ITMI20001759A1 - Nuova forma cristallina del 6-idrossi-3-(4-(2-(piperidini-1-il)-etossi)fenossi)-2-(4-metossifenil)benzo (b) tiofene cloridrato. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Il 6-idrossi-3-{4-[2-{piperidin-l-il)etossi]-fenossi)-2-{4-metossifenil)benzo[b]tiofene cloridrato (arzoxifene) è stato descritto genericamente per la prima volta nel brevetto USA No. 5.510.357 ed è stato descritto specificamente nel brevetto USA No. 5.723.474 (’474) e nella domanda di brevetto europeo 0729956. L'arzoxifene è un antagonista/agonista misto non steroideo di estrogeni, utile fra l'altro nell'abbassare il colesterolo nel siero e nell'inibire iperlipidemia, osteoporosi, cancri dipendenti da estrogeni, che includono il cancro della mammella e il cancro dell'utero, endometriosi, disturbi del sistema nervoso centrale, incluso il morbo di Alzheimer, la proliferazione delle cellule della muscolatura liscia dell’aorta e la ristenosi.

Specificamente, l'arzoxifene è utile e viene valutato clinicamente per il trattamento del cancro metastatico della mammella positivo per il recettore; per il trattamento coadiuvante di pazienti positivi per il recettore dopo una appropriata terapia sistemica o locale; per la riduzione della recidiva del cancro della mammella invasivo e non invasivo; e per la riduzione dell'incidenza del cancro invasivo della mammella e del carcinoma duttale in situ (DCIS). L'arzoxifene è anche utile in combinazione con la radioterapia, con inibitori di aromatasi, con analoghi di LHRH e con inibitori della acetil colina esterasi (AChE).

La diffrazione dei raggi X (XRD) da parte della polvere, l'analisi termogravimetrica (TGA), la risonanza magnatica nucleare protonica

NMR) e le analisi di Karl Fischer (KF) dell'arzoxifene in massa isolato mediante le procedure insegnate in '474 hanno successivamente indicato che detto materiale era idratato, scarsamente cristallino e che conteneva quantità variabili di una sostanza organica volatile (etil acetato) nel suo reticolo.

I materiali scarsamente cristallini sono tipicamente meno desiderabili, rispetto a materiali altamente cristallini, per il trattamento di formulazioni. Inoltre, non è generalmente desiderabile formulare prodotti farmaceutici che contengono quantità sostanziali di solvente organico (per esempio etil acetato) a causa della potenziale tossicità del solvente per il ricevente e a causa di variazioni della potenza del prodotto farmaceutico come funzione del solvente.

Sebbene l'arzoxifene preparato mediante le procedure insegnate in '474 possa essere impiegato come prodotto farmaceutico si desidererebbe altamente e sarebbe vantaggioso trovare una forma più cristallina dell'arzoxifene che non contenga un solvente organico nel reticolo cristallino e che potesse essere preparato riproducibilmente ed efficientemente su scala commerciale.

La presente invenzione riguarda una nuova forma cristallina idrata non stechiometrica del 6-idrossi-3-(4-[2-(piperidin-l-il)etossi]-fenossi)-2-(4-metossifenil)benzo[b]tiofene cloridrato (F-I) che ha uno spettro di diffrazione dai raggi X che comprende i seguenti picchi: 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2, e 20,6 ± 0,2° in 20; quando ottenuto da una fonte di radiazione del rame.

Inoltra la presenta invenzione riguarda una formulazione farmaceutica che comprende F-I; uno o più veicoli, diluenti o eccipienti farmaceutici; e facoltativamente estrogeni, facoltativamente progestina, facoltativamente un inibitore di aroraatasi, facoltativamente un analogo di LHRH e facoltativamente un inibitore della acetil colina esterasi (AChE).

Inoltre la presente invenzione riguarda metodi per impiegare F-I per inibire condizioni patologiche come: fibrosi uterina, endometriosi, proliferazione della cellula della muscolatura liscia della aorta, ristenosi, cancro della mammella, cancro dell'utero, cancro della prostata, iperplasia prostatica benigna, perdita di osso, osteoporosi, malattie cardiovascolari, iperlipidemia, disturbi dal sistema nervoso centrale e morbo di Alzheimer e per l'impiego di F-I per la produzione di un farmaco per inibire lo stesso.

La presente invenzione riguarda inoltre metodi per inpiegare F-I per regolare verso l'alto la colina acetil transferasi (ChAT) e per impiegare F-I per la produzione di un farmaco per la regolazione verso l'alto della stessa.

La figura 1 è una traccia rappresentativa della calorimetria a scansione differenziale (DSC)/TGA di S-II.

La figura 2 è una traccia rappresentativa di DSC/TGA di F-I.

La figura 3 è una traccia rappresentativa di DSC/TGA di F-III.

La figura 4 rappresenta le isoterme di assorbimento di umidità per F-I e F-III.

La figura 5 rappresenta la desolvatazione di S-II come funzione del tempo di essiccamento e della temperatura.

li'arzoxifene in massa preparato mediante la procedura insegnata in '474 (esempio 41, cristallizzazione da una miscela di etanolo ed etil acetato, filtrazione ed essiccamento dello strato di filtrazione sotto vuoto fino ad un peso costante a temperatura ambiente) è stato caratterizzato mediante XRD e si è trovato che è scarsamente cristallino. La confermava che il materiale in massa conteneva il 6% di etil acetato.

La procedura di cristallizzazione insegnata in '474 è stata successivamente modificata così che l'etanolo veniva aggiunto ad una sospensione di arzoxifene grezzo in etil acetato sotto riflusso. Dopo raffreddamento e filtrazione sotto vuoto, il solido che risulta da questa procedura modificata è un solvato con etil acetato/acqua misto altamente cristallino di arzoxifene (qui di seguito chiamato S-II) che è stato successivamente scoperto è un materiale di partenza per F-I.

Si può preparare F-I rimuovendo l'etil acetato dal reticolo cristallino di S-II mediante essiccamento/ricottura sotto vuoto di S-II a temperature elevate. Il tempo e la temperatura richiesti per ricuocere S-II per preparare F-I variano da lotto a lotto, ma sono tipicamente dell'ordine di 5 giorni a circa 100°C. Per effettuare la conversione di S-II a F-I mediante questa procedura sono necessarie temperature elevate, in quanto la messa in sospensione di 5-II in acqua a temperatura ambiente o la conservazione di un campione al 98% di RH per 3 settimane non dava alcuna conversione a F-I. Inoltre, l'essiccamento di S-II in un forno a convezione a temperature elevate non desolvatava il materiale, suggerendo che per estrarre l'etil acetato dal reticolo di S-II si è anche richiesto il vuoto.

Preferibilmente F-I viene preparato e isolato facilmente a temperatura ambiente mediante cristallizzazione di arzoxifene (o di qualsiasi suo polimorfo/solvato) da tetraidrofurano. Questa cristallizzazione viene preferibilmente realizzata dissolvendo inizialmente l’arzoxifene in tetraidrofurano umido (dall'l al 10% di acqua in volume, preferibilmente dal 2,5 al 7,5% e più preferibilmente dal 4,5 al 5,5%) seguito dalla rimozione di detta acqua attraverso distillazione atmosferica. Un esempio di questa cristallizzazione è dettagliata qui di seguito nell'Esempio 2. Quando F-I viene preparato attraverso questa procedura di cristallizzazione migliorata, ci si può attendere un livello totale di sostanza correlata (TRS) di <0,5%.

Un adatto materiale di partenza di arzoxifene per questa cristallizzazione include, ma non à limitato a S-II, F-III, arzoxifene preparato mediante le procedure insegnate in '474, o qualsiasi loro miscela. Non è importante con quale forma di arzoxifene si parta in quanto la cristallizzazione da tetraidrofurano, secondo le procedure qui descritte, dà come risultato cristalli di F-I. Per la sintesi di F-I su scala commerciale, può essere vantaggioso seminare la cristallizzazione con F-I.

F-III, un altro idrato non stechiometrico dell'arzoxifene, viene prontamente preparato ed isolato a temperatura ambiente mediante cristallizzazione dell'arzoxifene (o di qualsiasi suo polimorfo/solvato) da una miscela di alcool isopropilico (IPA) ed acqua. Il rapporto dell’acqua rispetto all’IPA (v:v) è generalmente da circa 1:1 a 9:1. Più preferibilmente, il rapporto è tra 2,5 e 5,6:1. Più preferibilmente, il rapporto è tra 3 e 5,6:1. Il rapporto dell'IPA rispetto all’acqua non è critico per effettuare la cristallizzazione di F-III ma influenza la resa. Per la sintesi su scala commerciale di F-III, può essere vantaggioso di seminare la cristallizzazione con F-III. Materiale di partenza di arzoxifene idoneo per la cristallizzazione di cui sopra include, ma non è limitato a, S-II, F-I, arzoxifene preparato mediante le procedure insegnate in '474, o qualsiasi sua miscela.

Caratterizzazione e differenziazione di S-II. F-I e F-III

Per caratterizzare S-II, F-I e F-III si impiegarono i metodi DSC/TGA e XRD. TGA è spesso molto utile per effettuare una distinzione fra forme solide differenti di un materiale in quanto la temperatura (temperature) alla quale si verifica una variazione fisica in una materiale è usualmente caratteristica del polimorfo o del solvato. DSC è una tecnica che viene spesso impiegata per valutare composti per il polimorfismo e per la formazione di un solvato. Infine XRD è una tecnica che rivela l'ordine di intervallo lungo in un materiale cristallino.

L' arzoxifene preparato mediante le procedure insegnate in '474 dava spettri XRD con scarsi rapporti segnale/rumore e una linea base innalzata e ciò è indicativo di un materiale scarsamente cristallino. Perciò i confronti di F-I e F-III vengono fatti con il materiale (S-II) prodotto mediante la procedura di cristallizzazione modificata dell'arzoxifene discussa sopra (aggiunta di etanolo ad una sospensione di arzoxifene in etil acetato sotto riflusso).

