DE3632824C2

DE3632824C2 -

Info

Publication number: DE3632824C2
Application number: DE3632824A
Authority: DE
Inventors: Michel Follet; Marc Aramon Fr Bonato
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 1985-09-26
Filing date: 1986-09-26
Publication date: 1992-04-30
Also published as: HK91289A; AT402070B; DE3632824A1; FI84480B; FI863742A0; PT83437B; ES2001440A6; AR241702A1; IE59479B1; NL8602382A; NO863834L; IE862532L; LU86590A1; SE8603792L; FR2587699B1; ES2001705A6; FR2587703A1; PT83436A; FR2587702B1; GB8523776D0

Description

Die Erfindung betrifft bicyclische Brenzcatechinderivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und dieselben enthaltende therapeutische Zusammensetzungen.

Aus der britischen Patentschrift 14 28 110 sind strukturell ähnliche Benzothiepin- bzw. Benzothiopyran-Derivate bekannt, die cardiovasculäre Eigenschaften aufweisen sollen. Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen diese Eigenschaften nicht, sondern wirken u. a. entzündungshemmend und antiallergisch.

Die Erfindung stellt bicyclische Brenzcatechinderivate mit den allgemeinen Formeln I und II bereit

worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellen;
R₃ ein aromatisches Radikal, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Halogenatome oder Trifluormethylgruppen, darstellt und
Z eine Carbonyl-, Hydroxymethylen-, Methylen-, Carbonylmethylen-, Hydroxyethylen- oder Ethylengruppe darstellt, wobei die Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindung im Falle von Carbonylmethylen und Hydroxyethylen das Kohlenstoffatom betrifft, welches benachbart zu dem in die Ringverbindung eingebundenen ist.

Die Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II, wie sie oben definiert sind, sind Inhibitoren von Lipoxygenase und Cyclogenase. Sie können in der Humantherapie als nichtsteroide, entzündungshemmende, antithrombotische, antiallergische antiischämische und antianaphylaktische Mittel verwandt werden.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II bereit, wobei das Verfahren die Reaktion einer Verbindung der Formel III

worin R₁ und R₂ die oben angegebenen Bedeutungen haben (diese Verbindung wird durch Sulfochlorierung des aromatischen Rings nach einem von dem von Jusius, Liebigs Ann. Chem 1929, 468, 162 abgeleiteten Verfahren, gefolgt von der Reduktion durch naszierenden Wasserstoff - Clemmensen- Reaktion - hergestellt), mit einer geeignet substituierten Propion- oder Buttersäure (oder einem Ester oder einem Salz derselben) der Formel IV

worin R₃ die oben angegebene Bedeutung hat, umfaßt.

Unter alkalischen Bedingungen gibt dies eine Verbindung der Formel V

welche mit dehydratisierenden Mitteln, wie Phosphorsäureanhydrid, Polyphosphorsäuren oder -estern, Schwefelsäure, Chlorsulfonsäure und anderen Lewis-Säuren cyclisiert wird.

Für die Verbindungen der Formel II umfaßt das Verfahren die Reaktion der Verbindung der Formel VI mit einem R₃-substituierten γ-Butyrolacton VII

Gemäß einem Verfahren, das sich von dem von K. W. Bentley und W. I. Rushvoeth, Britisches Patent 1 428 110, herleitet, unter Bildung der Verbindung der Formel VIII

welche, nach der Cyclisierung einer Carboxylgruppe, zu der erwünschten Verbindung II führt.

Die Verbindungen I und II, worin Z Methylen, Ethylen, Hydroxymethylen oder Hydroxyethylen ist, kann nach herkömmlichen Reduktionsverfahren erhalten werden.

Die Carbonylgruppe kann entweder durch Behandlung mit stöchiometrischen Mengen an Aluminiumtrichlorid und Lithiumaluminiumhydrid nach einem sich von dem von H. Nakazumi, T. Veyama und T. Kitao, J. of Heterocyclic Chemistry 1984, 21, 193 herleitenden Verfahren oder nach dem Verfahren von Wolf-Kishner-Huang Minlon unter Verwendung von Hydrazin in eine Methylengruppe umgewandelt werden oder durch Natriumborhydridreduktion in Hydroxymethylen nach V. J. Traynelis und R. F. Love, J. Org. Chem. 1961, 26, 2728.

