KR100697177B1 - 신규 결정질 형태의6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[ｂ]티오펜 히드로클로라이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드의 신규 결정질 수화물 및 심혈관계 질환, 고지혈증 및 골다공증을 비롯한 에스트로겐 결핍에 관련된 질환의 증상 억제, 및 다른 병리학적 증상, 예를 들어 자궁내막증, 자궁섬유증, 에스트로겐 의존성 암(유방암 및 자궁암을 포함), 전립선 암, 양성 전립선 비대증, 알츠하이머병을 비롯한 중추신경계 질환, 유방암의 예방 및 상향 조절 ChAT의 억제를 비롯한 그의 용도에 관한 것이다.

6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드의 신규 결정질 수화물, 에스트로겐, 프로게스틴, 아로마타제 저해제, LHRH 유사체, 아세틸콜린 에스테라제(AChE) 저해제.

Description

신규 결정질 형태의 6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[ｂ]티오펜 히드로클로라이드 {A Novel Crystalline Form of 6-Hydroxy-3-(4-[2-(Piperidin-1-yl)Ethoxy]Phenoxy)-2-(4-Methoxyphenyl)Benzo[b]thiophene Hydrochloride}

도 1은 S-Ⅱ에 대한 대표적인 시차 주사 열량 측정(DSC)/TGA 기록이다.

도 2는 F-I에 대한 대표적인 DSC/TGA 기록이다.

도 3은 F-Ⅲ에 대한 대표적인 DSC/TGA 기록이다.

도 4는 F-I 및 F-Ⅲ에 대한 등온 흡습 곡선을 나타낸다.

도 5는 S-Ⅱ의 탈용매화를 건조 시간 및 온도에 대한 함수로서 나타낸 그래프이다.

6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드(아르족시펜, arzoxifene)는 최초로 미국 특허 제5,510,357호에 이름이 개시되었고, 미국 특허 제5,723,474호('474) 및 유럽 특허 출원 제0729956호에 구체적으로 개시되었다. 아르족시펜은 특히 혈청 콜레스테롤을 낮추고 고지혈증, 골다공증, 유방암 및 자궁암을 비롯한 에스트로겐 의존성 암, 자궁내막증, 알츠하이머병을 비롯한 중추신경계 질환, 대동맥의 평활근 세포 증식 및 재발협착증을 억제하는데 유용한 비스테로이드계 혼합형 에스트로겐 길항제/작용 물질이다.

구체적으로, 아르족시펜은 수용체 양성 전이성 유방암의 치료, 수용체 양성인 환자의 적절한 전신 및 국소 요법 후의 보조제 치료, 침습성 및 비침습성 유방암의 재발 감소 및 동소내 관암종(DCIS)의 발생 감소에 유용하며 임상적으로 평가중에 있다. 또한, 아르족시펜은 방사선요법, 아로마타제 저해제, LHRH 유사체 및 아세틸콜린 에스테라제(AChE) 저해제와 병용하면 유용하다.

나중에 '474에 개시된 방법에 의해 단리된 벌크 아르족시펜을 엑스선 분말 회절법(XRD), 열중량분석법(TGA), 양성자 핵자기공명법(¹H NMR) 및 칼 피셔분석법(KF)으로 분석한 결과, 상기 물질은 수화되어 있었고, 불량한 결정이었으며 그의 격자 내에 유기 휘발성 물질(에틸 아세테이트)을 일정치 않은 양으로 포함하는 것으로 나타났다.

제제화 과정 동안 불량한 결정질 물질은 통상적으로 고도의 결정질 물질보다 바람직하지 않다. 또한, 투여 대상에 대한 용매의 잠재적인 독성 및 용매의 작용으로 인한 약제 효능의 변화때문에 실질적인 양의 유기 용매(예를 들어 에틸 아세테이트)를 포함하는 약제를 제제화하는 것은 일반적으로 바람직하지 않다.

'474에 개시된 방법에 의해 제조된 아르족시펜도 약제로 사용될 수 있지만, 상업적인 규모로 재현가능하며 효율적으로 제조될 수 있는, 그의 결정 격자 내에 유기 용매를 포함하지 않는 보다 결정질인 형태의 아르족시펜을 밝혀내는 것은 매우 바람직하며 이로울 것이다.

본 발명은 구리 방사원을 사용하여 얻을때 2θ에서 7.9 ±0.2°, 10.7 ±0.2°, 14.9 ±0.2°, 15.9 ±0.2°, 18.3 ±0.2° 및 20.6 ±0.2°의 피크를 포함하는 엑스선 회절 패턴을 나타내는, 신규의 비화학량론적 수화 결정 형태인 6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드(F-I)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 F-I, 1종 이상의 제약상 담체, 희석제 또는 부형제, 및 임의로 에스트로겐, 임의로 프로게스틴, 임의로 아로마타제 저해제, 임의로 LHRH 유사체 및 임의로 아세틸콜린 에스테라제(AChE) 저해제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 F-I을 사용하여 병리학적인 증상, 예를 들어 자궁섬유증, 자궁내막증, 대동맥의 평활근 세포 증식, 재발협착증, 유방암, 자궁암, 전립선암, 양성 전립선 비대증, 골감소, 골다공증, 심혈관계 질환, 고지혈증, 중추신경계 질환 및 알츠하이머병을 억제하는 방법 및 F-I을 사용하여 상기 증상들을 억제하는 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 F-I을 사용하여 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 상향 조절(up-regulating)하는 방법 및 F-I을 사용하여 ChAT를 상향 조절하는 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

'474에 개시된 방법(실시예 41. 에탄올 및 에틸 아세테이트의 혼합물을 결정화하고, 여과하고, 필터 케이크를 실온에서 감압 하에 건조하여 항량이 되게 함)에 의해 제조된 벌크 아르족시펜을 XRD로 특성화한 결과, 불량한 결정임이 밝혀졌다. ¹H NMR로 벌크 물질이 에틸 아세테이트를 6 % 함유함을 확인하였다.

이어서, '474에 개시된 결정화 방법을 수정하여 에틸 아세테이트를 환류시키면서 에탄올을 조 아르족시펜의 현탁액에 첨가하였다. 냉각 및 감압 여과한 다음, 상기 수정된 방법에 의해 생성된 고체는 고도의 결정질인 아르족시펜의 혼합 에틸 아세테이트/수용매화물(하기에 S-Ⅱ로 언급됨)이었고, F-I의 출발 물질인 것으로 나중에 밝혀졌다.

승온에서 S-Ⅱ를 감압 건조/가열 냉각하여 S-Ⅱ의 결정 격자로부터 에틸 아세테이트를 제거함으로써 F-I을 제조할 수 있다. F-I을 제조하기 위해 S-Ⅱ을 가열 냉각하는 시간 및 온도는 상당히 다를 것이나 통상적으로는 약 100 ℃에서 약 5일 정도이다. 주변 온도에서 물중에 S-Ⅱ를 현탁시키거나 또는 3주 동안 98 % RH에서 샘플을 보관해도 F-I으로 전환되지 않기 때문에 이러한 방법을 통한 S-Ⅱ의 F-I으로의 전환은 고온에서 수행해야 한다. 또한, 고온의 대류 오븐에서 S-Ⅱ를 건조하여도 물질이 탈용매화되지 않았고, 이는 S-Ⅱ의 격자로부터 에틸 아세테이트 를 끌어내는데는 진공 상태도 필요하다는 사실을 시사한다.

바람직하게는, 주변 온도에서 테트라히드로푸란으로부터 아르족시펜(또는 그의 임의 다형체/용매화물)을 결정화하여 F-I을 쉽게 제조하고 단리할 수 있다. 이 결정화는 바람직하게는 먼저 습윤 테트라히드로푸란(물은 1 내지 10 부피%이고, 바람직하게는 2.5 내지 7.5 부피%이며, 가장 바람직하게는 4.5 내지 5.5 부피%임) 중에 아르족시펜을 용해시킨 다음, 상압 증류에 의해 상기 물을 제거하여 수행할 수 있다. 이러한 결정화의 한 예가 하기 실시예 2에 상술되어 있다. 이러한 개선된 결정화 방법에 의해 F-I을 제조하였을 때, 관련된 물질의 총량(TRS)은 0.5 % 미만일 것이다.

이러한 결정화에 적합한 아르족시펜 출발 물질에는 S-Ⅱ, F-Ⅲ, '474에 개시된 방법에 의해 제조된 아르족시펜 또는 그의 임의 혼합물이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. F-I 결정은 본 명세서에 기재된 방법에 따른 테트라히드로푸란으로부터의 결정화에 의해 생성되므로 어떤 형태의 아르족시펜으로 시작하는지는 중요하지 않다. 상업적인 규모로 F-I을 합성하는 경우, F-I을 파종하여 결정화하는 것이 이로울 것이다.

주변 온도에서 이소프로필 알콜(IPA) 및 물의 혼합물로부터 아르족시펜(또는 그의 임의 다형체/용매화물)을 결정화하여 아르족시펜의 다른 비화학량론적인 수화물인 F-Ⅲ를 쉽게 제조하고 단리할 수 있다. IPA에 대한 물의 비율(v/v)은 일반적으로 약 1:1 내지 9:1이다. 보다 바람직하게, 이 비율은 2.5 내지 5.6:1이다. 가장 바람직하게는, 이 비율은 3 내지 5.6:1이다. 물에 대한 IPA의 비율은 F-Ⅲ의 결정화를 수행하는데는 중요하지 않으나 수율에 영향을 준다. F-Ⅲ를 상업적인 규모로 합성하는 경우, F-Ⅲ을 파종하여 결정화하는 것이 이로울 것이다. 상기 결정화에 적합한 아르족시펜 출발 물질에는 S-Ⅱ, F-I, '474에 개시된 방법에 의해 제조한 아르족시펜, 또는 그의 임의 혼합물이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

S-Ⅱ, F-I 및 F-Ⅲ의 특성화 및 구별

DSC/TGA 및 XRD 방법을 이용하여 S-Ⅱ, F-I 및 F-Ⅲ을 특성화하였다. 어떤 물질에서 물리적 변화가 일어나는 온도는 일반적으로 그 다형체 또는 용매화물의 특성이므로 TGA는 흔히 어떤 물질의 다른 고체 형태들을 구분하는데 매우 유용하다. DSC는 화합물의 다형체 및 용매화물 형성을 구분하는데 흔히 사용되는 기술이다. 마지막으로, XRD는 결정 물질의 장거리 질서(long-range order) 유무를 탐지하는 기법이다.

