DE10036854A1

DE10036854A1 - Neue kristalline Form von 6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b] thiophenhydrochlorid

Info

Publication number: DE10036854A1
Application number: DE10036854A
Authority: DE
Inventors: Julie Kay Bush; Preston Charles Conrad; Merlyn Gerard Flom; Wayne Douglas Luke
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2001-03-01
Also published as: MD20000162A; SE0002792D0; GB0018641D0; HK1035370A1; FR2796944A1; CN1288007A; MD2336F2; CA2314682A1; MXPA00007461A; HUP0003001A2; NL1015821C2; LV12623B; AR031073A1; WO2001009116A2; ITMI20001759A0; BE1013411A3; AU6335600A; IL137553A0; SI20426A; BR0003209A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues kristallines Hydrat von 6-Hydroxy-3-(4- 2-(piperidin-1-yl)ethoxyF-phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl) DOLLAR A benzo bFthiophenhydrochlorid und Verwendungen für dieses, einschließlich der Hemmung von Krankheitszuständen, die assoziiert sind mit Östrogenverminderung, einschließlich kardiovskulärer Erkrankung, Hyperlipidämie und Osteoporose, und der Hemmung von anderen pathologischen Zuständen, wie Endometriose, Uterusfibrose, Östrogen-abhängiger Krebs (einschließlich Brust- und Uteruskrebs), Prostatakrebs, benigne Prostatahyperplasie, ZNS Störungen, einschließlich Alzheimerscher Erkrankung, Prävention von Brustkrebs und Hochregulation von ChAt.

Description

6-Hydroxy-3-(4-[2-piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (Arzoxifen) wurde als erstes allgemein in US 5 510 357 A beschrieben und wurde in US 5 723 474 A und der EP 0 729956 A spezifisch offenbart. Arzoxifen ist ein nicht-steroidaler gemischter Östrogenantagonist/-agonist, der unter anderem zur Verringerung des Serumcholestesterins und zur Hemmung der Hyperlipidämie, Osteoporose, Östrogen-abhängigen Krebsarten, einschließlich Brust- und Uteruskrebs, Endometriose, ZNS Störungen, wie Alzheimersche Erkrankung, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta und der Restenose brauchbar ist.

Genauer gesagt ist Arzoxifen brauchbar und daher in klinischer Untersuchung zur Behandlung des Rezeptor-positiven metastatischen Brustkrebses, der adjuvanten Behandlung von Rezeptor-positiven Patienten nach einer geeigneten systemischen oder lokalen Therapie, der Verringerung des Wiederauftretens von invasivem und nicht-invasivem Brustkrebs, und der Verringerung des Auftretens von invasivem Brustkrebs und Ductalcarzinom in situ (DCIS). Arzoxifen ist auch zur Kombination mit Bestrahlungstherapie, Aromataseinhibitoren, LHRH Analoga und Acetylcholinesteraseinhibitoren (AChE) brauchbar.

Analysen von Bulkarzoxifen, mittels Röntenbeugung am Pulver (XRD), Thermogravimetrie (TGA), Protonenkernmagnetresonanz (¹H NMR) und Karl Fischer (KF), das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren isoliert wurde, zeigen, daß dieses Material hydratisiert und wenig kristallin ist und variable Mengen an organisch flüchtigen Anteilen (Ethylacetat) im Kristallgitter enthält.

Wenig kristalline Materialien sind typischerweise weniger zur Formulierungsverarbeitung erwünscht als hochkristalline Materialien. Zusätzlich ist es im allgemeinen nicht erwünscht, Pharmazeutika, die wesentliche Mengen an organischen Lösemitteln enthalten (beispielsweise Ethylacetat) aufgrund der potentiellen Lösemitteltoxizität für den Empfänger hiervon und der Veränderungen in der Stärke des Pharmazeutikums durch das Lösemittel zu formulieren.

Obwohl das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellte Arzoxifen als Pharmazeutikum verwendet werden könnte, wäre es äußerst erwünscht und vorteilhaft, eine kristallinere Form von Arzoxifen zu finden, die kein organisches Lösemittel innerhalb des Kristallgitters enthält und reproduzierbar und effizient im kommerziellen Maßstab hergestellt werden könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue nicht-stöchiometrische hydratisierte kristalline Form von 6- Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (F-I) mit einem Röntgenbeugungsmuster, das die folgenden Peaks umfaßt: 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2 und 20,6 ± 0,2° in 2 θ, wenn es aus einer Kupferbestrahlungsquelle erhalten wird.

Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung, die F-I, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und wahlweise Östrogen, wahlweise Progestin, wahlweise einen Aromataseinhibitor, wahlweise ein LHRH Analogon und wahlweise einen Acetylcholinesterase (AChE) Inhibitor umfaßt.

Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung von F-I zur Hemmung von pathologischen Zuständen, wie Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne Prostatahyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, Hyperlipidämie, ZNS Störungen und Alzheimersche Erkrankung und zur Verwendung von F-I zur Herstellung eines Arzneimittels zu Hemmung derselben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Verwendung von F-I zur Hochregulierung von Cholinacetyltransferase (ChAT) und zur Verwendung von F-I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hochregulierung derselben.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 ist eine repräsentative Differentialscanningkalorimetrie (DSC)/TGA Messung von S-II.

Die Fig. 2 ist eine repräsentative DSC/TGA Messung von F-I.

Die Fig. 3 ist eine repräsentative DSC/TGA Messung von F-III.

Die Fig. 4 zeigt Feuchtigkeitssorptionsisothermen für F-I und F-III.

Die Fig. 5 zeigt eine Desolvatisierung von S-II als Funktion der Trocknungszeit und der Temperatur.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bulk-Arzoxifen, das durch das in US 5 723 474 A beschriebene Verfahren (Beispiel 41, Kristallisation aus einem Gemisch aus Ethanol und Ethylacetat, Filtration und Trocknung des Filterkuchens im Vakuum bis zu einem konstanten Gewicht bei Raumtemperatur) hergestellt wurde, wird durch XRD charakterisiert und als wenig kristallin befunden. Die ¹H NMR bestätigt, daß das Bulk-Material 6% Ethylacetat enthält.

Das in US 5 723 474 A beschriebene Kristallisationsverfahren wird anschließend so modifiziert, daß Ethanol zu einer Suspension aus rohem Arzoxifen in Ethylacetat am Rückfluß gegeben wird. Nach dem Abkühlen und der Vakuumfiltration ist der Feststoff, der aus diesem modifizierten Verfahren resultiert, ein hochkristallines gemischtes Ethylacetat/Wasser Solvat von Arzoxifen (hierin als S-II) bezeichnet, wobei später gefunden wurde, daß es ein Ausgangsmaterial für F-I ist.

F-I kann durch Entfernen des Ethylacetats aus dem S-II Kristallgitter durch Vakuumtrocknung/ Annelierung von S-II bei erhöhten Temperaturen hergestellt werden. Die Zeit und die Temperatur, die zur Annelierung von S-II unter Bildung von F-I erforderlich sind, variieren von Charge zu Charge, liegen aber typischerweise im Bereich von 5 Tagen bei um die 100°C. Es sind hohe Temperaturen erforderlich, um die Umwandlung von S-II zu F-I durch dieses Verfahren zu bewirken, da die Aufschlämmung von S-II in Wasser bei Umgebungstemperatur oder die Lagerung einer Probe bei 98% relativer Luftfeuchtigkeit für 3 Wochen keine Umwandlung zu F-I ergibt. Darüberhinaus desolvatisiert eine Trocknung von S-II in einem Konvektionsofen bei hohen Temperaturen ebenfalls das Material nicht, was nahelegt, daß ein Vakuum ebenfalls erforderlich ist, um das Ethylacetat aus dem S-II Kristallgitter zu ziehen.

Vorzugsweise wird F-I leicht bei Umgebungstemperatur durch die Kristallisation von Arzoxifen (oder jedem Polymorph oder Solvat hiervon) aus Tetrahydrofuran hergestellt und isoliert. Die Kristallisation wird vorzugsweise durch anfängliches Lösen von Arzoxifen in nassem Tetrahydrofuran (1-10 Volumenprozent Wasser, vorzugsweise 2,5-7,5% und am bevorzugtesten 4,5 bis 5,5%), gefolgt von einer Entfernung dieses Wassers durch atmosphärische Destillation ausgeführt. Ein Beispiel dieser Kristallisation ist später in Beispiel 2 beschrieben. Wenn F-I durch dieses verbesserte Kristallisationsverfahren hergestellt wird, kann man eine Gesamtmenge an verwandten Substanzen (TRS) von < 0,5% erwarten.

