DE60009303T2

DE60009303T2 - Vitamin d3 analoga

Info

Publication number: DE60009303T2
Application number: DE60009303T
Authority: DE
Inventors: David Andrew BATCHO; Michael Bernard HENNESSY; Radoje Milan USKOKOVIC
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-06
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: HK1047578A1; EG23909A; UY26239A1; PL356124A1; RU2235721C2; GC0000198A; DK1200399T3; RS50229B; PT1200399E; BR0012419A; HUP0202157A3; MA26808A1; HK1047578B; CA2378803A1; NO20020161L; MXPA02000313A; AR024695A1; DE60009303D1; ZA200110487B; PL201877B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbindung mit der Formel
worin R₁ Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe ist;
R₂ Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe ist; oder
R₁, R₂ und C₂₀ zusammen Cyclopropyl sind;
ist:
R₃ C₁-C₄ Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄-Alkyl oder Fluor-C₁-C₄-Alkyl ist; und
R₄ C₁-C₄ Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄-Alkyl oder Fluor-C₁-C₄-Alkyl ist.
Es wurde gefunden, dass die Verbindungen mit der Formel 1 die Inhibition der Proliferation bei Prostata-, Brust- und myeloischen Leukämie-Krebszelllinien induzieren. Entsprechend sind die Verbindungen mit der Formel 1 nützlich als Mittel zur Behandlung von Prostatakrebs, Brustkrebs und zur Behandlung von Leukämie.
Es wurde auch gefunden, dass die Verbindungen mit der Formel 1 eine antiandrogene Wirkung besitzen. Entsprechend sind die Verbindungen mit der Formel 1 nützlich bei der Behandlung von benignem Prostatawachstum, Kahlheit und Prostatakrebs.
Es wurde auch gefunden, dass die Verbindungen mit der Formel 1 eine Wirkung besitzen, welche sie zur Behandlung von Talgdrüsenerkrankungen wie etwa Akne oder seborrhoischer Dermatitis nützlich machen.
Es wurde auch gefunden, dass die Verbindungen mit der Formel 1 eine Wirkung besitzen, welche die Verbindungen zur Behandlung von Osteoporose nützlich machen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
dWie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Alkylgruppe" eine gerade oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, t-Butyl und dergleichen. Der Begriff "Hydroxyalkyl" bedeutet eine Alkylgruppe mit einem Hydroxysubstituenten an einem beliebigen der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe. Der Begriff "Fluoralkyl" bedeutet eine Alkylgruppe mit einem, zwei oder drei Fluoratomen, substituiert an einem beliebigen der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe.
In den hierin gezeigten Formeln sind die verschiedenen Substituenten, verbunden mit dem Kern, veranschaulicht durch eine der folgenden Definitionsweisen: eine keilförmige durchgezogene Linie (
), welche einen Substituenten anzeigt, der sich oberhalb der Fläche des Moleküls befindet; und eine keilförmige gepunktete Linie (
), welche einen Substituenten anzeigt, der sich unterhalb der Ebene des Moleküls befindet.
Bevorzugt ist R, Wasserstoff und R₂ ist Alkyl, oder R₁ ist Alkyl und R₂ ist Wasserstoff. Mehr bevorzugt ist R₁ Wasserstoff und R₂ ist Methyl, oder R₁ ist Methyl und R₂ ist Wasserstoff.
Bevorzugt sind R₃ und R₄ jeweils unabhängig Alkyl, Hydroxyalkyl oder Trifluoralkyl. Mehr bevorzugt sind R₃ und R₄ jeweils unabhängig Methyl, Hydroxymethyl oder Trifluormethyl.
Bevorzugt ist
Die am meisten bevorzugte Verbindung mit der Formel 1 ist 1,25-Dihydroxy-16-en-5,6-trans-cholecalciferol.
Die Verbindungen mit der Formel 1 werden hergestellt wie hierin nachfolgend beschrieben, mit besonderem Verweis auf das Formelschema unten.
Formelschema

R₅ ist Wasserstoff oder Trimethylsilyl.

Im obigen Formelschema, worin Ph Phenyl ist, wird die Verbindung mit der Formel II, welche die Verbindung [3S-(1E,3β,5α)-2-(3,5-bis(Dimethyl) dimethylsilyl]oxy]-2-methylen-cyclohexyliden]ethyl]diphenylphosphinoxid ist, durch Reaktion mit einer Verbindung mit der Formel III in eine Verbindung mit der Formel IA umgewandelt.
Die Reaktion wird bei -60°C bis -90°C in einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel wie etwa trockenem Ether oder mehr bevorzugt trockenem Tetrahydrofuran in Gegenwart einer starken Base wie etwa Alkyllithium, beispielsweise Butyllithium, durchgeführt.
Die Schutzgruppen der Verbindungen mit der Formel IA werden entfernt durch Reaktion mit einem Fluoridsalz wie etwa Tetrabutylammoniumfluorid, in einem polaren, organischen Lösungsmittel wie etwa Ether oder mehr bevorzugt Tetrahydrofuran, um die entsprechende Verbindung mit der Formel 1 zu erhalten.
Die Verbindung mit der Formel II wird hergestellt, wie es hierin nachfolgend in den Beispielen 1-6, beschrieben wird, oder alternativ, wie es in den Beispielen 7-8 beschrieben wird.
Verbindungen mit der Formel III sind bekannt (beispielsweise im US-Patent Nr. 5,087,61-9) oder sie können hergestellt werden durch die bekannten Verfahren.
Die nützliche Wirkung der Verbindungen mit der Formel 1 als Mittel zur Behandlung von Prostatakrebs, Brustkrebs, und zur Behandlung von Leukämie kann durch die folgenden Testverfahren gezeigt werden, welche im Stand der Technik bekannt sind.