'474에 개시된 방법에 의해 제조된 아르족시펜은 불량한 결정 물질의 지표인 불량한 입력신호 대 잡음비 및 상승한 기준선을 지닌 XRD 패턴을 나타냈다. 따라서, F-I 및 F-Ⅲ을 상기 기재된 수정된 아르족시펜 결정화 방법(에틸 아세테이트를 환류시키면서 에탄올을 아르족시펜의 현탁액에 첨가함)에 의해 제조된 물질(S-Ⅱ)과 비교하였다.

S-Ⅱ, F-I 및 F-Ⅲ에 관한 대표적인 DSC/TGA 기록은 도 1, 도 2 및 도 3에 각각 나타나 있다. S-Ⅱ에 관한 DSC 기록은 약 62 ℃에서부터 넓은 흡열부를 나타내는데 이는 격자로부터의 에틸 아세테이트 및 물의 손실에 상응한다. 약 152 ℃에서 흡열은 용융물이 되었음을 나타낸다. TGA의 약 2.5 % 중량 감소는 제1 전이 와 동시에 일어나지만 나머지 0.5 %의 중량 감소는 용융의 시작에 이르러 일어난다는 사실은 다소의 용매 분자가 격자내에 더 단단하게 보유되어 있음을 시사한다.

F-I에 관한 DSC 기록은 약 75 ℃에서부터의 넓은 흡열 구역 후에, 용융물을 의미하는 약 155 ℃에서부터의 제2의 흡열을 나타낸다. F-I에 관한 TGA 기록은 0.3 %의 점진적인 중량 감소 후에 1.5 %의 급격한 감소를 나타내고, 이는 모두 격자의 탈수화를 의미한다. 제1 DSC 전이의 시작 및 상응하는 TGA 중량 손실은 가열 속도의 차이로 인해 약간 상쇄된다. 처음의 중량 감소는 수화에 의해 약하게 보유된 물로 인한 것이지만 두번째 중량 감소는 매우 낮은 상대습도(5 % 미만-흡습 데이타 참조)에서 격자내에 존재하는 약 0.5 몰의 물로 인한 것이다.

F-Ⅲ에 관한 DSC 기록은 약 30 ℃에서 넓은 저온 흡열 후에 약 70 ℃에서 넓고 상대적으로 약한 제2의 흡열의 시작 및 약 146 ℃에서부터의 마지막 전이를 특징으로 한다. 첫번째 흡열과 동시에 일어나는 TGA에서의 급격한 1.5 %(약 0.5 몰)의 중량 감소는 약하게 보유된 물 분자의 감소에 상응하지만, 60 ℃ 이상에서 추가의 약 1.6 %의 중량 감소는 보다 단단하게 보유된 물 분자, 즉 매우 낮은 상대습도에서 존재하는 것들의 감소로 인한 것이다. 170 ℃ 이상에서 관찰된 중량 감소는 F-Ⅲ의 분해에 상응한다.

F-I 및 F-Ⅲ의 XRD 패턴은, 고도의 결정질 물질의 지표인 급격한 피크 및 평평한 기준선을 특징으로 한다. F-I, F-Ⅲ 및 S-Ⅱ의 대표적인 샘플에 관한 2θ에서의 각 피크 위치 및 상응하는 I/I_o 데이타는 표 1에 나타나 있다. 많은 강한 반 사가 대체로 동일한 회절각에서 생기지만, 각 형태는 S-Ⅱ, F-I 및 F-Ⅲ 사이의 명확한 차이를 보이는 다른 분말 패턴을 나타낸다.

임의 주어진 다형체에 대해, 회절 피크의 상대 강도는 결정 형태와 같은 인자로부터 발생하는 우세한 배향성으로 인해 변할 수 있음이 결정학 분야에 잘 알려져 있다. 우세한 배향성이 영향을 미치는 경우, 피크 강도는 변하지만, 다형체의 특징적인 피크 위치는 변하지 않는다. 예를 들어 문헌[The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18] 참조. 따라서, F-I은 피크 강도 및 피크 위치를 기준으로 패턴을 구리 방사원으로부터 얻을 때 2θ에서 7.9 ±0.2°, 10.7 ±0.2°, 14.9 ±0.2°, 15.9 ±0.2°, 18.3 ±0.2°, 20.6 ±0.2°에서의 피크의 존재로 확인할 수 있다.

F-I 및 F-Ⅲ의 다른 특징

F-I 및 F-Ⅲ에 대해 흡습성 연구를 수행하였다. F-I 및 F-Ⅲ에 관한 등온 흡습 곡선은 도 4에 나타나 있다. 먼저 샘플을 약 5 % RH에 노출시키자, F-I 및 F-Ⅲ에 대해 약 0.5 몰의 물에 해당하는 각각 1.5 % 및 1.7 %의 수분 중량이 즉시 증가하였다. 두 형태 모두 전체 습도 범위를 통해 지속적인 수분 흡수를 나타냈고, 이는 격자내에 물분자가 들어가기 때문일 것이다.

두 형태의 수분 흡수에서의 차이는 두 격자내로 혼입될 수 있는 물의 양(즉, 물분자를 수용할 수 있는 격자내 이용할 수 있는 공간의 크기)을 반영할 수 있다. F-I 및 F-Ⅲ에 대한 등온 흡습-방습 곡선에 히스테리시스가 없다는 것은 결정 형태가 임의 주어진 습도에서 빠르게 평형을 이룸을 의미한다.

F-I 및 F-Ⅲ의 흡습 프로필은 이러한 형태가 본질적으로 비화학량론적 수화물이라는 사실을 나타낸다. 실온의 상대 습도(약 50 % RH)에서, F-I은 0.5 몰의 물에 상응하는 약 1.7 %의 물을 포함하지만, F-Ⅲ은 약 0.85 몰의 물에 상응하는 약 3.0 %의 물을 흡수한다. F-I 및 F-Ⅲ의 벌크 형태는 대기와 빠르게 평형을 이루므로, 분석 기법에 의해 조사된 수분 함량은 데이타 수집시에 상대 습도의 반영이다. DSC 데이타에서 관찰된 로트 사이의 차이는 다른 주변 보관 상태로 인해 정도가 다르게 수화된 샘플때문일 것이다.

여러 상대습도(0, 22, 50 및 80 %)에서 보관된 샘플 F-I 및 F-Ⅲ에 대해 XRD 패턴을 얻었다. 상대습도 증가에 따라 2θ에서 약 13.8°, 17.6°, 18.0°, 20.5° 및 24.0°에서 처음(0 % RH)의 F-Ⅲ 피크의 점진적인 변화 및 덜 강한 피크의 약간의 이동이 있었다. F-Ⅲ에 관한 XRD 패턴에서의 이러한 관찰된 변화는 상대습 도 증가에 따라 유닛 셀 크기가 변하여 약하게 보유된 물 분자를 수용할 수도 있음을 나타낸다. 습도에 따른 피크의 지속적인 이동은 상기 RH 범위에서 점진적인 중량 증가를 보인 흡습 데이타와 상당한 상관성이 있으며 다양한 수화물 형성의 증거이다.

상대습도 변화가 격자에 유사한 영향을 주는지를 알기 위해 F-I으로 유사한 실험을 수행하였다(0, 25, 52, 73 및 95 % RH). 상대습도 증가에 따라 2θ에서 약 7.7°, 18.3°, 18.5°, 20.5°, 20.8°에서 0 % RH 피크의 매우 약간의 이동이 관찰되었다. 약 7.7°, 20.8° 및 24.1°에서의 피크도 더 높은 상대습도에서 약간 넓어지고 덜 분할되는 것으로 보이고, 이는 물이 특히 73 및 95 % RH에서 비결정질 성분 중에 흡수됨(또는 고체를 가소화함)을 나타낸다. F-I의 XRD 패턴의 피크 이동은 F-Ⅲ이 여러 상대습도에 노출될 때 관찰된 피크 이동보다 덜 급격하다. 이는 F-I 격자가 F-Ⅲ 격자와 동일한 팽창 및(또는) 수축을 겪지 않음을 시사한다.

물을 거의 2배 흡수하는 F-Ⅲ의 능력에도 불구하고, 전체 상대습도 범위에서 F-I 및 F-Ⅲ는 안정한 것으로 나타났다. 이 두 형태는 비슷한 결정 크기, 형태, 수용해도 및 용해 속도를 갖는 것으로 나타났다.

건조 연구를 수행하여 건조 시간 및 온도의 함수로 S-Ⅱ의 탈용매화를 모니터링하였다(도 5 참조). 탈용매화 실험 동안 여러 시점에서 XRD 패턴을 관찰하였다. S-Ⅱ의 탈용매화 연구에서의 많은 회절 피크가 F-I에 대해 유사한 각에서 나타났고, 이로써 S-Ⅱ 및 F-I 격자는 매우 유사함이 확인되었다. 단지 최소 건조 후에 2θ에서의 약 6.8°, 7.2°, 14.0°의 회절 피크의 소멸은 이러한 반사가 에 틸 아세테이트 분자의 부분적인 전자 밀도를 포함하는 결정 평면때문일 수 있음을 시사한다.

고온에서 감압하에 용매화된 물질의 가열 냉각을 연장하여 F-I을 얻었다. 이러한 방식으로 제조된 F-I은 XRD에서 고도의 결정성을 보여주었다. 따라서, '474에 개시된 바와 같이 에탄올 및 에틸 아세테이트의 용액으로부터 결정화한 다음, 몇시간 동안만 감압 건조하여 생성된 물질은 이 방법으로 일부만이 탈용매화된 S-Ⅱ가 만들어지기 때문에 매우 불량한 결정질을 나타낸다.