Schließlich betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen in welchen als aktiver Bestandteil wenigstens eine der oben definierten Verbindungen verwandt wird.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 6,7-Dihydroxy-2-phenyl-4-oxobenzothiopyran (I: R₁ = R₂ = H, Z = CO, R₃ = C₆H₅)

5 g (0,017 Mol) β-(3,4-Dihydroxyphenylthio)zimtsäure wurde in einem mit einem Magnetrührer ausgestatteten 50-ml-Zweihalskolben portionsweise in 10,5 ml konz. Schwefelsäure gegeben. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt und die erhaltene Suspension getrocknet und dann mit Benzol gewaschen.

Umkristallisation aus warmem Ethanol ergab ein organgefarbenes Pulver (Ausbeute 13%). Diese Verbindung hatte einen Schmelzpunkt oberhalb 250°C (Tottoli). Ihre Identität und Struktur wurde durch ¹H-NMR-Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 66,65%; H 3,73%
gefunden: C 66,71%; H 3,81%

Beispiel 2 6,7-Dihydroxy-2-(o-trifluormethylphenyl)-4-oxobenzothiopyran (I : R₁ = R₂ = H, Z = CO, R₃ = O-CF₃-C₆H₄)

1 g (0,028 Mol) o-Trifluormethyl-β-(3,4-dihydroxyphenylthio)- zimtsäure wurde in einem mit einem Magnetrührer ausgestatteten 50-ml-Dreihalskolben unter einem leichten Stickstoffstrom in 15 ml wasserfreiem Chloroform gelöst. Eine Lösung von 3,25 g (0,0075 Mol) Ethylpolyphosphat in 1 ml wasserfreiem Chloroform wurde bei 20°C hinzugefügt. Die Mischung wurde über 2 h refluxiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt und dann mit Ammoniak alkalisch gemacht. Nach der Extraktion wurde die organische Phase mit Wasser gewaschen. Verdampfen des organischen Lösungsmittels ergab ein orangefarbenes Gummi, welches mittels Chromatographie an Kieselgel durch Elution mit Dichlormethan gereinigt wurde (Ausbeute 12%). Diese Verbindung ist ein bei 131°C (Tottoli) schmelzender Feststoff. Ihre Identität und Struktur wurde durch ¹³C-NMR-Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 56,80%; H 2,70%
gefunden: C 56,64%; H 2,69%

Beispiel 3 6,7-Dimethoxy-2-phenyl-4-oxobenzothiopyran (I : R₁ = R₂ = CH₃, Z = CO, R₃ = C₆H₅)

Es wurde verfahren wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von β-(3,4-Dimethoxyphenylthio)zimtsäure anstelle von o-Trifluormethyl-β-(3,4-dihydroxyphenylthio)zimtsäure. Die Titelverbindung wurde in 15%iger Ausbeute erhalten. Sie ist ein bei 212°C (Tottoli) schmelzender Feststoff. Ihre Identität und Struktur wurde durch ¹³C-NMR-Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 68,44%; H 4,73%
gefunden: C 68,44%; H 4,74%

Beispiel 4 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluormethylphenyl)-4-oxobenzothiopyran (I : R₁ = R₂ = CH₃, Z = CO, R₃ = o-CF₃-C₆H₄)

Es wurde verfahren wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von o-Trifluormethyl-β-3,4-(dimethoxyphenylthio)zimtsäure anstelle von o-Trifluormethyl-β-3,4-(dihydroxyphenylthio) zimtsäure. Die Titelverbindung wurde in 50%iger Ausbeute erhalten. Sie ist ein bei 194°C schmelzender weißer Feststoff. Ihre Identität und Struktur wurde durch ¹³C-NMR- Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 59,01%; H 3,57%
gefunden: C 58,84%; H 3,56%

Beispiel 5 7,8-Dimethoxy-2-phenyl-5-oxobenzo[b]thiepan (II : R₁ = R₂ = CH₃, Z = CH₂ · CO, R₃ = C₆H₅)

Es wurde verfahren wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von 4-Phenyl-4-(3,4-dimethyloxyphenylthio)buttersäure anstelle von o-Trifluormethyl-β-(3,4-dihydroxyphenylthio) zimtsäure. Die Titelverbindung wurde in 27%iger Ausbeute erhalten. Reinigung wurde durch Dekantieren vom Diethylether bewirkt. Diese Verbindung ist ein bei 135°C (Tottoli) schmelzender weißer Feststoff. Ihre Identität und Struktur wurde durch ¹³C-NMR-Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 68,76%; H 5,77%
gefunden: C 68,63%; H 5,84%

