ES2215707T3 - Analogos de vitamina d3. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de la fórmula en donde R1 es hidrógeno o un grupo alquilo; R2 es hidrógeno o un grupo alquilo; ó R1, R2 y C20 conjuntamente son ciclopropilo; A es ó R3 es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo; y R4 es alquilo, hidroxi-alquilo o fluoroalquilo.
Description
Análogos de vitamina D_{3}.
La invención se refiere a un compuesto de la
fórmula
en
donde
R_{1} es hidrógeno o un grupo alquilo;
R_{2} es hidrógeno o un grupo alquilo; o
R_{1}, R_{2} y C_{20} conjuntamente son
ciclopropilo;
A es 2
R_{3} es alquilo,
hidroxi-alquilo o fluoroalquilo; y
R_{4} es alquilo,
hidroxi-alquilo o fluoroalquilo.
Se ha descubierto que los compuestos de la
fórmula I inducen la inhibición de la proliferación en las líneas
celulares de leucemia mieloide, cáncer de próstata y de mama. Según
esto, los compuestos de la fórmula I son útiles como agentes para el
tratamiento del cáncer de próstata, cáncer de mama y para el
tratamiento de la leucemia.
También se ha descubierto que los compuestos de
la fórmula I tienen actividad antiandrogénica. Según esto, los
compuestos de la fórmula I son útiles para el tratamiento del
crecimiento benigno de la próstata, calvicie y cáncer de
próstata.
También se ha descubierto que los compuestos de
la fórmula I presentan una actividad que los hace útiles para el
tratamiento de enfermedades relacionadas con las glándulas sebáceas
tales como el acné o la dermatitis seborréica.
También se ha descubierto que los compuestos de
la fórmula I presentan una actividad que hace a los compuestos
útiles para el tratamiento de la osteoporosis.
Tal como se emplea aquí, el término "grupo
alquilo" denota un grupo alquilo de cadena lineal o ramificada
que presenta entre 1-4 átomos de carbono, por
ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo,
t-butilo y similares. El término
"hidroxi-alquilo" denota un grupo alquilo que
presenta un substituyente hidroxi en cualquiera de los átomos de
carbono del grupo alquilo. El término
"fluoro-alquilo" denota un grupo alquilo que
presenta uno, dos o tres átomos de fluoro substituidos en cualquiera
de los átomos de carbono del grupo alquilo.
En las fórmulas presentadas aquí, varios
substituyentes se ilustran unidos al núcleo por uno de las
siguientes notaciones: una línea contínua con forma de cuña
(\blacktriangleleft) indicando un substituyente que se encuentra
por encima del plano de la molécula; y una línea discontínua con
forma de cuña (
\triline) indicando un substituyente que se encuentra por debajo del plano de la molécula.
Preferiblemente R_{1} es hidrógeno y R_{2} es
alquilo, o R_{1} es alquilo y R_{2} es hidrógeno. Más
preferiblemente, R_{1} es hidrógeno y R_{2} es metilo o R_{1}
es metilo y R_{2} es hidrógeno.
Preferiblemente R_{3} y R_{4} son,
independientemente, alquilo, hidroxi-alquilo o
trifluoro-alquilo. Más preferiblemente, R_{3} y
R_{4} son independientemente, metilo,
hidroxi-metilo o trifluorometilo.
Preferiblemente, A es
---
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{H}}---\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{H}}---.
El compuesto más preferido de la fórmula I es
1,25-dihidroxi-16-en-5,6-trans-colecalciferol.
Los compuestos de la fórmula I se preparan como
se describe a continuación, haciendo mención especial al Esquema de
Fórmula siguiente.
Esquema de
fórmula
R_{5} es hidrógeno o trimetilsililo.
En el anterior Esquema de Fórmula, en donde Ph es
fenilo, el compuesto de fórmula II, el cual es el compuesto
óxido de [3S-(1E,3\beta,5\alpha)-2-[3,5-bis(dimetiletil)dimetil-silil]oxi]-2-metilen-ciclohexiliden]etil]difenilfosfina, se convierte en un compuesto de fórmula IA mediante la reacción con un compuesto de la fórmula III.
óxido de [3S-(1E,3\beta,5\alpha)-2-[3,5-bis(dimetiletil)dimetil-silil]oxi]-2-metilen-ciclohexiliden]etil]difenilfosfina, se convierte en un compuesto de fórmula IA mediante la reacción con un compuesto de la fórmula III.
La reacción se lleva a cabo entre -60ºC y -90ºC,
en un solvente orgánico, aprótico polar, tal como éter seco o más
preferiblemente tetrahidrofurano seco, en presencia de una base
fuerte tal como un alquil litio como butil litio.
Los grupos protectores de los compuestos de
fórmula IA se eliminan mediante la reacción con una sal de fluoruro,
tal como fluoruro de tetrabutil-amonio en un
solvente polar orgánico tal como éter, o más preferiblemente
tetrahidrofurano, para dar lugar al correspondiente compuesto de
fórmula I.
El compuesto de fórmula II se prepara como se
describe a continuación en los Ejemplos 1-6, o de
forma alternativa, como se describe en los Ejemplos
7-8.
Los compuestos de la fórmula III son conocidos
(por ejemplo en la Patente U.S No 5.087.619) o se puede preparar
siguiendo métodos conocidos.
La actividad útil de los compuestos de la fórmula
I como agentes para el tratamiento de cáncer de próstata, cáncer de
mama y para el tratamiento de leucemia, se puede demostrar por los
siguientes ensayos que son conocidos en el campo.