F-I 및 F-Ⅲ는 상기 기재된 선행 기술의 아르족시펜 형태에 비해 몇가지 이점을 지닌다. '474에 개시된 방법에 의해 제조된 아르족시펜에 비해, F-I 및 F-Ⅲ은 주변 온도에서 보다 안정하며, 따라서 약제 개발, 즉 투여 제형 개발에 보다 적합하다. 또한, F-I 및 F-Ⅲ는 '474에 개시된 형태보다 훨씬 더 결정질이다. 결정질 물질은 일반적으로 비결정질 물질에 비해 덜 흡습성이고 보다 안정하며(예를 들어 화학적으로 분해되기 쉽지 않고 일관된 효능을 유지함), 따라서 제제화 과정에 보다 바람직하다. 또한, 격자내에 에틸 아세테이트 및 물을 포함하는, '474에 개시된 방법에 의해 제조된 형태의 아르족시펜과는 달리 F-I 및 F-Ⅲ는 물만을 함유한다.

특성화 방법

열분석기(Thermal Analyst) 3100에 부착되어 있고 냉동화 냉각 시스템을 장착한 열분석기구 2920 모듈화 DSC(TA Instruments 2920 Modulated DSC)로 DSC 측정을 수행하였다. 10 내지 240 ℃의 온도에서 분당 2 ℃의 가열 속도로 샘플(3 내지 5 mg)을 주름형 알루미늄 팬에서 가열하였다.

열분석기(Thermal Analyst) 3100에 부착된 열분석기구 2050 열중량분석기(TA Instruments 2050 Thermogravimetric Analyzer)로 TGA 분석을 수행하였다. 25 내지 250 ℃의 온도에서 분당 5 ℃의 가열 속도로 샘플(5 내지 10 mg)을 개방형 팬에서 가열하였다. 50 kV 및 40 mA에서 작동하는, CuKα원(λ= 1.54056 Å) 및 케벡스(Kevex) 고체-상태 검출기를 장착한 지멘스(Siemens) D5000 엑스선 분말 회절기로 XRD 패턴을 얻었다. 각 샘플을 2θ내의 4°및 35°사이에서 스캐닝하였다. 데이타 수집 전에 목적하는 온도 및(또는) 상대습도에서 30분 이상 동안 샘플이 평형을 이루게 하였다.

하기의 VTI 방법을 이용하여 F-I 및 F-Ⅲ에 대해 흡습성을 측정하였다. 추가의 중량 감소가 검출되지 않을때(이 시점에서, 샘플 챔버의 상대습도는 0 %가 됨)까지 각 샘플을 60 ℃에서 감압 건조하였다. 하기 조건의 VTI 진공 수분 밸런스(VTI vacuum moisture balance)를 이용하여 25 ℃에서 등온 흡습 곡선을 얻었다. 샘플 크기: 10 내지 15 mg, 흡습/방습 범위: 상대습도 0 내지 95 %, 단계 간격: 5 %, 샘플 간격: 10분.

하기 실시예는 본 발명의 수화물을 제조하는 방법에 관한 추가의 설명이다. 이러한 방법의 범위는 어떤 면에서도 하기의 실시예에 한정되는 것으로 생각되지 않는다.

제법

제법 1

S-Ⅱ

조 아르족시펜(본 명세서에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,723,474호의 실시예 41의 방법에 의해 제조한 물질 1.58 g)을 에틸 아세테이트 28 ml 중에 현탁시키고 가열하여 환류시켰다. 에탄올(18 ml)을 첨가하여 용해시켰다. 이 용액을 20분 동안 환류시킨 다음, 실온으로 냉각하였다. 침전물을 감압 여과하여 단리하고 에틸 아세테이트 30 ml로 세척하여 흰색 고체 분말 1.05 g을 얻었다.

<실시예>

실시예 1

S-Ⅱ로부터의 F-I 제조

100 ℃에서 118시간 동안 감압 오븐(-25 in. Hg)에서 S-Ⅱ를 건조하여 F-I을 얻었다.

실시예 2

아르족시펜으로부터 F-I을 제조하는 개선된 방법

아르족시펜 25.0 g, 테트라히드로푸란 475 ml 및 물 25 ml를 환류 응축기 및 오버헤드 교반기를 장착한 3구 1리터 둥근 바닥 플라스크에 채웠다. 그 후에, 단증류(simple distillation)를 위해 반응 용기를 장착하였다. 이 반응 혼합물을 가열하여 환류시키고 증류물 250 ml를 제거하였다. 잠시 가열을 중지하고 새로운 무수 테트라히드로푸란 250 ml를 추가로 첨가하고 반응 혼합물을 환류시켰다. 상압 증류를 계속하여 추가의 250 ml 증류물을 제거하였다. 가열을 중지하고 새로운 무수 테트로히드로푸란 250 ml를 첨가하고 추가의 250 ml 증류물을 제거하였다. 추 가의 테트라히드로푸란 250 ml를 첨가하고 반응 혼합물을 환류 하에 두었다. 테트라히드로푸란을 첨가하자 흰색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 교반하여 3시간 동안 천천히 냉각하고 이 시간 동안 추가의 고체 침전물 및 슬러리는 주변 온도에 도달했다. 결정질 슬러리를 여과하고 약한 N₂ 퍼징제로 50 ℃에서 48시간 동안 감압 건조하였다. 수율: 22.50 g(90.0 %). XRD 분석 결과, 습윤 케이크 및 건조 고체의 스펙트럼은 사실상 동일하고 앞서 제조된 F-I의 스펙트럼과도 사실상 동일한 것으로 나타났다. DSC 분석 결과, 용융점은 157 ℃였으나, TGA 분석 결과, 실온 내지 100 ℃에서 1.5 %의 질량 감소가 나타났다. 유리 염기로 측정한 HPLC 순도는 92.9 %의 이론치에 대비해 88.1 %이었다. HPLC 분석 결과, 관련된 물질 총량은 0.44 %였다.

실시예 3

6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜-(S-옥시드)로부터의 F-I의 제조

테트라히드로푸란(261 ml), 물(45 ml), 농축 황산(6.14 g) 및 6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜-(S-옥시드)(HPLC 순도 99 %, HPLC 관련된 물질 총량은 0.35 %)를 합하여 균질할때까지 교반하였다. 10 % Pd/C(물 22 ml 중에 슬러리 5.6 g)을 첨가하고 물 5 ml로 씻었다. 생성된 슬러리를 모아서 60 psi의 수소로 덮었다. 반응 온도를 30 ℃로 조정하였다. 2시간 후에, 10 % Pd/C(5.6 g)에 물(30 ml)을 첨가하였다. 60 psi 및 30 ℃에서 추가로 22시간 동안 수소 첨가를 지속하였다. 물 30 ml중에 10 % Pd/C 4.4 g을 추가로 첨가하고 60 psi 및 30 ℃에서 추가로 2.5시간 동안 수소 첨가를 지속하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 50 % 수산화나트륨을 사용하여 여과물의 pH를 7.24로 조정하였다. 물(18 ml) 중에 용해된 염화나트륨(8.66 g)을 첨가하고 이 이상성(biphasic) 용액을 30분 동안 교반하였다. 상이 분리되었고 수상을 다시 테트라히드로푸란 50 ml로 추출하였다. 유기상을 모아서 상압 증류에 의해 농축시켜 부피가 50 ml가 되게 하였다. 24 ℃에서 1시간에 걸쳐 농축물에 메탄올 180 ml를 첨가하였다. 생성된 결정질 슬러리를 24 ℃에서 30분 동안 교반하고 0 ℃로 냉각한 다음, 1시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하여 단리한 다음, 물 39 ml 및 메탄올 39 ml로 세척하고 50 ℃에서 철야 감압 건조하였다. 수율: 15.52 g(67.8 %).

상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, 상기 생성물의 분획(10 g)을 테트라히드로푸란 및 물로 재결정화하였다.

유용성

본 명세서에서 사용된 "유효량"이라는 용어는 본 명세서에 기재된 증상 또는 그의 해로운 작용을 억제할 수 있는 F-I의 양을 의미한다. F-I을 에스트로겐, 프로게스틴, 아로마타제 저해제, LHRH 유사체 또는 AChE 저해제와 함께 투여할 때, "유효량"이라는 용어는 목적하는 효과를 낼 수 있는 상기 물질의 양을 의미하기도 한다.

"억제" 및 "억제하다"라는 용어에는 일반적으로 용인된 그의 의미, 즉 본 명세서에 기재된 병리학적 증상의 심도 또는 그의 속발증의 예방, 금지, 제지, 완화, 개선, 지연, 중단 또는 역전이 포함된다.

"방지", "~의 방지", "예방", "예방성" 및 "방지하다"라는 용어는 본 명세서에서는 서로 바꿔쓸 수 있고 F-I을 투여한 환자가 본 명세서에 기재된 병리학적 증상 또는 그의 속발증을 일으키거나 또는 발생시킬 가능성을 감소시키는 것을 의미한다.

"에스트로겐이 결핍된" 및 "에스트로겐 결핍"이라는 용어는 여성이 에스트로겐 의존성 기능, 예를 들어 월경, 골 질량의 항상성, 신경 기능, 심혈관계 증상 등을 유지하는 충분한 내부생성 에스트로겐 호르몬을 생산할 수 없는, 자연적으로 발생하거나 또는 임상적으로 유도된 증상을 의미한다. 이러한 에스트로겐 결핍 상황은 그와 기능적으로 동등한, 예를 들어 아로마타제 저해제, GnRH 작용제 또는 길항제, ICI 182780 등을 투여하는 것을 비롯한 폐경기 및 수술 또는 화학적 난소 적출로부터 발생하나 이에 한정되지 않는다. 에스트로겐 결핍 상태에 관련된 질환 상태에는 골 감소, 골다공증, 심혈관계 질환 및 고지혈증이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 "에스트로겐"이라는 용어에는 에스트로겐 활성을 지닌 스테로이드계 화합물, 예를 들어 17β-에스트라디올, 에스트론, 컨쥬케이트 에스트로겐(프레마린(Premarin, 등록상표)), 에퀸 에스트로겐 17β-에티닐 에스트라디올 등이 포함된다. 바람직한 에스트로겐계 화합물은 프레마린(Premarin, 등록상표) 및 노르에틸노드렐이다.

