PL201877B1

PL201877B1 - Analogi witaminy D3

Info

Publication number: PL201877B1
Application number: PL356124A
Authority: PL
Inventors: Andrew David Batcho; Bernard Michael Hennessy; Milan Radoje Uskokovic
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2009-05-29
Also published as: CO5190683A1; JP2003504354A; AU6689400A; JO2255B1; MXPA02000313A; NO20020161D0; PE20010328A1; DE60009303D1; US6331642B1; EP1200399B1; GC0000198A; IL147254A; KR20020033728A; AU779408B2; HK1047578A1; AR024695A1; KR100477161B1; WO2001004089A1; TR200200054T2; PT1200399E

Abstract

Wynalazek dotyczy analogów witaminy D3 o ogólnym wzorze I, w którym, R 1 oznacza atom wodoru lub (C 1 -C 4 )alkil; R 2 oznacza atom wodoru lub (C 1 -C 4 )alkil; A wraz z s asiednimi atomami w egla oznacza -CH 2 -CH 2 -; R 3 oznacza (C 1 -C 4 )alkil; a R 4 oznacza (C 1 -C 4 )alkil. Zwi azki te s a u zyteczne w leczeniu raka sutka, raka prostaty, przewlek lej bia laczki szpikowej, lagod- nego rozrostu prostaty, lysienia i osteoporozy. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są analogi witaminy D3 o ogólnym wzorze I

w którym

R1 oznacza atom wodoru lub (C1-C4)alkil;

R2 oznacza atom wodoru lub (C1-C4)alkil;

A wraz z są siednimi atomami węgla oznacza -CH2-CH2-;

R3 oznacza (C1-C4)alkil; a

R4 oznacza (C1-C4)alkil.

Korzystny jest związek o wzorze (I), w którym R1 oznacza atom wodoru, a R2 oznacza (C1-C4)-alkil, albo R1 oznacza (C1-C4)alkil, a R2 oznacza atom wodoru.

Szczególnie korzystny jest związek o wzorze (I), w którym R1 oznacza atom wodoru, a R2 oznacza metyl, albo R1 oznacza metyl, a R2 oznacza atom wodoru.

Najkorzystniejszym związkiem jest 1,25-dihydroksy-16-eno-5,6-transcholekalcyferol.

Stwierdzono, że związki o wzorze I wywołują hamowanie proliferacji w liniach komórek raka prostaty, raka sutka oraz przewlekłej białaczki szpikowej. Zatem związki o wzorze I są użyteczne jako środki do leczenia raka prostaty, raka sutka oraz do leczenia białaczki.

Stwierdzono także, że związki o wzorze I wykazują aktywność antyandrogeniczną. Zatem związki o wzorze I są użyteczne w leczeniu łagodnego rozrostu prostaty, łysienia i raka prostaty.

Stwierdzono także, że związki o wzorze I wykazują aktywność jako środki użyteczne w leczeniu chorób gruczołów łojowych, takich jak trądzik lub łojotokowe zapalenie skóry.

Stwierdzono także, że związki o wzorze I wykazują aktywność jako środki użyteczne w leczeniu osteoporozy.

Stosowane tu określenie „(C1-C4)alkil” oznacza grupę alkilową o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, zawierającą 1-4 atomy węgla, np. metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, t-butyl itp.

W podanych wzorach różne podstawniki przedstawiono jako połączone z pierścieniem za pomocą jednego z następujących oznaczeń: pełny klin (-^) wskazuje, że podstawnik znajduje się nad płaszczyzną cząsteczki; a przerywany klin (.....i) wskazuje, że podstawnik znajduje się pod płaszczyzną cząsteczki.

PL 201 877 B1

Związki o wzorze I wytwarza się w sposób opisany poniżej, w szczególności przedstawiony na poniższym schemacie.

R5 oznacza atom wodoru lub trimetylosilil.

Zgodnie z powyższym schematem, na którym Ph oznacza fenyl, związek o wzorze II, czyli tlenek [3S-(1E,3e,5a)-2-[3,5-bis(dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etylo]-difenylofosfiny, przeprowadza się w związek o wzorze IA drogą reakcji ze związkiem o wzorze III.

Reakcję prowadzi się w temperaturze od -60 do -90°C, w polarnym aprotonowym rozpuszczalniku organicznym, takim jak bezwodny eter, lub korzystniej bezwodny tetrahydrofuran, w obecności mocnej zasady, takiej jak alkilolit, np. butylolit.

Grupy zabezpieczające w związkach o wzorze IA usuwa się drogą reakcji z fluorkiem, takim jak fluorek tetrabutyloamoniowy, w polarnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak eter, lub korzystniej tetrahydrofuran, z wytworzeniem odpowiedniego związku o wzorze I.

Związek o wzorze II wytwarza się w sposób opisany poniżej w przykładach 1-6, lub alternatywnie, w sposób opisany w przykładach 7 i 8.

Związki o wzorze III są znane (np. z opisu patentowego US 5087619) albo można je wytwarzać znanymi sposobami.

Związki o wzorze I można podawać doustnie, w leczeniu raka sutka, raka prostaty lub białaczki, ludziom potrzebującym takiego leczenia. W szczególności w takim leczeniu związki o wzorze I można podawać doustnie ludziom dorosłym w dawkach około 1 - 20 μg na dzień.

Związki o wzorze I można podawać doustnie, w leczeniu łagodnego rozrostu prostaty i łysienia u ludzi potrzebujących takiego leczenia. W szczególności w takim leczeniu związki o wzorze I leczenia można podawać doustnie ludziom dorosłym w dawkach od około 1 do 20 μg na dzień.

Związki o wzorze I można podawać doustnie w leczeniu osteoporozy u ludzi w dawkach od około 1 do 20 μg na dzień.

