DE2329253A1 - Mundpraeparat - Google Patents

Description

Dr.-lng. E. BERKENFELD DipJ.-tr.g. H. 3ERKENFELD, Patentanwalt·, Köln Anlag· Aktenzeichen

zur Eingab· «Μ. 6. Juni 1973 VA/ Name d. Anm. 1. THE ROYAL COLLEGE OF

SURGEONS OF ENGLAND

2. THE MEDICAL RESEARCH COUNCIL

Mundpräparat

Vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel, das ein biologisch aktives Molekül aufweist; die Erfindung betrifft insbesondere die Bekämpfung der Wirkungen von Mikroorganismen, die zur Entstehung von Mundkrankheiten, insbesondere Zahnkaries und periodontalen Krankheiten beitragen.

Die Präparate vorliegender Erfindung sind dazu bestimmt, an Stellen zu wirken, wo sich Zahn—Plaque auf Zahnflächen ansammelt. Es ist bekannt, daß Zahn-Plaques einen Herd für Bakterienkolonien bilden und daß die metabolischen Yirkungen solcher Bakterien zu dem Plaque-Volunen beitragen und zu den auf Zähnen und den umliegenden weichen Geweben ausgeübten W nachteiligen Wirkungen. So trägt zum Beispiel die Fähigkeit gewisser Bakterien, extracelluläres Polysaccharid aus in der Diät angesammeltem Zukker zu synthetisieren, zur Stärke und Haftung der Plaques bei, in der die Bakterien und ihre Fermentationsprodukte vor der selbstreinigenden Wirkung der Mundflüssigkeit bzw. Reibung der Kauwerkzeuge abgeschirmt sind.

Die sich auf den Zähnen und längs des Zahnfleischrandes bildende Plaoue verursacht zusätzlich eine ^tzündung, die zu einer Zahnfleischschruinpfung und zu Bedingungen führt, die allgemein als Mundkrankheit bekannt ist.

Polylucane sind besonders wichtige Beispiele solcher bakterieller extracellulärer Produkte, die in allen von Critchley, Wood, Saxton und Leach- (Caries Research 1,_ 1967, 122) untersuchten Plaques gefunden wurden. Die Bildung und Struktur der Zahn-

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Plaque wurde von vielen Forschern untersucht. Wenn ein Zahn durchbricht, ist er, wie man ,jetzt annimmt, mit einem Schmelzhäutchen bedeckt, das, wie man glaubt, das Endprodukt von Ameloblasten (Winkler and Backer Dirks, International Dental Journal 8, 1958, 561) ist. Ein sich schnell bildendes, sekundäres Häutchen ist verhältnismäßig frei von Bakterien urd enthält sowohl Protein als auch Carbohydrat, die sich, wie man annimmt, aus denaturierten Glycoproteiden des Speichels bilden. Die Ablagerung von einer Plaque-Grundsubstanz folgt; Bakterien machen etwa 70 % des gesamten Volumens der Plaque aus. Auf Elementen wie Calcium und Phosphor beruhende anorganische Verbindungen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Struktur der Plaque.

Zahn—Plaque kann man nicht durch die übliche Mundhygiene wie Zähneputzen oder Mundspülen entfernen, da sie sich in unzugänglichen Stellen abgesetzt hat, zum Beispiel in den sirh berührenden Flächen benachbarter Zähne,wie aber auch in Rissen und Löchern der Schmelzoberflächen, und auch weil die Plaque auf dem Zahnschmelz haftet. Zahnärzte können die Plaque durch sorgfältiges Schaben mit scharfen Instrumenten und mit Hilfe von sichtbarmachenden Lösungen, die solche Ablagerungen leichter erkennen lassen, entfernen. Vorliegender Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dieses zeitaufwendige und kostspielige Verfahren mittels eines medizinischen Präparates, das von jedem selbst angewendet werden kann, zu erübrigen.

Man hat versucht, die Bildung von Plaque zu verhindern oder zu verringern, und zwar durch Anwendung eines Eneyms wie Dextranase entweder in Form eines Nahrungszusatzmittels oder als therapeutisches Mittel in Zahnpasten oder Mundwässern. Versuche mit Tipren (Bowen, W. H., British Dent. Journal, Vol. 131, 1971, Seite 445) haben gezeigt, daß der Zusatz von Dextranase zu Zucker die Bildung von Karies und Plaque verringern kann. Die'Anwendung von Dextranase als Nahrungsmittelzusatz hat indes gewisse Nachteile, da es zum Beispiel durch Wärme bei der Herstellung der Gerichte inaktiviert wird und weil es schwierig ist, das Enzym an den

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Stellen der Polysaccharidsynthese in ausreichender Konzentration hinzubringen.

Vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel, das mindestens ein Agglutinin aufweist, das mit einem biologisch aktiven Molekül verbunden ist. Das Agglutinin dient dazu, den Herd zu finden,-das biologisch aktive Molekül ist wirksam, um die Natur des Herdes zu modifizieren.

Gemäß einer besonderen Ausführung der Erfindung weist ein medizinisches Mundpräparat wenigstens ein Agglutinin auf, das mit «.iner Anti-Plaque- bzw. Anti-Karies-Substanz verbunden ist. Vorliegerde Erfindung dient zum Schutz von Zähnen und/oder der angrenzenden weichen Gewebe in der Weise, daß ein Präparat, das wenigstens ein mit einer Anti-Plaque- oder Anti-Karies-Substanz verbijndenes Agglutinin aufweist, in Berührung mit dem Zahn und/ oder der anliegenden weichen Gewebeflächen in Berührung gebracht

