SK281584B6

SK281584B6 - Farmaceutický alebo kozmetický prípravok, jeho použitie a spôsob prípravy jeho účinnej zložky

Info

Publication number: SK281584B6
Application number: SK405-95A
Authority: SK
Inventors: Nigel Lidner; John Casey
Original assignee: Unichema Chemie B. V.
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 2001-05-10
Also published as: ZA937148B; ATE163913T1; DE69317433D1; PL308222A1; HUT70587A; US5753704A; HU226010B1; PL180281B1; EP0662946B2; ES2114616T3; JP3533218B2; JPH08502054A; AU688274B2; KR100221504B1; HU9500913D0; AU4828993A; MY110734A; EP0662946B1; EP0662946A1; DE69317433T2

Abstract

Opisuje sa farmaceutický alebo kozmetický prípravok na báze nenasýtených dikarboxylových kyselín s 8 až 16 atómmi uhlíka (vrátane), okrem zlúčenín, ktorých skupiny pozostávajú z kyseliny 2,5-oktándiéndiovej, kyseliny 1,7-oktadiéndiovej, kyseliny 2,4,6-oktatriéndiovej, kyseliny 1,3,5,7-nona-tetraéndiovej, kyseliny 2,5,8-dekatriéndiovej, kyseliny 3,6-dodekadiéndiovej, kyseliny 3,13-hexadekadiéndiovej. Uvádzajú sa farmaceutické alebo kozmetické prípravky obsahujúce nenasýtené dikarboxylové kyseliny alebo ich deriváty a spôsob prípravy nenasýtených dikarboxylových kyselín.ŕ

Description

Vynález sa týka farmaceutického alebo kozmetického prípravku, ktorý obsahuje nenasýtené dikarboxylové kyseliny, ktoré predstavujú nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny, najmä zlúčeniny C₈-C₂₂, výhodne, ale nie výlučne C₁₆ a C₁₈ nenasýtené dikarboxylové kyseliny (t. j. tie, ktoré majú 16 alebo 18 atómov uhlíka), spôsobu výroby dikarboxylových kyselín a ich použitie pri liečbe kože z medicínskeho a kozmetického hľadiska, ako napr. liečba akné a zosvetlenie pokožky.

Doterajší stav techniky

Použitie nasýtených alifatických dikarboxylových kyselín (so všeobecným vzorcom COOH(CH₂)_nCOOH) pri ošetrovaní kože z medicínskych a kozmetických príčin je známe. Napr. US 4386104 (Nazzaro-Porro) uvádza nasýtené dikarboxylové kyseliny, ktoré obsahujú 7 až 13 atómov uhlíka, s použitím pri liečbe akné a iných kožných prejavov.

Najmä C_g nasýtená dikarboxylová kyselina („kyselina azelainová“), ktorá má vzorec COOH(CH₂)₇COOH je často spomínaná pre svoju účinnosť pri liečbe akné a iných kožných defektov a pri zosvetľovaní pokožky.

Doteraz nenasýtené dikarboxylové kyseliny neboli ľahko komerčne dostupné, hoci spôsob syntézy určitých nenasýtených dikarboxylových kyselín je uvedený v EP 0229252. V skutočnosti niektoré z tejto triedy molekúl predtým opísané neboli. Akokoľvek, je známe, že niektoré nenasýtené dikarboxylové kyseliny, hlavne určité C₆, C₈, C]q a C[₂ mono-nenasýtené dikarboxyové kyseliny môžu byť detegované v moči pacientov s deficienciou stredného reťazca acyl CoA dehydrogenázy (Jin & Tsemg [1989] Joumal of Lipid Research, 30, 1612 až 1619 a Tsemg et al., [1990] Joumal of Lipid Research, 31, 763 až 771). Určité ďalšie dikarboxylové kyseliny sú uvedené v rôznych iných publikáciách.

EP 0341796 uvádza mikrobiálny spôsob použitia beta-oxidačných mutantov Candida cloacae na produkciu dikarboxylových kyselín z nasýtených mastných kyselín (monokarboxylových kyselín) alebo z triglyceridov. Súčasní vynálezcovia teraz pomocou mutantov uvedených v EPO 341796 vyrobili určité nenasýtené dikarboxylové kyseliny, z ktorých niektoré sú nové per se a zistilo sa, že majú prekvapujúco zosilnené účinky pri použití na liečbu kože pri medicínskych i kozmetických indikáciách.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje farmaceutický alebo kozmetický prípravok s obsahom jednej alebo viacerých nenasýtených alifatických dikarboxylových kyselín a/alebo derivátu nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny, derivátu obsahujúceho 15 alebo viac uhlíkových atómov v hlavnom uhľovodíkovom reťazci.

Obvykle sú takéto prípravky určené na povrchové použitie na pokožku. Nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny a ich deriváty sú bez problémov inkorporované do takých prípravkov, ktoré napr. môžu byť vo forme krémov, pleťových vôd alebo gélov. Vhodné prípravky sú odborníkom v oblasti dobre známe a sú uvedené napr. v US 4818768.

Vhodné polynenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny sú také, ktoré majú 8 až 16 uhlíkových atómov (vrátane), za vylúčenia zlúčenín, ktoré v skupine pozostávajú z: kyseliny 2,5-oktándiéndiovej; kyseliny 1,7-oktadiéndiovej; kyseliny 2,4,6-oktatriéndiovej; kyseliny 1,3,5,7-nonatetraéndiovej; kyseliny 2,5,8-dekatriéndiovej; kyseliny 3,6-dodekadiéndiovej; a kyseliny 3,13-hexadekadiéndiovej.

Zlúčeniny, ktoré sú vyššie špecificky vylúčené, sú známe z rôznych predchádzajúcich publikácií v tejto oblasti (napr. Grundman, 1937 Ber. 70B, 1148 až 1153).

Nové požadované zlúčeniny sú všetky syntetizovateľné pomocou novej metódy, čo je uvedené detailnejšie.

