SE464522B - Nya bicykliska katekolderivat, foerfarande foer framstaellning daerav och terapeutiska kompositioner innehaallande dem - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 4o4 522 finieras ovan. är lipoxigenas och -cyklogenasinhibitorer. De kan användas inom humanterapin som icke steroida antiinflam- matoriska, antitrombotiska, antiallergiska. antiischemiska och antianafylaktiska medel.

Uppfínningen avser vidare ett förfarande för frmställning av föreningarna med de allmänna formlerna I och II, vilket för- farande omfattar omsättning av en förening med formeln III III R O SH vari R1 och R2 har de ovan angivna betydelserna (denna förening framställes genom sulfoklorering av den aromatiska ringen med en metod härledd från den enligt JUSIUS, LIEBIGS ANN.CHEM 1929. åáå. 162. följt av en reduktion med nascerande väte, - CLEMMENSEN-reaktion -) med en lämpligt substituerad propion- eller smörsyra (eller en ester eller ett salt av de- samma) med formeln IV 123-(c)-c-c-coH IV 2 I I I vari R3 har samma betydelse som ovan.

Under alkalíska betingelser ger detta en förening med formeln V 10 15 20 25 30 35 464 522 som cykliseras med dehydratiserande medel såsom fosforsyraan- hydrid, polyfosforsyror eller -estrar, svavelsyra, klorosul- fonsyra eller Lewis-syror.

För föreningarna med formeln II omfattar förfarandet omsätt- ning av föreningen med formeln VI med en Y-R3-substituerad Y-smörsyralaktonen VII: ,,.NH , I I I *s I, R O O Ho s-c 3 HO VI VII med den metod, som härleds från den enligt K.W. BENTLEY och W.I. RUSHVOETH, brittiskt patent nr l 428 llO, vilket ger föreningen med formeln VIII: H0 C Rl0 2 VIII R2O S R som, efter cyklisering på karboxylgruppen, leder till den önskade föreningen II.

Föreningarna I och II, när Z är metylen. kan erhållas med vanliga reduktionsmetoder.

Karbonylgruppen kan omvandlas antingen till en metylengrupp genom behandling i stökíometriska proportioner med aluminium- 464 522 4 10 15 20 25 30 klorid och litiumaluminiumhydrid enligt en metod härledd från den enligt H.NAKAZUMI, T.VEYAHA och T.KITAO. J. OF HETERO- CYCLIC CHEHISTRY 1984. gl. 193 eller med metoden enligt WOLL- -KISHNER-HUANG MINLON med användning av hydrazin eller till hydroximetylen med natriumborhydridreduktion enligt V.J.

TRAYNELIS och R.F. LOVE, J. Org. Chem. 1961 26, 2728.

Uppfinningen avser slutligen farmaceutiska kompositioner, som såsom en aktiv ingrediens innehåller åtminstone en av de ovan definierade föreningarna.

Följande exempel illustrerar uppfinningen.

Exempel l 6,7-dihydroxi-2-fenyl-4-oxo-tiakromen ll :Rl = R2 = H, Z = CO, R3 = Caflsl 5 g (0,0l7 mol) ß-(3,4-dihydroxifenyltio)-kanelsyra sattes portionsvis till 10,5 ml koncentrerad svavelsyra i en tvâhal- sad 50 ml kolv försedd med en magnetisk omrörare. Reaktions- blandningen kyldes pâ is, och den erhållna suspensionen tor- kades och tvättades sedan med bensen.

Omkristallisation från varm etanol gav ett oranget pulver (utbyte 13 %). Denna förening har en smâltpunkt över 250°C (Tottoli). Dess identitet och struktur bekräftades med PMR-spektroskopi och elementarnikroanalys.

C H % beräknat 66.65 3.73 2 funnet 66.71 3.31 Exempel 2 6.7-dihydroxi-2-(o-trifluoroletyl-fenyl)-4-oxo-tiakronen (1,3 :R =n,z=co.1z3=o-cr3-c6g4)_ 1 2 l g (0,028 mol) o-trifluoronetyl-B-(3.4-dihydroxifeny1tio)- -kanelsyra upplöstes i 15 ll vattenfri kloroforn i en trehal- "\ 10 15 20 25 30 a35 464 522 sad 50 ml kolv försedd med en magnetomrörare och under ett lätt flöde av kväve. En lösning av 3,25 g (0.0075 mol) etyl- polyfosfat i 1 ml vattenfri kloroform tillsattes vid 20°C.

