FI84480C - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt verksamma bicykliska katekolderivat. - Google Patents

Description

1 84480

Menetelmä valmistaa farmakologisesti vaikuttavia bisyklisiä katekolijohdoksia - Förfarande för framställning av farmako-logiskt verksamma bicykliska katekolderivat

Menetelmä valmistaa farmakologisesti vaikuttavia bisyklisiä katekolijohdoksia, joiden kaavat I ja II ovat

RlO Z V R^O

R 2 O S R β R 2 O S Rg (I) (II) joissa kukin R^ ja R2 on toisistaan riippumatta vetyatomi tai metyyli ryhmä; R3 on fenyy1iryhmä, joka voi olla substituoitu trifluori-metyyliryhmäl1ä ja Z on karbonyyli-, metyleeni- tai karbonyylimetyleeniryhmä, jolloin karbonyylimetyleenin tapauksessa karbonyyliryhmä on rengasfuusioidun hiiliatomin vieressä.

Edellä määritellyt yleiskaavojen I ja II mukaiset yhdisteet ovat 1ipoksigenaasin ja sykiogenaasin inhibiittoreita.

Niitä voidaan käyttää ihmislääketieteessä ei-steroidisina tulehdustenvastaisina, antitromboottisina, antialler-geenisina, anti-iskeemisinä ja antianafylaktisina aineina.

2 84480

Keksintö tuo siten esiin menetelmän, jolla valmistetaan yleiskaavojen 1 ja II mukaisia yhdisteitä. Menetelmässä saatetaan kaavan III mukainen yhdiste

"XX

r2o *^Sn-/xAsssh jossa ja tarkoittavat samaa kuin edellä (tämä yhdiste on valmistettu sulfoklooraamalla aromaattinen rengas menetelmällä, joka on johdettu menetelmästä: JUSIUS, LIEBIGS ANN.CHEM 1929, 468., 162, minkä jälkeen pelkistetään kehittyvällä vedyllä, - CLEMMENSEN ' in reaktion -) reagoimaan sopivasti substituoidun kaavan IV mukaisen propionihapon tai voihapon (tai näiden esterin tai suolan) kanssa I I 1

R — (C) — c — o— co2H IV

I I 1 jossa tarkoittaa samaa kuin edellä.

Aikalisissä olosuhteissa tämä tuottaa kaavan V mukaisen yhdisteen

H02C~ (C) H

ΛΛ '

3 8 4 4 δ O

joka syklisoidaan dehydratointiainei1 la, kuten fosfori -happoanhydridi1lä, polyfosforihapoi1 la tai -estereillä, rikkihapolla, kloorisulfonihapolla ja muilla LEWIS’in hapoilla.

Kaavan II mukaisilla yhdisteillä menetelmässä saatetaan kaavan VI mukainen yhdiste reagoimaan -Rj-substituoidun Ύ -butyrolaktonin VII kanssa HO s>v _ mXX.sm

XnH2

VI VII

K.W. BENTLEY'n ja W.I. RUSHVOETH*n menetelmästä, brittiläinen patentti nro 1 428 110, johdetulla menetelmällä, jolloin saadaan kaavan VIII mukainen yhdiste D n HO.C, ;xu » 2 R3 josta karboksyyliryhmään tapahtuvan syklisoinnin jälkeen saadaan haluttu yhdiste II.

Yhdisteet I ja II, joissa Z on metyyli voidaan saada tavanomaisi11 a pelkistysmenetelmi1lä.

Karbonyyliryhmä voidaan muuntaa joko metyleeniryhmäksi käsittelemällä stökiömetrisi1lä määrillä alumiinitriklori- dia ja litiumalumiinihydridiä menetelmällä, joka on johdettu 4 84480 H.NAKAZUMI'η, T . WEYAMA'n ja T.KITAO'n, J. OF HETEROCYCLIC CHEMISTRY 1984, 21,, 193, menetelmästä tai WOLL-KISNER-HUANG MINLON-menetelmällä käyttämällä hydratsiinia tai hydroksi-metyleenikei pelkistämällä natriumboorihydridillä \l. 3 . TRAYNELIS ' in ja R.F. LOVE'n, J. Org. Chem. 1961 26,, 272Θ, menetelmällä.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

Esimerkki 1 6.7- dihydroksi-2-fenyyli-4-okso-tiakromeeni iXl_R . R2 = H, z = CO, - CH) 5 g (0,017 moolia) 3-(3,4-dihydroksiFenyylitio)-kaneli-happoa lisättiin annoksittain 10,5 mljaan väkevää rikkihappoa kaksikaulai8e88a 50 ml;n pullossa, joka oli varustettu magnee11isekoi11ime 1la. Reaktioseos jäähdytettiin jäillä ja saatu suspensio kuivattiin ja pestiin sen jälkeen bentsecnillä.

Kiteyttämällä uudelleen lämpimästä etanolista saatiin oranssinväristä jauhetta (saanto 13 ?ί)· Tämän yhdisteen sulamispiste on yli 250°C (Tottoli). Sen identiteetti ja rakenne vahvistetuin PMR-spektroskopialla ja alkuaineiden mikroanalyysillä.