Die zur Verwendung hierin ausgewählten Materialien und verwendeten Verfahren waren wie folgt:
Zelllinien. Die Brustkrebszelllinie (MCF-7), Prostatakrebszelllinie (LNCaP) und myeloide Leukämiezelllinie (HL-60) wurden wie folgt gehalten: MCF-7-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eaglemedium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) gehalten; LNCaP und HL-60 wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS kultiviert; alle drei Zelllinien wurden in einem Inkubator mit 5% CO₂ bei 37°C gehalten.
Vitamin D₃-Verbindungen. Die Vitamin D₃-Verbindungen wurden in absolutem Ethanol mit 10^-3 M als Stammlösung gelöst, die bei -20°C gelagert wurden und vor Licht geschützt wurden. Für die Verwendung in vitro wurden die Verbindungen in DMEM- oder RPMI-Medium verdünnt. Für die Verwendung in vivo wurden die Verbindungen mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) verdünnt. Ein Aliquot wurde nur einmal verwendet und die LNCaP-Zellen wurden trypsiniert. Gewaschene Einzelzellsuspensionen der Zellen wurden ausgezählt und mit insgesamt 1×10^-3 Zellen pro Well in einem Volumen von 400 μl pro Well in 24-Well Flachbodenplatten ausplattiert. Die Nährschicht wurde mit Agar hergestellt, welcher bei 42°C äquilibriert wurde. Vor diesem Schritt wurden die Verbindungen in Wells pipettiert. Nach der Inkubation wurden die Kolonien gezählt. Alle Experimente wurden mindestens 3-mal durchgeführt unter Verwendung von dreifachen Platten pro Experiment.
Serumcalciumspiegel in vivo. 28 männliche Balb/c-Mäuse im Alter von 8 bis 9 Wochen wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten und mit einer Standardlabordiät gefüttert. 4 Mäusen pro Gruppe wurde jeden zweiten Tag (außer Samstag und Sonntag) für 3 Wochen intraperitoneal entweder mit eine Vitamin D₃-Verbindung oder Verdünnungsmittel (100 μl/Maus) injiziert. Die Dosen von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ betrugen: 0,1, 0,5, 1,0 und 2,0 μg. Die Dosen von 1,25(OH)₂D₃ betrugen 0,1 μg/Maus. Den Kontrollmäusen wurde 100 μl PBS injiziert. Die Serumcalciumwerte wurden jede Woche durch den quantitativen kolorimetrischen Nachweisassay gemessen.
Impuls-Expositions-Experimente. Die MCF-7-Zellen wurden in einer flüssigen Kultur mit 10^-7 1,25(OH)₂D₃ oder 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ für verschiedene Zeiten inkubiert. Nach der Inkubation wurden diese Zellen vorsichtig zweimal mit PBS gewaschen und die lebensfähigen Zellen wurden gezählt und für einen Weichagarkolonieassay in 24-Well Platten ausplattiert, wie zuvor beschrieben.
Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie. Es wurde eine Zellzyklusanalyse durchgeführt mit MCF-7-Zellen, welche für 4 Tage entweder mit 10⁷ M 1,25(OH)₂D₃ oder 1,25(OH)₂-16-en-5,6-traps-D₃ inkubiert wurden. Die Zellen wurden in gekühltem Methanol über Nacht fixiert, vor einer Färbung mit 50 μg/ml Propidiumiodid, 1 mg/ml RNase (100 Unit/ml) und 0,1 % NP40. Die Analyse wurde unmittelbar nach der Färbung durchgeführt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig durchgeführt. Alle Daten wurden durch den Student-Test statistisch analysiert.
Western Blot-Analyse. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,1 % SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1 % NP40, 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Pepstatin und 10 μg/ml Leupeptin) suspendiert und für 30 min auf Eis platziert. Nach einer Zentrifugation bei 15000 g für 20 min bei 4°C wurde der Überstand gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden quantifiziert. Die gesamten Lysate (15 μg) wurden aufgelöst durch ein 15% Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel, wurden auf eine Immobilon-Polyvinylidendifuridmembran übertragen und wurden mit einem polyklonalen Anti-p27^kip1-Kaninchen-Antikörper und einem monoklonalen Anti-Actin-Maus-Antikörper sondiert. Die Blots wurden entwickelt.
Telomeraseaktivität. Um die relative Telomeraseaktivität zu bestimmen, wurden TRAP-Assays ("telomeric repeat amplification protocol assay") durchgeführt. Für die humane Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) wurden Gesamt-RNAs aus HL-Zellen isoliert, welche entweder mit 1,25(OH)₂D₃ oder 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ (10^-9, 10^-8 und 10^-7 M) für 4 Tage mit einer monophasischen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat behandelt wurden. Mit 1 μg der Gesamt-RNA und zufälligen Hexamerprimern wurde eine RT-PCR durchgeführt. Die cDNA wurde unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche spezifisch für das hTERT-Gen oder das GADPH-Gen waren, das als Kontrolle verwendet wurde. Die für hTERT verwendeten Primer waren: 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3' (sense) (SEQ ID NO: 1) und 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antisense) (SEQ ID NO: 2). Die thermischen Zyklen waren 94°C für 90 sek, gefolgt von 33 Zyklen von 95°C für 20 sek, 68 °C für 40 sek und 72°C für 30 sek. Die Primer für das GADPH-Gen waren: 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3' (sense) (SEQ ID NO: 3) und 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3' (antisense) (SEQ ID NO: 4). Die Bedingungen für die GADPH-Amplifikationen waren: 94°C für 2 min, 26 Zyklen mit 94°C für 30 sek, 62°C für 40 sek, 72°C für 40 sek, gefolgt von 72°C für 4 min. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt.
