JPH08502054A - 不飽和脂肪族ジカルボン酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示されたものは、2，5-オクタジエンニ酸、1，7-オクタジエン二酸、2，4，6-オクタトリエン二酸、1，3，5，7-ノナテトラエン二酸、2，5，8-デカトリエン二酸、3，6-ドデカジエン二酸及び3，13-ヘキサデカジエン二酸から成る群における化合物を除いた、８乃至16の炭素原子を有する特定の新規な多不飽和二酸である。又、不飽和二酸及び特定のその誘導体を含む医薬用又は美容用組成物も開示されている。又、ヒトの皮膚を処理する方法及び不飽和二酸を生成する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 不飽和脂肪族ジカルボン酸発明の分野 本発明は、不飽和の二酸、即ち、不飽和の脂肪族ジカルボン酸、特にＣ₈−Ｃ_{2 2} 化合物、特にしかし他を排除するものではないが、Ｃ₁₆−Ｃ₁₈不飽和二酸（即 ち、16又は18の炭素原子を有する二酸）に関し、そして特定の新規なＣ₈−Ｃ₁₆ 二酸、二酸を製造する方法及び、ざ瘡の治療及び皮膚の白くするような、医療及 び美容の目的での皮膚の処理における使用に関する。発明の背景 医療及び美容の目的で皮膚の処理用の飽和二酸（一般式、COOH（CH₂）_nC00Hを 有する）を使用することは知られている。例えば、米国特許第4386104号［ナザ ロ−ポロ（Nazzaro-Porro）には、ざ瘡及びその他の皮膚のコンディションの処 理用の、７乃至13の炭素原子を有する飽和二酸が開示されている。 特に、式、COOH（CH₂）₇C00Hを有するＣ₉飽和二酸（「アゼライン」酸）が、 ざ瘡及びその他の皮膚のコンディションの処理及び皮膚の色を白くすることにお いて有効であるとしばしば引用されている。 欧州特許第0229252号に特定の不飽和二酸を合成する方法が開示されているが 、現在に至るまで、不飽和二酸は、容易に商業的に入手できていない。実際、い くつかのこの種類の分子は以前には記載されていない。しかし、特定の不飽和二 酸、特に特定のＣ₆、Ｃ₈、Ｃ_IO及びＣ₁₂モノ不飽和二酸は、中鎖アシルＣｏＡデ ヒドロゲナーゼ欠損症患者の尿において検知されることが知られている［Jin及 びTserng（1989年）、Journal of Lipid Research）30巻、1612-1619頁及びTser ngらによる（1990年）、Journal of Lipid Research 31巻、763-771頁］。 特定のその他の不飽和二酸ば種々の他の刊行物に開示されている。 欧州特許第0341796号には、長鎖飽和脂肪酸（モノカルボン酸）又はトリグリ セリドからの飽和二酸の生成用のカンジダ・クロアカエ（Candida cloacae）β −酸化株を用いる微生物経路が開示されている。本発明者らは、欧州特許第 0.341796号に開示された株を用いて特定の不飽和二酸を生成し、そのいくつかは それ自体新規であり、医療の及び美容の目的での皮膚の処置用の予期せず増大さ れた特性を有することを見出だした。発明の概略 第一の面において、本発明は、８乃至16の炭素原子を有し、2，5-オクタジエ ン二酸、1，7-オクタジエン二酸、2，4，6-オクタトリエン二酸、1，3，5，7-ノ ナテトラエン二酸、2，5，8-デカトリエン二酸、3，6-ドデカジエン二酸及び3， 13-ヘキサデカジエン二酸から成る群における化合物は除く多不飽和二酸（すな わち、２以上の炭素／炭素二重結合を有する二酸）を供給する。 上記のように、特定して除いた化合物は、種々の先行技術の刊行物（例えば、 Grundmanによる1937 Ber．70B、1148-1153）により公知である。 請求の範囲に記載された新規な化合物は、すべて後に詳しく記載する新規な方 法により合成される。 その化合物は、偶数の長さの炭化水素鎖を有する二酸が好ましい。特に好まし い化合物は、Ｃ₁₆化合物である。 他の好ましい特徴は、新規な方法により最も容易に生成される場合、炭素／炭 素二重結合が２つの炭素／炭素単結合によって分離されている（即ち、二重結合 は好ましくは炭素原子３及び６又は、２及び５等に位置している） 本発明者らは、予期しないことに、新規な不飽和の二酸そして、実際に不飽和 の二酸（特にＣ₁₆及びＣ₁₈の不飽和な二酸）は一般的にその対応する飽和な二酸 よりも抗菌剤としてそして美容剤としてずっと大きな活性を有することを見出だ した。 先行技術により、二酸を用いて処理することができる症状には、ざ瘡（米国特 許第4,386,104号）、皺（欧州特許第336880号）、悪性黒色腫（米国特許第4,848 ,768号）、皮膚病（欧州特許第229,654号）、高色素皮膚病及び湿疹（米国特許 第4,292,326号）、酒さ（欧州特許第890308号）、ほくろ（日本特許第91024412 号）及び脂漏症（ドイツ特許第3133425号）及び膿痂疹が含まれることが教示さ れている。 同様に、先行技術には、いくつかの二酸誘導体もある症状の治療に有効である ことが教示されている。