Die Erfindung betrifft noch eine Ausführung der Modifikation von Enzymen wie Dextranase in der Weise, daß man sie in Berülvung mit einem Mittel , das ein Bindevermögen für eine Komponente der Zahn-Plaque hat, und so ein Präparat vorsieht, das auf der Zahn-Plaque adsorbiert wird, so daß es so wirksame Funktionen bei der Mundhygiene ausüben kann, wie Bildung solcher Polysaccharide wie Dextran oder anderer Polysaccharide zu inhibieren, die zur Plaquebildung beitragen und die oben beschriebenen nachteiligen Wirkungen habenj Wenn auch die vorliegende Erfindung besonders mit Bezugnahme auf die Verwendung von Dextranase als dem biologisch aktiven Molekül beschrieben wird, so ist die Erfindung doch hierauf nicht beschränkt. Das biologisch wirksame Molekül kann zum Beispiel ein Enzymkatalysator sein, ein Antibiotikum, ein mit Fluorid koraplexiertes Protein, irgendein anderes Anti-Plaoup- oder Anti-Karies-Molekül oder eine Kombination diener. Weitere für die Zwecke der Erfindung bratachbare Enzyme sind levanase, Enzyme, welche die orale Verdatung von Nahrungs—

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mitteln fördern, wie o(-Amylase und Glucamylase, die auf Stärke- und Dextrinkomponenten der Nahrung wirken, Lysozym (Muramidase), das bekanntlich im menschlichen Speichel vorliegt, und Substanzen des Anti-Lactobazillus-Systems (wie von Bowen, W. H. auf Seite 487 des Biology of the Peridontium, Verlag A. H. Melcher and W. H. Bowen, Academic Press, 1969, beschrieben). Solche Enzyme können einzeln oder in Kombiration miteinander verwendet werden, was besonders für Mischungen von Dextranase und Amylase zu-

trifft. Es können weitere Anti-Plaque- oder Anti-Karies-Substanzen verwendet werden, wie Fluoride, Calciumglycerinphosphat, Antibiotika und Dextran- und Saccharose-Inhibitoren.

Vorliegende Erfindung sieht ein Präparat von Enzymen, gekuppelt mit Mitte? η vor, die Polysaccharide oder Carbohydratteile von in der Zahn-Plaque vorliegenden Glycoproteinen binden. Solche Mittel können au$ pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Quellen isoliert werden; sie liegen in der Agglutine genannten Gruppe von Substanzen vor, zu welchen Protectine, Lectine (G. I. Pardoe, C. Uhlenbruck und U. Reifenberg, Medical Laboratory Technology, 28 (1971) 255) und Antikörper gehören.

Ein besonders brauchbares Lectin ist das Concanavalin. Als Antikörper kann Gamma-Globulin verwendet werden, wie noch besonders in Beispiel 1 beschrieben wird.

Das Agglutinln wirkt als Zielmittel, indem es seinen Enzymteil zu dem passenden Teil der Zahnplaque fül^rt. Die Art der Bindung des Agglutinins an das Enzym muß derart sein, daß sowohl das Bindungsvermögen des Agglutinins für sein Ziel wie aber auch die katalytische Wirksamkeit des Enzyms, an dem es gebunden ist, praktisch erhalten bleibt. Es kann nicht erwartet werden, daß nur eine einzige Methode allgemein anwendbar ist, wenn auch in «I der Praxis sich die folgenden Methoden für das Kupplungsverfahren als besonders nützlich erwiesen haben. Hierzu gehört die Verwendung von Toluol-2,4-diisocyanat, um die Antikörper an Dextranase zu kuppeln. Die Methode der Anwendung von Toluol-2,4-diiso-

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cyanat beruht auf der Methode von Schick und Singer (J* Biol. Chem. 236 (1961) 2477); der Unterschied liegt in der Anwendung eines Carbonatpuffers anstelle von Borat für die zweite Stufe. Die Antikörperkomponente von Affenserum ist auch an Dextranase gebunden worden unter Anwendung von Glutardialdehyd bei einem pH von 5,0 und 37° C 1
und einem pH von 6,0.

pH von 5,0 und 37° C wie auch von Diazosulfanilsäure bei 0° C

Die Kupplung von Concanavalin A an Dextranase ist erfolgt unter Anwendung von Glutardialdehyd bei 25° C und einem pH von 5 >0, von Diazosulfanilsäure bei 0° C und einem pH von 6,0 oder durch Anwendung des Diazoniumsalzes von Q- o-Dianisidin in einem pH-Puffer von 7,0,der 0,15M KCl enthält. Die Glutardialdehyd-Methode hat sich als besonders wirksam in Verbindung mit verschiedenen Quellen von Dextranase mit weitgehenden Unterschieden in der spezifischen Aktivität erwiesen.

Die Tatsache, daß die Komponenten der Concanavalin A-Dextranase-Vereinigungprf' ihre individuelle biologische Aktivität behalten, war unerwartet, da bekanntlich sowohl Concanavalin A und Dextranase eine Affinität für Dextran haben, so daß das Bindungsvermögen der ersten Komponente sehr wohl die enzymatische Wirksamkeit der zweiten Komponente hätte inhibieren können. Es scheint tatsächlich eine bestimmte Verzögerungsphase vorzuliegen, ehe die volle enzymatische Aktivität der Dextranase zur Geltung kommt.

Die erfindungsgemäßen Enzympräparate finden in der Weise Anwendung, daß man sie Mundwässern einverleibt, und zwar entweder als eine einzelne Enzym-Agglutinin-Vereinigung oder als Mischungen von Enzym-Agglutinin-Vereinigungen, da erwiesen werden konnte, daß sie sich selbst an Zahn-Plaque heften. Wenn also ein Mensch seinen Mund mit dem Concana'veLin-Dextranase-Präparat gespült hatte, wurde eine Probe der Plaque genommen und mit einem Anti-Concanavalin-Ser^um behandelt, das mit einem fluoreszierenden Mittel markiert war. Es konnten Flecken klarer Fluoreszenz gesehen und fotografiert werden.