본 명세서에 사용된 "프로게스틴"이라는 용어에는 프로게스틴성 활성을 지닌 화합물, 예를 들어 프로게스테론, 노르에틸노드렐, 논게스트렐, 메게스트롤 아세테이트, 노르에틴드론 등이 포함된다. 노르에틴드론은 바람직한 프로게스틴계 물질이다.

본 명세서에 사용된 "아로마타제 저해제"라는 용어에는 아로마타제를 저해할 수 있는 화합물, 예를 들어 시판되는 저해제, 예를 들어 아미노글루테미드(시탄드렌(CYTANDREN, 등록상표)), 아나스트라졸(아리미덱스(ARIMIDEX, 등록상표)), 레트로졸(페마라(FEMARA, 등록상표)), 포르메스탄(레나트론(LENATRON, 등록상표)), 엑세메스탄(아로마신(AROMASIN, 등록상표)) 등이 포함된다.

본 명세서에 사용된 "LHRH 유사체"라는 용어는 예를 들어 고세르린(졸라덱스(ZOLADEX, 등록상표)), 루프롤리드(루프론(LUPRON, 등록상표)) 등을 비롯한, 폐경전의 여성에서 에스트로겐 생성을 저해하는 호르몬을 방출하는 젖분비 호르몬의 유사체를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "AChE 저해제"라는 용어에는 아세틸콜린 에스테라제를 억제하는 화합물, 예를 들어 피소스티그민 살리실레이트, 타크린 히드로클로라이드, 도네페질 히드로클로라이드 등이 포함된다.

"ChAT를 상향 조절하다"라는 용어는 ChAT 효소 활성을 증가시키는 것, 즉 콜린의 아세틸콜린으로의 전환을 촉진하는 것을 의미한다. 이러한 촉진에는 효율, 및(또는) ChAT 및 콜린의 반응 속도의 증가 및(또는) 반응 부위에 존재하는 ChAT 양의 증가를 의미한다. 존재하는 효소 양에서의 이러한 증가는 유전자 조절 또는 다른 효소 형성의 합성 단계 및(또는) 효소의 실활화 및 대사에서의 감소때문일 수 도 있다.

<시험 절차>

일반적 랫트 준비 과정: 75일 된(다른 지시가 없다면) 암컷 스프라그 돌리 랫트(200 내지 225 g의 중량 범위)를 찰스 리버 실험실(Charles River Laboratories, Portage MI)에서 구입하였다. 랫트의 양쪽 난소를 적출하거나(OVX) 또는 찰스 리버 실험실에서 겉보기 수술 과정을 수행케 한 다음, 1주 후에 선적하였다. 도착한 다음, 우리 당 3 또는 4마리 군의 랫트를 금속제의 매다는 우리 안에 가두고 1주 동안 자유롭게 음식(칼슘 함량 약 0.5 %) 및 물을 주었다. 최소 40 %의 상대습도에서 실온을 22.2 ±1.7 ℃의 온도로 유지하였다. 실내 광주기는 12시간 동안은 빛을 주고 12시간 동안은 어둡게 하였다.

투여 요법 조직 수득: 1주 동안의 순응 기간 후에(따라서 OVX 2주 후), F-I을 매일 투여하기 시작하였다. 다른 지시가 없다면 1 % 카르복시메틸셀룰로스 중의 현탁액으로 또는 20 % 시클로덱스트린 중에 용해시켜 17α-에티닐 에스트라디올 또는 F-I을 경구투여하였다. 4일 동안 매일 랫트에 투여하였다. 투여 요법 후에, 랫트를 계체하고 케타민:크실라진(2:1, v:v) 혼합물로 마취하고 심장을 천자하여 혈액 샘플을 모았다. 그 후에, 랫트를 CO₂로 질식사시키고 중심선을 절개하여 자궁을 제거하고 습윤 자궁 중량을 측정하였다. 시그마 화학 주식회사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로부터 17α-에티닐 에스트라디올을 구입하였다.

심혈관계 질환/고지혈증

상기 혈액 샘플을 실온에서 2시간 동안 응집되게 한 다음, 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었다. 베링거 만하임 디아그노틱스(Boehringer Mannheim Diagnostics)사의 고성능 콜레스테롤 분석법을 이용하여 혈청 콜레스테롤을 측정하였다. 요컨대, 콜레스테롤을 콜레스트-4-엔-3-온 및 과산화수소로 산화시켰다. 그 다음, 페록시다제의 존재 하에 과산화수소를 페놀 및 4-아미노페나존과 반응시켜 p-퀴논 이민 염료를 제조하고 500 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 그 다음, 표준 곡선과 비교하여 콜레스테롤 농도를 구하였다. 바이오멕 자동화 워크스테이션(Biomek Automated Workstation)을 이용하여 전체 분석을 자동화하였다.

자궁의 에오시노필 페록시다제 분석법

효소 분석할 때까지 상기 자궁을 4 ℃로 유지하였다. 그 다음, 자궁을 0.005 % 트리톤 X-100을 포함하는 50 mM 트리스 완충액(pH 8.0) 50 부피 중에 균질화하였다. 트리스 완충액 중에 0.01 % 과산화수소 및 10 mM o-페닐렌디아민(최종 농도)을 첨가한 다음, 450 nm에서 1분 동안 흡광도 증가를 모니터링하였다. 자궁에서 에오소노필의 존재는 화합물의 에스트로겐 활성에 관한 지표이다. 반응 그래프의 처음의 직선 부분에 대해 15초 간격으로 최대 속도를 측정하였다.

골 감소(골다공증) 시험 방법의 억제

상기 기재된 일반적인 제조 방법에 따라, 35일 동안 매일 랫트를 처리하고 36일째 날에 CO₂로 질식사시켰다. 35일이라는 기간은 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정된 골밀도를 최대로 감소시키기에 충분하였다. 랫트를 죽일 때 자궁을 제 거하고 다른 조직이 없도록 해부하고, 완전한 난소 적출과 관련된 에스트로겐 결핍을 확인하기 위해 습윤 중량을 측정하기 전에 유체 함유물을 배출시켰다. 자궁 적출시에 자궁 중량은 일반적으로 약 75 %로 준다. 그 다음, 자궁을 중성으로 완충된 10 % 포르말린에 놓은 다음 해부 분석하였다.

오른쪽 대퇴부를 절개하고 디지털화 엑스선을 발생시키고 골간단 끝부분에서 화상 분석 프로그램(NIH 화상)으로 분석하였다. 정량적으로 계산된 엑스선 단층 촬영법으로 상기 랫트 트리비애(tribiae)의 인접면도 스캐닝하였다. 상기 방법에 따라, 20 % 히드록시프로필 β-시클로덱스트린 중에 F-I 또는 에티닐 에스트라디올(EE₂)을 시험 동물에 경구투여하였다. F-I도 에스트로겐 또는 프로게스틴과 병용할 수 있다.

MCF-7 증식 분석법

MCF-7 유방 선암 세포(ATCC HTB 22)를 10 % 우태아 혈청(FBS)(v/v), L-글루타민(2 mM), 소듐 피루베이트(1 mM), HEPES{(N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산]10 mM}, 비필수 아미노산 및 우 인슐린(1 ug/mL)(지속 배지)을 보충한 MEM(최소 필수 배지, 페놀 레드 없음, Sigma, St. Louis, MO) 중에 유지하였다. 분석 10일 전에, MCF-7 세포를 내부 저장 스테로이드를 고갈시키기 위해 10 % FBS 대신에 10 % 덱스트란-코팅 탄화물을 제거한 우태아 혈청(DCC-FBS)을 보충한 지속 배지로 옮겼다. 세포 분리 배지(10 mM HEPES 및 2 mM EDTA를 보충한 Ca++/Mg++ 유리 HBSS(페놀 레드 없음))를 사용하여 지속 플라스크로부터 MCF-7 세포를 제거하였 다. 세포를 분석 배지로 2회 세척하고 80,000 세포/ml로 조정하였다. 약 100 ml(8,000 세포)를 평평한 바닥의 미세배양 웰(Costar 3596)에 첨가하고 37 ℃에서 5 % CO₂로 습윤된 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션하여 전달 후에 세포가 부착하고 평형을 이루게 하였다. 희석 대조군으로 약물 또는 DMSO를 단계 희석하여 분석 배지 중에 준비하고 50 ml을 3개의 동일한 미세배양물에 옮긴 다음, 50 ml 분석 배지에 옮겨 최종 부피가 200 ml이 되게 하였다. 37 ℃에서 5 % CO₂ 습윤 인큐베이터 중에 48시간 동안 추가로 인큐베이션한 다음, 미세배양물을 4시간 동안 삼중수소화 티미딘(웰당 1 uCi)과 함께 4시간 동안 펄싱하였다. -70 ℃에서 24시간 동안 동결시킨 다음, 해동시키고 스카트론 반자동 세포 수획기(Skatron Semiautomatic Cell Harvester)를 이용하여 미세배양물을 수획하여 배양을 종결하였다. 웰락 베타플레이스 β계측기(Wallac BetaPlace βcounter)를 사용하여 액체 섬광으로 샘플을 계수하였다.