PL 201 877 B1

Związki o wzorze I można stosować miejscowo, w leczeniu łysienia u ludzi potrzebujących takiego leczenia. W szczególności w takim leczeniu można stosować związki o wzorze I w dawkach od około 5 do około 50 μg na gram preparatu do stosowania miejscowego na dzień.

Związki o wzorze I można podawać doustnie w leczeniu chorób gruczołów łojowych u ludzi w dawkach od około 1 to 20 μg na dzień.

Preparaty doustne zawierające związki o wzorze I według wynalazku można wprowadzać do kapsułek, tabletek itp. razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami.

Do farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, które można wprowadzać do kapsułek itp., należą np. substancje wiążące, takie jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana lub żelatyna, zaróbki, takie jak fosforan diwapnia, środki rozsadzające, takie jak skrobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy itp., substancje poślizgowe, takie jak stearynian magnezu, środki słodzące, takie jak sacharoza, laktoza lub sacharyna, środki smakowo-zapachowe, takie jak aromat mięty pieprzowej, olejek wintergrinowy lub aromat wiśniowy. Inne różne substancje mogą być obecne jako środki powlekające lub w inny sposób zmieniające fizyczną postać jednostki dawkowanej. Przykładowo tabletki można powlekać szelakiem, cukrem lub obiema tymi substancjami. Syrop lub eliksir mogą zawierać substancję czynną, sacharozę jako środek słodzący, metyloparaben i propyloparaben jako konserwanty, barwnik i środek smakowo-zapachowy, taki jak zapach wiśniowy lub pomarańczowy.

Preparaty do dawkowania miejscowego, zawierające związki o wzorze I według wynalazku, to np. maści i kremy stanowiące preparaty zawierające oleiste, wchłanialne, rozpuszczalne w wodzie podłoża typu emulsji, takie jak wazelina, lanolina, glikole polietylenowe itp.

Lotony to ciekłe preparaty w postaci od prostych roztworów do wodnych lub wodno-alkoholowych preparatów zawierających subtelnie rozdrobnione substancje. Lotony mogą zawierać środki suspendujące lub dyspergujące, np. pochodne celulozy, takie jak etyloceluloza, metyloceluloza itp., żelatynę lub gumy, które wprowadzają substancję czynną do zaróbki stanowiącej wodę, alkohol, glicerynę itp.

Żele to półstałe preparaty wytworzone przez żelowanie roztworu lub zawiesiny substancji czynnej w zaróbce nośnikowej. Zaróbkę, która może być wodna lub bezwodna, poddaje się żelowaniu z użyciem środka żelującego, takiego jak karboksypolimetylen i zobojętnia do odpowiedniej konsystencji żelu za pomocą środków alkalicznych, takich jak wodorotlenek sodu i aminy, takie jak polietylenokokoamina.

Stosowane tu określenie „miejscowo” oznacza stosowanie substancji czynnej, wprowadzonej w odpowiedni nośnik farmaceutyczny i naniesienie jej na miejsce zapalne w celu wywołania miejscowego działania. Tak więc środki do stosowania miejscowego stanowią te postacie farmaceutyczne, za pomocą których związek jest podawany zewnętrznie poprzez bezpośredni kontakt ze skórą. Postacie do dawkowania miejscowego stanowią żele, kremy, lotony, maści, pudry, aerozole i inne standardowe postacie do nanoszenia leków na skórę, otrzymane przez zmieszanie związków o wzorze I ze znanymi nośnikami farmaceutycznymi do podawania miejscowego.

Użyteczną aktywność związków o wzorze I jako środków do leczenia raka prostaty, raka sutka i do leczenia białaczki można wykazać na podstawie następujących testów znanych w dziedzinie wynalazku.

Materiały wybrane do stosowania oraz stosowane procedury opisano poniżej.

Linie komórkowe. Linię komórkową raka sutka (MCF-7), linię komórkową raka prostaty (LNCaP) oraz linię komórkową przewlekłej białaczki szpikowej (HL-60) hodowano w następujący sposób: komórki MCF-7 hodowano w pożywce Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM) z 10% płodową surowicą cielęcą (PCS), LNCaP, a HL-60 hodowano w RPMI1640 z 10% PCS; wszystkie trzy linie komórkowe hodowano w 37°C w inkubatorze zawierającym 5% CO2.

Związki typu witaminy D3. Związki typu witaminy D3 rozpuszczono w absolutnym etanolu i otrzymano roztwór podstawowy o stężeniu 10^-3 M, który przechowywano w -20°C i chroniono przed światłem. Do stosowania in vitro związki rozcieńczano pożywką DMEM lub RPMI. Do stosowania in vivo związki rozcieńczano solą buforowaną fosforanami (PBS). Podwielokrotną próbkę stosowano tylko raz i komórki LNCaP trypsynizowano. Przemyte jednokomórkowe zawiesiny komórek policzono i wysiano do 24-studzienkowych płytek o płaskim dnie przy całkowitej liczbie 1 x 10^-3 komórek/studzienkę w objętości 400 μl/studzienkę. Warstwę podłoża przygotowano z agaru równoważonego w 42°C. Przed tym etapem za pomocą pipety wprowadzono związki do studzienek. Po inkubacji policzono kolonie. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono co najmniej trzy razy stosując po trzy płytki dla każdego punktu doświadczalnego.

PL 201 877 B1

Poziom wapnia w surowicy in vivo. Dwadzieścia osiem samców myszy Balb/c w wieku 8-9 tygodni utrzymywano w warunkach wolnych od patogenów i karmiono standardową dietą laboratoryjną.

