DK165115B - Bicycliske catechol-derivater, fremgangsmaade til fremstilling deraf og farmaceutiske praeparater indeholdende saadanne derivater - Google Patents

Description

DK 165115 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte bicyc-liske catechol-derivater, fremgangsmåde til fremstilling deraf og farmaceutiske præparater indeholdende sådanne derivater.

5

De omhandlede bicycliske catechol-derivater, er kendetegnet ved, at de har en af de almene formler: 10

Rl°*V^Y'ZN *1°>Υ:::ΝΥ'Ζνϊ

XX X'·" XX X

15 (i) (II) hvori og R3 er ens og betegner et hydrogenatom eller 20 en methylgruppe, R3 betegner en O-trifluormethylphenylgruppe eller en phenyl gruppe og 25 Z betegner en carbonyl-, methylen- eller carbonylmethy- lengruppe, idet oxygen-carbon-bindingen, når det drejer sig om carbonylmethylen involverer det carbonatom, som er nabostillet til det i ring-fusionen involverede carbonatom.

30

Forbindelser med de ovenfor anførte almene formler I og II er inhibitorer af lipoxygenase og cyclogenase. De kan anvendes i den humane terapi som ikke-steroide anti-in-flammatoriske, anti-thrombotiske, anti-allergiske, anti-35 iskæmiske og anti-anafylaktiske midler.

DK 165115B

2

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af de bicycliske catechol-derivater med formlen I eller XI, hvori Z er carbonyl eller carbonylmethylen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man cyc-5 liserer en forbindelse med formlen: H02C-(CH2)n h

Vy\ V v 10 JL.

hvori R^, R2 og R^ har de tidligere nævnte betydninger, 15 og n er 0 eller 1, og den stiplede linie betegner en fakultativ binding under anvendelse af dehydratiserende midler såsom phosphorsyreanhydrid, polyphosphorsyre eller ester, svovlsyre, chlorsulfonsyre eller andre Lewis syrer.

20

Forbindelser med formlen (II) hvori Z betegner carbonyl, og R1 og R2 er hydrogen, kan også fremstilles ved en reaktion mellem forbindelsen med formlen (VI) og en r-R^-substitueret r-butyrolacton (VII): 25 HO .yv

Χλ „XX

HO t S — C R3 0 0 30

VI VII

hvori R3 har ovenfor anførte betydning i overensstemmelse 35 med en metode, som er afledt af den, der er anført af K.W. Bentley og W.I. Rushvoith, i Britisk patentskrift nr. 1 428 110, hvorved forbindelsen med formlen dannes:

DK 165115B

3

„ Λ HO,C

vXOs, 10 hvori Rg har ovenfor anførte betydning, som efter cycli-sering ved carboxylsyregruppen fører til den ønskede forbindelse med formelen (II), hvori Z er carbonyl, og og R2 er hydrogen.

15

Man kan opnå forbindelser med formlen (I) og (II), i hvilke Z er methylen, ved sædvanlige reduktionsmetoder af en af de tilsvarende forbindelser med formlen I eller II, hvori Z er carbonyl.

20

Carbonylgruppen kan enten omdannes til en methylengruppe ved behandling med støkiometriske mængder af aluminium-trichlorid og lithiumaluminiumhydrid i overensstemmelse med en metode, der er afledt fra den, der er anført af H.

25 Nakazumi, T. Veyama og T. Kitao, J. of Heterocyclic Chemistry 1984, 21, 193, eller ved metoden beskrevet af

Woll-Kishner-Huang Minlon under anvendelse af hydrazin.

Endelig angår opfindelsen farmaceutiske præparater, som 30 er ejendommelige ved, at den aktive bestanddel er en tilstrækkelig stor mængde af mindst et af de bicycliske ka-techol-derivater som ovenfor beskrevet i kombination med et passende bærestof eller excipiens.

35 De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen.

DK 165115B

EKSEMPEL 1 4 6.7- Dihydroxy-2-phenyl-4-oxo-thiachromen 5 (I = R2 = Η, Z = CO, Rc = C6H5)

Man satte i portioner 5 g (0,017 nunol) 0-(3,4-dihydroxy-phenylthio)-kanelsyre til 10, 5 ml koncentreret svovlsyre i en tohalset kolbe på 50 ml, der var udstyret med mag-10 netomrører. Reaktionsblandingen blev afkølet på is, og den opnåede suspension blev tørret og derpå vasket med benzen.

Omkrystallisation i ethanol førte til et orangefarvet 15 pulver (udbytte 13%). Denne forbindelse havde et smeltepunkt højere end 260 °C (Tottoli). Dens identitet og struktur blev bekræftet ved 1HNMR spektroskop! og mikro-elementæranalyse.

