewissen Maß durch den pH-Wert während der Herstellung kontrolliert werden kann. Die Herstellungsgeschwindigkeit der C&sub8;- bis C&sub1;&sub6;-Dicarbonsäuren bleibt nach Veränderungen des pH- Wertes während der Herstellung im wesentlichen linear. Tabelle II

Beispiel III - Tyrosinase-Inhibierungs-Assay

Die Inhibierung der Tyrosinase-Aktivität wird verwendet, um das Potential hautbleichender Mittel nachzuweisen. Assays zur Tyrosinase-Inhibierung werden nach dem Verfahren von Humada und Mishima (Br. J. Derm. (1972) 86, 385-394) durchgeführt.
Alle Lösungen wurden unter Verwenden von 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) als Verdünnungsmittel frisch hergestellt. Diese waren:
40 mM Ausgangslösung des Inhibitors, woraus der Reihe nach Verdünnungen hergestellt wurden, um die folgenden Konzentrationen von 4,0, 0,4 und 0,04 mM Inhibitor zu erhalten, Salzlösung, enthaltend Kupfersulphat (100 uM) und Magnesiumchlorid (100 mM),
Enzymlösung: 1 ml Pilztyrosinase (2000-4000 Einheiten pro mg) und
Substratlösung 48 mg Dihydroxiphenylalalin (DOPA)/100 ml.
Die Enzym- und DOPA-Lösungen wurden direkt vor der Verwendung hergestellt, da diese lichtempfindlich sind.
Die Inhibierung der tyrosinasekatalysierten Oxidation von DOPA durch Dicarbonsäuren wurde spektrophotometrisch durch Beobachten der Bildung von Dopachrom bei einer Wellenlänge von 492 nm verfolgt. Die Reaktion wurde in vertieften 96- Mikrotiter-Platten durch die Zugabe von 30 ul Inhibitor (oder Puffer zur Kontrolle), 50 ul Puffer und 20 ul Salzlösung durchgeführt. DOPA (50 ul) wurde zugesetzt, um die Reaktion zu starten und jede Platte wurde 30 Sekunden lang geschüttelt. Die Absorptionswerte wurden nach 18 Minuten unter Verwenden eines Mikrotiter-Plattenanzeigegeräts (Titertek Multiscan) abgelesen.
Die Ergebnisse des Tyrosinase-Inhibierungs-Assays zeigen, daß die ungesättigten Dicarbonsäuren einer mittleren Kettenlänge, wie auch Azelainsäure, wirksame Tyrosinase-Inhibitoren sind, was dazu führt, daß mindestens 50 % der Enzymaktivität inhibiert werden, wenn diese in einer Konzen tration von 10 mM vorliegen. Das ist überraschend, da Azelainsäure eine gesättigte Dicarbonsäure ist und deshalb deutlich andere Eigenschaften aufweist. So ist Azelainsäure bei Raumtemperatur ein kristalliner Feststoff, während ungesättigte C&sub8;-/ C&sub1;&sub0;-Dicarbonsäuren niedrigschmelzende, ölige Substanzen sind.
Es ist möglich, daß das Enzym Thioredoxinreductase ein wichtigeres Enzym als das Thyrosinase im Hinblick auf die durch Dicarbonsäuren induzierte Inhibierung der Hautpigmentierung ist. Neuere Forschung (beschrieben von Fitton & Goa in Drugs 41 (5), 780-798 (1991)) hat gezeigt, daß Azelainsäure die Thioredoxinreductase inhibiert. Im Hinblick auf die Offenbarung in dieser Anmeldung würde der Fachmann deshalb erwarten, daß ungesättigte Dicarbonsäuren auch dieses Enzym inhibieren.

