ITMI950032A1

ITMI950032A1 - Composti arilalchilenici

Info

Publication number: ITMI950032A1
Application number: IT95MI000032A
Authority: IT
Inventors: Carlo Farina; Stefania Gagliardi; Emanuela Consolandi; Mario Pinza
Original assignee: Smithkline Beecham Farma
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1995-01-10
Publication date: 1996-07-10
Also published as: IT1272880B; ITMI950032A0

Abstract

Il composto di formula (I): (FORMULA I) o un sale, o un suo solvato, in cui: R1 rappresenta rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non sostituito; R2 e R3 rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile; R4, R5, R8 e R9 rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, arile, arile sostituito, aralchile oppure R4 R5, insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati, oppure R8 e R9, insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati, formano un anello fenilico eventualmente sostituito; R6 e R7 rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, arile, alcossi; oppure R6 e R7, insieme all'atomo di carbonio a cui sono legati, formano un anello eterociclico saturo; X rappresenta idrossi, alcossi o un gruppo di formula NRsRt in cui Rs e Rt rappresentano ciascuno indipendendemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, fenile, fenile sostituito,fenilalchile o eteroarilalchile; oppure Rs e Rt, insieme all'atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo, sono utili per il trattamento dell'osteoporosi.

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "COMPOSTI ARILALCHILENICI"

La presente invenzione ha per oggetto nuovi composti, un procedimento per preparare tali composti, composizioni farmaceutiche contenenti tali composti e l'uso di tali composti e conposizioni in medicina.

Si è sorprendentemente scoperto che certi derivati arilalchilenici sono indicati per ridurre il riassorbimento osseo mediante inibizione della degli osteoclasti e di conseguenza sono di potenziale uso per il trattamento e/o la profilassi della osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

Di conseguenza, la presente invenzione fornisce un composto di formula ( I) :

o un suo sale, o un suo solvato, in cui:

rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non

sostituito;

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile;

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, arile, arile sostituito, aralchile oppure

insieme agli aromi di carbonio a cui sono legati, oppure e

insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati, formano un anello

fenilenico eventualmente sostituito;

e rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile,

arile, aloossi; oppure insieme all 'atomo di carbonio a cui sono legati, formano un anello eterociclico saturo;

X rappresenta idrossi, aloossi o un gruppo di formula in cui Rs e

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile , alchile

sostituito, fenile, fenile sostituito, fenilalchile o eteroarilalchile; oppure insieme all 'atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo.

Opportunamente , R1 rappresenta un gruppo alchile, per esempio metile.

Opportunamente , rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno.

Opportunamente , R4 rappresenta idrogeno.

Quando rappresentano un gruppo alchile sostituito, sostituenti adatti comprendono uno o più gruppi idrossi.

Opportunamente , , insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati, oppure insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati , formano un anello fenilenico.

Quando insieme all 'atomo di carbonio a cui sono legati, formano un anello eterociclico saturo, anelli adatti comprendono tetraidrofurano e diossolano.

Opportunamente, X rappresenta aloossi, in particolare metossi.

Come qui usato, il termine "alchile" comprende gruppi alchile a catena lineare o ramificata avente da 1 a 12 atomi di carbonio, opportunamente da l a 6, preferibilmente da 1 a 4, e conprende inoltre tali gruppi alchile quando fanno parte di altri gruppi quali gruppi alcossi o alcanoile.

Eventuali sostituenti adatti per un qualsiasi gruppo alchile comprendono gruppi idrossi , ammino, nitro, carbossi, alcossicarbonile, alcossicarbonilalchile , alchilcarbonilossi o alchilcarbonile, in particolare idrossi.

Come qui usato, il termine "arile" conprende gruppi fenile e naftile, in particolare fenile.

Eventuali sostituenti adatti per un qualsiasi gruppo arile corrprendcno fino a 5 sostituenti, preferibilmente fino a 3 sostituenti, scelti fra alchile, alcossi, idrossi, alogeno, trifluorometile, acetile, ciano, nitro, ammin o e alchilcarbonilammi.

Come qui usato, il termine "eteroarile" comprende gruppi eteroarile singoli o fusi, ciascun anello avendo da 5 a 7 atomi nell'anello, in particolare 5 o 6, i quali atomi d'anello comprendono 1, 2 o 3 eteroatomi scelti tra 0, S, o N.

Gruppi eteroarile adatti comprendono gruppi piridile, in particolare 4-piridile, furanile, tiofenile, pirrolile e eteroarile comprendenti anelli benzenici fusi, quali i gruppi chinolinile, benzofuranile e indolile.

Alcuni degli atomi di carbonio dei composti di formula (I) - come quei composti in cui R1-R9 contengono un gruppo alchile chirale - sono atomi di carbonio chirali e pertanto possono fornire stereoisomeri del composto di formula (I) . L'invenzione comprende tutte le forme stereoisomere dei composti di formula (I ) , compresi gli enantiomeri e le loro miscele, racemati inclusi. Le differenti forme stereoisomere possano essere separate o risolte l'una dall'altra con metodi convenzionali, oppure un dato isomero può essere ottenuto per sintesi convenzionali stereospecifiche o asimmetriche.