そのような化合物には、二酸のエステルと塩（米国特許 第4818768号）及び二酸のメルカプト誘導体（米国特許第4292326号）が含まれて いる。二酸誘導体の用途についての他の文献には、例えば日本特許第58170713号 、欧州特許第0297436号及び欧州特許第0305407号が見出だされる。独国特許出願 第4033567号には、毛髪及び皮膚における局所的使用に関する美容用途又は医薬 用途の皮脂抑制剤（sebosuppresive agents）として、特にＣ₃−Ｃ₁₄（炭化水素 主鎖）二酸（飽和又は不飽和）のモノエステル誘導体が開示されている。 本発明の第二の面において、不飽和二酸及び／又は、炭化水素主鎖において15 以上の炭素原子を有する、不飽和二酸の誘導体の使用から成る医療目的又は美容 目的のためにヒトの皮膚を処理する方法を提供する。 二酸誘導体に関して用いられる「炭化水素主鎖」という用語は、２つのカルボ ン酸基（又はその誘導残基）の酸素原子間に位置する分子のその部分に言及する ものである。従って、例えば、式、R-OOC-CH₂-COOR¹及びR-OOC-CH₂-CH₂-COOR¹は 、それぞれＣ₃及びＣ₄の炭化水素主鎖を有すると記載される。 その誘導体は、例えば、アルコール、置換又は非置換アミド、モノ−又はジー エステル（アリール又はアルキル、特に低級アルキルエステル）である。 好ましくは、本発明の方法に使用される不飽和二酸は、８乃至22の炭素原子、 最も好ましくは16又は18の炭素原子を有する。不飽和二酸誘導体は、好ましくは 炭化水素主鎖に16又は18の炭素原子を有する。 特定の不飽和二酸は、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacteriu m acnes）（P．acnes）及びスタフイロコツカス・アウレウス（Staphylococcus aureus ）（Staph．aureus）に対して特に活性であることが見出だされた。従っ て、本発明の方法は、又、プロピオニバクテリウム・アクネ及び／又はスタフィ ロコッカス・アウレウスがその症状の原因、維持又は悪化に関与していることが 知られている又は疑われる症状を治療するのに有用であることがわかる。 本発明により、不飽和二酸を、先行技術に関連して先に論じたざ瘡等のような 広範の皮膚症状の処理に用いることができる。同様に、誘導体に関する言及は先 行技術に関連して論じたように、エステル及び塩のような誘導体を指すことを意 図している。 不飽和二酸又はそれらの誘導体の使用により改良が可能な他の症状には、ふけ 症及び体臭の存在が含まれる。 その他に、本発明者らは、皮膚の色を白くする物質としての活性に関して化合 物を予備選別するのに用いられた試験において、不飽和二酸が、予期しないこと に、チロシナーゼの阻害剤としてそして、培養された黒色腫細胞によるメラニン 合成の阻害剤として有効であることが見出だされた。 従って、本発明は、第三の面において、不飽和二酸又はそれらの誘導体を用い ることを含む皮膚の色を白くする方法に関する。 第四の面において、本発明は１つ以上の不飽和二酸及び／又は、炭化水素主鎖 において15以上の炭素原子を含む不飽和二酸の誘導体を含む医薬組成物又は美容 組成物を提供する。 典型的に、そのような組成物は皮膚への局所的使用に処方される。不飽和二酸 及びそれらの誘導体は、例えば、クリーム、ローション又はゲルの形態をとる組 成物に容易に混合される。適する配合は、当業者に公知であり、例えば米国特許 第4818768号に開示されている。 従って、本発明のその他の面は、有効量の不飽和二酸又はそれらの誘導体に皮 膚科学的に容認できる美容用又は医薬用担体を混合することを含む、皮膚に局所 的に使用するための抗菌組成物又は皮膚の色を白くする組成物をつくる方法を提 供する。 本発明はさらに、活性な治療物質として、不飽和二酸及び／又は、炭化水素主 鎖に15以上の炭素原子を有する不飽和二酸の誘導体の使用を提供する。 本発明は又、皮膚の色を美白剤及び／又は抗菌剤として不飽和二酸又はそれら の誘導体の用途を提供する。 そのような組成物において用いられる二酸は、下記の新規な方法により製造さ れ得る。その代わりとして、それらは例えば欧州特許第0296506号に開示された 又は、ウエムラ等［1988年、プロシーディングス・オブ・ワールド・カンファレ ンス・オン・バイオテクノロジー・フォー・ザ・ファッツ・アンド・オイル・イ ンダストリー（Proceedings of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oil Industry）、アメリカン・オイル・ケミスト・ソサイエティー（A merican Oil Chemists Society）］、ブフラー（Buhler）及びシンドラー（Shin dler）［1984年、アリファティック・ハイドロカーボンズ・イン・バイオテクノ ロジー（Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology）、レーム（Rehm）及びリ ード（Reed）編、169巻、ベルラグ・ケミー（Verlag Chemie）、ウエインハイム （Weinheim）］又はピカタギオ（Picataggio）ら［1992年、バイオテクノロジー （Biotechnology）、10巻、894-898頁］により教示された公知の方法を用いて製 造される。 