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Die Enzym-Agglutinin-Präparate vorliegender Erfindung können auch in der Weise angewendet werden, dpß man sie Zahnpasten einverleibt, wobei das Präparat nur eine einzige Enzym-Agglutinin-Vereinigung oder eine Mischung solcher Vereinigungen enthalten kann· Die übrigen Bestandteile einer Zahnpaste dürfen weder mit der Enzym-Agglutinin-Vere.inigung eine Komplexverbindung eingehen, noch die enzymatische Aktivität dieser Vereinigung beeinträchtigen oder inaktivieren.

Die erfindungsgemäßen Präparate können auch Trägern wie Kaugummi, Pastillen , kaubaren Tabletten oder sogar Nahrungsmitteln odpr Getränken einverleibt werden. Der Träger kann ein Material sein, das sich in die Plaque einbringen läßt und das das Präparat langsam mit der Zeit freisetzt.

In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher beschrieben; die Beispiele 1 bis 4 zeigen, wie Gamma-Globulin mit dem Lectin-Concanavalin konjugiert werden kann; die Beispiele 5 bis 10 zeigen, wie das Enzym Dextranase mit dem Lectin-Concanavalin konjugiert werden kann; die Beispiele 11 und 12 zeigen, wie verschiedene Antibiotika mit Concanavalin konjugiert werden können, und Beispiel 13 beschreibt einen Versuch mit einem erfindungsgeiräßen Mittel. Vorliegende Erfindung ist indes auf diese Beispiele nicht beschränkt, da die Erfindung auch die analoge Vereinigung anderer biologisch aktiver Substanzen mit anderen Mitteln des Agglutinintyps einschließt und so ein Mittel zu deren Bindung an die Plaque in therapeutischer Konzentration gebildet wird.

Die Beispiele 11 und 12 zeigen, daß Antibiotika an das Concanavalin gebunden werden können, wobei ihre biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zwei Methoden werden angewendet, um das Antibiotikum an das Concanavalin zu binden. Nach der ersten Methode wird, wie oben angegeben _t Glutardialdehyd verwendet; nach der zweiten Methode wird jede der Komponenten (Lectin und Antibiotikum^ in ein Thiolat übergeführt, worauf eine Oxidation erfolgt, um die Thiolgruppen von getrennten Molekülen des Lectin-

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thiolsts und Antibiotikumthiolats in Form einer Disulfidbrücke zu verbinden. Die Überführung in ein Thiolat kann in wäßriger Lösung unter sehr milden Bedingungen unter Anwendung von N-Acetylcysteinthiole*acton bzw, N-Acetyl-homo-cysteinthiolacton erfolgen. Mit dem ersteren Thiolacton kann die Bildung eines Thiolates innerhalb eines weiteren Bereiches des pH-Wertes als mit der zweiten Verwebindung erfolgen, und deshalb werden auch mildere Reaktionsbedingungen möglich, die für die Stabilität des Lectins und des Antibiotikums geeignet sind. Obwohl die.Glutardialdehyd-Methode zeitraubend ist, hat die Thiolatbildung/Oxidation die besonderen Vorteile, daß erstens lediglich nichtgiftige <\Tninopäuren in den Lectin-Antibiotikum-Komplex eingeführt werden und zweitens die Verwbindung zwischen dem Lectin und dem Antibiotikum entsprechend dem pH und des für die Thiolatbildung verwendeten Mittels sich in verschiedener Weise ausführen läßt; so kann das N-Acetylcysteinthiolacton mit Hydroxylgruppen bei leicht saurem pH reagieren, mit Phenolgruppen bei einem wesentlich längeren Zeitraum bei diesem pH und mit Aminogruppen bei einem alkalischen pH, und da die Reaktionskomponenten für sich in Thiolate übergeführt werden, ermöglichen diese Verhältnisse dem Fachmann die optimalen Reaktionsbedingungen zur Bewahrung der A»%£ antibiotisehen Aktivität bzw. der 4es Lectins, in dem Maße, wie die Reaktionsbedingungen geändert werdenParittens ermöglicht das angewendete Verfahren eine Vereinigung, nämlich die -S-S-Bindung, die, wenn sie auch in luftenthalteriden wäßrigen Lösungen stabil ist, doch einerReduktion zur Trennung der Thiole durch Enzyme in den Bakterien der Zahn-Plaque zugänglich ist, was unter diesen Umständen eine langsame Freisetzung der Formulierung ermöglicht, wo diese erforderlich ist. Diese Methode kann dazu dienen, Lectine mit Enzymen zu vereinigen, da sowohl die ersteren als auch die letzteren stets einige Gruppen des oben angegebenen erforderlichen Typs aufweisen. Es liegen demnach Methoden vor, um die Erfindung mit einer großen Vielzahl von Mitteln zu verwirklichen, die "heimfinden" zur Zahn-Plaque, nämlich gewisse Agglutinine, Lectine Aind Antikörper,/ um ihre Verbindung mit einer Vielzahl von Anti-Plaque-Substanzen zu bewirken. Aus der Litera-

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folgt, daß durch die Verwendung verschiedener Tyt>en von Enzymen und Proteinen die Anti-Plaoue-Suhstanz auch Fluorid und andere Substanzen enthalten kann; so bildet Fluorid Komplexe mit Serum-Albumin (di San Stefano, Brunese und Gombes, Arch. Stomatol., 7 287 (1966); Rugyiero, Brunese, Gombers und di San Stefano, Arch. Stomatol, 8 177 (1967)).