Czterem myszom z grupy podawano śródotrzewnowo każdego dnia (z wyjątkiem soboty i niedzieli) związek typu witaminy D₃ lub rozcieńczalnik (100 μΐ/mysz) przez 3 tygodnie. Dawki 1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃ wynosiły: 0,1,0,5, 1,0, i 2,0 μg. Dawki 1,25(OH)₂D₃ wynosiły 0,1 μg/mysz. Myszom kontrolnym wstrzyknięto 100 μl PBS. Co tydzień mierzono poziom wapnia w surowicy stosując ilościowy test kolorymetryczny.

Doświadczenia z pulsacyjnym wystawieniem na działanie. Komórki MCF-7 inkubowano w ciekłej hodowli z 10^-7 1,25(OH)2D3 lub 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 przez różne okresy czasu. Po inkubacji komórki dokładnie przemyto dwukrotnie PBS i żywe komórki policzono i wysiano do 24-studzienkowych płytek do testu hodowania kolonii na miękkim agarze, jak opisano powyżej.

Analiza cyklu komórkowego metodą cytometrii przepływowej. Analizę cyklu komórkowego wykonano z użyciem komórek MCF-7 inkubowanych przez 4 dni z 1,25(OH)2D3 lub 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 w stężeniu 10^-7 M. Komórki utrwalono w ochłodzonym metanolu przez noc przed wybarwieniem z użyciem 50 μg/ml jodku propidiowego, 1 mg/ml Rnazy (100 jednostek/ml) i 0,1% NP40. Analizę przeprowadzono natychmiast po wybarwieniu. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono niezależnie co najmniej trzy razy. Dla wszystkich wyników wykonano analizę statystyczną stosując test Studenta.

Analiza Western Blot. Komórki przemyto dwukrotnie PBS, przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze do lizy (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% deoksycholan sodu, 1% NP40, 100 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu, 2 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml pepstatyny i 10 μg/ml leupeptyny) i umieszczono w lodzie na 30 minut. Po odwirowaniu przy 15000 g przez 20 minut w 4°C zebrano supernatant. Oznaczono stężenie białka. Całe lizaty (15 μg) rozdzielono w 15% żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, wykonano transfer na błonę immobilon poli(difluorek winylidenu) i wyznakowano króliczym przeciwciałem poliklonalnym przeciw-p27^kip1 i mysim monoklonalnym przeciwciałem przeciw aktynie. Bloty wywołano.

Aktywność telomerazowa. Aby określić względną aktywność telomerazową zastosowano testy z protokołem amplifikacji powtórzeń telomerowych (TRAP). Dla ludzkiej telomerazy odwrotnej transkryptazy (hTERT), wyizolowano całkowity RNA z komórek HL, które poddawano działaniu 1,25(OH)2D3 lub 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 (10^-9, 10^-8 i 10^-7 M) przez 4 dni w jednofazowym roztworze fenolu i izotiocjanianu guanidyny. RT-PCR przeprowadzono z użyciem 1 μg całkowitego RNA i losowych starterów heksamerycznych. cDNA zamplifikowano stosując startery specyficzne dla genu hTERT lub genu GAPDH, który zastosowano jako kontrolę. Starterami dla genu hTERT były: 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' (sensowny) (SEQ ID NO: 1) i 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antysensowny) (SEQ ID NO: 2). Cykle temperaturowe były następujące: 94°C przez 90 sekund, a następnie 33 cykle 95°C przez 20 sekund, 68°C przez 40 sekund i 72°C przez 30 sekund. Starterami dla genu GAPDH były: 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3' (sensowny) (SEQ ID NO: 3) i 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3' (antysensowny) (SEQ ED NO: 4). Warunki amplifikacji GAPDH były następujące: 94°C przez 2 minuty, 26 cykli 94°C przez 30 sekund, 62°C przez 40 sekund, 72°C przez 60 sekund, a następnie 72°C przez 4 minuty. Produkty PCR poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i wybarwiono bromkiem etydyny.

Działanie analogów witaminy D3 w teście klonogenicznym. Komórki LNCaP, MCF-7 i HL-60 klonowano w miękkim agarze w obecności analogów witaminy D3 w stężeniu 10^-11 do 10^-7 M. Wykreślono krzywe odpowiedzi na dawkę i wyznaczono skuteczną dawkę, która hamowała w 50% tworzenie kolonii (ED50). 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 była skuteczna w hamowaniu proliferacji klonalnej tych trzech linii komórkowych w sposób zależny od dawki. ED50 dla 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 wynosiła 1,4 x 10^-9 M dla komórek LNCaP, 4,3 x 10^-9 M dla komórek MCF-7 i 3,0 x 10^-11 M dla komórek HL-60 i była około 10 - 100 razy silniejsza niż dla 1,25(OH)2D3.

Poziom wapnia w surowicy in vivo. Ponieważ hiperkalcemia jest głównym czynnikiem toksyczności związków witaminy D3, porównano wpływ na stężenie wapnia 1,25(OH)2D3 i 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D₃. Wszystkie myszy przeżyły trzytygodniowe badanie. U myszy, które otrzymywały 0,1 μg 1,25(OH)2D3, wystąpiła hiperkalcemia przy poziomie wapnia w surowicy około 12 mg/dl (norma 8,5 - 10,5 mg/dl). W odróżnieniu od tego myszy, które otrzymywały 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 (0,1 - 2,0 μg/mysz), miały prawie ten sam poziom wapnia (8 - 10 mg/dl) co myszy kontrolne (8 - 9 mg/dl).

Doświadczenia z pulsacyjnym wystawieniem na działanie. Aby zbadać, czy hamowanie proliferacji klonogenicznej przez analogi witaminy D3 było odwracalne, przeprowadzono doświadczenia

PL 201 877 B1 z pulsacyjnym wystawieniem na działanie. Komórki MCF-7 poddano działaniu 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 lub 1,25(OH)2D3 przez różne okresy czasu, dokładnie przemyto, wysiano w miękki agar i policzono liczbę kolonii w czternastym dniu hodowli. Odpowiednio około 40 i 30% komórek klonogenicznych zostało zahamowanych przez czterodniowe wystawienie na działanie 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3.