特定の不飽和二酸が、以前には飽和化合物を製造するのに用いられていた欧州 特許第0341796号に開示された株を用いて、より長い鎖の不飽和基質から都合良 く生成される。従って、その他の面では、本発明は、増殖培地で増殖された酵母 を用いて、より長鎖の不飽和基質の限定されたβ−酸化（鎖の短小化）により不 飽和二酸を生成する方法を提供する。 好ましくは、生成される不飽和二酸はＣ₈−Ｃ₂₂であり、より好ましくはＣ₁₆ 又はＣ₁₈である。 その目的に適する酵母は、欧州特許第0341796号及び、カシー（Casey）らによ るジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジー （Journal ofGeneral Microbiology）、136巻、1197-1202頁（1990年）において開示されている。その ような株［例えば、［「ＬＡ１２」と略されるカンジダ・クロアカエ（Candida cloacae ）５ＧＬＡ１２］は乏しい又は低減したβ−酸化活性を示す。 その酵母は、不飽和脂肪酸をエステルの形態で、好ましくは油のようなトリグ リセリドエステルとして生成する。特に適する例には、ヒマワリ油及びオリーブ 油のような不飽和油が含まれる。 好ましくは、出発物質として用いられる油は、主な不飽和長鎖脂肪酸はＣ_{16-2 2} 化合物であり、より好ましくはＣ₂₀又はＣ₁₈化合物であるトリグリセリドであ る。好ましくは、基質物質は主には多不飽和化されている。ＬＡ１２のような酵 母株による発酵により、鎖が短小化された不飽和の二酸（典型的にはＣ₈-Ｃ₁₈化 合物）の混合物の生成がもたらされる。これらの混合された生成物は例えば溶媒 微分抽出により画分に分離され得る。 β−酸化の間に、Ｃ₂構成単位のランダム除去があり、生成物の異性化が起こ らないとした場合、下記の生成物は、基質としてオレイン酸を用いたときに生成 されると考えられる：シス-7-ヘキサデセン二酸、シス-5-テトラデセン二酸、シ ス-7-テトラデセン二酸、シス-3-ドデセン二酸、シス-5-ドデセン二酸、シス-3- デセン二酸、シス-5-デセン二酸及びシス-3-オクテン二酸。 リノール酸から下記の生成物が予測される： シス-6，9-ヘキサデカジエン二酸、シス-4，7-ヘキサデカジエン二酸、シス-5 ，8-テトラデカジエン二酸、シス-4，7-テトラデカジエン二酸、シス-2，5-テト ラデカジエン二酸、シス-3，6-ドデカジエン二酸、シス-4，7-ドデカジエン二酸 、シス-2，5-ドデカジエン二酸、シス-3，6-デカジエン二酸、シス-2，5-デカジ エン二酸、シス-2，5-オクタジエン二酸、シス-4-デセン二酸及びシス-2-オクテ ン二酸。 同様に、出発物質としてリノレン酸を用いる予測される生成物は、下記の通り である： シス-4，7，10-ヘキサデカトリエン二酸、シス-6，9，12-ヘキサデカトリエン 二酸、シス-2，5-8-テトラデカトリエン二酸、シス-4，7，10-テトラデカトリエ ン二酸、シス-2，5，8-ドデカトリエン二酸、シス-3，6-ドデカジエン二酸、シ ス-2，5，8-デカトリエン二酸、シス-3，6-デカジエン二酸、シス-4-デセン二酸 、シス-2，5-オクタジエン二酸、シス-4-オクテン二酸及びシス-2-オクテン二酸 。 すべての場合において、生成物混合物は、出発化合物と同じ鎖長の生成物を少 量含有している。 実際、好ましい基質は脂肪酸エステル（特に、Ｃ₁₈脂肪酸エステル）であるが 、発酵の生成物は、出発基質による。従って、基質を変えることにより、全範囲 の不飽和二酸が生成され得る。 いくつかの適する基質は、欧州特許第0229252に特定されており、Ｃ₁₀−Ｃ₂₄ アルケン及び不飽和アルカノール（特にＣ₁₆、Ｃ₁₈及びＣ₂₂不飽和アルカノール ）のようなその他の不飽和炭化水素、相当するモノカルボン酸又はそれらのヒド ロキシカルボン酸誘導体を包含する。 当然、トランス不飽和化合物が出発化合物である場合は、トランス不飽和生成 物が生成される。 製造方法において用いられる酵母は、窒素制限条件下では増殖しないことは非 常に好ましい特徴である。実際（欧州特許第0341796号に記載されている方法と は異なり）、酵母は、ｐＨの変化が有機体の鎖短小化β−酸化活性に影響する、 窒素が比較的豊かである条件下で増殖する。 従って、発酵方法の生成物の分布は、不飽和二酸の生成中に発酵培地のｐＨの 変化により都合良く変えられる。特に、この方法で異なる長さの二酸分子の相対 濃度を変えることは可能である。例えば、オリーブ油の発酵中にｐＨを7.5から7 .1に低くすることにより、Ｃ₁₂の不飽和二酸の相対量を増加させることが可能で ある。 