ITMI950804A1 - Composti lattonici utili per il trattamento dell'osteoporosi - Google Patents

Description

"COMPOSTI LATTONICI UTILI PER IL TRATTAMENTO

DELL'OSTEOPOROSI "

La presente invenzione si riferisce a nuovi composti, a un processo per la loro preparazione, a conposizioni farmaceutiche che li contengono e all'uso di tali composti e composizioni in medicina.

Si è sorprendentemente trovato che certi derivati di bafilomicina A-Lsono in grado di ridurre il riassorbimento osseo mediante inibizione della IT^-ATPasi di osteoclasto e sono pertanto di potenziale uso per il trattamento e/o la profilassi dell1osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

Di conseguenza, la presente invenzione fornisce un composto di formula (I):

R

o un suo solvato,

in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un gruppo -OR5, in cui R5 rappresenta un grippo alcanoile o benzoile sostituito nella funzione fenilica;

R} rappresenta idrogeno,un gruppo alchile o un gruppo benzile;

I3⁄42 rappresenta idrogeno o un residuo -CORg in cui Rg rappresenta un gruppo C^_4 alchile o fenile sostituito;

R3 rappresenta idrogeno o C^_4 alchile; e

R4 rappresenta un gruppo metile o metossi.

Opportunamente,X rappresenta un gruppo idrossi.

Opportunamente,R1 rappresenta un gruppo Cg_g alchile,per esenpio un gruppo n-esile.

Opportunamente,R2 rappresenta H.

Opportunamente,R3 rappresenta H.

Opportunamente,R4 rappresenta metossi.

Come qui usato, il termine "alchile" o "alchile inferiore" comprende grippi alchile a catena lineare o ramificata avente da 1 a 12 atomi di carbonio, opportunamente fino a 6 o dove indicato da 1 a 4, e comprende inoltre tali grippi alchile quando fanno parte di altri grippi quali gruppi alcossi o alcanoile.

Eventuali opportuni sostituenti per un qualsiasi gruppo fenile comprendono fino a 5, preferibilmente fino a 3, grippi scelti fra alogeno, gruppi alchile, fenile, alcossi, alogeno-alchile, idrossi, animino, nitro, carbossi, alcossicarbonile, alcossicarbonilalchile, alchilcarbonilossi o alchilcarbonile.

Gli atomi di carbonio legati a X e NR3R2 sono atomi di carbonio chirali e pertanto possono fornire stereoisomeri del composto di formula (I).L'invenzione comprende tutte le forme stereoisomere dei conposti di formula (I), conpresi gli enantiomeri e le loro miscele, racemati inclusi. Le differenti forme steroisomere possono essere separate o risolte l’una dall'altra con metodi convenzionali, oppure ogni isomero palò essere ottenuto per sintesi convenzionali stereospecifiche o asimmetriche.

Opportuni solvati dei composti di formula (I) sono i solvati farmaceuticamente accettabili, quali gli idrati.

I solvati dei composti di formula (I) che non sono farmaceuticamente accettabili possono essere utili come intermedi nella preparazione di solvati farmaceuticamente accettabili dei composti di formula (I) o degli stessi composti di formula (I), e costituiscono pertanto un ulteriore aspetto della presente invenzione.

Un composto di formula (I) o un suo solvato può essere preparato per amminazione di un composto di formula (II):

(Π)

in cui 1*3, R4 e X sono come definiti in relazione alla formula (I) e Lj rappresenta un gruppo uscente, per reazione con un composto di formula (HI):

(III)

in cui 3⁄4 e I?2 sono come definiti in relazione ai conposti di formula (I); e successivamente, se necessario, effettuando una o più delle reazioni seguenti:

(i) conversicele di un composto di formula (I) in un altro conposto di formula (I);

(ii)preparazione di un solvato del conposto cosi formato.

Un gruppo uscente adatto è un gruppo (sostituito-benzene) solfonile,come un gruppo 4-nitrobenzensolfernie.