C H

Laskettu, % 66,65 3,73

Saatu, % 66,71 3,81

Esimerkki 2 6.7- dihydroksi-2-(o-tri fluorimetyyli-fenyyli)-4-okso-tiakromeeni (1: R, = R0 H, Z = CO, = 0-CF^ - CgH^) 5 84480 1 g (0,028 moolia) o-trifluorimetyyli-g-(3,4-dihydiOksi-fenyylitio)-kanelihappoa liuotettiin 15 ml:aan vedetöntä kloroformia kolmkaulaiseesa 50 ml:n pullossa, joka oli varustettu magneettisekoittimeila, pienen typpivirran alla. 20°C s saa lisättiin liuos, joka sisälsi 3,25 g (0,075 moolia) etyy1ipolyfosfaattia 1 ml:ssa vedetöntä kloroformia. Seosta refluksoitiin 2 tuntia. Reaktioseos jäähdytettiin jäillä ja tehtiin alkaliseksi ammoniakilla. Uuttamisen Jälkeen orgaaninen faasi pestiin vedellä.

Kun orgaaninen liuotin haihdutettiin pois, saatiin oranssinväristä kumimaista ainetta, joka puhdistettiin silikagee-likromatograafisesti eluoimalla dikloorimetaanilla (saanto 12 %). Tämä yhdiste on kiinteä aine, jonka sulamispiste on 131°C (Tottoli). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin 13C NMK-spektroskopialla ja alkuaineiden mikro-analyysillä.

C H

f

Laskettu, % 56,80 2,70

Saatu, % 56,64 2,69

Esimerkki 3 6t7-dimetok8i-2-fBnyyli-4-okso-tiakromeeni I: R2 = R2 = CH3, Z = CO, R3 = CfiH5)

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 2, mutta £-trifluorimetyyli-8-(3,4-dihydroksi fenyylitio)-kanelihapon asemesta köytettiin 0-(3,4-dimetoksifenyylitio)-kaneli-happoa. Otaikkoyhdistettä saatiin 15 ä saannolla. Se on keltainen kiinteä aine, jonka sulamispiste on 212°C (Tottoli). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin 13C NMR-spoktroskopian ja alkuaineiden mikroanalyysin -_· avulla.

6 84480

C H

Laskettu, % 68,44 4,73

Saatu, S 68,44 4,74

Esimerkki 4 6.7-dimetoksi-2-(Q-trifluorimetyyli-fenyyli)-4-okso- tiakromeeni (I: R1 = R» = CHj. Z = CO.. Rj e o-CF,..C H)

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 2, mutta £-trifluorimetyyli-0-(3,4-dihydroksifenyylitio)-kanelihapon asemesta käytettiin £-trifluorimetyyli-0-(3,4-dimetoksi-fenyylitio )-kanelihappoa.' Otsikkoyhdistettä saatiin 50 % saannolla. Se on valkoinen kiinteä aine, jonka sulamispiste on 194°C. Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin ^3C NMR-spektroskopia 11 a ja alkuaineiden mikroanalyysillä.

C H

Laskettu, % 59,01 3,57

Saatu, % 58,84 3,56

Esimerkki 5 7,B-dimetoksi-2-fenyyli-5-okso-bent8o/b/tiefaani (II: R = R2 = CHj. Z = CH_. C8. R^ = C.H,)

Toimittiin esimerkin 2 mukaisesti, mutta £-trifluori-metyyli-0-(3,4-dihydroksifenyylitio)-kanelihapon asemesta käytettiin 4-fenyyli-4-(3,4-dimetoksifenyylitio)-voihappoa. Otsikkoyhdistettä saatiin 27 K saannolla. Puhdistaminen suoritettiin dekantoimalla dietyylieetteristä. Tämä yhdiste on valkoinen kiinteä aine, jonka sulamispiste on 135°C (Tottoli). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin 13C NMR-spektroskopian ja alkuaineiden mikroanalyysin avulla.

7 84480

C H

Laskettu, % 60,76 5,77

Saatu, % 68,63 5,04

Esimerkki 6 6.7- dimetok3i-2-(o-trifluorimetyylifenyyli)-4H- tiakrämeeni (I: R2 = R: = CH j. Z = CH„ . R-, =_o-CF ) 204,9 mg (5,4 miliimoolia) litiumalumiinihydridiä ja 720 mg (5,6 miliimoolia) alumiinikloridia liuotettiin ympäristön lämpötilassa 32 mlsaan vedetöntä tetrahydro-furaania kolmikaulaisesaa 100 ml:n pullossa, joka oli varustettu magneettisekoittimella, pienen typpivirran alla. 25°C:ssa lisättiin liuos, joka sisälsi 1 g (2,7 miliimoolia) esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistettua 6.7- dimetoksi-2-(£-trifluorimetyyli-fenyyli)-4-okso- tiakromeenia 9 mlsssa vedetöntä tetrahydrofuraania. Reaktio-mediumia sekoitettiin 2 tuntia 20 - 25°C:ssa ja sen jälkeen hydrolysoitiin 0,54 g:lla vettä ja 1,35 ml:lla väkevää rikkihappoa. Saatu seos suodatettiin ja uutettiin sen jälkeen dietyylieetterillä. Haihduttamalla orgaaninen liuotin saatiin punaista jauhetta (saanto 20 %), sulamispiste 94°C (lottoli). Tämän yhdisteen identiteetti ja rakenne vahvistettiin NMR-spektroskopian ja alkuaineiden mikroanalyysin avulla.