Nelle figure 1, 2 e 3 sono rappresentate rispettivamente tracce DSC/TGA rappresentative di S-II, F-I e F-III. La traccia DSC per S-II mostra un'ampia endotermia che inizia a circa 62°C, che corrisponde alla perdita di etilacetato e acqua dal reticolo. L'andòtermia che inizia a circa 152°C rappresenta una massa fusa. Nella TGA si verifica una perdita di peso di circa 2,5% simultaneamente con la prima transizione, mentre la restante perdita di peso di circa 0,5% si verifica fin dall'inizio della fusione suggerendo che una certa quantità di molecole del solvente siano più strettamente trattenute nel reticolo.

La traccia DSC di F-I mostra un'ampia endotermia che inizia a circa 75 °C seguita da una seconda endotermia che inizia a 155 “C che corrisponde a una massa fusa. La traccia TGA di F-I mostra una perdita di peso graduale dello 0,3% seguita da una netta perdita dell’1,5% che assiema rappresentano la deidratazione del reticolo. L'inizio della prima transizione DSC e della corrispondente perdita di peso della TGA sono leggermente scostate a causa della differenza delle velocità di riscaldamento. La perdita di peso iniziale rappresenta acqua di idratazione trattenuta debolmente mentre la seconda perdita di peso è conforme a circa 0,5 moli di acqua presente nel reticolo a umidità relative molto basse (al di sotto del 5% -si vedano i dati di assorbimento di umidità).

La traccia DSC di F-III rappresenta un'endotermia ampia a bassa temperatura, a circa 30°C, seguita da una seconda endotermia ampia e relativamente debole che inizia a circa 70°C e una transazione finale che inizia a circa 146°C che corrisponde a una massa fusa. La perdita netta dell'l,5% in peso (circa 0,5 moli) nella TGA coincidente con la prima endotermia corrisponde alla perdita di molecole di acqua trattenute debolmente, mentre la perdita di peso addizionale di circa 1,6% al di sopra di 60°C rappresenta la perdita di molecole di acqua trattenute più strettamente, cioè quelle che sono presenti a umidità relative molto basse. La perdita di peso osservata dopo 170°C corrisponde alla decomposizione di F-III.

Gli spettri XRD di F-I e F-III rappresentano picchi netti e una linea base piatta, e ciò e indicativo di materiali altamente cristallini. Le posizioni angolari di picco in 2Θ e i corrispondenti dati di I/Io per campioni rappresentativi di F-I, F-III e S-II sono riportati in tabella 1. Sebbene parecchie delle riflessioni intense siano generalmente ad angoli di diffrazione simili, ciascuna delle forme da uno spettro differente dalla parte della polvere, permettendo una chiara distinzione fra S-II, F-I e F-III.

E' ben noto in campo cristallografico che, per qualsiasi polimorfo dato le relative intensità dei picchi di diffrazione possono variare a causa dell'orientamento preferito risultante da fattori come la morfologia del cristallo. Quando sono presenti gli effetti di un orientamento preferito, le intensità dei picchi sono alterate, ma le posizioni caratteristiche dei picchi del polimorfo sono invariate. Si veda per esempio, The United States Pharmacopeia N. 23, National Formulary N. 18, pag. 1843-1844, 1995. Quindi, in base alle intensità dei picchi come pure in base alla posizione dei picchi, F-I può essere identificato mediante la presenza di picchi a 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2, e 20,6 ± 0,2° in 2Θ; quando lo spettro viene ottenuto da una fonte di radiazione del rame.

Tabella 1

Ulteriore caratterizzazione di F-I e F-III

Su F-I e F-III si effettuarono studi di igroscopicità. Le isoterma di assorbimento di umidità per F-I e F-III sono rappresentate in figura 4. Dopo esposizione iniziale dei campioni ad un'umidità relativa di circa 5%, vi era un immediato aumento di peso dall'1,5% e di umidità dell'1,7% per F-I e F-III, rispettivamente, e ciò è equivalente a circa 0,5 moli di acqua. Entrambe le forme mostrano un assorbimento continuo di umidità nell'intero intervallo di umidità, che è probabilmente dovuta all'incorporazione di molecole di acqua nei reticoli.

La differenza di assorbimento di umidità delle due forme riflette probabilmente la quantità di acqua che può essere incorporata nei due reticoli, (cioè la quantità di spazio disponibile nel reticolo che può accogliere molecole di acqua). La mancanza di isteresi nelle isoterme di assorbimento-desorbimento di F-I e F-III indica che le forme cristalline si equilibrano rapidamente a qualsiasi umidità data.

I profili di assorbimento di umidità per F-I e F-III rivelano che queste forme sono idrati essenzialmente non stechiometrici. Ad un'umidità relativa ambiente (circa 50% di umidità relativa), F-I contiene circa l'l,7% di acqua che corrisponde a 0,5 moli di acqua mentre F-III ha assorbito circa il 3,0% di acqua che corrisponde a circa 0,85 moli di acqua. Le forme in massa di F-I a F-III si equilibrano rapidamente con l’atmosfera, così che il contenuto di acqua osservato mediante tecniche analitiche è il riflesso della umidità relativa al momento della raccolta dei dati. Le differenze da lotto a lotto osservate nei dati DSC derivano probabilmente dal fatto che i campioni sono idratati in misura differente a causa di differenti condizioni di conservazione ambiente!

Si ottennero spettri XRD per campioni di F-I e F-III conservati a umidità relative differenti (0, 22, 50, e 00%). Vi è un graduale spostamento dei picchi di F-III iniziali (0% di umidità relativa) a circa 13,8, 17,6, 18,0, 20,5 e 24,0° in 2Θ come pure un leggero spostamento di picchi meno intensi quando 1'umidità relativa aumenta. Queste variazioni osservate negli spettri XRD di F-III indicano che le dimensioni della cella unitaria cambiano, presumibilmente per accogliere molecole di acqua trattenute debolmente quando l'umidità relativa viene aumentata. Lo spostamento continuo dei picchi con l'umidità si correla bene con i dati di assorbimento di umidità che mostrano un aumento di peso graduale in questo intervallo di umidità relativa, fornendo l'evidenza di una formazione dell’idrato variabile.

Un esperimento simile venne effettuato su F-I per determinare se facendo variare l'umidità relativa si avesse un effetto simile sul suo reticolo {0, 25, 52, 73 e 95% di umidità relativa). Quando l'umidità relativa viene aumentata si osserva uno spostamento molto leggero dei picchi allo 0% di umidità relativa a circa 7,7, 18,3, 18,5, 20,5, 20,8° di 2Θ. Sembra anche che i picchi a circa 7,7, 20,8, e 24,1 diventino leggermente ampliati e meno risolti a umidità relative più elevate, indicando che l'acqua viene assorbita in componenti amorfi (o plastifica il solido) in particolare al 73 e al 95% di umidità relativa. Lo spostamento dei picchi negli spettri XRD di F-I è meno drammatica dello spostamento dei picchi osservati quando si esponeva F-III a umidità relative differenti. Questo suggerisce che il reticolo di F-I non subisce la stessa espansione e/o contrazione del reticolo di F-III

Si è trovato che F-I e F-III sono stabili nell’intero intervallo di umidità relativa, nonostante la capacità di F-III di assorbire quasi due volte più acqua. Si è trovato che le due forme hanno dimensioni dei cristalli, morfologia, solubilità acquosa e velocità di dissoluzione confrontabili.

Si effettuò uno studio di essiccamento per controllare la desolvatazione di S-II come funzione del tempo di essiccamento e della temperatura (si veda la figura 5). Si presero gli spettri XRD in vari momenti durante l'esperimento di solvatazione. Parecchi picchi di diffrazione dallo studio di desolvatazione di S-II compaiono ad angoli simili a F-I, confermando che i reticoli di S-II e F-I sono molto simili. La scomparsa di picchi di diffrazione a circa 6,8, 7,2 e 14,0° in 2Θ dopo soltanto un essiccamento minimo suggerisce che queste riflessioni possono essere attribuite a piani cristallografici che contengono una densità di elettroni parziale di molecole di etil acetato.

Una ricottura prolungata del materiale solfatati sotto vuoto a temperate elevate dava F-I. F-I preparato in questo modo presentava un elevato grado di cristallinità in base a XRD. Perciò il materiale generato mediante cristallizzazione da una soluzione di etanolo ed etil acetato seguita da essiccamento sotto vuoto per soltanto alcune ore come insegnato in ’474 presentava una cristallinità molto scarsa in quanto una tale procedura dà come risultato S-II parzialmente desolvatato.

F-I e F-III presentano parecchi vantaggi rispetto alla forma di arzoxifene della tecnica nota descritta sopra. Rispetto all'arzoxifene prodotto mediante le procedure insegnate in '474, F-I e F-III sono più stabili a temperatura ambiente e sono perciò più riconducibili ad uno sviluppo farmaceutico, cioè sviluppo di una formulazione di dosaggio. Inoltre, F-I e F-III sono molto più cristallini rispetto alla forma descritta in '474. I materiali cristallini sono generalmente meno igroscopici e più stabili (per esempio meno soggetti a degradazione chimica, mantengono una potenza consistente) rispetto ai materiali amorfi e perciò sono più desiderabili per il trattamento di formulazione. Inoltre, diversamente dalla forma di arzoxifene prodotta mediante le procedure insegnate in '474, che conteneva etil acetato e acqua nel suo reticolo, F-I e F-III contengono soltanto acqua .

Metodi di caratterizzazione

Le misurazioni DSC vennero effettuate su un dispositivo DSC modulato TA Instruments 2920 attaccato ad un analizzatore termico 3100 e dotato di un sistema di raffreddamento refrigerato. Dei campioni (3-5 mg) vennero riscaldati in bacinelle di alluminio pieghettate da 10 a 240°C ad una velocità di riscaldamento di 2°C/min.