Blandningen återloppskokades under 2 timmar. Reaktionsbland- ningen kyldes på is och gjordes sedan alkalisk med ammoniak.

Efter extraktion tvättades den organiska fasen med vatten.

Avdrivning av det organiska lösningsmedlet gav ett oranget gummi, som renades genom silikagelkromatografi under eluering med diklorometan (utbyte 12 2). Denna förening är en fast substans. som smälter vid l3l°C (Tottoli). Dess identitet och struktur bekräftades med 136 NHR-spektroskopi och element- armikroanalys.

C H 2 beräknat 56,80 2,70 % funnet 56.64 2.69 Exempel 3 6,7-dimetoxi-2-fenyl-4-oxo-tiakromen (I : Rl = R2 = R2 = CH3, Z = CO, R3 = Cafisl Genom att arbeta såsom beskrives i exempel 2 men med använd- ning av ß-(3.4-dimetoxifenyltio)-kanelsyra istället för o-trifluorometyl-ß-(3.4-dihydroxifenyltio)-kanelsyra erhölls titelföreningen med 15 %-igt utbyte. Detta är en gul fast substans, som smälter vid 212°C (Tottoli). Dess identitet och struktur bekräftades med 130 NHR-spektroskopi och elementar- mikroanalys.

C H % beräknat 68,44 4.73 2 funnet 63.44 4-74 Exemgel 4 6.7-dimetoxi-2-(o-trifluorometyl-fenyl)-4-oxo-tiakromen (1 = nl = az = en? z = co. Ra = °-CF3_-_C+-,ä4i Genom att arbeta såsom beskrives i exempel 2 men med använd- 464 522 5 10 15 20 25 30 35 ning av o-trifluorometyl-ß-(3,4-dimetoxifenyltio)-kanelsyra istället för o-trifluorometyl-ß-(3,4-dihydroxifenyltio)- -kanelsyra erhölls titelföreningen med 50 2-igt utbyte. Det är en vit fast substans, som smälter vid l94°C. Dess identitet een struktur bekräftades med 13c NHR-spektrosxopi och ele- mentarmikroanalys. 'z C H % beräknat 59.01 3,57 % funnet 58.84 3.56 Exempel 5 7,8-dimetoxi-2-fenyl-5-oxo-benso[6] tiepan lll : Rl = R2 = CH3L Z = CH2 . CO. R3 = Câgsl Genom att arbeta såsom beskrives i exempel 2 men med använd- ning av 4-fenyl-4-(3.4-dimetoxifenyltio)-smörsyra istället för o-trifluorometyl-ß-(3,4-dihydroxifenyltio)-kanelsyra erhölls titelföreningen med 27 %-igt utbyte. Rening utfördes genom dekantering från dietyleter. Denna förening är en vit fast substans, som smälter vid l35°C (Tottoli). Dess identitet och struktur bekräftades med 13 mikroanalys.

C NHR-spektroskopi och elementar- C H % beräknat 68.76 5,77 % funnet 68,63 5,84 Exempel 6 6,7-dimetoxi-2-(o-trifluorometylfenyl)-4H-tiakromen (I : Rl = R2 = CH3. Z = CH2, R3 = o-CF3;Q6§4¿ 204,9 mg (5,4 mmol) av litiumaluminiumhydrid och 720 mg (5,6 mmol) av aluminiumklorid upplöstes vid rumstemperatur i 32 ml vattenfri tetrahydrofuran i en trehalsad 100 ml kolv försedd med en magnetomrörare och under ett lätt flöde av kväve. En lösning av l g (2,7 mmol) av 6,7-dimetoxi-2-(o-trifluorometyl- -fenyl)-4-oxo-tiakromen, framställd sâson beskrives i exempel 10 15 20 25 30 35 464 522 4, i 9 ml vattenfri tetrahydrofuran tillsattes vid 25°C. Reak- tíonsmediumet omrördes under 2 timmar vid 20-25°C och hydroly- serades sedan med 0,54 g vatten och 1,35 ml koncentrerad svavelsyra. Den erhållna blandningen filtrerades och extra- herades sedan med dietyleter. Avdrivning av det organiska lösningsmedlet gav ett rött pulver (utbyte 20 2), som smälter vid 94°C (Tottoli). Identiteten och strukturen hos denna före- ning bekräftades med l3C NHR-spektroskopi och elementar- mikroanalys.

