ITMI950033A1

ITMI950033A1 - Composti arilalchilenici

Info

Publication number: ITMI950033A1
Application number: IT95MI000033A
Authority: IT
Inventors: Carlo Farina; Stefania Gagliardi; Maria Riccaboni; Carlo Parini; Mario Pinza
Original assignee: Smithkline Beecham Farma
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1995-01-10
Publication date: 1996-07-10
Also published as: IT1272881B; ITMI950033A0

Abstract

I composti di formula (I): (FORMULA I) o un loro sale, o un loro solvato, in cui:R1 rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non sostituito; R2, R3, e R4 rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile;R5 e R6 rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, idrossi, ammino, alcossi, alchilcarbonillosi, fenossi eventualmente sostituito, benzilossi eventualmente sostituito, alchilammino, dialchilammino, cloro, alchile, carbossi, carbalcossi, carbammoile, alchilcarbammoile oppure R5 e R6 rappresentano insieme una catena C3-5 alchilenica satura o insatura, ognuno degli atomi di carbonio della quale è eventualmente sostituito con fino a tre gruppi alchile; e X rappresenta idrossi, alcossi o un gruppo di formula NRsRt in cui rs e Rt rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, fenile fenile sostituito, fenilealchile o eteroarilalchile; oppure Rs e Rt, insieme all'atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo; sono utili per il trattamento dell'osteoporosi.

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "COMPOSTI ARILALCHILENICI"

La presente invenzione ha per oggetto nuovi composti, un procedimento per preparare tali composti, composizioni farmaceutiche contenenti tali composti e l'uso di tali composti e composizioni in medicina.

Si è sorprendentemente scoperto che certi derivati arilalchilenici sono indicati per ridurre il riassorbimento osseo mediante inibizione della degli osteoclasti e di conseguenza sono di potenziale uso per il trattamento e/o la profilassi della osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

Di conseguenza, la presente invenzione fornisce un composto di formula (I):

o un suo sale, o un suo solvato, in cui:

rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non

sostituito;

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile;

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, idrossi, armino, alcossi, alchilcarbonilossi, fenossi eventualmente sostituito, benzilossi eventualmente sostituito, alchilammino, dialchilammino , cloro, alchile, carbossi, carbalcossi, carbammoile , alchilcarbammoile oppure rappresentano insieme una catena alchilenica satura o insatura, ognuno degli atomi di carbonio della quale è eventualmente sostituito con fino a tre gruppi alchile; e

X rappresenta idrossi, alcossi o un gruppo di formula in cui e

rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, fenile, fenile sostituito, fenilalchile o eteroarilalchile; oppure insieme all'atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo.

Opportunamente, rappresenta un gruppo alchile , per esempio metile.

Opportunamente, rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno.

Opportunamente, rappresenta idrogeno, idrossi, alcossi o alchilcarbonilossi .

Quando rappresentano assieme una catena -alchilenica satura o insatura, catene adatte sono le catene alchileniche , esempi comprendono :

Sostituenti adatti per i gruppi alchile rappresentati da

comprendano i gruppi idrossi.

Sostituenti adatti per i gruppi fenile rappresentati da

comprendono i gruppi idrossialchile.

Gruppi eterociclici saturi adatti rappresentati da

comprendono i gruppi morfolinile.

Un gruppo fenilalchile adatto rappresentato da è un gruppo benzile.

Opportunamente, X rappresenta alcossi, in particolare metossi.

Come qui usato, il termine "alchile" comprende gruppi alchile a catena lineare o ramificata avente da 1 a 12 atomi di carbonio, opportunamente da 1 a 6, preferibilmente da 1 a 4, e comprende inoltre tali gruppi alchile quando fanno parte di altri gruppi quali gruppi alcossi o alcanoile.

Eventuali sostituenti adatti per un qualsiasi grippo alchile comprendono gruppi idrossi, animino, nitro, carbossi, alcossicarbonile, alcossicarbonilalchile , alchilcarbonilossi o alchilcarbonile, in particolare idrossi.

Come qui usato, il termine "arile" comprende gruppi fenile e naftile, in particolare fenile.

Eventuali sostituenti adatti per un qualsiasi gruppo arile comprendono fino a 5 sostituenti, preferibilmente fino a 3 sostituenti, scelti fra alchile, alcossi, idrossi, alogeno, trifluorometile, acetile, ciano, nitro, ammino e alchilcarbonilammino.

Come qui usato, il termine "eteroarile" comprende gruppi eteroarile singoli o fusi, ciascun anello avendo da 5 a 7 atomi nell'anello, in particolare 5 o 6, i quali atomi d'anello comprendono 1, 2 o 3 eteroatomi scelti tra 0, S, o N.

Gruppi eteroarile adatti comprendono gruppi piridile, in particolare 4-piridile, furanile, tiofenile, pirrolile e eteroarile comprendenti anelli benzenici fusi, quali i gruppi chinolinile, benzofuranile e indolile.

Alcuni degli atomi di carbonio dei conposti di formula (I) - come quei composti in cui contengono gruppi alchile chirali - sono atomi di carbonio chirali e pertanto possano fornire stereoisomeri del composto di formula (I) . L'invenzione comprende tutte le forme stereoisomere dei composti di formula (I) , compresi gli enantiomeri e le loro miscele, racemati inclusi. Le differenti forme stereoisomere possono essere separate o risolte l'una dall'altra con metodi convenzionali, oppure un dato isomero può essere ottenuto per sintesi convenzionali stereospecifiche o asimmetriche.

I composti di formula (I) possiedono anche due doppi legami e pertanto possono esistere in uno o più isomeri geometrici. L'invenzione si estende a tutte queste forme isomere dei composti di formula (I) , comprese le loro miscele. Le diverse forme isomere possono essere separate tra loro con mezzi convenzionali, oppure un dato isomero può essere ottenuto con metodi di sintesi convenzionali.

Sali adatti dei composti di formula (I) sono i sali farmaceuticamente accettabili, come un sale cloridrato, metansolfonato, maleato, succinato, acetato, propionato o tartrato.

Opportuni solvati dei composti di formula (I) sono i solvati farmaceuticamente accettabili, quali gli idrati.

I sali e/o i solvati dei composti di formula (I) che non sono farmaceuticamente accettabili possono essere utili come intermedi nella preparazione di sali e/o solvati farmaceuticamente accettabili dei composti di formula (I) o degli stessi composti di formula (I), e costituiscono pertanto un ulteriore aspetto della presente invenzione.

Un composto di formula ( I ) , o un suo sale o un suo solvato, può essere preparato:

(a) facendo reagire un conposto di formula (II):

in cui sono come definiti in relazione alla formula (X), con un reagente capace di convertire un residuo di formula

in un residuo di formula (a):

in cui e x sono come definiti in relazione a formula (I); e successivamente, se necessario, realizzare una o più delle seguenti reazioni:

(i) conversione di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I);

(ii) rimozione di un eventuale gruppo protettore;

(iii) preparazione di un sale o di un solvato del composto così formato.