Uprednostňuje sa, aby zlúčeninou bola alifatická dikarboxylová kyselina s párnou dĺžkou uhlíkového reťazca. Zvlášť sú výhodné C_]6 zlúčeniny. Ďalšou výhodnou vlastnosťou je, že dvojité väzby uhlík/uhlík sú oddelené dvoma jednoduchými väzbami uhlík/uhlík (t. j. dvojité väzby môžu byť výhodne umiestnené na atómoch uhlíka 3 a 6, alebo 2 a 5, atď.), keďže takéto zlúčeniny sú najľahšie vyrobené podľa novej metódy.

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že nové nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny a nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny vôbec (špeciálne C₁₆ a C₁₈ nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny) majú oveľa väčšiu aktivitu ako ich nasýtené analógy, aj ako antimikrobiálne a kozmetické agensy.

Indikácie, s primárnou citlivosťou proti dikarboxylovým kyselinám zahrnujú: akné (US 4386104); vrásky (EP 336880); malígny melanóm (US 4818768); dermatózy (EP 229654); hyperpigmentačné dermatózy a ekzémy (US 4292326); rosaceu (EP 890308); lentigo (JP 91024412) a seborrheu (DE 3133425) a impetigo.

Podobne, sú niektoré deriváty dikarboxylových kyselín účinné aj pri liečbe určitých stavov. Tieto deriváty zahrnujú estery a soli (US 4818768) a merkapto-deriváty dikarboxylových kyselín (US 4292326). Ďalšie údaje o použití derivátov dikarboxylových kyselín možno nájsť napr. v JP 58170713, EP 0297436 a EP 0305407. Nemecká patentová prihláška č. DE 40 33 567 uvádza medzi inými monoesterové deriváty C₃-C₁₄ (hlavný uhľovodíkový reťazec) dikarboxylových kyselín (ktoré môžu byť nasýtené alebo nenasýtené) ako sebosupresívne agensy na použitie v kozmetických a farmaceutických prípravkoch na povrchové použitie vo vlasoch a na koži.

Preto na druhej strane vynález poskytuje spôsob ošetrovania kože z medicínskych alebo kozmetických dôvodov, zahrnujúc použitie nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny, derivátu s obsahom 15 alebo viac uhlíkových atómov v hlavnom uhľovodíkovom reťazci.

Termín „hlavný uhľovodíkový reťazec“, použitý vzhľadom na deriváty dikarboxylových kyselín, označuje časť molekuly umiestnenú medzi atómmi kyslíka dvoch karboxylových skupín (alebo ich derivátových zvyškov). Preto napr. deriváty vzorca R-OOC-CH2-COO-R¹ a R-OOC-CH₂-CH2-COO-R’ možno označiť, že majú C₃ a C₄hlavné uhľovodíkové reťazec.

Derivátmi môžu byť, napr. alkoholy, substituované alebo nesubstituované amidy, mono- alebo diestery (arylové alebo alkylové, najmä nižšie alkylestery).

Výhodne, nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny uvedené v tomto vynáleze, obsahujú 8 až 22 atómov uhlíka, najvýhodnejšie 16 alebo 18 atómov uhlíka. Nenasýtený derivát karboxylovej kyseliny prednostne obsahuje 16 alebo 18 atómov uhlíka v hlavnom uhľovodíkovom reťazci.

Zistilo sa, že určité nenasýtené dikarboxylové kyseliny sú zvlášť účinné proti Propionibacterium acnes (P. acnes) a Staphylococcus aureus (Staph. aureus). Preto vo vše obecnosti možno využitie vynálezu považovať za vhodné pri liečbe stavov, kde sa dokážu P. acnes a/alebo Staph. aureus, alebo sú suspektné, že sa podieľajú na príčine, pretrvávaní alebo exacerbácii tohto stavu.

Podľa vynálezu možno nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny použiť pri liečbe širokej škály kožných ochorení, ako napr. akné atď., ako je už uvedené. Podobne sa to týka derivátov, ako napr. esterov a solí, ako už bolo spomenuté.

Ďalšie stavy, ktoré môžu byť citlivé na použitie nenasýtených alifatických dikarboxylových kyselín alebo ich derivátov zahrnujú lupiny a prítomnosť telového zápachu.

Dodatočne sa dokázalo, že nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny sú prekvapujúco účinné ako inhibitory tyrozinázy a ako inhibitory syntézy melaninu v kultivovaných melanómových bunkách, v testoch použitých na skríning zlúčenín z hľadiska ich aktivity ako agensov so zosvetlujúcim účinkom na pokožku.

Vynález poskytuje spôsob na zosvetlenie pokožky, použitím nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny alebo jej derivátu.

Antimikrobiálny alebo pokožku zosvetľujúci prípravok s povrchovou aplikáciou na pokožku, sa môže vyrobiť zmiešaním účinného množstva nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny alebo jej derivátu s dermatologicky vhodným kozmetickým alebo farmaceutickým nosičom.

Vynález ďalej umožňuje použitie nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny a/alebo jej derivátu, derivátu s obsahom 15 alebo viac atómov uhlíka v hlavnom uhľovodíkovom reťazci ako účinnej terapeutickej látky.

Vynález tiež umožňuje použitie nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny a/alebo jej derivátu ako agensu so zosvetľujúcim a/alcbo antimikrobiálnym účinkom na pokožku.

Dikarboxylové kyseliny použité v prípravkoch možno pripraviť novým spôsobom, ktorý je uvedený. Alternatívne môžu byť pripravené s použitím známych spôsobov, napr. ako uvádza EP 296 506 alebo podľa Uemura et al. (1988, Proceedins of World Conference on Biotechnology for the Fats and Olil Industry, Američan Oil Chemists Society), Buhler & Schindler (1984, v Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology, Rehm & Reed (Eds.), 169, Verlag Chemie, Weinheim) alebo podľa Picataggio et al. (1992, Biotechnology, 10, 894 až 898).

