DE69637449T2

DE69637449T2 - Verwendung von alpha-hydroxysäuren zur herstellung eines arzneimittels für die behandlung von entzündungen

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Publication number: DE69637449T2
Application number: DE69637449T
Authority: DE
Inventors: Hakon Westermarck; Pentti Hietala; Maire Jaarma; Timo Sorsa; Martti Vaara
Original assignee: Extracta Ltd Oy
Current assignee: Extracta Ltd Oy
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1996-06-20
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2016-06-21
Also published as: FI962602A0; DK0871438T3; FI119543B; EP0871438B1; FI962602A; DE69637449D1; AU6225896A; EP0871438A1; WO1997000676A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer alpha-Hydroxysäure, wie sie in den anliegenden Ansprüchen definiert ist. Erfindungsgemäß ist die Grundlage der Verwendung von alpha-Hydroxysäuren deren inhibierende und bakterizide Wirkung auf Mikroorganismen und Proteinasen, insbesondere die Inhibierung von Matrix Metalloproteinasen. Matrix Metalloproteinasen sind proteolytische Enzyme, die die Proteine der Basalmembran von Bindegewebe und Entzündungstransmittersubstanzen hydrolysieren.
Der Stand der Technik ist zum Beispiel in der Publikation Nutrition and Metabolism 23 (3), Seiten 227 bis 234 (1979) beschrieben, wonach zwei alpha-Hydroxysäuren, nämlich alpha-Hydroxyisovaleriansäure (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure), und alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure) aus einer Lösung isoliert werden. Die Lösung wird erhalten aus einem proteinreichen tierischen Abfall der Lactobazillus plantarum Fermentation. Die Isolierung dieser Säuren wurde durch die Entdeckung ausgelöst, dass eine solche Fermentationslösung eine wachstumsinhibierende Wirkung auf zwei Mikroorganismen, nämlich Escherichia coli und Trichophyton sp. ausübt. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass diese Verbindungen inhibierend auf ein großes Spektrum von Mikroorganismen wirken.
Milchsäurebakterien und Milchsäure werden weit verbreitet verwendet um organische Materialien zu modifizieren und zu konservieren wie Lebensmittel und Tierfutter. Milchsäure wird auch für die Behandlung von Hautkrankheiten eingesetzt.
Nach US-Patent 5,389,679 kann Milchsäure zur Behandlung von Läsionen des Mundes, insbesondere von Aphthen, verwendet werden. Die Ätiologie dieser Läsionen der Schleimhaut ist unbekannt. Es wird hier auf Streptococcus sanguis Bakterium verwiesen, das zum Teil den Beginn dieser Krankheit unter anderen Faktoren verursachen mag. Die antimikrobielle Wirkung von Milchsäure kann durch die Acidität alleine bewirkt werden, vorausgesetzt dass überhaupt ein merklicher antimikrobieller Effekt für die Heilung von Aphthen existiert. In diesen Geschwüren können ebenso Matrix Metalloproteinasen gefunden werden. Davon ausgehend kann plausibelerweise angenommen werden, dass die Inhibierung dieser Proteinasen einen Effekt bei der Behandlung von Läsionen der Mundhöhle hat, unabhängig davon, ob eine mikrobielle Infektion eine wesentliche Ursache für das Auftreten dieser Läsionen ist oder nicht.
US Patent 4,772,592 beschreibt verbesserte Präparate für die lokale Behandlung von Akne. Die hier beschriebenen aktiven Verbindungen sind Ester von Milchsäure mit C1-C4 Alkoholen. Es wird angenommen, dass die aktiven Verbindungen freie Milchsäure und Alkohol umfassen, die durch Lipasen von bakteriellem Ursprung gebildet werden, nachdem die Ester durch die Epidermis der Haut resorbiert worden ist.
US Patent 4,380,549 beschreibt eine große Anzahl organischer Säuren, deren Salze und andere Derivate, die für die Behandlung von „trockener Haut" geeignet sind. Natürlich auftretende Säuren sowie synthetisch hergestellte Säuren können für diesen Zweck in verschiedenen Formulierungen eingesetzt werden. Der pH dieser Formulierungen liegt in dem Bereich von 2,7 bis 5,7. In dem zitierten US Patent 4,380,549 wird weder die mögliche antimikrobielle Wirkung oder Inhibierung von proteolytischen Enzymen, die diese Verbindungen für die Behandlung des „trockene Haut" Syndroms aufweisen, diskutiert, noch findet sich ein Hinweis darauf.
US Patent 4,363,815 beschreibt die Verwendung von alpha-Hydroxysäuren und von alpha-Typ Ketosäuren bei Zuständen, die durch gestörte Keratinisierung charakterisiert sind. Alpha-Hydroxysäuren können für die lokale Behandlung dieser Erkrankungen eingesetzt werden. Die wirksamen Verbindungen enthalten alle Hydroxy- und Keto-analoga von Aminosäuren, unabhängig davon, ob die entsprechenden Aminosäuren in den Proteinen vorhanden sind oder nicht.