Los materiales que se seleccionaron para
utilizarlos aquí y los procedimientos empleados fueron los
siguientes:
La línea celular de cáncer de mama
(MCF-7), la línea celular de cáncer de próstata
(LNCaP) y la línea celular de leucemia mieloide
(HL-60) se mantuvieron del modo siguiente: las
células MCF-7 se mantuvieron en Dulbecco's Modified
Eagle Media (DMEM) con suero fetal de ternera (FCS) al 10%; LNCaP y
HL-60 se hicieron crecer en RPMI1640 con FCS al 10%.
Las tres líneas celulares se mantuvieron en un incubador a 37ºC
conteniendo CO_{2} al 5%.
Los compuestos de vitamina D_{3} se disolvieron
en etanol absoluto a 10^{-3} M como solución madre, la cual se
conservó a -20ºC y se protegió de la luz. Para su uso in
vitro, los compuestos se diluyeron en medio DMEM o RPMI. Para su
uso in vivo, los compuestos se diluyeron con una solución
salina tamponada con fosfato (PBS). Se utilizó una alícuota sólo una
vez y las células LNCaP fueron tripsinizadas. Las suspensiones de
células con células únicas lavadas se enumeraron y se plaquearon en
placas de fondo plano de 24 pocillos con un total de 1 x 10^{-3}
células/ pocillo en un volumen de 400 \mul/pocillo. La capa de
nutrientes se preparó con agar que se equilibró a 42ºC. De forma
previa a este paso, los compuestos se dispusieron en los pocillos.
Tras la incubación, se contaron las colonias. Todos los experimentos
se realizaron al menos tres veces utilizando placas por triplicado
para un punto experimental.
Veintiocho ratones macho Balb/c de 8 a 9 semanas
de edad se mantuvieron en condiciones sin patógenos y se alimentaron
con una dieta de laboratorio estándar. Cuatro ratones por grupo
fueron inyectados intraperitonealmente cada día (excepto el sábado y
el domingo) con un compuesto de vitamina D_{3} o bien con un
diluyente
(100 \mul/ratón) durante 3 semanas. Las dosis de 1,25(OH)_{2}-16-ene-5,6-trans-D_{3} fueron: 0,1, 0,5, 1,0 y 2,0 \mug. Las dosis de 1,25(OH)_{2}D_{3} fueron 0,1 \mug/ratón. Los ratones control fueron inyectados con 100 ml de PBS. Los valores de calcio en suero se midieron cada semana mediante un ensayo de detección colorimétrico y cuantitativo.
(100 \mul/ratón) durante 3 semanas. Las dosis de 1,25(OH)_{2}-16-ene-5,6-trans-D_{3} fueron: 0,1, 0,5, 1,0 y 2,0 \mug. Las dosis de 1,25(OH)_{2}D_{3} fueron 0,1 \mug/ratón. Los ratones control fueron inyectados con 100 ml de PBS. Los valores de calcio en suero se midieron cada semana mediante un ensayo de detección colorimétrico y cuantitativo.
Las células MCF-7 se incubaron en
cultivo líquido con 10^{-7} de 1,25(OH)_{2}D_{3}
ó
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
durante diferentes períodos. Tras la incubación, estas células se
lavaron con cuidado dos veces con PBS y las células viables se
contaron y plaquearon en placas de 24 pocillos para llevar a cabo el
ensayo de colonia en agar blando, tal como se ha descrito
previamente.
El análisis del ciclo celular se llevó a cabo en
células MCF-7 incubadas durante 4 días con
1,25(OH)_{2}D_{3} ó bien con
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}a
10^{-7} M. Las células se fijaron en metanol frío durante toda la
noche antes de la tinción con 50 \mug/ml de yoduro de propidio,
Rnasa 1 mg/ml (100 unidades/ml) y NP40 al 0,1%. El análisis se
realizó de forma inmediata tras la tinción. Todos los experimentos
se realizaron al menos tres veces de forma independiente. Todos los
datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de
Student.
Las células se lavaron dos veces con PBS, se
resuspendieron en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM,
SDS 0,1%, deoxicolato sódico 0,5%, NP40 1%, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 100 \mug/ml, aprotinina 2 \mug/ml,
pepstatina 1 \mug/ml y leupeptina 10 \mug/ml), y se dejaron en
hielo durante 30 minutos. Tras la centrifugación a 15.000 g durante
20 minutos a 4ºC, se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de
proteína se cuantificaron. Los lisados completos (15 \mug) se
analizaron por gel de poliacrilamida dodecil sulfato sódico al 15%,
se transfirieron a una membrana immobilon poliviniliden difururo y
se analizaron mediante anticuerpo policlonal de conejo
anti-p27^{kip1} y anticuerpo monoclonal
anti-Actina murina. Las membranas se revelaron.
Para detectar la actividad telomerasa relativa,
se realizaron ensayos de protocolo de amplificación de repetición
telomérica (TRAP). Para la transcriptasa reversa telomerasa humana
(hTERT), se aislaron los RNAs totales de las células HL que se
trataron con 1,25(OH)_{2}D_{3} ó
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
(10^{-9}, 10^{-8}, y 10^{-7} M) durante 4 días con una
solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio. El
RT-PCR se realizó con 1 \mug de RNA total y
cebadores hexámeros al azar. El cDNA se amplificó utilizando
cebadores específicos para el gen hTERT o el gen GAPDH, que se usó
como control. Los cebadores utilizados para hTERT fueron:
5'-CGGAAGAGTGTCTGGAG
CAA-3' (sentido) (SEQ ID NO:1), y 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antisentido) (SEQ ID NO:2). Los ciclos térmicos fueron 94ºC durante 90 segundos, seguido por 33 ciclos de 95ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 40 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Los cebadores para el gen GAPDH fueron: 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3' (sentido) (SEQ ID NO:3), y 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3' (antisentido) (SEQ ID NO:4). Las condiciones para las amplificaciones GAPDH fueron: 94ºC durante 2 minutos, 26 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 40 segundos, 72ºC durante 60 segundos, seguido por 72ºC durante 4 minutos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%, el cual se tiñió con bromuro de etidio.