I composti di formula (I) possiedono anche due doppi leganti e pertanto possono esistere in uno o più isomeri geometrici. L'invenzione si estende a tutte queste forme isomere dei composti di formula (I) , comprese le loro miscele. Le diverse forme isomere possono essere separate tra loro oon mezzi convenzionali, oppure un dato isomero può essere ottenuto con metodi di sintesi convenzionali.

Sali adatti dei composti di formula (I) sono i sali farmaceuticamente accettabili, come un sale cloridrato, metansolfonato, maleato, succinato, acetato, propionato o tartrato.

Opportuni solvati dei composti di formula (I) sono i solvati farmaceuticamente accettabili, quali gli idrati.

I sali e/o i solvati dei composti di formula (I) che non sono farmaceuticamente accettabili possono essere utili come intermedi nella preparazione di sali e/o solvati farmaceuticamente accettabili dei composti di formula (I) o degli stessi composti di formula (I) , e costituiscono pertanto un ulteriore aspetto della presente invenzione.

Un composto di formula (I ) , o un suo sale o un suo solvato , può essere preparato facendo reagire un composto di formula (II) :

in cui sono cane definiti in relazione alla formula (I), con un reagente capace di convertire un residuo di formula in un residuo di formula (a):

in cui e x sono, cane definiti in relazione a formula (I) ; e successivamente, se necessario, realizzare una o più delle seguenti reazioni:

(i) conversione di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I);

(ii) rimozione di un eventuale gruppo protettore;

(iii) preparazione di un sale o di un solvato del composto così formato

Un reagente adatto capace di convertire un residuo della formula -

sopra definita in un residuo della formula (a) sopra definita,

comprende reagenti convenzionali usati per convertire i legami C-0 in doppi legami carbonio carbonio, come un reagente di Wittig o un reagente di Homer-Emmons ,per esempio quelli di formula (III):

in cui è come definito in relazione ai composti di formula (I ) ,

rappresenta X come definito in relazione a formula (I) o un gruppo convertibile in esso e rappresenta un residuo , in cui è come sopra definito, o un gruppo

La reazione tra i composti di formula ( II) e il reagente capace di convertire il gruppo di formula nel residuo di formula (a) , può essere effettuata in condizioni convenzionali appropriate, a seconda del particolare reagente scelto, per esempio:

quando il reagente è un composto di formula (III) in cui è un residuo allora la reazione viene effettuata in condizioni convenzionali di Homer-Emmons , usando un solvente come tetraidrofurano (THF) , cloruro di metilene o toluene, di preferenza THF, a una temperatura che fornisce una adatta velocità di formazione del prodotto richiesto, convenientemente a temperatura ambiente o a temperatura elevata, come una temperatura nell'intervallo da 30 °C a 120 °C; di preferenza la reazione è condotta in presenza di una base quale idruro di sodio, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU) o diisopropiletilammina (DIPEA) , preferibilmente idruro di sodio, e in generale la reazione è effettuata in atmosfera inerte, per esempio azoto.

Quando il reagente è un composto di formula (III) in cui è un residuo Ph3P-, allora la reazione viene effettuata in condizioni convenzionali di Wittig, utilizzando un solvente quale THF, dietiletere, cloruro di metilene o toluene, di preferenza cloruro di metilene, a una temperatura che fornisce una adatta velocità di formazione del prodotto richiesto, convenientemente a temperatura ambiente o a una temperatura elevata, come una temperatura nell'intervallo da 30°C a 120°C, preferibilmente la reazione è condotta in presenza di una base quale idruro di sodio, DBU o DIPEA, preferibilmente idruro di sodio.

La reazione tra i composti di formula (II) e il reagente di Homer-Emmons di formula (III) può essere effettuata in condizioni convenzionali di Horner-Emmons come quelle sopra descritte.

Un altro reagente adatto capace di convertire un residuo della formula sopra definita in un residuo della formula (a) sopra definita è un composto di formula (IV) :

in cui sono come definiti in relazione ai composti di formula (III).

In generale, il reagente di formula (IV) è in forma attivata, opportunamente in forma anicnica, come una forma salificata, per esempio una forma salificata di un metallo alcalino. La reazione tra i composti di formula (II)e (IV)può essere effettuata secondo procedure note, per esempio quelle descritte in Liebigs Ann.Chem.,703,1967, 37.

Conversioni adatte di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I) comprendono la conversione di un composto di formula (I) in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un gruppo aloossi in un composto di formula (I) in cui X rappresenta un residuo della formula sopra definita.