20 C H

% beregnet 66,65 3,73 % fundet 66,71 3,81 EKSEMPEL 2 25 6.7- Dihydroxy-2- (o-trif luormethyl-phenyl) -4-oxo-thiachro-men (I ;R^ = Ro = Η, Z = CO, Ro = O-CFp - ) 30

Man opløste 1 g (0,028 mmol) o-trifluormethyl-0-(3,4-di-hydroxyphenylthio)-kanelsyre i 15 ml vandfrit chloroform i en trehalset kolbe på 50 ml, som var udstyret med mag-netomrører, og som befandt sig under en svag strøm af ni-35 trogen. Man tilsatte ved 20 "C en opløsning af 3,25 g (0,0075 mmol) ethylpolyphosphat i 1 ml vandfri chloroform. Blandingen blev opvarmet under tilbagesvaling i 2

DK 165115B

5 timer. Reaktionsblandingen blev afkølet på is og derpå gjort alkalisk med ammoniak. Efter ekstraktion blev den organiske fase vasket med vand. Afdampning af det organiske opløsningsmiddel førte til en orangefarvet gummi, som 5 blev renset ved silicagelkromatografi, idet man eluerede med dichlormethan (udbytte 12%). Denne forbindelse er et fast stof, der smelter ved 131 °C (Tottoli). Dens identi- 13 tet og struktur blev bekræftet ved C NMR spektroskopi og ved mikroelementæranalyse.

10

C H

% beregnet 56,80 2,70 % fundet 56,64 2,69 15 EKSEMPEL 3 6,7-Dimethoxy-2-phenyl-4-oxo-thiachromen (I ;R1 = R2 = CH3, 2 = CO, R3 = C6H5) 20

Man gik frem som beskrevet som i eksempel 2, men anvendte Æ-(3,4-dimethoxyphenylthio)-kanelsyre i stedet for o- trifluormethyl-Æ- (3,4-dihydroxyphenylthio) -kanelsyre, hvorved man opnåede den i overskriften nævnte forbindelse 25 med et udbytte på 15%. Det er et fast gult stof, som smelter ved 212 °C (Tottoli). Dets identitet og struktur 13 blev bekræftet ved C NMR spektroskopi og ved mikroelementæranalyse .

30 C H

% beregnet 68,44 4,73 % fundet 68,44 4,74 35

DK 165115B

EKSEMPEL 4 6 6.7- Dimethoxy-2-(o-trifluormethyl-phenyl)-4-oxo-thiachro-men 5

Man opnåede, idet man gik frem som beskrevet i eksempel 2; men idet man anvendte o-trifluormethyl-/5-( 3,4-dimetho- xyphenylthio)-kanelsyre i stedet for o-trifluormethyl-Æ- (3,4-dihydroxyphenylthio)-kanelsyre, den i overskriften 10 nævnte forbindelse med et udbytte på 50%. Det er et fast hvidt stof, som smelter ved 194 °C. Dets identitet og 13 struktur blev bekræftet ved C NMR spektroskopi og ved mikroelementæranalyse.

15 C H

% beregnet 59,01 3,57 % fundet 58,84 3,56 EKSEMPEL 5 20 7.8- Dimethoxy-2-phenyl-5-oxo-benzo[b]thiepan (II :R± = R2 = CHC, Z = C0-CH2, Rc = ) 25 Man opnåede, idet man gik frem som beskrevet i eksempel 2; men idet man anvendte 4-phenyl-4-(3,4-dimethoxyphenyl-thio)-smørsyre i stedet for o-trifluormethyl-/5-(3,4-dihydroxyphenylthio) -kanelsyre, den i overskriften nævnte forbindelse med et udbytte på 27%. Rensningen blev gen-30 nemført ved at dekantere fra diethylether. Denne forbin delse er et fast hvidt stof, som smelter ved 135 °C (Tot- 13 toli). Dens identitet og struktur blev bekræftet ved C NMR spektroskopi og ved mikroelementæranalyse.

35 C H

% beregnet 68,76 5,77 % fundet 68,63 5,84 EKSEMPEL 6

DK 165115B

7 6.7- Dimethoxy-2- (o-trif luorme thy lphenyl) -4H-thi achr omen 5 (I :RX = R2 = CH3, Z CH2, R3 = o-CF^-CgH^)

Man opløste ved omgivelsernes temperatur 204,9 mg (5,4 mmol) lithiumaluminiumhydrid og 720 mg (5,6 mmol) alumi-niumchlorid i 32 ml vandfrit tetrahydrofuran i en trehal-10 set kolbe på 100 ml, som var udstyret med en magnetomrø-rer, og som befandt sig under en svag strøm af nitrogen.