Un reagente adatto capace di convertire un residuo della formula -

sopra definita in un residuo della formula (a) sopra definita comprende reagenti convenzionali usati per convertire i legami C=0 in doppi legami carbonio carbonio, come un reagente di Wittig o un reagente di Horner-Emmons,per esenpio quelli di formula (III):

in cui è come definito in relazione ai conposti di formula (I),

rappresenta X come definito in relazione a formula (I) o un gruppo convertibile in esso e X2 rappresenta un residuo , in cui R7 è come sopra definito, o un gruppo

La reazione tra i composti di formula (II) e il reagente capace di convertire il grippo di formula -CO-R2 nel residuo di formula (a) , può essere effettuata in condizioni convenzionali appropriate, a seconda del particolare reagente scelto, per esempio:

quando il reagente è un conposto di formula (III) in cui X2 è un residuo allora la reazione viene effettuata in condizioni convenzionali di Horner-Emmons, usando un solvente come tetraidrofurano (THF), cloruro di metilene o toluene, di preferenza THF, a una temperatura che fornisce una adatta velocità di formazione del prodotto richiesto, convenientemente a temperatura ambiente o a temperatura elevata, come una temperatura nell'intervallo da 30°C a 120°C; di preferenza la reazione è condotta in presenza di una base quale idruro di sodio, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU) o diisopropiletilammina (DIPEA), preferibilmente idruro di sodio, e in generale la reazione è effettuata in atmosfera inerte, per esenpio azoto.

Quando il reagente è un composto di formula (III) in cui è un residuo allora la reazione viene effettuata in condizioni convenzionali di Wittig, utilizzando un solvente quale THF, dietiletere, cloruro di metilene o toluene, di preferenza cloruro di metilene, a una temperatura che fornisce una adatta velocità di formazione del prodotto richiesto, convenientemente a temperatura ambiente o a una temperatura elevata, come una temperatura nell'intervallo da 30°C a 120°C, preferibilmente la reazione è condotta in presenza di una base quale idruro di sodio, DBU o DIPEA, preferibilmente idruro di sodio.

La reazione tra i composti di formula (II) e il reagente di Homer Emmons di formula (III) può essere effettuata in condizioni convenzionali di Homer Emmons come quelle sopra descritte.

Un altro reagente adatto capace di convertire un residuo della formula sopra definita in un residuo della formula (a) sopra definita è un conposto di formula (IV) :

(IV) in cui sono come definiti in relazione ai composti di formula (HI) .

In generale, il reagente di formula (IV) è in forma attivata, opportunamente in forma anionica, come una forma salificata, per esempio una forma salificata di un metallo alcalino. La reazione tra i composti di formula (III) e (IV) può essere effettuata secondo procedure note, per esempio quelle descritte in Liebigs Ann. Chem. , 703, 1967, 37.

Conversioni adatte di un composto di formula ( I ) in un altro composto di formula (I) comprendono la conversione di un composto di formula (I) in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un gruppo alcossi in un composto di formula (I) in cui X rappresenta un residuo della formula sopra definita.

La conversione di un composto di formula (I) in un altro composto di formula (I) può essere effettuata usando la procedura convenzionale adatta, per esempio la conversione sopra menzionata di un composto in cui X rappresenta un gruppo idrossi o un grippo alcossi in un composto in cui X rappresenta un residuo della formula sopra definita, può essere effettuata come segue:

(i) quando X è alcossi, mediante idrolisi basica, usando per esempio idrossido di potassio, per fornire un composto di formula (I) in cui X è idrossi,e successivo trattamento con un composto di formula H in cui hanno il valore richiesto rispettivamente di e di

di preferenza la reazione col composto di formula avviene in presenza di un agente condensante, quale N,N'-dicicloesil carbodiimmide (DCC)o dopo conversione di (I), in cui X è idrossi, nel corrispondente cloruro di acido e condensazione in presenza di una base quale trietilammina; alternativamente mediante trattamento di detto composto di formula (I) direttamente con un composto di formula in presenza di un trialchilalluminio, come trimetilalluminio, secondo procedure note, quali quelle descritte in Tetrahedron Lett., 48, 1977, 4171.

(ii)quando X è idrossi, mediante uso di procedure analoghe a quelle sopra menzionate in (i).

Un composto di formula ( II) può essere preparato secondo la sequenza di reazioni illustrata nello Schema (I) qui sotto:

Schema (I)

Le reazioni nello Schema (I) possono essere effettuate usando la procedura convenzionale appropriata, per esempio: quando rappresenta H,mediante una reazione di Claisen-Schmidt, l'aldeide (VII)può reagire con le aldeidi alifatiche (VIII) in presenza di basi quali idrossido di sodio o di potassio, fornendo il composto (II) che può essere preparato alternativamente per reazione di Wittig di un chetoderivato (VI) con il sale di fosfonio adatto, utilizzando le condizioni sopra menzionate. L’estere carbossilico (V) viene poi convertito nell'alcol corrispondente mediante un agente riducente quale DIBAH (diisobutilalluminio idruro), in qualsiasi solvente adatto quale , a una temperatura tra -10 °C e 60°C, per esempio a temperatura ambiente. Poi l'alcol intermedio viene ossidato ad aldeide (II) con un agente ossidante quale POC (piridinio clorocromato) o PDC (piridinio dicromato),preferibilmente con

Quando R2 è diverso da -H, per esenpio alchile, i composti (II) sono ottenuti direttamente dal (VI) con una reazione di Wittig o di Homer-Emmons ,con le ilidi di fosforo o i fosfonati adatti, utilizzando le condizioni sopra descritte.

I sali e/o i solvati dei composti di formula (I) possono essere preparati usando la procedura tradizionale adatta.

I composti di formula (III) e (IV) sono composti noti o possono essere preparati utilizzando metodi analoghi a quelli usati per preparare composti noti, come quelli descritti in Chem. Ber. , 97, 1964, 1713; Tetrahedron, 50, 1994, 3177; J. Am. Chem. Soc. , 70, 1948, 3569.

I composti di formula (VI) , (VII) e (VIII) sono composti noti o sono preparati impiegando metodi analoghi a quelli usati per preparare composti noti, quali quelli descritti in J. March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition (1985), Wiley Interscience .

Un composto di formula (I) o un suo sale o un suo solvato può essere isolato dai processi sopracitati secondo procedure chimiche standard. Quando richiesto è possibile determinare la stereochimica assoluta dei composti impiegando metodi convenzionali, quali cristallografia ai raggi X.

Come sopra citato, i conposti dell'invenzione sono dotati di utili proprietà terapeutiche.

La presente invenzione fornisce pertanto un conposto di formula (I) o un suo solvato farmaceuticamente accettabile, per uso come sostanza terapeuticamente attiva.