発酵生成物の特定の画分が特定の意図する用途に特に有利な特性を有し得るの で、このことは重要である。 水性相を種々の異なる酸性のｐＨに調整した後にジエチルエーテルで抽出する ことにより、異なる生成物の異なる画分が培地から得られる。 本発明の異なる面は、下記の例示的実施例及び図面を参照することによってよ りよく理解され得る。 図１は、基質としてヒマワリ油を用いての時間に対する二酸濃度（ｌ当りｇ） のグラフである。 図２は、基質としてオリーブ油を用いての時間に対する二酸濃度（ｌ当りｇ） のグラフである。 図３は、ｐＨ条件を変えて、基質としてオリーブ油を用いての時間に対する二 酸濃度（ｌ当りｇ）のグラフである。 図４は、ヒマワリ油から得られる中鎖二酸についてのメラニン低減％を示す棒 グラフである。実施例Ｉ −発酵による中鎖不飽和二酸の生成 ニトロソグアニジンを用いての突然変異生成物により生成するカンジダ・クロ アカエのβ−酸化株［ＬＡ１２株、欧州特許第0341796号及びカセイ（Casey）ら によるJ．Gen．Microbiol．（1990年）、136巻、1197-1202頁を参照］は、を用 いて、高含量の不飽和脂肪酸を含むオリーブ油及びヒマワリ油のようなトリグリ セリドからＣ₈−Ｃ₁₄不飽和二酸を生成するのに用いられる。 下記のような化学的に規定された培地が用いられた。 酵母抽出物（５ｇ／ｌ）、蔗糖（10ｇ／ｌ ）、ペプトン（５ｇ／ｌ）培地で 増殖させたカンジダ・クロアカエ（Candida Cloacae）β−酸化株ＬＡ１２の24 時 間培養物を２％（ｖ／ｖ）、培地（2.5ｌ）に接種した。その培養物をｐＨ6.8で 20時間増殖させ、その後、油20ml／ｌを添加し、そしてｐＨを7.4-7.6に上げ、 中鎖不飽和二酸の産生を開始させた。油は、ヒマワリ油又はシリカ精製オリーブ 油であった。二酸の生成中にＲＱ［呼吸商（respiratory quotient）値は約0.6 に落ちた。発酵槽ブイヨンの試料（10-20ｍｌ）を脂質分析のために毎日取り出 し、必要とする添加油を加えた。 産生を８−１２日で停止し、発酵物を収穫した。 ＨＣＩでｐＨ６に酸性化することにより中鎖の不飽和二酸を発酵槽ブイヨンか ら単離し、次にジエチルエーテルで抽出しＣ₁₂−Ｃ₁₄に富んだ画分を単離した。 次に、ブイヨンをさらにＨＣＩで約ｐＨ2.0に酸性化し、さらにジエチルエーテ ルで抽出して、Ｃ₈−Ｃ₁₀に富んだ画分を単離した。混合酸の単離のために、ブ イヨンｐＨを一段階で7.5から約2.0に下げ、次にジエチルエーテルで抽出した。 回転式蒸発（rotary evaporation）によって、二酸画分から溶媒を除去した。 ヒマワリ油（ＳＦＯ）及びシリカ精製オリーブ油（ＯＯ）からの中鎖不飽和二 酸の生成の時間経過をそれぞれ図１及び図２に示す。 図１は、基質としてヒマワリ油を用いてのＣ₈−Ｃ₁₄の不飽和二酸の個々のそ して全体の生成を示す。中鎖不飽和二酸の生成速度が３日目乃至４日目に迅速に 増加するが８日目までに事実上０に傾きが落ち、その時間まで二酸の濃度はおお よそ一定であった。 図２は、基質としてオリーブ油を用いてのＣ₈−Ｃ₁₄の不飽和二酸の個々のそ して全体の生成を示す。この場合、二酸の生成速度は急な増加は少ないことを示 したが８日目において増加し続けた。 ２つの基質間で正味の生成物分布は変わるが（例えば基質としてヒマワリ油を 用いて比較的より多いＣ₁₀生成物が得られた）、両方の場合に、より短鎖の二酸 （Ｃ₁₀、Ｃ₈）より大きい二酸（Ｃ₁₄、Ｃ₁₂）がより多い総割合を構成した。 これらのデーターを表Ｉにおいて表の形でも表わした。実施例II −生成物分布を変えるためのｐＨの使用 7，4乃至7，6の生成ＰＨで、Ｃ₁₈不飽和脂肪酸を含有する油（例えばオリーブ 油）からの主な種はＣ₁₄不飽和二酸である。 しかし、生成ｐＨを7.4乃至7.6から約7.1に低下させると、Ｃ₁₂不飽和脂肪酸 が主な種になる。先の実施例において詳記した発酵をｐＨが7.1に低下し、Ｃ₁₄ 種の「代謝回転（turn-over）」が起こり、Ｃ₁₂生成が増加した。その結果を図 ３に示す。 図３は、８日目にｐＨを7.5から7.1に調整した、基質としてオリーブ油を用い てのＣ₈−Ｃ₁₆不飽和二酸の生成を個々にそして全体として示している。図２で 表わされるように、基質としてオリーブ油を用いた場合、二酸の総生成量は８日 後に増加し続ける。しかし、その生成物分布が非常に影響される。８日目まで、 Ｃ₁₄二酸の濃度は増加し続け、最も濃度が高い二酸生成物であった。しかし、そ の後に、ｐＨを低下させる条件下でその濃度は低減し始め、Ｃ₁₂生成物が増加し 続け、10日後にＣ₁₂二酸力住生成物になった。 これらのデーターは表IIにおいて表の形で示されている。 この実験は、生成物分布が生成ｐＨによりいくらか制御されることを示す。Ｃ₈ −Ｃ₁₆二酸生成の速度は、生成ｐＨの変化後も実質的に線状のままである。実施例III −チロシナーゼ阻害評価 チロシナーゼ活性阻害を用いて潜在的皮膚漂白を特定する。