Určité nenasýtené dikarboxylové kyseliny môžu byť vhodne pripravené z nenasýtených substrátov s dlhším reťazcom s použitím mutantov uvedených v EP 0341796, ktoré boli predtým použité na prípravu nasýtených zlúčenín. Preto, vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy nenasýtených dikarboxylových kyselín ohraničenou beta oxidáciou (skrátenie reťazca) nenasýtených substrátov s dlhším reťazcom s použitím kvasiniek rozmnožených v rastovom médiu.

Výhodne sú produkovanými nenasýtenými kyselinami C₈-C₂₂, najvýhodnejšie C|₆ alebo Ci₈.

Kvasinky vhodné na tento účel sú uvedené v EP 0341796 a v Casey et al., (1990), Joumal of Generál Microbiology, 136, 1197 až 1202). Takéto kmene (napr. Candida cloacae 5GLA12, skrátene „LA 12“) vykazujú ohraničenú alebo zníženú beta-oxidačnú aktivitu.

Kvasinkám sú vhodne dodávané nenasýtené mastné kyseliny vo forme esterov, prednostne ako estery triglyceridov, ako je olej. Zvlášť vhodné príklady zahrnujú nenasýtené oleje ako slnečnicový olej a olivový olej.

Výhodne sú olejmi použitými ako východiskové látky triglyceridy, v ktorých prevládajúcou nenasýtenou mastnou kyselinou s dlhým reťazcom je C₁₆.₂₂ alebo výhodnejšie zlúčenina C₂₀ alebo Ci₈. Je vhodné, aby substrát bol prevažne poly-nenasýtený. Fermentácia pomocou kvasinkových kmeňov ako LA12 môže vyústiť do vytvorenia zmesí nenasýtených dikarboxylových kyselín so skráteným reťazcom (typicky C₈-C|₈ zlúčenín). Tieto zmiešané produkty môžu byť separované na frakcie, napr. extrakciou v diferenciálnom rozpúšťadle.

Za predpokladu, že odstránenie C₂ jednotiek počas beta-oxidácie je náhodné a nevyskytuje sa žiadna izomerizácia produktov, možno predpovedať tvorbu nasledovných produktov, ak sa použije ako substrát kyselina olejová: kyselina cis-7-hexadecendiová; kyselina cis-5-tetradecendiová; kyselina cis-7-tetradecendiová; kyselina cis-3-dodecediová; kyselina cis-5-dodecendiová; kyselina cis-3-decendiová; kyselina cis-5-decendiová a kyselina cis-3-okténdiová.

Z kyseliny linolovej možno očakávať nasledovné produkty: kyselina cis-6,9-hexadekadiéndiová; kyselina cis-4,7-hexadekadiéndiová; kyselina cis-5,8-tetradekadiéndiová; kyselina cis-2,5-tetradekadiéndiová; kyselina cis-3,6-dodekadiéndiová; kyselina cis-2,5-dodekadiéndiová; kyselina cis3,6-dekadiéndiová; kyselina cis-2,5-dekadiéndiová; kyselina cis-2,5-oktadiéndiová; kyselina cis-4-decéndiová a kyselina cis-2-okténdiová.

Podobne, s použitím kyseliny linolenovej ako východiskovej látky sú predpovedanými produktmi: kyselina cis-4,7,10-hexadekatriéndiová; kyselina cis-6,9,12-hexadekatriéndiová; kyselina cis-2,5,8-tetradekatriéndiová; kyselina cis-4,7,10-tetradekatriéndiová; kyselina cis-2,5,8-dodekatriéndiová; kyselina cis-3,6-dekadiéndiová; kyselina cis-4-decéndiová; kyselina cis-2,5-oktadiéndiová; kyselina cis-4-okténdiová a kyselina cis-2-okténdiová. ,.

Zmes produktov bude vo všetkých prípadoch obsahovať malé množstvá produktov s tou istou dĺžkou reťazca, akú má východisková zlúčenina.

Skutočne, pokiaľ sú výhodnými substrátmi estery mastných kyselín (zvlášť C₁₈ estery mastných kyselín), fermentačné produkty závisia od východiskového substrátu. Preto so zmenou substrátu možno pripraviť celý rad nenasýtených dikarboxylových kyselín.

Niektoré vhodné substráty sú identifikované v EP 0 229 252 a zahrňujú C₁₀-C₂4 alkény a ďalšie nenasýtené uhľovodíky, ako nenasýtené alkanoly (hlavne C|₆,C_I8 a C₂₂nenasýtené alkanoly), zodpovedajúce monokarboxylové kyseliny alebo ich hydroxykarboxylové deriváty.

Prirodzene, kde sú východiskovými látkami trans-nenasýtcné zlúčeniny, výsledkom budú trans-nenasýtené produkty.

Je veľmi výhodné, aby kvasinky použité v procese neboli rozmnožované v podmienkach dusíkovej limitácie. Namiesto toho (na rozdiel od spôsobu opísaného v EP 0341796), kvasinka vyrastá v podmienkach, ktoré sú porovnateľne obohatené dusíkom, kde zmena pH ovplyvňuje beta-oxidačnú aktivitu organizmu skracovať reťazec.

Teda sa zistilo, že produktový profil fermentačného procesu môže byť vhodne modifikovaný zmenou pH fermentačného média počas produkcie nenasýtených dikarboxylových kyselín. Hlavne je takto možné meniť relatívne koncentrácie molekúl dikarboxylových kyselín s rozdielnou dĺžkou. Napr. znížením pH zo 7,5 na 7,1 počas fermentácie olivového oleja je možné zvýšiť relatívne množstvo C₁₂nenasýtených dikarboxylových kyselín.

Toto je významné, pretože určité frakcie fermantačných produktov môžu mať zvlášť výhodné vlastnosti pre špeciálne použitie.

SK 281584 Β6

Rozdielne frakcie rôznych produktov možno získať z kultivačného média extrakciou dietyléterom po nastavení vodnej fázy na rôzne kyslé pH.