CAA-3' (sentido) (SEQ ID NO:1), y 5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antisentido) (SEQ ID NO:2). Los ciclos térmicos fueron 94ºC durante 90 segundos, seguido por 33 ciclos de 95ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 40 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Los cebadores para el gen GAPDH fueron: 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3' (sentido) (SEQ ID NO:3), y 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3' (antisentido) (SEQ ID NO:4). Las condiciones para las amplificaciones GAPDH fueron: 94ºC durante 2 minutos, 26 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 40 segundos, 72ºC durante 60 segundos, seguido por 72ºC durante 4 minutos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%, el cual se tiñió con bromuro de etidio.
Las células LNCaP, las células
MCF-7 y las células HL-60 se
sometieron a clonaje en agar blando en presencia de análogos de
vitamina D_{3} a concentraciones de entre 10^{-11} y 10^{-7}
M. Se representaron las curvas dosis-respuesta y se
determinó la dosis efectiva que inhibía el 50% de la formación de
colonias (ED_{50}). El
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
fue eficaz en cuanto a la inhibición de la proliferación clonal de
las tres líneas celulares de una forma dependiente de dosis. La
ED_{50} de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
fue 1,4 x 10^{-9} M para las células LNCaP, 4,3 x 10^{-9} M para
las células MCF-7 y 3,0 x 10^{-11} M para las
células HL-60, que fue alrededor de
10-100 veces más potente que
1,25(OH)_{2}D_{3}.
1,25(OH)_{2}D_{3}.
Debido a que la hipercalcemia representa una
toxicidad importante de los compuestos de vitamina D_{3}, se
compararon los efectos calcémicos de
1,25(OH)_{2}D_{3} con
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}.
Todos los ratones sobrevivieron a las 3 semanas de estudio. Los
ratones que recibieron 0,1 \mug de
1,25(OH)_{2}D_{3}, todos fueron hipercalcémicos
con niveles de calcio en suero de aproximadamente 12 mg/dl (valor
normal 8,5-10,5 mg/dl). En contraste, los ratones
que recibieron
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
(0,1-2,0 \mug/ratón) presentaron casi el mismo
nivel de calcio (8-10 mg/dl) que los ratones control
(8-9 mg/dl).
Para investigar si la inhibición de la
proliferación clonogénica por los análogos de vitamina D_{3} era
reversible, se llevaron a cabo experimentos de exposición a pulsos.
Las células MCF-7 se expusieron a
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
ó 1,25(OH)_{2}D_{3} durante diferentes períodos,
se lavaron y plaqueron en agar blando y el número de colonias se
contó el día 14 de cultivo. Aproximadamente el 40 y el 30 por ciento
de las células clonogénicas fueron inhibidas a los 4 días de
exposición a
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
y 1,25(OH)_{2}D_{3}, respectivamente.
Se determinó el efecto de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}y
1,25(OH)_{2}D_{3} (10^{-7}, 4 días) en el ciclo
celular de las células MCF-7. Se observó un
incremento significativo (P \leq 0,05) en el número de
células en fase G_{0}-G_{1} del ciclo celular,
conjuntamente con una disminución concomitante en la proporción de
células en fase S.
Los inhibidores de la quinasa dependiente de
ciclina conocidos como p21^{waf1} y p27^{kipl} son capaces de
inhibir la actividad de la ciclina quinasa y así disminuir la
progresión de las células a través del ciclo celular. Las células
MCF-7 control presentaban constitutivamente un nivel
moderado de expresión de p21^{waf1} y p27^{kipl}, tal como se
determinó por análisis por Western blot. La exposición durante un
día a
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
(10^{-7} M) aumentó la expresión de p21^{waf1} y p27^{kipl}
entre 3,2-3,5 veces, mientras que el cultivo con
1,25(OH)_{2}D_{3} (10^{-7} M) aumentó la
expresión de p21^{waf1} y p27^{kipl} entre
1,6-1,8 veces. La exposición de las células
MCF-7 a
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
(10^{-7} M) durante 3 días resultó en un aumento de 2,8 veces y
3,4 veces en la expresión de p21^{waf1} y p27^{kipl},
respectivamente. 1,25(OH)_{2}D_{3} (10^{-7} M, 3
días) aumentó la expresión de p21^{waf1} y p27^{kipl} en 4,8
veces y 3,3 veces, respectivamente.
Se estudió el efecto dependiente de la dosis de
los compuestos de vitamina D_{3} en la expresión de p27^{kipl}
en células HL-60. Tanto
1,25(OH)_{2}D_{3} como
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
estimulan la expresión de p27^{kipl} y estos niveles aumentan de
forma significativa tras la incubación con
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
(4 días, 10^{-9} M). Los niveles de p27^{kipl} aumentan de forma
notable cuando las células HL-60 se cultivan con
1,25(OH)_{2}D_{3}10^{-8}-10^{-9}
M.
El efecto de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
y de 1,25(OH)_{2}D_{3}
(10^{-9}-10^{-7} M, 4 días) en la actividad
telomerasa se evaluó mediante el ensayo TRAP. La actividad
telomerasa disminuyó de forma notable en células
HL-60 incubadas con
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
10^{-9} M ó 1,25(OH)_{2}D_{3} 10^{-7} M.
Los efectos de los análogos de la vitamina
D_{3} en la expresión de hTERT en células HL-60 se
evaluó mediante RT-PCR. Tanto
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}como
1,25(OH)_{2}D_{3} inhibieron la expresión del mRNA
de hTERT de forma dependiente de la dosis, consiguiendo casi la
total inhibición de la expresión con 10^{-8} M de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
y con 10^{-7} M de 1,25(OH)_{2}D_{3}.