Geeignetes Arzoxifenausgangsmaterial für die obige Kristallisation umfaßt ist aber nicht beschränkt auf S- II, F-I, Arzoxifen, das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, oder jedes Gemisch hiervon. Es ist nicht wichtig, mit welcher Arzoxifenform man beginnt, da die Kristallisation aus Tetrahydrofuran gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren zu F-I Kristallen führt. Für die Synthese im Produktionsmaßstab von F-I kann es vorteilhaft sein, die Kristallisation mit F-I anzuimpfen.

F-III, ein weiteres nicht-stöchiometrisches Hydrat von Arzoxifen, wird leicht bei Umgebungstemperatur durch Kristallisation von Arzoxifen (oder jedes Polymorphs/Solvats hiervon) aus einem Gemisch aus Isopropylalkohol (IPA) und Wasser hergestellt und isoliert. Das Verhältnis von Wasser zu IPA (V : V) beträgt im allgemeinen etwa 1 : 1 bis 9 : 1. Bevorzugter liegt das Verhältnis zwischen 2,5 : 1 und 5,6 : 1. Am bevorzugtesten liegt das Verhältnis zwischen 3 : 1 und 5,6 : 1. Das Verhältnis von IPA zu Wasser ist nicht entscheidend, um die Kristallisation von F-III auszulösen, beeinflußt aber die Ausbeute. Für die Synthese im Produktionsmaßstab von F- III kann es vorteilhaft sein, die Kristallisation mit F-III anzuimpfen. Geeignetes Arzoxifenausgangsmaterial für die obige Kristallisation umfaßt ist aber nicht beschränkt auf S-II F-I, Arzoxifen, das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, oder jedes Gemisch hiervon.

Charakterisierung und Differenzierung von S-II F-I und F-III

DSC/TGA und XRD Methoden werden zur Charakterisierung von S-II, F-I und F-III verwendet. TGA ist oft sehr wertvoll, um zwischen verschiedenen festen Formen eines Materials zu unterscheiden, da die Temperatur(en), bei denen eine physikalische Veränderung im Material auftritt, gewöhnlich für das Polymorph oder Solvat charakteristisch sind. Die DSC ist eine Technik, die oft verwendet wird, um Verbindungen auf Polymorphismus und Solvatbildung zu screenen. Schließlich ist XRD eine Technik, die die Fernordnung in einem kristallinen Material bestimmt.

Durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestelltes Arzoxifen ergibt XRD Muster mit schwachen Signal-zu-Rausch Verhältnissen und einer erhöhten Grundlinie, was ein wenig kristallines Material anzeigt. Daher werden Vergleiche von F-I und F-III gegenüber dem Material (S-II) gemacht, das durch das oben diskutierte modifizierte Arzoxifenkristallisationsverfahren hergestellt wird (Zusatz von Ethanol zu einer Suspension aus Arzoxifen in Ethylacetat bei Rückflußtemperatur).

Die repräsentativen DSC/TGA Messungen von S-II, F-I und F-III sind jeweils in den Fig. 1, 2 und 3 gezeigt. Die DSC Messung für S-II zeigt einen breiten endothermen Verlauf, der bei etwa 62°C beginnt und dem Verlust von Ethylacetat und Wasser aus dem Kristallgitter entspricht. Die Endotherme, die bei etwa 152°C beginnt, zeigt das Schmelzen an. Der TGA Gewichtsverlust von etwa 2,5% tritt gleichzeitig mit dem ersten Übergang auf, während der verbleibende Verlust von 0,5 Gewichtsprozent nach dem Einsetzen des Schmelzens auftritt, was nahelegt, daß einige Lösemittelmoleküle fester im Gitter gehalten werden.

Die DSC Messung von F-I zeigt einen breiten endothermen Verlauf, der bei etwa 75°C beginnt, wonach eine zweite Endotherme folgt, die bei etwa 155°C beginnt und einem Schmelzen entspricht. Die TGA Messung von F-I zeigt einen graduellen Gewichtsverlust von 0,3% gefolgt von einem abrupten Verlust von 1,5%, die zusammen die Dehydratisierung des Gitters darstellen. Das Einsetzen des ersten DSC Übergangs und der entsprechende TGA Gewichtsverlust sind aufgrund der unterschiedlichen Aufheizgeschwindigkeiten leicht versetzt. Der anfängliche Gewichtsverlust repräsentiert schwach gebundenes Hydratisierungswasser, während der zweite Gewichtsverlust mit etwa 0,5 mol Wasser übereinstimmt, das im Gitter bei sehr geringen relativen Luftfeuchtigkeiten (unter 5% - siehe Feuchtigkeitssorptionsdaten) vorkommt.

Die DSC Messung von F-III zeigt eine breite. Niedrigtemperatur-Endotherme bei etwa 30°C gefolgt von einer zweiten breiten und relativ schwachen Endotherme, die bei etwa 70°C beginnt und einem schließlichen Übergang, der bei etwa 146°C beginnt und einem Schmelzen entspricht. Der abrupte 1,5%ige (~0,5 mol) Gewichtsverlust bei TGA, der gleichzeitig mit der ersten Endotherme auftritt, entspricht einem Verlust an schwach gebundenen Wassermolekülen, während der zusätzliche ~1,6%ige Gewichtsverlust über 60°C den Verlust von mehr oder weniger fest gebundenen Wassermolekülen repräsentiert, das heißt die, die bei sehr geringen relativen Luftfeuchtigkeiten vorkommen. Der Gewichtsverlust, der über 170°C beobachtet wird, entspricht einer Zersetzung von F-III.

Die XRD Muster von F-I und F-III zeigen scharfe Peaks und eine flache Basislinie, was hochkristalline Materialen anzeigt. Die Winkel-Peakpositionen in 2 θ und die entsprechenden I/I₀ Daten für die repräsentativen Proben von F-I, F-III und S-II sind in Tabelle 1 tabelliert. Obwohl viele der intensiven Reflektionen im allgemeinen bei unterschiedlichen Beugungswinkeln auftreten, ergibt jede der Formen ein unterschiedliches Pulvermuster, was eine klare Unterscheidung zwischen S-II, F-I und F-III erlaubt.

Es ist gut bekannt in der Kristallographietechnik, daß für jedes Polymorph die relativen Intensitäten der Beugungspeaks aufgrund der bevorzugten Orientierung variieren können, die aus Faktoren resultieren, wie der Kristallmorphologie. Wo die Effekte der bevorzugten Orientierung auftreten, sind die Peakintensitäten verändert, aber die charakteristischen Peakpositionen des Polymorphs sind unverändert. Siehe beispielsweise The United States Pharmacopeia Nr. 23, National Formulary Nr. 18, Seiten 1843-1844, 1995. Daher kann F-I auf der Grundlage der Peakintensitäten wie auch den Peakpositionen durch das Vorkommen der Peaks bei 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2 und 20,6 ± 0,2° in 2 θ identifiziert werden, wenn das Muster von einer Kupferstrahlenquelle erhalten wird.

Tabelle 1

Weitere Charakterisierung von F-I und F-III

Es werden Hygroskopizitätsuntersuchungen mit F-I und F-III ausgeführt. Die Feuchtigkeitssorptionsiso thermen für F-I und F-III sind in Fig. 4 gezeigt. Bei der anfänglichen Exposition der Proben gegenüber etwa 5% relativer Luftfeuchtigkeit findet eine unmittelbare Gewichtszunahme von 1,5% und 1,7% Feuchtigkeit jeweils für F-I und F-III statt, die etwa 0,5 mol Wasser entspricht. Beide Formen zeigen eine kontinuierliche Sorption von Feuchtigkeit im gesamten Feuchtigkeitsbereich, das aus dem Einbau von Wassermolekülen in die Gitter resultieren dürfte.

Der Unterschied in der Feuchtigkeitsaufnahme der zwei Formen spiegelt die Menge an Wasser wider, die in die zwei Gitter aufgenommen werden kann (das heißt die Menge an verfügbarem Raum in den Gittern, der Wassermoleküle beherbergen kann). Das Fehlen der Hysterese in den Sorptions-Desorptions-Isothermen von F-I und F-III zeigt, daß die Kristallformen schnell bei jeder gegebenen Feuchtigkeit äquilibrieren.