Gewisse metallhaltige Proteine, wie Perioxidase, können Fluorldionen koordinieren (Dunford und Alberty, Biochemistry, 6, 447 (1967), Carboxypeptidase-Mg und Catalase (Brill, Sr.ndberg, Biopnys., J. 8, 669 (1968)),

BEISPIEL

Bildung eines Dextranase-Antikörperr unter Anwendung von Toluol-2,4-«dii5Ocyanat

Für die Beispiele 1 bis 4 wurde als Antikörper Gamma-Globuljn aus dem in Affen enthaltenen Antiserum verwendet, die gegen cariogene St^eptocokken geimpft waren. Dies wurde aus dem Antise— rum xjnter Anwendung von DEAF 5? Cellulose (!','batman Ltd.) nach der Methode von Stanworth et al (Nature, 188, 156 (i960)) erhalten.

Der Versuch wurde nach der Methode von Schick und Singer (J. Biol. Chem. 2477, 2?6 (I96I)) mit Modifikationen ausgeführt.

Es wurden 2 mg (1 mg/cm⁵ in 0,1M Phosphat-Puffer, pH 7,5) Dextranase mit 10 ml Toluol-?,4-diisocvanat behandelt; die Mischung wurde magnetisch 2? Minuten bei 0° C gemischt. Die Mischung wurde dann bei 0° C dreißig Minuten zentrifugiert und die oben stehende Flüssigkeit sorgfältig von dem nicht umgesetzten Diisocyanat getrennt. Diese Flüssigkeit wurde dann eine weitere Stunde bei 0° C stehengelassen.

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Die Lösung wurde dann mit ein^r Lösung des Antikörpers-I¹^ P mg (1 mg/cm⁵ in Carbonat-Puffer·, pH 9,% 0,1M) bei 37° C gemischt; Antikörper war also mit I^1?- markiert. Nach dem Stehenlassen bei Ύ7 C während .einer Stunde wurde die Lösung durch eine Bi.ogel PlO-Säule (16 cm χ 1,f> cm) geführt und 1 cm- Fraktionen aufgenommen.

Die optische Dichte de·*" Fraktionen bei PPQ nm wurde auf einem Unicam SP500 Spectrophotom^+er abgelesen. Die Fraktionen mit hoher optischer Dichte wurden dqnn vereinigt und gegen Phosphat-Puffer 0,1 M, pH 7,0, dialysiert.

BEISPIEL P

eines Dextranase-Antikörpers unter Anwendung von Diazo— sulfanilsäure

Natriumnitrit wurde in 0,5 N Salzsäure (1? mg/cm') bei 0° C gelöst. Sulfanilsäure wurde in Wasser (20 mg/cnr) gelöst und auf f5° C gekühlt. Gleiche Volumina der beiden Lösungen wurden gemischt und sorgfältig darauf geachtet, daß die Temperatur während des Mischens una danach nicht über 5° C stieg. Die so hergestellte Diazostilfanilsäure wurde dann auf ein pH von 6,0 mit Natriumacetat eingestellt und sofort wie folgt verwendet:

Dextranase (P mg) O mg/cm in Phosphat 0,1 M, pH 6,0) und der mit j^fff- markierte Antikörper (P mg) (1 mg/cm in Phosphat, 0,1 M, pH 6,0) wurden gemischt und in Eis auf 0° C gekühlt. ^O ml der wie vorstehend beschriebenen Diazosulfanilsäure wurden zugegeben und die Mischung eine Stunde bei 0° C stehengelassen. Die Lösung wurde dann auf eine Biogel PlO-Kolonne (16 cm χ 1,? cm) ger^rtben und 1 cm" Fraktionen aufgenommen. Diese wurden bei ?8O rvn geprüft und die Fraktionen mit hoher optischer Dichte und hohem Molekulargewicht wurden zusammengegeben und bei 0 C gelagert.

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BEIS P T E I.

Herstellung eines Dextranase-Antikörpers υ,ρter Anwendung; vor. Glutardialdehvd

Es wurden 2 mg Dextranase (1 mg/cm in Citrat-Piiffer, pH 5,0, 0,1 M) und mit I markierter Antikörper, 2 ™g (1 mg/1 er* in Citrat-Puffer, pH 5,0, 0,1 M) bei Raumteperatür (21° C!) gemischt und 100 ml Glutardialdehyd (25 % in Nasser) zugegeben. Di^ Mischung wurde eine Stunde bei 37° C gerührt. Das Reaktionrgemisch wurde dann auf eine Biogel ΡΙΦ-ΚοΠοηη^ (16 cn χ 1,5 cm) ^ep-eben und 1 cm Fraktionen gepamnelt. Die Fraktionen wurden a^f .ihr Protein hei 2PO nm geprüft und die P p^oteinhaltigen Fraktionen wurden zusammengegeben.

BEISPIEL Beweis für die Bildung von Dextranase-Antikörper-Konjugaten

Die Protein-halt igen Fraktionen "on jedem der Beispiele 1 bis 3 wurden auf eine Biogel P300-Kolonne (16 cm χ 1,5 cm) gereben, die vorher mit freiem Dextranase-Antikörper kalib*riert worden war. Es wurden 1 cnr Fraktionen gesammelt und auf Dextranase-Aktivität sowie auf Antikörper-Protein geprüft, das durch seine

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I Markierung festgestellt wurde. In jedem Fall wurde eine Verbindung mit einem hohen Molekulargewicht festgestellt, die sowohl eine Dextranase-Aktivität als auch Antikörper-Protein enthielt.

Eine Celluloseacetat-Elektrophorese auf den Produkten de-r Peispiele 2 und 3 wurde auch auf die freien Proteine und die hochmolekularen Fraktionen aus der Biogel P300-Kolonne durchgeführt. In jedem Fall wurde in dem Reaktionsgemisch ein Band mit schwacher Beweglichkeit ermittelt, das nicht in den freien Proteinen vorlag.