C H % beräknat 61,36 4.29 % funnet 61,52 4,35 FARMAKOLOGI Lipoxigenaser (LOs) omvandlar arakidonsyra (AA) till hydroxi- derivat och leukotriener. Dessa produkter är potenta farma- kologiska medel med potentiellt viktiga roller vid inflamma- tions- och hypersensitivitetsrubbningar. Flera LOs verkar på AA principiellt 5 LO leder till leukotriener, 12 LO leder till 12-hydroperoxieikosatetraensyra (12 HPETE) och andra 12 hydroxiföreningar, 15 LO leder till 15 HPETE och andra 15-hydroxiföreningar och (vid lägre halt) 8 LO och ll LO.

De mest betydande produkterna i LO-reaktionsvâgarna är leuko- triener, som produceras av S-LO. Den antydda betydelsen hos SRS-A vid astma- och anafylaktiska reaktioner och upptäckten att SRS-A hör till leukotrienerna stimulerade intresset för studier av den biologiska betydelsen hos dessa substanser. LTC 4 och LTD 4 (0,1 till l nH) orsakade koncentrationsberoende kontraktioner av marsvinsileum när den användes för att be- stämma den biologiska aktiviteten hos SRS - A i relation till histamin. Det visade sig att på molbasis var histamin 200 gån- ger mindre aktiv än LTC 4, vilket antyder att l enhet av 10 15 20 25 30 35 464 522 8 SRS-A(6 ng Hist, HC1) motsvarar ca 0,2 pmol LTC 4.

LTC 4 och LTD 4 ökar även kärlpermeabiliteten i marsvinsskinn och hade stimulerande egenskaper på glatt muskulatur identiska med dem, som tidigare observerats för SRS-A. LTC 4 och LTD 4 spelar en kritisk roll för mikrocirkulationen i hjärta eller lunga.

LTB 4 påverkar leukocytmigrering genom att orsaka leukocytad- hesion till endoteliumet i post-kapillära små vener och genom potenta kemotaktiska effekter. Därför är leukotriener viktiga mediatorer i värdförsvarsmekanismer såsom omedelbara hypersen- sitivitetsreaktioner och akuta inflammationsreaktioner. Vidare är effekterna av vissa cyklooxigenaser (CO) produkter och leukotriener komplementära. Synergism mellan leukotrienerna orsakar sålunda plasmaläckage, och de vasodilaterande före- ningarna PGE 2 och PGI 2 kan ha betydelse vid ödembildning.

Vidare måste en stor betydelse ges till synergistiska effekter mellan leukotrienerna och tromboxan (TxA2) vid bronkokonstrik- tion. LTC 4 och LTD 4 orsakar frigivning av TxA2 i marsvins- lunga. Eftersom TxA2 är en viktig substans, som orsakar kon- striktion i andningsvägarna kan dess frigivning medverka till bronkospasm vid allergiska minifesteringar. Vidare förefaller en del resultat tyda på att LTB 4 medverkar vid vissa verknin- gar hos PAF-aceter. Icke steroida anti-inflammatoriska läkeme- del (AINS) förhindrar inte anafylaxi. Omvänt ökar de hypersen- sitivitetsreaktioner eftersom de mobiliserar AA för LOs-reak- tionsvägarna. Kortikosteroider (CS) förhindrar frigivningen av prekursorn, som verkar genom att stimulera syntesen av lipomo- dulin, en peptidinhibitor för fosfolifasen A2. Genom att inhi- bera frigivningen av AA förhindrar CS bildning av icke endast CO-produkter utan även LOs-produkter och sedan bildning av leukotriener.