Man tilsatte ved 25 "C en opløsning af 1 g (2,7 mmol) 6.7- dimethoxy-2-( o-trif luormethy lphenyl )-4-oxo-thiachro-men, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 4, i 9 15 ml vandfri tetrahydrofuran. Reaktionsmediet blev omrørt i 2 timer ved 20-25 °C og derpå hydrolyseret med 0,54 g vand og 1,35 ml koncentreret svovlsyre. Den således opnåede blanding blev filtreret og derpå ekstraheret med di-ethylether. Afdampning af det organiske opløsningsmiddel 20 førte til et rødt pulver (udbytte 20%), som smeltede ved 94 °C (Tottoli). Identiteten og strukturen af denne for- 13 bindelse blev bekræftet ved C NMR spektroskopi og ved mikroelementæranalyse.

25 C H

% beregnet 61,36 4,29 % fundet 61,52 4,35

Farmakologi 30

Lipoxygenaser (LO-er) omdanner arachidonsyre (AA) til hy-droxyderivater og leukotriener. Disse produkter er kraftige farmakologiske midler med potentielt vigtige roller ved~ inflammation og hypersensitivitetsforstyrrelser. Ad-35 skillige LO-er indvirker på AA, specielt fører:

DK 165115B

8 5 LO til leukotriener, 12 LO til 12-hydroperoxyeicosatetraensyre (12 HPETE) og andre 12 hydroxyforbindelser, 5 15 LO til 15 HPETE og andre 15 hydroxyforbindelser, og (på et lavere niveau 8) LO og 11 LO.

10 De vigtigste produkter indenfor LO omdannelsesvejene er leukotriener frembragt af 5-LO. Den antydede vigtighed af SRS-A ved astma og anafylaktiske reaktioner og den kendsgerning, at SRS-A hører til leukotrienerne, har stimuleret interessen for undersøgelser af den biologiske værdi 15 af disse substanser. Leucotrien C4 (LTC 4) og Leucotrien D4 (LTD 4) (0,1 til 1,0 nM) forårsagede koncentrationsafhængige kontraktioner af marsvins ileum, således som det er blevet anvendt til bestemmelse af den biologiske aktivitet af SRS-A relationen til histamin. Man fandt at hi-20 stamin på en molær basis var 200 gange mindre aktiv end LTC 4, hvilket antydede, at en enhed af SRS-A (6 ng Hist, HC1) svarer til ca 0,2 pmol LTC 4.

LTC 4 og LTD 4 forøgede ligeledes vaskulær permeabilitet 25 i marsvins hud og udviste glat muskulatur-stimulerende egenskaber identisk med dem, som tidligere var observeret for SRS-A. LTC 4 og LTD 4 spiller en kritisk rolle i mi-krocirkulationen i hjertet og i lungerne.

30 Leucotrien B4 (LTB 4) influerer på leukocytmigrationen ved at forårsage leukocytadhæsion til endotheliet i post-kapillære venuler eller små blodårer og ved kraftig kemo-taktiske virkninger. Leukotrienerne er derfor vigtige mediatorer i værtens forsvarsmekanismer som umiddelbare hy-35 persensitivitets reaktioner og akutte inflammations-reaktioner. Yderligere er virkningerne af visse cyclooxygenase (CO) produkter og leukotrienerne komplementære. Såle-

DK 165115B

9 des kan synergisme mellem leukotrienerne forårsagende plasma lækage og vasodilatorerne PGE 2 og PGI 2 være af betydning ved dannelsen af ødemer. Yderligere må der lægges stor betydning i de synergistiske virkninger mellem 5 leukotrienerne og tromboxan (TxA2) ved bronchokonstrikti-on. LTC 4 og LTD 4 forårsager en frigivelse af TxA2 i marsvinets lunge. Eftersom TxA2 er en kraftig konstriktor af luftvejene kan frigivelse deraf bidrage til broncho-spasmerne ved allergiske manifestationer. Yderligere sy-10 nes visse resultater at påvise, at nogle virkninger af pladeagglutinationsfaktor Acether (PAF-Acether) kunne blive medieret med LTB 4. Ikke-steroide anti-inflammato-riske lægemidler (AINS) forhindrer ikke anaphylaxe. Omvendt forøger de hypersensitivtetsreaktioner, eftersom 15 der mobiliseres AA til LO omdannelsesveje. Corticostero-ider (CS) forhindrer frigivelsen af præcursoren, som virker ved at stimulere syntesen af lipomodulin, en peptidinhibitor for phospholipase A2. Ved at inhibere frigivelsen af AA forhindrer CS dannelsen ikke alene af CO pro-20 dukter, men ligeledes af LO produkter og derpå dannelsen af leukotriener.