チロシナーゼ阻害 の評価をフマダ（Humada）及びミシマ（Mishima）による方法 ［Br．J．Derm． （1972年）、86巻、385-394頁］により行った。 希釈剤として0.1Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.8）を用いてすべての溶液 を新しく調製した。これらは、 40ｍＭの阻止剤原液：これから逐次希釈物を作り、4.0、0.4及び0.04ｍＭの濃度 の阻害剤を得た。 塩溶液：硫酸銅（100μＭ）及び塩化マグネシウム（100ｍＭ） 酵素溶液：１mlのマッシュルームチロシナーゼ（mg当り2000-4000単位）及び 基質溶液：48mgのジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ／100ml） 酵素及びＤＯＰＡ溶液は、光に対して敏感なので使用直前に調製する。 二カルボン酸によるＤＯＰＡのチロシナーゼ触媒化酸化の阻害を492ｎｍの波 長でドパクロム（dopachrome）生成をモニターすることにより分光光度的に追っ た。その反応は、30μｌ阻害剤（又は対照用緩衝液）、50μｌの緩衝液及び20μ ｌの塩溶液を入れた96ウエルのミクロ力価滴定プレート（96-well microtitrepl ate）において行った。ＤＯＰＡ（50μｌ）を添加し反応を開始させ、各プレー トを30秒間振った。10分後に、ミクロ力価読取装置（microtitre platereader） ［チターテク・マルチスカン（Titertek Multiscan）］を用いて吸収の読取をし た。 チロシナーゼ阻害評価の結果により、アゼライン酸のように、中鎖不飽和二酸 は、１０ｍＭ濃度で存在するときに、酵素活性の少なくとも50％の阻害をもたら す、有効なチロシナーゼ阻害剤であることが見出だされた。アゼライン酸は飽和 二酸であり、従って、非常に異なる性質を有するので、このことは予期しないこ とである。従って、アゼライン酸は、室温で結晶質固体であり、一方、Ｃ₈／Ｃ_{1 0} 不飽和二酸は、低融点の油状の物質である。 チオレドキシン還元酵素は、皮膚の色素形成の二酸媒介阻害に関してチロシン よりもより重要な酵素であり得る。最近の研究［Fitton及びGoaにより、ドラッ グス（Drugs）、41巻（５）、780乃至798頁（1991年）］では、アゼライン酸が チオレドキシン還元酵素を阻害することが示されている。従って、本明細書に照 らして、当業者は、不飽和二酸が同様にこの酵素の阻害剤であることを予測する であろう。実施例I V−メラニン生成の阻害 実施例IIIを補足するためのさらなる評価において、試験管内でのメラニン形 成細胞培養物における不飽和二酸の効果を調べた。 哺乳動物の黒色腫から誘導される色素形成細胞を培養で標準法により増殖させ た。好ましい細胞系はＢ16（欧州特許第0338104号に開示された）又はＳ−91（ 例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ 51.3、クローンＭ−３）細胞であるが、他の系又は 発達第一段階のマウス（primary mouse）又はヒトのメラニン形成細胞が用いら れる。 黒色腫細胞を完全細胞培養培地（欧州特許第0308919号に記載されたような） で、約1/3の集密（confluence）に増殖させた。次に、試験するその組成物を培 地に添加した。 その細胞をさらに４日間培養し、生成したメラニンの量を540 ｎｍでの吸収を 測定することにより培地及び収穫した細胞から抽出された総メラニンの評価をし た。 先に記載した方法を用いて不飽和二酸（Ｃ₁₂−Ｃ₁₄画分、Ｃ_8-10画分又は混合 酸）を0.1ｍＭで又は1.0ｍＭで含む組成物の、負の対照培養物と比較して、メラ ニン形成細胞培養物により生成したメラニンの量を低減させる能力を評価した。 コージ酸（皮膚の色を白くする物質として用いられる物質）を正の対照として用 いた。その結果を、非処理の対照と比べて処理した培養物におけるメラニンの低 減％を示す棒グラフである図４に示す。 種々の二酸画分が、この面において実質的に同様の特性を有した。実施例Ｖ −抗菌活性の測定 種々の不飽和の二カルボン酸混合物の各々の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を寒天希 釈技術を用いて10％のイントラリピッド（Intralipid）［カビ・ファーマシア・ インコーポレッド（Kabi Pharmacea，Inc．）の存在下又は不存在下でプロピオ ニバクテリウム・アクネスの32株及び好気性細菌の種々の種類の32株の感受性の 目的で測定した。その方法は後に記載する。 10ｇの二酸物質を、２倍濃度（double strength）のトリプティック・ソイ・ ブロス（Tryptic Soy Broth）（ＴＳＢ）［バルチモア・バイオロジカル・ラボ ラトリース（Baltimore Biological Laboratories）200mlに添加することにより 各物質の５％の原液を調製した。各溶液のｐＨを水酸化ナトリウムを用いて7.0 ±0.2に調整した。 