Erfindungsgemäß können alpha-Hydroxysäuren zur Verbesserung der entzündungshemmenden Wirkung von Corticosteroiden und als Stabilisator von Dithranol in Formulierungen eingesetzt werden, die für die lokale Behandlung geeignet sind. Die antimikrobielle Wirkung dieser Säuren und deren inhibierende Wirkung auf Matrix Metalloproteinasen als ein potentieller Mechanismus dieser Wirkung wurde nicht in Betracht gezogen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neuartige Verwendung von alpha-Hydroxysäuren aufgrund der generellen antimikrobiellen Wirkung dieser Verbindungen und aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf Matrix Metallo-Proteinasen. Die charakterisierende Beschreibung der Erfindung ist in den anliegenden Ansprüchen offenbart. Deren Wirkung auf das Eindringen von pathogenen Mikroben in Gewebe wird in zwei Schritte unterteilt: Das Wachstum der Organismen wird inhibiert durch alpha-Hydroxysäuren und Inhibierung der Matrix Metalloproteinasen der Wirtszellen verhindert eine Eskalation der Entzündung.
Die Erfindung bietet signifikante Vorteile.
Die alpha-Hydroxysäuren oder deren Mischungen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, können entweder chemisch synthetisiert oder biotechnisch, zum Beispiel in einer Fermenationslösung mit dem Bakterium, produziert werden. Ein wesentliches Erfordernis ist, dass die Säure wenigstens vier Kohlenstoffatome und/oder eine Verbindung oder Verbindungen enthält, die eine verzweigte Kohlenstoffkette oder einen aromatischen oder anderen geeigneten Substituenten enthält. Hierfür besonders vorteilhaft sind 2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, 2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure oder Mischungen davon.
Matrix Metalloproteinasen (MMP) sind proteolytische Enzyme, die von menschlichen Zellen und Säugetierzellen produziert werden, um bei Bedarf für die Lyse des äußeren Bindegewebes und der Basalmembran der Zellen zu sorgen (siehe Woessner F. Jr., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 11–21, 1994). MMP Enzyme können nahezu alle Proteine des Bindegewebes außerhalb der Zellen und der zellulären Basalmembran sowie, während der akuten Phase einer Erkrankung, bestimmte Serinproteinaseinhibitoren des Serums, (das heißt Inhibitoren und Serpine wie apha-1-Antritrypsin) und Entzündungstransmittersubstanzen (zum Beispiel den Alpha-Faktor von Tumornekrose) zersetzen (siehe Krane S. M., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 11–21, 1994). Heutzutage umfasst die Anzahl an Mitgliedern der MMP Enzymfamilie 14 verschiedene Mitglieder, die durch verschiedene Gene produziert werden, obwohl auf lange Sicht davon auszugehen ist, dass neue Mitglieder der MMP-Enzymfamilie identifiziert werden (siehe Matrisian L. M., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 42–50, 1994).
Bei vielen menschlichen Erkrankungen und Säugetiererkrankungen (zum Beispiel rheumatische, Zahnfleisch-, Krebs-, Blutgefäss-, Gastrointestinal-, Ohr-, Augen-, Haut-Erkrankungen und schmerzhafte wiederkehrende Geschwüre der Mundhöhle) übertrifft die erhöhte Produktion und Aktivität von MMP-Enzymen in verschiedenen Zellarten, die entweder infiziert sind oder entzündete Läsionen von Menschen oder Säugetieren umgeben oder dazu benachbart sind, die Konzentrationen und inhibierende Wirkung der Inhibitorproteine (alpha-2-Macroglobolin) und der Gewebeinhibitoren (TIMP-Moleküle) von MMP Enzymen, die durch den Organismus selbst erzeugt werden. Dies verursacht häufig eine lokale und/oder systemische Gewebeschädigung oder Läsionen, die für die Erkrankung typisch sind (siehe Sorsa et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994, Woessner J. Fr., Ann. N. Y. Acad. Sci 732: 11–21, 1994, Häyrinen-Immonen et al. Int. J. Oral. Maxillfax. Surg. 22: 46–49, 1993, Häyrinen-Immonen et al., J. Oral. Pathol. Med. 23: 269–272, 1994), wobei die pathologischen Veränderungen charakterisiert sind durch Zerfall und Schädigung des Bindegewebes und der Basalmembranstruktur und Anhäsion sowie Erkrankungen und Läsionen der Haut, des Zahnfleischgewebes, der Schleimhautanteile des Mundes und des intestinalen Traktes sowie des Knorpel- und Knochengewebes. Gleichzeitig sind die Aktivitäten von Serinproteinasen (zum Beispiel Kathepsin-G) bei verschiedenen Erkrankungen von Menschen und Säugetieren erhöht (siehe Weiss, S. J., N. Engl. J. Med. 320: 365–376, 1989, Tervahartiala et al., J. Clin. Periodontol. 23: 68–75, 1996). Mikroben, die Proteinasen in Zusammenhang mit Parodontitis erzeugen können, umfassen:

– Bacteroides forsythus
– Porphyromonas gingivalis
– Prevotella intermedia
– Fusbacterium nucleatum
– Treponema denticola
– Peptostreptococcus micros
– Actinocacillus actinomycetemomitans
– Campylobacter rectus.

Der Zweck der alpha-Hydroxysäuren gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verringerung oder Verhinderung des Auftretens von pathologisch erhöhten Aktivitäten und Konzentrationen von Matrix Metalloproteinasen und Serinproteinasen (Kathepsin G), so dass die normalen zellulären Aktivitäten und Konzentrationen dieser Proteinasen im Gewebe von Menschen und Säugetieren während Erkrankungen erhalten bleiben, welche üblicherweise mit erhöhten Aktivitäten und Konzentrationen dieser Enzyme einhergehen. Alpha-Hydroxysäuren eigenen sich sowohl für die Behandlung von Entzündungen von Menschen und Säugetieren sowie zur Ausrottung von multiresistenten Mikroben auf deren Trägern. Die Erfindung betrifft die Verwendung von alpha-Hydroxysäuren in allen pharmazeutisch akzeptablen Formen einschließlich Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulaten, Sirup, Elixieren und rektalen Zäpfchen. Die Tabletten können beschichtet oder unbeschichtet sein. Neben der antimikrobiell wirksamen Komponente können die oralen Präparate und die rektalen Zäpfchen weitere pharmazeutisch akzeptable Bestandteile enthalten. Die Erfindung betrifft zudem lokal eingesetzte Präparate, Salben, Lösungen, Dispersionen, Tinkturen, Tropfen und rektale Zäpfchen, die sowohl für die heilende als auch die präventive Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, die die Haut, Schleimhäute, ophthalmologische, gynäkologische, otologische, orale und weitere Infektionsorte beeinträchtigen sowie die Ausrottung von pathogenen und multiresistenten Mikroben auf den Trägern.
Beispiele für die Verwendung von alpha-Hydroxysäuren zur Verhinderung von mikrobiellen Infektionen in Epithelgeweben wurden mit zwei Säuren durchgeführt: d, 1-2 Hydroxy-3-methybutylsäure und d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure. Diese Säuren sind physiologisch akzeptabel, da ihr gesamter Katabolismus in organischen Geweben durch sorgfältige Untersuchung ihrer enzymatischen Reaktionen verifiziert worden ist. Nach heutiger Erkenntnis ist deren Einsatz auf die Haut, die Mundhöhle und den Verdauungstrakt zu beschränken. Bei dem Verabreichungsniveau, wie es erfindungsgemäß eingesetzt wird, sind keine systemischen Nebenwirkungen zu erwarten. Soweit es für diese Säuren bekannt ist, erfolgt ihre Resorption durch den Darm passiv.
Dadurch wird ihre Verweilzeit im Darm lang, was die antimikrobielle Wirkung, die durch diese Säuren im Gastrointestinaltrakt ausgeübt wird, erhöht.
Da die d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure und die d, 1-2-Hydroxy-4-methlyvaleriansäure sowohl in Wasser als auch in lipid-auflösenden Flüssigkeiten löslich sind, verteilen sie sich zwischen der wässrigen und der Lipidphase. Beide sind freisetzbare organische Säuren mit pK_a 3,80. Daher ist die antimikrobiell aktive Form dieser Säuren die freie Säure und nicht das Anion. Weiter hängt ihre antimikrobielle Wirkung vom pH ab. Bei pH 3–8 sind diese Säuren halbneutralisiert, so dass die Pufferkapazität ihrer Lösungen maximal ist.
Im Folgenden wird die Erfindung mithilfe der folgenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert, wobei
1 ein Diagramm der Wachstumsinhibierung von E. coli und S. aureus durch HMV (d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure) ist;
2 ein Diagramm der Inhibierung der GCF (gingivalen Sulkusflüssigkeit) Kollagenaseaktivität durch HMV ( d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure) und HMB (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure) mit und ohne APMA (Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat) ist;
3 ein Diagramm der Dosisabhängigkeit der Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher gingivaler Sulkusflüssigkeit Kollagenase (MMP-8-Inhibierung) durch alpha-Hydroxysäuren ist;
4 ein Diagramm der Reduktion/Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher Fibroblastgelatinase A (72 kD Typ IV Kollagenase MMP-2) und von menschlicher neutrophiler Gelantinase B (92 kD Typ IV Kollagenase MMP-9) durch alpha-Hydroxyisocapronsäure ist;
5 ein Diagramm der Reduktion/Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher Fibroblastgelatinase A (MMP-2) durch alpha-Hydroxyisovaleriansäure ist;
6 ein Diagramm der Inhibierung der katalytischen Aktivität von Kathepsin-G isoliert aus menschlichen Neutrophilen ist; und
7 ein Diagramm der Inhibierung der katalytischen Aktivität von Kathepsin-G isoliert aus menschlichen Neutrophilen ist.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Wirkungen dieser alpha-Hydroxysäuren und deren Verwendung bei der Behandlung von Entzündungen. Die Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der Erfindung, wobei die Anwendungen der Erfindung nicht hierauf beschränkt sind, vielmehr können die Materialien und Verwendungen, die in den Beispielen beschrieben sind, für unterschiedliche Zwecke innerhalb des Bereichs der Erfindung wie er in den anliegenden Ansprüchen offenbart ist, variiert werden.
Abkürzungen, die in den Beispielen verwendet werden:

HMV: = d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure
HMB: = d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure
MMP: = Matrix Metalloproteinase, verschiedene Typen, die durch eine Codenummer identifiziert sind
GCF: = gingivale Sulkusflüssigkeit
APMA: = Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat.