Die Feuchtigkeitssorptionsprofile für F-I und F-III zeigen, daß diese Formen im wesentlichen nicht- stöchiometrische Hydrate sind. Bei einer relativen Feuchtigkeit der Umgebung (etwa 50% relative Feuchte) enthält F-I etwa 1,7% Wasser, was 0,5 mol Wasser entspricht, während F-III etwa 3,0% Wasser sorbiert, das etwa 0,85 mol Wasser entspricht. Die Bulk-Formen von F-I und F-III äquilibrieren rasch mit der Atmosphäre, so daß der durch die analytischen Techniken beobachtete Wassergehalt eine Reflektion der relativen Luftfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Datengewinnung ist. Unterschiede von Charge zu Charge, die in den DSC Daten beobachtet werden, dürften von Proben stammen, die aufgrund von unterschiedlichen Umgebungslagerbedingungen in unterschiedlichem Ausmaß hydratisiert wurden.

Die XRD Muster werden für die Proben von F-I und F-III erhalten, die bei unterschiedlichen relativen Feuchtigkeiten gelagert wurden (0, 22, 50 und 80%). Man beobachtet eine Verschiebung der anfänglichen Peaks von F-III (0% relative Luftfeuchtigkeit) bei etwa 13,8, 17,6, 18,0, 20,5 und 24,0° in 2 θ wie auch eine leichte Verschiebung von Peaks mit geringerer Intensität, wenn die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die beobachteten Veränderungen in den XRD Mustern von F-III zeigen, daß die Einheitszellendimensionen sich verändern, vermutlich um schwach gebundene Wassermoleküle zu beherbergen, wenn die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die kontinuierliche Verschiebung der Peaks mit der Luftfeuchtigkeit korreliert gut mit den Feuchtigkeitssorptions daten, die einen graduellen Gewichtsgewinn über den relativen Luftfeuchtigkeitsbereich zeigen, was auf eine variable Hydratbildung hinweist.

Es wird ein ähnliches Experiment mit F-I ausgeführt, um zu zeigen, ob die Veränderung der relativen Luftfeuchtigkeit eine ähnliche Wirkung auf das Gitter hat (0, 25, 52, 73 und 95% relative Luftfeuchtigkeit). Man beobachtet eine sehr geringe Verschiebung der Peaks bei 0% relativer Luftfeuchtigkeit bei etwa 7,7, 18,3, 18,5, 20,5, 20,8° in 2 θ, wenn die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die Peaks bei etwa 7,7, 20,8 und 24,1 scheinen bei höheren relativen Luftfeuchtigkeiten auch breiter und weniger aufgelöst zu werden, was anzeigt, daß Wasser in die amorphen Komponenten sorbiert wird (oder der Feststoff aufweicht), insbesondere bei 73% und 95% relativer Luftfeuchtigkeit. Die Verschiebung der Peaks in den XRD Mustern von F-I ist weniger dramatisch als die Peakverschiebungen, die beobachtet werden, wenn F-III unterschiedlichen relativen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt wird. Dies legt nahe, daß das F-I Gitter nicht derselben Ausdehnung und/oder Kontraktion unterzogen wird, wie das F-III Gitter.

F-I und F-III sind über den gesamten relativen Luftfeuchtigkeitsbereich stabil, trotz der Fähigkeit von F-III, fast doppelt so viel Wasser zu sorbieren. Die zwei Formen haben eine vergleichbare Kristallgröße, Morphologie, Wasserlöslichkeit und Auflösungsgeschwindigkeit.

Es wird eine Trocknungsstudie ausgeführt, um die Desolvatisierung von S-II als Funktion der Trocknungszeit und Temperatur zu verfolgen (siehe Fig. 5). Es werden bei verschiedenen Zeitpunkten während des Desolvatisierungsexperiments XRD Muster aufgenommen. Viele Beugungspeaks aus der Desolvatisierungs studie von S-II treten bei ähnlichen Winkeln wie bei F-I aufl was bestätigt, daß die Gitter von S-II und F-I sehr ähnlich sind. Das Verschwinden der Beugungspeaks bei etwa 6,8, 7,2 und 14,0° in 2 θ nach nur minimaler Trocknung legt nahe, daß diese Reflektionen kristallographischen Ebenen zugeordnet werden können, die teilweise eine Elektronendichte von Ethylacetatmolekülen aufweisen.

Ausgedehntes Annelieren des solvatisierten Materials unter Vakuum bei hohen Temperaturen ergibt F-I. Auf diese Weise hergestelltes F-I zeigt ein hohes Maß an Kristallinität bei der XRD. Daher zeigt das durch Kristallisation aus einer Lösung aus Ethanol und Ethylacetat gefolgt von einer Vakuumtrocknung für nur wenige Stunden gewonnene Material, wie dies in US 5 723 474 A beschrieben ist, eine sehr geringe Kristallinität, da ein solches Verfahren zu einem teilweise desolvatisierten S-II führt.

F-I und F-III weisen gegenüber der Arzoxifenform des Stands der Technik, wie sie oben beschrieben ist, mehrere Vorteile auf. Relativ zu Arzoxifen, das durch das in US 5 723 474 A beschriebene Verfahren hergestellt wurde, sind F-I und F-III bei Umgebungstemperatur stabiler und sind daher bei der pharmazeutischen Entwicklung, das heißt bei der Entwicklung einer Dosisformulierung, beliebter. Zusätzlich sind F-I und F-III viel kristalliner als die in US 5 723 474 A beschriebene Form. Die kristallinen Materialien sind im allgemeinen weniger hygroskopisch und stabiler (unterliegen beispielsweise weniger einem chemischen Abbau und halten eine konsistente Stärke aufrecht) als amorphe Materialien und sind daher für die Formulierungsverarbeitung erwünschter. Darüberhinaus enthalten F-I und F-III nur Wasser im Gegensatz zu der Arzoxifenform, die durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, die Ethylacetat und Wasser im Gitter enthält.

Charakterisierungsverfahren

Die DSC Messungen werden auf einem TA Instruments 2920 modulierten DSC ausgeführt, der an einen Thermal Analyst 3100 angeschlossen ist und mit einem Kühlsystem ausgestattet ist. Die Proben (3-5 mg) werden in Aluminiumschälchen von 10 bis 240°C bei einer Aufheizrate von 2°C/min erhitzt.

Die TGA Analysen werden auf einem TA Instruments 2050 Thermographimetric Analyser ausgeführt, der an einen Thermal Analyst 3100 angeschlossen ist. Die Proben (5-10 mg) werden in offenen Schälchen von 25°C bis 250°C bei einer Aufheizrate von 5°C/min erhitzt.

Die XRD Muster werden auf einem Siemens D5000 Röntgenpulverdifraktometer erhalten, das mit einer CuKα Quelle (λ = 1,54056 Å) und einem Kevex Festphasendetektor ausgestattet ist, der bei 50 kV und 40 mA arbeitet. Jede Probe wird zwischen 4° und 35° in 2 θ gescannt. Die Proben können sich für mindestens 30 Minuten bei der gewünschten Temperatur und/oder relativen Luftfeuchtigkeit äquilibrieren, bevor die Daten gewonnen werden.

Die Hygroskopizitätsmessungen werden für F-I und F-III mittels des VTI Verfahrens wie folgt ausgeführt. Jede Probe wird unter Vakuum bei 60°C getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr beobachtet wird, wonach die Probenkammer auf 0% relative Luftfeuchtigkeit gebracht wird. Die Feuchtigkeitssorptionsisothermen werden bei 25°C mittels einer VTI Vakuumfeuchtigkeitsbalance mit den folgenden Bedingungen erhalten: Probengröße 10-15 mg, Adsorptions/Desorptionsbereich 0-95% relative Luftfeuchtigkeit, Stufenintervall 5%, Probenintervall 10 Minuten.

Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung des Hydrats der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sollen den Schutzumfang dieser Verfahren in keiner Weise beschränken und sollen auch nicht so aufgefaßt werden.

Präparationen Präparation 1 S-II

Rohes Arzoxifen (1,58 g des durch das in Beispiel 41 der US 5 723 474 A beschriebene Verfahren hergestellten Materials, wobei die Beschreibungen hiermit eingeführt sind) wird in 28 ml Ethylacetat suspendiert und auf Rückfluß erhitzt.

Ethanol (18 ml) wird zur Bewirkung der Auflösung zugegeben. Die Lösung wird für 20 Minuten am Rückfluß gehalten und kann dann auf Raumtemperatur abkühlen. Der Niederschlag wird durch Vakuumfiltration isoliert und mit 30 ml Ethylacetat unter Bildung von 1,05 g eines pulverigen, weißen Feststoffs gewaschen.

Beispiele Beispiel 1 F-I aus S-II

S-II wird in einem Vakuumofen (-25 Inch Hg) bei 100°C für 118 Stunden unter Bildung von F-I getrocknet.