Le analisi TGA vennero effettuate su un analizzatore termogravimetrico TA Instruments 2050 attaccato ad un analizzatore termico 3100. Dei campioni 5-10 mg vennero riscaldati in bacinelle aperte da 25°C a 250°C ad una velocità di riscaldamento di 5°C/min.

Gli spettri XRD vennero ottenuti su un diffrattometro dei raggi X da parte della polvere Siemens D5000 dotato di una fonte di CuKa ( λ = 1,54056 À) e di un rivelatore Kevex allo stato solido, che funziona a 50 kV e 40 mA. Ciascun campione venne sottoposto a scansione fra 4° e 35° in 2θ. I campioni vennero lasciati equilibrare per almeno 30 minuti e alla temperatura e/o umidità relativa desiderate prima della raccolta dei dati.

Le misurazioni di igroscopicità vennero effettuate per F-I e F-III impiegando il metodo VTI come segue. Ciascun campione venne essiccato sotto vuoto a 60°C fino a quando non si rivelava più alcuna perdita di peso, e a questo punto la camera dei campioni venne portata ad un'umidità relativa dello 0%. Si ottennero le isoterme di assorbimento dell'umidità a 25°C impiegando una bilancia dell'umidità sotto vuoto VTI con le seguenti condizioni: dimensione del campione, 10-15 mg, intervallo di adsorbimentodesorbimento 0-95% di umidità relativa, intervallo di fase 5%, intervallo per il campione 10 minuti.

Gli esempi che seguono illustrano ulteriormente procedimenti per preparare l'idrato della presente invenzione. Non si intende in alcun modo che gli esempi siano limitativi dell'ambito di questi procedimenti e non devono essere cosi considerati.

Preparazioni

Preparazione 1

S-II

Arzoxifene grezzo (1,58 g di materiale preparato mediante la procedura dell'Esempio 41 nel brevetto statunitense No. 5.723.474, i cui insegnamenti sono qui incorporati mediante riferimento) è stato sospeso in 28 mL di etil acetato e riscaldato sotto riflusso. E’ stato aggiunto etanolo (18 mL) per effettuare la dissoluzione. La soluzione è stata mantenuta sotto riflusso per 20 minuti e quindi lasciata raffreddare a temperatura ambiente. Il precipitato è stato isolato mediante filtrazione sotto vuoto ed è stato lavato con 30 mL di etil acetato per dare 1,05 g di un solido bianco polverulento.

Esempi

Esempio 1

F-I da S-II

S-II è stato essiccato in una stufa sotto vuoto (-25 in. Hg) a 100°C per 118 ore per produrre F-I.

Esempio 2

Procedura migliorata per preparare F-I da arzoxifene Una beuta a fondo arrotondato a 3 colli, di 1 L, equipaggiata con un condensatore a riflusso ed un agitatore sovrastante viene caricata con 25,0 g di arzoxifene, 475 ml di tetraidrofurano e 25 ml di acqua. Il recipiente di reazione viene quindi equipaggiato per una semplice distillazione. La miscela di reazione viene riscaldata sotto riflusso e sono rimossi 250 ml di distillato. Il calore viene brevemente rimosso e vengono aggiunti 250 ml di tetraidrofurano anidro fresco al recipiente. La distillazione atmosferica viene continuata con rimozione di addizionali 250 ml di distillato. Il riscaldamento viene brevemente rimosso, vengono aggiunti 250 mi di tetraidrofurano fresco, e sono rimossi addizionali 250 ml di distillato. Addizionali 250 mi di tetraidrofurano sono aggiunti, e la miscela di reazione è riscaldata sotto riflusso. Con questa aggiunta di tetraidrofurano si forma un precipitato bianco. La miscela di reazione agitata viene lasciata raffreddare lentamente per 3 ore durante il qual tempo precipitano ulteriori solidi e la dispersione raggiungeva la temperatura ambiente. La dispersione cristallina veniva filtrata ed essiccata sotto vuoto a 50°C per 48 ore purgando leggermente . Resa di 22,50 g (90,0%). L'analisi XRD mostrava che lo spettro di una torta umida e il solido secco sono sostanzialmente identici, e sostanzialmente identici a quello di F-I precedentemente preparato. L'analisi DSC portava un punto di fusione di 157°C mentre l’analisi TGA mostrava una perdita di massa dell'1,5% fra temperatura ambiente e 100°C. La purezza di HPLC calcolata come base libera era dell'88,l% contro una potenza teorica del 92,9%. L'analisi HPLC mostrava un livello di sostanza totale correlata dello 0,44%.

Esempio 3

F-I da [6-benzilossi-3-[4-[2-(piperidin-lil)etossi)fenossi]-2-(4-metossifenil)]benzo[b]tiofene-(S-ossido)

Si combinarono tetraidrofurano (261 ml), acqua (45 ml), acido solforico concentrato (6,14 g) e [6-benzilossi-3-[4-[2-(piperidin-l-il)etossi)~ fenossi]-2-(4-metossifenil)]benzo[b]tiofene-(S-ossido) (potenza della HPLC 99%, livello di sostanza totale correlata, mediante HPLC, 0,35%) e si agitarono fino all'omogeneità. Si aggiunse 10% Pd/C (5,6 g in sospensione in 22 ml di acqua) con un lavaggio con 5 mi di acqua. La sospensione risultante venne evacuata e ricoperta con 60 psi di idrogeno. La temperatura di reazione venne regolata a 30°C. Dopo 2 ore, si aggiunse 10% Pd/C (5,6 g) con acqua (30 ml). L'idrogenazione a 60 psi e a 30°C venne continuata per altre 22 ore. Si aggiunsero altri 4,40 g di 10% Pd/C in 30 ml di acqua e si continuò l'idrogenazione a 60 psi e a 30°C per altre 2,5 ore. Il catalizzatore venne rimosso mediante filtrazione e il pH del filtrato vanne regolato a 7,24 con idrossido di sodio al 50%. Si aggiunse cloruro di sodio (8,66 g) sciolto in acqua (18 mi) e si agitò la soluzione a due fasi per 30 minuti. Le fasi vennero separate e la fase acquosa venne controestratta con 50 ml di tetraidrofurano. Le fasi organiche vennero combinate e concentrate mediante distillazione atmosferica fino ad un volume di 50 mi. Al concentrato a 24°C si aggiunse metanolo, 180 mi in un periodo di 1 ora. La sospensione cristallina risultante venne agitata per 30 minuti a 24°C, venne raffreddata a 0°C e agitata per 1 ora. 1 solidi vennero isolati mediante filtrazione e lavati in successione con 39 mi di acqua e 39 mi di metanolo, questo seguito da essiccamento sotto vuoto per tutta la notte a 50°C. Resa 15,52 g (67,8%).

Una porzione del prodotto di cui sopra (10 g) veniva ricristallizzata da tetraidrofurano ed acqua come descritto nell'Esempio 2.

Utilità

Come qui impiegato, il termine "quantità efficace" significa una quantità di F-I che è capace dì inibire le condizioni, o i loro effetti dannosi, qui descritte. Quando F-I viene co-soraministrato con estrogeni, progestina, un inibitore di aromatasi e un analogo di LHRH, o un inibitore di AChE, il termine- "quantità efficace" significa anche una quantità di un tale agente capace di produrre il suo effetto previsto.

I termini "inibire" e "inibiscono” includono il loro significato generalmente accettato, cioè prevenzione, proibizione, limitazione, sollievo, miglioramento, rallentamento, interruzione o inversione della progressione o della gravità di una condizione patologica o sua sequela, qui descritta.

I termini "prevenire", "prevenzione di", "profilassi", "profilattico” e "prevengono" sono qui impiegati interscambievolmente e si riferiscono alla riduzione della probabilità che il ricevente di F-I incorra in o sviluppi qualsiasi delle condizioni patologiche o sua sequela, qui descritte.

I termini "privato di estrogeni" e "privazione di estrogeni" si riferisce ad una condiziona, naturale o indotta clinicamente, in cui una donna non può produrre ormoni estrogeni endogeni sufficienti a mantenere le funzioni dipendenti da estrogeni, per esempio cicli mensili, omeostasi della massa ossea, funzione neuronaie, condizioni cardiovascolari, eccetera. Tali situazioni da privazione di estrogeni derivano da ma non sono limitate a menopausa e ovarectomia chirurgica o chimica, incluso un suo equivalente funzionale, per esempio trattamento con un inibitore di aromatasi, agonisti o antagonisti di GnRH, ICI 182780, e simili. Gli stati patologici associati con uno stato dovuto a una privazione di estrogeni includono ma non sono limitati a: perdita di osso, osteoporosi, malattie cardiovascolari e iperlipidemia.

Come qui impiegato il termine "estrogeni" include composti steroidei che hanno attività estrogenica come, per esempio, 17fl-estradiolo, estrone, un estrogeno coniugato (Premarin®) , l'estrogeno equino 17fi-etinil estradiolo e simili. Un composto a base di estrogeni preferiti è Premarin® e noretilnodrel .

Come qui impiegato il termine "progestina" include composti che hanno una attività progestinica, come, per esempio progesterone, noretilnodrel, nongestrel, megestrol acetato, noretindrone e simili. Il noretindrone è un agente a base di progestina preferito.

Come qui impiegato il termine "inibitore di aromatasi" include composti capaci di inibirà un arómatasi, par esempio inibitori disponibili in commercio come amminoglutemmide ( Anastrazolo

e simili.

Come qui impiegato il termine "analogo di LHRH" si riferisce ad un analogo dell’ormone che rilascia l’ormone luteinizzante che inibisce la produzione di estrogeni in una donna prima della menopausa inclusi per esempio goserlin leuprolide © simili.

Come qui impiegato il termine "inibitore di AChE" include composti che inibiscono la acetil colina esterasi, per esempio fisostigmina salicilato, tacrina cloridrato, donepezil cloridrato e simili.