Den ökande kunskapen av LOs-systemet förefaller antyda nya möjligheter för utveckling av nya och mer terapeutiska medel. isynnerhet för sjukdomar relaterade till omedelbara hypersen- sitiva reaktioner såsom astma, allergi, hjärtanafylaxi, hjärn- 10 15 20 30 35 464 522 ischemi och inflammation. Sådana läkemedel kan vara baserade på antagonism av slutprodukter eller inhibering av enzymer involverade i alstringen av och vidare omvandling av den intermediära nyckelprodukten LTA 4. En dubbel effekt på leuko- trienreaktíonsvägen och cyklooxigenasreaktionsvâgen kan även vara av värde. 1) 'in vitro' undersökning av 7 föreningar såsom potentiella inhibitorer av sojabönlipoxigenas a. Introduktion Monohydroxi-eikosatetraensyror (HETES) är kvantitativt bety- dande arakidonsyrametaboliter (AA) i en mängd olika däggdjurs- celler och vävnader. T.ex. har 12-L-HETE identifierats från blodplättarna; 5-D-HETE från kanin PM; 12-L-HETE. ll-HETE och 15-HETE från marsvinslunga och råttmastceller; och 5-HETE. 8-HETE, 9-HETE, ll-HETE och 12-HETE bildar humana neutrofiler.

HETE-fördelningen är artberoende och representativt för AA-metabolism, katalyserad enzymetisk med lipoxigenaser. De möjiga biologiska rollerna hos dessa produkter har inte full- ständigt belysts ännu. 12-HETE erhållande från humana blod- plättar visade emellertid kemotatisk aktivitet för humana polymorfonukleära leukocyter (Siegel, H.I. et 1. Proc. Natl.

Acad. Sci. 11. 308-312; l980). 5-HPETE (hydroperoxisyran) är föregångaren till den långsamt reagerande substansen. ett mycket verksamt kontraherande medel på glatt muskulatur, som förmedlar symtom av omedelbar hypersensivitet. Det framgår sålunda att inhibering av lipoxigenas endast kan vara välgörande isynnerhet när anti-allergiska eller anti-inflamma- toriska läkemedel kartlägges. Däggdjurs- och växtlipoxigenas (soljaböna) ha: många biokemiska egenskaper gemensamt, och det har visats att de flesta inhibitorer för plantenzym även in- hiberar lipoxigenaser härledda från blodplättar eller leuko- cyter (Baumann. J. et al.. Prostglandins ZQ. 627-639, 1980).

Sojabönlipoxigenas inducerar den exklusiva bildningen av 15-HPETE (C.P.A. Van Os et al. Biochim. et Biophys. Acta Qåå. 177-193, 1981) och har visat sig vara tio gånger mer känslig 464 522 10 10 15 20 25 30 än blodplättlipoxigenas (Wallach, D.P., et al, Biochim. och Biophys. Acta ggâ, 361-372, 1981). Dessutom är 15-HETE en potent och specifik inhibitor av blodplättlipoxienas (12-HETE) som indirekt stimulerar bildningen av tromboxan A2 (Vander- hoek, J.. et 1.. J.Biolog. chem. ggâ, 5996-5998; (1980). 15-hydroperoxianalogen har även rapporterats undertrycka prostacyklinsyntetasaktivitet i grisaorta (Gryglewski. R.J. et al. Prostglandins lg. 685-713; 1976). Denna inhiberande verkan utövas av produktionen av en destruktiv oxiderande substans, antagligen en OH-radikal eller en substans med liknande akti- vitet (Weiss, S.J., et al. Blood, âå. 1191. 1979). w b. Material och metoder bl) Spektrofotometrisk analys En spektrofotometrisk metod har utvecklats för att bestämma enzymaktiviteten enligt (J. Amer. Chem. Soc. LQQ. 1750-1752; 1982). I en slutvolym av 1.8 ml blandades 0,2 H luftad borax- buffert pH = 9,00 med 500 enheter sojabönlipoxigenas. När inhibitorerna testades sattes de till 0,6 nl vid slutkoncent- ln :111 104m föijt av förinkubering 10 minuter vid rumstemperatur. Reaktionen sattes igång av l0_4H arakidonsyra. Efter inkubering vid rumstemperaturen i 90 minu- ter bestämdes l5-HPETE genom absorptionsmätningar vid 236 nm. rationer från 10- b2) Behandling av resultateten Denna metod kontrollerades med kända inhibitorer för lipoxige- nas. För varje testsubstans inkluderades en kontroll med kokad lipoxigenas för att beakta eventuell absorption av föreningen vid den använda våglängden. Den procentuella enzynetiska akti- viteten beräknades för varje koncentration. och den mängd substans, som erfordrades för att inhibera 50 % av enzymakti- viteten, beräknades med linjär regression på en uppsättning datapunkter, som beskriver logaritmen av koncentrationen (H) 2 inhibering. 10 15 20 25 30 35 H 464 522 c. Resultat föreningar IKSO (koncentration med 50 % inhibering) Exempel l 7,25 10°5 Exempel 2 8,23 10-5 Exempel 3 1,21 1o“6 Exempei 4 1,35 1o"5 Exempel 5 2,29 10-6 Exempel 6 1,42 10"? Difenyltiokarbazon 1,61 l0'6H 2) 'in vitro' potentiell inhiberíng av superoxidanjonradikal (02 '> a. Introduktion Den inflammatoriska processen kännetecknas av en minskad in- tegritet hos den endoteliala cellbarriären, förändringar i kärlpermeabiliteten och aktivering av fagocytceller såsom polymorfonukleära leukocyter (PM) med den efterföljande fri- givningen och alstringen i det extracellulära utrymmet av en grupp aktiva föreningar. av vilka en del är fri radikaler.