La actividad beneficiosa de los compuestos de
fórmula I como agentes para el tratamiento del crecimiento benigno
de próstata se puede demostrar mediante los siguientes ensayos que
son conocidos en el campo.
Se evaluó
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
en cuanto a actividad antiandrogénica en hámsters Syrian machos,
castrados y estimulados con testosterona. Los estudios demostraron
que
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
suprimió substancialmente la hipertrofia inducida por andrógenos de
las vesículas seminales y de la glándula de la próstata ventral en
estos animales, mientras que 1,25(OH)_{2}D_{3} fue
inactivo a dosis no tóxicas (1 \mug).
Los hámsters Syrian machos castrados fueron
inyectados diariamente, s.c. con 20 \mug de testosterona
propionato y 1 \mug de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
durante 14 días consecutivos. Ambos compuestos se administraron en
un vehículo de 0,2 ml de aceite de sésamo cada uno. La necropsia se
llevó a cabo en el día 15. La próstata y las vesículas seminales se
retiraron, se secaron y se pesaron. Los datos se analizaron para
determinar su significación estadística mediante la prueba t de
Student y se expresaron como porcentaje de inhibición de la
respuesta estimulada.
La actividad beneficiosa de los compuestos de la
fórmula I como agentes para el tratamiento de la osteoporosis se
puede demostrar mediante los ensayos siguientes, los cuales son
conocidos en el campo.
Se utilizaron ratas hembras adultas de tres meses
de edad. Tras una semana de aclimatación, los animales se agruparon
por peso y se trataron mediante alimentación forzada de 1 ml/kg/día
con diversas concentraciones de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}.
En el día 7 de dosificación, los animales se sangraron y se
determinaron los niveles de calcio en suero.
El compuesto se disolvió en etanol de graduación
200 para obtener una concentración de 100 \mug/ml. Se prepararon
el vehículo de aceite de sésamo y la solución del compuesto en
etanol para la concentración de la mayor dosificación y entonces se
evaporaron de forma rotatoria a 37ºC para eliminar el etanol. El
volumen de la dosis se calculó mediante el grupo de dosificación por
peso corporal medio. Se realizaron diluciones seriadas del compuesto
disuelto en el vehículo para obtener las concentraciones de dosis
apropiadas.
Se recogió la sangre (1,5 ml) de cada animal
mediante punción orbital bajo anestesia por éter el día 7 de
dosificación. La sangre se recogió en tubos separadores de suero, se
centrifugó a 2000 rpm durante 15 minutos y entonces el suero se
alicuoteó para realizar las determinaciones de calcio. El calcio en
suero se determinó mediante ensayo colorimétrico.
Niveles de calcio en
suero
| Grupo # | Tratamiento | Dosis | Media de Calcio | DE |
| \mug/kg/día | en Suero | |||
| (mg/dL) | ||||
| 1 | Vehículo | 0 | 9,65 | 0,25 |
| 6 | Compuesto | 0,5 | 10,64 | 0,51 |
| 7 | Compuesto | 1 | 10,06 | 0,47 |
| 8 | Compuesto | 1,5 | 9,92 | 0,39 |
| 9 | Compuesto | 2 | 9,77 | 0,46 |
Los niveles de calcio en suero para los grupos de
dosificación de hasta 2 \mug/kg/día de tratamiento con
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
se encontraron dentro del rango normal.
Ratas hembra adultas de tres meses de edad fueron
sometidas a una ovariectomía bilateral o cirugía de control. Tras
una semana de aclimatación, los animales se agruparon por peso y se
trataron mediante alimentación forzada de 1 mg/kg de la
concentración especificada. El volumen de la dosis se calculó
semanalmente mediante el grupo de peso corporal medio. La dosis se
inicio 17 días después de la cirugía y se continuó durante 19 días.
En el día 20, los animales se sacrificaron mediante inhalación de
dióxido de carbono y se les escindió los fémures izquierdos.
En la necropsia se escindieron los fémures
izquierdos de todos los grupos y se eliminó el tejido blando. Los
huesos se midieron y se cortaron por la mitad por la diáfisis;
entonces la porción distal se cortó longitudinalmente por la mitad
tras eliminar la epífisis. La médula ósea se limpió y el calcio se
extrajo mediante inmersión en TCA al 5%. El contenido de calcio de
los extractos de TXA se determinó mediante una determinación
colorimétrica y cuantitativa de calcio. Los datos se expresaron como
media del calcio en hueso total en mg/mitad distal del fémur (DHF)
\pm suero.
Se recogió la sangre (1,5 ml) de cada animal
mediante punción orbital bajo anestesia por éter el día 7 y día 18
tras la dosificación. La sangre se recogió en tubos separadores de
suero, se centrifugó a 2000 rpm durante 15 minutos y entonces el
suero se alicuoteó para realizar las determinaciones de calcio. El
calcio en suero se determinó mediante ensayo colorimétrico.
Para obtener una verificación del efecto de la
ovariectomía en el calcio óseo, se compararon los grupos falso y
vehículo ovx mediante la prueba de la t de Student. Los grupos ovx
se compararon mediante el análisis de la varianza de 1 variable
(ANOVA), seguido por Fischer's LSD para comparar cada grupo de
tratamiento con el vehículo cuando el efecto global era
estadísticamente significativo.
Efecto en el calcio del fémur ajustado en
relación al peso
corporal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto en los niveles de calcio en
suero
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar identificamos la actividad
beneficiosa de los compuestos de la fórmula I como agentes para el
tratamiento de enfermedades relacionadas con las glándulas sebáceas,
tal como se ha demostrado con los siguientes ensayos que son
conocidos en el campo.