Beispiel 6 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluormethylphenyl)-4H-benzothiopyran (I : R₁ = R₂ = CH₃, Z = CH₂, R₃ = o-CF₃ - C₆H₄)

204,9 mg (5,4 mMol) Lithiumaluminiumhydrid und 720 mg (5,6 mMol) Aluminiumchlorid wurden bei Raumtemperatur in 32 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran in einem mit einem Magnetrührer ausgestatteten 100-ml-Dreihalskolben unter einem leichten Stickstoffstrom gelöst. Eine Lösung von 1 g (2,7 mMol) 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluormethylphenyl)-4- oxobenzothiopyran, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, in 9 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurde bei 25°C hinzugegeben. Das Reaktionsmedium wurde über 2 h bei 20 bis 25°C gerührt und dann mit 0,54 g Wasser und 1,35 ml konz. Schwefelsäure hydrolysiert. Die erhaltene Mischung wurde filtriert und dann mit Diethylether extrahiert. Abdampfen des organischen Lösungsmittels ergab (Ausbeute 20%) ein bei 94°C (Toltoli) schmelzendes rotes Pulver. Die Identität und Struktur dieser Verbindung wurde durch ¹³C-NMR-Spektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt.

berechnet: C 61,36%; H 4,29%
gefunden: C 61,52%; H 4,35%

Pharmakologie

Lipoxygenasen (LOs) wandeln Arachidonsäure (AA) in Hydroxyderivate und Leukotriene um. Diese Produkte sind wirksame pharmakologische Mittel, die möglicherweise wirksame Rollen in entzündlichen und Überempfindlichkeitsstörungen spielen. Mehrere LOs reagieren auf AA, wobei grundsätzlich

5 LO zu Leukotrienen führt,
12 LO zu 12-Hydroperoxyeicosatetraensäure (12 HPETE) und anderen 12-Hydroxyverbindungen führt,
15 LO zu 15 HPETE und anderen 15 Hydroxyverbidungen führt,
und (in geringerem Ausmaß) 8 LO und 11 LO.

Die wichtigsten Produkte der LO-Reaktionswege sind 5-LO gebildete Leukotriene. Die angenommene Bedeutung von SRS-A in Asthma- und anaphylaktischen Reaktionen und der Befund, daß SRS-A zu den Leukotrienen gehört, regte das Interesse an Studien hinsichtlich der biologischen Funktion dieser Verbindungen an. LTC 4 und LTD 4 (0,1 bis 1,0 nM) verursachten konzentrationsabhängige Kontraktionen des Meerschweinchendarms, als es zur Bestimmung der biologischen Aktivität der SRS-A-Relation zu Histamin verwandt wurde. Es wurde gefunden, daß auf molarer Basis Histamin 200mal weniger aktiv war als LTC 4, woraus sich ergibt, daß eine SRS-A-Einheit (6 ng Hist, HCl) ungefähr 0,2 pMol LTC 4 entspricht.

LTC 4 und LTD 4 erhöhten auch die Gefäßdurchlässigkeit in Meerschweinchenhaut und hatten hinsichtlich glatter Muskeln stimulierende Eigenschaften, welche identisch mit den zuvor für SRS-A beobachteten sind. LTC 4 und LTD 4 spielen eine kritische Rolle in der Herz- oder Lungen-Mikrozirkulation.

LTB 4 beeinflußt die Leukozytenwanderung dadurch, daß es die Leukozytenadhäsion an das Endothelium in post-kapillaren Äderchen bewirkt sowie durch potente chemotaktische Effekte. Deshalb sind Leukotriene wirksame Mittler in Wirt-Verteidigungsmechanismen, wie unmittelbaren Überempfindlichkeitsreaktionen und akuten Entzündungsreaktionen. Weiterhin sind die Wirkungen einiger Cyclooxygenase-(CO)-Produkte und der Leukotriene komplementär. Folglich kann Synergismus zwischen Plasmaverlust bewirkenden Leukotrienen und den Vasodilatoren PGE 2 und PGI 2 wichtig bei der Bildung von Ödemen sein. Weiterhin muß synergistischen Effekten von Leukotrienen mit Thromboxan (TxA2) bei Bronchokonstriktion Wichtigkeit zuerkannt werden. LTC 4 und LTD 4 bewirken die Freisetzung von TxA2 in Meerschweinchenlungen-AS. TxA2 ist ein wirksamer Luftwegsverenger, und seine Freisetzung kann zum Bronchospasmus bei allergischen Erscheinungen beitragen. Weiterhin scheinen einige Ergebnisse zu zeigen, daß einige Wirkungen von PAF-Acether durch LTB 4 vermittelt werden konnten. Nicht-steroide entzündungshemmende Drogen (AINS) verhindern die Anaphylaxe nicht. Dagegen erhöhen sie Überempfindlichkeitsreaktionen, da sie AA für LO-Reaktionswege mobilisieren. Corticosteroide (CS) verhindern die Freisetzung des Vorläufers und wirken durch Anregung der Synthese von Lipomodulin, einem Peptid-Inhibitor von Phospholipase A2. Durch Inhibierung der Freisetzung von AA verhindert CS nicht nur die Bildung von CO-Produkten, sondern auch von LO-Produkten und danach die Leukotrienbildung.