In particolare la presente invenzione fornisce un composto di formula (I) o un suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile, per uso nel trattamento e/o profilassi dell 'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.

I composti attivi o i loro sali e/o solvati farmaceuticamente accettabili sono normalmente somministrati in forme di dosaggio unitario.

Una quantità efficace per trattare la patologia sopra descritta dipende da fattori quali l'efficacia dei composti attivi, la particolare natura del sale o solvato farmaceuticamente accettabile scelto, la natura e gravità delle malattie da trattare e il peso del paziente.

Tuttavia, una dose unitaria conterrà normalmente da 0,01 a 50 mg, per esempio da 1 a 25 mg, del composto dell'invenzione. Dosi unitarie saranno normalmente somministrate una o più volte al giorno, per esempio 2, 3, 4, 5 o 6 volte al giorno, più frequentemente da 2 a 4 volte al giorno, in modo che la dose giornaliera totale sia normalmente nell'intervallo, per un adulto di 70 kg, da 0,01 a 250 mg, più frequentemente da 1 a 100 mg, per esempio da 5 a 70 mg, che equivale all'intervallo da circa 0,0001 a 3,5 mg/kg/giorno, più frequentemente da 0,01 a 1,5 mg/kg/giomo, per esempio da 0,05 a 0,7 mg/kg/giomo.

Nell' intervallo di dose sopra descritto, non sono stati riscontrati effetti tossici per i composti dell' invenzione.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per il trattamento dell' osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate in un mammifero umano o non umano, che conprende la somministrazione di una quantità efficace, non tossica di un composto di formula (I ) o di un suo sale o solvato farmaceuticamente accettabile al soggetto che necessita di tale trattamento.

In tale trattamento, il composto attivo può essere somministrato per una qualunque via adatta, per esempio per via orale, parenterale o topica. Per tale uso, il composto sarà normalmente impiegato sotto forma di una composizione farmaceutica in associazione con un veicolo, diluente e/o eccipiente farmaceutico umano o veterinario, sebbene la precisa forma della composizione dipenda naturalmente dal modo di somministrazione .

Le composizioni sono preparate per miscelazione e sono opportunamente adatte per somministrazione orale, parenterale o topica, e possono essere in forma di compresse, capsule, preparazioni orali liquide, polveri, granuli, cialde, pastiglie, polveri ricostituibili, soluzioni o sospensioni iniettabili e per infusione, supposte e dispositivi transdermici. Sono preferite composizioni somministrabili per via orale, in particolari composizioni orali solide, poiché esse sono più convenienti per l'uso generale.

Le compresse e le capsule per somministrazione orale sono normalmente presentate in dose unitaria e contengono eccipienti convenzionali quali agenti leganti, riempitivi, diluenti, agenti di pressatura, lubrificanti, disintegranti, coloranti, aromi e agenti bagnanti. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti.

Riempitivi adatti comprendono cellulosa, marmi tolo, lattosio e altri agenti simili. Disintegranti adatti comprendono amido, polivinilpirrolidone e derivati di amido quale amido sodio glicolato. Lubrificanti adatti comprendono, per esempio, stearato di magnesio. Opportuni agenti bagnanti farmaceuticamente accettabili comprendono sodio laurilsolfato.

Queste composizioni orali solide possono essere preparate con metodi convenzionali di miscelazione, riempimento, compressione o simili. Ripetute operazioni di miscelazione possono essere usate per distribuire l'agente attivo in quelle composizioni che impiegano grandi quantità di riempitivi. Tale operazioni sono ovviamente di tipo convenzionale .

Preparazioni orali liquide possono essere, per esempio, nella forma di sospensioni acquose o oleose, soluzioni, emulsioni, sciroppi o elisir o possono essere presentate come prodotti secchi da ricostituire con acqua o altri opportuni veicoli prima dell'uso. Tali preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali quali agenti sospendenti, per esempio sorbitolo, sciroppo, metilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gel di alluminio stearato o grassi idrogenati commestibili, agenti emulsionanti, per esempio lecitina, sorbitan monoleato o gomena acacia; veicoli non acquosi (che possono conprendere olii commestibili) , per esempio, olio di mandorla, olio frazionato di cocco, esteri oleosi quali esteri di glicerina, propilenglicol o alcol etilico; conservanti , per esempio metil o propil p-idrossibenzoato o acido sorbico e se desiderato agenti aromatizzanti o coloranti convenzionali.

Per la somministrazione parenterale, si preparano forme di dosaggio unitario fluide contenenti un composto della presente invenzione e un veicolo sterile. Il composto, a seconda del veicolo e della concentrazione, può essere in sospensione o in soluzione. Le soluzioni parenterali sono normalmente preparate sciogliendo il composto in un veicolo e sterilizzando per filtrazione prima della distribuzione in una opportuna fiala o flaconcino. Vantaggiosamente, nel veicolo vengono sciolti anche eccipienti e adiuvanti quali anestetici locali, agenti conservanti e tamponanti. Per aumentare la stabilità, la conposizione può essere congelata dopo la distribuzione nella fiala e l'acqua eliminata sotto vuoto.

Sospensioni parenterali sono preparate sostanzialmente allo stesso modo, salvo che il composto è sospeso anziché sciolto nel veicolo e sterilizzato per esposizione ad ossido di etilene prima della sospensione nel veicolo sterile. Vantaggiosamente, nella conposizione viene incluso un agente tensioattivo o bagnante per facilitare la distribuzione uniforme del conposto attivo.

Per la somministrazione topica, la conposizione può essere sotto forma di pomata o cerotto transdermico per la somministrazione sistemica del composto attivo e può essere preparata in maniera convenzionale, per esempio come descritto nei testi standard quali "Dermatological Formulations" - B.W. Barry (Drugs and thè Pharmaceutical Sciences -Dekker) o Harrys Cosmetico logy (Léonard Hill Books).

Come è pratica comune, le composizioni saranno accompagnate da istruzioni scritte o stampate per l'uso nell’indicazione medica prevista.

Le seguenti descrizioni, esempi e metodi farmacologici illustrano l'invenzione senza limitarla in alcun modo.