Doscientos \mul de
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
se disolvieron en propilenglicol, se administraron diariamente (5
días por semana) mediante alimentación forzada para obtener Golden
Syrian hamsters. Los animales se sacrificaron a las 4 semanas y las
orejas se procesaron para su evaluación histológica. El área de las
glándulas sebáceas se midió en secciones transversales de la oreja
preparadas histológicamente mediante análisis por imagen.
| Dosis(\mu/day) | % Cambio de control |
| 10 | -50 |
| 1 | -50 |
| 0.1 | -23 |
| 0.01 | -5 |
También se examinó la fracción lipídica total de
una de las orejas (extracción por solvente orgánico seguida por peso
del material lipídico remanente).
| Dosis(\mu/day) | % Cambio de control |
| 10 | -56 |
| 1 | -37 |
| 0.1 | -25 |
| 0.01 | -26 |
Los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar oralmente para el tratamiento de cáncer de mama, cáncer
de próstata o leucemia a humanos que necesiten dicho tratamiento.
Más específicamente, los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar oralmente a un humano adulto con una dosis que se
encuentra dentro del rango de entre 1 y 20 \mug por día de dicho
tratamiento.
Los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar oralmente, para el tratamiento del crecimiento benigno
de la próstata y de la calvicie a humanos que necesiten dicho
tratamiento. Más específicamente, los compuestos de la fórmula I se
pueden administrar oralmente a un humano adulto con unas dosis que
se encuentran en el rango de entre 1 y 20 \mug por día de dicho
tratamiento.
Los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar oralmente para el tratamiento de la osteoporosis a
humanos, con una dosis de alrededor de 1 a 20 \mug por día.
Los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar tópicamente para el tratamiento de la calvicie en
humanos que necesiten dicho tratamiento. Más específicamente, los
compuestos de la fórmula I se pueden administrar tópicamente con
dosis que se encuentran en el rango de alrededor de 5 a alrededor de
50 \mug por gramo de formulación tópica por día, para dicho
tratamiento.
Los compuestos de la fórmula I se pueden
administrar oralmente, para el tratamiento de las enfermedades
relacionadas con las glándulas sebáceas en humanos, con una dosis de
alrededor de 1 a 20 \mug por día.
Las formas con dosificación oral que comprenden
compuestos de la fórmula I de la invención se pueden incorporar en
cápsulas, comprimidos y similares con materiales de vehículos
farmacéuticamente aceptables.
De forma ilustrativa, los materiales de vehículos
farmacéuticamente aceptables que se pueden incorporar en cápsulas y
similares son los siguientes: un agente de unión tal como goma de
tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; un excipiente tal
como fosfato dicálcico; un agente desintegrador tal como almidón de
maíz, almidón de patata, ácido algénico y similares; un lubricante
tal como estearato de magnesio, un agente edulcorante tal como la
sacarosa, lactosa o sacarina; un agente aromatizante tal como la
menta, aceite de gualteria o cereza. Otros materiales pueden estar
presentes en forma de cubierta o para modificar de otra manera la
forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los
comprimidos pueden estar recubiertos con laca, azúcar o ambos. Un
jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como
agente edulcorante, metil y propil paraben como conservantes, un
colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza o de
naranja.
Las formas de dosificación tópicas que comprenden
compuestos de la fórmula I de la invención incluyen: pomadas y
cremas que comprenden las formulaciones con bases del tipo emulsión,
solubles en agua, absorbibles y oleaginosas tales como petrolado,
lanolina, polietilen glicoles y similares.
Las lociones son preparaciones líquidas, que
varian desde soluciones simples a preparaciones acuosas o
hidroalcohólicas que contienen substancias finamente divididas. Las
lociones pueden contener agentes en suspensión o en dispersión, por
ejemplo, derivados de celulosa tales como etil celulosa, metil
celulosa y similares; gelatina o gomas, que incorporan el
ingrediente activo en un vehículo formado por agua, alcohol,
glicerina y similares.
Los geles y las preparaciones
semi-sólidas se preparan mediante la gelificación de
una solución o suspensión del ingrediente activo en un vehículo
transportador. Los vehículos, que pueden estar hidratados o
deshidratados, se gelifican mediante un agente gelificante, tal como
carboxi polimetileno y se neutralizan para obtener una consistencia
característica del gel mediante el uso de álcalis tales como
hidróxido de sodio y aminas, tales como polietilencocoamina.
Como se emplea aquí, el término "tópico"
denota el uso del ingrediente activo, incorporado en un vehículo
farmacéuticamente adecuado y aplicado en la zona de inflamación para
que se produzca la acción local. Según esto, las composiciones
tópicas incluyen aquellas formas farmacéuticas en las que el
compuesto se aplica externamente mediante el contacto directo con la
piel. Las formas de dosificación comprenden geles, cremas, lociones,
pomadas, polvos, aerosoles y otras formas convencionales de
aplicación de la medicación sobre la piel, obtenidas por la mezcla
de los compuestos de fórmula I con materiales de transporte tópico
farmacéuticamente conocidos.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para
describir la invención y no pretenden limitarla de ninguna
forma.
A una solución agitada magnéticamente de 18,5 g
(0,0523 moles) de
(2R,3R,5S,7S)-5-hidroxi-4-metilen-7[(1,1,-dimetiletil)dimetilsililoxi]-1-oxaspiro[2,5]octano-2-metanol
acetato (Y.Kiegiel, P.M. Wovkulich and M.R. Uskokovic, Tetrahedron
Letters, 32, pgs. 6057-6060 (1991)) y 6,8 g
(0,099 moles) de imidazol en 50 ml de dimetilformamida bajo una
atmósfera de argón, se añadieron 9,8 g (0,065 moles) de cloruro de
t-butildimetilsililo. La mezcla de reacción se agitó
durante 5 horas, se particionó con 5 ml de agua, se agitó durante 30
minutos y se depositó en 400 ml de agua. Entonces se extrajo con 2 x
500 ml de hexano y 2 x 500 ml de éter. Las capas orgánicas se
combinaron, se lavaron con 300 ml de agua, se secaron sobre
Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. La cromatografía en una columna de
gel de sílice dio 22,31 g (92%) del compuesto del título en forma
de aceite incoloro.