Rozdielne aspekty vynálezu možno lepšie pochopiť uvedením nasledovných ilustračných príkladov a obrázkov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je graf vyjadrujúci koncentráciu dikarboxylovej kyseliny (g/1) v závislosti od času, s použitím slnečnicového oleja ako substrátu.

Obr. 2 graficky znázorňuje koncentráciu dikarboxylovej kyseliny (g/1) v závislosti od času, s použitím olivového oleja ako substrátu.

Obr. 3 graficky vyjadruje koncentráciu dikarboxylovej kyseliny (g/1) v závislosti od času, s použitím olivového oleja ako substrátu za zmenených podmienok pH.

Obr. 4 je stĺpcový diagram znázorňujúci percentuálne zníženie melanínu pre dikarboxylové kyseliny so stredne dlhým reťazcom, ktoré sa získali zo slnečnicového oleja.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad I

Produkcia nenasýtených dikarboxylových kyselín so stredne dlhým reťazcom pomocou fermentácie

Beta-oxidačný mutant Candida cloacae produkovaný mutagenézou s použitím nitrozoguanidínu (mutant LA12, pozri EPO 341796 a tiež Casey et al., J. Gen. Microbiol., 1990, 136, s. 1197-1202) bol použitý na prípravu C₈-C₁₄nenasýtených dikarboxylových kyselín z triglyceridov, ako jc olivový a slnečnicový olej, ktoré obsahujú vysoké hladiny nenasýtených mastných kyselín.

Ako je uvedené nižšie, bolo použité chemicky definované médium:

Cukróza (NH₄)₂HPO₄

KH₂PO₄ g/1 g/1

6.4 g/1

1.5 g/1 až 40 mg/1

Na₂SO₄

Triglycerid (napr. olivový alebo slnečnicový olej autokláv min. pri

121 °C

ZnSO₄.7 H₂O	20 mg/1
MnSO₄.4 H₂O	20 mg/l
FeSO₄.7H₂O	20 mg/1
MgCl₂.6 H₂O	2 g/1
Biotin	100 mg/1
Pantotenát	6 mg/1
Tiamín	8 mg/1
Kyselia nikotínová	30 mg/1
Pyridoxín	20 mg/1

Fermentačne podmienky boli:

sterilizovať filter a „ aseptický pridať keď ferment vychladne

Rastové pH

Produkčné pH

Teplota

Aerácia

Rýchlosť miešadla Fermentačný objem Inokulum

6,8

7.4 až 7,5 °C

0,1 v/v/m vzduchu

800 až 1000 ot za min.

2.5 1

2% udržiavané samopridávaním 10 N NaOH

Typ fermentátora: LSL s rozrušovačom peny

Médium (2,5 1) bolo inokulované s 2 % (v/v) 24 hodinovej kultúry beta-oxidačného mutantu LA 12 Candida cloacae, vyrastenej na médiu pozostávajúcom z kvasinkového extraktu (5 g/1), cukrózy (10 g/1), peptónu (5 g/1). Kultúra rástla 20 hodín pri pH 6,8, potom sa pridalo 20 ml/1 oleja a pH sa zvýšilo na 7,4 až 7,6, aby sa iniciovala produkcia nenasýtených dikarboxylových kyselín so stredným reťazcom. Olejom bol alebo slnečnicový olej alebo olivový olej purifikovaný oxidom kremičitým. Počas tvorby dikarboxylových kyselín sa hodnota RQ (respiračný kvocient) znížila asi na 0,6. Podiely (10 až 20 ml) fermentačného rastového média sa odoberali denne na lipidovú analýzu a olej sa dopĺňal podľa potreby.

Fermentácia bola zozbieraná po 8 až 12 dňoch, keď bola produkcia ukončená.

Nenasýtené dikarboxylové kyseliny boli izolované z fermantačných médií acidifikáciou na pH 6 pomocou HC1, potom extrakciou dietyléterom, aby sa izolovala frakcia C₁₂-Ci₄. Rastové médium bolo potom ďalej acidifikované HC1 asi na pH 2,0 a pokračovalo sa v extrakcii dietyléterom, aby sa izolovala frakcia C_g-C_l0. Na izoláciu zmesi kyselín bolo pH rastového média znížené zo 7,5 na približne 2,0 v jednom kroku a potom bolo extrahované dietyléterom.

Rozpúšťadlo bolo z frakcií dikarboxylových kyselín odstránené rotačným odparovaním.

Časový priebeh produkcie nenasýtených dikarboxylových kyselín zo slnečnicového oleja (SPO) a olivového oleja purifikovaného kysličníkom kremičitým (OO) znázorňujú obr. 1 a 2.

Obr. 1 znázorňuje produkciu C₈-Ci₄ nenasýtených dikarboxylových kyselín jednotlivo a celkovo, s použitím olivového oleja ako substrátu. Rýchlosť produkcie nenasýtených dikarboxylových kyselín so strednou dĺžkou reťazca sa výrazne zvýšila medzi 3. a 4. dňom, ale málo sa znížila na 8. deň, takže od toho času bola koncentrácia dikarboxylových kyselín viac menej konštantná.

Obr. 2 znázorňuje produkciu C₈-C₁₄ nenasýtených karboxylových kyselín jednotlivo a celkovo, s použitím olivového oleja ako substrátu. V tomto prípade rýchlosť produkcie dikarboxylových kyselín vykazovala menej náhle zvýšenie, ale pokračovala v zvyšovaní 8. deň.

V oboch prípadoch, dlhšie dikarboxylové kyseliny (C₁₄, C₁₂) predstavovali väčšie percento z celku ako dikarboxylové kyseliny s kratším reťazcom (C_lo, C_g), hoci presný profil produktu bol pri dvoch použitých substrátoch rozdielny (napr. relatívne viac C_lo produktu sa získalo použitím slnečnicového oleja ako substrátu).

Tieto údaje sú tiež prezentované v tabuľkovej forme v tabuľke I.

