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6-Hydroxy-3(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (Arzoxifen)
wurde zuerst allgemein in
US
5 510 357 A beschrieben und wurde speziell in
US 5 723 474 A und in
EP 0 729 956 A beschrieben.
Arzoxifen ist ein nichtsteriodaler gemischter Östrogejnantagonist/Agonist,
der unter anderem zur Verringerung des Serumcholesterins und zur
Hemmung der Hyperlipidämie,
Osteoporose, Östrogenabhängigen Krebsarten,
wie Brust- und Uteruskrebs, Endometriose, ZNS Störungen, einschließlich Alzheimerscher
Erkrankung, der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta
und der Restenose brauchbar ist.
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Genauer gesagt ist Arzoxifen zur
Behandlung von Rezeptor-positivem metastatischem Brustkrebs, der der
Zusatzbehandlung von Rezeptor-positiven Patienten nach einer geeigneten
systemischen oder lokalen Therapie, der Verringerung des Wiederauftretens
von invasivem und nicht-invasivem Brustkrebs und der Verringerung
des Auftretens von invasivem Brustkrebs und dem duktalen Carzinom
in situ (DCIS) brauchbar und wird hierfür klinisch evaluiert. Arzoxifen
ist auch in Kombination mit der radioaktiven Therapie, Aromataseinhibitoren,
LHRH Analoga und Acetylcholinesteraseinhibitoren (AChE) brauchbar.
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Röntgenbeugung
am Pulver (XRD), Thermogravimetrie (TGA), Protonenkernmagnetresonanz
(
1H NMR) und Karl Fischer (KF) Analysen
von Bulkarzoxifen, das durch die in
US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren isoliert
wurde, zeigen an, dass das Material hydriert und wenig kristallin
ist und in dessen Kristallgitter variable Mengen an organischen
flüchtigen
Bestandteilen (Ethylacetat) enthält.
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Wenig kristalline Materialien sind
typischerweise weniger für
die Formulierungsverarbeitung erwünscht als hochkristalline Materialien.
Zusätzlich
ist es im allgemeinen nicht erwünscht,
Pharmazeutika zu formulieren, die wesentliche Mengen an organischem
Lösemittel
(beispielsweise Ethylacetat) aufgrund einer potentiellen Lösemitteltoxizität für den Empfänger hiervon
enthalten und aufgrund von Veränderungen
in der Stärke
des Pharmazeutikums als Funktion des Lösemittels.
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Obwohl das durch die in
US 5 723 474 A beschriebenen
Verfahren hergestellte Arzoxifen als Pharmazeutikum verwendet werden
kann, wäre
es sehr erwünscht
und vorteilhaft, eine kristallinere Form von Arzoxifen zu finden,
die kein organisches Lösemittel
in ihrem Kristallgitter enthält,
die reproduzierbar und effizient auf einem industriellen Maßstab hergestellt
werden kann.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine neue nicht-stöchiometrisch
hydrierte, kristalline Form von 6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid
(F-III) mit einem Röntgenbeugungsmuster,
das die folgenden Peaks aufweist: 4,6 ± 0,2, 7,8 ± 0,2,
9,3 ± 0,2,
14,0 ± 0,2, 17,6 ± 0,2,
20,8 f 0,2 und 24,3 ± 0,2 ° in 2 θ, wenn es
bei 25 ± 2°C und 35 ± 10 %
relativer Luftfeuchtigkeit (RH) mit einer Kupferbestrahlungsquelle
erhalten wird. Darüberhinaus
betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung,
die F-III, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe
und wahlweise Östrogen,
wahlweise Progestin, wahlweise einen Aromataseinhibitor, wahlweise
ein LHRH Analogon und wahlweise einen Acetylcholinesteraseinhibitor
(AChE) enthält.
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Zusätzlich betrifft die vorliegende
Erfindung auch Verfahren zur Verwendung von F-III zur Hemmung der
pathologischen Zustände,
wie Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen
der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne,
prostatische Hyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, cardiovaskuläre Erkrankung,
Hyperlipidämie,
ZNS Störungen
und Alzheimersche Erkrankung und die Verwendung von F-III zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Hemmung derselben.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner Verfahren zur Verwendung von F-III zur Hochregulation von Cholinacetyltransferase
(ChAT) und zur Verwendung von F-III zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Hochregulierung derselben.