Un recipiente de 3 litros con 3 aperturas
provisto de válvula de argón, agitador mecánico y termómetro se
rellenó con 500 ml de tetrahidrofurano y se enfrió a -60ºC en un
baño de acetona en hielo seco. La adición con respecto a las
porciones de 43,23 g (0,108 moles) de hexacloruro de tungsteno
anhidro se llevó a cabo mientras se mantenía la temperatura a -60ºC,
y entonces la rápida adición gota a gota de 200 ml de
n-butil-litio 1,6 M en hexano
mantuvo la temperatura por debajo de -45ºC (aproximadamete 5
minutos). El baño de acetona en hielo seco se sustituyó por un baño
de agua-hielo, permitiendo alcanzar una temperatura
de 5ºC. Se produjeron cambios de color del azul al caqui y al negro
rojizo. Tras 30 minutos a 5ºC, se añadió rápidamente gota a gota una
solución de 22,31 g (0,04884 moles) de acetato de
(2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetil-etil)dime-tilsilil]oxi]-4-metilen-1-oxaspiro[2,5]octano-2-metanol
en 50 ml de hexano durante 3 minutos. Tras 4 horas, la mezcla de
reacción se diluyó con 2 litros de hexano, se filtró a través de un
depósito de gel de sílice, el cual se lavó con 3 x 500 ml de
hexano-etilacetato 9:1 y se evaporó. El residuo se
sometió a cromatografía mediante una columna de gel de sílice de 75
g para dar 22,56 g de producto crudo. La cromatografía mediante una
columna de gel de sílice de presión media y la elución con una
mezcla de diclorometano- acetato de etilo 100:1 proporcionó 17,42 g
(80,1%) del compuesto del título y una pequeña cantidad del
correspondiente epímero 1Z.
A 465 ml de THF anhidro a -78ºC se añadió, bajo
agitación, 64,3 g (160 mmoles) de WCl_{6} (solución azul), seguido
por la adición de 337,5 ml de n-BuLi 1,43 M en
hexano (a tal velocidad que la temperatura interna no subió por
encima de los -20ºC). Entonces la mezcla se dejó calentándo a
temperatura ambiente. Se añadió gota a gota una solución de 24,5 g
(53,6 mmoles) de
(2R,3S,5S,7S)-2-[5,7-bis[(1,1-dimetil-etil)dime-tilsilil]oxi]-4-metilen-1-oxaspiro[2,5]-octano-2-metanol
en 65 ml de THF y la mezcla se agitó durante 4 h. La mezcla se
diluyó con 600 ml de pentano y se filtró a través de un lecho de 4
cm de gel de sílice, se lavó con hexano/EtOAc (19:1) para dar, tras
la evaporación de los agentes volátiles bajo presión reducida, 27 g
de mezcla de dieno crudo. Otra purificación mediante cromatografía
eluída con hexano/EtOAc (25:1) dio 21,6 g (91%) de una mezcla de
dienos Z/E 2:3 (compuestos del título), los cuales se pueden separar
mediante cromatografía en gel de sílice (hexano/EtOAc
40:1).
40:1).
Z-dieno^{1}H RMN
\delta 0,052 (s, 6H), 0,06 (s, 6H), 0,87 (s,9H), 0,89 (s, 9H),
1,74-1,90 (m, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,20 (dd, J=6,0,
12,8 Hz, 1H), 2,41 (d, J= 11,1 Hz, 1H), 4,19 (m, 1H9, 4,42 (m, 1H),
4,61 (dd, J= 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,68 (dd, J= 7,3, 12,1 Hz, 1H), 4,80
(s, 1H), 5,20 (s, 1H), 5,47 (t, J= 7,2 Hz, 1H).
[\alpha]_{D}^{25}= +1,2º (c= 0,4, EtOH). Anal. Calcd.
para C_{23}H_{44}O_{4}Si_{2}: C, 62,27; H, 10,01; Hallado:
C, 62,55, H, 10,33.
E-dieno^{1}H RMN
\delta 0,046 (s, 3H), 0,057 (s, 3H), 0,065 (s, 6H), 0,88 (s, 9H),
0,89 (s, 9H), 1,77 (ddd, J= 3,1, 9,4, 11,9 Hz, 1H), 1,89 (m, 1H),
2,09 (s, 3H), 2,31 (dd, J= 2,0, 15,2 Hz, 1H), 4,21 (br s, 1H), 4,50
(m, 1H), 4,58 (dd, J= 7,2, 12,9 Hz, 1H), 4,65 (dd, J= 7,2, 12,9 Hz,
1H), 4,95 (s, 1H), 4,99 (s, 1H), 5,69 (t, J=7,2 Hz, 1H).
[\alpha]_{D}^{25}= +8,0º (c= 0,5, EtOH). Anal. Calcd.
para C_{23}H_{44}O_{4}Si_{2}: C, 62,27; H, 10,06; Hallado:
C, 62,42, H, 10,01.
A una solución agitada magnéticamente de 10,84 g
(0,0246 moles) de acetato de
[3S-(1E,3\beta,5\alpha)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oxi]-2-metilenciclohe-xiliden]etanol
en 100 ml de metanol bajo una atmósfera de argón, se añadió 3,5 g de
perlas de hidróxido sódico y la mezcla de reacción se agitó bajo
argón durante 3 horas. Entonces se evaporó bajo presión reducida
hasta obtener un volumen de 50 ml, se diluyó con 500 ml de agua, se
extrajo con
2 x 500 ml de hexano:éter. La capa orgánica (100%) del compuesto del título se lavó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó. Resultaron 9,80 g (100%) del compuesto del título en forma de sólido de color blanco.