La conversione di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I) può essere effettuata usando la procedura convenzionale adatta, per esempio la conversione sopra menzionata di un composto in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un gruppo alcossi in un composto in cui X rappresenta un residuo della formula sopra definita, può essere effettuata come segue:

(i) quando X è alcossi, mediante idrolisi basica, usando per esempio idrossido di potassio, per fornire un composto di formula (I) in cui X è idrossi, e successivo trattamento con un composto di formula in cui hanno i valori richiesti rispettivamente di e di di preferenza la reazione col composto di formula avviene in presenza di un agente condensante, quale N.N'-dicicloesil carbodiimmide (DCC) o dopo conversione di (I) , in cui X è idrossi, nel corrispondente cloruro di acido e condensazione in presenza di una base quale trietilammina; alternativamente mediante trattamento di detto composto di formula (I) direttamente con un composto di formula in presenza di un trialchilalluminio, come trimetilalluminio , secondo procedure note, quali quelle descritte in Tetrahedron Lett. , 48, 1977 , 4171.

(ii) quando X è idrossi, mediante uso di procedure analoghe a quelle sopra menzionate in (i).

Un composto di formula (II) può essere preparato secondo la sequenza di reazioni illustrata nello Schema (I) qui sotto:

Le reazioni nello Schema (I) possono essere effettuate usando la procedura convenzionale appropriata per esempio: quando R2 rappresenta idrogeno, i composti di formula (V) sono preparati mediante una reazione di Homer-Emmons a partire dai chetoni (VI) e trietilfosfonoacetato, come descritto in letteratura (J. Am. Chem. Soc., 83, 1961, 1733; Tetrahedron Lett., 35, 1994, 3383) e l'estere carbossilico (V) ottenuto viene poi convertito nell'alcol corrispondente con un agente riducente quale diisobutilalluminio idruro (DIBAH),o L in un solvente quale cloruro di metilene dietilere o THF a una temperatura tra -10°C e 60°C, per esempio a temperatura ambiente. Poi l'alcol viene ossidato ad aldeide (II) (R2 - H)usando un agente ossidante quale

PCC (piridinio clorocromato) o PDC (piridinio dicromato) , preferibilmente con

Quando è diverso da idrogeno,per esenpio alchile i composti (II) sono ottenuti direttamente dal (VI) oon una reazione di Wittig o di Homer-Emmons,con le ilidi di fosforo o i fosfonati adatti, utilizzando le condizioni sopra descritte

I sali e/o i solvati dei composti di formula (I) possono essere preparati usando la procedura tradizionale adatta.

I composti di formula (III ) sono composti noti o seno preparati utilizzando metodi analoghi a quelli usati per preparare composti noti, come quelli descritti in Chem. Ber. , 97, 1964, 1713; Tetrahedron, 50, 1994, 3177.

I composti di formula (IV) e (VI) sono composti noti o sono preparati impiegando metodi analoghi a quelli usati per preparare composti noti, quali quelli descritti in J. March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition (1985) , Wiley Interscience.

Un composto di formula (I) o un suo sale o un suo solvato può essere isolato dai processi sopracitati secondo procedure chimiche standard. Quando richiesto è possibile determinare la stereochimica assoluta dei composti impiegando metodi convenzionali, quali cristallografia ai raggi X.

Come sopra citato, i composti dell’invenzione sono dotati di utili proprietà terapeutiche.

La presente invenzione fornisce pertanto un composto di formula (I) o un suo solvato farmaceuticamente accettabile, per uso come sostanza terapeuticamente attiva.

In particolare la presente invenzione fornisce un composto di formula (I) o un suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile, per uso nel trattamento e/o profilassi dell 'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

I composti attivi o i loro sali e/o solvati farmaceuticamente accettabili sono normalmente somministrati in forme di dosaggio unitario. Una quantità efficace per trattare la patologia sopra descritta dipende da fattori quali l’efficacia dei composti attivi, la particolare natura del sale o solvato farmaceuticamente accettabile scelto, la natura e gravità delle malattie da trattare e il peso del paziente.

Tuttavia, una dose unitaria conterrà normalmente da 0,01 a 50 mg, per esempio da 1 a 25 mg, del composto dell'invenzione. Dosi unitarie saranno normalmente somministrate una o più volte al giorno, per esempio 2, 3, 4, 5 o 6 volte al giorno, più frequentemente da 2 a 4 volte al giorno, in modo che la dose giornaliera totale sia normalmente nell'intervallo, per un adulto di 70 kg, da 0,01 a 250 mg, più frequentemente da 1 a 100 mg, per esempio da 5 a 70 mg, che equivale all'intervallo da circa 0,0001 a 3, 5 mg/kg/giorno, più frequentemente da 0,01 a 1,5 mg/kg/giorno, per esempio da 0,05 a 0,7 mg/kg/giorno.

Nell'intervallo di dose sopra descritto, non sono stati riscontrati effetti tossici per i composti dell'invenzione.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per il trattamento dell 'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate in un mammifero umano o non umano, che comprende la sonministrazione di una quantità efficace, non tossica di un composto di formula (I) o di un suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile al soggetto che necessita di tale trattamento.