DMBA-유도 유방암 억제

인디애나주 인디애나폴리스 소재의 할란 인더스트리사(Harlan Industry)에서 구입한 암컷 스프라그 돌리에 에스트로겐 의존성 유방암을 발생시켰다. 약 55일 째에 랫트에게 7,12-디메틸벤즈[a]안트라센(DMBA) 20 mg을 한번에 경구투여하였다. DMBA 투여하고 약 6주 후에, 1주 간격으로 발암되었는지 유선을 촉진하였다. 하나나 그 이상의 종양이 발생할 때마다 각각의 종양의 최장 및 최단 직경을 측정용 캘리퍼로 측정하고 측정치를 기록하여 실험용 동물을 선별하였다. 평균 크기의 종양 이 시험군 사이에 동등하게 분포하도록 시험처리군 및 대조군에 여러 크기의 종양이 균일하게 분포되도록 하였다. 각 실험의 대조군 및 시험군은 동물을 5 내지 9마리 포함하였다. 2 % 아카시아검을 복강내 주입하거나 또는 경구로 F-I을 투여하였다. 경구 투여 화합물을 용해하거나 또는 옥수수유 0.2 ml 중에 현탁하였다. 아카시아검 및 옥수수유 대조 치료제를 비롯한 각 치료제를 각 시험 동물에 매일 1회 투여하였다. 시험 동물의 처음의 종양 측정 및 선별 후에, 상기 언급된 방법에 의해 종양을 매주 측정하였다. 동물의 치료 및 측정을 3 내지 5주 동안 계속하고 이 기간에 종양의 최종 면적을 측정하였다. 각 화합물 및 대조 치료제에 대해, 평균 종양 면적의 변화를 결정하였다.

자궁 섬유증 시험 방법

시험 1: 자궁 섬유증에 걸린 3 내지 20명의 여성에게 F-I을 투여하였다. 투여된 화합물의 양은 하루에 0.1 내지 1000 mg이고, 투여 기간은 3개월이었다. 투여 기간 동안 및 투여 중단후 3개월까지 자궁 섬유증에 대한 효과에 대해 이 여성들을 관찰하였다.

시험 2: 투여 기간이 6개월이라는 점을 제외하면 시험 1과 동일한 방법이 사용되었다.

시험 3: 투여 기간이 1년이라는 점을 제외하면 시험 1과 동일한 방법이 사용되었다.

시험 4: 장기간의 에스트로겐 자극을 이용하여 성적으로 성숙한 암컷 기니 피그에서 평활근종을 유발시켰다. 2 내지 4개월 동안 또는 종양이 발생될 때까지 이 동물에 주당 3 내지 5회 에스트라디올을 주사하여 투여하였다. F-I 또는 비히클로 이루어진 치료제를 3 내지 16주 동안 매일 투여한 다음, 동물을 죽이고 자궁을 수획하고 종양 퇴화를 분석하였다.

시험 5: 인간 평활근 조직을 성적으로 성숙한, 난소를 제거한 암컷의 흉선 없는 마우스의 복강 및(또는) 자궁근육층에 이식하였다. 외생의 에스트로겐을 공급하여 이식된 조직의 성장을 유도하였다. 어떤 경우에는, 수획된 종양 세포를 이식하기 전에 시험관내에서 배양하였다. F-I 또는 비히클로 이루어진 치료체를 3 내지 16주 동안 매일 기준으로 위세척으로 공급하고 이식물을 제거하고 성장 또는 퇴화를 결정하였다. 죽일 때, 자궁을 수획하여 장기의 상태를 평가하였다.

시험 6: 인간 자궁의 섬유종 조직을 수획하고 1차 비형질전환 배양으로 시험관내에 유지하였다. 수술 견본을 무균 메쉬 또는 분자체를 통과시키거나 또는 별도로 주변 조직으로부터 떼어내 단일한 세포 현탁액을 생성시켰다. 10 % 혈청 및 항생제를 포함하는 배지에서 세포를 유지하였다. 에스트로겐의 존재 및 부재하에 생장 속도를 측정하였다. 보체 성분 C3를 생성하는 세포의 능력 및 성장 요인 및 성장 호르몬에 대한 세포의 반응을 분석하였다. 시험관내에서 프로게스틴, GnRH, F-I 및 비히클 처리에 따른 배양의 증식 반응을 평가하였다. 스테로이드 호르몬 수용체의 수준을 주마다 평가하여 중요한 세포 특성이 시험관내에서 유지되는지를 결정하였다. 환자 5 내지 25명의 조직을 사용하였다.

시험 7: 에스트로겐으로 촉진된 평활근 유래의 ELT 세포 라인의 증식을 억제하는 F-I의 능력을 사실상 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 푸크스-영(Fuchs- Young) 등의 문헌["Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17(3):151-159 (1996)]에 개시된 바와 같이 결정하였다.

자궁내막증 시험 방법

시험 1: 시험 동물로 성체 CD 종 암컷 랫트 12 내지 30마리를 사용하였다. 이 랫트를 동수의 3군으로 분류하였다. 모든 랫트의 발정 주기를 모니터링하였다. 발정 전날에, 각 암컷을 수술하였다. 각 군의 암컷의 좌측 자궁각을 제거하고 작은 조각으로 절단하고 조각를 장간막 혈류에 인접한 여러 부위에 느슨하게 봉합하였다. 또한, 2군의 암컷의 난소를 제거하였다. 수술 다음날, 1군 및 2군의 랫트에게는 14일 동안 물을 복강내 주사로 투여하였으나 3군의 랫트에는 같은 기간 동안 체중 1 kg 당 F-I 1.0 mg을 복강내 주사로 투여하였다. 치료 14일 후에, 해부 검사를 위해 각 암컷을 죽이고 적절한 자궁내막 체외이식편, 부신, 남은 자궁 및 난소를 떼어내어 준비하였다. 난소 및 부신의 무게를 쟀다.

시험 2: 시험 동물로 성체 CD 종 암컷 랫트 12 내지 30마리를 사용하였다. 이 랫트를 동수의 2군으로 분류하였다. 모든 랫트의 발정 주기를 모니터링하였다. 발정 전날에, 각 암컷을 수술하였다. 각 군의 암컷의 좌측 자궁각을 제거하고 작은 조각으로 절단하고 조각을 장간막 혈류에 인접한 여러 부위에 느슨하게 봉합하였다. 수술하고 약 50일 후에, 1군의 랫트에는 21일 동안 물을 복강내 주사로 투여하였으나 2군의 랫트에게는 같은 기간 동안 체중 1 kg 당 F-I 1.0 mg을 복강내 주사로 투여하였다. 치료 21일 후에, 각 암컷을 죽이고 자궁내막 체외이식편 및 부신을 떼어내고 무게를 쟀다. 성장의 지표로 체외이식편을 측정하였다. 발정 주기를 모니터링하였다.

시험 3: 자궁내막 조직의 방사선조사를 이용하여 랫트 및(또는) 토끼의 자궁내막증을 유발시켰다. 생식적으로 성숙한 암컷 동물의 양측의 난소를 적출하고 에스트로겐을 외부에서 공급하여 특이적이고 일정한 수준의 호르몬을 제공하였다. 자가 이식한 자궁내막 조직을 동물 5 내지 150 마리의 복강에 이식하고 에스트로겐을 공급하여 체외이식 조직의 성장을 유도하였다. 본 발명의 화합물로 이루어진 치료제를 3 내지 16주 동안 매일 위세척을 통해 공급하였고, 이식 조직을 떼어내고 증식 또는 퇴화를 측정하였다. 죽일 때, 손상되지 않은 자궁각을 수획하여 자궁내막의 상태를 평가하였다.

시험 4: 인간 자궁내막 손상 조직을 성적으로 성숙한, 난소를 제거한 암컷 흉선 없는 마우스의 복강에 이식하였다. 외부에서 에스트로겐을 공급하여 체외이식된 조직의 성장을 유도하였다. 어떤 경우에는, 수획된 종양 세포를 이식하기 전에 시험관내에서 배양하였다. F-I으로 이루어진 치료제를 3 내지 16주 동안 매일 기준으로 위세척을 통해 공급하고 이식물을 떼어내어 증식 또는 퇴화를 측정하였다. 죽일 때, 자궁을 수획하여 손상되지 않은 자궁내막의 상태를 평가하였다.

시험 5: 인간 자궁내막 손상 조직을 수획하고 1차 비형질전환 배양으로 시험관내에 유지하였다. 수술 견본을 무균 메쉬 또는 분자체에 통과시키거나 또는 주변 조직으로부터 떼어내 단일한 세포 현탁액을 생성시켰다. 10 % 혈청 및 항생제를 포함하는 배지에서 세포를 유지하였다. 에스트로겐의 존재 및 부재 하에 생장 속도를 측정하였다. 보체 성분 C3를 생성하는 세포의 능력 및 성장 요인 및 성장 호르몬에 대한 세포의 반응을 분석하였다. 시험관내에서 프로게스틴, GnRH, F-I 및 비히클 처리에 따른 배양의 증식 반응을 평가하였다. 스테로이드 호르몬 수용체의 수준을 매주 평가하여 중요한 세포 특성이 시험관내에서 유지되는지를 결정하였다. 환자 5 내지 25명의 조직을 사용하였다.

알츠하이머 병을 비롯한 중추신경계 질환

에스트로겐, 예를 들어 17β-에스트라디올은 특정 세포 집단의 세포질에 있는 에스트로겐 수용체(ER)에 결합하여 유전자 전사를 조절한다. ER의 리간드 활성화는 13 염기쌍 회문구조 DNA 컨센서스 서열에 결합(에스트로겐 반응 요소, 또는 ERE)하면 적합한 목적 유전자의 활성화를 최고조에 달하게 하는 전사 기구의 조립을 개시하는 복합체의 핵내 운반에 필수적이다. 에스트로겐에 의해 조절되는 여러 가지 유전자가 확인되었다. 이러한 유전자에는 세포내 골격 단백질, 신경전달 물질 생합성 및 대사 효소, 및 수용체뿐 아니라, 다른 호르몬 및 신경 펩티드에 관한 유전자가 포함된다. ERE는 비텔로제닌, c-fos, 프로락틴 및 젖분비 호르몬을 비롯한 많은 에스트로겐 반응성 유전자에서 확인되었다.