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Die 1 ist
eine repräsentative
DSC/TGA Spur von F-III. Die 2 zeigt
die Feuchtigkeitsisothermen für
F-III.
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Bulkarzoxifen, das durch das in
US 5 723 474 A beschriebene
Verfahren hergestellt wurde (Beispiel 41, Kristallisation aus einem
Gemisch aus Ethanol und Ethylacetat, Filtration und Trocknung des
Filterkuchens bis zu einem konstanten Gewicht bei Raumtemperatur)
wird durch XRD charakterisiert und ist wenig kristallin. Die
1H NMR bestätigt, dass das Bulkmaterial
6 % Ethylacetat enthält.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist eine besonders bevorzugte Form von Arzoxifen F-III. F-III wird leicht
bei Raumtemperatur hergestellt und isoliert. Es sind nur moderate
Trocknungsbedingungen erforderlich, um geringe Mengen an restlichen
Kristallisationslösernittel
bei der Herstellung von F-III zu entfernen. Diese moderaten Trocknungsbedingungen
führen
konsistent zu einem Feststoff mit hoher Reinheit (das heißt frei
von restlichem organischem Lösemittel)
und Kristallinität
und daher eliminiert die Verwendung von F-III die Toxikologie, die
mit restlichem organischem Lösemittel
und organischem Lösemittel
im Kristallgitter assoziiert ist. Ferner ist die Herstellung von
F-III einfach und effizient, das heißt für eine Bulkproduktion geeignet.
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F-III wird leicht bei Umgebungstemperatur
durch die Kristallisation von Arzoxifen (oder jedem Polymorph /Solvat
hiervon) aus einem Gemisch aus Isopropylalkohol (IPA) und Wasser
hergestellt und isoliert. Typischerweise kann Arzoxifen in einem
Gemisch aus IPA und Wasser suspendiert und erhitzt werden, um die Auflösung des
Arzoxifenausgangsmaterials zu bewirken. Wenn einmal die Auflösung erreicht
ist, kann die Lösung
langsam auf Raumtemperatur abkühlen
und dann weiter (mit Hilfe eines Eisbads oder einer Kühlung) zwischen
0°C und
5°C. Nachdem
eine ausreichende Zeitspanne für
die Kristallisation verstrichen ist, können die Kristalle durch Vakuumfiltration
gewonnen und im Vakuum bis zu einer Gewichtskonstanz unter Bildung
von F-III mit Ausbeuten von mehr als 80 % getrocknet werden.
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Geeignetes Arzoxifenausgangsmaterial
für die
obige Kristallisation umfasst unter anderem Arzoxifen, das durch
die in
US 5 723 474
A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Es ist nicht
entscheidend, mit welcher Arzoxifenform man beginnt, da die Kristallisation
aus IPA und Wasser gemäß den hierin
beschriebenen Verfahren zu F-III Kristallen führt. Das Verhältnis von
Wasser zu IPA (V:V) beträgt
im allgemeinen etwa 1:1 bis 9:1. Bevorzugter liegt das Verhältnis zwischen
2,5 und 5,6:1. Am bevorzugtesten liegt das Verhältnis zwischen 3 bis 5,6:1.
Bei der Gewinnung der Kristalle durch Vakuumfiltration kann der
nasse F-III Kuchen mit kaltem, entionisiertem Wasser vor der Trocknung
im Vakuum gewaschen werden. Zusätzlich
sind leicht erhöhte Temperaturen
(etwa 50°C
für 12
bis 24 Stunden) bevorzugt. Für
die Synthese im kommerziellen Maßstab von F-III kann es vorteilhaft
sein, die Kristallisation mit F-III zu beimpfen.
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In einem bevorzugten Verfahren wird
F-III anschließend
an die chemische Entfernung der 6-Isopropylhydroxyschutzgruppe von
6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid
(Vorläufer
A) hergestellt, isoliert und gereinigt. Die Schutzgruppenabspaltungsreaktion
wird für
die vollständige
Entfernung der Isopropylschutzgruppe verfolgt und wenn bestimmt
wurde, dass die Entfernung im wesentlichen vollständig ist,
umfasst die Aufarbeitung der Reaktion vorzugsweise eine Kristallisation
unter den Bedingungen, die F-III liefern, wie dies oben und später diskutiert
ist. Verfahren zur Herstellung des Vorläufers A und zur Entfernung
der Isopropylgruppe kann man in
US 5 723 474 A finden.