Il termine "regolare verso l’alto ChAT" si riferisce all'aumento dell'attività enzimatica di ChAT, cioè promuovere la conversione di colina a acetil colina. Questa promozione include un aumento dell'efficienza e/o velocità di reazione di ChAT e colina e/o un aumento della quantità di ChAT presente nel sito di azione. Questo aumento della quantità di enzima presente può essere dovuto ad una regolazione genica o altra fase di sintesi della formazione dell'enzima e/o a una diminuzione della deattivazione e metabolismo dell'enzima.

Procedure sperimentali scelte

Procedura generale di preparazione di ratti: si ottengono ratti Sprague Dawley femmine di 75 giorni (a meno che non venga indicato diversamente) (intervallo di peso da 200 a 225 g) da Charles River Laboratories (Portage, MI). Gli animali vengono o ovariectomizzati (OVX) bilateralmente o esposti ad una procedura chirurgica simulata presso Charles River Laboratories, e poi vengono spediti dopo una settimana. All'arrivo essi vengono alloggiati in gabbie metalliche appese, in gruppi di tre o quattro per gabbie ed hanno accesso ad libitum al cibo (contenuto di calcio circa 0,5%) e acqua per una settimana. La temperatura dell'ambiente viene mantenuta a 22,2° ± 1,7°C con un'umidità relativa minima del 40%. Il fotoperiodo della stanza era 12 ore di luce e 12 ore di buio.

Raccolta di tessuto in regime di dosaggio: dopo un periodo di acclimatazione di una settimana (perciò due settimane post-OVX) si inizia il dosaggio giornaliero con F-I. Si somministra 17a-etinil estradiolo o F-I per via orale a meno che non venga indicato diversamente, come una sospensione in carbossimetilcellulosa all'1% o sciolto in ciclodestrina al 20%. Gli animali vengono dosati giornalmente per 4 giorni. Dopo il regime di dosaggio, gli animali vengono pesati e anestetizzati con una miscela di chetammina:xilazina (2:1, v:v) e si raccoglie un campione di sangue mediante puntura cardiaca. Gli animali vengono poi uccisi mediante asfissia con CO2 l'utero viene rimosso attraverso un incisione lungo la linea mediana e si determina il peso dell'utero umido. Si ottiene 17α-etinil estradiolo da Sigma Chemical Co., St. Luis, MO.

Malattia cardiovascolare/iperlipidemia

I campioni di sangue di cui sopra vengono lasciati coagulare a temperatura ambiente per 2 ore e si ottiene il siero dopo centrifugazione per 10 minuti a 3000 giri per minuto. Si determina il colesterolo nel siero impiegando un'analisi a prestazione elevata per il colesterolo di Boehringer Mannheim Diagnostics. In breve il colesterolo viene ossidato a colest-4-en-3-one e perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno viene poi fatto reagire con fenolo e 4-amminofenazone in presenza di perossidasi per produrre un colorante p-chinon imminico che viene letto spettrofotometricamente a 500 nm. Si calcola poi la concentrazione di colesterolo rispetto a una curva standard. L'intera analisi viene automatizzata impiegando una postazione Biomek Automated Workstation.

Analisi per la eosinofil perossidasi uterina (EPO)

Gli uteri di cui sopra vengono mantenuti a 4°C fino al momento dell'analisi enzimatica. Gli uteri vengono poi omogeneizzati in 50 volumi di tampone Tris 50 raM (pH - 8,0) che contiene lo 0,005% di Triton X-100. Dopo aggiunta di 0,01% di perossido di idrogeno e O-fenilendiammina 10 mM {concentrazioni finali) in tampone Tris, si controlla l'aumento di assorbenza per 1 minuto a 450 nm. La presenza di eosinofili nell'utero e un'indicazione della attività estrogenica di un composto. Si determina la velocità massima di un intervallo di 15 secondi rispetto alla porzione iniziale lineare della curva di reazione.

Procedura sperimentale di inibizione della perdita di ossa (osteoporosi) Dopo la procedura generale di preparazione descritta sopra, i ratti vengono trattai giornalmente per 35 giorni (6 ratti per gruppo di trattamento) e vengono uccisi mediante asfissia con biossido di carbonio il 36° giorno. Il periodo di tempo di 35 giorni è sufficiente a permettere una riduzione massima della densità ossea, misurata come qui descritto. Al momento dell'uccisione, gli uteri vengono rimossi, dissezionati, privi di tessuto estraneo e i contenuti fluidi vengono espulsi prima della determinazione del peso umido al fine di confermare il deficit di estrogeni associato con una ovariectomia completa. In risposta alla ovariectomia il peso dell'utero viene abitualmente ridotto di circa 75%. Gli uteri vengono poi poeti in formalina tamponata neutra al 10% per permettere una successiva analisi istologica.

I femori destri vengono prelevati e si generano raggi X digitalizzati e ai analizzano mediante un programma di analisi di immagini (immagine NIH) in corrispondenza della metafisi distale. L'aspetto prossimale delle tibie di questi animali viene anch'essa sottoposta a scansione mediante tomografia quantitativa computerizzata. Secondo le procedure di cui sopra, agli animali da esperimento si somministra per via orale F-I o etinilestradiolo (EE2) in idrossipropil β-ciclodestrina al 20%. F-I è anche utile in combinazione con estrogeni o progestina.

Analisi di proliferazione di MCF-7

Cellule di adenocarcinoma della mammella MCF-7 (ATCC HTB 22) vengono mantenute in MEM (mezzo essenziale minimo, privo di rosso fenolo, Sigma, St. Louis, MO) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) (V/V), L-glutammina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), HEPES {N-[2-idrossietil]piperazina-N'-[ acido 2-etansolfonico]10 mM}, ammino acidi non essenziali e insulina bovina (1 μg/ml) (mezzo di mantenimento). 10 giorni prima dell’analisi, si passano le cellule MCF-7 al mezzo di mantenimento integrato con il 10% di mezzo di analisi di siero bovino fetale strippato con carbone rivestito di destrano (DCC-FBS) al posto di 10% di FBS per eliminare depositi interni di steroidi. Le cellule MCF-7 vengono rimosse dai matracci di mantenimento impiegando un mezzo di dissociazione delle cellule (HBSS privo di Ca++/Mg++ (privo di rosso fenolo) integrato con HEPES 10 mM e EDTA 1 mM). Le cellule vengono lavate due volte con il mezzo di analisi e regolate a 80.000 cellule/ml. Si aggiungono circa 100 ml (8.000 cellule) a pozzetti di microcultura a fondo piatto (Costar 3596) e si incubano a 37°C in un incubatore umidificato al 5% di C02 per 48 ore per permettere l'aderenza e l'equilibramento delle cellule dopo il trasferimento. Si preparano diluizioni in serie di farmaci, o di DMSO come controllo di diluente, in un mezzo di analisi e si trasferiscono 50 ml in microcolture in triplicato seguiti da 50 ml di mezzo di analisi per un volume finale di 200 mL. Dopo altre 48 ore a 37°C in un incubatore umidificato al 5% di C02, le microculture vengono marcate (pulsed) con timidina tratta con tritio (1 μCi/pozzetto) per 4 ore. Le colture vengono fatte terminare mediante congelamento a -70 “C par 24 ore seguito da scongelamento e raccolta di microcolture impiegando un raccoglitore di cellule semiautomatico Skatron. I campioni vengono sottoposti a conteggio mediante scintillazione di liquido impiegando un contatore Wallac BetaPlace β.

Inibizione del tumore della mammella indotto da DMBA

Si producono tumori della mammella dipendenti da estrogeni in ratti Sprague-Dawley femmine che vengono acquistati da Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Ad un'età di circa 55 giorni i ratti ricevono una singola alimentazione orale di 20 mg di 7,12-dimetilbenz[a]entracene (DMBA). Circa 6 settimane dopo la somministrazione di DMBA le ghiandole mammarie vengono palpate a intervalli settimanali per la comparsa di tumori. Tutte le volte che compaiono uno o più tumori, si misurano i diametri più lunghi e più corti di ciascun tumore con un compasso metrico, si registrano le misurazioni e si sceglie quell'animale per la sperimentazione. Si fa un tentativo di distribuire uniformemente le varie dimensioni dei tumori nei gruppi trattati e di controllo così che fra i gruppi in esame siano distribuiti in modo equivalente tumori di dimensioni medie. I gruppi di controllo e i gruppi di prova per ciascun esperimento contengono 5-9 animali.

Si somministra F-I o mediante iniezione intraperitoneale in gomma arabica al 2% o per via orale. I composti somministrati per via orale vengono o disciolti o messi in sospensione in 0,2 mL di olio di mais. Ciascun trattamento inclusi i trattamenti di controllo con gomma arabica e olio di mais viene somministrato una volta al giorno a ciascun animale da esperimento. Dopo la misurazione iniziale dei tumori e la scelta degli animali da esperimento, i tumori vengono misurati ogni settimana mediante il metodo summenzionato. Il trattamento e le misurazioni degli animali continuano per 3-5 settimane e a questo punto si determinano le aree finali dei tumori. Per ciascun trattamento con un composto e di controllo, si determina la variazione dell'area media del tumore.

Procedure di prova per la fibrosi uterina

Prova 1: si somministra F-I ad un numero di donne da 3 a 20 che sono affette da fibrosi uterina. La quantità di composto somministrata è da 0,1 a 1000 rag/giorno e il periodo di somministrazione è 3 mesi. Le donne vengono tenute sotto osservazione durante il periodo di somministrazione e fino a 3 mesi dopo l'interruzione della somministrazione, per gli effetti sulla fibrosi uterina.

Prova 2: si impiega la stessa procedura come nella prova 1, eccetto che il periodo di somministrazione è 6 mesi.

Prova 3: si impiega la stessa procedura come nella prova 1, eccetto che il periodo di somministrazione è 1 anno.