Analiza cyklu komórkowego. Określono wpływ 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 (10^-7, 4 dni) na cykl komórkowy komórek MCF-7. Stwierdzono znaczący wzrost (P < 0,05) liczby komórek w fazie G0-G1 cyklu komórkowego i towarzyszące mu zmniejszenie udziału komórek w fazie S.

Analiza Western Blot. Zależne od cyklin inhibitory kinaz znane jako p21^waf1 i p27^kip1 potrafią hamować aktywność kinazy cykliny i to spowolnia postęp cyklu komórkowego w komórkach. W kontrolnych komórkach MCF-7 obserwowano konstytutywny średni poziom ekspresji p21^waf1 i p27^kip1, co oznaczono metodą analizy Western blot. Wystawienie na działanie 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 (10^-7 M) zwiększyło ekspresję p21^waf1 i p27^kip1 około 3,2 - 3,5-krotnie, podczas gdy hodowanie z 1,25(OH)2D3 (10^-7 M) zwiększyło ekspresję p21^waf1 i p27^kip1 około 1,6 - 1,8-krotnie. Wystawienie komórek MCF-7 na działanie 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 (10^-7 M) przez 3 dni wywołało 2,8-krotne i 3,4-krotne zwiększenie ekspresji odpowiednio p21^waf1 i p27^kip1. 1,25(OH)2D₃ (10^-7 M, 3 dni) zwiększyła ekspresję p21^waf1 i p27^kip1 odpowiednio 4,8-krotnie i 3,3-krotnie.

Zbadano zależne od dawki działanie związków typu witaminy D3 na ekspresję p27^kip1 w komórkach HL-60. Zarówno 1,25(OH)2D3, jak i 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 zwiększały ekspresję p27^kip1, a te poziomy znacznie wzrosły po inkubacji z 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 (4 dni, 10^-9 M). Poziomy p27^kip1 wzrosły znacząco gdy komórki HL-60 hodowano z 10^-8 - 10^-7 M 1,25(OH)₂D₃.

Aktywność telomerazowa. Wpływ 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 i 1,25(OH)2D3 (10^-9 - 10^-7 M, 4 dni) na aktywność telomerazową określono na podstawie testu TRAP. Aktywność telomerazowa znacznie zmniejszyła się w komórkach HL-60 hodowanych z 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 10^-9 M lub 10^-7 M 1,25(OH)2D3.

Wpływ analogów witaminy D3 na ekspresję hTERT w komórkach HL-60 określono metodą RT-PCR. Zarówno 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3, jak i 1,25(OH)2D3 hamowała ekspresję hTERT mRNA w sposób zależny od dawki z prawie całkowitym zahamowaniem przy 10^-8 M 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 i przy 10^-7 M 1,25(OH)2D3.

Użyteczną aktywność związków o wzorze I jako środków do leczenia łagodnego rozrostu prostaty można wykazać na podstawie następujących testów znanych w dziedzinie wynalazku.

1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 zbadano pod względem aktywności antyandrogenicznej u wykastrowanych, stymulowanych testosteronem samców chomika syryjskiego. Badania wykazały, że 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 znacząco hamuje wywoływany androgenami przerost pęcherzyków nasiennych i brzusznej prostaty u tych zwierząt, podczas gdy 1,25(OH)2D3 była nieaktywna w dawkach nietoksycznych (1 μg).

Wykastrowanym samcom chomika syryjskiego podawano codziennie, s.c., 20 μg propionianu testosteronu i 1 μg 1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃ przez 14 kolejnych dni. Obydwa związki podawano w 0,2 ml oleju sezamowego jako zaróbce. Sekcję wykonano piętnastego dnia. Usunięto prostatę i pęcherzyki nasienne, osuszono bibułą i zważono. Dane analizowano pod względem istotności statystycznej stosując test t Studenta i wyrażono jako procentowe hamowanie stymulowanej odpowiedzi.

T a b e l a I

Hamowanie wzrostu prostaty i pęcherzyka nasiennego u wykastrowanych chomików stymulowanych testosteronem

Grupa	Leczenie	Prostata brzuszna	Pęcherzyki nasienne
mg	Hamowanie	mg + SEM	Hamowanie
1.	Zaróbka	12 ± 1	-	36 ± 3	-
2.	Testosteron	43 ± 5	-	105 ± 6	-
3.	Testosteron + 1,25-(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 0,1 μ9	19 ± 2	77%	71 ± 1	48%

***p<0,001

Użyteczną aktywność związków o wzorze I jako środków do leczenia osteoporozy można wykazać na podstawie poniższego testu znanego w dziedzinie wynalazku.

PL 201 877 B1

Materiały i metody

Zwierzęta i warunki ich hodowli

Użyto trzymiesięcznych samic szczurów. Po tygodniu aklimatyzacji zwierzęta podzielono na grupy i podawano im przez zgłębnik 1 ml/kg/dzień 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 w kilku stężeniach. W siódmym dniu dawkowania od zwierzą t pobrano krew i oznaczono poziom wapnia w surowicy.

Przygotowanie związku

Związek rozpuszczono w etanolu gatunek 200 i otrzymano roztwór o stężeniu 100 μg/ml. Przygotowano mieszaninę oleju sezamowego jako zaróbki i etanolowego roztworu, o najwyższym stężeniu związku do dawkowania, a następnie odparowano ją w wyparce obrotowej w 37° w celu usunięcia etanolu. Obliczono objętość dawki uwzględniając średnią masę ciała zwierząt w grupie. Wykonano kolejne rozcieńczenia związku rozpuszczonego w zaróbce do odpowiedniego stężenia roztworu do dawkowania.