중추신경계에서 중요한 ERE-유사 서열을 p75ngr 및 trkA에서 확인하였고, 두가지 모두 뉴트로핀에서 신호 분자(신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래의 신경 성장 인자(BDNGF) 및 뉴트로핀-3) 역할을 한다.

BDNF 및 NGF는 배양 중에 콜린성 뉴런의 생존을 촉진하는 것으로 나타났다. 뉴트로핀 및 에스트로겐 사이의 상호작용이 전뇌 기저부의 뉴런(알츠하이머 병에서 는 퇴화됨)의 발달과 생존에 중요하다면 에스트로겐의 결핍이 나타나는 임상 증상(폐경기 후와 같이)은 이러한 뉴런의 감소때문일 수 있다.

난소 적출한 랫트(상기 기재된 바와 같이 준비함)에서 하기 실험을 수행하여 다양한 뇌 영역에서의 유전자 발현에 영향을 주는 F-I 및 에스트로겐 사이의 유사점 및(또는) 차이점을 결정하였다. 6주된 랫트에 에스트라디올 벤조에이트(0.03 mg/kg), F-I 또는 비히클(대조)을 피하 주사로 매일 투여하였다. 치료 5주 후에, 동물을 죽이고 그의 뇌를 제거하고 미세 절개하여 해마상 융기를 수획하였다. 해마상 융기를 액체 질소로 빨리 동결시키고 -70 ℃에서 저장하였다. 적합한 처리로 모은 조직 및 대조군으로부터 전체 RNA를 준비하고 특이적 mRNA(폴리-A+) 집단에 대해 선택한 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 랜덤 5' 올리고뉴클레오티드(10 염기쌍 길이, 총 150), 반응 완충액, 태크 중합효소 및 ³²PdTCP로 이루어진 혼합물에서 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. 40회 증폭한 다음, 반응 생성물을 6 % TBE-우레아 겔 상에서 크기대로 나누고 건조하고 엑스선 필름에 노출시켰다. 치료군 사이의 생성된 mRNA 표시 패턴을 비교하였다.

에스트로겐과 함께 F-I의 사용

폐경 전 및 폐경 후의 여성은 흔히 호르몬 대체 요법(HRT)을 통해 순환하는 내생적인 에스트로겐의 저하와 관련된 부정적인 결과를 막고자 한다(예를 들어 핫 플래쉬(hot flash)를 처리함). 그러나, HRT는 자궁암 및 유방암을 비롯한 몇가지 암에 대한 위험 증가와 관련이 있었다. 이러한 위험을 억제하기 위해 HRT와 함께 F-I을 사용할 수도 있다.

아로마타제 저해제와 함께 F-I의 사용

당연히, 폐경기 후의 여성의 난소는 기능하지 않는다. 그녀의 유일한 에스트로겐 공급원은 주변 조직(지육, 근육 및 유방암 자체를 비롯한)에서 발견되는 효소인 아로마타제에 의한 부신 안드로겐의 에스트로겐으로의 전환을 통한 것이다. 따라서, 아로마타제를 저해하는 약물(아로마타제 저해제)은 폐경기 후의 여성에게서 순환하는 에스트로겐을 고갈시킨다. 아로마타제 저해에 의한 에스트로겐 결핍은 전이성 유방암에 걸린 환자에게는 치료에 있어 중요한 선택적 문제이다. 아로마타제 저해제로 치료하는 동안, 순환하는 에스트로겐의 부족은 예를 들어 혈청 지질 수준에 있어 부정적이고 의도하지 않은 부작용을 유발할 수 있다. F-I을 사용하여 이러한 부정적인 효과를 억제할 수 있다.

LHRH 유사체와 함께 F-I의 사용

LHRH(젖분비 호르몬 방출 호르몬) 유사체에 지속적으로 노출시키자 뇌하수체 선의 감도가 줄어들었고 이는 에스트로겐을 생산하는 난소를 더이상 자극하지 않아 폐경기전 여성의 에스트로겐 생산은 억제되었다. 이러한 임상 효과는 LHRH 유사체가 휴지된 후에는 가역적인 것인 "의학적 난소 적출"이다. LHRH 유사체로 치료하는 동안, 순환하는 에스트로겐의 부족은 예를 들어 혈정 지질 수준의 부정적이고 의도하지 않은 부작용을 일으킬 수 있다. F-I을 사용하여 이러한 부정적인 효과를 억제할 수 있다.

아세틸콜린 수준의 증가

알츠하이머 병을 고통받는 환자는 알츠하이머 병에 걸리지 않은 대등한 사람들에 비해 해마상 융기에서의 두드러지게 낮은 수준의 콜린성의 뉴런을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 콜린성의 뉴런의 점진적인 감소는 이러한 환자의 점진적인 기억 및 인식 기능의 상실을 반영하는 것으로 보인다. 이러한 뉴런 감소의 한 이유는 신경 전달 물질인 아세틸콜린의 상실 또는 기능 감소라고 생각된다.

뉴런에서의 아세틸콜린 수준은 기본적으로 그의 생합성 및 생분해 평형에 의해 결정된다. 효소인 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)는 주로 아세틸콜린 합성 역할을 하고 아세틸콜린에스테라제(AChE)는 그의 분해 역할을 한다.

ChAT 수준에 대한 F-I의 효과를 결정하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 상기 기재된 일반적인 랫트 준비 과정에 따라, 40마리의 랫트에게 매일 피하 주사 또는 경구적 위관영양법에 의해 10 % 시클로덱스트린을 포함하는 비히클 중에 3 mg/kg/일의 F-I, 0.03 또는 0.3 mg/kg/일의 에스트라디올 벤조에이트 또는 비히클 대조를 투여하였다. 동물을 3일 또는 10일 동안 처리하였다. 각 투여 요법 당 20마리의 동물이 있었다. 적절한 시간 간격에서, 동물을 죽이고 그의 뇌를 절개하였다. 뇌의 특정 부분을 균질화하고 분석하였다. 해마상 융기 및 전뇌 피질로부터의 균질물을 가공하고 아세틸콜린 생합성에 대한 방사성 표지 분석법에 의해 ChAT 활성을 결정하였다. 이러한 과정은 본 명세서에 참고문헌으로 인용된 쇼엡(Schoepp) 등의 문헌[J. Neural Transmiss., 78:183-193, 1989]에서 찾을 수 있다.

OVX 동물에서 예상된 바와 같이, ChAT 수준은 모의로 조작된 대조군에 비해 50 %(p < 0.001) 이상 감소되었다.

본 발명의 다른 실시태양에서, F-I은 AChE 저해제와 함께 사용되었다. AChE 저해제의 사용은 AChE의 저해를 통해 아세틸콜린의 분해를 차단하여 아세틸콜린의 수준을 증가시킨다.

양성 전립선 비대증(BPH)

에스트로겐 작용과 BPH 및 전립선 암종의 치료 사이의 관계에 대한 배경 지식에 대해서는 PCT 출원 제WO98/07274호(국제 출원일: 1998년 10월 15일) 참조.

하기 기재된 실험에서, 몇가지 인간 전립선 암세포 라인의 에스트로겐 수용체에 결합하는 F-I의 능력을 평가하였다.

LNCaP, DU-45 및 PC-3 인간 전립선 암세포 라인의 용해물을 50 nM 트리스·HCl(pH 7.4), 1.5 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.4 M KCl, 10 % 글리세롤, 0.5 mM 2-ME 및 10 mM 소듐 몰리브데이트를 포함하고 추가로 프로테아제 저해제인 펩스타틴(1 mg/ml), 루펩틴(2 mg/ml), 아프로티닌(5 mg/ml) 및 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF, 0.1 mM)을 포함하는 TEG배지(TEGP)에서 제조하였다.

세포 용해물을 원심분리하고 펠릿을 찬 TEGP(펠릿 100 mg 당 TEGP 1 ml)에 재현탁시키고 및 브란손 모델 450 소니피어(Branson Model 450 Sonifier)로 30초 동안 초음파처리하였다(주기 효율 70 %, 산출 1.8). 상등액을 따라내고 각각을 즉시 사용하고 -70 ℃에서 보관한 다음, 4 ℃에서 15분 동안 10,000 x G에서 원심분리하여 용해물을 펠릿으로 만들었다.

경쟁적 결합 분석: 결합 완충제는 0.4 M KCl을 50 mM NaCl로 치환하고 난알 부민 1 mg/ml을 추가로 첨가한 TEG이다(TEGO). F-I을 TEGO 중에 20 nM로 희석하고 이를 3개의 단계 배율로 희석한 것들을 제조하였다. 3개의 동일한 마이크로웰의 둥근바닥 폴리프로필렌 마이크로플레이트로 분석하였다. 각 웰에 삼중수소화 17β-에스트라디올 35 ml(0.5 nM, 특이적 활성 60.1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) 및 찬 경쟁 시험 화합물(0.1 nM 내지 5 mM) 또는 TEGO를 첨가한 다음, 4 ℃에서 5분 동안 진탕하면서 인큐베이션하고 MCF-7 세포 라인 용해물 70 ml를 첨가하였다.

플레이트를 4 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 각 웰에 덱스트란-코팅 탄화물(DCC) 70 ml를 첨가한 다음, 4 ℃에서 8분 동안 강력 진탕하였다. 그 다음, 플레이트를 4 ℃에서 10분 동안 1500 x G에서 원심분리하였다. 각 웰로부터 상등액을 수획하고 웰락 미코베타 모델 1450 측정기(Wallac Micobeta Model 1450 counter)로의 섬광 계수를 위해 가요성 폴리스티렌 마이크로플레이트에 넣었다. 계수 효율(35 내지 40 %) 및 배경값을 위해 보정한 다음, 분당 붕괴(DPM)로 방사 활성을 나타냈다. 다른 대조값은 총 계수치 및 DCC 추출가능한 계수치의 정의된 하한치에 대한 총 계수치 + DCC이다. 이러한 경쟁적 결합 분석의 결과는 하기 식을 이용하여 평균 결합 %(결합 %) +/- 표준편차로 나타냈다.