Den forøgede viden om LO systemet synes at indikere nye muligheder for udviklingen af hidtil ukendte og bedre te-25 rapeutiske midler, især ved sygdomstilstande, som er forbundet med umiddelbare hypersensitivitetsreaktioner, så som astma, allergi, hjerte anaphylaxe, hjerne iskæmi og inflammation. Sådanne lægemidler kunne være baseret på antagonisme mod slutprodukterne eller på inhibering af 30 enzymerne involveret i dannelsen af og yderligere omdannelse af det vigtige nøglemellemprodukt leucotrien A4 (LTA 4). En dobbelt effekt på leukotrien omdannelsesvejen og cyclooxygenase omdannelsesvejen kunne ligeledes være af værdi.

35

DK 165115B

10 1) "In vitro" screening af 7 forbindelser som potentielle inhibitorer af sojabønnelipoxygenease a. Introduktion 5

Monohydroxy-eicosatetraensyrer (HETE-er) er kvantitativt signifikante metabolitter af arachidonsyre (AA) i et udvalg af pattedy reel ler og væv. Man har f.eks. identificeret 12-L-HETE fra blodpladerne; 5-D-HETE fra kanin PMN; r 10 12-L-HETE, 11-HETE og 15-HETE fra marsvinelunge og rotte-mastceller; og 5-HETE, 8-HETE, 9-HETE, 11-HETE og 12-HETE fra humane neutrophiler. Distributionen af HETE-er er arts-afhængig og repræsentativ for AA metabolisme katalyseret enzymatisk af lipoxygenaser. Disse produkters muli-15 ge biologiske rolle er endnu ikke blevet fuldstændigt belyst. 12-HETE opnået fra humane blodplader viste en kemo-taktisk aktivitet for humane polymorphonucleære leucocyt-ter (Siegel, M.I. et al., Proc. NaTL. aCAD. sCI. 77, 3Q8-312; 1980). 5-HPETE (hydroperoxysyren) er prækursoren for 20 den såkaldte "Slow Reacting Substance", der er et meget kraftigt kontraherende middel for glat muskulatur og som medierer symptomer på umiddelbar hypersensitivetet. Det synes således, at inhibering af lipoxygenase kun ville være af værdi, specielt når man screenede for anti-aller-25 giske eller anti-inflammatoriske lægemidler. Pattedyrli-poxygenase og plantelipoxygenase (sojabønne) har mange biokemiske egenskaber tilfælles, og det er blevet påvist at de fleste inhibitorer af planteenzymet ligeledes inhi-berer lipoxygenaser afledt fra blodplader eller leucocyt-30 ter (Baumann, J. et al., Prostaglandins 20, 627-639, 1980). Sojabønnelipoxygenase inducerer den specielle dannelse af 15-HPETE (C.P.A. Van Os et al., Biochim. et Bio-phys. Acta 663, 177-193, 1981), og er blevet påvist som værende ti gange mere følsom end blodpladelipoxygenase 35 (Wallach, D.P., et al., Biochim. and Biophys. Acta 663, 361-372, 1981). Derudover er 15-HETE en kraftig og specifik inhibitor for blodpladelipoxygenase (12-HETE), som

DK 165115B

11

Indirekte stimulerer dannelsen af thromboxan a2 (Vander-hoek, J., et al., J. Biolog. Chem. 225, 5996-5998; 1980).

Den 15-hydroperoxy-analoge er ligeledes blevet rapporteret som værende i stand til at undertrykke svineaorta 5 prostacyclin-syntetaseaktivitet (Gryglewski, R.J. et al. Prostaglandins 12, 685-713; 1976). Denne inhiberende virkning udøves ved produktionen af en destruktiv oxida-tiv forbindelse, sandsynligvis et OH-derivat eller en forbindelse med tilsvarende aktivitet (Weiss, S.J., et 10 al., Blood, 53, 1191, 1979).

b. Materialer og metoder bl) Spektrofotometrisk måling 15

Man har udviklet en spektrofotometrisk metode til at bestemme enzymaktiviteten ifølge Corey E.J. et al., (J.

Amer. Chem. Soc, 104, 1750-1752; 1982). X et slut rumfang på 1,8 ml blandede man 0,2 M beluftet Borax puffer pH = 20 9,00 med 500 enheder sojabønnelipoxygenase. Når man af prøvede inhibitorer, blev de tilsat i en mængde på 0,6 ml «3 -8 i slutkoncentrationer, der lå fra 10 M til 10 M efterfulgt af en preinkubering på 10 minutter ved stuetempera- -4 tur. Reaktionen blev initieret med 10 M arachidonsyre.