Die vermehrte Kenntnis über das LO-System scheint neue Möglichkeit für die Entwicklung von neuen und therapeutisch besser wirkenden Mitteln aufzuzeigen, insbesondere bei Krankheiten, die mit unmittelbaren Überempfindlichkeitsreaktionen wie Asthma, Allergie, kardialer Anaphylaxe, Gehirnischaemie und Entzündung verbunden sind. Solche Mittel können auf dem Antagonismus von Endprodukten oder der Inhibierung von mit der Bildung und weiteren Umwandlung des Schlüssel-Zwischenprodukts LTA 4 verbundenen Enzymen basieren. Ein dualer Effekt des Leukotrien-Reaktionswegs und des Cyclooxygenase-Reaktionswegs kann ebenfalls von Wert sein.

1) "In vitro"-Sichtung von 7 Verbindungen als potentielle Inhibitoren von Sojabohnen-Lipoxygenase a. Einleitung

Monohydroxyeicosatetraensäuren (HETEs) sind in quantitativer Hinsicht bedeutende Metabolite von Arachidonsäure (AA) in einer Vielzahl von Säugetierzellen und -geweben. Beispielsweise wurde 12-L-HETE in Blutplättchen; 5-D-HETE in Kaninchen-PMN; 12-L-HETE, 11-HETE und 15-HETE in Meerschweinchenlungen- und Rattenmastzellen sowie 5-HETE, 8-HETE, 9-HETE, 11-HETE und 12-HETE in menschlichen Neutrophilen identifiziert. Die HETE-Verteilung ist abhängig von der Spezies und repräsentativ für den von Lipoxygenasen enzymatisch katalysierten AA-Metabolismus. Die möglichen biologischen Rollen dieser Produkte sind bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Gleichwohl zeigte aus menschlichen Blutkörperchen erhaltenes 12-HETE chemotaktische Aktivität auf menschliche polymorphonukleare Leukozyten (M./I. Siegel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 308-312; 1980). 5-HPETE (Hydroperoxysäure) ist der Vorläufer der Slow Reacting Substance, einem sehr wirkungsvollen Kontraktionsmittel für die glatte Muskulatur, welches die Symptome augenblicklicher Überempfindlichkeit mildert. Deshalb scheint es, daß die Inhibierung von Lipoxygenase insbesondere nur bei der Sichtung antiallergischer oder entzündungshemmender Mittel nützlich sein könnte. Lipoxygenase von Säugetieren und Pflanzen (Sojabohne) haben viele biochemische Eigenschaften gemeinsam, und es ist gezeigt worden, daß die meisten Inhibitoren von Pflanzenenzymen auch von Blutplättchen oder Leukozyten abgeleitete Lipoxygenasen inhibieren (J. Baumann et al, Prostaglandins 20, 627-639, 1980). Sojabohnen-Lipoxygenase induziert die ausschließliche Bildung von 15-HPETE (C. P. A. Van Os et al, Biochim. et Biophys. Acta 663, 177-193, 1981), und es wurde gezeigt, daß sie zehnmal empfindlicher ist als Blutplättchen- Lipoxygenase (D. P. Wallach et al, Biochim. and Biophys. Acta 663, 361-372, 1981). Zusätzlich ist 15-HETE ein wirksamer und spezifischer Inhibitor von Blutplättchen- Lipoxygenase (12-HETE), welche indirekt die Bildung von Thromboxan A₂ anregt (J. Vanderhoek et al, J. Biolog. Chem. 225, 5996-5998; 1980). Vom 15-Hydroperoxyanalogen wurde auch berichtet, daß es die Aktivität aortischer Prostacyclin- Synthetase in Schweinen unterdrückt (R. J. Gryglewski et al, Prostaglandins 12, 685-713, 1976). Diese Hemmwirkung wird durch die Produktion einer destruktiven oxidativen Spezies ausgeübt, wahrscheinlich eines OH-Radikals oder einer Spezies ähnlicher Aktivität (S. J. Weiss et al, Blood, 53, 1191, 1979).