C H

Laskettu,S 61,36 4,29

Saatu, % 61,52 4,35

FARMAKOLOGIA

Lipoksigenaaeit (LOrt) muuntavat arakidonihapon (AA) hydroksijohdokseksi ja leukotrieneiksi. Nämä tuotteet β 84480 ovat tehokkaita farmakologisia aineita, joilla on potentiaalisesti tärkeitä rooleja tulehdustaudeissa ja yli-herkkyystaudeissa. Arakidonihappoon vaikuttaa useita lipoksigenaaseja, pääasiallisesti 5 LO johtaa leukotrieneihin, 12 LO johtaa 12-hydroperoksieikosatetraeenihappoon (12 HP1 IL) ja muihin 12-hydroksiyhdisteisiin, 15 LO johtau 15 HPETL-yhdisteeseen ja muihin 15-hydroksi-yhdieteisiin, ja (alhaisemmalla tasolla) 8 LO ja 11 LO.

LO-reittien kaikkein tärkeimpiä tuotteita ovat 5-L0:n tuottamat leukotrienit. SRS-A:n ehdotettu tärkeys astmassa ja anafytaktisissa reaktioissa ja havainto, että SRS-A kuului leukotrieneihin, lisäsi mielenkiintoa näiden aineiden biologisiin tutkimuksiin. LTSC 4 ja LTD 4 (0,1 -1 nM) aiheuttivat marsun ileumin konsentraatiosta riippuvia supistumisia. Tätä on käytetty SRS - A:n biologisen aktiivisuuden määrittämiseen suhteessa histamiiniin. Moolipohjalta laskettuna histamiinin havaittiin olevan 200 kertaa vähemmän aktiivista kuin LTC 4, mikä viittaa siihen, että yksi yksikkö SRS-A (6 ng Hist, HC1) vastaa noin 0,2 pikomoolia LTC 4.

LTC 4 ja LTD 4 lisäsivät myös suonten permeabiliteettia marsun iholla ja niillä oli sileitä lihaksia stimuloivia ominaisuuksia, jotka olivat identtiset aikaisemmin SRS-A:lla havaittujen kanssa. LTC 4:llä ja LTD 4:llä on kriittinen osuus sydämen tai keuhkojen mikroverenkierrossa.

LTB 4 vaikuttaa leukosyyttien kulkeutumiseen saattamalla leukosyytin kiinnittymään endoteliumiin kapillaarien jälkeisisaä pikkuiaskimoissa ja tehokkaiden kemotaktisten vaikutusten avulla. Leukotrienit ovat siten tärkeitä 9 84480 välittäjää ine i La isännän puolustusmekanismeissa, kuten välittömissä yliherkkyysreaktioissa ja akuuteissa tulehdusreaktioissa. t raiden syklo-oksigenaasi (CQ)-tuotteiden ja leukotrienien vaikutukset ovat lisäksi toisiaan täydentäviä. Siten piasmavuotoa aiheuttavien leukotrienien ja vasodilaattoreiden PGE 2 ja PGI 2 välisellä synergialla voi olla tärkeä merkitys edeeman muodostumisessa. Lisäksi suuri merkitys on annettava leukotrienien ja tromboksaanin (TxA2) välisille synergietisille vaikutuksille keuhkoputken kuristumassa. LTC 4 ja LTD 4 aiheuttavat tromboksaalin vapautumisen marsun keuhkoissa. Koska TxA2 on ilmatiehyeitä tehokkaasti kuristava aine, sen vapautuminen saattaa osaltaan vaikuttaa keuhkoputken kouristukseen allergian ilmenemismuodoissa. Eräät tulokset näyttävät lisäksi osoittavan, että LTB 4 voi välittää eräitä PAF-aseetterin vaikutuksia. Ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (AINS) eivät estä anafylaksiaa. Ne päinvastoin lisäävät yliherkkyysreaktioita, koska ne mobilisoivat arakidonihapon lipoksigenaasireiteille. Kortikosteroidit (CS) estävät prekursorin vapautumisen stimuloimalla lipomoduliinin, joka on fosfolipaasin A2 peptidi-inhibiittori, synteesiä. Kun CS estä aragidonihapon vapautumisen, se estää CO-tuot-teiden muodostumisen lisäksi myös LO-tuotteiden ja sen jälkeen leukotrienien muodostumisen.