25 Efter inkubering ved stuetemperatur i 90 minutter bestemte man 15-HPETE med målinger af absorbans ved 236 nm.

b2) Udtrykkelse af resultaterne 30 Denne metode blev kalibreret med kendte inhibitorer for lipoxygenase. For hver forsøgsforbindelse inkluderede man en kontrol med kogt lipoxygenase for at tage enhver absorption af denne forbindelse ved den anvendte bølgelængde med i beregningen. Den procentige enzymatiske aktivi-35 tet blev beregnet på hver koncentration, og den mængde forbindelse, der var nødvendig for at inhibere 50% af enzymaktiviteten, blev beregnet ved en lineær regression af

DK 165115B

12 et sæt af datapunkter, som beskrev logaritmen af koncentrationen (M)/% inhibering.

C. Resultater 5

Forbindelsen IC,-„ (koncentration ved 50 fra 50% inhibering) _5 10 Eksempel 1 7,25 x 10 -5

Eksempel 2 8,23 x 10 —

Eksempel 3 1,21 x 10 15 -

Eksempel 4 1,35 x 10-^

Eksempel 5 2,29 x 10-^ 20 Eksempel 6 1,42 x 10”^ —6

Diphenylthiocarbazoner 1,61 x 10 M

25 2) "In vitro" potentiel inhibering af superoxid-anion-ra- dikal (O2 ).

a. Introduktion 30 Den inflammatoriske proces er karakteriseret ved en nedsat integritet af den endotheliale cellebarriere, ved ændring i vaskulær permeabillitet og aktivering af fagocy-tiske celler såsom polymorphnukleære leuocytter (PMN) med den~ heraf følgende frigørelse og dannelse af en gruppe 35 aktive forbindelser i det extracellulære rum, af hvilke nogle er frie radikaler. Den indbyrdes relation mellem disse radikaltyper til andre træk i forbindelse med in-

DK 165115B

13 flanunation er ikke fuldstændigt forstået. En vigtig komponent ved det respiratoriske udbrud af aktiverede inflammatoriske celler, såsom FMN, er den monovalente enzymatiske reduktion af 02 til superoxid-anion-radikalet 5 o2“. En stor andel af det dannede 02" frigives til det extracellulære rum, hvori der kan indtræde spontan dismutation med den samtidige dannelse af H202 og 02· Den samtidige tilstedeværelse af 02”, H202 og kelerede metal katalysatorer i det extracellulære rum kan resultere i 10 yderligere dannelse af flere aktivt-oxygen afledte molekyler, såsom hydroxyl-grupper (OH.) og såkaldt singlet oxygen Superoxid dismutase (SOD) fungerer som en enzymatisk såkaldt scavenger (middel til bortfjernelse) af 02 (McCord et al. J. Biol. Chem. 244, 6049-5055; 15 1969), hvorimod 1-methionin og DMSO begge er scavenger for OH.

Enz-H2 - 02--->Enz + 02" + 2H+

20 SOD

(scavenger) i CAT metalioner 25 02 - H20 <------------H202------------> OH. + OH~+102 (scavenger) 02_ | 1-methionin eller DMSO (scavenger) 30 Formodet mekanisme ved dannelse af substrat-xanthin-oxi-dase fri radikal

Skema 1 35 Substrat-xanthin-oxidase modellen for dannelsen af frie radikaler er blevet grundigt udforsket (Fridowich, I., J.

Biol. Chem. 215, 4053-4057; 1970) og anvendt til at danne

DK 165115B

14 frie radikaler såvel "in vitro" som "in vivo" (Chmori, H., et al., Biochem. Pharmacol. 27, 1397-1400; 1978).

En bekvem og følsom spektrofotometrisk målemetode til 5 specifikt at konstatere og overvåge 02~ er baseret på dette radikals evne til at reducere ferricytochrom C (Cyt 3+ c ). Tilstedeværelsen af xantin oxidase med hypoxanthin 3+ og Cyt c i hydrogencarbonatpuffer danner 00 , som fra 3+ 2+ Δ starten reducerer Cyt c til Cyt c (Del Maestro, R.F., 10 Microvascular Res. 22, 255-270; 1981), efterfulgt af re- 2+ oxidation af noget Cyt c med OH. (Fong, K., et al.,

Chem. Biol. Interact. 15, 77-89; 1976).