Wirkung von Vitamin D₃-Analoga auf einen klonogenen Assay. LNCaP-Zellen, MCF-7-Zellen und HL-60-Zellen wurden in Weichagar in Gegenwart von Vitamin D₃-Analoga bei 10^-11 bis 10^-7 M kloniert. Es wurden die Dosis-Wirkungskurven aufgezeichnet und es wurde die wirksame Dosis, welche 50% der Koloniebildung hemmte (ED₅₀) bestimmt. 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ war wirksam bei der Hemmung der klonalen Proliferation der drei Zelllinien in einer dosisabhängigen Art und Weise. Die ED₅₀ von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ betrug 1,4 × 10^-9 M für LNCaP-Zellen, 4,3 × 10^-9 M für MCF-7-Zellen und 3,0 × 10^-11 M für HL-60-Zellen, was etwa 10-100-mal wirksamer war als 1,25(OH)₂D₃.
Serumcalciumspiegel in vivo. Da Hyperkalzämie eine bedeutende Toxizität von Vitamin D₃-Verbindungen darstellt, wurden die kalzämischen Wirkungen von 1,25(OH)₂D₃ mit denen von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ verglichen. Alle Mäuse überlebten nach einer dreiwöchigen Studie. Die Mäuse, welche 0,1 μg 1,25(OH)₂D₃ erhielten, waren alle hyperkalzämisch mit Serumcalciumspiegeln von ungefähr 12 mg/dl (normal 8,5-10,5 mg/dl). Im Gegensatz dazu besaßen Mäuse, welche 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ (0,1- 2,0 μg/Maus) erhielten, fast die gleichen Calciumspiegel (8-10 mg/dl) wie die Kontrollmäuse (8-9 mg/dl).
Impuls-Expositions-Experimente. Um zu untersuchen, ob die Inhibition der klonogenen Proliferation durch Vitamin D₃-Analoga reversibel war, wurden Impuls-Expositions-Experimente durchgeführt. Die MCF-7-Zellen wurden entweder gegenüber 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ oder 1,25(OH)₂D₃ für verschiedene Zeiten exponiert, gründlich gewaschen, in Weichagar ausplattiert und an Tag 16 der Kultur wurden die Koloniezahlen gezählt. Ungefähr 40 und 30% der klonogenen Zellen wurden durch 4 Tage Exposition gegenüber 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ bzw. 1,25(OH)₂D₃ gehemmt.
Zellzyklusanalyse. Es wurde die Wirkung von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ und von 1,25(OH)₂D₃ (10^-7, 4 Tage) auf den Zellzyklus der MCF-7-Zellen bestimmt. Es trat ein signifikanter Anstieg (P ≤ 0,05) in der Anzahl der Zellen in der G₀-G₁-Phase des Zellzyklus auf, mit einer gleichzeitigen Abnahme des Anteils der Zellen in der S-Phase.
Western Blotting-Analyse. Die Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitoren, welche als p21^waf1 und p27^kip1 bekannt sind, können die Aktivität der Zyklinkinase hemmen und somit die Weiterentwicklung der Zellen durch den Zellzyklus verlangsamen. Die MCF-7-Kontrollzellen besaßen konstitutiv ein mittleres Expressionsniveau von p21^waf1 und p27^kip1, wie durch Western Blotting-Analyse bestimmt wurde. Die Exposition für 1 Tag gegenüber 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ (10^-7 M) steigerte die Expression von p21^waf1 und p27^kip1 um etwa das 3,2-3,5fache, wohingegen eine Kultur mit 1,25(OH)₂D₃ (10^-7 M) die Expression von p21^waf1 und p27^kip1 um etwa das 1,6-1,8fache steigerte. Die Exposition von MCF-7-Zellen gegenüber 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ (10^-7) für 3 Tage ergab einen 2,8fachen und 3,4fachen Anstieg der Expression von p21^waf1 bzw. p27^kip1. 1,25(OH)_ZD₃ (10^-7 M, 3 Tage) steigerte die Expression von p21^waf1 und p27^kip1 um das 4,8fache bzw. 3,3fache.
Die dosisabhängige Wirkung der Vitamin D₃-Verbindungen auf die Expression von p27^kip1 bei HL-60-Zellen wurde bestimmt. Sowohl 1,25(OH)₂D₃ als auch 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ regulierten die Expression der p27^kip1-Expression nach oben, und diese Spiegel stiegen nach einer Inkubation mit 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ (4 Tage, 10^-9 M) deutlich an. Die Spiegel von p27^kip1 stiegen deutlich sichtbar an, wenn die HL-60-Zellen mit 10^-8-10^-7 M 1,25(OH)₂D₃ kultiviert wurden.
Telomeraseaktivität. Die Wirkung von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ und 1,25(OH)_ZD₃ (10^-9-10^-7 M, 4 Tage) auf die Telomeraseaktivität wurde bewertet unter Verwendung des TRAP-Assays. Die Telomeraseaktivität nahm in HL-60-Zellen, welche entweder mit 1,25(OH)₂16-en-5,6-trans-D₃, 10^-9 M oder 10^-7 M 1,25(OH)₂D₃ kultiviert wurden, deutlich ab.
Die Wirkungen der Vitamin D₃-Analoga auf die hTERT-Expression in HL-60-Zellen wurden unter Verwendung einer RT-PCR bewertet. Sowohl 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ als auch 1,25(OH)₂D₃ hemmten die Expression von hTERT-mRNA auf dosisabhängige Art und Weise, wobei bei 10^-8 M 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ und bei 10^-7 M 1,25(OH)₂D₃ eine fast vollständige Hemmung der Expression auftrat.
Die nützliche Wirkung der Verbindungen mit der Formel 1 als Mittel zur Behandlung von benignem Prostatawachstum kann durch die folgenden, im Stand der Technik bekannten Testverfahren gezeigt werden.