Lisääntynyt tieto LO-järjestelmästä näyttää viittaavan uusiin mahdollisuuksiin kehittää uusia ja entistä terapeut-tisempia aineita, erityisesti taudeissa, jotka liittyävät välittömiin yliherkkyysreaktioihin, kuten astma, allergia, sydänanafylaksia, aivojen iskemia ja tulehdus. Tällaiset lääkkeet saattaisivat perustua lopputuotteiden antagonismille tai avainvälituotteen LTA 4 muodostumiseen ja edelleenmuuntumiseen liittyvien entsyymien inhibiitiolle. Arvokas saattaisi olla myös kaksoisvaikutus leukotrieni-reit ti in ja syklo-oksigenaasi-reittiin.

10 84480 1) 7 yhdisteen "in vitro" seulonta soijapapulipoksiqenaasin potentiaalisina inhibiitteinä a. Johdanto

Monohydrokei-eikosatetraeenihapot (HETE:t) ovat kvantitatiivisesti merkittäviä arakidonihapon (AA) metaboliitteja monissa erilaisissa nisäkässoluissa ja -kudoksissa. Esimerkiksi 12-L-HETE on identifioitu verihiutaleista; 5-D-HETE kaniinin PMN:stä; 12-L-HETE, 11-HETE ja 15-HETE marsun keuhkcsoiuista ja rotan syöttösoluista; ja 5-HETE, B-HETE, 9-HETE, 11-HETE ja 12-HETE ihmisen neutrofiileistä. HETE-jakaantuma on lajieta,riippuva ja tyypillinen lipokai-genaaeien entsymaattisesti katalysoimalle AA-metabolialle. Näiden tuotteiden mahdollisia biologisia merkityksiä ei ole vielä täysin selvitetty. Ihmisen verihiutaleista saadulla 12-HETE:llä oli kuitenkin kemotaktinen aktiivisuus ihmisen polymorfonukleaarisiin leukosyytteihin nähden (Siegel, M.I. et ai. Proc, Natl. Acad. Sei. 308-312; 1980). 5-HPETE (hydroperoksihappo) on S R S : n (S1ou/ Reacting Substance) prekursori. SRS on hyvin tehokas sileitä lihaksia supistava aine, joka välittää välittömän yliherkkyyden oireet. Lipoksigenaasin inhibiitio näyttää siten olevan edullista, erityisesti, kun seulotaan anti-allergeenisia tai anti-inflammatorisia lääkkeitä. Nisäkkään ja kasvin lipoksigenaasilla (soijapapu) on useita yhteisiä biokemiallisia ominaisuuksia, ja on osoitettu, että ; useimmat kasvientsyymin inhibiitit inhiboivat myös verihiu taleista tai leukosyyteistä saatuja 1ipoksigenaaseja (Baumann, J. et ai., Prostaglandins 2£, 627-639, 1980).

5oijapapulipoksigenaasi aiheuttaa 15-HPETEsn ekslusiivista muodostumista (C.P.A. Van 0s et ai, Biochim. et Biophys. Acta 663,, 177-193, 1981), ja sen on havaittu olevan kymmenen kertaa herkempi kuin verihiutale-lipoksigenaasi (Wallach, D.P., et ai, Biochim. and Biophys. Acta 663.

11 84480 361-372, 19ϋ1). 15-ΗΕΤΕ on lisäksi tehokas ja spesifinen inhibiittori verihiutale-lipoksigenaasille (12-HETE), joka epäsuoraan stimuloi tromboksaanin A^ muodostumista (\l anderhoek, J., et ai., J.Biolog. Chem. 225 , 5996-5998; 1980). 15-hydroperoksianalogin on myös raportoitu alentavan sian aorta-prostasykliini-syntetaasin aktiivisuutta (Grygleu/ski, R.J. et ai. Prostaglandins 12,- 685-713; 1976). Tämä inhibiitiovaikutus johtuu tuhoavien hapettavien aineiden, todennäköisesti OH-radikaalin tai aktiivisuudeltaan samanlaisten aineiden muodostumisesta (Weiss, S.J., et ai. Blood, 52, 1191, 1979).

b. Materiaalit ja menetelmät bl) Spektrofotometrinen määritys

Entsyymiaktiivisuuden määrittämiseksi on kehitetty spektrofotometrinen menetelmä, Corey E.J. et ai. (J. Amer.

Chem. Soc, 104. 1750-1752; 1982). 1,8 ml:n lopputilavuudessa sekoitettiin 0,2 M ilmastettua Borax-puskuria, pH = 9,00 500 yksikön kanssa soijapapu-1ipoksigenaasia. Kun inhibiittoreita testattiin, niitä lisättiin 0,6 ml loppu-

»3 -B

konsentraatiossa välillä 10 M - 10 M, minkä jälkeen esi-inkuboitiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktio käynnistettiin 10”^M arakidonihapolla. Inkuboitiin huoneen lämpötilassa 9U minuuttia, minkä jälkeen 15-HPETE määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 236 nm.