2 x 500 ml de hexano:éter. La capa orgánica (100%) del compuesto del título se lavó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó. Resultaron 9,80 g (100%) del compuesto del título en forma de sólido de color blanco.
A una solución agitada de 6,67 g (0,050 moles) de
N-clorosuccinimida en 150 ml de diclorometano bajo
una atmósfera de argón enfriada a 2ºC en un baño de
hielo-acetona, se le añadió gota a gota durante 2
minutos 4 ml (0,055 moles) de dimetilsulfuro. Se formó un
precipitado de color blanco. Tras 30 minutos a 0ºC, el baño se
sustituyó por un baño de acetona en hielo seco y la temperatura de
la mezcla de reacción se ajustó a -20ºC. Se añadió una solución de
9,8 g (0,0246 moles) de
[3S-(1E,3\beta,5\alpha)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetiletil)dimetilsilil]oxi]-2-metilen-ciclohexiliden]-etanol
en 60 ml de diclorometano. Tras 15 minutos, el baño enfriado se
retiró y la mezcla de reacción se agitó durante 50 minutos y
entonces se transfirió a un dispositivo separador que contenía 500
ml de agua. Se extrajo con 2 x 350 ml de hexano. La capa orgánica se
lavó con 500 ml de agua, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó
para dar 10,49 g de producto crudo en forma de líquido de color
amarillo. La purificación mediante cromatografía Flash dió el
compuesto del título puro en forma de aceite incoloro. RMN
(CDCl_{3}): \delta 0,03 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 6H),
0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,70 - 1,94 (m, 2H), 2,34 (m, 2H), 4,13
(m, 2H), 4,28 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,03 (m, 1H),
5,78 (tm, J= 8Hz, 1H).
Un recipiente de 1 litro con 3 aperturas provisto
de válvula de argón, termómetro y agitador mecánico se rellenó con
una solución de 10,26 g (0,0246 moles) de 1R-(1\alpha, 3\beta,
5E)-[[-2-cloroetiliden)-4-metilen-1,3-ciclohexanediil]bis-(oxi)]bis(1,1-dimetiletil)dimetilsilano
en 100 ml de tetrahidrofurano anhidro recién destilado y se enfrió
en un baño de acetona en hielo seco a -65ºC. Se necesitó la adición
de 60 ml de difenilfosfuro potásico en tetrahidrofurano durante 30
minutos para que persistiera un color rojo. Tras la agitación
durante 1 hora a -65ºC, se añadió 10 ml de agua y se retiró el baño
enfriado. La reacción perdió su color. Entonces se añadieron
rápidamente 200 ml de diclorometano seguido por 200 ml de una
solución acuosa que contenía 10 ml de peróxido de hidrógeno al 30%.
Tras 1 hora, se añadieron 13,5 g de sulfito de sodio, 100 ml de
salmuera y 200 ml de diclorometano. Tras su agitación cuidadosa, las
fases se separaron y la fase acuosa se lavó con 200 ml de
diclorometano. Las fases orgánicas se lavaron con 200 ml de
salmuera. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de
sodio, se filtraron y se evaporaron para dar 16,33 g de producto
crudo. Este producto crudo se purificó mediante cromatografía (gel
de sílice G-60) de presión media para dar 12,54 g
(87%) del compuesto del título en forma de cristales de color
blanco. RMN (CDCl_{3}): \delta 0,02 (s, 3H), 0,07 (s, 6H), 0,08
(s, 3H), 0,84 (s, 18H), 1,76 (m, 2H), 2,98 - 3,15 (m, 2H), 4,06 (m,
1H), 4,37 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 4,79 (m, 1H), 7,45
(m, 6H), 7,72 (m, 4H).
Una solución de 4,45 g (0,01043 moles) de éster
metílico del ácido
Z-(3S,5R)-[3,5-Bis-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-2-metilen-ciclohexiliden]
acético (X) (A. Mowrino, et al., Tetrahedron Letters,
38, pgs. 4713-4716 (1997)) en 10 ml de hexano
se irradió con una fuente de UV durante 3 horas. La evaporación dió
4,25 g (95,5%) del compuesto del título en forma de aceite incoloro.
RMN (CDCl_{3}): \delta 0,06 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H),
0,89 (s, 9H), 1,76 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 2,70 (m, 1H), 3,36 (m,
1H), 3,70 (s, 3H), 4,26 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 5,07 (m, 2H), 5,91
(brs, 1H).
A una solución de 4,25 g (0,00996 moles) de éster
metílico del ácido
E-(3S,5R)-[3,5-bis-(terc-butil-dimetil-silani-loxi)-2-metilenciclohexiliden]
acético en 100 ml de tolueno a -78ºC, se añadió gota a gota, 25 ml
de hidruro de diisobutilaluminio 1,2M (0,03 moles) y la mezcla de
reacción se agitó durante una hora. Tras la adición de 5 ml de
metanol, la mezcla de reacción se dejó atemperando a temperatura
ambiente. Entonces se diluyó con 150 ml de tartrato
sodio-potasio acuoso 2M y se agitó vigorosamente. La
fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó
hasta sequedad. El producto crudo se purificó por cromatografía
Flash con hexano-acetato de etilo 8:2, dando 2,8 g
(70%) del compuesto del título en forma de sólido ceroso incoloro.