Beispiel 1 (erläuterndes Beispiel, das kein Teil der Erfindung ist)
Die antimikrobielle Wirkung von d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure und d, 1-2-Hydroxy-4-methlyvaleriansäure wurde in vitro getestet. Die Konzentration dieser Verbindungen wurde auf 4 mg/ml für eine typische Kulturmediumlösung für jede der nachstehenden Mikroben eingestellt. Der pH der Kulturmediumlösungen wurde auf pH 5,2 eingestellt. Wachstumsinhibierung wurde für die folgenden Mikroben nachgewiesen:

Trichophyton sp.
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Salmonella typhimurium
Salmonella typhi 643 W
Streptococcus pyogenes
Streptococcus mutans
Klebsiella pneumonia
Helicobacter pylori
Staphylococcus capitis MCS A 1 ATCC 27482
Staphylococcus warneri RM 130 ATCC 27837
Staphylococcus lactis 15306
Staphylococcus muscae ARCC 121162
Staphylococcus xylosus KL 162
Staphylococcus simulans MK 148 ATCC 27848
Staphylococcus epidermis AW 269
Staphylococcus haemolyticus SM 131
Staphylococcus cohnii GH 137
Staphylococcus citreus 413 Manchester
Staphylococcus hominis KL 243 ATCC 27846
Staphylococcus saprophyticus TW 11
Staphylococcus epidermis 128 Lausanne

Beispiel 2 (erläuterndes Beispiel, das kein Teil der Erfindung ist)
Eine Mischung aus d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure und dessen Natriumsalz wurden in einem molaren Verhältnis von 1:1 hergestellt. Die Mischung wurde homogenisiert und durch ein 200-Meshsieb gesiebt. Das dabei erhaltene Pulver wurde zweimal am Tag, am morgen und am abend, auf irritierte Hautbereiche von Patienten gerieben, die mit Trichophyton infiziert waren. Die Trichophytoninfektion war in zwei Wochen ausgeheilt.
Beispiel 3 (erläuterndes Beispiel, das kein Teil der Erfindung ist)
Wachstumsmedium: Die Bakterien wurden auf einem Trypticase-Soja-Fleisch-Extrakt-Medium (BBL), dessen pH durch Säure (auf pH 5,5) eingestellt wurde, wachsen gelassen. Dem Medium wurden ansteigende Mengen an d, 1-2- Hydroxy-4-methylvarleriansäure (HMV) zugesetzt und wieder auf pH 5,5 eingestellt.
Bakterienstämme: Die Bakterien, die für dieses Beispiel eingesetzt wurden, waren Stämme Staphylococcus aureus ATCC 25923 und Escherichia coli ATCC 23682, die von der American Typ Culture Collection bezogen worden waren.
Messung der antibakteriellen Aktivität: Bakterienkolonien, die auf Blutagarplatten bei 37°C gewachsen waren, wurden in einer sterilen Salzlösung (0,9% NaCl) suspendiert und eine weitere Verdünnung dieser Suspension (in steriler Salzlösung) wurde als Bakterientransplantat zur Inokulierung von Aliquots von 200 μml Wachstumsmedium in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipetiert (die Größe des Transplantats war etwa 10⁵ kolonie-bildende Einheiten (colony-forming units (CFU) pro Milliliter). Die Platten wurden dann bei 27°C 24 Stunden (S. aureus) beziehungsweise 48 Stunden (E. coli) inkubiert. Danach wurde das bakterielle Wachstum durch Messung der Absorption von jeder Vertiefung bei 405 nm Wellenlänge bestimmt unter Verwendung eines Titertek Multiscan Spektrometers (Vertreiber Labsystems Oy, Helsinki, Finnland). Eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, die lediglich nicht inokuliertes Kulturmedium enthielt, wurde als Nullprobe für das Spektrometer verwendet.
Ergebnisse: 1 zeigt ein Diagramm der Testergebnisse. Das Wachstum von Staphylococcus aureus und Escherichia coli ist aufgezeichnet als relative Einheiten in Tryptikase-Soja-Fleisch-Extrakt-Kulturmedium (bei pH 5,5) enthaltend 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure.
Die inhibierende Wirkung der d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure auf das Wachstum sowohl von S. aureus und E. coli zeigt sich bei einen HMV-Gehalt von 1 mg/ml Kulturmedium.
Beispiel 4 (erläuterndes Beispiel, das kein Teil der Erfindung ist)
Präparationen und Pufferlösungen: Präparation A (0,625% HMV) enthielt ein Teil einer 2,5% d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure (HMV) Salbe (pH 3,9) und drei Teile steriles destilliertes Wasser. Präparation B (Kontrollpräparation) enthielt ein Teil an Säuresalbe (pH 3,8) und drei Teile destilliertes Wasser. Die phosphatgepufferte sterile Salzlösung (pH 7,2, PBS) enthielt 0,9% NaCl und 0,01 M Kaliumphosphatpufferlösung.
Bakterienstämme: Die Bakterienstämme in diesem Test waren Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 und Escherichia coli ATCC 23682, die von der American Type Culture Collection bezogen worden waren. Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia KY 3 728, Acinetobacter sp. KY 109 und Propionibakterium Aknes KY 16409 waren klinische Isolate, die von der Stammsammlung der Universität von Helsinki, Unit of Digagnostic Bacteriology (Helsinki, Finnland) bezogen wurden waren.
Test auf antibakterielle Aktivität: Bakterienkolonien, die auf Blutagarplatten bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (P. acnes), in einem candle jar (Str. pyogenes) oder aerob (weitere Stämme) wachsen gelassen wurden, wurden in steriler Salzlösung (0,9% NaCl) suspendiert und eine weitere Verdünnung dieser Suspension (in steriler Salzlösung) wurde als Bakterientransplantat zum Inokulieren von 1 ml Aliquots der Präparationen A und B eingesetzt (die Größe des Transplantats war etwa 10⁵ koloniebildende Einheiten (CFU) pro Milliliter). Die inokulierten Aliquots der Präparationen wurden dann bei 37°C 18 Stunden inkubiert. Anschließend wurde die Menge an überlebenden Bakterien bestimmt, indem zunächst eine 5 μl Probe in 500 μl PBS-Lösung transferiert wurde, dann diese Lösung in PBS mit ansteigender Zehnerpotenz n pro ml PBS verdünnt wurde und schließlich Blutagarplatten mit dieser aufeinanderfolgenden Reihe von Verdünnungen inokuliert wurden. Die Kolonien lies man bei 37°C drei Tage (P. acnes) oder 24 Stunden (die anderen Stämme) unter den vorstehend beschriebenen Wachstumsbedingungen wachsen.
Ergebnisse: Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die Testergebnisse. Präparation A (0,625% HMV) konnte die Lebensfähigkeit der folgenden Bakterienstämme um einen Faktor ≥ 100 unterdrücken: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 23682, Stenotrophomonas maltophilia KY 3728 und Acinetobacter sp. KY 1090.
Die Lebensfähigkeit von Propionibacterium acnes KY 16409 Stamm wurde um einen Faktor ≥ 10 unterdrückt.