1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ wurde bewertet im Hinblick auf die antiandrogene Wirkung in kastrierten, mit Testosteron stimulierten männlichen Syrischen Hamstern. Die Untersuchungen zeigten, dass 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ die Androgen-induzierte Hypertrophie der Samenblasen und der ventralen Prostatadrüse in diesen Tieren erheblich unterdrückte, wohingegen 1,25(OH)₂D₃ bei nichttoxischen Dosen (1 μg) nicht aktiv war.
Kastrierten männlichen Syrischen Hamstern wurde für 14 aufeinanderfolgende Tage täglich 20 μg Testosteronpropionat und 1 μg 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ subkutan injiziert. Beide Verbindungen wurden jeweils in einem Träger von 0,2 ml Sesamöl verabreicht. Die Autopsie wurde an Tag 15 durchgeführt. Die Prostatadrüse und die Samendrüsen wurden entfernt, abgetupft und gewogen. Die Daten wurden unter Verwendung des t-Tests nach Student im Hinblick auf die statistische Signifikanz untersucht, und werden als prozentuale Hemmung der stimulierten Antwort ausgedrückt.
Tabelle 1 Hemmung des Wachstums der Prostatadrüse und Samenblase in kastrierten, mit Testosteron stimulierten Hamstern
Die nützliche Wirkung der Verbindungen mit der Formel 1 als Mittel für die Behandlung von Osteoporose kann durch die folgenden, im Stand der Technik bekannten Testverfahren gezeigt werden.
Material und Methoden
Tiere und Behandlung
Es wurden 3 Monate alte erwachsene weibliche Ratten verwendet. Nach 1 Woche der Akklimatisierung wurden die Tiere nach Gewicht gruppiert und durch orale Zwangsernährung mit 1 ml/kg/Tag von verschiedenen Konzentrationen von 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ behandelt. Am Tag 7 der Dosierung wurde den Tieren Blut entnommen und die Serumcalciumspiegel wurden bestimmt.
Präparation der Verbindung
Die Verbindung wurde in 200 Proof Ethanol gelöst, um eine Konzentration von 100 μg/ml zu erzeugen. Sesamölträger und Ethanolverbindungslösung wurden hergestellt für die höchste Konzentration der Dosierung, dann bei 37 ° rotationsverdampft, um Ethanol zu entfernen. Das Dosisvolumen wurde berechnet unter Verwendung des mittleren Körpergewichts der Dosierungsgruppe. Es wurden Verdünnungsreihen der mit Träger verdünnten Verbindung auf die geeigneten Dosierungskonzentrationen durchgeführt.
Sammeln des Serums und Bestimmung
Es wurde Blut (1,5 ml) von jedem Tier entnommen durch Orbitalpunktion unter Etheranästhesie an Tag 7 der Dosierung. Das Blut wurde in Serumseparatorröhrchen gesammelt, bei 2000 rpm für 15 min zentrifugiert und dann wurde das Serum für die Calciumbestimmungen allquotiert. Serumcalcium wurde mittels kolorimetrischem Assay bestimmt.
Ergebnisse Serumcalciumspiegel
Die Serumcalciumspiegel lagen bei den Dosierungsgruppen mit bis zu 2 μg/kg/Tag Behandlung mit 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ innerhalb des Normalbereichs.
Material und Methoden
Tiere und Behandlung
Drei Monate alte erwachsene weibliche Ratten wurden einer bilateralen Ovariektomie oder einer Scheinoperation unterzogen. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Tiere nach Gewicht eingruppiert und durch orale Zwangsernährung mit 1 mg/kg der angegebenen Konzentration behandelt. Das Dosisvolumen wurde wöchentlich berechnet unter Verwendung des durchschnittlichen Körpergewichts der Gruppe. Die Dosierung begann 17 Tage nach der Operation und wurde für 19 Tage fortgeführt. Am 20. Tag wurden die Tiere durch Kohlenidoxidinhalation getötet und es wurden die linken Femure entfernt.
Gesamtcalcium des Femurknochens
Bei der Autopsie wurden die linken Femuren von allen Gruppen herausgenommen und die Weichteile entfernt. Die Knochen wurden gemessen und in der Mitte der Diaphyse in Hälften geschnitten; dann wurde der distale Teil longitudinal nach der Entfernung der Epiphyse in Hälften geschnitten. Das Knochenmark wurde ausgespült und das Calcium wurde durch Eintauchen in 5% TCA extrahiert. Der Calciumgehalt der TCA-Extrakte wurde bestimmt unter Verwendung einer quantitativen kolorimetrischen Bestimmung des Calciums. Die Daten wurden als mittleres Gesamtknochencalcium in mg/distale Femurhälfte (DHF) ± Serum angegeben.
Sammlung des Serums und Bestimmung
Blut (1,5 ml) wurde von jedem Tier durch orbitale Punktion unter Etheranästhesie an Tag 7 und an Tag 18 der Dosierung entnommen. Das Blut wurde im Serumseparatorröhrchen gesammelt, bei 2000 rpm für 15 min zentrifugiert und dann wurde das Serum für Calciumbestimmungen allquotiert. Das Serumcalcium wurde bestimmt durch einen kolorimetrischen Assay.
Statistik
Für eine Bestätigung der Wirkung der Ovariektomie auf das Knochencalcium wurde die Gruppen mit Scheinoperation und OVX-Träger unter Verwendung des t-Tests nach Student verglichen. Die OVX-Gruppen wurden durch Einfachanalyse der Varianz (ANOVA) verglichen, gefolgt von Fisher's LSD zum Vergleich jeder Behandlungsgruppe mit dem Träger, wenn die Gesamtwirkung statistisch signifikant war.
Ergebnisse Wirkung auf das Femurcalcium, abgeglichen mit dem Körpergewicht
Wirkung auf die Serumcalciumspiegel
Wir identifizierten erstmals die nützliche Wirkung der Verbindungen mit der Formel 1 als Mittel zur Behandlung von Talgdrüsenerkrankungen, wie durch die folgenden, im Fachgebiet bekannten Testverfahren gezeigt wird.