Le abbreviazioni utilizzate nel corso della descrizione e negli esempi successivi hanno i seguenti significati:

Lista delle abbreviazioni

Celite Marchio registrato per dicalite

DMF Dimetilformammide

EI Impatto Elettronico

EtOAc Acetato d'etile

MS Spettro di Massa

CI Ionizzazione Chimica

FAB POS Bombardamento Atomico Veloce/Rivelazione con Ioni Positivi TSP TermoSpray

Preparazione 1

(E)-3-(3-Idrossifenil)-2-propenaldeide

Una miscela di 3-idrossibenzaldeide (3,66 g, 30 mmol), cesio carbonato (9,78 g, 30 mmol) e (formilmetilene)trifenilfosforano (9,12 g, 30 mmol) in 1,4-diossano (50 ml) e 2,4 ml di acqua, fu riscaldata a 70°C per 7 ore. Il solvente fu rimosso sotto vuoto ed il residuo fu trattato con

filtrato ed il filtrato fu evaporato a secchezza. Il residuo fu

purificato mediante cromatografia flash (EtOAc/esano 4:6) , ottenendo 1,5 g del composto del titolo come grezzo. Dopo sgranamento con etere isopropilico, si ottennero 0,5 g (11,2%) del composto del titolo puro come polvere arancione, p.f.= 108-109*C. ;Preparazione 2 ;A) (2E)-3-[2-(5,6,7,8-Tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftil)]-2-butenoato di etile ;Ad una soluzione di trietil fosfonoacetato (27,1 g, 0,121 mol) in THF anidro (100ml) raffreddata a 0°C, una soluzione 1,6 M di n-butillitio in esano (77 mi, 0,123 mol) fu aggiunta durante un'ora, sotto azoto. L'agitazione fu continuata per altri 30 minuti, quindi 2-acetil-5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8,-tetrametilnaftalene (5,65 g, 24,5 mmol; Drugs of thè Future, 1983, 8, 432-434) fu aggiunto goccia a goccia mantenendo la temperatura a 0°C. La soluzione fu lasciata salire a temperatura ambiente e quindi scaldata a riflusso per 3 ore. Dopo raffreddamento, il solvente fu rimosso sotto vuoto e il residuo fu estratto con . Le fasi organiche furono lavate successivamente con una soluzione satura di ;una soluzione satura di NaCl, anidrificate con e portate a ;secco per fornire 6,9 g di una miscela di isomeri E e Z. La miscela fu purificata per cromatografia su colonna (esano/EtOAc 9:1) per dare 3 g (40,7%) del composto del titolo come olio. ;B ) ( 2E)- 3- [2- ( 5,6,7, 8-Tetraidro- 5,5,8, 8-tetrametilnaftil ) ] -2-butenaldeide ;Ad una soluzione di (2E)-3-[2-(5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftalenil ) ]-2-butenoato di etile (3 g, 10 mnol) in (30 ml) fu aggiunta goccia a goccia una soluzione di DIBAH 1M in esano (30 ml, 30 mmol) sotto azoto e mantenendo la temperatura tra -10 e 5°C. La soluzione fu lasciata salire a temperatura ambiente e, dopo 30 min fu aggiunta una soluzione satura di (30 mi) . La miscela fu filtrata su un pannello di Celite e la fase organica fu separata, anidrificata con e evaporata sotto vuoto per dare 2,3 g (9 mmol) dell'alcol corrispondente, come olio. L'alcol grezzo fu sciolto in (30 ml) e trattato con attivato (3,3 g, 32,2 mmol) . La miscela fu agitata per due giorni a temperatura ambiente, filtrata su un pannello di Celite e il solvente rimosso a pressione ridotta ottenendo, dopo cromatografia su gel di silice (EtOAc/esano 1:9) , 1 ,1 g (43%) del composto del titolo come olio giallo. ;Preparazione 3 ;3- [ 2- ( 5 , 6 , 7 , 8-Tetraidronaftil ) ] -2-butenaldeide ;Una miscela di Montmorillonite K10 (20 g) e trimetilortoformiato (30 ml , 274 mmol) in metanolo (15 ml) fu agitata a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo filtrazione, il precipitato umido fu aggiunto ad una soluzione di 2-acetil-5,6,7,8-tetraidronaftalene (10 g, 57 mmol) in CC14 ( 50 ml ) . La miscela fu agitata per due ore a temperatura ambiente e filtrata. Il solvente fu rimosso a pressione ridotta per fornire un olio (10,5 g) al quale furono aggiunti in atmosfera di azoto Montmorillonite K10 (50 mg) ed etil vinil etere (3,43 g, 47,6 mmol) . L'agitazione fu continuata per due ore e quindi furono aggiunti acido formico (15 ml) e formiato di sodio (4 g, 59 mmol) . Questa miscela fu scaldata a riflusso per due ore. Dopo raffreddamento, fu aggiunta acqua fredda (100 ml) e la reazione estratta con etere etilico. Le fasi organiche furono lavate in successione con una soluzione satura di una soluzione satura di ;anidrificate con ed evaporata a secchezza. Il residuo fu distillato per eliminare il composto di partenza non reagito, ottenendo 1 g (8,7%) del composto del titolo come olio giallo. ;Esempio 1 ;( 2Z , 4E ) -5-Fenil-2-metossi-2 , 4-pentadienoato di metile ;Ad una sospensione di sodio metossido (5,4 g, 0,1 mol) in toluene anidro (50 mi) venne aggiunta goccia a goccia una soluzione di metil metossiacetato (29,7 mi, 0,3 mol) e trans-cinnamaldeide (12,6 ml , 0,1 mol) . La soluzione scura ottenuta fu agitata a temperatura ambiente per 24 ore e poi trattata con acqua (100 mi) ed estratta con acetato d'etile (100 ml) . Le fasi organiche riunite furono lavate con 5% HC1 acquoso (50 ml) , acqua, anidrificate con filtrate ed evaporate sotto vuoto. Il residuo oleoso fu trattato con etere isopropilico per dare, dopo filtrazione, 9,5 g (43%) del composto del titolo come un solido di colore giallo chiaro, p.f .= 83-84°C. ;;;;;Esempio 2 ;Acido (2Z,4E) -5-fenil-2-metossi-2 , 4-pentadienoico ;Ad una soluzione di Κ0Η (4,5 g, 80 mmol) in etanolo anidro (45 ml), si aggiunse (2Z,4E)-2-metossi-5-fenil-2,4-pentadienoato di metile (9 g, 41 mmol) . La soluzione fu riscaldata a 50 °C per due ore. Dopo raffreddamento, la miscela fu evaporata a secchezza e il residuo fu acidificato con HC1 al 10% e il precipitato ottenuto fu filtrato, seccato e sgranato con etere isopropilico (100 ml) per dare 4,5 g (53,7%) del composto del titolo come polvere bianca, p.f .= 162-164*0.

Esempio 3

(2Z,4E) -5-Fenil-N- ( 4-idrossimetilfenil ) -2-metossi-2 , 4-pentadienammide

L'acido (2Z,4E)-5-fenil-2-metossi-2,4-pentadienoico (1 g, 4,9 mmol) fu sciolto in (20 mi) ed addizionato di cloruro di ossalile (0,85 ml, 9,7 mmol) . La soluzione fu agitata a temperatura ambiente per due ore sotto azoto e quindi evaporata a secco. Il cloruro acido grezzo fu sciolto in THF anidro (15 mi) ed aggiunto goccia a goccia, a temperatura ambiente, ad una miscela di 4-amminobenzil alcol (0,6 g, 4,9 mmol) e

1:1 (12 mi) . L'agitazione fu continuata per una ora.