b2) Tulosten ilmaiseminen Tämän menetelmän toimivuus vahvistettiin tunnetuilla 1ipoksigenaaain inhibiittoreilla. Jokaisella testattavalla aineella oli mukana kontrolli, jossa oli mukana kiehutettua lipoksigenaasia, jotta otettaisiin huomioon yhdisteen mahdollinen absorptio käytetyllä aallonpituudella. Entsymaattieen aktiivisuuden prosentuaalinen i2 84480 määrä laskettiin kullekin konsentraatiolle. Yhdisteen määrä, joka tarvitaan inhiboimaan entsyymiaktiivisuus 50-prosenttisesti, laskettiin lineaarisen regression avulla tulospisteistä, jotka esittävät prosentuaalisen inhibiition konsentraatio (M)/inibiitio-?i-logaritmeja.

c. Tulokset

Yhdisteet ^^50 inhibiition konsentraatio)

Esimerkk il 7,25105 8,23 10~5 F s imerkk i 2 '

Esimerkki 3 1,21 10 6

Esimerkki 4 1,35 10 6

Esimerkki 5 2,29 10-6

Esimerkki 6 1,42 10 6 — 6

Difenyy ] j. t iokarbatsoni 1,61 10 M

i3 84480 2) Superoksidianiuni-rauikaalin (Q„~) "in vitro11 potentiaalinen inhibiitio a. Johdanto

Tulehdusprosessi 1 le on tunnusomaista endoteliasolubarrie-rin pienentynyt eheys, auon ipermeabi1iteetin muuttuminen ja fagosyyttisolujen, kuten liuskatumaisten leukosyyttien (PMN) aktivoituminen ja tästä johtuva aktiivisten yhdisteiden, joista eräät ovat vapaita radikaaleja, vapautuminen ja muodostuminen solunulkoiseen tilaan.

Näiden radikaa1ilajien suhdetta tulehduksen muihin tunnusmerkkeihin ei täysin ymmärretä. Aktivoituneiden tulehdussolujen, kuten PMN-solujen respiratorisen purkauksen eräs oleellinen komponentti on O^in yksiva-lenssinen ent3ymaattinen pelkistyminen superoksidianioni-radikaaliksi Q^”. Suuri osa muodostuneesta (^'-radikaalista vapautuu solunulkoiseen tilaan, jossa voi tapahtua spontaani diumutnutio niin, että muodostuu samanaikaisesti vetyperoksidia ja happea. D^--radikaalin, vetyperoksidin ja gelatoi tuneideri metallikataly y ttien samanaikainen läsnäolo solunulkoisessa tilassa voi johtaa aktiivisempien : happiperäi8ten molekyylien, kuten hydroksyyliradikaalin (OH.) ja singlettihapen (^0^) muodostumiseen. Superoksidi-dismutaasi (SOD) toimii O^--radikaa1 in entsymaattisena siepparina (McCord et ai. J. Biol. Chem. 244, 6049-6055; 1969). Sen sijaan 1-metioniini ja DMSO ovat kummatkin OH -sieppareita.

i4 84480

Ents. -H2 - 02 -J>Ents.+ 02” + 2H+ SOD , (sieppari) ' 4 > CAT .. _ metalli-ionit ^ ι„

O, - H00 <“---— HO--> OH. + OH + O

* £ (sieppari) O

2 4 l-metioniini tai DMSO (sieppari)

Vapaiden radikaalien muodostumisen substraatti-ksantiinioksi-daa8i-mallin ehdotettu mekanismi KAAVIO 1

Substraatti-ksaiit i inioksidaasi-mallia vapaiden radikaalien muodostumiselle on voimakkaasti tutkittu (Fridou/ich, I., J. Biol. Chem. 215, 4053-4057; 1970) ja käytetty vapaiden radikaalien muodostamiseen sekä "in vitro" että "in vivo" (Chmori, H., et ai. Biochem. Pharmacol.

27, 1397-1400; 1978).

02"-radikaalin spesifiseen havaitsemiseen ja seuraamiseen tarkoitettu helppo ja herkkä spektrofotometrinen määritysmenetelmä perustuu tämän radikaalin kykyyn pelkistää ferrisytokromi C (Cyt c^+). Keantiiniokidaasin, hypoksan-tiinin ja Cyt c3+;n mukanaolo bikarbonaattipuskuriasa muodostaa 02~, Joka aluksi pelkistää Cyt c^+:n Cyt c^+:ksi (Del Maestro, R.F., Microvascular Res. 22_, 255-2709; 1981), minkä jälkeen OH. hapettaa uudelleen osan Cyt c^+:sta i5 84480 (Fong, K., el ai., Chem. Biol. Intercat. 15, 77-89; 1976).