Príklad II

Použitie pH na zmenu profilu produktu

Pri pH 7,4 až 7,6 počas produkcie je prevládajúcim druhom z olejov (napr. olivového oleja) s obsahom C₁₈ nenasýtených mastných kyselín Cj₄ nenasýtená dikarboxylová kyselina.

Akokoľvek, ak sa pH počas produkcie zníži zo 7,4 až 7,6 na asi 7,1, je prevládajúcim druhom C₁₂ nenasýtená dikarboxylová kyselina. Fermentácia bola vykonávaná, ako je detailne uvedené v spomenutých príkladoch, až po 8. deň fermentácie, keď sa pH znížilo na 7,1, čo sa prejavilo ako „tum-over“ (zvrat) Cj₄ druhu a ako zvýšenie C₁₂ produkcie. Výsledky sú uvedené na obr. 3.

Tabuľka I

Čas fermentácie (dni)	Dikarboxylové kyseliny (g/1)
C]₄	C]2	C₁₀	c₈	spolu C₈-Ci₄
	SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO	SFO	OO
2	1,7	0,6	0,5	0,2	0,2	-	0,1	-	2,5	0,8
3	2,7	1,5	0,9	0,4	0,6	0,1	0,2	0,1	4,1	2,1
4	5,7	3,0	2,3	0,9	1,8	0,2	0,6	0,2	10,4	4,3
5	7,4	3,9	3,4	1,3	2,6	0,3	0,8	0,2	14,2	5,7
6	8,4	5,1	4,2	3,7	3,2	0,7	1,0	0,4	16,8	8,9
7	8,4	6,8	4,5	3,6	3,5	1,0	1,1	0,6	17,5	12,0
8	8,7	8,8	4,7	5,1	3,4	1,2	1,3	0,8	18,1	15,9

Obr. 3 vyjadruje produkciu C₈-C₁₆ nenasýtených dikarboxylových kyselín jednotlivo a celkovo, s použitím olivového oleja ako substrátu, kde pH je 8. deň nastavené na 7,1 zo 7,5. Ako bolo uvedené na obr. 2, celková produkcia dikarboxylových kyselín pokračuje v náraste po 8. dni, keď sa ako substrát použije olivový olej. Akokoľvek, profil produktu je významne ovplyvnený. Do 8. dňa koncentrácia C₁₄ dikarboxylovej kyseliny pokračovala v náraste, a táto bola najkoncentrovanejšou produkovanou dikarboxylovou kyselinou. Avšak potom, v podmienkach redukovaného pH, začala koncentrácia klesať, zatiaľ čo C_!2 produkt pokračoval v náraste koncentrácie, takže po 10. dni predstavovala C₁₂ dikarboxylová kyselina hlavný produkt.

Tieto údaje sú tiež uvedené v tabuľkovej forme v tabuľke II.

Tento experiment ukazuje, že profil produktu možno do istej miery regulovať pomocou pH pri produkcii. Rýchlosť produkcie C₈-C₁₆ dikarboxylových kyselín zostáva v podstate po zmene pH pri produkcii lineárna.

Príklad III

Test inhibície tyrozinázy

Inhibícia aktivity tyrozinázy sa používa na identifikáciu potenciálnych látok bieliacich pokožku. Testy inhibície tyrozinázy sa vykonávali podľa metód Humada and Mishima (Br. J. Derm. (1972), 86, str. 385 až 394.

Všetky roztoky boli čerstvo pripravované s použitím 0,1 M pufra fosforečnanu sodného (pH 6,8) ako rozpúšťadla.

Roztoky zahrnovali:

mM inhibičný zásobný roztok: z neho sa urobila séria riedení, aby sa získali nasledovné koncentrácie 4,0, 0,4 a 0,04 mM inhibítora.

Tabuľka II

Fermentačné dni	Dikarboxylové kyseliny (g/1)	spolu
	Cl6	C₁₄	C12	Cjo	c₈	C₈-C_]6
1	0,1	0,6	0,1	0	0	0,8
2	0,52	0,7	0,2	0	0	1,24
3	0,9	1,5	0,4	0,1	0,1	3,0
4	1,6	3,0	0,9	0,2	0,1	5,8
5	2,1	4,4	1,3	0,3	0,2	8,3
6	1,5	5,5	2,7	0,7	0,4	10,8
7	0,6	7,1	3,6	1,0	0,6	12,9
8	0,6	8,8	5,1	1,4	0,8	16,7
9	0,4	8,2	6,1	1,9	0,9	17,5
10	0,13	8,2	8,0	2,3	1,2	21,0
11	0,25	8,0	9,6	3,1	1,4	22,35
12	0,1	7,5	10,6	3,6	1,5	23,2
13	0,1	6,8	12,2	4,3	1,8	25,2

Roztok soli: obsahuje síran meďnatý (100 JM) a chlorid horečnatý (100 mM).

Roztok enzýmu: 1 ml tyrozinázy z húb (2000 až 4000 jednotiek/ml), a roztok substrátu: 48 mg dihydroxyfenylalanínu (DOPA)/100 ml.

Roztoky enzýmu a DOPA boli pripravené tesne pred použitím, pretože sú fotosenzitívne.

Inhibícia tyrozinázou katalyzovanej oxidácie DOPA dikarboxylovými kyselinami bola sledovaná spektrofotometricky monitorovaním tvorby dopachrómu pri vlnovej dĺžke 492 nm. Reakcia bola vykonávaná na 96-jamkových mikrotitračných platniach s pridaním 30 TI inhibítora (alebo pufra ako kontroly), 50 fl pufra a 20 TI roztoku soli. DOPA (50 TI) bol pridaný, aby sa začala reakcia a každá platňa bola trepaná 30 sekúnd. Po 10 mi nútach sa pomocou čítača mikrotitračných platní (Titertek Multiscan) odčítala absorbancia.