Beispiel IV - Inhibierung der Melaninproduktion

In einem weiteren Assay, ergänzend zum Beispiel III, wurden die Effekte von ungesättigten Dicarbonsäuren auf in vitro- Kulturen von Melanocyten untersucht.
Aus einem Säugermelanom gewonnene Zellen, die Pigmente herstellen, wurden unter Anwenden von Standardverfahren in Kulturen gezüchtet. Bevorzugte Zellinien sind B16 (offenbart in der EP 0338104) oder S-91 (z.B. ATCC CCL 51,3, done M-3) Zellen, es können jedoch auch andere Zelllinien oder ursprüngliche Maus- oder menschliche Melanocyten verwendet werden.
Melanomzellen werden in einem vollständigen Zellkulturmedium (wie in der EP 0308919 beschrieben) bis etwa 1/3 Konfluenz gezüchtet. Die zu testende Zusammensetzung wurde dann dem Kulturmedium zugegeben.
Die Zellen wurden für eine weitere Zeitspanne von 4 Tagen kultiviert und die Menge des hergestellten Melanins wurde durch Messen der Absorption bei 540 nm des gesamten Melanins, das aus dem Kulturmedium und von den geernteten Zellen extrahiert wurde, bestimmt.
Das oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um die Fähigkeit der Zusammensetzungen, die ungesättigte Dicarbonsäuren (C&sub1;&sub2;- bis C&sub1;&sub4;-Fraktion, C&sub8;-&sub1;&sub0;-Fraktion, oder gemischte Säuren) in Konzentrationen von 0,1 mM oder 1,0 mM enthalten, zu bestimmen, die Menge an Melanin zu verringern, das von Melanocytenkulturen im Verhältnis zu einer Negativkontrolle hergestellt wird. Kojisäure (eine Substanz, die zur Klärung der Haut verwendet wird) wurde als eine Positivkontrolle verwendet. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt, welche ein Schaubild darstellt, das die prozentuale Verminderung an Melanin in den behandelten Kulturen, verglichen zu der unbehandelten Kontrolle, zeigt.
Es wurde gefunden, daß die verschiedenen Dicarbonsäure fraktionen in dieser Hinsicht im wesentlichen ähnliche Eigenschaften aufwiesen.