Prova 4: si impiega una stimolazione prolungata con estrogeni per indurre leiomiomata in porcellini d'india femmine sessualmente mature. Gli animali vengono dosati con estradiolo 3-5 volte alla settimana mediante iniezione per 2-4 mesi o fino a quando compaiono tumori. Il trattamento che consiste di F-I o di un veicolo, viene somministrato giornalmente per 3-16 settimane e poi gli animali vengono uccisi e gli uteri vengono raccolti ed analizzati per la regressione dei tumori.

Prova 5: si impiantano tessuto da leiomiomi umani nella cavità peritoneale e/o nel miometrio uterino di topi nude, femmine, sessualmente mature, castrate. Si fornisce estrogeno esogeno per indurre la crescita del tessuto espiantato. In alcuni oasi, le cellule tumorali raccolte vengono coltivate in vitro prima dell'impianto. Il trattamento, che consiste di F-I o di un veicolo, viene fornito mediante lavanda gastrica su base giornaliera per 3-16 settimane e gli impianti vengono rimossi e misurati per la crescita o per la regressione. Al momento dell'uccisione, gli uteri vengono raccolti per valutare lo stato dell'organo.

Prova 6: tessuto da tumori fibroidi uterini umani viene raccolto e mantenuto, in vitro, come culture non trasformate primarie. Si spingono campioni chirurgici attraverso una maglia sterile o setaccio sterile, o in alternativa si staccano dal tessuto circostante per produrre una sospensione cellulare singola. Le cellule vengono mantenute in un mezzo che contiene il 10% di siero e un antibiotico. Si determinano le velocità di crescita in presenza e in assenza di estrogeni. Le cellule vengono analizzate per la loro capacità di produrre il componente del complemento C3 e la loro risposta a fattóri di crescita e l'ormone della crescita. Le colture in vitro vengono valutate per la loro risposta proliferativa dopo trattamento con progestine, GnRH, F-I, e un veicolo. I livelli i recettori di ormoni steroidei vengono valutati settimanalmente per determinare se in vitro vengono mantenute caratteristiche importanti delle cellule. Si utilizza il tessuto da 5 a 25 pazienti.

Prova 7: si misura la capaciti di F-I di inibire la proliferazione, stimolata da estrogeni, di linee cellulari ELT derivate da leiomiomi, sostanzialmente come descritto in Fuchs-Young, et al., "Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car. 17(3):151-159 (1996), i cui insegnamenti sono qui incorporati mediante riferimento.

Procedure di prova per la endometriosi

Prova 1: Come animali da esperimento si impiegano 12-30 ratti adulti femmine del ceppo CD. Essi vengono suddivisi in tre gruppi con un numero uguale. Si controlla il ciclo dell'estro di tutti gli animali. Il giorno del proestro, si pratica un intervento chirurgico su ciascuna femmina. Alle femmine in ciascun gruppo viene rimosso il collo uterino sinistro, viene sezionato in piccoli quadratini e i quadratini vengono suturati in modo lasco in vari siti adiacenti al flusso di sangue mesenterico. Inoltre, alle femmine del gruppo 2 vengono rimosse le ovaie. Il giorno dopo l'intervento chirurgico, gli animali nei gruppi 1 e 2 ricevono iniezioni intraperitoneale di acqua per 14 giorni mentre gli animali nel gruppo 3 ricevono iniezioni intraperitoneali di 1,0 mg di F-I per kg di peso corporeo per la stessa durata. Dopo 14 giorni di trattamento, ciascuna femmina viene uccisa e gli espianti di endometrio, ghiandole surrenali, l'utero restante e le ovaie, dove applicabile, vengono rimossi e preparati per l'esame istologico. Le ovaie e le ghiandole surrenali vengono pesate.

Prova 2: Come animali da esperimento si impiegano 12-30 ratti adulti femmine del ceppo CD. Essi vengono divisi in due gruppi uguali. Si controlla il ciclo dell'estro di tutti gli animali. Il giorno del proestro, si pratica un intervento chirurgico su ciascuna femmina. Alle femmine in ciascun gruppo si rimuove il corpo uterino sinistro, lo si seziona in piccoli quadratini e si suturano i quadratini in modo lasco in vari siti adiacenti al flusso di sangue mesenterico. Circa 50 giorni dopo l'intervento chirurgico, gli animali assegnati al gruppo 1 ricevono iniezioni intraperitoneali di acqua per 21 giorni, mentre gli animali nel gruppo 2 ricevono iniezioni intraperitoneali di 1,0 mg di F-I per kg di peso corporeo per la stessa durata. 21 giorni dopo il trattamento, ciascuna femmina viene uccisa e gli espianti di endometrio e le ghiandole surrenali vengono rimossi e pesati. Gli espianti vengono misurati come un'indicazione di crescita. Si controllano i cicli di estro.

Prova 3: si impiegano autoinnesti di tessuto dell’endometrio per indurre l 'endometriosi in ratti e/o conigli. Gli animali femmine alla maturità riproduttiva subiscono una oforectomia bilaterale e si somministrano estrogeno per via esogena fornendo così un livello specifico e costante di ormone. In modo analogo il tessuto dell’endometrio viene impiantato nel peritoneo di 5-150 animali e si fornisce estrogeno per indurre la crescita del tessuto espiantato. Il trattamento che consiste di un composto della presente invenzione, viene somministrato mediante lavanda gastrica su base giornaliera per 3-16 settimane e gli impianti vengono rimossi e misurati per la crescita o la regressione. Al momento dell'uccisione, si raccoglie il corno intatto dell'utero per valutare lo stato dell'endometrio.

Prova 4: si impianta tessuto da lesioni dell'endometrio umano nel peritoneo di topi nude, femmine sessualmente mature, castrate. Si fornisce estrogeno esogeno per indurre la crescita del tessuto espiantato. In alcuni casi, le cellule dell'endometrio raccolte vengono coltivate in vitro prima dell'impianto. Il trattamento che consiste di F-I fornito mediante lavanda gastrica su base giornaliera per 3-16 settimane, e gli impianti vengono rimossi e misurati per la crescita o la regressione. Al momento dell’uccisione, gli uteri vengono raccolti per valutare lo stato dell'endometrio intatto.

Prova 5: si raccoglie tessuto da lesioni dell'endometrio umano e lo si mantiene in vitro come colture non trasformate primarie. Campioni chirurgici vengono spinti attraverso una maglia sterile o setaccio sterile, o in alternativa vengono staccati dal tessuto circostante per produrre una sospensione cellulare singola. Le cellule vengono mantenute in un mezzo che contiene 10% di siero e un antibiotico. Si determinano le velocità di crescita in presenza e in assenza di estrogeno. Le cellule vengono valutate per la loro capacità di produrre il componente del complemento C3 e la loro risposta a fattori di crescita e all'ormone della crescita. Si valutano colture in vitro per la loro risposta proliferativa dopo trattamento con progestine, GnRH, F-I, e un veicolo. I livelli di recettori dell’ormone steroideo vengono valutati settimanalmente per determinare se in vitro vengono mantenute importanti caratteristiche delle cellule. Si utilizza il tessuto da 5 a 25 pazienti.

Disturbi del sistema nervoso centrale incluso il morbo di Alzheimer

Gli estrogeni come 17J5-estradiolo, regolano la trascrizione genica mediante il legame come recettori degli estrogeni (ER) che risiedono nel citoplasma di certe popolazioni cellulari. L'attivazione del ligando dell'ER è un prerequisito per il trasporto nucleare del complesso in cui il legame con una sequenza di consenso di DNAS palindromica a 13 paia di basi (elemento di risposta a estrogeni, o ERE) inizia l'assemblaggio di un apparato trascrizionale che culmina nell'attivazione di appropriati geni bersaglio . Sono stati identificati vari geni che vengono regolati da estrogeni. Questi includono proteine citoscheletriche, enzimi neurotrasmettitori biosintetici e metabolici e recettori come pure altri ormoni e neuropeptidi . Sono stati identificati ERE in parecchi geni responsivi a estrogeni, che includono vitellogenina, c-fos, prolattina, e ormone luteinizzante.

Significativamente nel sistema nervoso centrale sono state identificate sequenze ERE-simili in p<75>ngr e trkA, entrambi i quali servono come molecole segnale per le neurotrofine: fattore di crescita nervosa (NGF), fattore di crescita nervoso derivato dal cervello (BDNGF) e neurotrofina-3.

BDNF come pure NGF hanno mostrato di favorire la sopravvivenza di neuroni solinergici in coltura. Si è ipotizzato che se le interazioni fra neurotrofine ed estrogeni sono importanti per lo sviluppo e la sopravvivenza di neuroni basali del proencefalo (che degenerano nel morbo di Alzheimer) allora condizioni cliniche in cui esiste un deficit di estrogeni (come dopo la menopausa possono contribuire ad una perdita di questi neuroni)

In ratti ovariectomizzati (preparati come descritto sopra) è stato effettuato il seguente esperimento per determinare le somiglianze e/o differenze fra F-I e un estrogeno nell'influenzare l’espressione genica in varie regioni cerebrali. Si dosano giornalmente ratti di 6 settimane con iniezioni sottocutanee di estradiolo benzoato (0,03 mg/kg), F-I o di un veicolo (controllo). Dopo 5 settimane di trattamento gli animali vengono uccisi e i loro cervelli vengono rimossi e gli ippocampi vengono raccolti mediante microdissezione. Gli ippocampi vengono congelati velocemente in azoto liquido e conservati a -70°C. Si prepara l'RNA totale da tessuto riunito dagli appropriati gruppi di trattamento di controllo e lo si sottopone a trascrizione inversa impiegando un innesco 3' oligonucleotidico che viene scelto per le specifiche popolazioni di mRNA (poli-A+). Si effettuano reazioni a catena della polimerasi (PCR) in un cocktail che consiste di: 5' oligonucleotidi casuali (lunghi 10 paia di basi; totale di 150), tampone di reazione, Taq polimerasi, e un PdTCP.