In tale trattamento, il composto attivo può essere somministrato per una qualunque via adatta, per esempio per via orale, parenterale o topica. Per tale uso, il composto sarà normalmente inpiegato sotto forma di una composizione farmaceutica in associazione oon un veicolo, diluente e/o eccipiente farmaceutico umano o veterinario, sebbene la precisa forma della composizione dipenda naturalmente dal modo di somministrazione .

Le composizioni sono preparate per miscelazione e sono opportunamente adatte per sorrministrazione orale, parenterale o topica, e possono essere in forma di compresse, capsule, preparazioni orali liquide, polveri, granuli, cialde, pastiglie, polveri ricostituibili, soluzioni o sospensioni iniettabili e per infusione, supposte e dispositivi transdermici. Sono preferite composizioni somministrabili per via orale, in particolari composizioni orali solide, poiché esse sono ρίύ convenienti per l'uso generale.

Le compresse e le capsule per somministrazione orale sono normalmente presentate in dose unitaria e contengono eccipienti convenzionali quali agenti leganti, rierpitivi, diluenti, agenti di pressatura, lubrificanti, disintegranti, coloranti, aromi e agenti bagnanti. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti. Riempitivi adatti comprendono cellulosa, mannitolo, lattosio e altri agenti simili. Disintegranti adatti comprendono amido, polivinilpirrolidone e derivati di amido quale amido sodio giocolato. Lubrificanti adatti comprendono, per esempio, stearato di magnesio. Opportuni agenti bagnanti farmaceuticamente accettabili comprendono sodio laurilsolfato.

Queste composizioni orali solide possono essere preparate con metodi convenzionali di miscelazione, riempimento, compressione o simili. Ripetute operazioni di miscelazione possono essere usate per distribuire l'agente attivo in quelle composizioni che impiegano grandi quantità di riempitivi. Tale operazioni sono ovviamente di tipo convenzionale.

Preparazioni orali liquide possono essere, per esenpio, nella forma di sospensioni acquose o oleose, soluzioni, emulsioni, sciroppi o elisir o possano essere presentate come prodotti secchi da ricostituire con acqua o altri opportuni veicoli prima dell'uso. Tali preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali quali agenti sospendenti, per esempio sorbitolo, sciroppo, metilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gel di all urànio stearato o grassi idrogenati commestibili, agenti emulsionanti, per esenpio lecitina, sorbitan monoleato o gomma acacia; veicoli non acquosi (che possono comprendere olii commestibili) , per esempio, olio di mandorla, olio frazionato di cocco, esteri oleosi quali esteri di glicerina, propilenglicol o alcol etilico; conservanti, per esempio metil o propil p-idrossibenzoato o acido sorbico e se desiderato agenti aromatizzanti o coloranti convenzionali.

Per la somministrazione parenterale, si preparano forme di dosaggio unitario fluide contenenti un composto della presente invenzione e un veicolo sterile. Il composto, a seconda del veicolo e della concentrazione, può essere in sospensione o in soluzione. Le soluzioni parenterali sono normalmente preparate sciogliendo il composto in un veicolo e sterilizzando per filtrazione prima della distribuzione in una opportuna fiala o flaconcino. Vantaggiosamente, nel veicolo vengono sciolti anche eccipienti e adiuvanti quali anestetici locali, agenti conservanti e tamponanti. Per aumentare la stabilità, la composizione può essere congelata dopo la distribuzione nella fiala e l 'acqua eliminata sotto vuoto.

Sospensioni parenterali sono preparate sostanzialmente allo stesso modo, salvo che il composto è sospeso anziché sciolto nel veicolo e sterilizzato per esposizione ad ossido di etilene prima della sospensione nel veicolo sterile. Vantaggiosamente, nella composizione viene incluso un agente tensioattivo o bagnante per facilitare la distribuzione uniforme del composto attivo.

Per la somministrazione topica, la composizione può essere sotto forma di pomata o cerotto transdermico per la somministrazione sistemica del composto attivo e può essere preparata in maniera convenzionale , per esempio come descritto nei testi standard quali "Dermatological Formulations" - B.W. Barry (Drugs and thè Pharmaceutical Sciences -Dekker) o Harrys Cosmetioology {Léonard Hill Books) .

Come è pratica comune , le composizioni saranno accompagnate da istruzioni scritte o stampate per l'uso nell'indicazione medica prevista.

Le seguenti descrizioni, esempi e metodi farmacologici illustrano l ' invenzione senza limitarla in alcun modo.

Le abbreviazioni utilizzate nel corso della descrizione e negli esempi successivi hanno i seguenti significati:

Lista delle abbreviazioni

Celite Marchio registrato per dicalite

EI Impatto Elettronico

MS Spettro di Massa

CI Ionizzazione Chimica

PARTE SPERIMENTALE

Preparazione 1

2-Cicloesilideneacetaldeide. Ad una sospensione raffreddata a 0°C di LiAlH4 (0,25 g, 6,6 mmol) in THF anidro (10 ml) sotto azoto, cicloesilideneacetato di etile (lg, 6 mmol) (Organic Synthesis, Coll. Vol. 5, pag 547, John Wiley) sciolto in THF anidro (5 ml), fu aggiunto goccia a goccia. La miscela fu agitata per 2h a 0°C e quindi bloccata per aggiunta sequenziale di acqua (0,25 ml), soda acquosa al 15% (0,25 ml) ed acqua. La fase organica fu estratta con anidrifìcata con

evaporata sotto vuoto per fornire 0,82 g di un olio incolore.