Sambandet mellan dessa radikalsubstanser och de andra egen- skaperna hos inflammationen är inte helt kartlagd. En väsent- lig komponent 1 andningsutbrottet hos aktiverade inflammato- riska celler säsom PMN är den envärda en enzymatiska reduk- tionen av 02 till superoxidanjonradikalen 02 '. En stor andel av alstrat 02 _ friges i det extracellulära utrym- met, där en spontan dismutation kan ske med åtföljande bild- ning av H2O2 och 02. Den samtidiga närvaron av 02 -, H202 och gelatbunden metallkatalysator i det extracellu- lära utrymmet kan resultera i ytterligare alstring av mer aktiva syrehärledda molekyler såsom hydroxylgrupp (0H.), och' ett singlettsyre (102). Superoxiddismuts (SOD) fungerar 46Ä 522 10 15 20 25 30 35 12 som en renhâllare av 02 _ (McCord et al. J. Biol. chem.

Zêå, 6049-6055; 1969), under det att 1-metionin och DMSO båda är OH-renhâllare.

Enz-H2 - 02 --> Enz + 02' + 2H+ SOD | (renhållare) CAT metalljoner 1 oz -Hzoè-í-Ho -_--%on. +oH"+ o (renhållare) 2 2 Q ' - 2 2 i 1-metionin eller DMSO (renhållare) Experimentmekanism av substrat-xantinoxidasfriradikalbildning Schema l Substratxantincxidasmodellen för alstring av fria radikaler har studerat intensivt (Fridowich. I.. J. Biol. Chem. glå. 4053-4057; 1970) och används för att alstra fria radikaler både 'in vitro' och 'in vivo' (Chnori, H., et al. Biochem.

Pharmacol. gl, 1397-1400; 1978).

En lämplig och känslig spektrofotonetrisk analys för att specifikt upptäcka och styra 02 _ år baserd på egenskapen hos denna radikal att reducera ferricytokron C (Cyt c3+). 3* 1 bikar- 3+ Närvaron av xantinoxidas ned hypoxantin och Cyt c bonatbuffert alstrar 02 ' sol initialt reducerar Cyt c till Cyt c2+ (Del Maestro. R.F.. Hicrovascular Res. gg. 255-270; 1981), följt av reoxidation av vissa Cyt c2+ a OH' (Fong, K., et al.. Chen. Biol. Interact. lä, 77-89; 1976).

V 4) 10 15 25 30 35 13 464 522 Hypoxantin + xantinoxidas + Cyt c3+-f) 02";-Cyt c2++-OH' Cyt c3+ Väteperoxid bildas genom tvâelektronreduktionen av molekylärt syre eller genom dismutation av 02 '. Katals (CAT) reduce- rar HZOZ til H20. b. Material och metoder Superoxidanjonrdikal 02__-alstring Det använda förfarandet var identiskt med det, som beskrives av Del Maestro, R.F., J. Björk och K.E. Arfors (Hicrovascular Res. gg. 239-254: 1981). Reduktionen av cytokrom cs* (Cyt c3+) analyserades i ett system sammansatt av 0,96 mM hyp- oxantin, s.1o'5n cyc G3* 1 bikarbonatbuffert pa = 1.35 (o,1a2n Naci, 4,1,1o'3n xci, z,1o'3n caciz. 1,2.1o'3n MgSO4. 0,018! NaHC03). Reaktionen startades genom tillsats av xantinoxidas i en koncentration av 0,07 U/ml. ökningen i absorbansen vid 550 nm styrdes vid 37°C i en termostaterad spektrofotometrisk cell varje minut under 4 minuter.