Zbieranie surowicy i oznaczenia

Krew (1,5 ml) pobrano od każdego zwierzęcia przez oczodołową punkcję przy narkozie eterowej w siódmym dniu dawkowania. Krew zebrano do probówek do oddzielania surowicy, odwirowano przy 2000 obr/min przez 15 minut, a następnie surowicę podzielono na części w celu oznaczenia stężenia wapnia. Stężenie wapnia oznaczono na podstawie testu kolorymetrycznego.

Wyniki podano w tabeli II.

T a b e l a II. Poziom wapnia w surowicy

Nr grupy	Leczenie	Dawka ^g/kg/dzień)	Wapń w surowicy
Średnia (mg/dl)	SD
1	Zaróbka	0	9,65	0,25
6	Związek	0,5	10,64	0,51
7	Związek	1	10,06	0,47
8	Związek	1,5	9,92	0,39
9	Związek	2	9,77	0,46

Poziom wapnia w surowicy pozostawał w normalnym zakresie dla zakresu dawkowania do 2 μg/kg/dzień przy leczeniu z użyciem 1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃.

Materiały i metody

Zwierzęta i warunki ich hodowli

Trzymiesięczne dorosłe samice szczurów poddano obustronnemu wycięciu jajników lub symulowanej operacji. Po tygodniu aklimatyzacji zwierzęta zważono i podzielono na grupy, którym podawano przez zgłębnik doustny konkretny związek w stężeniu 1 mg/kg. Objętość dawki określano co tydzień uwzględniając średnią masę ciała zwierząt w grupie. Dawkowanie rozpoczęto w 17 dni po operacji i kontynuowano przez 19 dni. W dwudziestym dniu zwierzęta uśpiono przez inhalację dwutlenkiem węgla i wycięto lewą kość udową.

Całkowita zawartość wapnia w kości udowej

Podczas sekcji wszystkim zwierzętom usunięto lewe kości udowe i usunięto z nich tkanki miękkie. Kości zmierzono i przecięto w połowie trzonu kości, a następnie dystalną część przecięto wzdłużnie na pół po usunięciu nasady kości. Szpik kostny wypłukano i wyekstrahowano wapń przez zanurzenie w 5% TCA. Zawartość wapnia w ekstraktach TCA oznaczono stosując ilościową, kolorymetryczną metodę oznaczania wapnia. Dane wyrażono jako średnie całkowitej zawartości wapnia w mg/dystalną połowę kości udowej (DHF) ± surowica.

Zbieranie surowicy i oznaczenia

Krew (1,5 ml) pobrano od każdego zwierzęcia przez oczodołową punkcję przy narkozie eterowej siódmego i osiemnastego dnia dawkowania. Krew zebrano do probówek do oddzielania surowicy, odwirowano przy 2000 obr/min przez 15 minut, a następnie surowicę podzielono na części w celu oznaczenia stężeń wapnia. Stężenie wapnia oznaczono na podstawie testu kolorymetrycznego.

Analiza statystyczna

W celu sprawdzenia wpływu wycięcia jajników na zawartość wapnia w kościach grupy udawanej operacji i po wycięciu jajników (ovx) porównano obie grupy stosując test t Studenta. Grupy ovx porównano

PL 201 877 B1 na podstawie jednościeżkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie LSD Fishera dla porównania każdej grupy badanej z zaróbką gdy ogólny wpływ był statystycznie znaczący.

Wyniki podano w tabelach III i IV.

T a b e l a III. Wpływ na zawartość wapnia w kości udowej w odniesieniu do całej masy ciała

Leczenie	Dawka (pg/kg)	Zawartość Ca/100 g masy ciała		SEM	Wartość p względem Ovx
Udawane/Zaróbka	0,000	14,44	±	0,31	0,0001
Ovx/Zaróbka	0,000	10,58	+	0,33	-
1,25(OH)2D3	0,500	11,91	±	0,32	0,0026
1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3	2,000	11,49	±	0,26	0,0368

T a b e l a IV. Wpł yw na poziom wapnia w surowicy

Leczenie	Dawka (pg/kg)	Poziom wapnia w surowicy mg/dl		SEM	Wartość p względem Ovx
Udawane/Zaróbka	0,000	10,48	±	0,12	nieistotna
Ovx/Zaróbka	0,000	10,41	±	0,15	-
1,25(OH)2D3	0,500	11,74	±	0,19	0,0001
1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃	2,000	9,98	±	0,09	nieistotna

Początkowo zidentyfikowano użyteczną aktywność związków o wzorze I jako środków do leczenia chorób gruczołów łojowych, co wykazano na podstawie poniższych procedur testowych znanych w dziedzinie wynalazku.

Samcom chomików Golden Syrian podawano codziennie (przez 5 dni w tygodniu) przez zgłębnik 200 μΐ 1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃ rozpuszczonej w glikolu propylenowym. Zwierzęta uśmiercono po 4 tygodniach i uszy poddano dalszej ocenie histologicznej. Na podstawie analizy obrazu zmierzono obszar gruczołów łojowych na przygotowanych skrawkach histologicznych ucha.

Wyniki podano w tabeli V.

T a b e l a V

Dawka (pg/dzień)	Zmiana względem kontroli (%)
10	-50
1	-50
0,1	-23
0,01	-5

Zbadano również całkowitą frakcję lipidów w jednym z uszu (ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym, a następnie zważenie pozostałej substancji lipidowej).

Wyniki podano w tabeli VI.