Beispiel V - Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität

Die minimale Inhibierungskonzentration (MIC) jeder der verschiedenen ungesättigten Dicarbonsäuremischungen wurde in Gegenwart und Abwesenheit von 10% Intralipid (Kabi Pharmacia, Inc.), unter Verwenden der Agar-Verdünnungstechnik zur Suszeptibilität von 32 Stämmen von Prodionibacterium acnes und von 32 Stämmen verschiedener Gattungen aerober Bakterien, bestimmt. Das Verfahren war wie folgt:
Eine 5 % Ausgangslösung für jedes Mittel wurde durch Zugabe von 10 g des Dicarbonsäurematerials zu 200 ml zweifach konzentrierter Tryptic Soy Broth (TSE), (Baltimore Biological Laboratories) hergestellt. Der pH-Wert jeder Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 ± 0,2 eingestellt.
Für jede organische Säure wurden zwei Sätze von 200 ml-Flaschen/Kolben von 1 bis 9 numeriert. In jede Flasche wurden 50 cm³ des zweifach konzentrierten TSB gegeben. Von der 5% Ausgangslösung wurden 50 cm³ TSB in die Flaschen #1 und #2 gegeben. 50 cm³ werden nacheinander in Flasche #2 bis Flasche #8 gegeben. Die Flasche #9 jedes Satzes enthielt nur 50 cm³ des doppelt konzentrierten TSB ohne eine Dicarbonsäure. Allen 18 Flaschen wurden 2 g granulärer Agar (BBL) zugegeben.
Alle Flaschen wurden bei 121ºC bei 15 psi 15 min. lang autoklaviert und dann in einem Wasserbad auf 50&sup5;C temperiert.
Dem einen Flaschensatz #1-9 wurden 50 cm³ heißes, steriles Wasser zugegeben. Die Flaschen wurden geschüttelt, um den Inhalt zu mischen und 25 cm³ wurde in jede von vier Petrischalen gegossen, um zu erstarren. Dem zweiten Flaschensatz wurden 50 cm³ Intralipid (vorgewärmt auf 50ºC) zugegeben. Die Inhalte wurden daraufhin gemischt und wie oben gegossen.
Standardimpflösungen des Testorganismus wurden durch Anpassen der Bakteriensuspension in 0,85 % physiologischer Kochsalzlösung (PSS physiological sahne solution) auf einem 0,5 McFarland Standard und zehnfaches Verdünnen, um 10&sup7; koloniebildende Einheiten (CFU, colony forming units) zu erhalten, hergestellt. 32 Vertiefungen eines Steuerungsreplikators wurden mit den Impflösungen beschickt. Der vielarmige Inokulator liefert 0,001 bis 0,002 cm³, was zu einer Animpfung von 10&sup4; CFU pro Stelle führt.
Die Platten wurden von der niedrigsten zur höchsten Konzentration angeimpft (um den Effekt des "Verschleppens" der Impflösung zu vermindern) und trocknen gelassen. Die Platten wurden dann umgedreht und 24 Stunden lang bei 35ºC inkubiert. Mit Prodionibacterium acnes-Stämmen angeimpfte Platten wurden unter anaerobischen Bedingungen sieben Tage lang bei 35ºC inkubiert.
Die Kontrollplatten (#9), die kein Mittel enthielten, wurden am Ende der Inkubation auf Wachstumsfähigkeit und Zeichen von Verunreinigungen untersucht. Endwerte der minimalen Inhibierungskonzentration wurden durch Beobachten der Platten mit der kleinsten Konzentration des Mittels, das sichtbar das Wachstum von Mikroorganismen inhibiert, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt, die die minimalen Inhibierungskonzentrationen für Dicarbonsäuren mittlerer Kettenlänge ("gemischte Dicarbonsäuren", z.B. gemischte C&sub8;-C&sub1;&sub4;-Dicarbonsäuren), einer C&sub1;&sub2;-angereicherten Fraktion und für die einfach ungesättigte C18:1-Verbindung, verglichen mit Azelainsäure, für eine Vielzahl von Mikroorganismen zeigt. Die Daten repräsentieren die Ergebnisse der Experimente, die im allgemeinen an einigen verschiedenen Stämmen jeder Spezies durchgeführt wurden, (z.B. P. acnes- Stämme ATCC 6919 und 29399 (ATCC bedeutet American Type Culture Collection); Staph. aureus-Stämme ATCC 25923, 35556 und 29213; Staph. edidermidis ATCC 35984, 31432 und 14490; Micrococcus sedentanus ATCC 27574; M. luteus ATCC 27141, 9341, und 15957; Brevibacterium epidermidis ATCC 35514; Corvnebacterium minutissium ATCC 23347, 23348 und 23349).
Die Gegenwart oder Abwesenheit von "Intralipid" hatte keinen wesentlichen Einfluß. Ein kleiner Unterschied wurde nur für die einfach ungesättigte C18:1-Verbindung beobachtet, wobei vorgeschlagen wurde, daß Intralipid die minimale Inhibierungskonzentration für Stadh. aureus erhöht und für P. acnes und M. luteus erniedrigt. Tabelle 3 MIC-Agardiffusionstest für Azelain versus ungesättigte Dicarbonsäuren
P. acnes ist der Hauptverursacher der Akne, so daß eine Effizienz gegen diesen Organismus Nützlichkeit bei der Prävention und Behandlung von Akne anzeigt. Staphylococcus aureus ist ein pathogener, gram-positiver Organismus, der üblicherweise mit Verbrennungen und Abzessen einhergeht. Candida albicans ist eine resistente Hefe, die als Negativkontrolle hinzugezogen wird. Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli sind beide gewöhnliche, gram-negative Organismen.
Unerwarteterweise waren in allen Fällen die ungesättigten Dicarbonsäuren (sowohl mittlerer Kettenlänge als auch die C&sub1;&sub8;-Verbindungen) aktiver als Azelainsäure Die Verbindungen waren insbesondere effektiv gegen P. acnes, Staph. aureus und Staph. edidermidis. Insbesondere die C&sub1;&sub8;-Verbindung zeigte ein Aktivität, die vielfach höher war als die von Azelainsäure.
Unter Verwenden des gleichen Verfahrens wurde ein ähnliches Experiment durchgeführt, um das Maß an inhibitorischer Aktivität (für P. acnes) von Azelainsäure, der C18: 1-Dicarbonsäure (erhalten aus einem Substrat, das Oleinsäure umfaßt), einer Mischung von C18:1-Fettsäure (mono-carboxy lisch), der korrespondierenden C18:1- und C18: 2-Dicarbonsäuren (erhalten aus einem Substrat, das Linoleinsäure umfaßt) und der C16:1-Dicarbonsäure (erhalten aus einem Substrat, das Palmitoleinsäure umfaßt) zu vergleichen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle IV gezeigt. Die minimalen Inhibierungskonzentrationen für Azelainsäure und C18:1-Dicarbonsäure bestätigten, wie zuvor, im wesentlichen die vorhergehenden Ergebnisse. Die korrespondierende Fettsäure hatte eine sehr kleine Aktivität. So zeigt die C18:1 Dicarbonsäure annähernd das 100-fache der Aktivität von Azelainsäure, obwohl die äquivalente Fettsäure (Oleinsäure) weniger aktiv als Azelainsäure ist.
Im Experiment 4 war das Ausmaß der Inhibierung durch die Azelainsäurekontrolle und damit auch für die Testproben ein wenig niedriger als das in den vorhergehenden Experimenten beobachtete. Tabelle 4 Minimale Inhibierungskonzentrationen für Dicarbonsäuren einer großen Kettenlänge gegen P. Acnes ATCC 25746 versus Azelainsäure- und Oleinsäurekontrollen
nb = nicht bestimmt
Im Experiment 4 war das Ausmaß der Inhibierung durch die Azelainsäurekontrolle und damit auch für die Testproben ein wenig niedriger als das in den vorhergehenden Experimenten beobachtete. Der wahrscheinlichste Grund dafür war die erhöhte Inkubationszeit von 18 Tagen im Vergleich zu 7 Tagen bei der früheren Arbeit.