Varje testsubstans tillsattes före xantinoxidaset. En enhet aktivitet definierades som förändringen av 0.001 enheterlmi- nut. Den procentuella enzymatiska aktiviteten beräknades för varje koncentration av undersökta föreningar, och mängden er- forderlig substans för att inhibera 50 % av enzymet (IKSO) beräknades med linjär regression på en uppsättning datapunk- ter, som beskriver logaritmen av koncentrationen H/% inhibe- ring. 10 15 20 25 30 35 464 522 14 c. Resultat Föreningar oz " rennaiiare, IKSO (koncentration av 50 t inhibi- tion Exempel 1 6,64 1o”6 Exempel 2 6,33 10-6 Exempel 3 2,22 10"5 Exempel 4 3,67 1o'5 Exempel 5 5.81 1o'5 Exempel 6 4,12 10'5 Camferol 9,05 10'6H 3,4-dihydroxi- fenylätciksyra 3,87 1o"5u 3) 'in vitro' analys av föreningar i arakidonkaskadmetabolism i humana blodplättmikrosomer a. Material och metoder Den enzymatiska analysen utfördes på en silanbehandlad glasyta med metoden enligt P. Ho, P. Walters och H, Sullivan (Prosta- glandins lg. 951; 1976). Reaktinsblandningen innehållande 50 mh tris HCl buffert, pH 7,9, 5 mH 2-tryptofan. 2 H-metemoglo- bin, 0,2 mg mikrosomalt pulver och testföreningen i en total volym av 0.2 ml inkuberades vid 37°C under 5 ninuter före tillsatsen av l0ul 20uHl4C arakidonsyra (0,08uCI).

Efter 5 minuters inkubering avslutades omsättningen genom tillsats av l0ul lH citronsyra.

Blandningen extraherades 4 gånger med 0.5 nl vattenfri dietyl- eter och torkades med natriunsulfat. återstoden âtersuspende- rades i ca 40ul eter och utsattes för kronatografi på sili- kagelplattor. Elueringssystenet bestod av dietyleterlmetanol- /ättiksyra (90:l:2). RF-värdena mättes relativt arakidonsyra. 10 15 20 25 30 35 15 464 522 Tunnskiktskromatografiplattor (TLC) exponerades på LKB-u1tra- film under ca 24 timmar. Partiell identifiering av fläckarna utfördes med löpande standardsubstanser (PGA2. PGB2, PGE2, PGF2c. PXB2, arakidonsyra) i samma lösningsmedel- system. Kvantitativa resultat erhölls genom kartläggning av den framkallade filmen med en transmissionsdensitometer (EC apparatur 910) med en mellankopplad Hewlett Packard 339OA integrator. Imidazol och indometacin inkluderades som positiva standarder för specifik inhibering av tromboxansyntetas resp. cyklooxigenas. b. Cyklooxigenasinhibering i humana blodplättsmikrosomer Föreningar IKSU (koncentration vid 50 % inhibering) Exempel 1 1,51 1o'4 Exempel 2 1,68 1o"4 Exempel 3 9.37 10-4 Exempel 4 1,33 l0"5 Exempel 5 3,56 1o'6 Exempel 6 7,39 l0'6 Indometacin 1,12 10-5! Fenylbutazon 2,74 l0_4M Aktiviteten hos substanserna i cyklooxigenaset kvantifieras genom de tvâ fläckar, som motsvarar PGE2 och TxB2 (för- hållande PGE2/TxB2). 4) 'in vitro' inhibition av prostaglandinsyntetas i vesikel- mikrosomer i sädesvätska från bagge a. Material och metoder En förbättrad analys togs fram baserat på de publicerade metoderna enligt Baumann et al (Nunyn-Schniedeberg's Arch. 10 15 20 25 30 35 464 522 16 Pharm. ågl, 73; 1979) och Takeguchi, C. et al (Biochem. lg, 2372; 1971). Den enzymatiska radioanalysen utfördes på en silanbehandlad glasyta. Reaktionsblandningen innehållande 50 mM tris HC1 buffert, pH = 8.3 i närvaro av reducerad glutation (GSH). 1 mM samt hydrokinon, 0,55 mH, testsubstansen och 50ug av vesikelmikrosomalt pulver från baggesädesvätska i total volym av 0,2 ml inkuberades 5 min. vid 37°C före till- sats av 10u1 l4C arakidonsyra 10-6! (0,08uCI). Efter 30 minuters inkubering med tillfällig skakning avslutades reaktionen genom tillsats av l0ul citronsyra lM.