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BEISP-I-EL

Bildung eines Dextranase-Concanavalin A-Konjugates mit Diazosulfani!säure

Fp wurrVn 2 rag (1 mg/cm in Phosphat-Puffer, pH 6,0, 0,1 M) Dextranase und 2 mc (1 mg/cm in Phosphat-Puffer, pH 6,0, 0,1 M) Concaravalin A bei 0 C gemischt und 50 ml frisch hergestellte Diar^osulfanilsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei 0° C stehengelassen. ■

Das R^oaktionsgeniisch wurde dann auf eine Biogel P10-(olonne (18 cm χ 1-,-fj- rm) gegeben, um überschüssiges Kupplungsmittel zti entfernen. 1 enr⁵ Fraktionen wurden gesammelt und auf Potein bei nvr\ geprüft. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden dann zin»sammen-

PETSPTEL

eine? Dextranase-Concanavalin A-Kon_siugates mittels GIu-

Ss wurden 9 mg {A mg/em' in Citrat-Puffer, pH 5,0, 0,1 M) Dextranase und 2 mg (1 mg/cm⁵ in Citrat-Puffer, pH 5,0, 0,1 M) Concanavalin bei Raumtemperatur (21° C) gemischt, der Mischung 100 ml Glutardialdehyd (25 % in Wasser) zugegeben imd die Mischung· eine Stunde bei 37° C gehalten.

Das Reaktionsgemisch wurde dann au"f eine Biogel PlO-Kolonne (18 cn χ 1,5 cm) gegeben, um überschüssiges Kupplungsmittel zu entfernen. 1 cm ^Fraktionen wurden gesammelt und bei 280 nm auf Protein geprüft· Die proteinhaltigen Fraktionen wurden zusaramengegeben.

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BEISPIEL

Bildung eines Dextranase-Concanavalin A-Konjugates mittels defl Diazon^Tsal?gsvon o-Dianisidin

Es wurden 2 mg (1 mg/cm in Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) Dextranase und 2 mg (1 mg/onr in Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) Concanavalin A bei Raumtemperatur gemischt. Dann wurden 300 ml einer frisch hergestellten Lösung des Diazoniumsalzes von o-Dianisidin in 0,15 M Kaliumchloridlösung zugegeben und die Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur (?1 C) gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Biogel PlO-Kolonne (30 cm χ 1,5 cm) gegeben und 1 cm Fraktionen aufgenommen und bei 280 nm auf Protein geprüft. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden zusammengegeben.

BEISPIEL 8

Beweis für die Bildung von Dextranase-Concanavalin A-Kon^jugaten nach den Beispielen 5 bis 7

Die proteinhaltigen Fraktionen der Beispiele 5 bis 7 wurden auf t Biogel P300-Kolonnen (16 χ 1,5 cm) gegeben, die vorher sowohl mit freier Dextranase wie freiem Concanavalin A kalibriert worden waren. In jedem Fall wurden 1 cnr Fraktionen gesammelt und sowohl auf Dextranase-Aktivität als auch Concanavalin A-Bindungseigenschaften geprüft, und es wurde festgestellt, daß sie in einem hochmolekularen Produkt Vorliegen.

Ein weiterer Beweis für die Bildung einer hochmolekularen Verbindung im Falle des mit Glutardialdehyd gekuppelten !Conjugates, das sowohl Dextranase als auch Concanavalin A (Beispiel 6) enthielt, ergibt sich aus den folgenden Beispielen 9 und 10.

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BEISPIEL

Fällung des Kon.lugats mit Glycogen und. Messung des Abfalls der Dextranase-Aktlvität der überstehenden Flüssigkeit

Es wurde eine 1 cm -Probe des Konjugats des Beispiels 6 mit 400 mg Glycogen (1 mg/cnr Lösung in Phosphat-Puffer, pH 7,?) gemischt und die Mischung vier Stunden auf 37° C gehalten. Gleichzeitig wurde eine identische Kontrolle mit 400 ml Puffer anstelle einer Glycogenlösimg durchgeführt.

Nach der Inkugbation wurden *?0 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung zugegeben, um die Fällung zu unterstützen, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht (16 Stunden) stehengelassen. Die Lösungen wurden dann zentrifugiert und die Dextranase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten gemessen.

Es wurde gefunden, daß die mit Glycogen behandelte Probe 33 % der ursprünglichen Dextranase-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit aufwies.

Da ein identischer Versuch unter Anwendung einer Mischung von freier Dextranase und Concanavalin A mit einer identischen Profe— teinkonzentration keinen Abfall in Dextranase-Aktivität im Ver-

ι -

gleich mit dem Hauptversuch zeigte, ist die Annahme berechtigt, daß sich ein chemisch verbundenes Dextranase-Concanavalin A-Konjugat gebildet hatte.

BEISPIEL 10

Veränderung des Reaktionsprofils der Wirkung von Dextranase auf Dextran

Es wurden ?0O ml Dextranase-ConranPivalin A-Kon.iugat des Beispieles £·■ bei 37° C mit P, 5 cm^ Piper o^ % DeVtranlösung (Citrat-

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Puffer, 0,2 M, pH 5,0) inkubiert. Es wurden aliquote Teile bei 0, 10, 20 und 30 Minuten entnommen und die Menge des gebildeten reduzierenden Zuckers gemessen.

Gleichzeitig wurde ein identischer Versuch unter Anwendung von 200 ml Dextranase-Concanavalin Α-Mischung einer identischen Konzentration durchgeführt, die nicht mit dem Kupplungsmittel gemäß Beispiel 6 behandelt worden war.

Aus dem in ein Koordinatensystem eingetragenen Mengen an gebildetem reduzierenden Zucker versus Zeit konnte festgestellt v/erden, daß im Falle des Konkjugats eine bestimmte Verzögerung regeben war, bevor eine volle enzymatische Aktivität, erzielt war, die in dem Gemisch nicht vorlag. Dies ist ein weiterer Beweis dafür, daß ein chemisch gebundener Komplex von Dextranase und Concanavalin A erhalten worden war.