Hypoksantiini + ksanLiinioksidaasi + Cyt cr " ^ O- + Cy t c + OH

ΐ

Cyt c3+

Vetyperoksidia muodostuu molekyylimuotoisen hapen kahden elektronin pelkistämisen tai (^"rn dismutaation kautta. Katalaasi (CAT) pelkistää vetyperoksidin vedeksi.

b. Materiaalit, ja menetelmät

Superok8idianiuniradikaalin 0^" muodostaminen

Noudatettu menettely oli identtinen julkaisussa: Del Maestro, R.F., J. Björk ja K.E. Arfors, (Mcrovascular Res. 22, 239-254; 1981 kuvatun menetelmän kanssa. Sytokromin c3+ (Cyt c3+) pelkistyminen määritettiin nimittäin järjestelmässä, jonka koostumus oli 0,96 mM hypoksantiini, 5,10“3M Cyi c3+ bikarbonaattipuskurissa, pH = 7,35 (0,132M NaCl, 4,7,1ϋ'3Μ KC1, 2,10"3M CaCl2, 1,2,10-3M MgSQ4, Ο,ΟΙΘΜ NaHCO^j). Reaktio aloitettiin lisäämällä ksantiini-oksidaasia konsentraatiossa 0,07 U/ml. Absorbanssin (550 nm) kasvua seurattiin 37°Cjasa termostoidussa spektro fotometrikyvetisää joka minuutti 4 minuutin ajan.

Kukin testattu yhdiste lisättiin ennen ksantiinioksidaasia. Aktiivisuusyksikoksi määriteltiin 0,001 yksikön muutos minuutissa. EnlsymaatLisen aktiivisuuden prosentuaalinen määrä laskettiin testattujen yhdisteiden kullekin koneen traat io 1 1 e . Aineen, joka tarvitaan inhiboimaan entsyymi .·_ 50-prosent t i ses t i (IC^), määrä laskettiin lineaarisen regression avulla tulospisteistä, jotka esittävät kon-sentraatio M/ inhibi itio-SS-logaritmeja .

84480 e . Tulokset.

O -siepparin IC-

Yhdisteet , ( 50 ?o inhibiit ion konsent raat io)

Esimerkki 1 6;64 10

Esimerkki 2 6^33 10 ^ < -5

Esimerkki 3 2,22 10

Esimerkki 4 3^67 io”5

Esimerkki 5 5,81 10 6

Esimerkki 6 4,12 10 6

Kamferoli 9,05 10 3,4-dihydroksi -5

' 3,87 10 3M

f eny y 1 i e t ikkaliappo i7 84480 3) Yhdisteiden "in vitro" seulonta; arakidoni-kaskadimeta-bolia ihmisen verihiutalemikrosomeissa a. Materiaalit ja menetelmät

Entsymaattinen määritys suoritettiin silanoiduissa lasi-astioissa P.Hu'n, P. Walters'in ja H. Sullivan'in (Prostaglandins 12, 951; 1976) menetelmällä. Reaktioseosta, jonka koostumus oli: 50 mM Tris HCl-puskuri, pH = 7,9, 5 mM 2-1rypto f aani, 2 M methemoglobiini, 0,2 mg mikrosomi-jauhe ja testattu yhdiste; kokonaistilavuus 0,2 ml, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa, ennenkuin lisättiin 10 /ui tai 2U ^im^C arakidonihappoa (0,08 /jCI) . 5 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio päätettiin lisäämällä 10 ui IM sitruunahappoa.

iieoa uutettiin neljä kerl.au 0,5 ml:lla vedetöntä dietyyli-eetteriä ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Jäännös suspen-doitiin uudelleen noin 40 piisaan eetteriä ja-kromato-grafoitiin si 1ikageelilevyillä. Eluointijärjestelmä 011 dietyylieet ter i/me tanoli/et ikkahappo (90:1:2). RF-arvot :· mitattiin arakidonihapon suhteen. Ohutlevykromatografialevyt (TLC) valotettiin LKB-ultra fiImi 1lä noin 24 tuntia.

Täplien osittainen identifiointi suoritettiin ajamalla standardit (PGA_, PGB„, PGE„, PGF. , PXB-, arakidonihappo)

- ' : Z Z Z Zc ’ Z

samassa 1iuotinjörjestelmössä. Kvantitatiiviset tulokset ;'; saatiin ska n naa malla kehitetty kalvo transmissiotiheys- mittarilla (1Γ Apparatus 910), joka oli kytketty Hewlett Packard 339UA-integraattoriin. Imidatsoli ja indometasiini olivat mukane positiivisina standardeina, jotka inhiboivat spesifisesti vastaavasti tromboksaanisynte taas ia ja syklo-oksiyenaasia.

ia 84480 b. Syklo-oksigenaasin inhibiitio ihmisen verihiutale-mikrosomei8sa

Yhdistit . IC5“ (50 Ä inhiblition konsentraatio) -4

Esimerkki 1 1;51 10 -4

Esimerkki 2 ^-/.68 10

Esimerkki 3 9,37 10-4 -5

Esimerkki 4 1,3310

Esimerkki 5 3,56 10

Esimerkki 6 ' 7,.39 10~^ -5

Indometasiini 1,12 10 M

* - -4

ienyylibutaLsoni 2,74 10 M

Aineiden aktiivisuus syklo-oksigenaasiin on kvantitatisoitu 2 täplällä, jotka vastaavat PGE2 ja TxB2 (suhde PGE2/lx/B2).

I’ 84480 4) Prostaglandiinisyntetaasin "in vitro" inhibiitio passin siemennestevesikkelimikrosomeissa a. Materiaalit ja menetelmät

Baumann' in el. ai (Naunyn-Schmiedeberg' s Arch. Pharm.