b. Material und Methoden b1) Spektrophotometrische Analyse

Eine spektrophotometrische Methode wurde gemäß E. J. Corey et al zur Bestimmung der Enzymaktivität entwickelt (J. Amer. Chem. Soc, 104, 1750-1752, 1982). In einem Endvolumen von 1,8 ml waren 0,2 M luftgesättigter Borax- Puffer von pH 9,00 mit 500 Einheiten Sojabohnen-Lipoxygenase gemischt. Beim Test von Inhibitoren wurden diese in 0,6 ml gegeben bei Endkonzentrationen im Bereich von 10^-13 M bis 10^-8 M, gefolgt von einer Vorinkubation über 10 min bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch 10^-4 M Arachidonsäure eingeleitet. Nach der Inkubation über 90 min bei Raumtemperatur wurde 15-HPETE durch Absorptionsmessung bei 236 nm bestimmt.

b2) Darstellung der Ergebnisse

Diese Methode wurde mit bekannten Lipoxygenase-Inhibitoren in Wert gesetzt. Für jede Testsubstanz wurde eine Vergleichsmessung mit abgekochter Lipoxygenase vorgenommen, um jegliche Absorption der Verbindung bei der verwandten Wellenlänge berücksichtigen zu können. Die prozentuale enzymatische Aktivität wurde für jede Konzentration berechnet und die zur Inhibierung von 50% der Enzymaktivität benötigte Substanzmenge durch lineare Regession eines Satzes von den LOG der Konzentration (M)/% Inhibierung beschreibenden Datenpunkten berechnet.

c. Ergebnisse
Verbindungen
IC₅₀ (Konzentration bei 50% Inhibierung
Beispiel 1\|7.25 · 10^-5
Beispiel 2	8.23 · 10^-5
Beispiel 3	1.21 · 10^-6
Beispiel 4	1.35 · 10^-6
Beispiel 5	2.29 · 10^-6
Beispiel 6	1.42 · 10^-6
Diphenylthiocarbazon	1.61 · 10^-6 M

2) "In vitro"-potentielle Inhibierung von Superoxidradikalanion (O₂ ^-) 2a. Einleitung

Der Entzündungsprozeß ist durch eine verminderte Integrität der endothelialen Zellbarriere, eine Änderung der Gefäßpermeabilität und eine Aktivierung von phagozytischen Zellen wie polymorphonuklearen Leukozyten (PMN) mit der nachfolgenden Freigabe und Generierung in den extrazellularen Raum einer Gruppe von aktiven Verbindungen, von denen einige freie Radikale sind, gekennzeichnet. Das Verhältnis dieser Radikalspezies zu anderen Erscheinungen der Entzündung ist nicht vollständig verstanden. Eine wesentliche Komponente des Atmungsausbruchs von aktivierten Entzündungszellen, wie PMN ist die einwertige enzymatische Reduktion von O₂ zum Superoxidradikalanion O₂ ^-. Ein großer Anteil des generierten O₂ ^- wird in den extrazellularen Raum entlassen, wo spontane Dismutation mit begleitender Bildung von H₂O₂ und O₂ auftreten kann. Die gleichzeitige Anwesenheit von O₂ ^-, H₂O₂ und chelierten Metallkatalysatoren im extrazellularen Raum kann zur weiteren Bildung von aktiveren, von Sauerstoff abgeleiteten Molekülen, wie dem Hydroxylradial (OH.) und Singletsauerstoff (¹O₂) führen. Superoxiddismutase (SOD) fungiert als enzymatischer O₂ ^--Fänger (McCord et al, J. Biol. Chem. 224, 6049-6055, 1969), wohingegen 1-Methionin und DMSO beide OH.-Fänger sind.

Versuchsweiser Mechanismus für die Substrat-Xanthinoxidase- Bildung freier Radikale Schema 1

Das Substrat-Xanthinoxidase-Modell für die Bildung freier Radikale ist eingehend studiert (I. Fridowich, J. Biol. Chem. 215, 4053-4057, 1970) und zur Generierung freier Radikale sowohl "in vitro" als auch "in vivo" (H. Chmori et al, Biochem. Pharmacol. 27, 1397-1400, 1978) verwandt worden.