BEISPIEL 11

Bildung von Kon.iugaten des Concanavalin A mit, verschiedenen Antibiotika durch Kupplung mit Glutaraldehvd

(I) Bildung eines Vancomycin-Concanavalin A-Konjugats unter Anwendung von Glutaraldehyd

Es wurden 5 mg (1 mg/cm^ in Acetat-Puffer, pH 5,0, 0,1 M) Concanavalin A und 5 mg (1 mg/cm⁵ in Acetat-Puffer, pH 6,0, 0,1 Vl) Vancomycin gemischt und Glutaraldehyd (25 % in H_p0; 125 }il) zugegeben und die Mischung eine Stunde bei 3 21° C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine Biogel PlO-Kolonne (18 χ 1,5 cm) gegeben, die vorher sowohl mit Vancomycin als auch mit Concanavalin A kalibriert worden war. ? cm' Fraktionen wurden aufgenommen·

Das Verfahrensprodukt erschien als einziger hochmolekularer GIp-

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felnunkt (Fraktionen 7 bis 12), der Concanavalin A-Aktivität enthielt, mit Entfernung des niedrigmolekularen Gipfelpunktes, was auf das Varicömycin zurückzuführen ist, das mit den Fraktionen Uk bis 58 bei der Kalibrierung eluiert worden war.

Das hochmolekulare Gewicht wurde dann mit folgenden Ergebnissen auf seine biologische Aktivität im Vergleich mit nativem Vancomycin geprüft.

Organismus

Menge, die zur Inhibition des Wachstums erforderlich ist

Vancomycin HCl Konjugat*

Escherichia coil

faecalis Streptococcus Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa

62,5 u g/cm" inaktiv

1,9 (J g/cm' 20 u g/cnr

0,4 u g/cm- 5 u g/cnr

inaktiv inaktiv

* Zahlen korrigiert für den Anteil des Concanavalin A am . eingesetzten Gewicht

(IT) Bildung eines Ampicillin-Concanavalin A-Konjugats unter Anwendung von Glutaraldehyd

Es wurden 5 mg (1 mg/cnr in Acetat-Puff er, t>H 5,-0-, 0,1 M) Concanavalin A und 5 mg (1 mg/cnr in- Acetat-Rvffer, pH 5,0, 0,1 M) Ampicillin gemischt und Glutaraldehyd (25 % in H₂O; 125 μ l) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur (21° C) stehengelassen.

Das Gemisch wurde dann auf einer vorkalibrierten Biogel P6O-K0-lonne eluiert und 2 cm- Fraktionen aufgenommen. Diese wurden danrr sowohl auf Concanavalin A als auch Ampicillin-Aktivität geprüft.

Die Ergebnirpe zeigten, d*ß Ampicillin in einer feststellbaren

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Form bei dem Eluierungsvolumen nativen Ampicüllins (Fraktionen 28 bis 38) nicht mehr vorlag, was darauf hinweist, daß tatsächlich die Bildung eines !Conjugates stattgefunden hatte, das Concanavalin Α-Aktivität enthielt, die mit den Fraktionen 18 bis ?.& eluiert War.

Dieses hochmolekulare Produkt wurde dann auf seine biologische Aktivität im Vergleich zu nativem Ampicillin geprüft und folgende Ergebnisse erhalten.

Organismus

Menge, die zur Inhibition des Wachstums erforderlich ist

Escherichia coli Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeniginosa

Ampicillin

0,4 u g/cm'

1,9μ g/cm⁵
0,2 μ g/cm⁵
inaktiv

Konjugat*

31,7 μ g/cm³ 15,6 ρ g/cm⁵ 3,9 ρ g/cm³ inaktiv

* Zahlen korrigiert für den Anteil des Conoanavalin A am eingesetzten Gewicht

BEISPIEL

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Bildung von Kon.iugaten des Concanavalir A mit verschiedenen Antibiotika durch Oxidation der in Thiolderivate übergeführten Antibiotika und des Concanavalin A

(T) Bildung eines Bacitracin-Concanavalin A-Koraa.jugats unter Anwendung von N-Acetylhomocysteinthiolacton

(a) Bildung eines Thiolats ^on Concanavalin A und Bacitracin

Es wurden 10 mg (2 mg/cm in S sauerstofffreiem Carbonat-Puffer, pH 10,6, 0,1 M) Concanavalin A mit N-Acetylhomocysteinthiolacton

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(20 mg/car in sauerstofffreiem destillierten Wasser, 50 u. 1) bei 0° C zwei Stunden behandelt. Die Umsetzung wurde dann durch Zusetzen von sauerstofffreiem Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0) abgebrochen, bis das pH des Reaktionsgemisches 7,0 war.

Das Reaktionsgemisch' wurde dann auf einer Biogel PlO-Kolonne (16 χ 1,5 cm) mit sauerstofffreiem Phosphat-Puffer (pH 7,0, 0,1 M) eluiert und 2 cm- Fraktionen aufgenommen. Die Fraktionen wurden bei 280 nm geprüft und auf Concanavalin Α-Aktivität und den Gehalt an Thiolat geprüft. Die hochmolekularen Fraktionen (7 bis 11) wiesen alle diese Eigenschaften auf; sie wurden dann unter Stickstoff bei 0° C gelagert.

Dann wurde eine Probe von Bacitracin in der gleichen Weise behandelt und mit einer Biogel PlO-Kolonne (18 χ 1,5 cm) eluiert. In diesem Fall wurden die Fraktionen auf Protein bei ?80 nm und auf den Gehalt an Thio^UeC geprüft j die hochmolekularen Fraktionen (7 bis 11)-, die beide Eigenschaften aufwiesen, wurden unter Stickstoff bei 0° C gelagert.

Es wurde gefunden, daß das Bacitracin-Thiolat 0,8 SH Reste je Molekül Bacitracin enthielt, während das Concanavalin A-Thiolat 36 SH Reste je Molekül aufwies.