200 μl 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ wurden in Propylenglykol gelöst, täglich (5 Tage pro Woche) durch Zwangsernährung an Syrische Goldhamster verabreicht. Die Tiere wurden nach 4 Wochen getötet und die Ohren wurden für eine histologische Untersuchung bearbeitet. Der Bereich der Talgdrüsen wurde an histologisch präparierten Querschnitten des Ohrs mittels Bildanalyse gemessen.
Ergebnisse
Es wurde auch die Gesamtlipidfraktion von einem der Ohren untersucht (Extraktion mittels organischem Lösungsmittel, gefolgt vom Wiegen des verbleibenden Lipidmaterials).
Ergebnisse
Die Verbindungen mit der Formel 1 können oral verabreicht werden zur Behandlung von Brustkrebs, Prostatakrebs oder Leukämie, an Menschen, welche eine solche Behandlung benötigen. Insbesondere können die Verbindungen mit der Formel 1 für eine solche Behandlung oral an einen Erwachsenen verabreicht werden in Dosierungen, welche im Bereich von etwa 1 bis 20 μg pro Tag liegen.
Die Verbindungen mit der Formel 1 können oral verabreicht werden zur Behandlung von benignem Prostatawachstum und Kahlheit, an Menschen, welche eine solche Behandlung benötigen. Insbesondere können die Verbindungen mit Formel 1 für eine solche Behandlung oral verabreicht werden an einen Erwachsenen in Dosierungen, welche im Bereich von etwa 1 bis 20 μg pro Tag liegen.
Die Verbindungen mit der Formel 1 können zur Behandlung von Osteoporose oral verabreicht werden an Menschen, mit einer Dosierung von etwa 1 bis 20 μg pro Tag.
Die Verbindungen mit der Formel 1 können topisch verabreicht werden für die Behandlung von Kahlheit an Menschen, welche eine solche Behandlung benötigen. Insbesondere können die Verbindungen mit der Formel 1 für eine solche Behandlung topisch verabreicht werden in Dosen, welche im Bereich von etwa 5 bis etwa 50 μg pro Gramm topischer Formulierung pro Tag liegen.
Die Verbindungen mit der Formel 1 können oral verabreicht werden zur Behandlung von Talgdrüsenerkrankungen bei Menschen mit einer Dosierung von etwa 1 bis 20 μg pro Tag.
Orale Dosierungsformen, welche erfindungsgemäße Verbindungen mit der Formel 1 umfassen, können in Kapseln, Tabletten und dergleichen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterialien eingebracht werden.
Beispiele für die pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterialien, welche in Kapseln und dergleichen eingebracht werden können, sind folgende: ein Bindemittel wie etwa Tragantgummi, Akzaiengummi, Maisstärke oder Gelatine; ein Arzneimittelträger wie etwa Dicalciumphosphat; ein Aufschlussmittel wie etwa Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen; ein Gleitmittel wie etwa Magnesiumstearat, ein Süßungsmittel wie etwa Saccharose, Lactose oder Saccharin; ein Geschmacksstoff wie etwa Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirsche. Es können verschiedene andere Materialien vorliegen als Beschichtung oder, um die physikalische Form der Dosierungseinheit anderweitig zu modifizieren. Tabletten können beispielsweise mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet werden. Ein Sirup oder Elixier kann den Wirkstoff, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und einen Geschmacksstoff wie etwa Kirsch- oder Orangengeschmack enthalten.
Topische Dosierungsformen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen mit der Formel 1 enthalten, umfassen: Salben und Cremes, welche die Formulierungen beinhalten, mit ölartigen, absorbierbaren, wasserlöslichen und emulsionsartigen Basen wie etwa Petrolatum, Lanolin, Polyethylenglykolen und dergleichen.
Lotionen sind flüssige Präparationen und variieren von einfachen Lotionen bis zu wässrigen oder hydroalkoholischen Präparationen, welche feinverteilte Substanzen enthalten. Lotionen können Suspendierungsmittel oder Dispergierungsmittel enthalten, beispielsweise Cellulosederivate wie etwa Ethylcellulose, Methylcellulose und dergleichen; Gelatine oder Gummi, welche den Wirkstoff in einem Träger enthalten, welcher aus Wasser, Alkohol, Glycerin und dergleichen besteht.
Gele sind halbfeste Präparationen, welche durch Gelieren einer Lösung oder Suspension des Wirkstoffs in einem Trägervehikel hergestellt werden. Die Vehikel, welche wasserhaltig oder wasserfrei sein können, werden unter Verwendung eines Gelierungsmittels wie etwa Carboxypolymethylen geliert, und auf eine passende Gelkonsistenz mit der Verwendung von Alkali wie etwa Natriumhydroxid und Aminen wie etwa Polyethylencocoamin neutralisiert.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "topisch" die Verwendung des Wirkstoffs, welcher in einen geeigneten pharmazeutischen Träger eingebracht ist, und an die Stelle der Entzündung für die Ausübung einer lokalen Wirkung aufgebracht wird. Entsprechend umfassen die topischen Zusammensetzungen die pharmazeutischen Formen, in welchen die Verbindung äußerlich durch direkten Kontakt mit der Haut aufgetragen wird. Die topischen Dosierungsformen umfassen Gele, Cremes, Lotionen, Salben, Pulver, Aerosole und andere konventionelle Formen zum Auftragen des Medikaments auf die Haut, welche durch Mischen der Verbindungen mit der Formel 1 mit bekannten pharmazeutischen topischen Trägermaterialien erhalten werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung weiter zu beschreiben und sollen die Erfindung in keiner Hinsicht beschränken.