T a b e l a VI

Dawka (pg/dzień)	Zmiana względem kontroli (%)
10	-56
1	-37
0,1	-25
0,01	-26

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

PL 201 877 B1

P r z y k ł a d 1

Octan (2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-4-metyleno-1-oksaspiro[2,5]oktano-2-metanolu

Do roztworu 18,5 g (0,0523 mola) octanu (2R,3S,5S,7S)-5-hydroksy-4-metyleno-7[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosililoksy]-1-oksaspiro[2,5]oktano-2-metanolu (Y. Kiegiel, P.M. Wovkulich i M. R. Uskokovic, Tetrahedron Letters, 32, str. 6057-6060 (1991)) i 6,8 g (0,099 mola) imidazolu w 50 ml dimetyloformamidu, w atmosferze argonu, w trakcie mieszania z użyciem mieszadła magnetycznego, dodano 9,8 g (0,065 mola) chlorku t-butylodimetylosililu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 5 godzin, reakcję przerwano dodawszy 5 ml wody, mieszano przez 30 minut i wlano do 400 ml wody. Następnie mieszaninę wyekstrahowano 2 x 500 ml heksanu i 2 x 500 ml eteru. Warstwy organiczne połączono, przemyto 300 ml wody, wysuszono nad Na2SO4 i odparowano. Po chromatografii w kolumnie z żelem krzemionkowym otrzymano 22,31 g (92%) związku tytułowego w postaci bezbarwnego oleju.

P r z y k ł a d 2

Octan [3S-(1E,3e,5a)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanolu

W 3 litrowej trójszyjnej kolbie, wyposażonej we wlot argonu, mieszadło mechaniczne i termometr, umieszczono 500 ml tetrahydrofuranu i ochłodzono do -60°C na łaźni z suchym lodem i acetonem. Dodano porcjami 43,23 g (0,108 mola) bezwodnego heksachlorku wolframu, utrzymując temperaturę -60°C, po czym szybko wkroplono (w ciągu około 5 minut) 200 ml 1,6 M n-butylolitu w heksanie, utrzymując temperaturę poniżej -45°C. Łaźnię z suchym lodem i acetonem zastąpiono łaźnią z lodem i wodą, co umożliwiło wzrost temperatury do 5°C. Nastąpiła zmiana zabarwienia z błękitnego na khaki, a następnie na czerwonawo-czarne. Po 30 minutach w temperaturze 5°C szybko wkroplono w ciągu 3 minut roztwór 22,31 g (0,04884 mola) octanu (2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-4-metyleno-1-oksaspiro[2,5]oktano-2-metanolu w 50 ml heksanu. Po 4 godzinach mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 2 litrami heksanu, przesączono przez warstwę żelu krzemionkowego, którą przemyto 3 x 500 ml mieszaniny heksan-octan etylu 9:1, i mieszaninę odparowano. Pozostałość poddano chromatografii w kolumnie z 75 g żelu krzemionkowego i otrzymano 22,56 g surowego produktu. Po chromatografii średniociśnieniowej w kolumnie z żelem krzemionkowym i elucji mieszaniną 100:1 dichlorometan-octan etylu otrzymano 17,42 g (80,1%) związku tytułowego i niewielką ilość odpowiedniego epimery 1Z.

P r z y k ł a d 3

Octan [3S-(1E,3e,5a)]-2-[3,5-bis-[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanolu (E-dien) i

PL 201 877 B1

Octan [3S-(1Z,3e,5a)]-2-[3,5-bis-[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanolu(Z-dien)

Do 465 ml bezwodnego THF w -78°C w trakcie mieszania dodano 64,3 g (160 mmoli) WCl6 (błękitny roztwór), a następnie 337,5 ml 1,43 M n-BuLi w heksanie (z taką szybkością, aby temperatura wewnętrzna nie wzrosła powyżej -20°C). Następnie mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Wkroplono roztwór 24,5 g (53,6 mmola) octanu (2S,3R,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-4-metyleno-1-oksaspiro[2,5]oktano-2-metanolu w 65 ml THF i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny. Mieszaninę rozcieńczono 600 ml pentanu i przesączono przez 4 cm złoże żelu krzemionkowego, z przemyciem mieszaniną heksan/EtOAc (19:1) i po odparowaniu składników lotnych pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 27 g surowej mieszaniny dienów. Po dalszym oczyszczeniu chromatograficznym z elucją mieszaniną heksan/EtOAc (25:1) otrzymano 21,6 g (91%) mieszaniny 2:3 dienów Z/E (związków tytułowych), które rozdzielono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym (heksan/EtOAc 40:1).

Z-dien ¹H NMR δ 0,052 (s, 6H), 0,06 (s, 6H) 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,74-1,90 (m, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,20 (dd, J = 6,0, 12,8 Hz, 1H), 2,41 (d, J = 11,1 Hz, 1H) 4,19 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,61 (dd, J = 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,68 (dd, J = 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 5,20 (s, 1H), 5,47 (t, J = 7,2 Hz, 1H). [a]D²⁵ = +1,2° (c = 0,4, EtOH). Analiza: obliczono dla C₂₃H₄₄O₄Si₂ = C, 62,27; H, 10,01; stwierdzono: C, 62,55, H, 10,33.

E-dien ¹H NMR δ 0,046 (s, 3H), 0,057 (s, 3H), 0,065 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,77 (ddd, J = 3,1, 9,4, 11,9 Hz, 1H), 1,89 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 2,31 (dd, J = 2,0, 15,2 Hz, 1H), 2,39 (dd, J = 6,3, 15,2 Hz, 1H), 4,21 (br s, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,58 (dd, J = 7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,65 (dd, J = 7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 4,99 (s, 1H), 5,69 (t, J = 7,2 Hz, 1H). [a]D²⁵ = +8,0° (c = 0,5, EtOH). Analiza: obliczono dla C23H44O4Si2: C, 62,67; H, 10,06; stwierdzono: C, 62,42, H, 10,01.