결합 % = [(DPM_{시험 화합물} - DPM_{총 계수치+DCC})/(DPM_{시험 화합물 없음} - DPM_{총 계수치+DCC})] x 100

유방암의 예방

또한, 본 발명은 드노보(de novo) 유방암 발생 위험이 있는 환자에게 F-I을 투여하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 "드노보"라는 용어는 첫번째 경우로 정상적인 유방 세포를 암 또는 악성 세포로 형질전환 또는 변형의 부족을 의미한다. 이러한 형질전환은 진화 과정을 통해 동일한 세포 또는 딸세포에서 일어날 수 있거나 또는 하나의 중추적 사건에서 일어날 수 있다. 이 드노보 과정은 이미 형질전환되거나 또는 악성 세포의 처음의 종양 부위에서 새로운 위치로의 전이, 국소화 또는 확장과는 대조적이다.

유방암이 발생할 현저한 위험이 없는 사람도 드노보 유방암에 걸릴 수 있는 사람이며, 병에 대한 보통 위험 이상의 잠재성의 증거 또는 조짐이 없고 이 병에 전혀 걸릴 위험이 없는 사람도 이 병에 걸렸다는 진단을 받는다. 유방암 발생의 원인이 되는 가장 큰 위험 인자는 그의 존재에 대한 증거가 없는 소강 상태에서조차 이 병에 걸린 개인의 병력 또는 이 병의 조기 발병이다.

랫트에서 발암 물질인 N-니트로소-N-메틸우레아의 투여에 의한 유방암의 유도는 유방암 연구에서 잘 용인되는 동물 모델이고 화학적 예방 물질의 효과를 분석하는데 적합한 것으로 밝혀졌다. 독립된 두 연구에서, 55일 된 암컷 스프라그 돌리 랫트에게 여러가지 양의 F-I, (z)-2-[4-(1,2-디페닐-1-부테닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민 염기(타목시펜 염기)를 포함하는 음식물을 임의로 공급하기 전에 1주 동안 체중 1 kg 당 N-니트로소-N-메틸우레아 50 mg을 정맥내(연구 1) 또는 복강내(연구 2)로 투여하거나 또는 대조군을 혼합하였다.

연구 1에서, 60 mg/kg의 음식물 투여량 및 20 mg/kg의 음식물 투여량은 시험 동물의 체중에 대해 거의 3 mg/kg 및 1 mg/kg의 투여량에 견줄만했다.

연구 2에서, 20, 6, 2 및 0.6 mg/kg의 음식물 투여량은 시험 동물의 체중에 대해 거의 1, 0.3, 0.1 및 0.03 mg/kg의 투여량에 견줄만했다.

주당 1회 독성 흔적에 대해 랫트를 관찰하고 무게를 재고 암 형성에 대해 촉진하였다. 13주(연구 1) 또는 18주(연구 2) 후에 랫트를 죽이고 종양을 확인하여 해부시에 무게를 쟀다.

제형

본 명세서에 부수적으로 사용된 "약제"라는 용어는 투여대상 포유류에 사실상 해롭지 않음을 의미한다. "약학 조성물"이라는 용어는 담체, 희석제, 부형제 및 활성 성분이 제형의 다른 성분과 배합가능해야 하고 그의 투여대상에 해로워서는 안됨을 의미한다.

바람직하게는, F-I은 투여 전에 제제화된다. 제형 선택은 유효량의 결정에 관련된 동일한 인자를 고려하는 주치의가 결정해야 한다.

이러한 제형의 전체 활성 성분은 제형의 약 0.1 % 내지 99.9 %를 포함한다. 바람직하게는 2가지 활성 성분만이 상기 제형에 포함된다. 즉, F-I을 에스트로겐, 프로게스틴, 아로마타제 저해제, LHRH 유사체 및 AChE 저해제로부터 선택된 제2 활성 성분과 함께 제제화하는 것이 바람직하다. 대부분의 바람직한 제형은 F-I이 유일한 활성 성분인 제형이다.

잘 알려지고 용이하게 이용할 수있는 성분을 사용하여 당업계에 공지된 방법에 의해 본 발명의 약제 제형을 제조하였다. 예를 들어, F-I 단독으로 또는 에스 트로겐, 프로게스틴, 아로마타제 저해제, LHRH 유사체 또는 AChE 저해제와 공동으로 통상의 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제제화하여 정제, 캅셀제, 현탁액, 요액, 주사제, 에어로졸, 분말제 등을 형성한다. 본 발명의 비경구 투여용 제약 조성물에는 무균의 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼뿐 아니라 사용 직전에 멸균 용액 또는 현탁액에 녹이는 무균 분말제가 포함된다. 적합한 무균 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예에는 물, 생리적인 염수 용액, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리(에틸렌 글리콜) 등) 및 적합한 그의 혼합물, 식물성유(예를 들어 올리비유) 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액 및 현탁액의 경우에는 적합한 입도를 유지함으로써, 또한 표면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성을 유지한다.

비경구적 조성물은 결합제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시켜 미생물 작용을 확고히 예방한다. 등장 물질, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사 제형의 장기간의 흡수를 야기할 수 있다.

어떤 경우에는, 약물의 효과를 지연시키기 위해 약물의 흡수를 지연시킨 다음, 피하 또는 근육내 주사하는 것이 바람직하다. 낮은 수용해성 결정 물질의 액체 현탁액을 사용하거나 또는 오일 비히클에 약물을 현탁시켜 이를 달성할 수 있 다. 낮은 수용해도를 지닌 약물 형태를 포함하는 현탁액을 피하 또는 근육내 주사하는 경우, 약물의 흡수 속도는 그의 용해 속도에 좌우된다.

당업계에 기술된 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 락트산 및 글리콜산의 공중합체, 및 이러한 물질의 다(무수물) 중에 약물의 마이크로캅셀화 매트릭스를 형성하여 F-I의 주사할 수 있는 "저장" 제형을 제조할 수 있다. 중합체에 대한 약물 비율 및 특정 중합체의 특징에 따라, 약물 방출 속도를 조절할 수 있다.

주사가능한 제형을 제조시 또는 투여 직전에 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통해 여과하거나 또는 그를 혼합하기 전에 혼합물의 성분을 미리 멸균하여 멸균하였다(이중의 챔버 주사기 패키지의 예에서와 같음).

경구 투여용 고체 투여 형태에는 캅셀제, 정제, 환제, 분말제 및 과립제가 포함된다. 이러한 고체 투여 형태에서, F-I을 1종 이상의 불활성 약제 담체, 예를 들어 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 및(또는) (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스 및 글루코스를 비롯한 당, 만니톨 및 실릭산, (b) 결합제, 예를 들어 카로복시메틸 셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 알긴산, 젤라틴, 폴리(비닐피롤리딘), 수크로스 및 아카시아검, (c) 습윤제, 예를 들어 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들어 아가-아가, 탄산칼슘, 중탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 실리케이트 및 탄산나트륨, (e) 가습제, 예를 들어 글리세롤, (f) 용액 지연제, 예를 들어 파라핀, (g) 흡수 촉진제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물, (h) 습윤제, 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세린 모노스테아레이트, (i) 흡습제, 예 를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토 및 (j) 윤활제, 예를 들어 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리(에틸렌 글리콜), 소듐 라우릴 술페이트 및 그의 혼합물과 함께 혼합하였다. 캅셀제, 정제 및 환제의 경우에는, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다.

유사한 형태의 고체 조성물은 부형제, 예를 들어 락토스 및 고분자량의 폴리(에틸렌 글리콜) 등을 사용하는 연질 또는 경질의 젤라틴 캅셀 중에 충전될 수도 있다.

코팅하거나 또는 쉘, 예를 들어 장용제피 또는 약제 제제화 분야에 잘 알려진 다른 코팅으로 고체 투여 형태, 예를 들어 정제, 당의정제, 캅셀제, 환제 및 과립제를 제조할 수도 있다. 코팅은 소화선 특정 부위에서, 예를 들어 위에서 활성 성분을 방출하는 산-가용성 코팅 또는 소장관에서 활성 성분을 방출하는 염기-가용성 코팅과 같이 활성 성분을 방출하는 물질 또는 유백화제를 포함할 수 있다.

활성 성분을 방출 조절 코팅 중에 마이크로캅셀화할 수도 있으며, 이 마이크로캅셀은 캅셀 제형인 환제의 성분으로 제조된다.

F-I의 경구 투여용 액체 투여 형태에는 용액, 에멀젼, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제가 포함된다. 활성 성분뿐 아니라, 액체 제형은 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 다른 약제 용매, 용해제 및 유화제, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(특히, 면화씨유, 땅콩유, 옥수수유, 종자유, 올리브유, 카스토르유 및 세삼유), 글리세 롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리(에틸렌 글리콜), 소리비톨의 지방산 에스테르 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다.

불활성 희석제 외에도, 액체 경구 제형은 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 방향제를 포함할 수 있다.

액체 현탁액은 활성 성분 외에 현탁제, 예를 들어 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트 점토, 아가-아가, 및 트라가칸쓰 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다.

F-I을 적합한 비자극성 부형제, 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실온에서 고체이지만 체온에서는 액체여서 직장 또는 질강내 용해시 활성 성분을 방출하는 어떤 좌제 왁스를 혼합하여 직장 또는 질내 투여용 조성물을 제조하였다. 이 화합물을 용해된 왁스에 용해시켜 목적하는 형태로 형성하고 최종적인 좌제 제형으로 경화되게 하였다.

F-I을 리포좀 형태로 투여할 수도 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래한다. 리포좀 제형은 수성 배지 중에 분산된 단층 또는 다층의 라멜라 수화 액체 결정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 무독성이고 약제이며 대사가능한 임의 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 본 발명의 조성물은 F-I 외에도 안정제, 부형제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이고 두가지 모두 천연 또는 합성물이다.

리포좀을 형성하는 방법은 예를 들어 프레스콧(Prescott)의 문헌[Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq]에 개시된 바와 같이 당업계에 알려져 있다.

하기 제형의 예는 단지 본 발명에 대한 설명일뿐 이에 한정되지 않는다.