Questo fu sciolto in cloruro di metilene (15 ml),e fu aggiunto biossido di manganese attivato (0,96 g, 11 irmol). La miscela di reazione fu agitata a temperatura ambiente per tre giorni e quindi filtrata su un pannello di Celite che fu lavato con cloruro di metilene (3 x 20 ml). I filtrati riuniti furono evaporati a secchezza per fornire 0,68 g (91,2%) del composto del titolo.

Esempio 1

( Z)-4-Cicloesilidene-2-metossi-2-butenoato di metile e (E)-4-cicloesilidene-2-metossi-2-butenoato di metile. Ad una sospensione di NaH (0,42 g, 10,5 mmol; sospensione in olio al 60% pre-lavata con pentano) in THF anidro (10 ml) sotto azoto, una soluzione di trimetri 2-metossifosfonoacetato (2,23 g, 10,5 mmol) in THF anidro (5 ml) fu aggiunta goccia a goccia e la miscela fu agitata a 40°C per 40 min. Dopo averla fatta tornare a temperatura ambiente, fu aggiunta 2-cicloesilideneacetaldeide (0,87 g, 7 mmol) e l 'agitazione fu continuata per due giorni. La miscela fu trattata con acqua, estratta con (2 x 10 ml ) , lavata con una soluzione satura di NaCl, anidrificata con

ed evaporata sotto vuoto. Il residuo fu cromatografato su gel di silice

ottenendo 0 ,22 g ( 15 , 1%) dell ' isomero Z e 0,06 g

(4,06%) dell'isomero E.

(Z)-4-Cicloesilidene-2-metossi-2-butenoato di metile:

( E ) -4-Cicloesilidene-2-metossi-2-butenoato di metile:

Preparazione 2

2- ( 1 , 4-Diossaspiro [4,5] decan-8-ilidene ) acetato d'etile. Ad una sospensione di NaH (1, 54 g, 38,5 mmol; sospensione in olio al 60% prelavata con pentano) in THF anidro ( 100 ml) sotto azoto, fu aggiunta goccia a goccia una soluzione di trietil fosfonoacetato (7,64 ml , 38 ,5 mmol) in THF mlidro ( 20 mi) e la reazione fu agitata a temperatura ambiente per 1 h. Una soluzione di 1,4-cicloesandione mono-etilene chetale (5 g, 32 mmol ) in THF anidro ( 15 ml) fu gocciolata e la reazione fu tenuta sotto azoto a riflusso per sei giorni. Dopo raffreddamento, la reazione fu bloccata con acqua, estratta con (3 x 30 ml) , anidrificata ccn ed evaporata sotto vuoto. Il residuo fu purificato mediante cromatografia flash (esano/EtOAc 7:3) per fornire 3,45 g (47,6%) del composto del titolo come olio.

Preparazione 3

2- ( 1 , 4-Diossaspiro[4 , 5 ] decan-8-ilidene ) acetaldeide . Ad una soluzione di 2-(1,4-diossaspiro[4,5) decan-8-ilidene) acetato d'etile (1 g, 4,42 nel) in cloruro di metilene (20 ml) fu aggiunta goccia a goccia una soluzione 1M di DIBAH in esano (8,84 ml, 8,84 mmol) sotto azoto a 0°C. L'agitazione fu continuata per 30 minuti, quindi la temperatura fu fatta salire a temperatura ambiente e fu aggiunta una soluzione satura di

(10 ml) . La miscela risultante fu filtrata su un pannello di

Celite. Le fasi furono separate e la fase organica fu lavata con acqua, anidrificata ccn ed evaporata sotto vuoto per dare l'alcol grezzo (0,8 g, 4,3 mmol ) come òlio. Questo fu sciolto in cloruro di metilene (10 ml) e trattato con biossido di manganese attivato (1,5 g, 17,4 mmol) . Dopo averla agitata a temperatura ambiente per tre giorni, la miscela fu filtrata su un pannello di Celite. Il filtrato fu evaporato a pressione ridotta per fornire, dopo cromatografia flash (esano/EtOAc 7:3), 0,71 g (88%) del conposto del titolo come olio.

Esempio 2

(Z)-4-( 1,4-Diossaspiro[4, 5 ] decan-8-ilidene ) -2-metossi-2-butenoato di metile e (E}-4-( 1 , 4-diossaspiro[ 4,5 )decan-8-ilidene)-2-metossi-2-butenoato di metile. Una miscela di trimetri 2-metossifosfonoacetato (0,7 g, 3,3 nmol) e NaH 60% dispersione in olio (0,14 g, 3,4 mmol ) fu trattata con 2- ( 1 , 4-diossaspiro[ 4 , 5 ]decan-8-ilidene ) acetaldeide (0,4 g.