Tabelle 1. Menge an lebensfähigen Bakteriellenzellen (in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter, CFU/ml), nachdem die Bakterien bei 37°C 18 Stunden mit Präparation A behandelt worden waren (2,5% HMV Salbe, pH 3,9, verdünnt mit Wasser in einem Verhältnis 1:3 v/v) und Präparation B (Kontrollsalbe, pH 3,8, verdünnt mit Wasser in einem Verhältnis 1:3 v/v). Die Menge an Bakterientransplantat war 10⁵ CFU/ml.

Bacterium	Präparation A (HMV)	Präparation B Kontrolle
Streptococcus pyogenes ATCC 19615	< 10³	< 10³
Staphylococcus aureus ATCC 25923	< 10³	800 × 10³
Pseudomonas aeruginosa ATTCC 27853	< 10³	2500 × 10³
Escherichia coli ATCC 23682	< 10³	3000 × 10³
Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 3728	< 10³	2 × 10³
Acinetobacter sp. 109	< 10³	2000 × 10³
Propionicbacterium acnes KY 16409	4 × 10³	< 10³

Beispiel 5
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Dosisabhängigkeit der Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher neutrophiler Kollagenase (MMP-8 Inhibierung) durch alpha-Hydroxy-Säuren zu testen. Für den Test wurde menschliche neutrophile Kollagenase (MMP-8, 500 ng, sowohl ohne als auch mit Aktivierung mit 1 mM Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat; siehe Sorsa et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994) vorbehandelt (bei 37°C für eine Stunde) mit einer Pufferlösung (mit TNC Pufferlösung enthalten 50 mM Tris-HCL, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,8) und mit 1–100 μg/μl alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, titriert bei pH 7,8) und mit alpha-Hydroxyisovaleriansäure (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, titriert bei pH 7,8) und anschließend in TNC Pufferlösung mit 1,5 μM löslichem nativen Typ I Kollagen bei Umgebungstemperatur (22°C) 12 Stunden inkubiert. Dann wurden die Proben bei 100°C 5 Minuten in Laemmli-Pufferlösung gekocht und mit Hilfe einer 8%–10% Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese analysiert (siehe Sorsa et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994). Die SDS-PAGE-Gele wurden mit 1,2 mM Coomassie Brillant Blue angefärbt und die überschüssige Färbung wurde mit einer Mischung aus 10% Essigsäure und 5% Methanol abgewaschen, danach wurden die Gele mit einem Laserdensitormeter vermessen. Die Katalyse von Typ 1 Kollagen, induziert durch menschliche neutrophile Kollagenase MMP-8, wurde gemessen als Prozent (%) Typ I Kollagen, das zersetzt war. Sowohl für die alpha-Hydroxyisocapronsäure als auch für die alpha-Hydroxyisovaleriansäure wurde gefunden, dass diese bereits bei einer Konzentration von 10 μg/μl eine beträchtliche Inhibierung von menschlichem MMP-8 bewirken. Das Testergebnis ist in 2 gezeigt.
Beispiel 6
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Dosisabhängigkeit der Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher gingivaler Sulkusflüssigkeit Kollagenase (MMP-8 Inhibierung) durch alpha-Hydroxysäuren zu testen (für die in Vivo Form von MMP-8 siehe Sorsa et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994, Tervahartiala et al,. J. Clin. Periodontol. 23: 68–75, 1996). Für den Test wurde menschliche gingivale Sulkusflüssigkeit Kollagenase (MMP-8, 5 μg sowohl ohne als auch mit Aktivierung mit 1 mM Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat; siehe Sorsa et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994) vorbehandelt (bei 37°C eine Stunde) mit einer Pufferlösung (mit TNC-Pufferlösung enthaltend 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,8) und mit 1–100 μg/μl alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2-Hydroxy-4-methlyvaleriansäure, titriert bei pH 7,8) und mit alpha-Hydroxyisovaleriansäure (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, titriert bei pH 7,8) und anschließend in TNC Pufferlösung mit 1,5 μM löslichen nativen Typ I Kollagen bei Umgebungstemperatur (22°C) zwölf Stunden inkubiert. Dann wurden