Il solvente organico fu rimosso sotto vuoto ed il solido precipitato fu filtrato per dare, dopo cristallizzazione da isopropanolo , 1 g (66%) del conposto del titolo come polvere color crema, p.f.= 156-157 "C.

I seguenti composti furono preparati secondo la procedura descritta nell'esempio 3:

Esempio 4

( 2Z , 4B ) -N-Esil-5-f enil-2-metossi-2 , 4-pentadienammide

Esempio 5

( 2Z , 4E )-N-Benzil-5-fenil-2-metossi-2 , 4-pentadienammide . p.f .= 123-124 °C.

Esempio 10

(2Z,4E)-5-Fenil-2-metossi-2,4-pentadienoato di benzile .

Una miscela di acido (2Z,4E)-5-fenil-2-metossi-2,4-pentadienoico (0,5 g, 2,45 mmol) , anidro (0,35 g, 2,45 mmol) e benzil bromuro (0,3 ml, 2,5 mmol) in DMF anidra (5 ml) fu agitata a temperatura ambiente per due giorni. Dopo aggiunta di acqua distillata (25 ml) la sospensione fu estratta con (3 x 50 ml) . Le fasi organiche furono lavate con una soluzione satura di NaCl, anidrificate con ed evaporate sotto vuoto. Il residuo fu purificato per cromatografia su colonna (EtOAc/ esano 1:9) per fornire 0,35 g (48,5%) del composto del titolo come olio.

Il seguente composto fu preparato secondo la procedura descritta nell' esempio 10

Esempio 11

(2Z,4E)-5-Fenil-2-metossi-2,4-pentadienoato di amile. Olio.

Esempio 12

( 2Z , 4E }-4-Etil-5-fenil-2-metossi-2 , 4-pentadienoato di metile. Ad una miscela di sodio metossido preparato di fresco (2,7 g, 50 mmol) in toluene anidro (80 ml) fu aggiunta goccia a goccia una soluzione di (E)-2-etil-3-fenil-2-propenaldeide (8 g, 50 mmol) {J.A.C.S., 1948, 3569) e metil metossiacetato (10 ml, 0,1 mol). La sospensione fu agitata a 50°C per 24 ore. Dopo raffreddamento, lamiscela fu portata a secco e ripresa con acqua fredda (50 ml) ed etile acetato (100 ml). La fase organica fu separata e lavata con HC15%, una soluzione satura di NaCl, anidrificata con ed evaporata sotto vuoto. L'olio residuo fu distillato (180°C, 0,01 mbar) per fornire 5,6 g (45,5%) del composto del titolo come olio di colore giallo chiaro.

Esempio 13

(2Z,4E)-5-Fenil-2-metossi-4-pentil-2,4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-fenil-2-metossi-4-pentil-2,4-pentadienoatodimetile.

NaH 60% in dispersione oleosa (0,3 g, 7,41 mmol) fu lavato con pentano (2x3 ml) e quindi sospeso inTHF anidro (15 mi) sotto azoto. Trimetil 2-metossifosfonoacetato (1,6 g, 7,41 mmol), sciolto in THF anidro (5 ml), fu aggiunto goccia a goccia e la miscela di reazione fu agitata a 40°C per 40 minuti. Una soluzione di α-amilcinnamaldeide (1 g, 4,9 mmol) in THF anidro (5 ml) fu aggiunta goccia a goccia e la sospensione fu agitata per tre giorni a temperatura ambiente. La reazione fu bloccata con acqua ed estratta con (3x10 ml). Le fasi organiche furono lavate con una soluzione satura di NaCl, anidrificate con ed evaporate sotto vuoto. Il residuo fu purificato mediante cromatografia flash {esano/EtOAc 9:1) per dare 16 mg (1,1%) dell' isomero (2Z,4E) e 160 mg (11,3%) dell'isomero (2E,4E) , entrambi come olii dal colore giallo chiaro.

(2Z,4E)-5-Fenil-2-metossi-4-pentil-2, 4-pentadienoato di metile :

(2E,4E)-5-Fenil-2-metossi-4-pentil-2, 4-pentadienoato di metile'.

Esempio 14

(2Z,4E)-5-Fenil-4-metil-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-fenil-4-metil-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile.

Questi composti furono preparati secondo la procedure dell'Esempio 13 a partire da a-metilcinnamaldeide (2,92 g, 20 mmol), NaH 60% (0,8 g, 20 mmol) e trimetri 2-metossifosfonoacetato (3,6 g, 17 mmol). Dopo purificazione per cromatografia flash, furono ottenuti 0,13 g (2,8%) dell'isomero (2Z,4E) come solido, p.f.= 60-61"C e 0,1 g (2%) dell'isomero (2E,4E)come olio incolore.

(2Z,4E)-5-Fenil-4-metil-2-metossi-2, 4-pentadienoato di metile :

(2E,4E)-5-Fenil-4-metil-2-metossi-4-2, 4-pentadienoato di metile :

Esempio 15

{2Z,4E)-4-Etil-2-metossi-5-(4-metossifenil)-2, 4-pentadienoato di metile e { 2E , 4E ) -4-etil-2-metossi-5- ( 4-metossifenil ) -2 , 4-pentadienoato di metile.

Questi composti furono preparati secondo l'Esempio 13 a partire da aetil-4-metossicinnamaldeide (0,5 g, 2,6 mmol) , NaH 60% (0,12 g, 3 mmol) e trimetil 2-metossifosfonoacetato (0,64 g, 3 mmol) . Dopo purificazione per cromatografia flash, furono ottenuti 64 mg (9%) dell' isomero (2Z,4E) come solido, p.f.= 68-69°C e 64 mg (9%) dell'isomero (2E,4E) come solido, p.f .= 65-66<e>C.

(2Z, 4E)-4-Etil-2-metossi-5-( 4-metossifenil )-2, 4-pentadienoato di metile:

( 2E, 4E }-4-Etil-2-metossi-5- ( 4-metossifenil )-2 , 4-pentadienoato di metile :

;

Esempio 16

(2Z, 4E)-5- (4- tert-Butilfenil )-4-metil-2-metossi-2 , 4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-(4-tert -butilfenil)-4-metil-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile.

Questi composti furono preparati secondo l'Esempio 13 a partire da ametil-4-tert-butilcinnamaldeid (1 g, 4,94 mmol) , NaH 60% (0,3 g, 7,5

mmol ) e trimetil 2-metossifosfonoacetato (1,6 g, 7,4 mmol) . Dopo

purificazione per cromatografia flash, furono ottenuti 0,227 g (16%)

dell'isomero (2Z,4E) come solido, p.f .= 40-41°C e 0,123 g (8,6%)

dell'isomero (2E,4E) come olio di colore giallo chiaro.

(2Z, 4E)-5-( 4-tert-Butilfenil )-4-metil-2-metossi-2, 4-pentadienoato di

(2E, 4E)-5-( 4-tert-Butilfenil )-4-metil-2-metossi-2, 4-pentadienoato di

Esempio 17

(2Z ,4B)-2-Metossi-5- (2-nitrofenil )-2 ,4-pentadienoato di metile.