2 ,2 mmol) secondo la procedura dell'Esempio 1 per fornire 0,175 g ( 30%) dell'isomero Z come olio e 0,23 g (39%) dell 'isomero E come olio.

(Z)-4-(1,4-Diossaspiro[4 ,5 ]decan-8-ilidene)-2-metossi-2-butenoato di

(E)-4-( 1,4-Diossaspiro[ 4 , 5 ]decan-8-ilidene)-2-metossi-2-butenoato di

Preparazione 4

2-1 (5-Acetossipentil)cicloesilidene]acetato d'etile. Una miscela di trietil fosfonoacetato (5,4 g, 24,2 mnol) e NaH 60% dispersione in olio (0 ,96 g, 24,2 mmol) fu trattata con 2-(5-acetossipentil)cicloesanone (J. Org. Chem. , 1968, 2013, ) (3 ,65 g, 16,13 mnol) secondo la procedura della Preparazione 2 per fornire 2,54 g (53%) del composto del titolo come olio.

Preparazione 5

2-[ ( 5-Idrossipentil )cicloesilidene ] acetaldeide . 2-[ ( 5-Acetossipentil)cicloesilidene] acetato d'etile (1,5 g, 5,06 mmol ) fu trattato con una soluzione 1M di DIBAH in esano (15 ml, 15 mmol ) , secondo la procedura della Preparazione 3, per fornire 1 g (4,7 mmol ) di 2-[ (5-idrossipentil )cicloesilidene] metanolo che fu quindi ossidato con biossido di manganese attivato (3 g, 34,5 mnol) per fornire 0,9 g (85%) del composto del titolo.

Esempio 3

( 2Z ) - 4- [ 2- ( 5- Idrossipentil ) cicloesilidene ] -2-metossi-2- butenoato di metile. Una soluzione di 2-[ (5-idrossipentil)cicloesilidene]acetaldeide (0,43 g, 2 mmol) in THF anidro (10 ml) fu trattata sotto azoto con bromuro di 2-metossi -2-(trifenilfosfonio) acetato di metile (Chem. Ber. , 97, 1964, 1713) (0,89 g, 2 mmol) e DBU (0,3 ml, 2 mmol) . La miscela di reazione fu agitata a 50 °C per due giorni, lasciata raffreddare, diluita con Et2O (10 ml) e filtrata. Il filtrato fu lavato successivamente con HC1 al 10% (5 ml) , una soluzione satura di (5 ml) , una soluzione satura di NaCl (5 ml) , anidrificato con ed evaporato sotto vuoto. Il residuo fu purificato per cromatografia flash (esano/EtOAc 65:35) per fornire 0,15 g (25,3%) del composto del titolo come olio.

Esempio 4

( 2E ) -4- [ 2- ( 5-Idrossipentil )cicloesilidene ] -2-metossi-2-butenoato di metile. Trimetil 2-metossifosfonoacetato (0, 5 g, 2,36 mmol ) e NaH (0,19 g, 4,7 mmol; 60% dispersione in olio) furono trattati con 2-[ (5-idrossipentil) cicloesilidene] acetaldeide (0,17 g, 0,8 mmol ) secondo la procedura dell'Esempio 1 per fornire 0,1 g (42 ,5%) del composto del titolo.

Preparazione 6

(1,2,3 ,4-Tetraidro-1-naftilidene) acetato d'etile. Trietil fosfonoacetato (17,7 ml, 89,2 mmol) e NaH 60% dispersione in olio (3,57 g, 89,2 mmol ) furono fatti reagire con 1-tetralone ( 11,8 ml, 89 mmol) , secondo la procedura della Preparazione 2, per fornire 9,46 g (49%) del composto del titolo come olio.

Preparazione 7

1,2, 3 ,4-Tètraidro- 1-naftilideneacetaldeide . (1,2,3, 4-Tetraidro-1-naftilidene) acetato d'etile (3 g, 13,87 nmol) fu trattato con

(0,6 g, 15,8 mmol) in THF anidro (20 ml) secondo la procedura descritta nella Preparazione 1. La successiva ossidazione dell'alcol corrispondente (2,3 g, 13,2 mmol ) fu eseguita con PCC (4,3 g, 19,8 mmol) in cloruro di metilene (20 ml) per due giorni a temperatura ambiente. Dopo diluizione con Et2O (20 ml) la miscela fu filtrata su Florisil e l'intermedio fu purificato mediante cromatografia flash (esano/EtOAc 8:2) , per fornire 1,13 g (47,3%) del composto del titolo.