307, 73; 1979) ja C. Takeguchi'in et al (Biochem. 10, 2372; 1971) julkaistuihin menetelmiin perustuen kehitettiin parannettu määritysmenetelmä. Entsymaattinen radiomääritys suoritettiin sjlanoiduissa lasiastioissa. Reaktioseosta, joka sisälsi 50 mM Tris HC1-puskuria, pH = 8,3, pelkistetyn glutationiri (GSH) läsnäollessa, 1 mM, 3ekö 0,55 mM hydro-kinonia, tesLaLtavaa yhdistettä ja 50 jjg pässin siemen-neatevesikkeli-inikroeomijauhetta kokonaistilavuuden ollessa 0,2 ml, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa, ennenkuin lisättiin 10/j1 arakidonihappoa 10”^M (0,08 uCI).

30 minuutin inkuboinnin jälkeen, jolloin silloin tällöin ravisteltiin, reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ui IM si t ruunaliappoa .

Seos uutettiin neljä kertaa 0,5 ml:lla vedetöntä dietyyli-eetteriä ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Jäännös suspen-doitiin uudelleen noin 40 ulsaan eetteriä ja kromatogra-foitiin silikugeelilevyillä. Eluointijärjestelmä oli dietyy1ieetteri/metanoii/etikkahappo (45:1:2). RF-arvot mitattiin arakidonihapon suhteen. Ohutlevykromatografialevyt valotettiin LKB-u ltrafilmillfi noin 20 tuntia. Täplien alustava identifiointi suoritettiin ajamalla standardit (PGEI, PGE2, PGFla, PGF2a, PGA^, PGA2, PGB1, PGB2) samassa liuotinjärjestBlmässä. Kvantitatiiviset tulokset saatiin densitometrian avulla.

b. Tulokset 20 84480

Yhdisteet Autoradiograafinen kvanti- ’ 1 tasointi muutos-?!' 3,2 10_6M PGF2a PGE2 PGD2

Esimerkki 1 - 51,49 - 15,12 - 5,12

Esimerkki 2 - 59,12 - 17,30 - 6,30

Esimerkki 3 --36,26 - 22,47 - 2,11

Esimerkki 4 “ 42,84 - 41f25 - 11,28

Esimerkki 5 ” 28,10 - 33,33 - 16,75 * Esimerkki 6 “ 30,29 - 16,48 - 29,63

Fenyylibutatsoni -43,36 -15,37 -21,98 2 10~5M__ 2i 84480 5) Ksantiinioksidaasin Inhibiitteinä potentiaalisten yhdisteiden "in vitro" seulonta a. Materiaalit ja menetelmät

KsantiinioksicJ aasi-aktiivisuus määritettiin H.M. Kalckar'in (J. Biol. Chain. 16 7, 429-443, 1947) menetelmällä, jossa mitataan spek tiu foto m et risesti v/irtsahapon muodostuminen.

Spektro fo Lometrikyve11iin lisättiin ksantiinioksidaasia 0,01 yksikkö/ml loppukonsentraatioon, minkä jälkeen lisättiin fosfaattipuskuria 0,05M, pH = 7,4, tai inhibiittoria. Reaktio aloitettiin lisäämällä ksantiinia 5.10'^M loppukonsentraatiossa. Virtsahapon vapautumista seurattiin aallonpituudella 295 nm joka 30. sekunti 2 minuutin ajan (lineaarinen vaihe). Aktiivisuusyksikkö määritettiin 0,001 muutokseksi minuutissa. Entsymaattisen aktiivisuuden prosentuaalinen määrä laskettiin testattujen yhdisteiden jokaiselle konsentraatiolle. Aineen se määrä, joka tarvitaan estämään entsyymi 50-prosenttisesti (IC ), laskettiin lineaarisen regression avulla tulospisteistä, jotka esittävät konsentraation M logaritmia inhibiitio-S»:n funkt iona.

b. Tulokse L · 22 84480 IC ·

Yhdisteet 50 (50 % inhibiition konsent raa t io) -5

Esimerkkil 5,20 10 -5

Esimerkki 2 5,39 10 -5

Esimerkki 5 1,13 10

Esimerkkiä 9„04 10 -5

Esimerkki 5 3t37 10

Esimerkki 6 1,03 10-® I __ ____ F o o 1 i h a ρ ρ ο 6,76 10_7Μ

Kamferuli 7,89 10 S

« 84480 6) Ihmisen leukosyytti-lipoksiqenaasin (LP) inhibiitio a) 5- ja 12- lipaksigenaasien inhibiitio, humaani, moni tumainen

Kokeen n:o 1 suoritustapa: 1. Inkuboidaan yhdessä 15 x 10^ ihmisen leukosyyttiä mlsssa ja 2 mM C a ^ + , 0,5 m M M g ^ + inhibiittien läsnäollessa 20 minuuttia 3 7 01’; s s a .