各有機酸について200ml容のビン／フラスコの２組を１乃至９と番号付けた。 各ボトルに、50ｃｃの２倍濃度のＴＳＢを添加した。５％の原液から、50ｃｃの ＴＳＢをビン＃１及び＃２に移した。50ｃｃの逐次移送をビン＃２からビン＃８ まで行った。各組のビン＃９は、二酸が全くなく、２倍濃度のＴＳＢの50ｃｃの みを含有していた。すべての18のビンに、粒状の寒天（ＢＢＬ）を２ｇ添加した 。 すべてのビンを121℃、15ｐｓｉのオートクレーブに15分間入れ、次に50℃で の水浴中に維持した。 ビン＃１乃至９の１組に、50ｃｃの熱い滅菌水を添加した。そのビンを撹拌し 、内容物を混合し、25ｃｃを４つのペトリ皿の各々に注ぎ、固化した。ビンの第 二の組に、50ｃｃのイントラリピッド（50℃に予め温めた）を添加した。次に内 容物を混合し、上記のように注いだ。 試験微生物の標準接種物を、0.85％のＰＳＳ（生理的食塩水）中の細菌懸濁液 を0.5マクファーランド基準（McFarland Standard）に合わせ、10倍に希釈する ことにより調製し、１０⁷ＣＦＵ（コロニー形成単位）を生じさせた。接種物を スチールス（steers）レプリケーターの32のウエルに入れる。多数の先がとがっ た接種器（inoculator）により、0.001乃至0.002ｃｃを分布させ、１地点当り10⁴ の最終接種物を得る。 プレートに最低濃度から最高濃度までを接種し（接種物の「持越し」の効果を 低減するために）、乾燥させた。次にそのプレートを倒立させ、35℃で24時間イ ンキューベーションした。プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacter ium acnes ）株で接種したプレートを嫌気性条件下、35℃で７日間インキュベー ションした。 試薬がない対照プレート（＃９）をインキュベーションの終りに生存能力およ び汚染物のしるしについて検査した。最終点ＭＩＣ値を、可視的な微生物成長を 阻止する試薬の最低濃度のプレートを観察することにより測定した。 得られた結果を表IIIにまとめる。この表は、ある範囲の微生物について、ア ゼライン酸と比較し、中鎖不飽和二酸（「混合した二酸」、すなわちＣ₈−Ｃ₁₄ 混合二酸）、Ｃ₁₂富有画分及びＣ_18:1モノ不飽和化合物に関してＭＩＣを示す。 このデーターは、各種のいくつかの異なる株について一般的に行われたの実験の 結果を表わす（例えば、プロピオニバクテリウム・アクネス株ＡＴＣＣ6919及び 29399 ［ＡＴＣＣはアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（Ameri can Type Culture Collection）から成る；スタフィロコッカス・アウレウス（S taph．aureus）株ＡＴＣＣ25923、35556及び29213；スタフィロコッカス・エピ デルミディス（Staph．epidermidis）ＡＴＣＣ35984、31432及び 14490；ミクロコッカス・セデンタリウス（Micrococcus sedentarius）ＡＴＣＣ 27574：ミクロコッカス・ルテウス（M．luteus）ＡＴＣＣ27141、9341及び15957 ；ブレビバクテリウム・エピデルミディス（Brevibacteriumepidermidis）ＡＴ ＣＣ35514；コリネバクテリウム・ミヌチシウム（Corynebactrium minutissium ）ＡＴＣＣ23347、23348及び23349）。 「イントラリピッド（Intralipid）」の存在又は不存在では、有意な効果がな かった。Ｃ_18:1モノ不飽和化合物についてのみわずかな違いが観察され、それら では、イントラリピッドがスタフィロコッカス・アウレウス（Staph．aureus） ではＭＩＣを増大させ、プロピオニバクテリウム・アクネス及びミクロコッカス ・ルテウスではＭＩＣを低減したことを示唆した。 プロピオニバクテリウム・アクネスは、ざ瘡の主な原因となる菌であり、従っ て、この微生物に対する効力は、ざ瘡の防止及び治療に有用であることを示す。 スタフィロコッカス・アウレウスは、通常、おでき、膿瘍と関係のある病原性の グラム十微生物である。カンジダ・アルビカン（Candida albicans）は、負の対 照として含まれた抗酵母である。シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonasa eruginosa ）及び大腸菌は、ともに普通のグラム−微生物である。 予期せぬことに、すべての場合において、不飽和の二酸（中鎖及びＣ₁₈化合物 ）はアゼライン酸よりもより活性である。それらの化合物は、プロピオニバクテ リウム・アクネス、スタフィロコッカス・アウレウス及びスタフィロコッカス・ エピデルミディスに特に有効であった。特に、Ｃ₁₈化合物は、何度もアゼライン 酸よりも大きい抗菌活性を示す。 