Esempio 5

(2Z , 4E ) -2-Metossi-4- (1,2,3, 4-tetraidro-1-naftilidene ) -2-butenoato di metile e ( 2E , 4E) -2-metossi— 4- (1,2,3, 4-tetraidro-1-naftilidene ) -2-butenoato di metile. Ad una soluzione di trimetril 2-metossifosfonoacetato (1,6 g, 7,5 mmol ) in THF anidro (20 ml) , furono aggiunti NaH 60% dispersione in olio (0,3 g, 7,41 mmol) e 1, 2,3,4-tetraidro-1-naftilideneacetaldeide (1 g, 5,8 mmol) in THF anidro (5 ml) secondo la procedura descritta nell'Esempio 1, Dopo la usuale lavorazione e purificazione mediante cromatografia su colonna (esano/EtOAc 9: 1) furono ottenuti 0,42 g (28%) dell'isomero (2Z,4E) come polvere bianca, p.f .- 73-75°C, e 0.27 g (18%) dell'isomero (2E,4E) come olio.

(2Z,4E)-2-Metossi-4-( 1, 2 ,3 ,4-tetraidro-1-naftilidene)-2-butenoato di

(2E,4E}-2-Metossi-4-(1,2,3,4-tetraidro-1-naftilidene)-2-butenoato di

Saggi biologici

E' noto che, in seguito all'adesione alla superficie ossea, una adenosin trifosfatasi (ATPasi) H<+ >elettrogenica è polarizzata alla interfaccia osteoclasto— osso. La pompa trasporta notevoli quantità di protoni nel microambiente di riassorbimento promuovendo la mobilizzazione del minerale osseo e creando il pH acido richiesto dalle collagenasi per degradare la matrice ossea.

La natura vacuolare della ponpa protonica dell'osteoclasto fu originalmente riconosciuta da Blair [H.C. Blair et al. , Science, 245, 855 (1989)) e poi confermata da Bekker (P.J. Bekker et al. , J. Bone.

Min. Res., 5, 569 (1990)] e Vaananen [K.K. Vaananen et al., J. Cell. Biol . , 111, 1305 (1990)]. L'evidenza era basata su preparazioni di frammenti di membrana da osteoclasti di uccello (ottenuti dall’osso midollare di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio) . Le vescicole di membrana ottenute si acidificano in risposta all'ATP, il che è facilmente valutato misurando la diminuzione di fluorescenza dell'arancio di ac ridin a, una base debole che si accumula nei compartimenti acidi.

Le caratteristiche biochimiche indicavano che la pompa protonica dell ’osteoclasto apparteneva alle ATPasi di tipo vacuolare, poiché il trasporto protonico era inibito dalla N-etilmaleimmide (NEM) , un reagente sulfidrilico, e dalla bafilomicina A1 un inibitore selettivo delle H<+ >-ATPasi vacuolari [J.E. Bowman et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 7972 (1988) ] , mentre non era inibito dalla ouabaina, un inibitore di Na<+>/K<+>-ATPasi; dall 'ortovanadato di sodio, un inibitore delle p-ATPasi, o da parte di omeprazolo o SCH 28080, entrambi inibitori della H<+>/K<+>-ATPasi gastrica [J.P. Mattson et al. , Acta Physiol. Scand. , 146, 253 (1992) ] .

E' noto che gli inibitori specifici delle ATP-asi vacuolari, quali la bafilomicina A1 sono in grado di inibire il riassorbimento osseo in colture di osteoclasti [K. Sundquist et al. , Biochem. Biophys. Res. Cormun. 168, 309-313 (1990) ] .

INIBIZIONE DEL TRASPORTO PROTONICO v-ATP-asi DIPENDENTE IN VESCICOLE DI MEMBRANE

Preparazione di microsomi grezzi da osso di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio.

Furono preparate vescicole da osso midollare ottenuto da tibie e femori di galline ovaiole che erano sottoposte a dieta priva di calcio per almeno 15 giorni. In breve, frammenti ossei furono prelevati con uno scalpello (lama 24) , sospesi in 40 ml di terreno di isolamento (0,2 M saccarosio, 50 mM KC1, 10 mM Hepes, 1 mM EGTA, 2 mM ditioteitrolo, pH 7,4) e filtrati attraverso una rete di nylon con pori da 100 μ pm. L'intera procedura era effettuata a 4°C. Dopo omogeneizzazione con un omogeneizzatore (20 colpi) in 40 ml di terreno di isolamento, fu effettuata una centrifugazione iniziale (6500 x 20 min) per rimuovere i mitocondri e lisosomi. Il surnatante fu centrifugato a 100.000 per 1 h e il pellet fu raccolto in 1 ml di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote da 200 μi, inmediatamente congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C. Il contenuto proteico fu determinato impiegando un kit colorimetrico Biorad secondo Bradford [M. Bradford, Anal, Biochem. , 72, 248 (1976) ] . Per il saggio di trasporto protonico, si impiegarono 5-10 μi di membrane.

Purificazione di membrane di osteoclasto. 1 ml di vescicole microsiomali grezze preparate come sopra fu applicato (circa 0,2 ml per provetta) sulla parte superiore di un gradiente discontinuo di saccarosio costituito da 3,5 ml di saccarosio al 15, 30 e 45% (p/p) nel terreno di isolamento e centrifugato a 280.000 per 2 ore (rotore SW 41 Ti) . Dopo centrifugazione le interfacce al 30-45% di saccarosio furono raccolte, diluite di circa 20 volte nel terreno di isolamento e centrifugate a 100.000 per 1 ora (rotore SW 28) . Il pellet fu <q>uindi risospeso in 1 ml di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote e congelato in azoto liquido e conservato a -80°C fino al momento dell' impiego.