Beispiel 1
(2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-Bis[1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-4-methylen-1-oxaspiro[2,5]octan-2-methanolacetat
Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 18,5 g (0,0523 Mol) (2R,3S, 5S,7S)-5-Hydroxy-4-methylen-7[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyloxy)-1-oxaspiro[2,5]octan-2-methanolacetat (Y. Kiegiel, P.M. Wovkulich und M.R. Uskokovic, Tetrahedron Letters, 32, S.6057-6060 (1991)) und 6,8 g (0,099 Mol) Imidazol in 50 ml Dimethylformamid unter einer Argonatmosphäre wurden 9,8 g (0,065 Mol) t-Butyldimethylsilylchlorid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 5 h gerührt, mit 5 ml Wasser abgeschreckt, für 30 min gerührt und 400 ml Wasser geschüttet. Es wurde dann mit 2 × 500 ml Hexan und 2 × 500 ml Ether extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit 300 ml Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und verdampft. Die Chromatographie auf einer Silicagelsäule ergab 22,31 g (92%) der Titelverbindung als farbloses Öl.
Beispiel 2
[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis[[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyt]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanolacetat
Ein 3 l 3-Halskolben, welcher mit einem Argoneinlass, einem mechanischem Rührer und einem Thermometer ausgestattet war, wurde mit 500 ml Tetrahydrofuran beladen und in einem trockenen Eisacetonbad auf -60°C gekühlt. Es würde die portionsweise Zugabe von 43,23 g (0,108 Mol) wasserfreiem Wolframhexachlorid durchgeführt, während die Temperatur bei -60°C gehalten wurde, und dann wurde eine schnelle tropfenweise Zugabe von 200 ml 1,6 M n-Butyllithium in Hexan durchgeführt, wobei die Temperatur unter -45° C gehalten wurde (ca. 5 min). Das trockene Eis-Acetonbad wurde durch ein Eiswasserbad ersetzt, wobei die Temperatur 5°C erreichen konnte. Es traten Farbänderungen von blau nach khaki nach rötlichblau auf. Nach 30 min bei 5°C wurde eine Lösung von 22,31 g (0,04884 Mol) (2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-Bis[1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-4-methylen-1-oxaspiro[2,5]octan-2-methanolacetat in 50 ml Hexan tropfenweise schnell über 3 min zugegeben. Nach 4 h wurde das Reaktionsgemisch mit 2 1 Hexan verdünnt, durch einen Silicagelkuchen, welcher mit 3 × 500 ml Hexan-Ethylacetat 9:1 gewaschen war, filtriert und verdampft. Der Rückstand wurde auf einer 75 g Silicagelsäule chromatographiert und ergab 22,56 g des rohen Produkts. Eine Chromatographie durch eine Mitteldruck-Silicagelsäule und Elution mit einem 100:1 Cichiormethan-Ethylacetat-Gemisch ergab 17,42 g (80,1 %) der Titelverbindung und eine kleine Menge des entsprechenden 1Z-Epimers.
Beispiel 3
[3S-(1E,3β,5α)]-2-I3,5-Bis-[[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanolacetat (E-Dien) und [3S-(1Z,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanolacetat (Z-Dien)
Zu 465 ml wasserfreiem THF bei -78°C wurden unter Rühren 64,3 g (160 mmol) WCIs (blaue Lösung) zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 337,5 ml 1,43 M n-BuLi in Hexan (mit einer Geschwindigkeit, so dass die innere Temperatur nicht über -20°C anstieg). Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt. Eine Lösung von 24,5 g (53,6 mmol) (2S,3R,5S,7S)-2-[5,7-Bis[1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-4-methylen-1-oxaspiro[2,5]octan-2-methanolacetat in 65 ml THF wurde tropfenweise zugegeben, und das Gemisch wurde für 4 h gerührt. Das Gemisch wurde mit 600 ml Pentan verdünnt und durch ein 4 cm-Bett von Silicagel filtriert, welches mit Hexan/EtOAc (19:1) gewaschen war, und ergab nach dem Verdampfen der flüchtigen Stoffe unter verringertem Druck 27 g des rohen Diengemischs. Eine weitere Reinigung durch Chromatographie, Elution mit Hexan/EtOAc (25:1) ergab 21,6 g (91 %) eines 2:3 Z/E-Diengemischs (Titelverbindungen), welche durch eine Silicagelchromatographie (Hexan/EtOAc 40:1) trennbar waren.
Z-Dien ¹H NMR δ 0,052 (s, 6H), 0,06 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,74-1,90 (m, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,20 (dd, J = 6,0, 12,8 Hz, 1H), 2,41 (d, J = 11,1 Hz, 1H) 4,19 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,61 (dd, J = 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,68 (dd, J = 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 5,20 (s, 1H), 5,47 (t, J = 7,2 Hz, 1H). [α] 25 / D = +1,2° (c = 0,4, EtOH). Anal. berechnet für C₂₃H₄₄O₄Si₂:C, 62,27; H, 10,01; gefunden: C, 62,55, H, 10,33.
E-Dien ¹H NMR δ 0,046 (s, 3H), 0,057 (s, 3H), 0,065 (s, 6H), 0,88 (s, 9h), 0,89 (s, 9H), 1,77 (ddd, J = 3,1, 9,4, 11,9 Hz, 1H), 1,89 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 2,31 (dd, J = 2,0, 15,2 Hz, 1H), 2,39 (dd, J = 6,3, 15,2 Hz, 1H), 4,21 (br s, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,58 (dd, J = 7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,65 (dd, J = 7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 4,99 (s, 1H), 5,69 (t, J = 7,2 Hz, 1H). [α] 25 / D = +8,0° (c = 0,5, EtON). Anal. berechnet für C23H₄₄O₄Si₂:C, 62,67; H, 10,06; gefunden: C, 62,42, H, 10,01.