同じ方法を用いて同様の実験を行い、アゼライン酸、Ｃ_18:1二酸（オレイン酸 含む基質から得られた）、Ｃ_18.1脂肪（モノカルボン）酸の混合物、相当するＣ_18:1 及びＣ_18:2二酸（リノール酸を含む基質から得られる）及びＣ_16:1二酸（パ ルミトレイン酸を含む基質から得られる）の阻止活性度を比較した（プロピオニ バクテリウム・アクネスについて）。その結果を表IVに示す。アゼライン酸とＣ_18.1 二酸は、本質的に先の結果と同じであり、先の結果を確認するものであった 。相当する脂肪酸は非常に少ない活性しかなかった。従って、相当する脂肪酸（ オレイン酸）は、アゼライン酸よりも活性が小さいが、Ｃ_18.1二酸はアゼライン 酸の活性のほぼ100倍の活性を有する。 実験４では、アゼライン酸対照の阻止度、従って試験試料の阻止度も、先の実 験において観察されたよりもわずかに小さかった。 実験４では、アゼライン酸対照の阻止度そして従って試験試料の阻止度も又、 先に観察されたよりもわずかに小さかった。この最も有り得る理由は、インキュ ベーション時間が、先の実験では７日間であつたのに対し、18日に増加したこと であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年９月１５日 【補正内容】 翻訳文の請求の範囲の補正 １．不飽和二酸及び／又は炭化水素主鎖において15以上の炭素原子を含む、不飽 和二酸の誘導体を含む医薬又は美容組成物。 ２．不飽和二酸は、８乃至22の炭素原子を含み及び／又は誘導体は、炭化水素主 鎖において15乃至22の炭素原子を有する不飽和二酸の誘導体である、請求項１に 記載の組成物。 ３．１つ以上の不飽和のＣ₁₆又はＣ₁₈二酸及び／又はその誘導体を含む、請求項 １又は請求項２に記載の組成物。 ４．抗菌活性を有する、請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の組成物。 ５．プロピオニバクテリウム・アクネス及びスタフィロコッカス・アウレウスに 対して活性である、請求項１乃至４のいずれか１請求項に記載の組成物。 ６．皮膚美白活性を有する、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の組成物 。 ７．二酸誘導体が、アルコール、置換又は非置換のアミド又は低級アルキルエス テルである、請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載の組成物。 ８．皮膚への局所的使用に適する、請求項１乃至７のいずれか１請求項に記載の 組成物。 ９．組成物が、0.001乃至20重量％の不飽和二酸及び／又はその誘導体を含む、 請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の組成物。 10．組成物が、0.01乃至１重量％の不飽和二酸及び／又はその誘導体を含む、請 求項１乃至９のいずれか１請求項に記載の組成物。 11．有効量の、請求項１乃至10のいずれか１請求項に記載の組成物の使用を含む 、医薬又は美容のためにヒトの皮膚を処理する方法。 12．プロピオニバクテリウム・アクネス及び／又はスタフィロコッカス・アウレ ウスによりもたらされ、維持され又は悪化した状態を処理するための、請求項 11に記載のヒトの皮膚を処理する方法。 13．ざ瘡、皺、悪性黒色腫、皮膚病、高色素皮膚病及び湿疹、酒さ、ほくろ及び 脂漏症、膿痂疹、ふけ及び体臭の１つ以上の処理のための、請求項11又は請求項 12に記載のヒトの皮膚を処理する方法。 14．不飽和二酸又はその誘導体の使用を含む、皮膚を白くする方法。 15．活性治療物質として、不飽和二酸及び／又は、炭化水素主鎖において15以上 の炭素原子を有する、不飽和二酸の誘導体の使用。 16．抗菌剤として又は美白剤としての不飽和二酸又はその誘導体の使用。 17．Ｃ₁₆又はＣ₁₈の不飽和二酸又はその誘導体の使用を含む、請求項₁₅又は請求 項16に記載の使用。 18．有効量の不飽和二酸又はその誘導体を皮膚科学的に認容できる美容用担体又 は医薬用担体と混合することを含む、皮膚への局所的使用のための抗菌組成物又 は皮膚美白組成物を製造する方法。 19．不飽和二酸又はその誘導体がＣ₁₆又はＣ₁₈の不飽和二酸又は誘導体である、 請求項₁₈に記載の方法。 20．増殖培地において増殖された酵母を使用する、（所望の生成物よりも長鎖を 有する）不飽和の基質の制限されたβ−酸化を含む、不飽和二酸を製造する方法 。 21．カンジダ・クロアカエ株５ＧＬＡ１２の使用を含む、請求項20に記載の方法 。 22．基質がＣ₁₆乃至Ｃ₂₂の不飽和化合物を含む、請求項20又は請求項21に記載の 方法。 23．基質がオレイン酸、リノール酸、リノレン酸又はアラキドン酸を含む、請求 項20乃至22のいずれか１請求項に記載の方法。 24．基質がトリグリセリドを含む、請求項20乃至23のいずれか１請求項に記載の 方法。 25．基質が、オリーブ由、ヒマワリ油又はヒマシ油を含む、請求項20乃至24のい ずれか１請求項に記載の方法。 26．酵母が窒素制限条件下では増殖されない、請求項20乃至25のいずれか１請求 項に記載の方法。 