Beispiel 2 Verbessertes Verfahren zur Herstellung von F-I aus Arzoxifen

Ein 1 l fassender Dreihalsrundbodenkolben, der mit einem Rückflußkühler und einer Rührwelle ausgestattet ist, wird mit 25,0 g Arzoxifen, 475 ml Tetrahydrofuran und 25 ml Wasser gefüllt. Das Reaktionsgefäß wird dann für eine einfache Destillation ausgestattet. Das Reaktionsgemisch wird auf Rückfluß erhitzt und es werden 250 ml Destillat entfernt. Die Heizung wird kurz entfernt und 250 ml frisches wasserfreies Tetrahydrofuran wird in das Gefäß gegeben. Die atmosphärische Destillation wird unter Entfernung von weiteren 250 ml Destillat fortgesetzt. Die Heizung wird kurz entfernt und zusätzliche 250 ml Tetrahydrofuran werden zugegeben und zusätzliche 250 ml Destillat werden entfernt. Zusätzliche 250 ml Tetrahydrofuran werden zugegeben und das Reaktionsgemisch wird am Rückfluß gehalten. Durch diese Tetrahydrofuranzugabe bildet sich ein weißer Niederschlag. Das gerührte Reaktionsgemisch kann sich langsam über 3 Stunden abkühlen, währenddessen zusätzliche Feststoffe ausfallen und die Aufschlämmung Raumtemperatur erreicht. Die kristalline Aufschlämmung wird filtriert und bei 50°C für 48 Stunden mit einem leichten Stickstoffstrom vakuumgetrocknet. Ausbeute 22.50 g (90,0%). Die XRD Analyse zeigt, daß das Spektrum des nassen Kuchens und des trockenen Feststoffs im wesentlichen identisch sind und im wesentlichen zu dem des vorher hergestellten F-I identisch ist. Die DSC Analyse ergibt einen Schmelzpunkt von 157°C, während die TGA Analyse einen 1,5%igen Massenverlust zwischen Umgebungstemperatur und 100°C aufweist. Die auf die freie Base berechnete HPLC Reinheit beträgt 88,1% gegenüber einem theoretischen Gehalt von 92,9%. Die HPLC Analyse zeigt einen Gesamtgehalt an verwandten Substanzen von 0,44%.

Beispiel 3 F-I aus [6-Benzyloxy-3-(4-[2-piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid)

Tetrahydrofuran (261 ml Wasser (45 ml), konzentrierte Schwefelsäure (6,14 g) und [6-Benzyloxy-3-[4-[2- (piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid) (HPLC Gehalt 99%, gesamte verwandte Verbindungen gemäß HPLC 0.35%) werden vereinigt und bis zur Homogenität gerührt. 10% Pd/C (5.6 g aufgeschlämmt in 22 ml Wasser) werden mit einer Wassermenge von 5 ml zugegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird evakuiert und mit 60 psi Wasserstoff überlagert. Die Reaktionstemperatur wird auf 30°C eingestellt. Nach 2 Stunden werden 10% Pd/C (5.6 g) mit Wasser (30 ml) zugegeben. Die Hydrierung bei 60 psi und 30°C wird für weitere 22 Stunden fortgesetzt. Es werden weitere 4,40 g 10% Pd/C in 30 ml Wasser zugegeben und die Hydrierung bei 60 psi und 30°C wird für weitere 2,5 Stunden fortgesetzt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und der pH des Filtrats wird mit 50% Natriumhydroxid auf 7,24 eingestellt. Natriumchlorid (8,66 g) wird in Wasser (18 ml) gelöst zugegeben und die biphasische Lösung wird für 30 Minuten gerührt. Die Phasen werden getrennt und die wäßrige Phase wird mit 50 ml Tetrahydrofuran rückextrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und durch atmosphärische Destillation auf ein Volumen von 50 ml konzentriert. Zum Konzentrat werden bei 24°C 180 ml Methanol über einen Zeitraum von einer Stunde gegeben. Die entstehende kristalline Aufschlämmung wird für 30 Minuten bei 24°C gerührt, auf 0°C gekühlt und für 1 Stunde gerührt. Die Feststoffe werden durch Filtration isoliert und nacheinander gewaschen mit 39 ml Wasser und 39 ml Methanol, wonach eine Vakuumtrocknung über Nacht bei 50°C erfolgt. Ausbeute 15,52 g (67,8%).

Ein Teil des obigen Produkts (10 g) wird aus Tetrahydrofuran und Wasser wie in Beispiel 2 beschrieben umkristallisiert.

Brauchbarkeiten

Wie hierin verwendet meint der Ausdruck "wirksame Menge" eine Menge von F-I, die zur Hemmung von hierin beschriebenen Zuständen oder nachteiligen Effekten fähig ist. Wenn F-I zusammen mit Östrogen, Progestin, einem Aromataseinhibitor, einem LHRH Analogon oder einem AChE Inhibitor verabreicht wird, meint "wirksame Menge" auch eine Menge eines solchen Mittels, die zur Herstellung der gewünschten Wirkung fähig ist.

Der Ausdruck "hemmend" oder "hemmen" umfaßt die allgemein anerkannte Bedeutung, das heißt das Verhindern. Unterbinden, Beschränken, Lindern. Verbessern, Verlangsamen. Aufhalten oder Umkehren des Fortschreitens, der Schwere eines hierin beschriebenen pathologischen Zustands oder des Leidens hieran.

Die Ausdrücke "verhindernd", "Verhinderung von", "Prophylaxe", "prophylaktisch" und "verhindern" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Verringerung der Wahrscheinlichkeit, daß der Empfänger von F-I einen der hierin beschriebenen pathologischen Zustände oder Leiden hieran sich zuzieht oder entwickelt.

Die Ausdrücke "Östrogen-vermindert" und "Östrogenverminderung" beziehen sich auf einen Zustand, der entweder natürlich auftritt oder klinisch hervorgerufen wird, bei dem eine Frau nicht ausreichend endogene Östrogenhormone bilden kann, um die Östrogen-abhängigen Funktionen aufrechtzuerhalten, wie Menstruation, Homöostase der Knochenmasse, neuronale Funktion, kardiovaskulärer Zustand usw. Solche Östrogen-verminderten Situationen resultieren unter anderem aus Menopause und Operation oder chemische Ovarektomie, einschließlich des funktionellen Äquivalents, beispielsweise Behandlung mit einem Aromataseinhibitor, GnRH Agonisten oder Antagonisten. ICI 182780 und dergleichen. Krankheitszustände, die mit einem Östrogen-verminderten Zustand assoziiert sind, sind unter anderem: Knochenverlust, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung und Hyperlipidämie.

Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin®), Pferdeöstrogen, 17β-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Eine bevorzugte Östrogen-basierte Verbindung ist Premarin® und Norethylnodrel.

Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit progestationaler Aktivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethylnodrel, Nongestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen. Norethindron ist ein bevorzugtes Progestin-basiertes Mittel.

Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "Aromataseinhibitor" Verbindungen, die zur Hemmung der Aromatase fähig sind, beispielsweise im Handel erhältliche Inhibitoren, wie Aminoglutemid (CYTANDREN®), Anastrazol (ARIMIDEX®), Letrozol (FEMARA®), Formestan (LENATRON®), Exemestan (AROMASIN®) und dergleichen.

Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "LHRH" Analogon auf ein Analogon eines Hormons, das ein luteinisierendes Hormon freisetzt, das die Östrogenbildung in einer prämenopausalen Frau hemmt, beispielsweise Goserlin (ZOLADEX®), Leuprolid (LUPRON®) und dergleichen.

Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "AChE Inhibitor" Verbindungen, die die Acetylcholinesterase hemmen, beispielsweise Physostigminsalicylat, Tacrinhydrochlorid, Donepezilhydrochlorid und dergleichen.

Der Ausdruck "hochregulieren von ChAT" bezieht sich auf die Erhöhung der enzymatischen Aktivität von ChAT, das heißt der Förderung der Umwandlung von Cholin zu Acetylcholin. Diese Förderung umfaßt eine Zunahme der Effizienz und/oder Geschwindigkeit der Reaktion von ChAT und Cholin und/oder einer Erhöhung der Zunahme der Menge an ChAT, die am Wirkort vorkommt. Diese Erhöhung in der vorkommenden Enzymmenge kann auf der Genregulation oder eines anderen Syntheseschritts der Enzymbildung und/oder einer Abnahme der Enzymdeaktivierung und des Metabolismus beruhen.