La reazione tra i corrposti di formula (II) e (III) può essere effettuata in qualsiasi solvente adatto, quale piridina, a qualsiasi temperatura adatta che fornisce una conveniente velocità di formazione del prodotto desiderato, opportunamente a temperatura ambiente o a temperatura elevata quale quella nell'intervallo da 30*C a 80*C, per esernpio a temperatura ambiente.

Un composto di formula (II) può essere preparato facendo reagire un composto di formula (IV):

(IV)

in cui R3, R4 e X sono come definiti in relazione alla formula (I),con un reagente capace di convertire il gruppo OH C-21 in un gruppo uscente

Quando rappresenta un 4-nitrobenzensolfonile,un reagente adatto capace di convertire il gruppo OH C-21 in un gruppo uscente 3⁄4 è un alogenuro di 4-nitrobenzensolfonile, come il cloruro di 4-nitrobenzensolfonile.

Le condizioni di reazione per la reazione tra i composti di formula (IV) e il reagente capace di convertire il gruppo OH C-21 in un grippo uscente dipendono dalla natura del reagente scelto, per esempio quando il reagente è un alogenuro di 4-nitrobenzensolfonile, come il cloruro di 4-nitrobenzensolfonile, la reazione può essere effettuata in qualsiasi solvente inerte, in generale in un solvente clorurato quale cloruro di metilene, a qualsiasi temperatura adatta a fornire una conveniente velocità di formazione del prodotto desiderato, generalmente a temperatura ambiente o a una temperatura leggermente elevata così da essere nell'intervallo da 20"C a 40"C, per esempio a temperatura ambiente.

In una forma preferita della reazione per la preparazione di un composto di formula (I), un conposto di formula (II)viene preparato da un composto di formula (IV)e un reagente capace di convertire il gruppo OH C-21 in un gruppo uscente L^,come sopra descritto, e poi il composto risultante di formula (II) viene fatto reagire in situ con un composto di formula (III) per fornire il conposto richiesto di formula (I); in seguito,se necessario,effettuando una o più delle reazioni seguenti: (i) conversione di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I);

(ii)preparazione di un solvato del conposto cosìpreparato.

La reazione di solvatazione può essere effettuata impiegando una qualsiasi procedura di solvatazione convenzionale.

I composti di formula (IV) sono noti o possono essere preparati impiegando metodi analoghi a quelli usati per preparare i composti noti, quali quelli descritti da G. Werner et al., J. Antibiotics, 1984, 37, 110; M.Deeg et al.,J.Antibiotics, 1987, 40, 320; J.R.Everett et al., J. Chem. Soc.Perkin Trans.2,1990, 717; E.J.Corey et al.,Tetrahedron Lett.,1984, 25, 4325; G.H.Baker et al., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 5565.

I composti di formula (III) sono composti noti o sono preparati impiegando metodi analoghi a quelli usati per preparare composti noti, quali quelli descritti in J. March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition (1985),Wiley Interscience.

Un composto di formula (I)o un suo solvato può essere isolato dai processi sopracitati secondo procedure chimiche standard. Quando richiesto è possibile determinare la stereochimica assoluta dei composti impiegando metodi convenzionali,quali cristallografia ai raggi X.

Come sopra citato, i composti dell'invenzione sono dotati di utili proprietà terapeutiche.

La presente invenzione fornisce pertanto un composto di formula (I) o un suo solvato farmaceuticamente accettabile, per uso come sostanza terapeuticamente attiva.

In particolare la presente invenzione fornisce un composto di formula (I) o un suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile, per uso nel trattamento e/o profilassi dell' osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

I composti attivi o i loro sali e/o solvati farmaceuticamente accettabili sono normalmente somministrati in forme di dosaggio unitario. Una quantità efficace per trattare la patologia sopra descritta dipende da fattori quali l'efficacia dei composti attivi, la particolare natura del sale o solvato farmaceuticamente accettabile scelto, la natura e gravità delle malattie da trattare e il peso del paziente.