Claims

1. Pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine ungesättigte Dicarbonsäure und/oder ein Derivat einer ungesättigten Dicarbonsäure, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die ungesättigte Dicarbonsäure 8 bis (einschließlich) 22 Kohlenstoffatome enthält und/oder das Derivat ein Derivat einer ungesättigten Dicarbonsäure, enthaltend 15 bis (einschließlich) 22 Kohlenwasserstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette, ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine oder mehrere ungesättigte C&sub1;&sub6;- oder C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäuren und/oder ein Derivat davon.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, die antimikrobielle Wirksamkeit aufweist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die gegen Propionibacterium acnes und Staphyloccccus aureus wirksam ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die eine hautklärende Wirksamkeit aufweist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Dicarbonsäurederivat ein Alkohol, ein substituiertes oder unsubstituiertes Amid, ein Salz, ein Mono- oder Diester oder eine Mercaptoverbindung ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die zum topischen Anwenden auf der Haut geeignet ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Zusammensetzung 0,001 % bis 20 Gew.-% ungesättigte Dicarbonsäure und/oder Derivat davon umfaßt.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Zusammensetzung 0,01 bis 1 Gew.-% ungesättigte Dicarbonsäure und/oder Derivat davon umfaßt.

11. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem pH-Wert in dem Bereich von 6,8 bis 7,2.

12. Verfahren zur Behandlung von menschlicher Haut zu kosmetischen Zwecken, umfassend das Verwenden einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Kosmetisches Verfahren zur Behandlung menschlicher Haut nach Anspruch 12 zum Zwecke der Behandlung eines Leidens, das von Propionibacterium acnes und/oder Staphylococcus aureus bedingt, aufrechterhalten oder verschlimmert wird.

14. Kosmetisches Verfahren zur Behandlung menschlicher Haut nach Anspruch 12 oder 13 zur Behandlung von einem oder mehreren aus folgendem: Akne, Falten, Dermatose, hyper-pigmentäre Dermatose, Ekzem, Rosacea, Lentigo, Seborrhoea, Impetigo, Dandruff und unangenehmem Körpergeruch.

15. Verfahren zum Klären der Haut, umfassend das Verwenden einer ungesättigten Dicarbonsäure oder eines Derivates davon.

16. Ungesättigte Dicarbonsäure oder Derivat einer ungesättigten Dicarbonsäure, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt, zur Verwendung als therapeutischer oder kosmetischer Wirkstoff.

17. Ungesättigte Dicarbonsäure oder Derivat davon zur Verwendung als ein antimikrobielles oder als ein hautklärendes Mittel.

18. Ungesättigte C&sub1;&sub6;- oder C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäure oder Derivat davon, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt, zur Verwendung als therapeutischer oder kosmetischer Wirkstoff.

19. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen oder kosmetischen Zusammensetzung zum topischen Anwenden auf der Haut, umfassend das Mischen einer wirksamen Menge einer ungesättigten Dicarbonsäure oder eines Derivates davon mit einem dermatologisch akzeptablen kosmetischen oder pharmazeutischen Träger, wobei das Derivat 15 oder mehr Kohlenstoffatome in der Kohlenwasserstoffhauptkette umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die ungesättigte Dicarbonsäure oder das Derivat davon eine ungesättigte C&sub1;&sub6;oder C&sub1;&sub8;-Dicarbonsäure oder ein Derivat ist.

21. Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Dicarbonsäure, umfassend eine limitierte, kettenverkürzende beta- Oxidation eines ungesättigten Substrates unter Verwenden einer Hefe, die in einem Nährmedium vermehrt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, umfassend das Verwenden von Candida cloacae, Stamm 5GLA12.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei das Substrat eine ungesättigte C&sub1;&sub6;- bis C&sub2;&sub2;-Verbindung umfaßt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21, 22 oder 23, wobei das Substrat Olein-, Linol-, Linolen- oder Arachidonsäuren umfaßt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Substrat ein Triglycerid umfaßt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei das Substrat Olivenöl, Sonnenblumenöl oder Castoröl umfaßt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die Hefe nicht unter stickstofflimitierenden Bedingungen gezüchtet wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei die Änderung des pH-Wertes das Produktprofil der Dicarbonsäure in dem Verfahren beeinflußt.