3+ - 2+

Hypoxanthin + xanthin oxidase + Cyt C —0o +Cyt C +0H*

15 I I

I_I

i

Cyt c3+ 20 Hydrogenperoxid dannes ved to-elektronreduktionen af molekylært oxygen eller ved dismutationen af O2 . Catalase (CAT) reducerer 1^02 til ^0.

b. Materialer og metoder 25

Dannelse af superoxid-anion-radikal 0^~

Den anvendte procedure var identisk med den, der er be- 30 skrevet af Del Maestro, R.F., J. Bjork og K.E. Arfors (Microvascular Res. 22, 239-254; 1981). Således blev re- 3+ 3+ duktionen af cytochrom c (Cyt c ) målt i et system bestående af 0,96 mM hypoxanthin, 5 x 10-¾ Cyt C3+ i hy-drogencarbonat puffer pH = 7,35 (0,132M NaCl, 4,7xl0-3 M 35 KC1, 2xl0-3M CaCl2, 1,2x10_3M MgS04, 0,018M NaHCOg). Reaktionen blev startet ved tilsætning af xanthinoxidase i en koncentration på 0,07 E/ml. Forøgelsen i absorbans ved

DK 165115B

15 550 nm blev registreret ved 37 °C i en termostatstyret spektrofometrisk celle hvert minut igennem 4 minutter.

Hver forbindelse, der skulle afprøves blev tilsat før 5 xanthinoxidasen. En enhed aktivitet blev defineret som en ændring på 0,001 enheder/minut. Den procentige enzymatiske aktivitet beregnedes for hver koncentration af afprøvede forbindelser, og den mængde forbindelse, der krævedes for at inhibere 50% af enzymet (IC^-q), blev beregnet 10 ved lineær regression af et sæt datapunkter, der beskrev logaritmen af koncentrationen M/% inhibering.

c. Resultater i5 - 02~ Scavenger IC 50

Forbindelsen (koncentration ved fra 50% inhibering) 20 Eksempel 1 6,64 x 10~6

Eksempel 2 6,33 x 10~6

Eksempel 3 2,22 x 10-5 25 -

Eksempel 4 3,67 x 10"5

Eksempel 5 5,81 x 10-6 30 Eksempel 6 4,12 x 10-6

Campherol 9,05 x 10-6M

374-dihydroxyphe- _c

35 nyl eddikesyre 3,87 x 10 M

16

DK 165115B

3) "In vitro" screening af forbindelser på arachidon kaskade metabolisme i humane blodpladers mikrosomer a. Materialer og metoder 5

Den enzymatiske måling blev gennemført i silaniseret glasudstyr i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der er beskrevet af P. Ho, P. Walters og H, Sullivan (Prostaglandins 12, 951; 1976). Man inkuberede en reaktionsblan-10 ding indeholdende 50 mM tris HC1 puffer, pH = 7,9, 5mM 2-tryptophan, 2 M methemoglobin, 0,2 mg mikrosomalt pulver samt forbindelsen, der skulle afprøves, i et samlet rumfang på 0,2 ml ved 37 °C i 5 minutter før tilsætningen af 14 10 ni af en 20 uM C arachidonsyre (0,08 uCI). Efter 5 15 minutters inkubering blev reaktionen afbrudt ved tilsætning af 10 dl 1M citronsyre.

Blandingen blev ekstraheret fire gange med 0,5 ml vandfrit diethylether og tørret med natriumsulfat. Inddamp-20 ningsresten blev bragt til suspension igen i ca. 40 dl ether og underkastet kromatografi på silicagelplader. Elueringssystemet bestod af diethylether/methanol/eddike-syre (90:1:2). RF værdierne blev målt i forhold til arachidonsyre. Tyndtlag kromatografiplader (TLC) blev ekspo-25 neret på LKB ultrafilm i ca. 24 timer. Delvis identifikation af pletterne blev gennemført ved at køre standarder (PGA2, PGB2, PGE2, PGF2c' PXB2' arachidonsyre) i det samme opløsningsmiddelsystem. Kvantitative- resultater blev opnået ved at scanne den fremkaldte film med et 30 transmissionsdensitometer (EC apparatus 910), som var interface- forbundet med en Hewlett Packard 3390A integrator. Imadazol og indomethacin blev inkluderet som positive standarder for specifik hæmning af henholdsvis throm-boxansynthetase og cyclooxygenase.

35

DK 165115B

17 b. Cycloxygenase inhibering i humane blodplade mikrosomer

Forbindelse IC50 i koncentration for 5 fra 50% inhibering) -4

Eksempel 1 1,51 x 10

Eksempel 2 1,68 x 10 ^ 10 ------—

Eksempel 3 9,37 x 10 ^

Eksempel 4 1,33 x 10 ^ — 15 Eksempel 5 3,56 x 10

Eksempel 6 7,39 x 10“

Indomethacin 1,12 x 10*" 20 -

Phenylbutazon 2,74 x 10 ^M

Aktiviteten af forbindelserne på cyclooxygenase er fast-25 lagt kvantitativt ved de 2 pletter svarende til PGE2 og TxB2 (forholdet PGE2/TxB2).