die Proben bei 100°C fünf Minuten in Laemmlipufferlösung gekocht und mit 8% bis 10% Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese analysiert (siehe Sorsa et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 732: 112–131, 1994). Die SDS-PAGE-Gele wurden mit 1,2 mM Coomassie Brilliant Blue gefärbt und die Färbung wurde mit einer Mischung enthaltend 10% Essigsäure und 5% Methanol gewaschen, wonach die Gele mit einem Laserdensitormeter vermessen wurden. Die Katalyse des Typ I Kollagens, das durch menschliche gingivale Sulkusflüssigkeit Kolagenase MMP-8 induziert wurde, wurde als Prozent (%) Typ I Kollagen, das zersetzt worden war, gemessen. Sowohl für die alpha-Hydroxyisocapronsäure als auch für die alpha-Hydroxyisovaleriansäure wurde gefunden, dass diese bereits bei einer Konzentration von 10 μg/μl eine beträchtliche Inhibierung der menschlichen MMP-8 bewirken. Das Testergebnis ist in 3 gezeigt.
Beispiel 7
Dieses Beispiel wurde durchgeführt um die Reduktion/Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher Fibroplast Gelantinase A (72 kD Typ IV Kollagenase MMP-2) und von menschlicher neutrophiler Gelantinase B (92 kD Typ IV Kollagenase MMP-9) durch alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2- Hydroxy-4-methylvaleriansäure, titriert bei pH 7,8) zu testen. Für den Test wurden 100 ng gereinigte MMP-2 und 65 ng gereinigte MMP-9 (beide sowohl ohne als auch mit Aktivierung mit 1 mM Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat) vorbehandelt (bei 37°C für eine Stunde) mit einer Pufferlösung (mit TNC Pufferlösung enthaltend 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,8) und mit 2–80 μg/μl alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, titriert bei pH 7,8) und anschließend mit 1,5 μM ¹²⁵I-markierter radioaktiver Typ I Gelatine (bei 37°C für eine Stunde) inkubiert, worauf das nicht zersetzte Gelatinesubstrat mit 20% Trichloressigsäure gefällt, und die Radioaktivität der überstehenden Phase gemessen wurde, um ein Maß für das zersetzte Gelatinesubstrat zu erhalten (siehe Westerlund et al., J. Dent. Res., in press, 1996). Es wurde gefunden, dass die alpha-Hydroxyisocarpronsäure bei einer Konzentration von 10 μg/μl eine beträchtliche Inhibierung der menschlichen Gelantinase A (MMP-2) und Gelantinase B (MMP-9) bewirkt. Das Testergebnis ist in 4 gezeigt.
Beispiel 8
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Reduktion/Inhibierung der katalytischen Aktivität von menschlicher Fibroblast Gelantinase A (72 kd Typ IV Kollagenase MMP-2) durch alpha-Hydroxyisovaleriansäure (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, titriert bei pH 7,8) zu testen. Für den Test wurden 100 ng gereinigte MMP-2 (sowohl ohne als auch mit Aktivierung mit 1 mM Amino-Phenyl-Quecksilber-Acetat) vorbehandelt (bei 37°C für eine Stunde) mit einer Pufferlösung (mit TNC Pufferlösung enthaltend 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,8) und mit 2–80 μg/μl alpha-Hydroxyisovaleriansäure (d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, titriert bei pH 7,8), und anschließend mit 1,5 μM ^12SI-markierter radioaktiver Typ I Gelatine (bei 37°C für eine Stunde) inkubiert, danach wurde das nicht zersetzte Gelatinesubstrat mit 20% Trichloressigsäure gefällt und die Radioaktivität der überstehenden Phase gemessen, um ein Maß für das zersetzte Gelatinesubstrat zu erhalten (siehe Westerlund et al., J. Dent. Res., in press, 1996). Es wurde gefunden, dass die alpha- Hydroxyisocapronsäure eine beträchtliche Inhibierung der menschlichen Gelatinase A (MMP-2) bei einer Konzentration von 10 μg/μl bewirkte. Das Testergebnis ist in 5 gezeigt.
Beispiel 9