Tuttavia, una dose unitaria conterrà normalmente da 0,01 a 50 mg, per esempio da 1 a 25 mg, del composto dell'invenzione. Dosi unitarie saranno normalmente somministrate una o più volte al giorno, per esempio 2, 3, 4, 5 o 6 volte al giorno, più frequentemente da 2 a 4 volte al giorno, in modo che la dose giornaliera totale sia normalmente nell'intervallo, per un adulto di 70 kg, da 0,01 a 250 mg, più frequentemente da 1 a 100 mg, per esempio da 5 a 70 mg, che equivale all'intervallo da circa 0,0001 a 3,5 mg/kg/giorno,più frequentemente da 0,01 a 1,5 mg/kg/giomo,per esempio da 0,05 a 0,7 mg/kg/giomo.

Nell'intervallo di dose sopra descritto, non sono stati riscontrati effetti tossici per i composti dell'invenzione.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per il trattamento dell'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate in un mammifero umano o non umano, che comprende la somministrazione di una quantità efficace,non tossica di un composto di formula (I)o di un suo solvato farmaceuticamente accettabile al soggetto che necessita di tale trattamento.

In tale trattamento, il composto attivo può essere somministrato per una qualunque via adatta, per esempio per via orale, parenterale o topica.Per tale uso, il composto sarà normalmente impiegato sotto forma di una composizione farmaceutica in associazione con un veicolo farmaceutico umano o veterinario, un diluente e/o eccipiente, sebbene la precisa forma della composizione dipenda naturalmente dal modo di somministrazione.

Le conposizioni sono preparate per miscelazione e sono opportunamente adatte per somministrazione orale, parenterale o topica, e possono essere in forma di conpresse, capsule, preparazioni orali liquide, polveri,granuli, cialde,pastiglie, polveri ricostituibili, soluzioni o sospensioni iniettabili e per infusione, supposte e dispositivi transdermici.Sono preferite composizioni somministrabili per via orale, in particolari composizioni orali solide, poiché esse sono più convenientiper l'uso generale.

Le compresse e le capsule per somministrazione orale sono normalmente presentate in dose unitaria e contengono eccipienti convenzionali quali agenti leganti, rienpitivi, diluenti, agenti di pressatura, lubrificanti, disintegranti, coloranti, aromi e agenti bagnanti.Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti.

Rienpitivi adatti comprendono cellulosa, marinitolo, lattosio e altri agenti simili. Disintegranti adatti comprendono amido, polivinilpirrolidone e derivati di amido quale amido sodio giocolato. Lubrificanti adatti conprendono, per esempio, stearato di magnesio. Opportuni agenti bagnanti farmaceuticamente accettabili comprendono sodio laurilsolfato.

Queste conposizioni orali solide possono essere preparate con metodi convenzionali di miscelazione, riempimento, conpressione o simili. Ripetute operazioni di miscelazione possono essere usate per distribuire l'agente attivo in quelle conposizioni che impiegano grandi quantità di riempitivi. Tale operazioni sono ovviamente di tipo convenzionale.

Preparazioni orali liquide possono essere, per esempio, nella forma di sospensioni acquose o oleose,soluzioni, emulsioni, sciroppi o elisir o possono essere presentate come prodotti secchi da ricostituire con acqua o altri opportuni veicoli prima dell'uso. Tali preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali quali agenti sospendenti, per esempio sorbitolo, sciroppo, metilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gel di alluminio stearato o grassi idrogenati commestibili, agenti emulsionanti, per esempio lecitina, sorbitan monoleato o gomma acacia; veicoli non acquosi (che possono comprendere olii commestibili), per esempio, olio di mandorla, olio frazionato di cocco, esteri oleosi quali esteri di glicerina, propilenglicol o alcol etilico; conservanti, per esempio metil o propil p-idrossibenzoato o acido sorbico e se desiderato agenti aromatizzanti o coloranti convenzionali.

Per la somministrazione parenterale, si preparano forme di dosaggio unitario fluide contenenti un composto della presente invenzione e un veicolo sterile. Il composto, a seconda del veicolo e della concentrazione, può essere in sospensione o in soluzione. Le soluzioni parenterali sono normalmente preparate sciogliendo il composto in un veicolo e sterilizzando per filtrazione prima della distribuzione in una opportuna fiala o flaconcino. Vantaggiosamente, nel veicolo vengono sciolti anche eccipienti e adiuvanti quali anestetici locali, agenti conservanti e tamponanti. Per aumentare la stabilità, la composizione può essere congelata dopo la distribuzione nella fiala e l'acqua eliminata sotto vuoto.