Questo conposto fu preparato secondo l'Esempio 13 a partire da 4-nitrocinnamaldeide (0,5 g, 2,82 mmol), NaH 60% (0,13 g, 3,25 mmol) e

trimetil 2-metossifosfonoacetato (0,69 g, 3,25 mmol). Dopopurificazione

per cromatografia flash, 127 mg (17%) di composto del titolo furono

ottenuti come solido giallo, p.f.= 66-70°C.

.

3H) .

MS (EI, 70 eV, 200 mA) : 263 (M+); 204; 172.

Esempio 18

( 2Z , 4E ) -2-Metossì-5- ( 2-metossifenil ) -2 , 4-pentadienoato di metile.

La resina Amberlite IRA 68 (0,82 g, 1,82 meq) fu sospesa in

anidro (5 ml) sotto di azoto e si aggiunse bromuro di metil 2-metossi-2 (trifenilfosfonio) acetato (Chem. Ber. , 97, 1964, 1713) (0,6 mg, 1,35 mmol ) . La miscela fu agitata 20 minuti a temperatura ambiente . 2-Metossicinnamaldeide (0,146 mg, 0,9 mmol) fu aggiunta goccia a goccia e la sospensione fu agitata durante la notte a temperatura ambiente e quindi scaldata a riflusso per 24 ore. Il solvente venne quindi evaporato a pressione ridotta. Il residuo fu ripreso con etile acetato e lavato con una soluzione satura di acido citrico, una soluzione di

acquoso, una soluzione satura di NaCl, anidrificato con ed

evaporato sotto vuoto. Il residuo fu purificato mediante cromatografia flash (esano/EtOAc 4:1) per fornire 44 mg (20%) del composto del titolo come olio incolore.

Esempio 19

( 2Z , 4E )-5-( 3-Idrossifenil )-2-metossi-2 , 4-pentadienoato di metile e (2E,4E)- 5- (3-idrossifenil )-2-metossi-2, 4-pentadienoato di metile.

Una miscela di ( E )-3-( 3-idrossifenil )-2-propenaldeide (0,5 g, 3,4 mmol) ,

(1,65 g, 5,07 mmol) e trimetri 2-metossifosfonoacetato (0,95 g, 4,5 mmol) in 1,4-diossano (15 mi) e 0,8 ml di acqua fu agitata a 50°C per 12 ore. Dopo raffreddamento, il solvente fu rimosso sotto vuoto e il residuo fu trattato con acetato di etile (50 ml) , filtrato e la fase organica fu lavata con 5% HC1, anidrificata con ed evaporata a secchezza. Il residuo fu purificato per cromatografia su colonna

per fornire 0,35 g (43,9%) dell'isomero (2Z,4E) come

polvere arancione, p.f .= 97-99°C e 0,05 g (6,3%) dell'isomero (2E,4E) come olio marrone.

(2Z,4E)-5-(3-Idrossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile·.

(2E,4E)-5-(3-Idrossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile:

Esempio 20

(2Z,4E)-5-(2-Idrossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-(2-idrossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile.

Una miscela di (E)-3-(2-idrossifenil)-2-propenaldeide (0,7 g, 4,7 mmol), potassio carbonato anidro (1,05 .g, 7,6 mmol) e trimetril 2-metossifosfonoacetato (1,35 g, 6,4 mmol) in 1,4-diossano (15 ml) fu agitata a 70°C per 24 ore. Dopo raffreddamento, il solvente fu evaporato sotto vuoto e il residuo fu trattato con acetato di etile (50 ml) , filtrato e la fase organica fu lavata con HC1 5%, anidrificata con

ed evaporata a secchezza. Il residuo fu purificato per

cromatografia su colonna per fornire 0,12 g (10,9%) dell' isomero (2Z,4E) come polvere marrone, p.f.= 72-74°C e 0,15 g (13,6% ) dell'isomero (2E,4E) come polvere arancione, p.f .= 92-94"C.

(2Z,4E)-5-(2-Idrossifenil)-2-metossi-2, 4-pentadienoato di metile :

(2E,4E)-5-(2-Idrossifenil)-2-metossi-2, 4-pentadienoato dì metile:

Esempio 21

(2Z,4E )-5- ( 4-Acetossifenil)-2-metossi-2 , 4-pentadienoato di metile e (2E, 4E)-5-( 4-idrossifeni )-2-metossi-2 ,4-pentadienoato di metile.

Questi composti furono preparati secondo l'Esempio 19 a partire da 4-acetossicinnamaldeide (0,64 g, 3,34 mmol), C (1,65 g, 5,07 mmol) e trimetil 2-metossifosfonoacetato (0,95 g, 4,5 mmol). Dopo purificazione per cromatografia flash furono ottenuti, 20 mg (2%) dell'isomero (2Z,4E) come polvere bianca, p.f.= 110-115°C e 20 mg (2,5%) dell'isomero (2E,4E) come solido, p.f .= 151-153°C.

(2Z,4E)-5-(4-Acetossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile :

(2E,4E)-5-(4-Idrossifenil)-2-metossi-2,4-pentadienoato di metile:

Esempio 22

( 2Z , 4E ) -2-Metossi-5- ( 4-clorofenil ) -2 , 4-pentadienoato di metile.

Una soluzione di 4-clorocinnamaldeide (1,9 g, 11.4 mmol) in cloruro di metilene (40 ml) fu trattata con bromuro di 2-metossi-2-trifenilfosfonio acetato di metile (4.95 g, 11.4 mmol) e successivamente furono gocciolati a temperatura ambiente 2 ml (11,4 mmol) di DIPEA. La miscela di reazione fu agitata a temperatura ambiente per 4 ore e quindi lavata con una soluzione di HC1 10% (10 ml) , una soluzione satura di (10 mi) , una soluzione satura di sodio cloruro, anidrificata su ed evaporata sotto vuoto. Il residuo fu diluito con etere etilico, filtrato e concentrato sotto vuoto. Il solido ottenuto fu cristallizzato con cicloesano dando, dopo filtrazione, 0,2 g (7%) del prodotto del titolo, p . f . — 92-93°C.

Esempio 23

(2Z ,4E)-2-Metossi-5- (3 ,4-diclorofenil )-2 , 4-pentadienoato di metile .