Blandningen extraherades fyra gånger med 0,5 nl vattenfri dietyleter och torkades ned med natriumsulfat. återstoden âtersuspenderades i ca 40ul eter och utsattes för kremato- grafi på silikagelplattor. Elueringssystenet bestod av dietyl- eter/metanol/ättiksyra (45:1:2). RF-värdena mättes med refe- rens till arkidonsyra. Tunnskiktskromatografiplattor exponera- des för LKB-ultrafilm under ca 20 timmar. Preliminär identi- fiering av fläckarna utfördes med löpande standardföreningar (PGEl. PGE2 PGFla. PGF2a. PGAl. PGA2, PGBI.

PGB2) i samma lösningsmedelsysten. Kvantitativa resultat erhölls genom densitometri. b. Resultat Autoradiografkvantifiering Föreningar 2 variation -6 3,2 10 H PGF2 PGE2 PGD2 Exempel l - 51.49 - 15.12 - 5.12 Exempel 2 - 59.12 - 17,30 - 6,30 Exempel 3 - 36,26 - 22.47 - 2,11 Exempel 4 - 42.84 - 41.25 - 11.28 Exempel 5 - 28.10 - 33.33 - 16.75 Exempel 6 - 30.29 - 15-43 ' 29-53 Fenylbutazon - 43.36 - 15-37 ' 21-93 2 l0'5H w 10 15 20 30 35 464 522 17 §l_'in vitro' kartläggning av föreningar som potentiella inhibitorer av xantinoxidas a. Material och metoder Xantinoxidasaktivitet bestämdes med metoden enligt H.H.

Kalckar (J. Biol. Chem. 167, 429-443, 1947) som mäter urin- syrabildningen spektrofotometriskt.

I en spektrofotometrisk kyvett, sattes xantinoxidas till en slutkoncentration av 0,01 enheter/ml. följt av fosfatbuffert 0,05 M, pH = 7,4 eller inhibitorn. Reaktionen sattes igång genom tillsatt xantin vid en slutkoncentration av 5.l0'5M.

Frigivningen av urinsyra styrdes vid 295 nm varje 30 sekund under 2 minuter (linjär fas). En aktivitetsenhet bestämdes som förändringen av 0,001 enheter/minut. Den procentuella enzy- matiska aktiviteten beräknades för varje koncentration under- sökt förening. och den mängd substans. som erfordrades för att inhibera 50 2 av enzymet (IK50) beräknades med linjär reg- ression på en uppsättning datapunkter, som beskriver logarit- men av koncentrationen M som funktion av procent inhibering. b. Resultat Föreningar IKSO (koncentration vid 50 % inhibering) Exempel 1 5,20 10-5 Exempel 2 5,39 l0'5 Exempel 3 1.13 10-5 Exempel 4 9.04 1o'4 Exempel 5 3,37 10-5 Exempel 6 1.03 10'° Folsyra 6.76 l0_7N Kamferol 7,89 10-6! 10 15 20 25 30 35 4654 i 5222 18 6) Inhibering av humant leukocytlípoxigenas (LO) a) Inhíberíng på human polynukleâra 5- och 12-lipoxigenaser Protokoll för experiment nr l: l. Inkubering av 15 x 106 humana leukocyter/ml med Ca2+ 2 mn. Mg2*o.5 mn 1 närvaro av lnnlblrererna vid 37°c under zo minuter. 2. Stimuleríng med lpg jonofor (A23l87)/ml under 4 min. 3. Stopp av inkuberingen med l volym metanol. 4. Analys med TP-HPLC. kolonn C18. Sum. 5. Mätning av topparnas höjd och jämförelse med inre standard (PGB2).