Ausgewählte Testverfahren

Allgemeines Rattenpräparationsverfahren: Fünfundsiebzig Tage alte (falls nichts anderes angegeben ist) weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) werden von den Charles River Laboratories (Portage, MI) erhalten. Die Tiere werden entweder bilateral ovarektomiert (OVX) oder einem Schein- Operationsverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen, und dann nach einer Woche verschickt. Nach der Ankunft werden sie für eine Woche in hängenden Metallkäfigen in Gruppen zu 3 oder 4 pro Käfig, mit freiem Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und Wasser gehalten. Die Raumtemperatur wird auf 22,2° + 1,7°C mit einer minimalen relativen Feuchtigkeit von 40% gehalten. Die Photoperiode im Raum beträgt 12 Stunden Helligkeit und 12 Stunden Dunkelheit.

Dosierungsplan/Gewebegewinnung: Nach einer Woche der Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit F-I begonnen. 17α-Ethinylöstradiol oder F-I werden oral als eine Suspension in 1% Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20% Cyclodextrin gegeben, falls nichts anderes angegeben ist. Den Tieren werden die Dosen täglich 4 Tage lang gegeben. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Ketamin : Xylazin (2 : 1) (V : V) Gemisch anästhesiert und eine Blutprobe wird durch kardiale Punktion gewonnen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO₂ getötet und der Uterus wird durch eine Inzision entlang der Mittellinie entfernt und das Uterusnaßgewicht wird bestimmt. 17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co., St. Louis. MO.

Kardiovaskuläre Erkrankung/Hyperlipidämie

Die obigen Blutproben läßt man bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen, und das Serum wird nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm gewonnen. Das Serumcholesterin wird unter Verwendung eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4- Aminophenazon in Gegenwart einer Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgewertet werden kann. Die Cholesterinkonzentration wird dann gegen eine Standardkurve berechnet. Der ganze Test wird unter Verwendung einer Biomek Automated Workstation automatisiert.

Uterus-Eosinophilen-Peroxidasetest (EPO)

Die Uteri werden bei 4°C bis zur enzymatischen Analyse gehalten. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Trispuffer (pH 8,0), der 0,005% Triton X-100 enthält, homogenisiert. Nach einer Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Trispuffer, wird die Zunahme der Absorbtion für eine Minute bei 450 nm aufgezeichnet. Die Anwesenheit der Eosinophilen im Uterus ist ein Hinweis für die Östrogenaktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekundenintervalls wird über den anfänglichen, linearen Anteil der Reaktionskurve bestimmt.

Testverfahren für die Hemmung des Knochenverlusts (Osteoporose)

Durch Befolgen des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung mit Kohlendioxid am 36. Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Reduktion der Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Naßgewichts entleert, um die mit der vollständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Untersuchung zu ermöglichen.

Die rechten Femuren werden entnommen und digitalisierte Röntgenstrahlen werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm (NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt. Gemäß den obigen Verfahren werden F-I oder Ethinylöstradiol (EE₂) in 20% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin oral an Testtiere verabreicht. F-I ist auch in Kombination mit Östrogen oder Progestin brauchbar.

MCF-7 Proliferationstest

MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (V/V), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM}, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (1 µg/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) (Testmedium) anstelle von 10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmedium entfernt (Ca²⁺/Mg²⁺ freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 µl (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Transfer zu ermöglichen. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt und 50 µl werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 µl Testmedium auf ein Endvolumen von 200 µl überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert (1 µCi/Vertiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei -70°C für 24 Stunden gefolgt von einem Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigscintillation mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen.

DMBA-induzierte Brusttumorhemnnung

Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries. Indianapolis, Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen (DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.

F-I wird entweder über intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.

Uterusfibrosetestverfahren

Test 1: Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man F-I. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0.1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate. Die Frauen werden während des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.

Test 2: Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.

Test 3: Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.

Test 4: Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3-5 mal pro Woche durch Injektion für 2-4 Monate dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus F-I oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3-16 Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen und auf Tumorregression untersucht.

Test 5: Gewebe von humanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung kultiviert. Die Behandlung, die aus F-I oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des Organs zu untersuchen.

Test 6: Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nicht- transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-I und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.

Test 7: Die Fähigkeit von F-I zur Hemmung der durch Östrogen stimulierten Proliferation der von Leimyomen stammenden ELT Zellinien wird gemessen, wie dies im wesentlichen beschrieben ist in Fuchs-Young et al., "Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17 (3): 151-159 (1996), wobei die Beschreibung hiermit eingeführt ist.

Endometriosetestverfahren

Test 1: Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstncs wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt. Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-I pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrialen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.

Test 2: Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das Linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-I pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrischen Explantate und Nebennieren werden entfernt und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen werden aufgezeichnet.

Test 3: Autographien von endometrischem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometriales Gewebe wird im Peritoneum von 5-150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachstumsinduktion des esplantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums zu bestimmen.

Test 4: Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus F-I, das durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.

Test 5: Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nicht- transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedruckt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-I und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.

ZNS Störungen einschließlich Alzheimerscher Erkrankung

Östrogene, wie 17β-Östradiol, regulieren die Gentranskription durch die Bindung an Östrogenrezeptoren (ÖR), die im Zytoplasma von bestimmten Zellpopulationen sind. Die Ligandenaktivierung des ÖR ist eine Voraussetzung für den nuklearen Transport des Komplexes, wo bei einem Binden an eine 13 Basenpaar lange palindromische DNA Konsensussequenz (Östrogen-reaktives Element oder ÖRE) der Zusammenbau eines Transkriptionsapparates beginnt, der zur Aktivierung der geeigneten Zielgene führt. Es wurde eine Vielzahl an Genen identifiziert, die durch Östrogen reguliert werden. Diese umfassen Zytoskelettproteine, Neurotransmitter, biosynthetische und metabolische Enzyme und Rezeptoren, wie auch andere Hormone und Neuropeptide. ÖRE's wurden in vielen Östrogen-reaktiven Genen gefunden, einschließlich Vitellogenin, c-fos, Prolactin und luteinisierendem Hormon.

Mit einer Bedeutung im zentralen Nervensystem wurden ÖRE-ähnliche Sequenzen in p75^ngr und trkA identifiziert, die beide als Signalmoleküle für die Neurotrophine dienen: Nervenwachstumsfaktor (NGF), aus dem Gehirn stammender Nervenwachstumsfaktor (BDNGF) und Neurotrophin-3.

Von BDNGF wie auch von NGF wurde gezeigt, daß sie das Überleben von cholinergen Neuronen in Kultur fördern. Es wird postuliert, daß falls die Wechselwirkungen zwischen Neurotrophinen und Östrogenen wichtig für die Entwicklung und das Überleben von basalen Großhirnneuronen sind (die bei der Alzheimerschen Erkrankung degenerieren), klinische Zustände, worin eine Östrogendefizienz existiert (wie nach Menopause) dann zu einem Verlust dieser Neuronen führen könnten.

Das folgende Experiment wird in ovarektomierten Ratten (wie oben beschrieben hergestellt) ausgeführt, um die Ähnlichkeiten und/oder Unterschiede zwischen F-I und Östrogen bei der Beeinflussung der Genexpression in verschiedenen Gehirnregionen zu bestimmen. Sechs Wochen alten Ratten werden täglich subkutane Injektionen mit Östradiolbenzoat (0,03 mg/kg), F-I oder Träger (Kontrolle) verabreicht. Nach fünf Wochen Behandlung werden die Tiere getötet und ihr Gehirn wird entfernt und die Hippocampi durch Mikrodissektion gewonnen. Die Hippocampi werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert. Es wird die gesamte RNA aus vereinigtem Gewebe aus der jeweiligen Behandlung und der Kontrolle präpariert und mittels 3' Oligonukleofid primer revers transkribiert, der für die spezifischen mRNA Populationen ausgewählt ist (Poly-A+). Es werden Polymerasekettenreaktionen (PCR) in einem Cocktail ausgeführt, der besteht aus zufälligen 5' Oligonukleotiden (10 Basenpaare lang, insgesamt 150), Reaktionspuffer, Taq Polymerase und ³²PdTCP.

Nach 40 Amplifikationsrunden werden die Reaktionsprodukte der Größe nach auf einem 6% TBE Harnstoffgel fraktioniert, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die entstehenden mRNA Muster werden zwischen den zwei Behandlungsgruppen verglichen.

Verwendung von F-I zusammen mit Östrogen

Peri- und postmenopausale Frauen unterziehen sich oft einer Hormonersatztherapie (HRT), um negative Konsequenzen zu bekämpfen, die mit dem Abfall des zirkulierenden endogenen Östrogens assoziiert sind, beispielsweise um Hitzewallungen zu behandeln. Jedoch ist die HRT mit erhöhten Risiken bestimmter Krebsarten assoziiert, einschließlich Uterus- und Brustkrebs. F-I kann zusammen mit HRT verwendet werden, um diese Risiken zu minimieren.