RMN (CDCl_{3}): \delta 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,88 (s, 9H),
0,91 (s, 9H), 1,74 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,26 (dm, J= 13,6 Hz, 1H),
2,40 (dd, J= 13,6, 5,2, 1H), 4,30-4,11 (m, 3H), 4,53
(m, 1H), 4,98 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 5,80 (tm, J= 7 Hz, 1H).
Una solución agitada de 796 mg (0,00137 moles) de
óxido de
[3S-(1E,3\beta,5\alpha)]-2-[3,5-bis[[(1,1-dimetiletil)dimetil-silil]oxi]-2-metilenciclohexiliden]-etil]difenilfosfina
en 10 ml de tetrahidrofurano anhidro a -78ºC se trató con 0,83 ml
(0,00133 moles) de n-butil litio 1,6 M en hexano,
gota a gota, bajo una atmósfera de argón. Para obtener una solución
de color rojo se añadió una solución de 280 mg (0,000803 moles) de
[3aR-[1(R*),3a\alpha,
7a\beta]]-1-[1,5-dimetil-5-[(trimetilsilil)oxi]hexil]-3,3a,5,6,7,7a-hexahidro-7a-metil-4H-inden-4-ona
en 5 ml de tetrahidrofurano, gota a gota durante un período de 10
minutos bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó
a -78ºC durante 90 minutos, entonces se particionó por adición de 40
ml de una sal Rochelle 2N y KHCO_{3} 2N 1:1 y se dejó calentando a
temperatura ambiente. Se extrajo con 3 x 100 ml de acetato de etilo.
Las capas orgánicas se lavaron 3 x agua/salmuera, se secaron sobre
sulfato sódico y se evaporaron hasta sequedad. Este producto crudo
se purificó mediante cromatografía Flash en una columna de gel de
sílice de 40 mm x 6'' con hexano-acetato de etilo
40:1, dando 278 mg del compuesto del título trisililado y 140 mg de
la cetona de partida.
Una solución de 278 mg (0,000389 moles) de este
intermediario trisililado en 8 ml de tetrahidrofurano anhidro, se
trató con 1,9 (1,9 mmoles) de fluoruro de
tetrabutil-amonio 1M en tetrahidrofurano bajo una
atmósfera de argón durante 17 horas. Se particionó con 6 ml de agua
y se agitó durante 30 minutos. Tras la evaporación del
tetrahidrofurano al vacío, la solución residual se extrajo con 3 x
100 ml de acetato de etilo. Las capas orgánicas se lavaron 4 x agua/
salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta
sequedad. El producto crudo, 192 mg, se purificó mediante
cromatografía Flash en una columna de gel de sílice, la cual fue
previamente lavada con una solución al 1% de trietilamina: acetato
de etilo (300 ml); la elución se llevó a cabo con acetato de etilo.
Ésta dió 152 mg del compuesto del título cristalizado. La muestra
recristalizada de tetrahidrofurano:metilformato (0,3:7) tenía un
p.f. 95-100ºC. [\alpha]D^{25} + 160,5º
(EtOH, c= 0,20). \lambdamax 272/3 nm (\varepsilon 20600).
Cápsula de gelatina blanda Formulación
I
| Item | Ingredientes | mg/Cápsula |
| 1 | 1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3} | 0,001-0,02 |
| 2 | Hidroxitolueno butilado (BHT) | 0,016 |
| 3 | Hidroxianisol butilado (BHA) | 0,016 |
| 4 | Migliol 812 c.s. | 160,0 |
1. Resuspender BHT y BHA en Migliol 812. Calentar
a alrededor de 50ºC y agitar hasta conseguir su disolución.
2. Disolver
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
en la solución del paso 1 a 50ºC.
3. Enfriar la solución del Paso 2 a temperatura
ambiente.
4. Rellenar cápsulas de gelatina blanda con la
solución del Paso 3.
Nota: Realizar todos los pasos de elaboración
bajo una atmósfera de nitrógeno y protección de la
luz.
Cápsula de gelatina blanda Formulación
II
| Item | Ingredientes | mg/Cápsula |
| 1 | 1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3} | 0,001-0,02 |
| 2 | di-\alpha-Tocoferol | 0,016 |
| 3 | Migliol 812 c.s. | 160,0 |
1. Resuspender
di-\alpha-Tocoferol en Migliol
812. Calentar a alrededor de 50ºC y agitar hasta conseguir su
disolución.
2. Disolver
1,25(OH)_{2}-16-en-5,6-trans-D_{3}
en la solución del paso 1 a 50ºC.
3. Enfriar la solución del Paso 2 a temperatura
ambiente.
4. Rellenar cápsulas de gelatina blanda con la
solución del Paso 3.
Nota: Realizar todos los pasos de elaboración
bajo una atmósfera de nitrógeno y protección de la
luz.
Claims (7)
1. Un compuesto de la fórmula
en
donde
R_{1} es hidrógeno o un grupo alquilo;
R_{2} es hidrógeno o un grupo alquilo; ó
R_{1}, R_{2} y C_{20} conjuntamente son
ciclopropilo;
A es 16
R_{3} es alquilo,
hidroxi-alquilo o fluoroalquilo; y
R_{4} es alquilo,
hidroxi-alquilo o fluoroalquilo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en donde R_{1} es hidrógeno y R_{2} es alquilo o R_{1} es
alquilo y R_{2} es hidrógeno.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
2, en donde R_{1} es hidrógeno y R_{2} es metilo o R_{1} es
metilo y R_{2} es hidrógeno.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
3, en donde R_{3} y R_{4} son, independientemente, alquilo,
hidroxi-alquilo o
trifluoro-alquilo.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
4, en donde R_{3} y R_{4} son, independientemente, metilo,
hidroxi-metilo o
trifluoro-metilo.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
5, en donde A es
---
\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{H}}---\melm{\delm{\para}{H}}{C}{\uelm{\para}{H}}---.7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
6,
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