Sospensioni parenterali sono preparate sostanzialmente allo stesso modo, salvo che il composto è sospeso anziché sciolto nel veicolo e sterilizzato per esposizione ad ossido di etilene prima della sospensione nel veicolo sterile. Vantaggiosamente, nella composizione viene incluso un agente tensioattivo o bagnante per facilitare la distribuzione uniforme del composto attivo.

Per la somministrazione topica, la composizione può essere sotto forma di pomata o cerotto transdermico per la somministrazione sistemica del composto attivo e può essere preparata in maniera convenzionale,per esempio come descritto nei testi standard quali "Dermatological Formulations" - B.W. Barry (Drugs and thè Pharmaceutical Sciences -Dekker)o Harrys Cosmeticology (Léonard Hill Books).

Come è pratica comune, le composizioni saranno accompagnate da istruzioni scritte o stampate per l'uso nell'indicazione medica prevista.

Le seguenti descrizioni, esempi e metodi farmacologici illustrano l'invenzione senza limitarla in alcun modo.

Derivati della bafilomicina

Esempio 1

21-Deossi-21-esilanminobafilomicina Aj

La bafilomicina Aj^ (102 mg) fu sciolta in piridina (1 mi)e si aggiunse 4-nitrobenzensolfonil cloruro (88 mg). La soluzione fu agitata a temperatura ambiente per una notte. Dopo aggiunta di etile acetato la fase organica fu lavata più volte con una soluzione di acido citrico 10% e quindi con una soluzione satura di sodio cloruro, anidrificata (Na2SC>4) ed evaporata. Il residuo venne sciolto in CH2CI2 (2 mi) e trattato con esilammina (0,1 mi). La reazione venne lasciata a temperatura ambiente per dieci giorni. Dopo diluizione con CH2CI2 la fase organica fu lavata successivamente con una soluzione di acido citrico 10%, con una soluzione satura di NaHCX^, e una soluzione satura di NaCl. Dopo anidrifreazione ed evaporazione del solvente si ottennero 150 mg di un residuo giallo che venne purificato per HPLC preparativa e liofilizzato,ottenendo 10 mg del prodotto desiderato.

Condizioni HPLC

Colonna: Vydac RP18

Solventi: A) ACONH40,05M tarpone pH=6,5

B) MeOH

Sistema eluente: 75-90% di B in 40'

Flusso: 24 ml/min

254 nm

Il campione fu sciolto in MeOH (3 mi), vennero eseguite iniezioni di 1 mi.

^■H-NMR (registrato con un 300 MHz Bruker ARX)

• Lo spettro di massa [Fast Atom Bombardment (FAB), metodo ionizzazione negativa con dietanolamnina (DEA) come matrice e Xeno come gas ionizzante a 8 KV di d.d.p.] m/z = 704(M-H)“; 419[(Μ-3⁄4ιΗ24θ3)-Η]~.

Saggi biologici

E1 noto che, in seguito all'adesione alla superficie ossea, una adenosin trifostatasi (ATPasi) H-*· elettrogenica è polarizzata alla interfaccia osteoclasto-osso. La pompa trasporta notevoli quantità di protoni nel microambiente di riassorbimento promuovendo la mobilizzazione del minerale osseo e creando il pH acido richiesto dalle oollagenasi per degradare la matrice ossea.

La natura vacuolare della ponpa protonica dell1osteoclasto fu originalmente riconosciuta da Blair [H.C. Blair et al., Science, 245, 855 (1989)] e poi confermata da Bekker [P.J. Bekker et al.,J.Bone. Min. Res., 5, 569 (1990)] e Vàanànen [K.K. Vàànànen et al., J. Celi. Biol., Ili, 1305 (1990)]. L'evidenza era basata su preparazioni di frammenti di membrana da osteoclasti di uccello (ottenuti dall'osso midollare di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio). Le vescicole di membrana ottenute si acidificano in risposta all'ATP, il che è facilmente vellutato misurando la diminuzione di fluorescenza dell'arancio di acridina, una base debole che si accumula nei compartimenti acidi.