Beispiel 4
[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanol
Zu einer magnetisch gerührten Lösung von 10,84 g (0,0246 Mol) [3S(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanolacetat in 100 ml Methanol unter einer Argonatmosphäre wurden 3,5 g Natriumhydroxidpellets zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde unter Argon für 3 h gerührt. Es wurde dann unter verringertem Druck auf ein Volumen von 50 ml verdampft, mit 500 ml Wasser verdünnt, mit 2 × 500 ml Hexan-Ether 1:1 extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen, über Na₂₃SO₄ getrocknet und verdampft. Es wurden 9,80 g (100%) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
Beispiel 5
1R-(1α,3β,5E)-[[-2-Chlorethyliden)-4-methylen-1,3-cyclohexandiyl]bis(oxy)]bis (1,1-dimethylethyl)dimethylsilan
Zu einer gerührten Lösung von 6,67 g (0,050 Mol) N-Chlorsuccinimid in 150 ml Dichlormethan unter einer Argonatmosphäre, gekühlt auf 2°C in einem Eis-Acetonbad, wurden tropfenweise über 2 min 4 ml (0,055 Mol) Dimethylsulfid zugegeben. Es bildete sich ein weißer Niederschlag. Nach 30 min bei 0°C wurde das Bad durch ein Trockeneis-Acetonbad ersetzt und die Temperatur des Reaktionsgemischs wurde auf -20°C eingestellt. Es wurde eine Lösung von 9,8 g (0,0246 Mol) [3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis[[(1,1-dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylen-cyclohexyliden]ethanol in 60 ml Dichlormethan zugegeben. Nach 15 min wurde das Kühlbad entfernt und das Reaktionsgemisch wurde für 50 min gerührt und dann in einen Scheidetrichter übertragen, welcher 500 ml Wasser enthielt. Es wurde mit 2 × 350 ml Hexan extrahiert. Die organische Schicht wurde mit 500 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und verdampft und ergab 10,49 g des rohen Produkts als gelbe Flüssigkeit. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie ergab die reine Titelverbindung als farbloses Öl. NMR (CDCl₃): δ 0,03 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,70-1,94 (m, 2H), 2,34 (m, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,28 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,03 (m, 1H), 5,78 (tm, J = 8 Hz, 1H).
Beispiel 6
[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis[[dimethylethyl)dimethylsilyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethyl]diphenylphosphinoxid
Ein 1-l-Dreihalskolben, ausgestattet mit Argoneinlass, Thermometer und mechanischem Rührer, wurde mit einer Lösung von 10,26 g (0,0246 Mol) 1 R-(1α,3β,5E)-[[-(2-Chlorethyliden)-4-methylen-1,3-cyclohexandiyl]bis (oxy)]bis(1,1-dimethylethyl)dimethylsilan in 100 ml frisch destilliertem wasserfreiem Tetrahydrofuran beladen und in einem Trockeneis-Acetonbad auf -65°C gekühlt. Die Zugabe von 0,5 M Kaliumdiphenylphosphid in Tetrahydrofuran während 30 min, bis eine rote Farbe bestehen blieb, erforderte 60 ml. Nach dem Rühren für 1 h bei -65 ° C wurden 10 ml Wasser zugegeben und das Kühlbad wurde entfernt. Die Reaktion entfärbte sich. Dann wurden 200 ml Dichlormethan schnell zugegeben, gefolgt von 200 ml einer wässrigen Lösung, welche 10 ml 30% Wasserstoffperoxid enthielt. Nach 1 h wurden 13,5 g Natriumsulfit, 100 ml Lauge und 200 ml Dichlormethan zugegeben. Nach dem gründlichen Schütteln wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase wurde mit 200 ml Dichlormethan gewaschen. Die organischen Phasen wurden mit 200 ml Lauge gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft und ergaben 16,33 g des rohen Produkts. Dieses rohe Produkt wurde gereinigt durch Mitteldruck- (Silicagel G-60-) Chromatographie, was 12,54 g (87%) der Titelverbindung als weiße Kristalle ergab. NMR (CDCl₃): 6 0,02 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,08 (s, 3H), 0,84 (s, 18H), 1,76 (m, 2H), 2,98-3,15 (m, 2H), 4,06 (m, 1H), 4,37 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 7,45 (m, 6H), 7,72 (m, 4H).
Beispiel 7
E-(3S,5R)-(3,5-Bis-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-2-methylencyclohexyliden]-Essigsäuremethylester (Ro 65-8821)
Eine Lösung von 4,45 g (0,01043 Mol) Z-(3S,5R)-[3,5-Bis-(tert-butyldimethyl-silanyloxy)-2-methylen-cyclohexyliden]-Essigsäuremethylester (X) (A.
Mowrino, et al., Tetrahedron Letters, 38, S. 4713-4716 (1997)) in 100 ml Hexan wurde mit einer UV-Lampe für 2 h bestrahlt. Die Verdampfung ergab 4,25 g (95,5%) der Titelverbindung als farbloses Öl. NMR (CDCl₃): δ 0,06 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,76 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 4,26 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 5,07 (m, 2H), 5,91 (brs, 1H).
Beispiel 8
[3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis-[[(1,1-dimethylethylldimethyl-silyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethanol
Zu einer Lösung von 4,25 g (0,00996 Mol) E-(3S,5R)-[3,5-Bis-(tertbutyl-dimethyl-silanyloxy)-2-methylencyclohexyliden]-Essigsäuremethylester in 100 ml Toluol bei -78°C wurden tropfenweise 25 ml 1,2 M Diisobutylaluminiumhydrid (0,03 Mol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für 1 h gerührt. Nach der Zugabe von 5 ml Methanol wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt. Es wurde dann mit 150 ml von 2 M wässrigem Kalium-Natriumtartrat verdünnt und kräftig gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene verdampft. Das rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie mit Hexan-Ethylacetat 8:2 gereinigt und ergab 2,8 g (70%) der Titelverbindung als farblosen, wachsartigen Feststoff. NMR (CDCl₃): δ 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,88 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 1,74 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,26 (dm, J = 13,6 Hz, 1H), 2,40 (dd, J = 13,6, 5,2, 1H), 4,30 – 4,1 1 (m, 3H), 4,53 (m, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,80 (tm, J = 7 Hz, 1H).