Experiment nr l: analys av resultaten lxso Produkten 5-HETE LTB4 12-HETE Exempel l 2.lo'5n 2.lo"6u 2.lø'5n Exempel 3 lo"6u lo'6n 1o'6n Exempel s 2,lo'6 lo'6n lo'6u Exempel 6 a,lo'6 lo'6n 2,lo'6n b) Inhibering på humana polynukleära 5-, 12- och l5-lipoxige- naser Protokoll för experiment nr 2: 1. Inkubering av ll x 106 humana leukocyter/ml med ínhibi- 2 2+ torerna under 20 minuter (2 mH Ca + och 0.5 IH Hg ) vid 10 15 20 25 30 35 19 am. 2. Stimulering med l0ug arakidonsyra och lug jonofor (A23l87)/ml under 4 minuter. 3. Stopp av inkuberingen med l volym metanol och analys av 'RP-HPLC. 4. Mätning av topparnas höjd och jämförelse med inre standard (PGB2).

Experiment nr 2: analys av resultaten IK Produkter 5-HETE 12-HETE 1š9HETE EET LTE4 iExempe1 1 2,1o'6M 1o'6M 3,1o"5M 4,1o'5M 4,1o'6M Exempel 2 2,1o"6m 1o'6M 1o'5M 5,1o'5M 2,1o'6M Exempel 3 5,1o'5M 5,1o'6M s,1o'5M 1o'6M 5,1o'6M Exempel 4 1o'6m 1o'5M z,1o'6M 1o_5M s,1o°6M Exempel 5 3,1o'6M 2,1o'6M 1o'6M 2,1o'6M 1o"6M Exempel 6 6 3,1O_6M 5,10-GM 2,10-§M 10-6M 2,10' E Aamëršaiasere Stimulering av 15-lipoxigenas med ovanstående tre föreningar vid koncentrationer på l0'6H till 3 x l0“6H noteras under det att S-lipoxigenas inhiberas vid dessa koncentrationer.

Det skall framhållas att i experiment nr l har leukocyterna stimulerats med enbart jonoforen under det att i experiment nr 2 cellerna har stimulerats med jonoforen och arakidonsyra.

Närvaron av arakidonsyra exogen ökar 10 gånger ID50 för ginhibitorerna. A andra sidan medger tillsatsen av arakidonsyra mätning av aktiviteten hos 15-lipoxigenas, som normalt inte kan bestämmas i leukocyter, som stimulerats med enbart jonofor.

Claims (3)

464 522 10 15 20 25 30 20 Patentkrav

1. Bicykliska katekolderívat med de allmänna formlerna I och II RlO Z R o Z I l ü l R O S I II vari var och en av Rl och Rzoberoende av varandra betecknar en våteatom eller en metylgrupp, R3 betecknar en fenylqrupp. eventuellt substituerad med en eller flera trifluorometylqrupper och Z betecknar en karbonyl, metylen- och karbonylmetylengrupp. varvid syre-kolbindningen i karbonylmetylengruppen omfattar kolatomen nära den, som deltar i ríngbildninqen.

2. Ett förfarande för framställning av katekolderivat med de allmänna formlerna Z z Rlo a Rlo: j l R o s R R o s 2 R3 I II . vari var och en av RI och R2 oberoende av varandra betecknar en väteatom eller en metylgrupp, R3 betecknar en fenylgrupp. eventuellt substítuerad med en eller flera trífluorometylgrupper och 10 15 20 25 30 35 464 522 21 Z betecknar en karbonyl-, metylen-, karbonylmetylengrupp. var- vid syre-kolbindníngen i karbonylmetylengruppen omfattar kol- atomen nära den, som deltar i ringbildningen, K ä n n e - t e c k n a t av att en förening med formeln Ill III R O SH vari R1 och R2 har de ovan angivna betydelserna, omsättes med en på lämpligt sätt substituerad propion- eller emörstra (eller en ester eller ett salt därav) med formeln IV I I I R3_ICI""C_C-COH Iv 2 I I I vari R3 har ovan angiven betydelse.

3. En terapeutisk komposition, vari den aktiva ingrediensen är en tillräcklig mängd av minst en av föreningarna med de all- mânna formlerna I och II RIG L Rlg Z R O S R Q R3 s RB I II vari _ var och en av RI och R2 oberoende av varandra betecknar en väteatom eller en metylgrupp, *4¿4 522 22 H3 betecknar en fenylgrupp, eventuellt substítuerad med en eller flera trífluorometylgrupper och Z betecknar en karbonyl-, metylen- och karbonylmetylenqrupp, 5 varvid syre-kolbíndníngen í karbonylmetylenqruppen omfattar kolatomen nära den, som deltar í rínqbíldníngen, tillsammans med ett lämpligt utdrygníngsmedel eller bärare.