Il composto fu preparato seguendo l 'Esempio 22 partendo da 3,4-diclorocinnamaldeide (3,8 g, 18,9 mmol), DBU (2,8 ml, 18,9 mmol) e bromuro dì 2-metossì-2-trifenilfosfonio acetato di metile (8,41 g, 18,9 mmol) . Dopo la purificazione il composto fu cristallizzato con cicloesano a dare 1,1 g (20,2%) del composto del titolo, p.f .= 96-97°C. Esempio 24

(2Z,4E)-2-Metossi-5-(4-dimetilamminofenil )-2,4-pentadienoato di metile. Questo composto fu preparato seguendo l'Esempio 22 partendo da 4-dimetilammino cinnamaldeide (1,75 g, 10 mmol) , DBU (1,5 ml, 10 mmol) e bromuro di 2-metossi-2-trifenilfosfonio acetato di metile (4,45 g, 10 mmol ). Dopo la purificazione il composto fu triturato con isopropanolo a dare 0,6 g (23%) del composto del titolo, p.f .= 84-86°C.

Esempio 25

(2Z,4E)-5-Metil-2-metossi-5-[2-{5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftil)]-2,4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-metil-2-metossi-5-[2-(5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftil )]-2,4-pentadienoato di metile.

Ad una soluzione di trimetri 2-metossifosfonoacetato (1,5 g, 7,07 mmol) in THF anidro (45 ml), NaH 60% dispersione in olio (0,3 g, 7,5 mmol) e (2E)-3-[2-(5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftil)]-2-butenaldeide (1,2 g, 4,7 mmol) in THF anidro (12 mi) furono aggiunti a piccole porzioni sotto azoto secondo la procedura descritta nell'Esempio 13. Dopo la usuale lavorazione e purificazione mediante cromatografia su colonna furono ottenuti 0,35 g (21,7%) dell'isomero (2Z,4E) come polvere bianca,p.f.= 77-80°C e 0,3 g (18,6%)dell'isomero (2E,4E)come olio. ( 2Z, 4E)-5-Metìl -2-metossi-5-[2-( 5, 6, 7, 8-tetraidro-5, 5, 8, 8-tetrametilnaftil)]-2,4-pentadienoato di metile: : 7,42 (t, IH); 7,30

Esempio 26

(2Z,4E ) - 5-Metil- 2-metossi- 5- [ 2- ( 5 , 6 , 7 , 8-tetraidronaftil ) ]-2, 4-pentadienoato di metile e (2E,4E)-5-metil-2-metossi — 5-[2-(5,6,7,8-tetraidronaftil ) ]-2 , 4-pentadienoato di metile. Ad una soluzione di trimetil 2-metossifosfonoacetato {1 g, 4,7 mmol ) in THF anidro (10 ml) , NaH 60% dispersione in olio (0,2 g, 5 mmol) e 3-[2-(5, 6,7,8-tetraidronaftil)]2-butenaldeide (0,9 g, 4,5 mmol) in THF anidro (10 ml) furono aggiunti a piccole porzioni in atmosfera di azoto secondo la procedura descritta nell'Esempio 13. Dopo la lavorazione usuale e la purificazione mediante cromatografia su colonna furono ottenuti 0,34 g (26,4%) dell'isomero (2Z,4E) come olio e 0,23 g (17,8%) dell'isomero (2E,4E) come olio.

(2Z, 4E)-5-Metil-2-metossi-5-[2-( 5, 6, 7 , 8-tetraidronaftil ) ]-2,4-

Esempio 27

(2Z,4E)-5-Metil-2-metossi -5-(2-naftil)-2,4-pentadienoato di metile e (2E,4E) -5-metil-2-metossi — 5-( 2-naftil )-2 , 4-pentadienoato di metile. Questi composti furono preparati seguendo l'Esempio 22 partendo da (2E)-3-(2-naftil)propenaldeide (0,1 g, 0,55 mmol) , DBU (0,123 mi, 0,825 mmol) e bromuro di 2-metossi-2-trifenilfosfonio acetato di metile (0,37 g, 0,825 mmol) . Dopo la usuale lavorazione della reazione e la purificazione su colonna cromatografica, furono ottenuti 0,071 g (48,1%) dell' isomero (2Z,4E) come polvere gialla, p.f .= 96-97 °C e 0,015 g (10,1%) dell' isomero (2E,4E) come polvere gialla, p.f .= 99-101 °C.

Saggi biologici

E' noto che, in seguito all'adesione alla superficie ossea, una adenosin trifosfatasi (ATPasi) H<4 >elettrogenica è polarizzata alla interfaccia osteoclasto-osso La pompa trasporta notevoli quantità di protoni nel microambiente di riassorbimento promuovendo la mobilizzazione del minerale osseo e creando il pH acido richiesto dalle collagenasi per degradare la matrice ossea.

La natura vacuolare della pompa protonica dell ' osteoclasto fu originalmente riconosciuta da Blair [H.C. Blair et al., Science, 245, 855 (1989)] e poi confermata da Bekker [P.J. Bekker et al., J. Bone.

Min. Res. , 5, 569 (1990)] e Vaananen [K.K. Vaananen et al. , J. Cell. Biol. , 111, 1305 (1990)] . L'evidenza era basata su preparazioni di frammenti di membrana da osteoclasti di uccello (ottenuti dall'osso midollare di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio). Le vescicole di membrana ottenute si acidificano in risposta all'ATP, il che è facilmente valutato misurando la diminuzione di fluorescenza dell'arancio di acridina, una base debole che si accumula nei compartimenti acidi.

Le caratteristiche biochimiche indicavano che la pompa pròtonica dell'osteoclasto apparteneva alle ATPasi di tipo vacuolare, poiché il trasporto protonico era inibito dalla N-etilmaleimmide (NEM), un reagente sulfidrilico, e dalla bafilomicina A1, un inibitore selettivo delle vacuolari [J.E. Bowman et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 7972 (1988)] , mentre non era inibito dalla ouabaina, un inibitore di Na<+>/K<+>-ATPasi; dall ' ortovanadato di sodio, un inibitore delle p-ATPasi, o da parte di omeprazolo o SCH 28080, entrambi inibitori della gastrica [J.P. Mattson et al. , Acta Physiol. Scand. , 146, 253 (1992)] .

E' noto che gli inibitori specifici delle ATP-asi vacuolari, quali la bafilomicina Α1 , sono in grado di inibire il riassorbimento osseo in colture di osteoclasti [K. Sundquist et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 168, 309-313 (1990)] .

INIBIZIONE DEL TRASPORTO PROTONI CO v-ATP-asi DIPENDENTE IN VESCICOLE DI MEMBRANE

Preparazione di microsomi grezzi da osso di galline ovaiole sottoposte a dieta priva di calcio.