Beispiel 9
1,25 Dihydroxy-16-en-5,6-trans-cholecalciferol
Eine gerührte Lösung von 796 mg (0,00137 Mol) [3S-(1E,3β,5α)]-2-[3,5-Bis[[(1,1-dimethylethyl)dimethyl-silyl]oxy]-2-methylencyclohexyliden]ethyl]diphenylphosphinoxid in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran bei -78°C wurde mit 0,83 ml (0,00133 Mol) von 1,6 M n-Butyllithium in Hexan tropfenweise unter Argon behandelt. Zu der so erhaltenen rot gefärbten Lösung wurde eine Lösung von 280 mg (0,000803 Mol) [3aR-[1 (R*),3aα,7aβ]]-1-[1,5-Dimethyl-5-[(trimethylsilyl)oxy]hexyl]-3,3a,5,6,7,7a-hexahydro-7amethyl-4H-iden-4-on in 5 ml Tetrahydrofuran tropfenweise über einen Zeitraum von 10 min unter Argon zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei -78°C für 90 min gerührt, dann durch Zugabe von 40 ml eines 1:1 2N Rochelle-Salzes und 2N KHCΟ₃ abgeschreckt und auf Raumtemperatur erwärmt. Es wurde mit 3 × 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden 3 × mit Wasser/Lauge gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene verdampft. Dieses rohe Produkt wurde durch Flash-Chromatographie auf einer 40 mm × 6" Silicagelsäule mit Hexan-Ethylacetat 40:1 gereinigt, und ergab 278 mg der trisilylierten Titelverbindung und 140 mg des Ausgangsketons.
Eine Lösung von 278 mg (0,000389 Mol) dieses trisilylierten Zwischenprodukts in 8 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurde mit 1,9 (1,9 mmol) eines 1 M Tetrabutylammoniumfluorids in Tetrahydrofuran unter Argon für 17 h behandelt. Es wurde mit 6 ml Wasser abgeschreckt und für 30 min gerührt. Nach dem Verdampfen des Tetrahydrofurans in Vakuum wurde die restliche Lösung mit 3 × 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten wurden 4 × mit Wasser/Lauge gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene verdampft. Das rohe Produkt, 192 mg, wurde durch Flash-Chromatographie auf einer Silicagel-Säule gereinigt, welche mit einer 1 %-igen Triethylamin:Ethylacetatlösung (300 ml) vorgewaschen war; die Elution wurde mit Ethylacetat durchgeführt. Dies ergab 152 mg der kristallinen Titelverbindung. Eine Probe, umkristallisiert aus Tetrahydrofuran : Methylformiat (0,3:7) besaß einen Schmelzpunkt von 95-100°C. [α] 25 / D + 160:5° (EtOH, c = 0,20). λmax 272/3nm (ε 20600).
Beispiel 10
Weichgelatinekapsel Formulierung 1
Herstellungsverfahren

1. Suspendiere BHT und BHA in Miglyol 812. Erwärme auf etwa 50°C und rühre, bis es gelöst ist.
2. Löse 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans-D₃ in der Lösung aus Schritt 1 bei 50°C.
3. Kühle die Lösung aus Schritt 2 bei Raumtemperatur.
4. Fülle die Lösung aus Schritt 3 in Weichgelatinekapseln.
Bemerkung: Führe alle Herstellungsschritte unter einer Stickstoffatmosphäre durch und schütze vor Licht

Beispiel 11
Weichgelatinekapsel Formulierung II
Herstellungsverfahren

1. Suspendiere Di-α-tocopherol in Miglyol 812. Erwärme auf etwa 50°C und rühre, bis es gelöst ist.
2. Löse 1,25(OH)₂-16-en-5,6-trans D3 in der Lösung aus Schritt 1 bei 50°C.
3. Kühle die Lösung aus Schritt 2 bei Raumtemperatur.
4. Fülle die Lösung aus Schritt 3 in Weichgelatinekapseln
Bemerkung: Führe alle Herstellungsschritte unter einer Stickstoffatmosphäre durch und schütze vor Licht.

Claims

Verbindung mit der Formel
worin R₁ Wasserstoff oder eine C₁-C₄ Alkylgruppe ist; R₂ Wasserstoff oder eine C₁-C₄-Alkylgruppe ist; oder R₁, R₂ und C₂₀ zusammen Cyclopropyl sind;
R₃ C₁-C₄-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄ Alkyl oder Fluor-C₁-C₄-Alkyl ist; und R₄ C₁-C₄-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄ Alkyl oder Fluor-C₁-C₄-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ Wasserstoff ist und R₂ C₁-C₄ Alkyl ist, oder R₁ C₁-C₄ Alkyl ist und R₂ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₁ Wasserstoff ist und R₂ Methyl ist, oder R₁ Methyl ist und R₂ Wasserstoff ist.
Verbindung Nach Anspruch 3, worin R₃ und R₄ jeweils unabhängig C₁-C₄-Alkyl, Hydroxy-C₁-C₄-Alkyl oder Trifluor-C₁-C₄-Alkyl sind.
Verbindung nach Anspruch 4, worin R₃ und R₄ jeweils unabhängig Methyl, Hydroxymethyl oder Trifluormethyl sind.
Verbindung nach Anspruch 5, worin A
ist.
Verbindung nach Anspruch 6, welche 1,25-Dihydroxy-16-en-5,6-trans-cholecalciferol ist.