4. "In vitro" inhibering af prostaglandin syntetase i vædder sædblære mikrosomer 30 a. Materialer og metoder

Man udarbejdede en forbedret'målemetode baseret på de målemetoder, der publiseret af Baumann et al., (Naunyn-35 Schmiedeberg1 s Arch. Pharm. 307, 73; 1979) og Takeguchi, C. et al., (Biochem. 10, 2372; 1971). Det enzymatiske ra-dioassay blev udført i silaniseret glasudstyr. Man inku- 18

DK 165115B

berede reaktionsblandingen indeholdende 50 mM tris HC1 puffer, pH = 8,3 i nærvær af reduceret glutathion (GSH), 1 mM, såvel som hydroquinon, 0,55 mM, den forbindelse, der skulle afprøves, og 50"ug af vædder sædblære mikroso- 5 mal pulver i et samlet rumfang på 0,2 ml i 5 minutter ved 14 - 37 °C før tilsætningen af 10 ni af C arachidonsyre 10 ^M (0,08 fiCI). Efter 30 minutters inkubering med omrystning fra tid til anden blev reaktionen afbrudt ved tilsætning af 10 ni 1M citronsyre.

10

Blandingen blev ekstraheret fire gange med 0,5 ml vandfri diethylether og tørret med natriumsulfat. Inddampnings-resten blev igen bragt til suspension i ca. 40 ul ether og underkastet kromatografi på silicagelplader. Elue-15 ringssystemet bestod af diethylether/methanol/eddikesyre (45:1:2). RF værdierne blev målt i forhold til arachidonsyre. Tyndtlagskromatografiplader blev eksponeret på LKB ultrafilm i ca. 20 timer. Foreløbig identifikation af pletterne blev gennemført ved at køre standarder (PGE^, 20 PGE2' PGFla' PGF2a' pGAi' PGA2' PGB1 09 PGB2^ * det sanune opløsningsmiddelsystem. Kvantitative resultater blev opnået ved densitometri.

25 30 35

DK 165115B

19 b. Resultater

Forbindelsen Autoradiografiske kvantificeringer 5 3,2 x 10 ^ M % variation fra PGF2a PGE2 pgd2

Eksempel 1 - 51,49 - 15,12 - 5,12 10 Eksempel 2 - 59,12 - 17,30 - 6,30

Eksempel 3 - 36,26 - 22,47 - 2,11

Eksempel 4 - 42,84 - 41,25 - 11,28 15 -

Eksempel 5 - 28,10 - 33,33 - 16,75

Eksempel 6 - 30.29 - 16,48 - 29,63 20 Phenylbutazon - 43,36 - 15,37 - 21,98

2 x 10“5 M

5) "In vitro" screening af forbindelser som potentielle 25 Inhibitorer for xanthinoxidase a. Materialer og metoder

Xanthinoxidaseaktiviteten blev bestemt ved den metode, 30 der er beskrevet af H.M. Kalckar (J. Biol. Chem. 167, 429-443, 1947), hvor man spektrofotometrisk måler dannelsen af urinsyre.

Man tilsatte i en spektrofotometrisk cuvette, xanthinoxi-35 dase til opnåelse af en slutkoncentration på 0,01 enheder/ml, efterfulgt af phosphatpuffer o,05M, pH = 7,4 eller inhibitoren. Reaktionen blev startet ved tilsætning _5 20

DK 165115B

af xanthin til en slutkoncentration på 5x10 M. Frigørelsen af urinsyre blev registreret ved 295 nm hvert 30te sekund i 2 minutter (linær fase). En enhed aktivitet blev defineret som en ændring på 0,001 enheder/minut. Procent 5 enzymatisk aktivitet blev beregnet for hver koncentration af de afprøvede forbindelse, og den mængde forbindelse, der var nødvendig for at inhibere 50% af enzymet (IC^-q), blev beregnet ved en lineær regression af et sæt datapunkter, der beskrev logaritmen af koncentrationen M som 10 en funktion af procent hæmning.

b. resultater 15 Forbindelser IC^q (koncentration for fra 50% inhibering) -5

Eksempel 1 5,20 x 10 -5 20 Eksempel 2 5,39 x 10 _5

Eksempel 3 1,13 x 10

Eksempel 4 9,04 x 10 ^ , 25 -

Eksempel 5 3,37 x 10-S* — fi

Eksempel 6 1,03 x 10 ' 30 Folinsyre 6,76 x 10

Campherol 7,89 x 10 35

DK 165115B

21 6. Inhibering af human leucocyt lipoxygenase (LO) a) Inhibering af 5- og 12- lipoxygenaser i humane polynu-kleære celler 5

Protokol for forsøg nr. 1: 6 7 + 1. Inkubering af 15x10 humane leucocytter/ml med Ca 2+ 2 mM, Mg o,5 mM i nærvær af inhibitorerne ved 37 °C 10 i 20 minutter.