Verwendung von F-I zusammen mit einem Aromataseinhibitor

Gemäß der Definition sind die Ovarien einer postmenopausalen Frau nicht funktionsfähig. Ihre einzige Östrogenquelle ist die Umwandlung von adrenalen Androgenen zu Östrogenen durch das Enzym Aromatase, das in peripheren Geweben gefunden wird (einschließlich Fett, Muskel und dem Brusttumor selbst). Daher nehmen Arzneimittel, die die Aromatase hemmen (Aromataseinhibitoren) postmenopausalen Frauen das zirkulierende Östrogen. Die Östrogenverringerung durch die Aromataseinhibierung ist eine wichtige Behandlungsoption für Patienten mit metastatischem Brustkrebs. Während der Therapie mit einem Aromataseinhibitor kann das Fehlen des zirkulierenden Östrogens negative, unerwünschte Nebenwirkungen haben, beispielsweise auf die Serumlipidspiegel. F-I kann verwendet werden, um diese negativen Effekte zu hemmen.

Verwendung von F-I zusammen mit einem LHRH Analogon

Die andauernde Exposition gegenüber einem LHRH (luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon) Analogon hemmt die Östrogenbildung bei der prämenopausalen Frau durch die Desensibilisierung der Hinanhangs drüse, die dann nicht länger die Ovarien stimuliert, Östrogen zu bilden. Der klinische Effekt ist eine "medizinische Oophorektomie", die nach dem Einstellen des LHRH Analogons reversibel ist. Während der Therapie mit einem LHRH Analogon kann das Fehlen des zirkulierenden Östrogens negative, unerwünschte Nebenwirkungen haben, beispielsweise auf die Serumlipidspiegel. F-I kann verwendet werden, um diese negativen Effekte zu hemmen.

Erhöhte Mengen an Acetylcholin

Es ist bekannt, daß Patienten, die an Alzheimerscher Erkrankung leiden, deutlich geringere Mengen an cholinergen Neuronen im Hippocampus aufweisen, als die nicht-Alzheimer Entsprechungen. Der progressive Verlust dieser cholinergen Neuronen scheint den progressiven Verlust an Gedächtnis und Wahrnehmungsstörung in diesen Patienten widerzuspiegeln. Es wird angenommen, daß ein Grund für die Abnahme dieser Neuronen der Verlust oder die verringerte Funktion des Neurotransmitters Acetylcholin ist.

Die Menge an Acetylcholin in einem Neuron wird grundlegend dadurch bestimmt, wo das Gleichgewicht zwischen der Biosynthese und dem Bioabbau liegt. Das Enzym Cholinacetyltransferase (ChAT) ist primär für die Synthese und Acetylcholinesterase (AChE) für den Abbau verantwortlich.

Um den Effekt von F-I auf die Menge von ChAT zu bestimmen, wird das folgende Experiment ausgeführt: Nach dem oben beschriebenen allgemeinen Rattenpräparationsverfahren verabreicht man 40 Ratten F-I mit 3 mg/kg/Tag in einem Träger der 10% Cyclodextrin enthält, Östradiolbenzoat mit 0,03 oder 0,3 mg/kg/Tag oder einer Trägerkontrolle täglich durch subkutane Injektion oder orale Gabe. Die Tiere werden für 3 oder 10 Tage behandelt. Es sind zwanzig Tiere pro Dosierungsplan. Nach den geeigneten Zeiträumen werden die Tiere getötet und ihre Gehirne entnommen. Die bestimmten Anteile der Gehirne werden homogenisiert und getestet. Homogenate aus dem Hippocampus und dem frontalen Cortex werden verarbeitet und die Bestimmung der ChAT Aktivität wird durch einen radioaktiv markierten Test der Biosynthese von Acetylcholin ausgeführt. Dieses Verfahren kann bei Schoepp et al., J. Neural Transmiss., 78: 183-193, 1989 gefunden werden, wobei die Beschreibungen hiervon hiermit eingeführt sind.

Wie in den OVX Tieren erwartet, werden die ChAT Mengen im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen um mehr als 50% verringert (p < U,001).

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird F-I zusammen mit einem AChE Inhibitor verwendet. Die Verwendung eines AChE Inhibitors erhöht die Mengen an Acetylcholin durch die Blockade des Abbaus über die Hemmung von AChE.

Benigne Prostatahyperplasie (BPH)

Als Hintergrund für die Verbindung zwischen Östrogenwirkung und die Behandlung von BPH und Prostatacarzinom siehe PCT Anmeldung WO 98/07274. Internationales Veröffentlichungsdatum: 15. Oktober 1998.

In den unten beschriebenen Experimenten wird die Fähigkeit von F-I zur Bindung an Östrogenrezeptoren in mehreren humanen Prostatakrebszellinien evaluiert.

Die Lysate der humanen Prostatakrebszellinien LNCaP, DU-45 und PC3 werden in einem TEG Medium hergestellt, das 50 mM Tris HCl pH 7,4, 1,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,4 M KCl, 10% Glycerin, 0,5 mM 2-ME und 10 mM Natriummolybdat aufweist und ferner die Proteaseinhibitoren Pepstatin (1 mg/ml), Leupeptin (2 mg/ml), Aprotinin (5 mg/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 0,1 mM) enthält (TEGP).

Die Zellysate werden zentrifugiert und die Pellets werden in kaltem TEGP (1 ml TEGP/100 mg Pellet) resuspendiert und für 30 Sekunden (Betriebszyklus 70%, Stärke 1,8) auf einem Branson Modell 450 Ultraschallgerät ultrabeschallt. Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 10000 × g für 15 Minuten bei 4°C pelletiert, wonach die Überstände abgezogen werden und entweder sofort verwendet oder bei -70°C gelagert werden.

Kompetitionsbindungstest: Der Bindungspuffer ist TEG, worin 0,4 M KCl durch 50 mM NaCl ersetzt ist und zu dem 1 mg/ml Ovalbumin zugegeben wurde (TEGO). F-I wird in TEGO auf 20 nM verdünnt, woraus dreifache Reihenverdünnungen hergestellt werden. Die Tests werden in Rundbodenmikrotiterplatten aus Polypropylen dreifach in Mikrovertiefungen ausgeführt. Jede Vertiefung erhält 35 µl tritiertes 17β-Östradiol (0,5 nM, spezifische Aktivität 60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) und 35 µl kalter Kompetitionstestverbindung (0,1 nM-5 mM) oder TEGO und nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 4°C unter Schütteln 70 µl Lysate der MCF-7 Zellinie.

Die Platten werden für 24 Stunden bei 4°C inkubiert, wonach 70 µl Dextran-beschichtete Kohle (DCC) zu jeder Vertiefung gefolgt von einem starken Schütteln für 8 Minuten bei 4°C zugegeben wird. Die Platten werden dann bei 1500 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird dann aus jeder Vertiefung in eine flexible Polystyrolmikrotiterplatte für die Scintillationszählung in einem Wallac Micobeta Modell 1450 Zähler überführt. Die Radioaktivität wird als Zerfälle pro Minute (DPM) nach der Korrektur aufgrund der Zähleffizienz (35-40%) und dem Hintergrund ausgedrückt. Zusätzliche Kontrollen sind Gesamtzählungen und Gesamtzählungen + DCC, um das untere Limit der extrahierbaren DCC Zählungen zu definieren. Die Ergebisse dieser Kompetitionsbindungstests werden als mittlere Prozent Bindung (% Bindung) ± Standardabweichung mittels der folgenden Formel ausgedrückt:

Verhinderung von Brustkrebs

Die Erfindung betrifft auch die Verabreichung von F-I an einen Empfänger, der dem Risiko ausgesetzt ist, de novo einen Brustkrebs zu entwickeln. Der Ausdruck "de novo", wie er hierin verwendet wird, meint die Transformation oder Metamorphose von normalen Brustzellen zu krebsartigen oder malignen Zellen zum ersten Mal. Eine solche Transformation kann in Stufen in derselben Zelle oder in Tochterzellen über einen evolutionären Prozeß auftreten oder kann in einem einzelnen, alles entscheidenden Ereignis auftreten. Dieser de novo Prozeß steht im Gegensatz zur Metastase. Kolonisierung oder Ausbreitung von bereits transformierten oder malignen Zellen aus der Primärtumorstelle zu neuen Orten.

Eine Person, die keinem bestimmten Risiko für die Entwicklung von Brustkrebs ausgesetzt ist, ist eine, die Brustkrebs de novo entwickeln kann, keine Evidenz oder keinen Verdacht auf das Potential der Erkrankung über dem normalen Risiko aufweist und die niemals eine positive Diagnose der Erkrankung hatte. Der größte Risikofaktor, der zur Entwicklung von Brustkrebs beiträgt, ist eine persönliche Historie, an dieser Erkrankung zu leiden, oder ein früheres Auftreten der Erkrankung, sogar wenn sie sich in Remission befindet und keine Evidenz auf deren Vorkommen besteht. Ein weiterer Risikofaktor ist eine Familienhistorie dieser Erkrankung.