Dopo 40 cicli di amplificazione, i prodotti di reazione vengono frazionati in base alle dimensioni su un gel di 6% TBE-urea, vengono essiccati ed esposti ad una pellicola per raggi X. I modelli di visualizzazione dell'mRNA risultanti vengono confrontati fra i gruppi di trattamento.

Impiego di F-I assieme con un estrogeno

Donne peri-menopausali e post-menopausali vengono spesso sottoposte ad una terapia ormonale di sostituzione (HRT) per combattere le conseguenze negative associate con la diminuzione di estrogeni endogeni in circolo (per esempio per trattare le vampate). Tuttavia l’HRT è stata associata con rischi aumentati di certi cancri inclusi il cancro dell'utero e il cancro della mammella. Si può impiegare F-I assieme con HRT per inibire questi rischi.

Impiego di F-I assieme con un inibitore di arginatasi

Per definizione, le ovaie di una donna postmenopausale non sono funzionanti . La sua unica fonte di estrogeni e tramite la conversione di androgeni surrenali a estrogeni da parte dell’enzima aromatasi che si trova in tessuti periferici (inclusi grasso, muscolatura e il tumore della mammella stesso). Quindi i farmaci che inibiscono la aromatasi (inibitori di aromatasi ) eliminano gli estrogeni in cìrcolo in una donna post menopausale. La privazione di estrogeni mediante l’inibizione di aromatasi è un importante opzione di trattamento per pazienti con cancro metastatico della mammella. Durante la terapia con un inibitore di aromatasi la mancanza di estrogeni in circolo può provocare effetti collaterali negativi non intenzionale, per esempio livelli di lipidi nel siero. Si può impiegare F-I per inibire questi effetti negativi.

Impiego di F-I assieme con un analogo di LHRH

L'esposizione continua ad un analogo di LHRH (ormone che rilascia l'ormone luteinizzante) inibisce la produzione di estrogeni in donne premenopausali desensibilizzando l’ipofisi che allora non stimola più le ovaie a produrre estrogeni. L'effetto clinico è una "oofrectomia medica" che è reversibile quando si cessa l'esposizione all'analogo di LHRH. Durante la terapia con un analogo di LHRH, la mancanza di estrogeni in circolo può provocare effetti collaterali negativi non previsti, per esempio livelli di lipidi nel siero. Si può impiegare F-I per inibire questi effatti negativi.

Livelli crescenti di acetil coline

E' noto che i pazienti che soffrono del morbo di Alzheimer hanno un livello marcatamente inferiore di neuroni colinergici nell'ippocampo rispetto a loro pari non affetti da Alzheimer. La perdita progressiva di questi neuroni colinergici sembra rispecchiare la progressiva perdita di memoria e di funzione cognitiva in questi pazienti. Si pensa che una ragione del declino di questi neuroni sia la perdita o la funzione diminuita del neurotrasmettitore acetil colina.

Il livello di acetil colina in un neurone è fondamentalmente determinato da dove si trova l'equilibrio fra la sua biosintesi e la sua biodegradazione. L'enzima colina acetil transferasi (ChAT) è principalmente responsabile della sua sintesi e la acetilcolina esterasi (AChE) della sua degradazione. .

Per determinare se F-I influenza i livelli di ChAT, si effettua il seguente esperimento: dopo la procedura generale di preparazione di ratti descritta sopra, si dosano 40 ratti giornalmente,mediante iniezione sottocutanea o mediante sonda orale con F-I a 3 mg/kg/giorno in un veicolo che contiene 10% di ciclodestrina, estradiolo benzoato a 0,03 o D,3 mg/kg/giorno o un controllo di veicolo. Gli animali vengono trattati per 3 o 10 giorni, vi sono 20 animali per ciascun regime di dosaggio. A intervalli di tempo appropriati, gli animali vengono uccisi e i loro cervelli vengono dissezionati. Le particolari porzioni dei cervelli vengono omogeneizzate e analizzate. Si trattarono omogenati dall 'ippocampo e dalla corteccia frontale e si effettua la determinazione dell'attività di ChAT mediante un’analisi radio-marcata della biosintesi dell'acetil colina. Questa procedura si può trovare in Schoepp et al., J. Neural Transmiss., 78:183-193, 19B9, i cui insegnamenti sono incorporati mediante riferimento.

Come previsto, negli animali OVX, i livelli di ChAT sono ridotti a >50% (p<0,001) rispetto ai controlli operati in modo simulato.

In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, si impiega F-I in combinazione con un inibitore di AChE. L'impiego di un inibitore di AChE fa aumentare i livelli di acetilcolina bloccando la sua degradazione tramite l'inibizione di AChE.

Iperplasia prostatica benigna (BPH)

Come base della relazione fra azione di estrogeni e trattamento di BPH e carcinoma della prostata si veda la domanda PCT No. WO 98/07274, data di pubblicazione internazionale: 15 ottobre 1998.

Negli esperimenti descritti sotto, si valuta la capacità di F-I di legarsi in corrispondenza di recettori di estrogeni in parecchie linee cellulari di cancro della prostata umano.

Si preparano lisati delle linee cellulari di cancro della prostata umano LNCaP, DU-45 e PC-3 in un mezzo TEG che comprende Tris-HCl 50 nM pH 7,4, acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 1,5 mM, KC1, 0,4 M, 10% di glicerolo, 2-ME 0,5 mM e molibdato di sodio 10 mM che contiene inoltre gli inibitori di protessi pepstatina (1 mg/raL), leupeptina {2 mg/mL), aprotinina (5 mg/ml) e fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF, 0,01 mM) (TEGP).

I lisati cellulari vengono centrifugati e i granuli vengono di nuovo messi in sospensione in TEGP freddo (1 mL di TEGP/100 mg di granulo) e vengono trattati con ultrasuoni per 30 secondi (ciclo di funzionamento 70%, produzione 1,8) su un dispositivo ad ultrasuoni Branson modello 450. I lisati vengono ridotti a granuli mediante centrifugazione a 10.000 x G per 15 minuti a 4°C dopo di che i surnatanti vengono prelevati e o impiegati immediatamente o conservati a -70°C.

Analisi di legame competitivo: il tampone finale TEG in cui si sostituisce KC1 0,4 M con NaCl 50 raM e a cui e stato inoltre aggiunto 1 mg/mL di ovalbumina (TEGO). Si diluisce F-I a 20 nM in TEGO da cui si preparano diluzioni triplici in serie. Si effettuano le analisi in micropiastre di polipropilene a fondo tondo in pozzetti in triplicato. Ciascun pozzetto riceve 35 mL di 17β-estradiolo trattato con tritio (0,5 nM attività specifica 60,1 Ci/mmole, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) e 35 mL di composto competitore in esame freddo (0,1 nM - 5 mM) o TEGO, e dopo incubazione per 5 minuti a 4°C con sbattimento, 70 mL di lisato della linea cellulare MCG-7.

Le piastre vengono incubate per 24 ore a 4°C dopo il quale periodo di tempo si aggiungono 70 mL di carbone rivestito con destrano (DCC) ciascun pozzetto, seguito da vigoroso sbattimento per 8 minuti a 4°C. Le piastre vengono poi centrifugate a 1500 x G per 10 minuti a 4°C. Si raccoglie il surnatante da ciascun pozzetto in una micropiastra di polistirene flessibile per il conteggio a scintillazione in un contatore Wallac Micobeta Modello 1450. Si esprime la radioattività come disintegrazioni per minuto (DPM) dopo correzione per l'efficienza di conteggio (35-40%) e per il fondo. Controlli addizionali sono conteggi totali e conteggi totali DCC per definire il limite inferiore di conteggi estraibili con DCC. I risultati di queste analisi di legame competitivo sono espressi come percento di legato medio (% legato) /- deviazione standard impiegando la formula:

Prevenzione del cancro della mammella

La presente invenzione riguarda anche la somministrazione di F-I ad un ricevente che è a rischio di sviluppare de novo il cancro della mammella. Il termine "de novo", come qui impiegato significa la mancanza di trasformazione o metamorfosi di cellule della mammella normali a cellule cancerose o maligne in prima istanza. Una tale trasformazione può verificarsi in stadi nelle stesse cellule o in cellule figlie attraverso un processo evolutivo o può verificarsi in un singolo evento, principale. Questo processo de novo è in contrasto con le metastasi, la colonizzazione o la diffusione di cellule già trasformate o maligne dal sito del tumore primario a nuove posizioni.

Una persona che non è particolarmente a rischio di sviluppare il cancro della mammella è una persona che può sviluppare de novo il cancro della mammella non presenta alcuna evidenza o non ha alcun sospetto del potenziale della malattia al di sopra del rischio normale e che non ha mai avuto una diagnosi di avere la malattia. Il fattore di rischio più elevato che contribuisce allo sviluppo del carcinoma della mammella è una storia personale di soffrire della malattia, o un precedente verificarsi della malattia anche se è in remissione senza alcuna evidenza della sua presenza. Un altro fattore di rischio è la storia famigliare della malattia.

L’induzione di tumori della mammella in ratti mediante somministrazione del carcinogeno N-nitro-N-metilurea è un modello animale ben accettato per lo studio del cancro della mammella ed è stato trovato adatto per l’analisi dell'effetto di agenti di chemioprevenzione.

In due studi separati, a ratti Sprague-Dawley femmine di 55 giorni viene somministrata una dose endovenosa (studio 1) o intraperitoneale (studio 2) di 50 mg di N-nitroso-N-metilurea per kg di peso corporeo, una settimana prima dell'alimentazione a volontà con una dieta in cui sono mescolate varie quantità di F-I, base di (Z)-2-[4-(1,2-difenil-l-butenil)fenossi]-N,N-dimetiletanammina (base di tamoxifene), o un controllo.

Nello studio 1, le dosi dietetiche di 60 mg/kg di dieta e 20 mg/kg di dieta si traducono in dosi all'incirca confrontabili di 3 e 1 mg/kg di peso corporeo per animali da esperimento.