Le caratteristiche biochimiche indicavano che la pompa protonica dell'osteoclasto apparteneva alle ATPasi di tipo vacuolare, poiché il trasporto protonico era inibito dalla N-etilmaleimmide (NBt), un reagente sulfidrilico, e dalla bafilomicina Aj_, un inibitore selettivo delle H*-ATPasi vacuolari [J.E. Bowman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 7972 (1988)], mentre non era inibito dalla ouabaina, un inibitore di Na’l7Kf-ATPasi; dall1ortovanadato di sodio, un inibitore delle p-ATPasi,o da parte di omeprazolo o SCH 28080, entrambi inibitori della HVi^-ATPasi gastrica [J.P. Mattson et al., Acta Physiol. Scand., 146, 253 (1992)].

E' noto che gli inibitori specifici delle ATP-asi vacuolari, quali la bafilomicina λ^, sono in grado di inibire il riassorbimento osseo in colture di osteoclasti [K. Sundquist et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.168,309-313 (1990)].

INIBIZIONE DEL TRASPORTO PHOTONICO ATP-asi DIFENDENTE IH VESCICOLE DERIVATE DA MOffiRAHE DI 0STB0C1ASTI

Attività biologica delle aaminobafiloaicine

Preparazione di microeomi grezzi da osso di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio.

Furono preparate vescicole da osso midollare ottenuto da tibie e femori di galline ovaiole che erano sottoposte a dieta priva di calcio per almeno 15 giorni. In breve,frammenti ossei furono prelevati con uno scalpello,sospesi in 40 mi di terreno di isolamento (0,2 M saccarosio, 50 mM KC1, 10 mM Hepes, 1 mM EGTA, 2 mM ditioteitrolo, 7,4) e filtrati attraverso una rete di nylon con pori da 100 pm. L'intera procedura era effettuata a 4*C. Dopo omogeneizzazione con un omogeinizzatore (20 colpi) in 40 mi di terreno di isolamento si centrifugò a 6500 g,^ x 20 minuti per rimuovere i mitocondri e lisosomi. Il sumatante fu centrifugato a 100.000 per 1 h e il pellet fu raccolto in 1 mi di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote da 200 pi, immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a -80*C. Il contenuto proteico fu determinato impiegando un kit colorimetrico Biorad secondo Bradford [M. Bradford, Anal. Biochem., 72, 246 (1976)].Per il saggio di trasporto protonico, si impiegarono 5-10 pi di membrane.

Purificazione di membrane di osteoclasto.1 mi di vescicole microsiomali grezze preparate cane sopra fu applicato (circa 0,2 mi per provetta) sulla parte superiore di un gradiente discontinuo di saccarosio costituito da 3,5 mi di saccarosio al 15, 30 e 45% (p/p)nel terreno di isolamento e centrifugato a 280.000 g^x per 2 ore (rotore SW 41 Ti). Dopo centrifugazione le interfacce al 30-45% di saccarosio furono raccolte, diluite di circa 20 volte nel terreno di isolamento e centrifugate a 100.000 Qmax ΡβΓ 1 ora (rotore SW 28). Il pellet fu quindi risospeso in 1 mi di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote e congelato in azoto liquido e conservato a -80*C fino al manente dell'impiego.