2. Stimulering med 1 yg ionophor (A23187)/ml i 4 minutter .

15 3. Standsning af inkubationen med 1 rumfang methanol.

4. Analyse ved RP-HPLC, søjle Cl8, 5um.

5. Måling af højden af toppene og sammenligning med den 20 interne standard (PGB2).

Forsøg nr. 1: Analyse af resultaterne 25 Forbindelser IC,-« 50

fra 5-HETE LTB. 12-HETE

4

Eksempel 1 2xlO_6M 2xl0T6M 2xl0~6M

30 Eksempel 3 10~6M 10“6M 10"6M

Eksempel 5 2xl0-6 10~6M 10"6M

Eksempel 6 3xl0"6 10~6M 2xl0_6M

35 -

DK 165115B

22 b) Inhibering af 5-, 12- og 15- lipoxygenaser i humane polynuklære celler

Protokol for forsøg nr. 2; 5 £ 1. Inkubering af 11x10 humane leucocytter/ml med inhibi- 2+ 2+ torerne i 20 minutter (2 mM Ca og 0,5 mM Mg ) ved 37 °C.

10 2. Stimulering med 10 ag arachidonsyre og 1 ag ionophor (A23187)/ml i 4 minutter.

3. Standsning af inkubationen med 1 rumfang methanol og analyse med RP-HPLC.

15 4. Måling af højden af toppene og sammenligning med den interne standard (PGB2)·

Forsøg nr. 2; Analyse af resultaterne 20 IC50

Produkter 5-HETE 12-HETE 15-HETE HHT LTB.

4

25 Eksempel 1 2xlO"6M 10"6M 3x1ο"5 4xlO_5M 4xlO"6M

Eksempel 2 2xlO"6M 10"6M 10~5M 5xlO"5M 2xlO"6M

Eksempel 3 5xlO_5M 5xl0"6M 5xl0"5M 10"6M 5xlO"6M

30 - ' 11

Eksempel 4 10"6M 10'5M 2xlO"6M 10"5M 5xl0"6M

Eksempel 5 3xlO_6M 2xlO_6M 10"6M 2xl0“6M 10"6M

35 Eksempel 6 2x10 5 3x10 5M 5xlO"5M 2xlO-5M 10~5M

23

DK 165115B

Bemærkninger

Man bemærkede stimulering af 15-lipoxygenase af de to sidstnævnte forbindelser fra eksempel 5 og 6 i ovennævnte 5 tabel, ved koncentrationer på 10~DM til 3xl0-oM, hvorimod 5-lipoxygenase inhiberes ved disse koncentrationer.

Det skal bemærkes, at i eksperiment nr.l er leucocytterne blevet stimuleret med ionophor alene, medens cellerne i 10 eksperiment nr. 2 er blevet stimuleret med ionophor og arachidonsyre. Tilstedeværelsen af arachidonsyren forhø jer exogent med op til 10 gange ID(-q for inhibitoren; på den anden side muliggør tilsætningen af arachidonsyren måling af aktiviteten af 15-lipoxygenase, der normalt 15 ikke lader sig detektere i leucocytter stimuleret med inophor alene.

20 25 30 35

Claims (3)

1. Bicycliske catechol-derivater, kendetegnet 5 ved, at de har en af de almene formler: :«x ;»x 15 (I) (II) hvori og Rg er ens og betegner et hydrogenatom eller en methylgruppe, Rg betegner en phenylgruppe eller en 0-20 trifluormethylphenylgruppe, og Z betegner en carbonyl-, methylen- eller carbonylmethylengruppe, idet oxygen-car-bon-bindingen, når det drejer sig om carbonylmethylen, involverer det carbonatom, som er nabostillet til det i ringfusionen involverede carbonatom. 25

2. Fremgangsmåde til fremstilling af bicycliske catechol-derivater ifølge krav 1 og med formlen I eller II, hvori Z er carbonyl eller carbonylmethylen, kendetegnet ved, at man cycliserer en forbindelse med formlen V 30 H02C-(CH2)n h R1°*N^\ 4 U li v 35 cXXr3 r2o ^ s 25 DK 165115B hvori R^, R2 og R^ har den i krav 1 anførte betydning, og n er 0 eller 1, og den stiplede linie betegner en fakultativ binding, under anvendelse af dehydratiserende mid-5 ler til opnåelse af en tilsvarende forbindelse med formlen I eller II.

3. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at den aktive bestanddel er en tilstrækkelig stor mængde af 10 mindst et af de bicycliske catehol-derivater ifølge krav 1 i kombination med et passende bærestof eller excipiens. 15 20 25 30 35