Výsledky testu inhibície tyrozinázy ukázali, že podobne ako kyselina azelainová (nonandiová), boli nenasýtené dikarboxylové kyseliny so stredne dlhým reťazcom efektívnymi inhibítormi tyrozinázy, vykazujúcimi minimálne 50%-nú inhibíciu enzýmovej aktivity pri lOmM koncentrácii. Toto je prekvapujúce, pretože kyselina azelainová je nasýtená dikarboxylová kyselina, a preto má výrazne rozdielne vlastnosti. Preto kyselina azelainová je pri izbovej teplote tuhá kryštalická látka, kým C₈/C_lo nenasýtené dikarboxylové kyseliny sú olejovité látky s nízkym bodom topenia.

Je možné, že enzým tioredoxínreduktáza je významnejším enzýmom ako tyrozináza vo vzťahu k inhibícii kožnej pigmentácie sprostredkovanej dikarboxylový mi kyselinami. Výskum v poslednom čase (Fitton & Goa v Drugs, 41, (5), str. 780 až 798 (1991) ukázal, že kyselina azelainová inhibuje tioredoxínreduktázu. Vo svetle týchto výsledkov by preto podľa tejto špecifikácie skúsený pracovník mohol očakávať, že nenasýtené dikarboxylové kyseliny môžu takisto inhibovať tento enzým.

Príklad IV

Inhibícia produkcie melanínu

V ďalšom teste v doplnku k príkladu III boli sledované účinky nenasýtených dikarboxylových kyselín na kultúry melanocytov in vitro.

Bunky produkujúce pigment, derivované z cicavčieho melanómu, boli vykultivované štandardnými metódami. Výhodnými bunkovými líniami sú BI6 (uvedené v EP 0 338 104) alebo S-91 (napr. ATCC CCL 51.3, kloň M-3) bunky, ale možno tiež použiť iné línie alebo primárne myšie alebo ľudské melanocyty.

Melanómové bunky vyrástli v kompletnom bunkovom kultivačnom médiu (tak ako je opísané v EP 0 308 919) približne v 1/3 splývajúco. Prípravok, ktorý mal byť testovaný, bol potom pridaný ku kultivačnému médiu.

Bunky boli kultivované ďalšie 4 dni a množstvo vyprodukovaného melanínu sa testovalo meraním absorbancie celkového melanínu extrahovaného z kultivačného média a zo zberových buniek pri 540 nm.

Uvedený spôsob bol použitý na stanovenie schopnosti prípravkov s obsahom nenasýtených dikarboxylových kyselín (C_l2-C₁₄ frakcia, C₈._lo frakcia alebo zmes kyselín), pri 0,1 mM alebo 1,0 mM, redukovať množstvo melanínu produkovaného kultúrami melanocytov, vo vzťahu k negatívnej kontrolnej kultúre. Koji-kyselina (látka používaná ako prostriedok na zosvetlenie pokožky) bola použitá ako pozitívna kontrola. Výsledky znázorňuje obr. 4, ktorý je stĺpcovým diagramom ukazujúcim percento redukcie melanínu v ošetrovaných kultúrach v porovnaní s neošetrovanou kontrolou.

Zistilo sa, že rôzne frakcie dikarboxylových kyselín mali v podstate podobné vlastnosti vzhľadom na sledovaný aspekt.

Príklad V

Stanovenie antimikrobiálnej aktivity

Minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) každej z rozličných zmesí nenasýtených dikarboxylových kyselín bola stanovená v prítomnosti a neprítomnosti 10% Intralipidu (Kabi Pharmacia, Inc.) s použitím agarovej dilučnej techniky pre citlivosť 32 kmeňov Propionibacterium acnes a 32 kmeňov rôznych rodov aeróbnych baktérií. Metóda bola použitá, ako je uvedené nižšie. 5 %-ný zásobný roztok pre každý agens bol pripravený pridaním 10 g dikarboxylovej kyseliny k 200 ml v dvojnásobnom tryptickom sójovom bujóne (TSB), (Baltimore Biological Laboratories). pH každého roztoku bolo upravené na 7,0 Ž 0,2 hydroxidom sodným.

Pre každú organickú kyselinu boli 2 sady 200 ml baniek označené 1 až 9. Ku každej banke sa pridalo 50 ml dvojnásobného TSB. Z 5% zásobného roztoku sa 50 ml TSB prenieslo do baniek č. 1 a č. 2. Sériové prenosy 50 ml sa previedli z banky č. 2 až do banky č. 8. Banka č. 9 v každom sete obsahovala iba 50 ml dvojnásobného TSB bez akejkoľvek dikarboxylovej kyseliny. Do všetkých 18 baniek sa pridali 2 g granulovaného agaru (BBL).

Všetky banky boli autoklávované pri 121 °C, 105 kPa, 15 minút a potom sa udržiavali na vodnom kúpeli pri 50 °C.

K jednej sade baniek č. 1 až č. 9 sa pridalo 50 ml horúcej, sterilnej vody. Banky boli trepané, aby sa zmiešali obsahy a 25 ml z každej sa vlialo do 4 Petriho misiek a nechalo sa stuhnúť. K druhému setu baniek sa pridalo 50 ml Intralipidu (predhriateho na 50 °C). Obsahy boli potom zmiešané a vliate, ako je uvedené.

Štandardné inokulá z testovacích organizmov boli pripravené pomocou spojenia bakteriálnej suspenzie v 0,85% PSS (fyziologický roztok) s 0,5 McFarland štandardom a boli desať násobne zriedené, aby sa získalo 10⁷CFU (jednotiek tvoriacich kolónie). Inokulá boli nadávkované do 32 jamiek miešacieho replikátora. Viachrotový inokulátor uvoľňuje 0,001 až 0,002 ml, čo predstavuje vo finálnom inokule 10⁴ CFU na kvapku.

Platne boli inokulované od najnižšej po najvyššiu koncentráciu (aby sa znížili účinky „carry over“ inokulá), a nechali sa vysušiť. Platne boli potom invertované a inkubované pri 35 °C 24 hodín. Platne inokulované kmeňmi Propionibacterium acnes boli inkubované za anaeróbnych podmienok 7 dni pri 35 °C.