27．ｐＨの変更が、方法の二酸生成物の分布に影響を与える、請求項20乃至26の いずれか１請求項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/20 ＡＤＡ 9455−4Ｃ 31/225 9455−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 7/44 9548−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 7/44 Ｃ１２Ｒ 1:72） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．2，5−オクタジエン二酸、1，7-オクタジエン二酸、2，4，6-オクタトリエ ン二酸、1，3，5，7-ノナテトラエン二酸、2，5，8-デカトリエン二酸、3，6-ド デカジエン二酸及び3，13-ヘキサデカジエン二酸から成る郡における化合物を除 く、８乃至16の炭素原子を有する多不飽和二酸。 ２．偶数の炭素原子を有する、請求項１に記載の二酸。 ３．14乃至16の炭素原子を有する、請求項１又は請求項２に記載の二酸。 ４．不飽和二酸及び／又は炭化水素主鎖において１５以上の炭素原子を含む、不 飽和二酸の誘導体を含む医薬又は美容組成物。 ５．不飽和二酸は、８乃至22の炭素原子を含み及び／又は誘導体は、炭化水素主 鎖において15乃至22の炭素原子を有する不飽和二酸の誘導体である、請求項４に 記載の組成物。 ６．１つ以上の不飽和のＣ₁₆又はＣ₁₈二酸及び／又はその誘導体を含む、請求項 ４又は請求項５に記載の組成物。 ７．抗菌活性を有する、請求項４乃至６のいずれか１請求項に記載の組成物。 ８．プロピオニバクテリウム・アクネス及びスタフィロコッカス・アウレウスに 対して活性である、請求項４乃至７のいずれか１請求項に記載の組成物。 ９．皮膚美白活性を有する、請求項４乃至８のいずれか１請求項に記載の組成物 。 10．二酸誘導体が、アルコール、置換又は非置換のアミド又は低級アルキルエス テルである、請求項４乃至９のいずれか１請求項に記載の組成物。 11．請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の二酸を含む、請求項４乃至10の いずれか１請求項に記載の組成物。 12．皮膚への局所的使用に適する、請求項４乃至11のいずれか１請求項に記載の 組成物。 13．組成物が、0.001乃至20重量％の不飽和二酸及び／又はその誘導体を含む、 請求項４乃至12のいずれか１請求項に記載の組成物。 14．組成物が、0.01乃至１重量％の不飽和二酸及び／又はその誘導体を含む、請 求項４乃至13のいずれか１請求項に記載の組成物。 15．有効量の、請求項４乃至14のいずれか１請求項に記載の組成物の使用を含む 、 医薬又は美容のためにヒトの皮膚を処理する方法。 16．プロピオニバクテリウム・アクネス及び／又はスタフィロコッカス・アウレ ウスによりもたらされ、維持され又は悪化した状態を処理するための、請求項15 に記載のヒトの皮膚を処理する方法。 17．ざ瘡、皺、悪性黒色腫、皮膚病、高色素皮膚病及び湿疹、酒さ、ほくろ及び 脂漏症、膿痂疹、ふけ及び体臭の１つ以上の処理のための、請求項１５に記載の ヒトの皮膚を処理する方法。 18．不飽和二酸又はその誘導体の使用を含む、皮膚を白くする方法。 19．活性治療物質として、不飽和二酸及び／又は、炭化水素主鎖において15以上 の炭素原子を有する、不飽和二酸の誘導体の使用。 20．抗菌剤として又は美白剤としての不飽和二酸又はその誘導体の使用。 21．Ｃ₁₆又はＣ₁₈の不飽和二酸又はその誘導体の使用を含む、請求項19又は請求 項20に記載の使用。 22．有効量の不飽和二酸又はその誘導体を皮膚科学的に認容できる美容用担体又 は医薬用担体と混合することを含む、皮膚への局所的使用のための抗菌組成物又 は皮膚美白組成物を製造する方法。 23．不飽和二酸又はその誘導体がＣ₁₆又はＣ₁₈の不飽和二酸又は誘導体である、 請求項22に記載の方法。 24．増殖培地において増殖された酵母を使用する、（所望の生成物よりも長鎖を 有する）不飽和の基質の制限されたβ−酸化を含む、不飽和二酸を製造する方法 。 25．カンジダ・クロアカエ株５ＧＬＡ１２の使用を含む、請求項２４に記載の方 法。 26．基質がＣ₁₆乃至Ｃ₂₂の不飽和化合物を含む、請求項24又は請求項25に記載の 方法。 27．基質がオレイン酸、リノール酸、リノレン酸又はアラキドン酸を含む、請求 項24乃至26のいずれか１請求項に記載の方法。 28．基質がトリグリセリドを含む、請求項24乃至27のいずれか１請求項に記載の 方法。 29．基質が、オリーブ由、ヒマワリ油又はヒマシ油を含む、請求項24乃至28のい ずれか１請求項に記載の方法。 30．酵母が窒素制限条件下では増殖されない、請求項24乃至29のいずれか１請求 項に記載の方法。 31．ｐＨの変更が、方法の二酸生成物の分布に影響を与える、請求項24乃至30の いずれか１請求項に記載の方法。