(b) Kupplung des Bacitracin-Thiolats an das Concanavalin A-Thiolat

Es wurden 5 mg (1 mg/cm in sauerstofffreiem Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) Concanavalin A-Thiolat und 5 mg (0,7 rag/cm⁵ in sauerstofffreiem Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) Baeitracin-Thiolat gemischt und in freier Atmosphäre stehengelassen. Es wurden aliquote Teile, 500 u 1, in gewissen Zeitabständen entnommen und auf freien Thiolgehalt geprüft. Nach dem Stehenlassen während 36 Stunden konnten in dem Reaktionsgemisch keine freien Thiolgruppen mehr festgestellt werden. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf einer vorkalibrierten Biogel P150-Kolonne (18 χ 2 cm)

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■χ
eluiert und 2 cm Fraktionen aufgenommen.

Die Fraktionen wurden auf Protein bei 280 rim und Concanavalin A-Aktivität geprüft und festgestellt, daß sie einen einzigen hochmolekularen Gipfelpunkt (Fraktionen 12 bis 20) a"-*VLesen und diese beiden Eigenschaften hatten. Ein auf das Bacitracin-Thiolat (Kalibrierungslage Fraktionen 40 bis 52) te zurückzuführender Gipfelpunkt konnte indes nicht mehr festgestellt werden, was darauf hinweis, daß sowohl das Bacitracin als auch das aktive Concanavalin A in dem hochmolekularen Reaktionsprodukt enthalten waren.

Des hochmolekulare Produkt wurde dann auf seine biologische Aktivität im Vergleich zum nativen Bacitracin und seinen Thiolaten mit folgenden Ergebnissen geprüft:

Für eine Inhibition erforderliche

Menge (ug/cm3) Organismus

Bacitracin Bacitracin-Thiol Konjugat*

Escherichia coli	250	inaktiv
Streptococcus faecalis	31,2	12,5
Staphylococcus aureus	7,8	12,5
Pseudomonas aeruginosa	inaktiv	inaktiv

inaktiv 50 12,5 inaktiv

♦ Zahlen korrigiert für den Anteil des Concanavalin A am Konjugat

(II) Bildung eines Erythromycin-Concanavalin A-Kon^ugats

Das Concanavalin A wurde mittels ft-Acetylhomocysteinthiolacton nach der beschriebenen Methode in das Thiolat übergeführt.

Erythromycin wurde mittels N-Acetylcysteinthiolacton nach folgender Methode in das Thiolat übergeführt.

Es wurden 1 g N-Acetylcystein in 15 ml trockenem Dioxan gelöst

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und 1,2 * Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden gerührt, filtriert und verdampft (1,10 g).

Es wurden 200 mg N-Acetylcysteinthiolacton in 15 ml Dioxan gelöst und 1,0g Erythromycin zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht "Dei Raumtemperatur gerührt, bei Raumtemperatur im Vakuum verdampft und ein farbloser Rückstand verblieb. Dieser wurde in 20 ml Chloroform gelöst, mit Wasser (3x5 cm") gewaschen, getrocknet und verdampft und so ein schwach weißes, kristallines Produkt (II) mit einem Schmelzpunkt von 128 bis 130° C erhalten.

Es wurden 5 mg (1 mg/cnr in sauerstofffreiem Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) Concanavalin A-Thiolat mit 10 mg- (2 mg/cnr in sauerstofffreiem Phosphat-Puffer, pH 7,0, 0,1 M) N-Acetylcysteinerythromycinthiol gemischt und das Reaktionsgemisch der Atmosnhäre ausgesetzt; in gewissen Zeiträumen wurden aliquote Teile (500 jjI) entnommen und auf das Vorliegen von Thiolgruppen geprüft. Nach 36 Stunden konnten keine freien Thiolgruppen mehr festgestellt werden. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine vorkalibrierte Biogel PlO (16 χ 1,5 cm) Kolonne gegeben und mit Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,0) eluiert. 2 cm³ Fraktionen wurden aufgenommen und auf Protein bei 250 nm und Concanavalin-A-Aktivität geprüft. Es wurde eine hochmolekulare Fraktion, die beide Eigenschaften aufwies, festgestellt (Fraktionen 7 bis 12). Das Eluierungsvolumen dieser Fraktion entsprach dem des inaktiven Concanavalin A in dem Kalibrierurigsversuch.

Diese hochmolekulare Fraktion wurde dann auf ihre biologische Aktivität im Vergleich zu der von nativem Erythromycin (I) und N-Acetylcysteinerythromycinthiolacton (II) geprüft.

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Für eine Inaktivierung erforderliche

Menge (γ g/cm^) Organismus

Escherichia coli Streptococcus faecalis Staphylococcus aureup Pseudomonas aeruginosa

I	IT	Kon.jugat*
1,9	6?,5	50
0,4	7,8	6,?5
0,0^5	0,4	0,8
5.6	inaktiv	inaktiv

* korrigiert für den Anteil des Concanavalin A an dem eingesetzten Gewicht

Beweis für die Bildung von Concanavalin 4-Antibiotika-Konjugatefr gemäß Beispiel 12

(I) Fällung der Kon.jugate mit Glycogen und Messen des Abfalles an antibiotischer Aktivität der überstehenden Flüssigkeit

(a) Concanavalin A-Ampicillin

Es wurden 8 cm Proben des Kon.jugats mit 500 ul Glycogenlösu^p· (4 Ji in 1 M Natriumchlorid in Phosphat-Puff er, pH 7,? 0,1 M) gemischt und bei 21° C vier Stunden stehengelassen. Gleichzeitig wurde ein Kontrollversuch mit 500 μΐ Piffer anstelle einer GIycogenlösung durchgeführt.

Gleichzeitig wurde eine Mischung von Concanavalin A und Ampicillin identischer Konzentration ebenfalls mit 500 pl der Glycogenlösung vier Stunden behandelt.