Nello studio 2, le dosi dietetiche di 20, 6, 2 e 0,6 mg/kg di dieta si traducono all'incirca in dosi confrontabili di 1, 0,3, 0,1 e 0,03 mg/kg di peso corporeo per animale da esperimento.

I ratti vengono tenuti sotto osservazione per l'evidenza della tossicità è vengono pesati e palpati una volta alla settimana per la formazione di tumori. Gli animali vengono uccisi dopo 13 settimane (studio 1) o 18 settimane (studio 2) e i tumori vengono confermati e pesati all'autopsia.

Formulazioni

Il termine "farmaceutico" quando qui impiegato coma aggettivo significa sostanzialmente non dannoso per il mammifero ricevente. Con "formulazione farmaceutica" si intende che il veicolo, il diluente, gli eccipiente e l'ingrediente attivo (ingredienti attivi) devono essere compatibili con gli altri ingredienti della formulazione e non deleteri per il loro riceventi

F-I viene preferibilmente formulato prima della somministrazione. La scelta della formulazione deve essere decisa dal medico curante prendendo in considerazione gli stessi fattori coinvolti nella determinazione della quantità efficace.

Gli ingredienti attivi totali in tali formulazioni costituiscono dallo 0,1% al 99,9% in peso della formulazione. Preferibilmente in detta formulazione non sono contenuti più di 2 ingredienti attivi. Cioè, si preferisce formulare F-I con un secondo ingrediente attivo scelto da un estrogeno, progestina, inibitore di aromatasi, analogo di LHRH e inibitore di AChE. Le formulazioni più preferite sono quelle in cui F-I è l'unico ingrediente attivo.

Le formulazioni farmaceutiche della presente invenzione vengono preparate mediante procedure note nel settore impiegando ingredienti ben noti e facilmente disponibili. Per esempio, F-I, da solo o in combinazione con un estrogeno, progestina, inibitore di aromatasi, un analogo di LHRH o un composto inibitore di AChE, viene formulato con comuni eccipienti, diluenti o veicoli e formati in compresse, capsule, sospensioni, soluzioni, sostanze iniettabili, aerosol, polveri e simili.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione per la somministrazione parenterale comprendono soluzioni, dispersioni, sospensioni o emulsioni acquose o non acquose sterili come pure polveri sterili che vengono ricostituite immediatamente prima dell'uso in soluzioni o sospensioni sterili. Esempi di adatti vettori, diluenti, solventi o veicoli sterile, acquosi e non acquosi includono acqua, soluzione fisiologica salina, etànolo, polioli (come glicerolo, propilen glicol, poli(etilen glicol) e simili) e loro miscele adatte, olii vegetali (come olio di oliva) e esteri organici iniettabili come etil oleato. Si mantiene una fluidità appropriata per esempio mediante l'impiego di materiali di rivestimento come la lecitina, mediante il mantenimento di una appropriata dimensione delle particelle nel caso di dispersioni e sospensioni, e mediante l'impiego di tensioattivi .

Le composizioni parenterali possono anche contenere coadiuvanti come conservanti, agenti bagnanti, agenti emulsionanti e agenti disperdenti. La prevenzione dell'azione di microorganismi viene assicurata mediante l'inclusione di agenti antibatterici e enti-funghi, per esempio parabene, clorobutanolo, fenolo acido sorbico e simili. Può essere desiderabile includere agenti isotonici come zuccheri, cloruro di sodio e simili. L'assorbimento prolungato di formulazioni iniettabili può essere ottenuta mediante l'inclusione di agenti che ritardano l'assorbimento, come monostearato di alluminio e gelatina.

In alcuni casi, al fine di prolungare l'effetto del farmaco, è desiderabile rallentare l'assorbimento del farmaco dopo iniezione sottocutanea o intramuscolare. Questo può essere ottenuto mediante l'impiego di una sospensione liquida di un materiale cristallino a bassa solubilità in acqua o sciogliendo o sospendendo il farmaco in un veicolo oleoso. Nel caso dell'iniezione sottocutanea o intramuscolare di una sospensione che contiene una formula del farmaco con bassa solubilità in acqua, la velocità di assorbimento del farmaco dipende dalla sua velocità di dissoluzione.

Si preparano formulazioni di "deposito" iniettabili di F-I formando matrici microincapsulate del farmaco in polimeri biodegradabili come poli-(acido lattico), poli(acido glicolico) copolimeri di acido lattico e acido glicolico, poli(ortoesteri) e poli(anidridi) di questi materiali che sono descritti nel settore. A seconda del rapporto fra farmaco e polimero e a seconda delle caratteristiche del particolare polimero impiegato, si può controllare la velociti di rilascio di un farmaco.

Le formulazioni iniettabili vengono sterilizzate per esempio mediante filtrazione attraverso filtri che trattengono batteri o mediante presterilizzazione dei componenti della miscela prima della loro miscelazione, o al momento della produzione o appena prima della somministrazione (come nell'esempio di una confeziona a siringa a doppia camera).

Le forme solide di dosaggio per la somministrazione orale includono capsule, compresse, pillole, polveri e granuli. In tali forme solide di dosaggio F-I viene miscelato con almeno un veicolo farmaceutico inerte come citrato di sodio o fosfato dicalcico e/o (a) cariche o diluenti come amidi, zuccheri, inclusi lattosio e glucosio, mannitolo e acido siliceo, (b) agenti leganti come carbossimetilcellulosa e altri derivati della cellulosa, alginati, gelatina, poli(vinilpirrolidina), saccarosio e gomma arabica, (c) umettanti come glicerolo (d) agenti disaggreganti come agaragar, carbonato di calcio, bicarbonato di sodio, amido di patate o di tapioca, acido alginico, silicato e carbonato di sodio (e) agenti umidificanti come glicerolo; (f) agenti che ritardano la soluzione come la paraffina (g) agenti che accelerano l'assorbimento come composto di ammonio quaternario, (h) agenti bagnanti come alcol acetilico e glicerina monostearato (i) agenti assorbenti come caolino e argilla bentonitica, e (j) lubrificanti come talco, stearato di calcio, stearato di magnesio, poli-(etilen glicoli) solidi, lauril solfato di sodio e loro miscele. Nel caso di capsule, compresse e pillole, la forma di dosaggio può anche contenere agenti tampone.

Le composizioni solide di tipo simile possono anche comprendere il riempimento di capsule di gelatina morbide e dure impiegando eccipienti come lattosio, come pure poli(etilen glicoli) ad elevato peso molecolare e simili .

Le forme solide di dosaggio come compresse, confetti, capsule, pillole e granuli possono anche venire preparate con rivestimenti o gusci come rivestimenti enterici o altri rivestimenti ben noti nel campo delle formulazioni farmaceutiche. I rivestimenti possono contenere agenti specifici o agenti che rilasciano l'ingrediente attivo (ingredienti attivi) in una parte particolare del tratto digestivo, come per esempio rivestimenti solubili in acidi per il rilascio dell'ingrediente attivo (ingredienti attivi) nello stomaco o rivestimenti solubili in basi per il rilascio dell'ingrediente attivo (ingredienti attivi) nel-tratto intestinale.

L'ingrediente attivo (ingredienti attivi) può anche essere microincapsulato (possono anche essere microincapsulati) in un rivestimento a rilascio protratto, le microcapsule essendo rese parte di una pillola di una formulazione in capsule.

Le forme liquide di dosaggio per la somministrazione orale di F-I includono soluzioni, emulsioni, sospensioni, sciroppi ed elisir. Oltre ai componenti attivi, le formulazioni liquide possono includere diluente inerti comunemente impiegati nel settore come acqua o altri solventi farmaceutici, agenti solubilizzanti ed emulsionanti come etanolo, isopropanolo, etil carbonato, etil acetato, alcol benzilico, benzil benzoato, propilen glicol, 1,3-butilen glicol, dimetil formaramide, olii (in particolare olii di semi di cotone, di arachidi, di mais, di germe, di oliva, di ricino e di sesamo), glicerolo, alcool tetraidrofurfurilico, poli(etilenglicoli), esteri del sorbitolo con acidi grassi e loro miscele.

Oltre ai diluenti inerti, le formulazioni liquide orali possono anche includere coadiuvanti come agenti bagnanti, agenti emulsionanti e sospendenti e agenti edulcoranti, aromatizzanti e di profumazioni.

La sospensione liquida, oltre all'ingrediente attivo (ingredienti attivi) può contenere agenti sospendenti come alcoli isostearilici etossilati, esteri del sorbitano e poliossietilen sorbitolo, cellulosa microcristallina, metaidrossido di alluminio, argilla bentonitica, agar-agar e gomma adragante e loro miscele.

Le composizioni per la somministrazione rettale o endovaginale vengono preparate miscelando F-I con eccipienti non irritanti adatti come burro di cacao, polietilen glicol o qualsiasi cera per supposte che sia solida a temperatura ambiente ma liquida alla temperatura corporea e che perciò fonde nel retto o nella cavità vaginale rilasciando il componente attivo (componenti attivi). I composti vengono sciolti nella cera fusa, vengono formati nella forma desiderata e vengono lasciati indurire nella formulazione finita in supposte.

F-I può anche essere somministrato sotto forma di liposomi. Come è noto nel settore i liposomi sono generalmente derivati da fosfolipidi o altre sostanze lipidiche. Le formulazioni liposomiche sono formate da cristalli liquidi idrati monolamellari o multilamellari che sono dispersi in un mezzo acquoso. Si può impiegare qualsiasi lipide non tossico, farmaceutico e instatolizzabile capace di formare liposomi. Le presenti composizioni in forma di liposomi possono contenere, oltre a F-I, stabilizzanti, eccipienti, conservanti e simili. I lipidi preferiti sono fosfolipidi e le fosfatidii coline (lecitine), sia naturali sia sintetici.

I metodi per formare liposomi sono noti nel settore come descritti per esempio in Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), pag. 33 et seq.

Gli esempi di formulazione che seguono sono illustrativi soltanto e non intendo limitare l'ambito della presente invenzione.