P r z y k ł a d 4

[3S-(1E,3e,5a)]-2-[3,5-bis[[(1,1-Dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanol Do roztworu 10,84 g (0,0246 mola) octanu [3S-(1 E,3e,5a)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metyleno-cykloheksylideno]etanolu w 100 ml metanolu, w atmosferze argonu, w trakcie mieszania z użyciem mieszadła magnetycznego, dodano 3,5 g pastylek wodorotlenku sodu i mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze argonu przez 3 godziny. Następnie mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 50 ml, rozcieńczono 500 ml wody i wyekstrahowano 2 x 500 ml mieszaniny heksan-eter 1:1. Warstwę organiczną przemyto wodą, wysuszono nad Na2SO4 i odparowano. Otrzymano 9,80 g (100%) związku tytułowego w postaci białej substancji stałej.

P r z y k ł a d 5

1R-(1a,3e,5E)-[[-2-Chloroetylideno)-4-metyleno-1,3-cyklo-heksanodiylo]bis(oksy)]bis(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilan

Do roztworu 6,67 g (0,050 mola) N-chlorosukcynoimidu w 150 ml dichlorometanu, ochłodzonego do 2°C na łaźni z lodem i acetonem, w atmosferze argonu, w trakcie mieszania wkroplono w ciągu 2 minut 4 ml (0,055 mola) sulfidu dimetylowego. Wytrącił się biały osad. Po 30 minutach w 0°C łaźnię

PL 201 877 B1 zastąpiono łaźnią z suchym lodem i acetonem oraz temperaturę mieszaniny reakcyjnej doprowadzono do -20°C. Dodano roztworu 9,8 g (0,0246 mola) [3S-(1 E,3e,5a)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanolu w 60 ml dichlorometanu. Po 15 minutach łaźnię chłodzącą usunięto i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 50 minut, po czym przeniesiono ją do rozdzielacza zawierającego 500 ml wody. Mieszaninę wyekstrahowano 2 x 350 ml heksanu. Warstwę organiczną przemyto 500 ml wody, wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano, w wyniku czego otrzymano 10,49 g surowego produktu w postaci żółtej cieczy. Po oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej otrzymano czysty związek w postaci bezbarwnego oleju. NMR (CDCl3): δ 0,03 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,70 - 1,94 (m, 2H), 2,34 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,28 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,03 (m, 1H), 5,78 (tm, J = 8 Hz, 1H).

P r z y k ł a d 6

Tlenek [3S-(1E,3e,5a)]-2-[3,5-bis[[(dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etylo]difenylofosfiny

W 1 litrowej trójszyjnej kolbie, wyposażonej we wlot argonu, mieszadło mechaniczne i termometr, umieszczono roztwór 10,26 g (0,0246 mola) 1 R-(1a,3e,5E)-[[-(2-chloroetylideno)-4-metyleno-1,3-cykloheksanodiylo]bis(oksy)]bis(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilanu w 100 ml świeżo przedestylowanego bezwodnego tetrahydrofuranu i roztwór ochłodzono na łaźni z suchym lodem i acetonem do -65°C. W ciągu 30 minut dodano 0,5M difenylofosforku potasu w tetrahydrofuranie w ilości 60 ml aż do osiągnięcia trwałego czerwonego zabarwienia. Po mieszaniu przez 1 godzinę w -65°C dodano 10 ml wody i łaźnię chłodzącą usunięto. Mieszanina reakcyjna odbarwiła się. Następnie szybko dodano 200 ml dichlorometanu, a potem 200 ml wodnego roztworu zawierającego 10 ml 30% nadtlenku wodoru. Po 1 godzinie dodano 13,5 g siarczynu sodu, 100 ml solanki i 200 ml dichlorometanu. Po dokładnym wytrząsaniu fazy rozdzielono i fazę wodną przemyto 200 ml dichlorometanu. Fazę organiczną przemyto 200 ml solanki. Połączone warstwy organiczne wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i odparowano, w wyniku czego otrzymano 16,33 g surowego produktu. Produkt ten oczyszczono metodą chromatografii średniociśnieniowej (na żelu krzemionkowym G-60) i otrzymano 12,54 g (87%) związku tytułowego w postaci białych kryształów. NMR (CDCl3): δ 0,02 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,08 (s, 3H), 0,84 (s, 18H), 1,76 (m, 2H), 2,98-3,15 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 7,45 (m, 6H), 7,72 (m, 4H).

P r z y k ł a d 7

Ester metylowy kwasu E-(3S,5R)-[3,5-bis-(t-butylodimetylosilanyloksy)-2-metylenocykloheksylideno]octowego (Ro 65-8821)

Roztwór 4,45 g (0,01043 mola) estru metylowego kwasu Z-(3S,5R)-[3,5-bis-(t-butylodimetylosilanyloksy)-2-metylenocykloheksylideno]octowego (X) (A. Mowrino i inni, Tetrahedron Letters, 38, str. 4713-4716 (1997)) w 100 ml heksanu napromieniano lampą UV przez 3 godziny. Po odparowaniu otrzymano 4,25 g (95,5%) związku tytułowego w postaci bezbarwnego oleju. NMR (CDCl3): δ 0,06 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,76 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 4,26 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 5,07 (m, 2H), 5,91 (brs, 1H).

PL 201 877 B1

P r z y k ł a d 8

[3S-(1E,3e,5a)]-2-[3,5-bis-[[(1,1-Dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etanol

Do roztworu 4,25 g (0,00996 mola) estru metylowego kwasu E-(3S,5R)-[3,5-bis-(t-butylodimetylosilanyloksy)-2-metylenocykloheksylideno]octowego w 100 ml toluenu w -78°C wkroplono ml 1,2M wodorku diizobutyloglinu (0,03 mole) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Po dodaniu 5 ml metanolu mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono 150 ml 2M wodnego roztworu winianu potasowo-sodowego i intensywnie wymieszano. Fazę organiczną oddzielono, wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii rzutowej, z elucją mieszaniną heksan-octan etylu 8:2i i otrzymano 2,8 g (70%) związku tytułowego w postaci bezbarwnej, woskowatej substancji stałej. NMR (CDCl3): δ 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,88 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 1,74 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,26 (dm, J = 13,6 Hz, 1H), 2,40 (dd, J = 13,6, 5,2, 1H), 4,30 - 4,11 (m, 3H), 4,53 (m, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,80 (tm, J = 7 Hz, 1H).