Furono preparate vescicole da osso midollare ottenuto da tibie e femori di galline ovaiole che erano sottoposte a dieta priva di calcio per almeno 15 giorni. In breve, frammenti ossei furono prelevati con uno scalpello (lama 24) , sospesi in 40 mi di terreno di isolamento (0,2 M saccarosio, 50 mM KC1, 10 mM Hepes, 1 mM EGTA, 2 mM ditioteitrolo, pH 7,4) e filtrati attraverso una rete di nylon con pori da 100 μm. L'intera procedura era effettuata a 4°C. Dopo omogeneizzazione con un omogeneizzatore (20 colpi) in 40 mi di terreno di isolamento, fu effettuata una centrifugazione iniziale (6500 gmax x 20 min) per rimuovere i mitocondri e lisosomi. Il surnatante fu centrifugato a 100.000 gmax per 1 h e il pellet fu raccolto in 1 ml di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote da 200 μl, immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a -80 °C. Il contenuto proteico fu determinato inpiegando un kit colorimetrico Biorad secondo Bradford [M. Bradford, Anal. Biochem. , 72, 248 (1976)] . Per il saggio di trasporto protonico, si impiegarono 5-10 μl di membrane.

Purificazione di membrane di osteoclasto. 1 ml di vescicole microsiomali grezze preparate come sopra fu applicato (circa 0,2 ml per provetta) sulla parte superiore di un gradiente discontinuo di saccarosio costituito da 3,5 ml di saccarosio al 15, 30 e 45% (p/p) nel terreno di isolamento e centrifugato a 280.000 gmax per 2 ore (rotore SW 41 Ti). Dopo centrifugazione le interfacce al 30-45% di saccarosio furono raccolte, diluite di circa 20 volte nel terreno di isolamento e centrifugate a 100.000 gmax per 1 ora (rotore SW 28) . Il pellet fu quindi risospeso in 1 ml di terreno di isolamento, suddiviso in aliquote e congelato in azoto liquido e conservato a -80°C fino al momento dell ' impiego.

il trasporto protonico nelle vescicole di membrana fu valutato semiquantitativamente misurando la pendenza iniziale della diminuzione di fluorescenza dell'arancio di acridina (eccitazione 490 nm; emissione 530) dopo aggiunta di 5-20 μl di vescicole di membrana in 1 ml di tampone contenente 0,2 M saccarosio, 50 mM KCl , 10 mM Hepes pH 7,4 , ImM

ATP 1 mM CDTA, 5 μΜ valinomicina e 4 μΜ arancio di acridina. La

reazione fu avviata aggiungendo I risultati furono espressi come percentuale della media dei due controlli.

Inibizione della ATPasi sensibile alla bafilcmicina: fu valutata in vescicole di membrana purificate misurando il rilascio di fosfato inorganico (Pi) durante 30 min. di incubazione a 37 °C in una piastra da 96 pozzetti in presenza o in assenza di bafilomicina Al. IL terreno di reazione conteneva ImM ATP, 10 mM HEPES-Tris pH 8, 50 μΜ valinomicina , 5 μm nigericina, 1 mM CDTA-Tris, 100 pM armonio molibdato, 0,2 M saccarosio e membrane (20 μg proteina/ml ) . La reazione fu iniziata con

(pipetta a 8 canali) e interrotta, dopo 30 min, per aggiunta di 4

volumi del reagente verde malachite (pipetta a 96 canali) , preparato secondo Chan [Anal. Biochem. 157, 375 (1986) ] . L ' assorbenza a 650 nm fu misurata dopo 2 min, usando un lettore per micropiastre. I risultati sono espressi come μmol (Pi) x mg di proteina<-1 >x ora<-1 >e, per ciascun esperimento, rappresentano la media ± esm dei triplicati.

INIBIZIONE DEL RIASSORBIMENTO OSSEO

Il riassorbimento osseo può essere valutato come precedentemente descritto in letteratura [T.J. Chambers et al. , Endocrinology, 1985, 116, 234] . Brevemente, si disaggregarono meccanicamente osteoclasti da ossa lunghe di ratti neonati in terreno 199 (Flow, UK) tamponato con Hepes. La sospensione fu agitata con una pipetta e i frammenti più grandi furono lasciati depositare per 30 secondi. Le cellule furono quindi aggiunte a due pozzetti di una piastra multipozzetto contenenti fettine ossee (ognuna della misura di 12 mm2) . Dopo 15 minuti a 37°C le fettine ossee furono rimosse, lavate in terreno 199 e poste in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti. Queste furono incubate per 24 ore in un volume totale di 2 ml di terreno di coltura, consistente di siero fetale di vitello al 10% in MEM tamponato con Hanks, in presenza o in assenza di farmaco. Il numero di osteoclasti e il riassorbimento osseo furono quantificati per microscopia a scansione laser confocale (CLSM) : le fettine ossee furono fissate con glutaraldeide al 2% in 0,2 M tampone cacodilato e gli osteoclasti su ogni fettina ossea furono colorati per fosfatasi acida tartrato-resistente . Dopo la conta del numero di cellule colorate in rosso, grandi e multinucleate, le fettine ossee furono immerse in ipoclorito sodico al 10% per 60 minuti per rimuovere le cellule, lavate in acqua distillata e rivestite a spruzzo con oro.

L'intera superficie di ogni fettina ossea fu quindi esaminata in CLSM. Il numero e la dimensione delle cavità osteoclastiche , l'area piana e il volume dell'osso riassorbito furono registrati. I risultati furono espressi come numero medio di cavità per osteoclasto, area media per osteoclasto o volume medio per osteoclasto.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula ( I ) : o un suo sale, o un suo solvato, in cui: rappresenta un gruppo alchile o un gruppo fenile sostituito o non sostituito; rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno o alchile; rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, idrossi, ammino , alcossi, alchilcarbonilossi, fenossi eventualmente sostituito, benzilossi eventualmente sostituito, alchilamnino, dialchilammino , cloro, alchile, carbossi, carbalcossi, carbammoile , alchilcarbammoile eppure rappresentano insieme una catena -alchilenica satura o insatura, ognuno degli atomi di carbonio della quale è eventualmente sostituito con fino a tre gruppi alchile; e X rappresenta idrossi, alcossi o un gruppo di formula in cui e rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno, alchile, alchile sostituito, fenile, fenile sostituito, fenilalchile o eteroarilalchile; oppure , insieme all ' atomo di azoto a cui sono legati, rappresentano un gruppo eterociclico saturo.
2. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresenta un gruppo metile.
3. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano ciascuno indipendentemente idrogeno
4. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresenta un gruppo idrogeno, idrossi, aloossi o alchilcarbonilossi.
5. Conposti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano insieme .
6. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui i sostituenti dei gruppi alchilici rappresentano idrossi.
7. Composti secondo la rivendicazione 1,in cui Rs to Rfc rappresentano benzile.
8. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui Rs e/o Rt rappresentano fenile.
9. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui i sostituenti dei gruppi fenilici o benzilici in rappresentano idrossialchili, in particolare idrossimetile.
10. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui rappresentano insieme gruppi morfolinile.
11. Composti secondo la rivendicazione 1, in cui X rappresenta metossi.
12. Conposizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo un composto secondo le rivendicazioni 1-8.
13. Uso dei composti secondo le rivendicazioni 1-8 per la preparazione un medicamento utile per il trattamento e/o la profilassi dell'osteoporosi e delle malattie osteopeniche correlate.