Eine bequeme und empfindliche spektrophotometrische Probe, um O₂ ^- spezifisch nachzuweisen und zu verfolgen, beruht auf der Eigenschaft dieses Radikals, Ferricytochrom C (Cyt c³⁺⁺) zu reduzieren. Die Gegenwart von Xanthinoxidase zusammen mit Hypoxanthin und Cyt c³⁺⁺ in Bicarbonatpuffer generiert O₂ ^-, welches anfänglich Cyt c³⁺ zu Cyt c²⁺ reduziert (R. F. Del Maestro, Microvascular Res. 22, 255-270, 1981), gefolgt von der Rückoxidation von einigem Cyt c²⁺ durch OH^· (K. Fong et al, Chem. Biol. Interact. 15, 77-89, 1976).

Wasserstoffperoxid wird durch die Zwei-Elektronenreduktion von molekularem Sauerstoff oder durch die Dismutation von O₂ ^- gebildet. Catalase (CAT) reduziert H₂O₂ zu H₂O.

b. Material und Methoden Bildung von Superoxidradikalanion O₂ ^-

Das angewandte Verfahren war mit dem von R. F. Del Maestro, J. Bjork und K. E. Arfors (Microvascular Res. 22, 239-254, 1981) beschriebenen identisch. Die Reduktion von Cytochrom c³⁺ (Cyt c³⁺) wurde in einem System verfolgt, das aus 0,96 mM Hypoxanthin, 5 · 10^-5 M Cyt c³⁺ in Bicarbonatpuffer von pH 7,35 (0,132 M NaCl, 4,7 · 10^-3 M KCl, 2 · 10^-3 M CaCl₂, 1,2 · 10^-3 M MgSO₄, 0,018 M NaHCO₃) zuammengesetzt war. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Xanthinoxidase in einer Konzentration von 0,07 U/ml gestartet. Die Adsorptionszunahme bei 550 nm wurde bei 37°C jede min über 4 min in einer thermostatisierten spektrophotometrischen Zelle verfolgt.

Jede Testverbindung wurde vor der Xanthinoxidase zugegeben. Eine Aktivitätseinheit wurde definiert als eine Änderung von 0,001 Einheiten/min. Die prozentuale enzymatische Aktivität wurde für jede Konzentration der getesteten Verbindungen berechnet und die zur Inhibierung von 50% des Enzyms (IC₅₀) benötigte Substanzmenge durch lineare Regression eines Satzes von den LOG der Konzentration M/% Inhibierung beschreibenden Datenpunkten berechnet.

c. Ergebnisse
Verbindungen
O₂ ^--Fänger-IC₅₀

(Konzentration für
	50% Inhibierung)	Beispiel 1	6.64 · 10^-6
Beispiel 2	6.33 · 10^-6
Beispiel 3	2.22 · 10^-5
Beispiel 4	3.67 · 10^-5
Beispiel 5	5.81 · 10^-6
Beispiel 6	4.12 · 10^-6
Campherol	9.05 · 10^-6 M
3,4-Dihydroxyphenylessigsäure	3.87 · 10^-5 M

3) "In vitro"-Sichtung von Verbindungen auf Arachidon- Stufenmetabolismus in menschlichen Plättchen-Mikrosomen a. Material und Methoden

Die enzymatische Untersuchung wurde in silanisiertem Glasgerät nach dem Verfahren von P. Ho, P. Walters und H. Sullivan (Prostaglandins 12, 951, 1976) durchgeführt. Die 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,9, 5 mM 2-Tryptophan, 2 M Methemoglobin, 0,2 mg Mikrosompulver und die Testverbindung in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml enthaltende Reaktionsmischung wurde bei 37°C über 5 min inkubiert, bevor 10 µl 20 µM ¹⁴C-Arachidonsäure (0,09 µCi) zugegeben wurden. Nach 5 min Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 µl 1 M Zitronensäure beendet.