Formulazione 1: Capsule di gelatina

La formulazione di cui sopra può essere cambiata secondo le variazioni ragionevoli fornite.

Si prepara una formulazione per compresse impiegando gli ingredienti sotto:

Formulazione 2; Compresse

I componenti vengono miscelati e pressati per formare compresse.

Formulazione 3; Si preparano come segue compresse che contengono circa 10 e 50 mg, rispettivamente di F-I;

I componenti vengono miscelati e compressi per formare compresse. In alternativa si preparano come segue compresse che contengono ciascuna 2,5 - 1000 mg di F-I:

Formulazione 4: Compresse

Si fanno passare F-I, l'amido e la cellulosa attraverso un setaccio USA con mesh N. 45 e si miscelano accuratamente. Si miscela la soluzione di polivinilpirrolidone con le polveri risultanti che vengono poi fatte passare attraverso un setaccio USA con mesh N. 14. I granuli così prodotti vengono essiccati a 50°-60°C e vengono fatti passare attraverso un setaccio USA con mesh N. 18. Il sodio carbossimetil amido, lo stearato di magnesio e il talco, precedentemente fatti passare attraverso un setaccio USA No. 60 vengono poi aggiunti ai granuli che, dopo miscelazione vengono pressati su una macchina per compresse per dare compresse.

Si preparano come segue sospensioni che contengono ciascun 0,1-1000 mg di farmaco per dose da 5 ml:

Formulazione 5: Sospensioni

Il farmaco viene fatto passare attraverso un setaccio USA con mesh N.

45 e viene miscelato con sodio carbossimetil cellulosa e con lo sciroppo per formare una pasta uniforme. La soluzione di acido benzoico, l'aroma e il colore vengono diluiti con una certa quantità dell'acqua e vengono aggiunti, con agitazione. Si aggiunge poi acqua sufficiente a produrre il volume richiesto.

Si prepara una soluzione per aerosol che contiene i seguenti ingredienti:

Formulazione 6: Aerosol

Si miscela F-I con etanolo e si aggiunge la miscela ad una porzione del propellente 22, raffreddato a 30°C, e si trasferisce in un dispositivo di riempimento. Si alimenta poi la quantità richiesta in un contenitore di acciaio inossidabile e si diluisce con il propellente restante. Al contenitore si applicano poi le unità di valvola.

Si preparano supposte come segue.

Formulazione 7: Supposte

Si fa passare F-I attraverso un setaccio USA con mesh N. 60 e si mette in sospensione nei gliceridi di acidi grassi saturi precedentemente fatti fondere impiegando il calore minimo necessario. La miscela viene poi versata in uno stampo per supposte con una capacità nominale di 2 g e viene poi lasciata raffreddare.

Si prepara una formulazione endovenosa come segue:

Formulazione S: Soluzione endovenosa

La soluzione degli ingredienti di cui sopra viene somministrata per via endovenosa ad un paziente a una portata di circa 1 mL per minuto.

Formulazione 9: Combinazione capsula I

Formulazione 10: Combinazione Capsula II

Formulazione 11; Combinazione compressa

Dosaggio

La specifica dose di F-I somministrata secondo la presente invenzione viene determinata in base alle particolari circostanze di ciascuna situazione. Queste circostanze includono la via di somministrazione, la storia medica precedente del ricevente, la condizioni patologica o il sintomo che viene trattato, la gravità della condizione/sintomo che viene trattato e l'età e il sesso del ricevente.

In generale una dose giornaliera minima efficace di F-I è circa 1, 5, 10, 15 0 20 mg. Tipicamente, una dose massima efficace è circa 800, 100, 60, 50 o 40 mg. Nel modo più tipico, la dose varia fra 15 mg e 60 mg. La dose esatta può essere determinata, secondo la pratica standard nell'arte medica di "titolazione di dosaggio" del ricevente; cioè si somministra inizialmente una dose bassa del composto e si fa gradualmente aumentare la dose fino a quando si effettua l'effetto terapeutico desiderato.

Sebbene possa essere necessario titolare la dose per il ricevente rispetto alle terapie in combinazione discusse sopra, dosi tipiche di ingredienti attivi diversi da F-III sono come segue: etinil estrogeno (0,01-0,03 mg/giorno), mestranolo (0,05-0,15 mg/giorno), ormoni esterogenici coniugati (per esempio Premari: Wyeth-Ayerst; 0,3-2,5 rag/giorno), medrossiprogesterone (2,5-10 mg/giorno), noretilnodrel (1,0-10,0 mg/giorno), nonetindrone (0,5-2,0 rag/giorno), araminoglutanammide (250-1250 mg/giorno, preferibilmente 250 mg 4 volte al giorno), anastrazolo (1-5 mg/giorno, preferibilmente 1 mg una volta al giorno), letrozolo (2,5-10 mg/giorno, preferibilmente 2,5 rag una volta al giorno), formestano (250-1250 mg alla settimana, preferibilmente 250 mg due volte alla settimana), exemestano (25-100 mg/giorno, preferibilmente 25 mg una volta al giorno), goserlino (3-15 mg/3 mesi, preferibilmente 3,6-7,2 mg una volta ogni 3 mesi) e leuprolide (3-15 mg/mese, preferibilmente 3,75-7,5 mg una volta al mese).

Via di somministrazione

F-I può essere somministrato mediante-varie vie che includono le vie orale, rettale, transdermica, sottocutanea, endovenosa, intramuscolare e endonasale. I metodi di somministrazione di ciascun agente a base di estrogeno e progestina e conforme a quello che è noto nel settore. F-I da solo o in combinazione con estrogeno, progestina o un inibitore di AChE viene generalmente somministrato in una formulazione conveniente.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione possono essere somministrate all'uomo o ad altri animali, (per esempio cani, gatti, cavalli, suini e simili) per via orale, rettale, endovaginale, parenterale, topica, buccale o sublinguale o nasale. Il termine "somministrazione parenterale" si riferisce qui a modi di somministrazione che includono l'iniezione endovenosa, intramuscolare, intraperitoneale, intrasternale, sottocutanea o intraarticolare o infusione.

Modo/durata della somministrazione

Per la maggioranza dei metodi della presente invenzione F-I viene somministrato continuamente, da 1 a 3 volte al giorno o cosi spesso come necessario per somministrare una quantità efficace di F-I al ricevente. Una terapia ciclica può essere particolarmente utile nel trattamento della endometriosi o può essere impiegata acutamente durante attacchi dolorosi della malattia. Nel caso della ristenosi, la terapia può essere limitata a brevi intervalli (1-6 mesi) dopo procedure mediche come l’angioplastica.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. 6-idrossi-3- (4-[2-piperidin-l-il)etossi]fenossi)-2-(4-metossifenil)benzo[b]tiofene cloridrato idrato cristallino (F-I) che ha uno spettro di diffrazione dei raggi X e che comprende i seguenti picchi: 7,9 ± 0,2, 10,7 ± 0,2, 14,9 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 18,3 ± 0,2, e 20,6 ± 0,2° in 2Θ; quando ottenuto da una fonte di irradiazione di rame.
2. 2. Formulazione farmaceutica che comprende il composto cristallino secondo la rivendicazione 1; uno o più veicoli, diluenti o eccipienti farmaceutici; e facoltativamente estrogeno, facoltativamente progestina, facoltativamente un inibitore di aromatasi, facoltativamente un analogo di LHRH e facoltativamente un inibitore della acetil colina esterasi (AChE).
3. 3 . Formulazione secondo la rivendicazione 2, che comprende il composto cristallino secondo la rivendicazione 1; uno o più veicoli, diluenti, o eccipienti farmaceutici; e estrogeno.
4. 4. Formulazione secondo la rivendicazione 3, in cui l'estrogeno è Premarin<®>
5. 5 . Formulazione secondo la rivendicazione 2 che comprende il composto cristallino secondo la rivendicazione 1; uno o più veicoli, diluenti o eccipienti farmaceutici e progestina.
6. 6. Formulazione secondo la rivendicazione 5, in cui la progestina è scelta dal gruppo costituito da noretilnodrel e noretindrone.
7. 7. Formulazione secondo la rivendicazione 2 che comprende il composto cristallino secondo la rivendicazione 1, uno o più veicoli, diluenti o eccipiervti farmaceutici, e un inibitore di AChE.
8. 8. Formulazione secóndo la rivendicazione 7 in cui l'inibitore di AChE è scelto dal gruppo costituito da: fisostigmina salicilato, tacrina cloridrato e donepezil cloridrato.
9. 9. Formulazione secondo la rivendicazione 2 che comprende il composto cristallino secondo la rivendicazione 1; uno o più veicoli, diluenti o eccipienti farmaceutici, estrogeno; e progestina.
10. 10. Composto secondo la rivendicazione 1 per inibire una condizione patologica scelta dal gruppo costituito da: fibrosi uterina, endometriosi, proliferazione delle cellule della muscolatura liscia dell'aorta, ristenosi, cancro della mammella, cancro dell'utero, cancro della prostata, iperplasia prostatica benigna, perdita di osso, osteoporosi, una malattia cardiovascolare, iperlipideraia, disturbi del sistema nervoso centrale e il morbo di Alzheimer.
11. 11. Composto secondo la rivendicazione 10, per inibire il cancro della mammella.
12. 12. Composto secondo la rivendicazione 11, in cui il modo di inibizione è profilattico.
13. 13. Composto secondo la rivendicazione 10, per inibire il cancro delle ovaie.
14. 14. Composto secondo la rivendicazione 10, per inibire il cancro dell'endometrio.
15. 15. Composto secondo la rivendicazione 1 per regolare verso l'alto la colina acetil transferasi (ChAT) in mammiferi.
16. 16. Procedimento per preparare un composto secondo la rivendicazione 1, che comprende cristallizzare 6-idrossi-3-(4-[2-(piperidin-l-il)etossi] fenossi)-2-(4-metossifenil )benzo[b]tiofene cloridrato da tetraidrofurano.