P r z y k ł a d 9

1,25-Dihydroksy-16-eno-5,6-transcholekalcyferol

Do roztworu 796 mg (0,00137 mola) tlenku [3S-(1 E,3e,5a)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetyloetylo)dimetylosilil]oksy]-2-metylenocykloheksylideno]etylo]difenylofosfiny w 10 ml bezwodnego tetrahydrofuranu w -78°C, w atmosferze argonu, w trakcie mieszania wkroplono 0,83 ml (0,00133 mola) 1,6M n-butylolitu w heksanie. Do otrzymanego roztworu o barwie czerwonej wkroplono w ciągu 10 minut roztwór 280 mg (0,000803 mola) [3aR-[1(R*),3aa,7ae]-1-[1,5-dimetylo-5-[(trimetylosilil)oksy]heksylo]-3,3a,5,6,7,7a-heksahydro-7a-metylo-4H-in-den-4-onu w 5 ml tetrahydrofuranu, w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w -78°C przez 90 minut, po czym reakcję przerwano dodawszy 40 ml mieszaniny 1:1 2N roztworu soli Rochelle'a i 2N KHCO3, po czym mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej. Mieszaninę wyekstrahowano 3 x 100 ml octanu etylu. Warstwy organiczne przemyto 3 x wodą/solanką, wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii rzutowej w kolumnie (40 mm x 6 cali) z żelem krzemionkowym, z elucją mieszaniną heksan-octan etylu 40:1 i otrzymano 278 mg trisililowanego związku tytułowego oraz 140 mg ketonu wyjściowego.

Roztwór 278 mg (0,000389 mola) tego trisilowanego związku pośredniego w 8 ml bezwodnego tetrahydrofuranu poddawano działaniu 1,9 (1,9 mmola) 1M fluorku tetrabutyloamoniowego w tetrahydrofuranie w atmosferze argonu w ciągu 17 godzin. Reakcję przerwano z użyciem 6 ml wody i całość mieszano przez 30 minut. Po odparowaniu tetrahydrofuranu pod próżnią pozostałość w postaci roztworu wyekstrahowano 3 x 100 ml octanu etylu. Warstwy organiczne przemyto 4 x wodą/solanką, wysuszono nad siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt (192 mg) oczyszczono metodą rzutowej chromatografii w kolumnie z żelem krzemionkowym, którą wstępnie przemyto 1% roztworem trietyloaminy w octanie etylu (300 ml); z elucją octanem etylu. Otrzymano 152 mg krystalicznego związku tytułowego. Próbka poddana rekrystalizacji z mieszaniny tetrahydrofuran:mrówczan metylu (0,3:7) wykazywała temperaturę topnienia 95 - 100°C. [a]_D ²⁵ + 160,5° (EtOH, c = 0,20). λ^ 272/3 nm (ε 20600).

P r z y k ł a d 10

Miękka kapsułka żelatynowa

Preparat I

Nr	Składniki	mg/kapsułkę
1	1,25(OH)₂-16-eno-5,6-trans-D₃	0,001-0,02
2	Butylowany hydroksytoluen (BHT)	0,016
3	Butylowany hydroksyanizol (BHA)	0,016
4	Miglyol 812, tyle ile potrzeba do	160,0

PL 201 877 B1

Sposób wytwarzania

1. Sporządzono zawiesinę BHT i BHA w Miglyolu 812. Ogrzano ją do około 50°C i mieszano aż do rozpuszczenia.

2. Rozpuszczono 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 w roztworze z etapu 1 w 50°C.

3. Ochłodzono roztwór z etapu 2 do temperatury pokojowej.

4. Napełniono miękkie kapsułki żelatynowe roztworem z etapu 3.

Uwaga: Wszystkie etapy wytwarzania prowadzono w atmosferze azotu i chroniono składniki przed światłem.

P r z y k ł a d 11

Miękka kapsułka żelatynowa

Preparat II

Nr	Składniki	mg/kapsułkę
1	1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3	0,001-0,02
2	di-a-Tokoferol	0,016
3	Miglyol 812, tyle ile potrzeba do	160,0

1. Sporządzono zawiesinę di-a-tokoferolu w Miglyolu 812. Ogrzano ją do około 50°C i mieszano aż do rozpuszczenia.

2. Rozpuszczono 1,25(OH)2-16-eno-5,6-trans-D3 w roztworze z etapu 1 w 50°C.

3. Ochłodzono roztwór z etapu 2 do temperatury pokojowej.

4. Napełniono miękkie kapsułki żelatynowe roztworem z etapu 3.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Analogi witaminy D3 o ogólnym wzorze I w którym

R1 oznacza atom wodoru lub (C1-C4)alkil;

R2 oznacza atom wodoru lub (C1-C4)alkil;

A wraz z sąsiednimi atomami węgla oznacza -CH2-CH2-;

R3 oznacza (C1-C4)alkil; a

R4 oznacza (C1-C4)alkil.

2. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza atom wodoru, a R2 oznacza (C1-C4)alkil, albo R1 oznacza (C1-C4)alkil, a R2 oznacza atom wodoru.

3. Związek według zastrz. 2, w którym R1 oznacza atom wodoru, a R2 oznacza metyl, albo R1 oznacza metyl, a R2 oznacza atom wodoru.

4. Związek według zastrz. 3, którym jest 1,25-dihydroksy-16-eno-5,6-transcholekalcyferol.