Die Induktion der Brusttumoren in Ratten durch die Verabreichung des Carzinogens N-Nitroso-N- methylharnstoff ist ein gut akzeptiertes Tiermodell für die Untersuchung von Brustkrebs und wurde als geeignet für die Analyse der Wirkung der chemopräventiven Mittel befunden.

In zwei getrennten Studien wird 55 Tagen alten weiblichen Sprague-Dawley Ratten eine intravenöse (Studie 1) oder intraperitoneale (Studie 2) Dosis von 50 mg N-Nitroso-N-methylharnstoff pro Kilogramm Körpergewicht eine Woche vor der Fütterung einer ad libitum Diät verabreicht, in die verschiedene Mengen an F-I, (Z)-2-[4-(1,2-Diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethanaminbase (Tamoxifenbase) oder Kontrolle gemischt werden.

In Studie 1 lassen sich die Nahrungsdosen von 60 mg/kg Nahrung und 20 mg/kg Nahrung grob in vergleichbare Dosen von 3 und 1 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere übersetzen.

In Studie 2 lassen sich die Nahrungsdosen von 20, 6, 2 und 0,6 mg/kg Nahrung grob in vergleichbare Dosen von 1, 0,3, 0,1 und 0,03 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere übersetzen.

Die Ratten werden auf das Auftreten von Toxizität beobachtet und werden gewogen und auf Tumorbildung einmal pro Woche palpiert. Die Tiere werden nach dreizehn Wochen (Studie 1) oder achtzehn Wochen (Studie 2) getötet und die Tumoren werden dann bestätigt und nach der Autopsie gewogen.

Formulierungen

Der Ausdruck "Pharmazeutikum" wird hierin als Zusatzmittel verwendet, das für den empfangenden Säuger im wesentlichen nicht schädlich ist. Mit "pharmazeutische Formulierung" sind die Träger, Verdünnungs mittel, Hilfstoffe und Wirkstoff(e) gemeint, die mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sind.

F-I wird vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert. Die Auswahl der Formulierung sollte von dem behandelnden Arzt entschieden werden, wobei die selben Faktoren in Betracht gezogen werden, die mit bei der Bestimmung der wirksamen Menge beteiligt sind.

Die gesamten Wirkstoffe in solchen Formulierungen umfassen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Vorzugsweise sind nicht mehr als zwei Wirkstoffe in dieser Formulierung enthalten. Das rührt daher, daß es bevorzugt ist. F-I mit einem zweiten Wirkstoff zu formulieren, ausgewählt aus Östrogen, Progestin, Aromataseinhibitor. LHRH Analogon und AChE Inhibitor. Die bevorzugtesten Formulierungen sind die, worin F-I der alleinige Wirkstoff ist.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen werden durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe hergestellt. Beispielsweise wird F-I entweder alleine oder in Kombination mit einem Östrogen, Progestin, Aromataseinhibitor, LHRH Analogon oder einer AChE Inhibitorverbindung mit herkömmlichen Hilfsstoffen. Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und in Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Lösungen, Injektionen. Aerosolen, Pulvern und dergleichen geformt.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen. Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, wie auch sterile Pulver, die unmittelbar vor der Verwendung in sterile Lösungen oder Suspensionen rekonstituiert werden. Beispiele für geeignete sterile wäßrige und nicht-wäßrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösemittel oder Vehikel umfassen Wasser, physiologische Kochsalzlösung. Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglycol, Poly(ethylenglycol) und dergleichen), und geeignete Gemische hiervon und pflanzliche Öle (wie Olivenöl) und inizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch die Erhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall einer Dispersion und Suspension und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.

Parenterale Zusammensetzungen können auch Adjuvantien enthalten, wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulsionsmittel und Dispergiermittel. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen wird durch die Einarbeitung von antibakteriellen und antimykotischen Mitteln sichergestellt, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen. Es kann auch erwünscht sein, isotonische Mittel einzuarbeiten, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Die verlängerte Absorption von injizierbaren Formulierungen kann durch die Einarbeitung von Mitteln herbeigeführt werden, die die Absorption verzögern, wie Aluminiummono stearat und Gelatine.

In manchen Fällen ist es erwünscht, um die Wirkung des Arzneimittels zu verlängern, die Absortion des Arzneimittels nach einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch die Hilfe einer flüssigen Suspension von kristallinem Material mit geringer Wasserlöslichkeit oder durch die Lösung oder Suspension des Arzneimittels in einem Ölträger erreicht werden. Im Fall der subkutanen oder intramuskulären Injektion einer Suspension, die eine Form des Arzneimittels mit einer geringen Wasserlöslichkeit enthält, hängt die Absorptionsrate des Arzneimittels von der Auflösungsrate ab.

Injizierbare "Depot" Formulierungen von F-I werden durch Bildung von mikroverkapselten Matrizes des Arzneimittels in bioabbaubaren Polymeren hergestellt, wie Poly(milchsäure), Poly(glycolsäure). Copolymeren aus Milchsäure und Glycolsäure, Poly(orthoester) und Poly(anhydriden), wobei diese Materialien in der Technik beschrieben sind. In Abhängigkeit des Verhältnisses des Arzneimittels zum Polymer und den Eigenschaften des im einzelnen verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung kontrolliert werden.

Injizierbare Formulierungen werden beispielsweise durch Filtration durch bakterien-zurückhaltende Filter oder durch Vorsterilisation der Komponenten des Gemisches vor deren Mischung sterilisiert, entweder zum Zeitpunkt der Herstellung oder direkt vor der Verabreichung (wie im Beispiel einer Dualkammerspritzenpackung). Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung sind unter anderem Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula.

In solchen festen Dosierungsformen wird F-I mit mindestens einem inerten, pharmazeutischen Träger gemischt, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie Stärkearten, Zucker, einschließlich Lactose und Glucose, Mannit und Kieselsäure, (b) Bindemitteln, wie Carboxymethylcellulose und anderen Cellulosederivaten, Alginate. Gelatine, Poly(vinylpyrrolidin), Saccharose und Akaziengummi, (c) Feuchtigkeitsmitteln, wie Glycerin (d) Zerfallshilfssmitteln, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat. Natriumbicarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, Silicate und Natriumcarbonat (e) Befeuchtungsmitteln, wie Glycerin, (f) Lösungsverzögerer, wie Paraffin, (g) Absorptionsbeschleunigungsmitteln, wie quarternäre Ammonium verbindungen, (h) Netzmitteln, wie Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, (i) Absorbtionsmittel, wie Kaolin und Bentoniterde und (j) Gleitmitteln, wie Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Poly(ethylenglycole), Natriumlaurylsulfat und Gemische hiervon. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen, kann die Dosierungsform auch Puffer enthalten.

Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch die Weich- und Hartgelatinekapseln zum Einfüllen mittels Hilfsstoffen, wie Lactose, wie auch hochmolekularen Poly(ethylenglycolen) und dergleichen umfassen.

Feste Dosierungsformen, wie Tabletten, Dragees, Kapseln. Pillen und Granula können auch mit Beschichtungen oder Hüllen wie Enteralbeschichtungen oder anderen Beschichtungen hergestellt werden, die in der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind. Die Beschichtungen können abdeckende Mittel oder Mittel enthalten, die die Wirkstoffe in einem bestimmten Teil des Verdauungstrakts freisetzen, wie beispielsweise säurelösliche Beschichtungen zur Freisetzung der Wirkstoffe im Magen oder basenlösliche Beschichtungen zur Freisetzung der Wirkstoffe im Intestinaltrakt.

Die Wirkstoffe können auch in einer anhaltend-freisetzenden Beschichtung mikroverkapselt werden, wobei die Mikrokapseln als Teil einer Pille oder Kapselformulierung gemacht werden.

Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung von F-I umfassen Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können die flüssigen Formulierungen inerte Verdünnungsmittel enthalten, die herkömmlich in der Technik verwendet werden, wie Wasser oder andere pharmazeutische Lösemittel, Solubilisierungsmittel und Emulgiermittel, wie Ethanol, Isopropanol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuß-, Maiskeim-, Oliven-, Rizinus- und Sesamöle), Glycerin, Tetrahydro furfurylalkohol, Poly(ethylenglycole), Fettsäureester von Sorbit und Gemische hiervon.