Die Mischung wurde viermal mit 0,5 ml wasserfreiem Diethylether extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde erneut in ungefähr 40 µl Ether suspendiert und der Chromatographie an Kieselgelplatten unterworfen. Das Elu-tionssystem bestand aus Diethylether/ Methanol/Essigsäure (90 : 1 : 2). Die RF-Werte wurden realtiv zu Arachidonsäure gemessen. Die Dünnschichtchromatographieplatten (TLC) wurden über etwa 24 h auf LKB-Ultrafilm belichtet. Partielle Identifizierung der Flecken wurde durch mitlaufende Standards (PGA₂, PGB₂, PGE₂, PGF_2c, PXB₂, Arachidonsäure) im gleichen Lösungsmittelsystem durchgeführt. Quantitative Ergebnisse wurden durch Abfahren des entwickelten Films mit einem Transmissions- Densitometer mit zwischengeschalteten Integrator erhalten. Imidazol und Indomethacin waren als positive Standards zur jeweiligen spezifischen Inhibierung von Thromboxansynthetase und Cyclooxygenase eingeschlossen.

b. Cyclooxygenaseinhibierung in menschlichen Plättchenmikrosomen
Verbindungen
IC₅₀ (Konzentration für 50% Inhibierung)
Beispiel 1\|1.51 · 10^-4
Beispiel 2	1.68 · 10^-4
Beispiel 3	9.37 · 10^-4
Beispiel 4	1.33 · 10^-5
Beispiel 5	3.56 · 10^-6
Beispiel 6	7.39 · 10^-6
Indomethacin	1.12 · 10^-5 M
Phenylbutazon	2.74 · 10^-4 M

Die Aktivität der Substanzen auf die Cyclooxygenase wird durch die zwei Flecken quantifiziert, die PGE₂ und TxB₂ entsprechen (Verhältnis PGE₂/TxB₂).

4) "In vitro"-Inhibierung von Prostaglandinsynthetase in Widdersamenbläschenmikrosomen a. Material und Methoden

Es wurde eine verbesserte Analyse auf Basis der von Baumann et al (Naunyn-Schmiedeberg′s Arch. Pharm. 307, 73, 1979) und C. Takeguchi et al (Biochem. 10, 2372, 1971) veröffentlichten Methoden entwickelt. Die enzymatische Radioanalyse wurde in silanisiertem Glasgerät durchgeführt. Die Reaktionsmischung, die 50 mM Tris-HCl- Puffer von pH 8,3 in Gegenwart von 1 mM reduzierten Glutathion (GSH) wie 0,55 mM Hydrochinon, die Testverbindung und 50 µg Mikrosomenpulver von Widdersamenbläschen in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml enthielt, wurde über 5 min bei 37°C inkubiert, bevor 10 µl 10^-6 M ¹⁴C-Arachidonsäure (0,08 µCi) zugegeben wurden. Nach 30 min Inkubation unter gelegentlichem Schütteln wurde die Reaktion durch die Zugabe von 10 µl 1 M Zitronensäure beendet.

Die Mischung wurde viermal mit 0,5 ml wasserfreiem Diethylether extrahiert und mit Natriumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde erneut in ungefähr 40 µl Ether suspendiert und der Chromatographie an Kieselgelplatten unterworfen. Das Elutionssystem bestand aus Diethylether/Methanol/Essigsäure (45 : 1 : 2). Die RF-Werte wurden im Vergleich zu Arachidonsäure gemessen. Die Dünnschichtchromatographieplatten wurden für etwa 20 h auf LKB-Ultrafilm belichtet. Die versuchsweise Identifizierung der Flecken wurde durch mitlaufende Standards (PGE₁, PGE₂, PGF_1a, PGF_2a, PGA₁, PGA₂, PGB₁, PGB₂) im gleichen Lösungsmittelsystem durchgeführt. Quantitative Ergebnisse wurden durch Densitometrie erhalten.

c. Ergebnisse

5) "In vitro"-Sichtung von Verbindungen als potentielle Inhibitoren von Xanthinoxidase a. Material und Methoden

Die Aktivität von Xanthinoxidase wurde nach der Methode von H. M. Kalckar (J. Biol. Chem. 167, 429-443, 1947), welche die Bildung von Harnsäure spektrophotometrisch mißt, bestimmt.