Il trasporto protonico nelle vescicole di membrana fu valutato semiquantitativamente misurando la pendenza iniziale della diminuzione di fluorescenza dell'arancio di acridina (eccitazione 490 nm; emissione 530) dopo aggiunta di 5-20 μl di vescicole di membrana in 1 ml di tampone contenente 0,2 M saccarosio, 10 mM Hepes pH 7,4, 1mM ATP Na2, 1 mM CDTA, 5 μΜ valinomicina e 4 μΜ arancio di acridina. La reazione fu avviata aggiungendo I risultati furono espressi come percentuale della media dei due controlli.

Inibizione della ATPasì sensibile alla bafilomicina: fu valutata in vescicole di membrana purificate misurando il rilascio di fosfato inorganico (Pi) durante 30 min. di incubazione a 37 °C in una piastra da 96 pozzetti in presenza o in assenza di bafilomicina Al. IL terreno di reazione conteneva 1nM ATP, 10 mM HEPES-Tris pH 8, 50 μΜ valinomicina, 5 μm nigericina, 1 mM CDTA-Tris , 100 μΜ armonio molibdato, 0,2 M saccarosio e membrane (20 μg proteina/ml) . La reazione fu iniziata con

(pipetta a 8 canali) e interrotta, dopo 30 min, per aggiunta di 4

volumi del reagente verde malachite (pipetta a 96 canali) , preparato secondo Chan (Anal. Biochem. 157, 375 (1986) ] . L'assorbanza a 650 nm fu misurata dopo 2 min, usando un lettore per micropiastre. I risultati sono espressi come μmol (Pi) x mg di proteina-1 x ora<-1 >e, per ciascun esperimento, rappresentano la media ± esm dei triplicati.

INIBIZIONE DEL RIASSORBIMENTO OSSEO

Il riassorbimento osseo può essere valutato come precedentemente descritto in letteratura [T.J. Chambers et al . Endocrinology, 1985, 116, 234] . Brevemente, si disaggregarono meccanicamente osteoclasti da ossa lunghe di ratti neonati in terreno 199 (Flow, UK) tamponato con Hepes. La sospensione fu agitata con una pipetta e i frammenti più grandi furono lasciati depositare per 30 secondi. Le cellule furono quindi aggiunte a due pozzetti di una piastra multipozzetto contenenti fettine ossee (ognuna della misura di 12 mn<2>) . Dopo 15 minuti a 37 °C le fettine ossee furono rimosse, lavate in terreno 199 e poste in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti. Queste furono incubate per 24 ore in un volume totale di 2 ml di terreno di coltura, consistente di siero fetale di vitello al 10% in MEM tamponato con Hanks , in presenza o in assenza di farmaco. Il numero di osteoclasti e il riassorbimento osseo furono quantificati per microscopia a scansione laser confocale (CLSM ) : le fettine ossee furono fissate con glutaraldeide al 2% in 0,2 M tampone cacodilato e gli osteoclasti su ogni fettina ossea furono colorati per fosfatasi acida tartrato- resistente. Dopo la conta del numero di cellule colorate in rosso, grandi e multinucleate, le fettine ossee furono immerse in ipoclorito sodico al 10% per 60 minuti per rimuovere le cellule, lavate in acqua distillata e rivestite a spruzzo con oro.

L'intera superficie di ogni fettina ossea fu quindi esaminata in CLSM. Il numero e la dimensione delle cavità osteoclastiche, l'area piana e il volume dell'osso riassorbito furono registrati. I risultati furono espressi come numero medio di cavità per osteoclasto, area media per osteoclasto o volume medio per osteoclasto.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula ( I ) : o un suo sale, o un suo solvato, in cui: rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non sostituito; rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile; rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, arile, arile sostituito, aralchile oppure insieme agli aromi di carbonio a cui sono legati, oppure R8 e insieme agli atomi di carbonio a cui sono legati, formano un anello fenilenico eventualmente sostituito; rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, arile, alcossi; oppure insieme all'atomo di carbonio a cui sono legati, formano un anello eterociclico saturo; X rappresenta idrossi, alcossi o un gruppo di formula in cui Rs e rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, fenile, fenile sostituito, fenilalchile o eteroarilalchile; eppure insieme all'atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo.
2. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresenta un gruppo metile.
3. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno.
4. Conposti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresenta idrogeno.
5. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano idrossialchile.
6. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano insieme un anello fenilenico.
7. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano insieme un anello fenilenico.
8. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano insieme un anello diossolanico.
9. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui X rappresenta metossi.
10. Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un composto secondo le rivendicazioni 1 - 9.
11. Uso dei composti secondo le rivendicazioni .1 - 9 per la preparazione un medicamento utile per il trattamento e/o la profilassi dell 'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.