Die Lösungen wurden dann zentrifugiert und die überstehender Flüssigkeiten auf ihre biologische Aktivität geprüft und folgende Ergebnisse erzielt.

R 94/1

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Für eine Inhibition erforderliche

Menge (u g/cm^) Organismus ■

Konjugat KonjtJgat _Μ1._Λ- _ffunbehandelt behandelt wiscnung

Escherichia coli ' 6,2 (12,5) 25 1,6

Streptococcus faecalis (0,8) 3,1 (12,5) 25 (0,8) 3,1

Staphylococcus aureus (0,4) 1,6 1,6 0,?.

Pseudomonas aeruginosa inaktiv inaktiv inaktiv

Die in Klammern gesetzten Zahlen weisen auf den Beginn einer Inhibition hin. Das Fehlen dieser Zahlen zeigt an, daß bei den angegebenen Konzentrationen eine Inhibition deutlich festzustellen war.

Die Versuchsergebnisse zeigen, daß die Fällung des Konjugats zu einem Abfall an antibiotischer Aktivität führte im Vergleich zu den Kontrollen, was darauf hinweist, daß sich tatsächlich ein chemisch gebundenes Concanavalin A-Ampicillin-Konougat gebildet hatte. .__,__

BEISPIEL 13

Einer Gruppe von Wistar-Ratten wurde Trinkwasser gegeben, das folgende Präparate enthielt:

a} jeine Mischung von Dextranase und Concanavalin;

b) Dextranase;

c) Concanavalin;

d) ein nach Beispiel 6 gebildetes Konjugat aus Concanavalin und Dextranase.

Alle di Tiere erhielten Stephan-Diät 580 ad libitum. Der Versuch dauerte 21 Tage. Die Ergebnisse und die Zahl der eingesetzten Ratten waren folgende:

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	Zahl der Tiere	Zahl der kariösen Stellen
a) Dextranase und Conca-
navalin	14	5,2
b) Dextranase	14	A,9
c) Concanavalin	13	4,7
d) Konjugat	13	3,2

Patentansprüche

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Claims (21)

1. Dr.-lng. E. BERKENFELC · DIoUlng. K. BERKENFELD, Patentanwalt·, Köln

   Anlag· - Aktenzeichen

   zur Eingab· vom 6. JUTÜ. 1973 VA/ Nam. d. Anm. 1. THE ROYAL COLLEGE OF

   SURGEONS OF ENGIAND

   2, THE MEDICAL RESEARCH COUNCIL

   PATENTANSPRÜCHE

   Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Agglutinin enthält, das an ein biologisch aktives Molekül gebunden ist.
2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin herdgerichtetes, zielsuchendes Mittel ist und daß das biologisch aktive Molekül wirksam hinsichtlich der Modifikation der Natur einer Zielstelle ist.
3. 3. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin ein Antikörper, ein Lectin oder ein Pro— tectin ist,
4. 4. Mittel nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper wirksam gegen einen Bestandteil einer Zahn-Plaque ist, die mit der Entwicklung einer Zahnkrankheit in Verbindung steht,
5. 5. Mittel nach den Ansprüchen 3 und k_t dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an Dextranase gebunden ist.
6. 6. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis k_t dadurch gekennzeichnet, daß das biologisch aktive Molekül ein Enzymkatalysator, ein Antibiotikum, ein Komplex aus Protein und Fluorid, irgendeinem anderenAnti-Plaque- oder Anti-Karies-Molekül oder eine Kombination vorstehender Substanzen ist.
7. 7. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin Concanavalin ist.

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8. 8. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Concanavalin an Dextranase, Vancomycin, Ampicillin, Bacitracin

   _oder Erythromycin gebunden ist.
9. 9. Verfahren zum Herstellen eines Mittels nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Agglutinin

   , mit einem biologisch aktiven Molekül verbunden wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin ein herdgerichtetes, zielsuchendes Mittel ist, und daß das biologisch aktive Molekül die Natur einer Zielstelle wirksam modifizieren kann.
11. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin ein Antikörper, ein Lectin oder ein Protectin ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin ein gegen einen Bestandteil einer Zahn-Plaque wirksamer Antikörper ist und dieser Bestandteil mit der Entwicklung von Zahnerkrankungen zusammenhängt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an Dextranase gebunden ist.
14. 14· Verfahren nach den Ansprüchen 12 und 13» dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung mittels Glutardialdehyd, Toluol-2,4-diisocyanat oder Diazosulfanilsäure erfolgt.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Agglutinin Concanavalin ist, das Zahn-Plaque als Ziel sucht.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, daß das Concanavalin an Dextranase gebunden ist·
17. 17. Verfahren nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeich-

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    net, dass die Bindung mittels Glutardialdehyd, Diazosulfanilsäure oder diazotierten o-Dian1sidin erfolgt.
18. 18.Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Vancomycln mittels Glutaraldehyd an Ampicillin gebunden wird.
19. 19.Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass. das biologisch aktive Molekül ein Enzymkatalysator, ein Antibiotikum, ein mit Fluorid komplexiertes Fluorid, irgend ein anderes Antiplaque- oder Anticarles-Molekül oder eine Kombination dieser ist.
20. 20.Verfahren nach den Ansprüchen 9-11, dadurch gekennzeichnet, dass das biologisch aktive Molekül mit dem Agglutinin-Molekül in der Weise verbunden wird, dass man getrennt diese Moieklile mit N-Acetylcysteinthiolacton oder einer Kombination von N-Acetylcysteinthiolacton mit eine« anderen MIttel zur Bildung von Thiolaten in Thiolate überführt, und dann oxidiert, um die Synthese einer Disulphidbriicke zwischen den beiden Thiolaten zu bewirken.
21. 21.Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass Concanavilin mit ladt rad η oder Erythromycin verbunden wird..

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