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Inhibierung der katalytischen Aktivität von Kathepsin-G zu testen, das aus menschlichen Neutrophilen isoliert worden war. Für den Test wurde Kathepsin-G (10 ng) vorbehandelt (bei 37°C für eine Stunde) mit TNC Pufferlösung und mit 1,0 bis 100 μg/μl alpha-Hydroxyisocapronsäure (d, 1-2-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, titriert bei pH 7,8) und anschließend wurden die Enzymlösungen mit 1 mM Succinyl-Alanyl-Alanyl-Phenylalanyl-Paranitroanilid (SAAPNA) Peptitsubstrat bei 37°C zwei Stunden inkubiert. Die Kathepsin-G Aktivitäten wurden als Zunahme der Absorption bei 405 nm Wellenlänge gemessen und entweder als relative Änderung der Absorption und/oder internationale Einheiten der Enzymaktivität aufgezeichnet (siehe Tervahartiala et al., J. Clin. Periodontol. 23: 68–75, 1996). Es wurde gefunden, das alpha-Hydroxyisocapronsäure bei einer Konzentration von 10–50 μg/μl die Aktivität von Kathepsin/G wirksam inhibierte. Das Testergebnis ist in 6 gezeigt.
Beispiel 10
Dieses Beispiel wurde durchgeführt, um die Inhibierung der katalytischen Aktivität von Kathepsin-G zu testen, das aus menschlichen Neutrophilen isoliert worden war. Für den Test wurde Kathepsin-G (10 ng) mit TNC Pufferlösung und mit 1,0–100 μg/μl alpha-Hydroxyvaleriansäure (d-1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure, titriert bei pH 7,8) vorbehandelt (bei 37°C für eine Stunde) und anschließend wurden die Enzymlösungen mit 1 mM Succinyl-Alanyl-Alanyl-Phenylalanyl-Paranitroanilid (SAAPNA)-Peptitsubstrat bei 37°C zwei Stunden inkubiert. Die Kathepsin-G Aktivitäten wurden als Zunahme der Absorption bei 405 nm Wellenlänge gemessen und entweder als relative Änderung der Absorption und/oder internationalen Einheiten der Enzymaktivität aufgezeichnet (siehe Tervahartiala et al., J. Clin. Periodontol. 23: 68–75, 1996). Es wurde gefunden, das alpha-Hydroxyisovaleriansäure bei einer Konzentration von 10–50 μg/μl die Aktivität von Kathepsin-G wirksam inhibierte. Das Testergebnis ist in 7 gezeigt.
Beispiel 11
Studie A.
Dieser Teil des Beispiels wurde durchgeführt, um die Wirkung einer Irrigation-/Spülbehandlung mit 2% d, 1-2-Hydroxy-3-methylbutylsäure (HMB) und anschließender Spülung auf den Gesundheitszustand von Zahnfleisch und Mund von Parodontitispatienten zu testen. Die Parodontitispatienten, die an dieser Studie teilnahmen, wurden nach den folgenden klinischen Kriterien ausgewählt: Tiefe Zahnfleischspalten (Tiefe > 4 mm), Menge an Zahnfleischhämorrhagen, sichtbarer Plaqueindex, retentive Zahnstein- und Knochenresorption nachgewiesen durch Röntgenbilder in Bezug auf tiefe gingivale Spalten bei Parodontitis.
40 Paradontitispatienten erhielten eine Spülbehandlung mit 2% HMB, während eine Referenz/Kontrollgruppe (30 Patienten) eine Irrigation/Spülbehandlung mit Sol. Rotocani. Sol. Polymineroli, und Sol. Maraslavini erhielten.
Nach konventioneller mechanischer Entfernung des Zahnsteins erhielten die Testpatienten eine Irrigation-/Spülbehandlung mit 2% HMB, anschließend erhielt jeder Patient ein Aliquot 2% HMB Präparation für eine Mundspülung, die zweimal täglich zwei Wochen durchzuführen war; entsprechend wurde die Referenz-/Kontrollgruppe (30 Patienten) mit konventioneller mechanischer Entfernung des Zahnsteins behandelt und die anfängliche Irrigation-/Spülbehandlung der gingivalen Spalten wurde mit Sol. Maraslavini. Sol. Rotocani und Sol. Polymineroli Präparationen durchgeführt, danach wurden die Patienten angewiesen, die Mundspülung lediglich mit Wasser durchzuführen. Klinische und mikrobiologische Untersuchungen wurden vor und nach der Behandlung durchgeführt. Die mikrobiologischen Wachstumstests wurden auf Blutagar, Schokoladenagar und Tsistevitssalzagar-Platten durchgeführt. Falls es erforderlich war, eine Reinkultur auf einer unterschiedlichen Platte zu isolieren, wurde eine neue Kultur auf einer herkömmlichen Agarplatte wachsen gelassen, und in unklaren Fällen wurden die neuen Kulturen auf unterschiedlichen Platten wachsen gelassen bei Bedarf ergänzt durch herkömmliche biochemische und Fermentationstests. Die Ergebnisse zeigen, dass die HMP-Präperation auf zweifache Weise wirkt:

1. Die HMB-Präperation rottete die pathogene mikrobielle Flora, die in den gingivalen Spalten der Parodontitispatienten vorlag, in etwa 40% der Fälle vollständig aus, und in einigen Fällen war die Unterdrückung der mikrobiellen Flora im Vergleich zu der der Referenz/Kontrollgruppe um Größenordnungen besser.
2. Die HMB-Präparation veränderte das Spektrum der pathogenen mikrobiellen Flora der gingivalen Spalten der Parodontitispatienten vor Behandlung in eine a-pathogene Richtung.

Das Ziel dieses Test war die Bestimmung der Wirkung und Funktion der HMB-Präparation auf den Gesundheitszustand des Zahnfleisches und der Schleimhäute der Mundhöhle über eine Nachfolgezeitdauer von zwei bis drei Monaten nach der systematischen Spülbehandlung, die über zwei Wochen durchgeführt wurde. Es wurde gefunden, dass die HMB-Präparation eine antimikrobielle Wirkung hat, die drei Monate nach der Behandlung anhielt. Die klinischen Entzündungsindizes (gingivale Hämorrhagen und sichtbare Plaqueindizes), die den Gesundheitszustand des Zahnfleischgewebes charakterisieren, waren aufgrund der HMB-Behandlung/Prophylaxe signifikant verringert.
Da diese Symptome, die mit dem Fortschreiten der Parodontitis verbunden sind, die weitere Entwicklung der Erkrankung fördern, kann die HMB-Präparation das Fortschreiten der Gingivitis (und anderer gingivaler Erkrankungen) und Parodontitis vorbeugen.
Bei einer Untersuchung unmittelbar im Anschluss an die Beendigung der Behandlungsserie waren 40% der Patienten frei von pathogener Mikroflora und nach drei Monaten betrug diese Anzahl noch 27,5%. Im Vergleich zur Kontrollgruppe war das Ergebnis 1,5-fach besser.
Die HMB-Präparation konnte das Spektrum der pathogenen Mikroflora in a-pathogene Richtung verschieben. Eine besonders starke Unterdrückungswirkung zeigte die HMB-Präparation auf Streptococcen-Stämme (Streptococcus viridans und mutans). Gegen a-hämolytische Streptococci war die HMB-Präparation weniger wirksam: Deren Anzahl wurde quantitativ verringert, jedoch wurden immer noch lebensfähige Cocci nachgewiesen. Die HMB-Präparation hatte ebenso eine starke antibakterielle Wirkung auf E. coli.
Subjektiv hatten die Parodontitispatienten, die mit HMB Irrigation behandelt worden waren, ein sauberes und leichtes Gefühl im Mund. Im Ergebnis zeigen Tests, dass eine 2% Lösung HMB-Präparation geeignet ist zur aktiven Behandlung mittels Irrigationssäuberung von tiefen gingivalen Spalten (Tiefe > 4 mm), verursacht durch Parodontitis, gefolgt von der anschließenden Verwendung der 2% Lösung HMB Präparation als Mundspülung, insbesondere als allgemeine Prophylaxe gegen wiederkehrende Parodontitis und für die Behandlung von und als Prophylaxe gegen das erneute Auftreten von Parodontitis bei Patienten, die an ernsten systemischen Erkrankungen (Diabetes, Leukämie, Arthritis, Krebs, Gefäßerkrankungen und chronischen Krankheiten) leiden, sowie als allgemeine Prophylaxe um einen entzündungsresistenten Zustand im Mund zu erhalten.
Testergebnisse:

1. Kontrollgruppe, mikrobiologischer Status der Patienten vor der Behandlung: 30% zeigen α-hämolytische Streptococci 20% zeigen apathogene Saprophyten 20% zeigen Escherichia coli 20% zeigen verschiedene Typen von bakteroiden Mikroben 10% zeigen hämolytische Hämophilie (Haemophilus influenzae). Kontrollgruppe, mikrobiologischer Status der Patienten nach Behandlung: 18% zeigen kein Wachstum von Mikroorganismen 27% zeigen α-hämolytische Strepptococci 18% zeigen Wachstum von Streptococcus viridans 10% zeigen β-hämolytische Strepptococci (Streptococcus pyogenes) 10% haben apathogene Saprophyten. 10% zeigen apathogene gemischte Flora.
2. Testgruppe, mikrobiologischer Status der Patienten vor Behandlung mit HMB: 46% zeigen Fam. Streptococceae 15% zeigen Escherichia coli 12% zeigen apathogene gemischte Flora 10% zeigen bakteroide Mikroben 5% zeigen Haemophilia haemolyticus 5% zeigen keine bakterologische Flora 8% zeigen Micrococci. Testgruppe, mirkorobiologischer Status der Patienten nach Behandlung mit einer 2% Lösung HMB-Präparation: 39% zeigen keine bakteriologische Flora 18% zeigen Streptococcus viridans (lediglich einige Zellen davon) 18% zeigen apathogene gemischte Flora 8% zeigen α-hämolytische Streptococci 8% zeigen Saprophyten (lediglich wenige Zellen) 5% zeigen β-haemolytische Streptococci (lediglich wenige Zellen) 3% zeigen Mircrococci (lediglich wenige Zellen) 3% zeigen eine unvollständige Behandlung.

Studie B
Dieser Teil des Beispiels wurde durchgeführt, um die Wirkung einer 2% Lösung HMB Präparation auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora in Zahnbürsten von Parodontitispatienten vor und nach der Behandlung zu testen.
Es wurde eine mikrobiologische Untersuchung an Proben durchgeführt, die den Zwischenräumen der Borsten der Zahnbürsten der Patienten entnommen wurden. Vor Behandlung wurden weit verbreitet Mikroben gefunden, die zur Gruppe der Streptococci und E. coli gehörten. Behandlung mit der 2% Lösung HMB-Präparation verringerte die Anzahl dieser Mikroben beträchtlich.
Es ist bekannt, dass die Lücken zwischen den Borsten von Zahnbürsten unleugbar Rückhaltestellen von parodontopathogenen und anderen Mikrobien der Mundhöhle darstellen. Da Zahnbürsten nach der Anwendung üblicherweise nicht gewaschen und steril getrocknet werden, und damit eine feuchte Umgebung bilden, die ein ausgesprochen bevorzugtes Wachstums-, Förder- und Kulturmediumsubstrat für Bakterien der Mundhöhle darstellt, ergänzen die hier erhaltenen Ergebnisse vorteilhaft die empfehlenswerte Vorgehensweise, Zahnbüsten zu reinigen und zu desinfizieren.

Claims

Verwendung einer Alpha-Hydroxysäure enthaltend mindestens 4 Kohlenstoffatome und mit einer verzweigten Kohlenstoffkette, oder einer Mischung von diesen Säuren als antimikrobieller und Proteinase inhibierender Bestandteil für die Herstellung eines pharmazeutischen Produktes zur Behandlung von Entzündungen bei Tieren und Menschen.
Verwendung einer Alpha-Hydroxysäure nach Anspruch 1 in einem Prdoukt mit antimikrobieller und Proteinase inhibierender Wirksamkeit, wobei die Alpha-Hydroxysäure 2-Hydroxy-3-Methylbutylsäure, 2-Hydroxy-4-Methylvaleriansäure oder eine Mischung davon ist, für die Herstellung eines pharmazeutischen Produktes zur Behandlung von Entzündungen bei Tieren und Menschen.