In einer spektrophotometrischen Küvette wurde Xanthinoxidase für eine Endkonzentration von 0,01 Einheiten/ml gegeben, gefolgt von 0,05 M Phosphatpuffer von pH 7,4 oder dem Inhibitor. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Xanthin für eine Endkonzentration von 5 · 10^-5 M gestartet. Die Freisetzung von Harnsäure wurde alle 30 s für 2 min (lineare Phase) bei 295 nm verfolgt. Eine Aktivitätseinheit wurde definiert als eine Änderung von 0,001 Einheiten/ min. Die prozentuale enzymatische Aktivität wurde für jede Konzentration der getesteten Verbindungen berechnet und die zur Inhibierung von 50% des Enzyms (IC₅₀) benötigte Substanzmenge durch lineare Regression eines Satzes von den LOG der Konzentration M als Funktion von % Inhibierung beschreibenden Datenpunkten errechnet.

b. Resultate
Verbindungen
IC₅₀ (Konzentration für 50% Inhibierung
Beispiel 1\|5.20 · 10^-5
Beispiel 2	5.39 · 10^-5
Beispiel 3	1.13 · 10^-5
Beispiel 4	9.04 · 10^-4
Beispiel 5	3.37 · 10^-5
Beispiel 6	1.03 · 10^-6
Folsäure	6.76 · 10^-7 M
Campherol	7.89 · 10^-6 M

6) Inhibierung von menschlicher Leukozytenlipoxygenase (LO) a) Inhibierung von menschlicher polynuklearer 5- und 12- Lipoxygenase

Protokoll zum Experiment Nr. 1:
1. Inkubierung von 15×10⁶ menschlichen Leukozyten/ml mit 2 mM Ca²⁺, 0,5 mM Mg²⁺ in Gegenwart des Inhibitors bei 37°C über 20 min.
2. Stimulierung mit 1 µg Ionophor (A23187)/ml über 4 min.
3. Stoppen der Inkubation mit 1 Vol Methanol.
4. Analyse durch RP-HPLC, Säule C18, 5 µm.
5. Messung der Peakhöhe und Vergleich mit dem internen Standard (PGB₂).

Experiment Nr. 1: Analyse der Ergebnisse

b) Inhibierung von menschlicher polynuklearer 5-, 12- und 15-Lipoxygenase

Protokoll zum Experiment Nr. 2:
1. Inkubation von 11×10⁶ menschlichen Leukozyten/ml mit den Inhibitoren über 20 min (2 mM Ca²⁺ und 0,5 mM Mg²⁺) bei 37°C.
2. Stimulierung mit 10 µg Arachidonsäure und 1 µg Ionophor (A23187)/ml über 4 min
3. Stoppen der Inkubation mit 1 Vol Methanol und Analyse durch RP-HPLC.
4. Messung der Peakhöhen und Vergleich mit dem internen Standard (PGB₂).

Experiment Nr. 2: Analyse der Ergebnisse

Bemerkungen

Es ist festzustellen, daß die vorstehenden drei Verbindungen bei Konzentrationen von 10^-6 M bis 3×10^-6 M 15-Lipoxygenase stimulieren, während 5-Lipoxygenase bei diesen Konzentrationen inhibiert wird.

Es ist festzustellen, daß in Experiment Nr. 1 die Leukozyten durch das Ionophor allein stimuliert wurden, wohingegen in Experiment Nr. 2 die Zellen mit Ionophor und Arachidonsäure stimuliert worden sind. Die Gegenwart des Arachidonsäureexogens verstärkt den ID₅₀ der Inhibitoren um das 10fache; andererseits erlaubt die Zugabe der Arachidonsäure eine Messung der 15-Lipoxygenase-Aktivität, welche normalerweise in durch Ionophor allein stimulierten Leukozyten nicht nachweisbar ist.

Claims

1. Bicyclische Brenzcatechinderivate mit den allgemeinen Formeln I und II worin R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellen,
R₃ ein aromatisches Radikal, gegebenenfalls substituiert durch ein oder mehrere Halogenatome oder Trifluormethylgruppen, darstellt und
Z eine Carbonyl-, Hydroxymethylen-, Methylen-, Carbonylmethylen-, Hydroxyethylen- oder Ethylengruppe darstellt, wobei die Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindung im Falle von Carbonylmethylen und Hydroxyethylen das Kohlenstoffatom betrifft, welches benachbart zu dem in die Ringverbindung eingebundenen ist.

2. Verfahren zur Herstellung der Benzcatechinderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der Formel III worin R₁ und R₂ die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit einer geeignet substituierten Propion- oder Buttersäure (oder einem Ester oder einem Salz derselben) der Formel IV worin R₃ die oben angegebene Bedeutung hat, reagieren läßt.

3. Therapeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß als aktiver Bestandteil eine hinreichende Menge wenigstens einer der Verbindungen nach Anspruch 1 in Verbindung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger vorhanden ist.