Neben inerten Verdünnungsmitteln können die flüssigen oralen Formulierungen auch Adjuvantien enthalten, wie Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermittel und Süß-, Geschmacks- und Duftstoffe.

Eine flüssige Suspension kann zusätzlich zu den Wirkstoffen Suspendiermittel enthalten, wie ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentoniterde, Agar-Agar und Tragacanth und Gemische hiervon.

Zusammensetzungen zur rektalen oder intravaginalen Verabreichung werden durch Mischen von F-I mit geeigneten nicht-reizenden Hilfsstoffen, wie Kakaobutter, Polyethylenglycol oder jedem Zäpfchenwachs hergestellt, das bei Raumtemperatur ein Feststoff ist, aber bei Körpertemperatur flüssig wird und daher im Rektal- oder Vaginalraum unter Freisetzung der Wirkstoffe schmilzt. Die Verbindungen werden im geschmolzenen Wachs gelöst, in die gewünschte Form gebracht und können in der schließlichen Zäpfchenform aushärten.

F-I kann auch in Form von Liposomen verabreicht werden. Wie in der Technik bekannt ist, stammen Liposomen im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen. Die Liposomenformulierungen werden durch mono- oder multilamellar hydratisierte Flüssigkristalle gebildet, die in einem wäßrigen Medium dispergiert werden. Es kann jedes nicht-toxische, pharmazeutische und metabolisierbare Lipid verwendet werden, das zur Bildung von Liposomen fähig ist. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomenform können zusätzlich zu F-I Stabilisatoren, Hilfsstoffe. Konservierungsstoffe und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind Phospholipide und die Phosphatidylcholine (Lecithine), sowohl natürlich als auch synthetisch.

Verfahren zur Bildung von Liposomen sind in der Technik bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Prescott, Herausgeber, Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976), Seite 33 und folgende.

Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.

Formulierung 1

Gelatinekapseln

Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt

Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.

Eine Tablettenformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:

Formulierung 2

Tabletten

Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt.

Formulierung 3

Tabletten, die jeweils etwa 10 und 50 mg F-I enthalten, werden folgendermaßen hergestellt

Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt.

Alternativ dazu werden Tabletten, die jeweils 2,5-1000 mg F-I enthalten, folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 4

Tabletten

F-I, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh US Sieb gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein Nr. 14 Mesh US Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C-60°C getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh US Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein Nr. 60 Mesh US Sieb gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt werden.

Suspensionen, die jeweils 0,1-1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 5

Suspensionen

Das Arzneimittel wird durch ein Nr. 45 Mesh US Sieb gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen herzustellen.

Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:

Formulierung 6

Aerosol

F-I wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf -30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.

Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 7

Zäpfchen

F-I wird durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.

Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 8

Intravenöse Lösung

Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.

Formulierung 9

Kombinationskapsel 1

Formulierung 10

Kombinationskapsel II

Formulierung 11

Kombinationstablette

Dosierung

Die bestimmte Dosis von F-I, die gemäß der Erfindung verabreicht wird, wird durch die bestimmten Umstände bestimmt, die jede Situation umgeben. Diese Umstände umfassen den Verabreichungsweg, die medizinische Vorgeschichte des Empfängers, den zu behandelnden pathologischen Zustand oder das Symptom, die Schwere des zu behandelnden Zustands/Symptoms und das Alter und das Geschlecht des Empfängers.

Im allgemeinen beträgt eine wirksame minimale Tagesdosis von F-I etwa 1, 5, 10, 15 oder 20 mg. Typischerweise beträgt eine wirksame Maximaldosis etwa 800, 100, 60, 50 oder 40 mg. Am typischsten liegt die Dosis zwischen 15 mg und 60 mg. Die exakte Dosis kann gemäß der Standardpraxis in der Medizin, nämlich der "Dosistitration" des Empfängers bestimmt werden, das heißt man verabreicht am Anfang eine geringe Dosis der Verbindung und erhöht die Dosis stufenweise bis der gewünschte therapeutische Effekt beobachtet wird.

Obwohl es notwendig sein kann, den Empfänger in Anbetracht der oben diskutierten Kombinations therapien auszutitrieren, sind typische Dosen der anderen Wirkstoffe neben F-I folgende: Ethinylöstrogen (0,01-0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05-0,15 mg/Tag), konjugierte Östrogenhormone (beispielsweise Premarin®, Wyeth- Ayerst, 0,3-2,5 mg/Tag), Medroxyprogesteron (2,5-10 mg/Tag). Norethylnodrel (1,0-10,0 mg/Tag), Nonethindron (0,5-2,0 mg/Tag), Aminoglutemid (250-1250 mg/Tag, vorzugsweise 250 mg viermal am Tag), Anastrazol (1-5 mg/Tag, vorzugsweise 1 mg einmal am Tag), Letrozol (2,5-10 mg/Tag, vorzugsweise 2,5 mg einmal pro Tag), Formestan (250-1250 mg pro Woche, vorzugsweise 250 mg zweimal pro Woche), Exemestan (25-100 mg/Tag, vorzugsweise 25 mg einmal am Tag), Goserlin (3-15 mg/drei Monate, vorzugsweise 3,6-7,2 mg einmal alle drei Monate) und Leuprolid (3-15 mg/Monat, vorzugsweise 3,75-7,5 mg einmal im Monat).

Verabreichungsweg

F-I kann durch eine Vielzahl an Routen verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Das Verabreichungsverfahren von einem jeweils Östrogen- oder Progestin-basierendem Mittel stimmt mit dem überein, das in der Technik bekannt ist. F-I alleine oder in Kombination mit Östrogen. Progestin oder einem AChE Inhibitor wird im allgemeinen in der bequemen Formulierung verabreicht.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können Menschen oder anderen Säugern (beispielsweise Hunden, Katzen, Pferden, Schweinen und dergleichen) oral, rektal, intravaginal, parenteral, topisch, bukkal oder sublingual oder nasal verabreicht werden. Der Ausdruck "parenterale Verabreichung" bezieht sich hierin auf Verabreichungsarten, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane oder intraarterielle Injektion oder Infusion umfassen.

Art/Dauer der Verabreichung

Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren wird F-I kontinuierlich von ein- bis dreimal täglich oder so oft wie nötig verabreicht, um eine wirksame Menge von F-I an den Empfänger abzugeben. Eine zyklische Therapie kann besonders bei der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle (1-6 Monate) nach medizinischen Verfahren, wie Angioplastie, beschränkt sein.

Claims

1. Kristallines 6-Hydroxy-3(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydro chloridhydrat (F-I) mit einem Röntgenbeugungsmuster, das die folgenden Peaks umfaßt: 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2 und 20,6 ± 0,2° in 2 θ, wenn es aus einer Kupferbestrahlungsquelle erhalten wird.

2. Pharmazeutische Formulierung, die die kristalline Verbindung nach Anspruch 1, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und wahlweise Östrogen, wahlweise Progestin, wahlweise einen Aromataseinhibitor, wahlweise ein LHRH Analogon und wahlweise einen Acetylcholinesterase (AChE) Inhibitor enthält.

3. Formulierung nach Anspruch 2, die die kristalline Verbindung nach Anspruch 1, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und Östrogen enthält.

4. Formulierung nach Anspruch 3, worin das Östrogen Premarin® ist.

5. Formulierung nach Anspruch 2, die die kristalline Verbindung nach Anspruch 1, einen oder mehrere pharma zeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und Progestin enthält.

6. Formulierung nach Anspruch 5, worin das Progestin aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Norethylnodrel und Norethindron.

7. Formulierung nach Anspruch 2, die die kristalline Verbindung nach Anspruch 1, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und einen AChE Inhibitor enthält.

8. Formulierung nach Anspruch 7, worin der AChE Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Physostigminsalicylat, Tacrinhydrochlorid und Donepezilhydrochlorid.

9. Formulierung nach Anspruch 2, die die kristalline Verbindung nach Anspruch 1, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe, Östrogen und Progestin enthält.

10. Verbindung nach Anspruch 1 zur Hemmung eines pathologischen Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne Prostatahyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, Hyperlipidämie, ZNS Störungen und Alzheimersche Erkrankung.

11. Verbindung nach Anspruch 10 zur Hemmung von Brustkrebs.

12. Verbindung nach Anspruch 11, worin der Hemmechanismus prophylaktisch ist.

13. Verbindung nach Anspruch 10 zur Hemmung von Ovarkrebs.

14. Verbindung nach Anspruch 10 zur Hemmung von Endometriumkrebs.

15. Verbindung nach Anspruch 1 zur Hochregulierung der Cholinacetyltransferase (ChAT) in Säugern.

16. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Kristallisation von 6- Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid aus Tetrahydrofuran.