제형 1: 젤라틴 캅셀

하기 성분을 사용하여 경질의 젤라틴 캅셀을 제조함	양(mg/캅셀)
F-I	0.1-1000
전분, NF	0-650
전분 유동성 분말	0-650
실리콘 유체 350 센티스토크	0-15

상기 제형은 적당히 변형을 제공함에 따라 변할 수 있다. 하기 성분을 사용하여 정제 제형을 제조하였다.

제형 2: 정제

성분	양(mg/정제)
F-I	2.5-1000
셀룰로스, 미세결정	200-650
퓸드 실리콘 디옥시드	10-650
스테아레이트 산	5-15

상기 성분을 혼합하고 압축하여 정제를 형성하였다.

제형 3: F-I을 각각 약 10 mg 및 50 mg 포함하는 정제를 하기와 같이 제조하였다.

성분	양(mg/정제)	양(mg/정제)
F-I	11.3	56.5
락토스 무수물	176.8	128.2
특별히 건조한 락토스 분무	44.2	32.0
포비돈	11.0	13.0
폴리소르베이트 80	2.5	2.6
크로스포비돈(내부)	6.25	6.24
크로스보피돈(외부)	6.25	6.5
마그네슘 스테아레이트	1.5	1.7
미세결정 셀룰로스(외부)	0.0	13.0

상기 성분을 혼합하고 압축하여 정제를 형성하였다. 또는, F-I 2.5 내지 1000 mg을 포함하는 각 정제를 하기와 같이 제조하였다.

제형 4: 정제

성분	양(mg/정제)
F-I	25 내지 1000
전분	45
셀룰로스, 미세결정	35
폴리비닐피롤리돈(물 중 10 % 용액으로)	4
소듐 카르복시메틸 셀룰로스	4.5
마그네슘 스테아레이트	0.5
활석	1

F-I, 전분 및 셀룰로스를 제45호 메쉬 U.S. 분자체에 통과시키고 완전하게 혼합하였다. 폴리비닐피롤리돈 용액을 제14호 메쉬 U.S. 분자체에 통과시킨 생성된 분말과 혼합하였다. 이렇게 생성된 과립을 50 ℃ 내지 60 ℃에서 건조하고 제18호 메쉬 U.S. 분자체에 통과시켰다. 소듐 카르복시메틸 전분, 마그네슘 스테아레이트 및 활석을 제60호 U.S. 분자체에 미리 통과시킨 다음, 혼합 후에 과립에 첨가하고 정제 기계로 압축하여 정제를 제조하였다.

투여량 5 ml 당 치료 약물 0.1 내지 1000 mg을 각각 포함하는 현탁액을 하기와 같이 제조하였다.

제형 5: 현탁액

성분	양(mg/5 ml)
F-I	0.1 내지 1000 mg
소듐 카르복시메틸 셀룰로스	50 mg
시럽	1.25 mg
벤조산 용액	0.10 ml
향미제	적정량
착색제	적정량
정제수/총	5 ml

치료 약물을 제45호 메쉬 U.S. 분자체에 통과시키고 소듐 카르복시메틸 셀룰로스 및 시럽과 혼합하여 부드러운 페이스트를 형성하였다. 벤조산 용액, 향미제 및 착색제를 약간의 물로 희석하고 교반하면서 첨가하였다. 그 다음, 충분한 물을 첨가하여 필요한 부피로 제조하였다.

하기 성분을 포함하는 에어로졸 용액을 제조하였다.

제형 6: 에어로졸

성분	양(중량%)
F-I	0.25
에탄올	25.75
추진제 22(클로로디플루오로메탄)	70.00

F-I을 에탄올과 혼합하고 혼합물을 추진제 22의 분획에 첨가하고 30 ℃로 냉각한 다음, 충전 장치로 옮겼다. 그 다음, 요구량을 스테인레스 스틸 컨테이너로 공급하고 나머지 추진제로 희석하였다. 그 다음, 밸브 유닛을 컨테이너에 고정시켰다.

좌제를 하기와 같이 제조하였다.

제형 7: 좌제

성분	양(mg/좌제)
F-I	250
포화 지방산	2,000
글리세라이드

F-I을 제60호 메쉬 U.S. 분자체에 통과시키고 최소로 필요한 열을 사용하여 미리 용해된 포화 지방산 글리세라이드 중에 현탁시켰다. 그 후에, 혼합물을 아주 적은 2 g 용량의 좌제 주형에 붓고 냉각하였다.

정맥내 제형을 하기와 같이 제조하였다.

제형 8: 정맥내 용액

성분	양
F-I	25 mg
등장 염수	1,000 ml

상기 성분의 용액을 환자에게 분당 약 1 ml의 속도로 정맥내 투여하였다.

제형 9: 배합 캅셀제 I

성분	양(mg/캅셀)
F-I	50
프레마린	1
아비셀 pH 101	50
전분 1500	117.50
실리콘유	2
트윈 80	0.50
Cab-O-Sil	0.25

제형 10: 배합 캅셀제 Ⅱ

성분	양(mg/캅셀)
F-I	50
노르에틸노드렐	5
아비셀 pH 101	82.50
스타치 1500	90
실리콘유	2
트윈 80	0.50

제형 11: 배합 정제

성분	양(mg/캅셀)
F-I	50
프레마린	1
옥수수 전분 NF	50
포비돈, K29-32	6
아비셀 pH 101	41.50
아비셀 pH 102	136.50
크로스포비돈 XL10	2.50
마그네슘 스테아레이트	0.50
Cab-O-Sil	0.50

투여량

본 발명에 따라 투여되는 특정 투여량을 각 상태에 따른 특이적인 상황에 의해 결정하였다. 이러한 상황에는 투여 경로, 환자의 앞서의 의료 병력, 병리학적 증상 또는 치료 징후, 치료 증상/징후의 심도, 및 환자의 연령 및 성별이 포함된다.

일반적으로, F-I의 최소의 일일 유효 투여량은 약 1, 5, 10 또는 20 mg이다. 통상적으로, 최대 유효 투여량은 약 800, 100, 60, 50 또는 40 mg이다. 가장 통상적으로는, 투여량은 15 mg 내지 60 mg 사이의 범위이다. 정확한 투여량은 "투여 적정"의 의료 분야에서 환자의 표준 관행에 따라, 즉 먼저 화합물을 적은 양으로 투여하고 목적하는 치료 효과가 관찰될때까지 점차적으로 투여량을 증가시켜 결정할 수 있다.

상기 기재된 병행 요법으로는 환자에게 적정하게 투여하는 것이 필요하며 F-Ⅲ 외의 다른 전형적인 활성 성분 투여량은 다음과 같다. 에티닐 에스트로겐(0.01 내지 0.03 mg/일), 복합 에스트로겐 호르몬(예를 들어 프레마린(등록상표), 웨쓰-에이어스트(Wyeth-Ayerst), 0.3 내지 2.5 mg/일), 메드록시프로게스테론(2.5 내지 10 mg/일), 노르에틸노드렐(1.0 내지 10.0 mg/일), 논에틴드론(0.5 내지 2.0 mg/일), 아미노글루테미드(250 내지 1250 mg/일, 바람직하게는 250 mg을 하루 4회), 아나스트라졸(1 내지 5 mg/일, 바람직하게는 1 mg을 하루 1회), 레트로졸(2.5 내지 10 mg/일, 바람직하게는 2.5 mg을 하루 1회), 포르메스탄(1주일에 250 내지 1250 mg, 바람직하게는 250 mg을 일주일에 2회), 엑세메스탄(25 내지 100 mg/일, 바람직하게는 25 mg을 하루에 1회), 고세르린(3 내지 15 mg/3개월, 바람직하게는 3.6 내지 7.2 mg을 3개월마다 1회) 및 루프롤리드(3 내지 15 mg/1개월, 바람직하게는 3.75 내지 7.5 mg을 1개월마다 1회).

투여 경로

경구, 직장, 경피, 피하, 정맥, 근육내 및 비강내 투여를 비롯한 여러 가지 경로로 F-I을 투여하였다. 각 에스트로겐계 및 프로게스틴계 물질을 투여하는 방 법은 당업계에 알려진 바와 동일했다. 일반적으로, 간편한 제형에서는 F-I 단독으로 또는 에스트로겐, 프로게스틴 또는 AChE와 함께 투여될 것이다.

본 발명의 제약 조성물을 인간 및 다른 포유류(예를 들어 개, 고양이, 말, 돼지 등)에게 경구적으로, 직장내로, 질내로, 비경구적으로, 국소적으로, 구강적으로 또는 설하적으로 또는 비강적으로 투여하였다. "비경구 투여"라는 용어는 본 명세서에서 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 또는 관절내 주사 또는 주입을 비롯한 투여 방식을 의미한다.

투여 방식/기간

본 발명의 방법의 대부분의 경우, 매일 1 내지 3회 지속적으로 투여하거나 또는 필요시마다 유효량의 F-I을 환자에게 전달한다. 주기적인 치료법은 자궁내막증의 치료에 특히 유용할 수 있거나 또는 고통스러운 심장 마비 동안에 급히 사용될 수 있다. 재협착증의 경우, 치료법은 의학적 방법, 예를 들어 혈관확장술 전의 단기간(1 내지 6개월)으로 제한될 수 있다.

본 발명의 결정질 아르족시펜은 그의 결정 격자 내에 유기 용매를 포함하지 않는 고도의 결정질인 형태이므로 이롭다.

Claims (7)

1. 구리 방사원으로부터 얻을 때 2θ에서 7.9 ±0.2°, 10.7 ±0.2°, 14.9 ±0.2°, 15.9 ±0.2°, 18.3 ±0.2° 및 20.6 ±0.2° 피크를 포함하는 엑스선 회절 패턴을 지닌 결정질 6-히드록시-3-(4-[2-(피페리딘-1-일)에톡시]페녹시)-2-(4-메톡시페닐)벤조[b]티오펜 히드로클로라이드 수화물(F-I).
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