2. Stimuloidaan 4 minuutin ajan 1 ^/ug : 11a ionoforia 'A 2 31Q 7)/m1.

3. Inkuboinl i pysäytetään 1 tilavuudella metanolia.

4. RP-HPLC-ana .Ly y s i , kolonni C18, 5 5. Piikkien korkeus mitataan ja verrataan sisäiseen standardiin (PGB ).

Koe n:o 1: lulosten analyysi Ιύ50

Tuotteet 5-HETE LTB, 12-HETE

- - 4

Esimerkki 1 2,10 M 2,10 M 2r 10 M

Esiemrkki 3 10 M 10 M 10 M

i

Esimerkki 5 2,10 10 M 10 M

"-'λ' r . . , 3.10”6 10“6M 2.10"6M

: Esimerkki 6 / 2* 84480 b) 5-, 12- ja 15-1 ipoksigenaasien inhibiltio, humaani, monitumainen

Kokeen n:o 2 suoritustapa; 1. Inkuboidaiiii II x 10^ humaania leukosyyttiä mlrssa inhib i i 11 ien kanssa 2U minuuttia 37°C:ssa (2 mM Ca2 + ja 0,5 mM Mg2+).

2. Stimuloidaan 4 minuutin ajan 10 /Jg: 11a arakidonihappoa ja 1 ug:lla ionuf'oria (A231B7 )/ml.

3. Inkubointi pysäytetään 1 tilavuudella metanolia ja suoritetaan li P- HP LL'-analyysi .

4. Piikkien korkeus mitataan ja verrataan sisäiseen standardiin (P0B ) .

Koe n:o 2: Tulosten analyysi IC50

Tuotteet 5,-HETE 12-HETE 15-HETE HHT LTB4

Esimerkki 1 2,10_6M 1θ"6Μ 3,10_5M 4,10_5M 4,10~6M

Esimerkki 2 2,10_6M 1θ"6Μ 10"5M 5;10_5M 2,1θ“6Μ

Esimerkki 3 5,10 ~*M 5^10 M 5,10 M 10 M 5,10 M

* Esimerkki 4 10_6M 10_5M 2,10_6H lo"5M 5,10~6M

Esimerkki 5 3f10'6M 2;10"6M 10_6M 2,1θ"6Μ 1θ"6Μ

Esimerkki 6 2,1θ'6 3,1θ'6Μ 5,1θ"6Μ 2,1θ"6Μ 10’6M

25 84480 Γ ulokset

Edellä oleviin kolmen yhdisteen havaitaan stimuloivan 15-lipoksigenaasia konsentraatiossa 10“ M - 3 x 10 M, kun taas 5-lipokeigenaasi inhiboituu näissä konsentraa-lioissa.

Huomattakoon, että kokeessa n:o 1 vain ionofori stimuloi leukosyyttejä ja kokeessa n:o 2 ionofori ja arakidonihappo stimuloivat soluja. Eksogeenisen arakidonihapon mukanaolo lisää 10-kertaisesti inhibiittien ID^^-arvoa; toisaalta arakidonihapon lisääminen mahdollistaa 15-1ipoksige-naasiaktiivisuuden mittaamisen, jota ei tavallisesti voida ti avail n vain ionoforilla stimuloiduissa leukosyyteissä.

Claims (1)

1. 26 8 4480 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa farmakologisesti vaikuttavia bisyklisiä katekolijohdoksia, joiden kaavat I ja II ovat Rj^O Z R^O ^ R20 R3 R20 (i) ΠΙ) joissa kukin ja R2 on toisistaan riippumatta vetyatomi tai metyyli ryhmä; R3 on fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu trifluori-metyyliryhmällä ja Z on karbonyyli-, metyleeni- tai karbonyylimetyleeniryhmä, jolloin karbonyylimety1eenin tapauksessa karbonyyliryhmä on rengasfuusioidun hiiliatomin vieressä, tunnettu siitä, että kaavan III mukainen yhdiste *ι0Υ^Ίι ^ J1 (III) r2oSH jossa Rl ja R2 tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan sopivasti substituoidun kaavan IV mukaisen propionihapon tai voihapon (tai näiden esterin tai suolan) kanssa III R3 - (c) - c - c - co2h (IV) I 1 I jossa R3 tarkoittaa samaa kuin edellä. 2v 84480 Förfarande för framställning av farmakologiskt verksamma bicykliska katekolderivat med de allmänna formlerna I och II LII XII r2o r3 r2o \ s r3 (I) (II) där envar R^ och R2 oberoende av varandra är en väteatom eller en metylgrupp; R3 är en fenylgrupp, son kan vara substituerad med en tri-fluormetylgrupp och Z är en karbonyl-, metylen- eller karbonylmetylengrupp, varvid i fallet karbonylmetylen, coh karbonylgruppen ligger invid den ringkondenserade kolatomen, kännetecknat därav, att en förening med formeln III ^ 1 (III) R20 SH där R^ och R2 avser samma soin ovan, omsätts med en lämpligt subs-tituerad propionsyra eller butyrsyra (eller en ester eller ett sait av dessa) med formeln IV l I I r3 - (c) - c - c - co2h (IV) I I I där R3 avser samma som ovan.