Kontrolné platne bez agensu (č. 9) boli hodnotené na konci inkubácie na životaschopnosť a známky kontaminácie. Konečné MIC hodnoty boli stanovené pozorovaním platne s najnižšou koncentráciou agensu, ktorý viditeľne inhiboval rast mikroorganizmu.

Výsledky sú sumarizované v tabuľke III, ktorá uvádza MIC pre nenasýtené dikarboxylové kyseliny so strednou dĺžkou reťazca („Zmiešané dikarboxylové kyseliny“, t. j. C_s-C|₄ zmiešané dikarboxylové kyseliny), pre C]₂ obohatenú frakciu a pre C_t8:i mono-nenasýtenú zlúčeninu, v porovnaní s kyselinou azelainovou, pre rôzne mikroorganizmy. Dáta predstavujú výsledky experimentov, ktoré boli vo všeobecnosti vykonávané na niekoľkých rôznych kmeňoch každého druhu (napr. P. acnes kmene ATCC 6919 a 29399 [ATCC štandardy pre americkú typizačnú zbierku kultúr]; kmene Staph. aureus ATCC 25923, 35556 a 29213; Staph. epidermidis ATCC 35984, 31432 a 14490; Micrococcus sedentarius ATCC 27574; M. luteus ATCC 27141, 9341 a 15957; Brevibacterium epidermidis ATCC 35514; Corynebacterium minutissium ATCC 23347, 23348 a 23349).

Prítomnosť alebo neprítomnosť „Intralipidu“ nemala žiadny významný účinok. Malý rozdiel bol zistený iba pre C₁₈ j mono-nenasýtenú zlúčeninu, kde boli náznaky, že intralipid zvyšoval MIC pre Staph. aureus a znižoval MIC pre P. acnes a M. luteus.

P. acnes je hlavným agensom spôsobujúcim akné, preto účinnosť proti tomuto organizmu naznačuje použiteľnosť pri prevencii a liečbe akné. Staphylococcus aureus je patogénny grampozitívny organizmus obvykle súvisiaci s vredmi a abscesmi. Candida albicans predstavuje rezistentnú kvasinku zahrnutú ako negatívna kontrola. Pseudomonas aeruginosa a Escherichia coli sú obidve bežnými gramnegatívnymi organizmami.

Neočakávane, vo všetkých prípadoch boli nenasýtené dikarboxylové kyseliny (stredného reťazca aj C₁₈ zlúčeniny) účinnejšie ako kyselina azelainová. Zlúčeniny boli zvlášť účinné proti P. acnes, Staph. aureus a Staph. epidermidis. Zvlášť zlúčenina C_;8 vykazuje antimikrobiálnu aktivitu mnohonásobne vyššiu ako kyselina azelainová.

Tabuľka III

MIC test agarovej difúzie pre kyselinu azelainovú k nenasýteným dikarboxylovým kyselinám.

Reťazec	Zdroj	Dikarboxylové kyseliny (MIC %)
		Azelainová kysel.	Zmiešané diové kys. ex. olív, olej	C₁₂ mononenasýtené diové kys. ex. olivový olej	Zmieš. diové kyseliny ex. slnečníc, olej	C_ls.) diová kyselina ex. olejová kyselina	C_18:1 diová kys. ex. olejová kys. + „Intralipid“
Propionibacterium acnes	ATCC 6919	1,25	0,31	0,31	0,31	0,04	0,02
Propionibacterium acnes	ATCC 29399	1,25	0,31	0,31	0,62	0,04	0,02
Staphylococcus aureus	ATCC 25923	2,5	0,62	1,25	1,25	0,07	0,15
Staphylococcus aureus	ATCC 35556	2,5	0,31	0,31	0,62	0,07	0,31
Staphylococcus aureus	ATCC 29213	2,5	1,25	0,62	2,5	0,15	0,31
Staphylococcus epidermidis	ATCC 35894	>2,5	1,25	0,62	2,5	0,31	0,31
Staphylococcus epidermidis	ATCC 31432	>2,5	1,25	0,62	2,5	0,31	0,31
Staphylococcus epidermidis	ATCC 14490	>2,5	1,25	0,62	2,5	0,31	0,31
Micrococcus sedentaris	ATCC 27574	2,5	0,15	0,62	0,62	0,15	0,07
Micrococcus luteus	ATCC 27141	2,5	0,15	0,62	0,62	0,15	0,07
Micrococcus luteus	ATCC 9341	>2,5	1,25	0,62	0,62	0,15	0,07
Micrococcus luteus	ATCC 15957	>2,5	1,25	0,62	0,62	0,15	0,07
Brevibacterium epidermidis	ATCC 35514	>2,5	0,62	0,62	0,62	0,15	0,15
Brevibacterium epidermidis	NCDO 2285	>2,5	0,62	0,62	0,62	0,15	0,15
Corynebacterium minutissium	ATCC 23347	>2,5	0,62	0,62	0,62	0,15	0,15
Corynebacterium minutissium	ATCC 23348	>2,5	0,62	0,62	0,62	0,15	0,15
Corynebacterium minutissium	ATCC 23349	>2,5	0,62	0,62	0,62	0,15	0,15
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 27853	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5
Escherichia coli	ATCC 25922	2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5
Candida albicans	ATCC 18804	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5	>2,5

Podobný experiment bol vykonaný s použitím tej istej metódy, aby sa porovnal stupeň inhibičnej aktivity (pre P. acnes) azelainovej kyseliny, C_lg:1 dikarboxylovej kyseliny (získanej zo substrátu s obsahom kyseliny olejovej), zmesi C_I81 mastnej (monokarboxylovej) kyseliny, zodpovedajúcich C_]8:l a C_l8:2 dikarboxylových kyselín (získaných zo substrátu s obsahom kyseliny linolovej), a C_16:i dikarboxylovej kyseliny (získanej zo substrátu s obsahom kyseliny palmitolejovej). Výsledky sú uvedené v tabuľke IV. MIC pre kyselinu azelainovú a C_ls, dikarbo xylovú kyselinu sú v podstate rovnaké ako predtým, čo potvrdzujú predchádzajúce výsledky. Zodpovedajúca mastná kyselina mala veľmi nízku aktivitu. C|_8;i dikar- i boxylová kyselina mala potom takmer lOOx vyššiu účin- .· nosť ako kyselina azelainová, hoci ekvivalentná mastná r: kyselina (kyselina olejová) je menej aktívna ako kyselina j; azelainová.