Il trasporto protonioo nelle vescicole di membrana fu valutato semi-quantitativamente misurando la pendenza iniziale della diminuzione di fluorescenza dell'arancio di acridina (eccitazione 490 nm; emissione 530) dopo aggiunta di 5-20 pi di vescicole di membrana in 1 mi di tampone contenente 0,2 M saccarosio, 50 mM KC1, 10 mM Hepes pH 7,4, ImM ATP Na2, 1 mM CDTA, 5 mM valinomiclna e 4 mM arancio di acridina. La reazione fu avviata aggiungendo 5mM MgSO^. I risultati furono espressi come percentuale della inedia dei due controlli.

inibizione della ATPasi sensibile alla bafilomicina; fu valutata in vescicole di membrana purificate misurando il fosfato inorganico (Pi) prodotto (come complesso molibdato) con un metodo spettrofotometrico descritto da Yoda and Hokin. [Yoda and Hokin, Biochem Biophys. Res. Commun. , 40 880-6 (1970)]. Si effettuano i seguenti trattamenti (sia in presenza sia in assenza di bafilomicina Α^) :

- inibitore - Mg; - inibitore Mg; inibitore Mg. I controlli di Mg sono sottratti da tutti i trattamenti per dare l'attività Mg-dipendente. Le assorbenze sono misurate a 310 nm e sono corrette per gli effetti dovuti ai composti. Tutti i valori sono calcolati cane moli di Pi rilasciato/ora/mg di proteina. Le attività ATPasiche sensibili e insensibili alla bafilomicina sono calcolate come differenza fra i trattamenti /-. I risultati sono espressi come % della media dei due controlli Mg.

INIBIZIONE DEL RIASSORBIMENTO OSSEO

Il riassorbimento osseo può essere valutato come precedentemente descritto in letteratura [T.J. Chambers et al., Endocrinology, 1985, 116, 234]. Brevemente, si disaggregarono meccanicamente osteoclasti da ossa lunghe di ratti neonati in terreno 199 (Flou, UK) tamponato crai Hepes.

La sospensione fu agitata con una pipetta e i frammenti più grandi furono lasciati depositare per 30 secondi. Le cellule furono quindi aggiunte a due pozzetti di una piastra multipozzetto contenenti fettine ossee (ognuna misurante 12 ιπη^). Dopo 15 minuti a 37 *C le fettine ossee furono rimosse,lavate in terreno 199 e poste in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti. Queste furono incubate per 24 ore in un volume totale di 2 mi di terreno di coltura,consistente di siero fetale di vitello al 10% in MEM tamponato con Hanks in presenza o in assenza di farmaco. Il rumerò di osteoclasti e il riassorbimento osseo furono quantificati per microscopia a scansione laser confocale (CLSM): le fettine ossee furono fissate con glutaraldeide al 2% in 0,2 M tampone cacodilato e gli osteoclasti su ogni fettina ossea furono colorati per fosfatasi acida tartrato-resistente.Dopo la conta del numero di cellule colorate in rosso, grandi e multinucleate, le fettine ossee furono immerse in ipoclorito sodico al 10% per 60 minuti per rimuovere le cellule, lavate in acqua distillata e rivestite a spruzzo con oro.

L'intera superficie di ogni fettina ossea fu quindi esaninata in CLSM. Il numero e la dimensione delle cavità osteoclastiche, l’area piana e il volume dell’osso riassorbito furono registrati. I risultati furono espressi come rumerò medio di cavità per osteoclasto,area media per osteoclasto o volume medio per osteoclasto.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1 . Composti di formula {I):

   (I) o un loro solvato, in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un gruppo -OR5, in cui R5 rappresenta un gruppo alcanoile o benzoile sostituito nella funzione fenilica; Ri rappresenta idrogeno,un gruppo alchile o un gruppo benzile; R2 rappresenta idrogeno o un residuo -CORg in cui Rg rappresenta un gruppo 3⁄4_4 alchile o fenile sostituito; R3 rappresenta idrogeno o C]-4 alchile; e R4 rappresenta un gruppo metile o metossi.
2. 2. Composti secondo la rivendicazione 1,in cui X rappresenta un gruppo idrossi.
3. 3. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui R^ rappresenta un gruppo Cg_s alchile.
4. 4. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui R2 rappresenta H.
5. 5. Composti secondo la rivendicazione 1,in cui R3 rappresenta H.
6. 6. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui R4 rappresenta metossi.
7. 7. Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un composto secondo le rivendicazioni 1-6.
8. 8. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1 - 6 per la prepar azione di un medicamento utile per il trattamento e/o la profilassi dell1 osteoperosi e delle malattie asteopeniche correlate.