V 4. pokuse bol stupeň inhibície kyseliny azelainovej ako kontroly, a preto tiež testovacích vzoriek mierne menší ako v predchádzajúcich experimentoch.

Tabuľka IV

MIC pre dikarboxylové kyseliny s dlhým reťazcom proti P. acnes ATCC 25746 proti kyseline azelainovej a olejovej ako kontrolám

Testovací materiál	MIC (%)
Expt. 1	Expt. 2	Expt. 3	Expt. 4
Azelainová kyselina (kontr)	5	5	5	>5
C_lS:i mastná kyselina	nd	nd	>5	nd
C_18:1 diová kyselina ex. olejová kyselina	0,04	0,04	0,04	0,08
Cis^ig i diová kyselina ex. 60% linolová kyselina	nd	nd	nd	0.08
C₁₆j diová kyselina ex. palmitolejová kyselina	nd	nd	nd	0,16

V pokuse 4 bol stupeň inhibície kyseliny azelainovej ako kontroly, a preto aj testovacích vzoriek mierne nižší, ako sa zistilo predtým. Najpravdepodobnejšie je to zapríčinené časom inkubácie 18 dní oproti 7 dňom v predchádzajúcom pokuse.

Claims

1. Farmaceutický alebo kozmetický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nenasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny a/alebo derivát nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny, ktorý ob sahuje 15 alebo viac atómov uhlíka v hlavnom uhľovodíkovom reťazci.

2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nenasýtená alifatická dikarboxylová kyselina obsahuje 8 až 22 atómov uhlika (vrátane) a/alebo derivát je derivátom nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny obsahujúcej 15 až 22 atómov uhlíka (vrátane) v hlavnom uhľovodíkovom reťazci.

3. Prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje C₁₆ alebo C₁₈ dikarboxylové kyseliny a/alebo ich deriváty.

4. Prípravok podľa nároku 1, 2 alebo 3 na použitie na potláčanie mikroorganizmov.

SK 281584 Bft

5. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 4 na použitie na potláčanie Propionibacterium acnes a Staphylococcus aureus.

6. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 5 na použitie na zosvetlenie pokožky.

7. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že derivátom dikarboxylovcj kyseliny je alkohol, substituovaný alebo nesubstituovaný amid, soľ, alebo nižší alkylester.

8. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že je vhodný na povrchovú aplikáciu na pokožku.

9. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že obsahuje od 0,001 do 20 % hmotnostných nenasýtenej dikarboxylovej kyseliny a/alebo jej derivátu.

10. Prípravok podľa hociktorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že obsahuje od 0,01 do 1 % hmotnostných nenasýtenej dikarboxylovej kyseliny a/alebo jej derivátu.

11. Použitie prípravku podľa hociktorého z nárokov 1 až 10 na prípravu liečiva na liečenie ľudskej pokožky z lekárskych a kozmetických dôvodov.

12. Použitie podľa nároku 11 na prípravu liečiva na kauzálne liečenie stavov pretrvávajúcich alebo exacerbovaných Propionibacterium acnes a/alebo Staphylococcus aureus.

13. Použitie podľa nároku 11 alebo 12 na prípravu liečiva na liečenie jedného alebo viacerých z nasledovných stavov: akné, vrásky, malígny melanóm, dermatóza, hyperpigmentačná dermatóza, ekzém, rozacea, lentigo, mazotok, impetigo, lupiny a telový zápach.

14. Použitie prípravku podľa hociktorého z nárokov 1 až 10 na zosvetlenie pokožky.

15. Spôsob prípravy nenasýtenej alifatickej dikarboxylovej kyseliny s požadovanou dĺžkou reťazca, ktorá sa nachádza vo farmaceutickom alebo kozmetickom prípravku podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že čiastočná beta oxidácia nenasýteného alifatického substrátu s väčšou dĺžkou reťazca než je požadovaná dĺžka nenasýtených alifatických dikarboxylových kyselín sa uskutočňuje prostredníctvom kvasiniek množiacich sa v rastovom médiu.

16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že oxidácia sa uskutočňuje prostredníctvom kmeňa Candida albicans 5GLA12.

17. Spôsob podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúci sa tým, že substrát obsahuje C₁₆-C₂₂nenasýtenú zlúčeninu.

18. Spôsob podľa nároku 15, 16 alebo 17, vyznačujúci sa tým, že substrát obsahuje kyselinu olejovú, linolovú, linolenovú a arachidonovú.

19. Spôsob podľa hociktorého z nárokov 15 až 18, vyznačujúci sa tým, že substrát obsahuje triglycerid.

20. Spôsob podľa hociktorého z nárokov 15 až 19, vyznačujúci sa tým, že substrát obsahuje olivový, slnečnicový alebo ricínový olej.

21. Spôsob podľa hociktorého z nárokov 15 až 20, vyznačujúci sa tým, že rast kvasiniek sa reguluje dusíkovou limitáciou.

22. Spôsob podľa hociktorého z nárokov 15 až 21, vyznačujúci sa tým, že produktový profil dikarboxylovej kyseliny počas výroby sa reguluje zmenou pH.

4 výkresy

-K—

SPOLU ~^C1lf

Obr. 1

SK 281584 Β6

SPOLU

Obr. 2

SK 281584 Β6

ČAS (DNI)

SPOLU (j -c*

Obr. 3

REDUKCIA V MELANÍNE m o m o m o m o

CD (*) C9 fxj — —

Obr. 4