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In einem weiteren bevorzugten Verfahren
wird F-II anschließend
an die chemische Reduktion des S-Oxids und der chemischen Entfernung
der Benzylschutzgruppe vom 6-Hydroxyl in 6-Benzyloxy-3-(4-[2-(pipertdin-1yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-metlioxyplienyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid)
(Vorläufer
B) hergestellt, isoliert und gereinigt. Die Reduktions- und Schutzgruppenabspaltungsreaktionen
werden auf eine vollständige
Reduktion des Sulfoxids zum Sulfid und der vollständigen Entfernung
der Benzylhydroxyschutzgruppe verfolgt. Wenn bestimmt wird, dass
die Reduktion / Entfernung im wesentlichen vollständig ist,
umfasst die Aufarbeitung der Reaktion vorzugsweise eine Kristallisation
unter den Bedingungen, die F-III wie hierin diskutiert liefern.
Verfahren zur Herstellung des Vorläufers B, zur Entfernung der
Benzylgruppe und zur Reduktion des 1-Sulfoxids zum entsprechenden
Sulfid kann man auch in
US
5 723 474 A finden.
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Unabhängig von der in den Schutzgruppenabspaltungs-
und Reduktionsschritten verwendeten Chemie liefert die Krtstallisation
von Arzoxifen aus den hierin beschriebenen IPA / Wasser-Lösungen konsistent F-III
Kristalle in hoher Reinheit.
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Charakterisierung und
Differenzierung von F-III
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Es werden DSC/TGA und XRD Verfahren
verwendet, um F-III zu charakterisieren. Die TGA ist oft sehr nützlich für die Unterscheidung
zwischen unterschiedlichen festen Formen eines Materials, da die
Temperaturen), bei der eine physikalische Änderung im Material auftritt,
gewöhnlich
für das
Polymorph oder Solvat charakteristisch ist. Die DSC ist eine Technik,
die oft zum Screenen von Verbindungen auf Polymorphismus und Solvatbildung
verwendet wird. Schließlich
ist die XRD eine Technik, die eine hohe Ordnung in einem krtstallinen
Material detektiert.
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Das durch die in
US 5 723 474 A beschriebenen
Verfahren hergestellte Arzoxifen gibt ein XRD Muster mit schwachem
Signal-zu-Rausch Verhältnissen
und eine erhöhte
Grundlinie, was ein schwach kristallines Material anzeigt.
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Die DSC Spur von F-III, wie sie in 1 gezeigt ist, zeigt eine
breite Niedrigtemperaturendothermie bei etwa 30°C, gefolgt von einer zweiten
breiten und relativ schwachen Endothermie, die bei etwa 70°C beginnt und
einer schließlichen
Umwandlung, die bei 146°C
beginnt, was einer Schmelze entspricht. Der scharfe 1,5 % (~0,5
mol) betragende Gewichtsverlust im TGA, der mit der ersten Endothermie
auftritt, entspricht einem Verlust an schwach gebundenen Wassermolekülen, während zusätzliche
~1,6 % Gewichtsverlust über
60°C den
Verlust von fester gebundenen Wassermolekülen darstellen, das heißt die,
welche bei sehr geringen relativen Luftfeuchtigkeiten vorkommen.
Der nach 170°C
beobachtete Gewichtsverlust entspricht einer Zersetzung von F-III.
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Die XRD Muster von F-III zeigen scharfe
Peaks und eine flache Grundlinie, was hoch kristallines Material
anzeigt. Die Winkelpeakpositionen in 2 Θ und die entsprechenden I/I0 Daten für
eine repräsentative
Probe von F-III sind in Tabelle 1 angegeben.
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Es ist in der Kristallographietechnik
gut bekannt, dass für
jedes gegebene Polymorph die relativen Intensitäten der Beugungspeaks aufgrund
der bevorzugten Orientierung variieren können, die aus Faktoren resultiert,
wie Kristallmorphologie. Wenn die Effekte der bevorzugten Orientierung
vorhanden sind, sind die Peakintensitäten verändert, aber die charakteristischen
Peakpositionen des Polymorphs sind unverändert. Siehe beispielsweise
The United States Pharmacopeia Nr. 23, National Formulary Nr. 18,
Seiten 1843-1844, 1995. Daher kann basierend auf den Peakintensitäten wie
auch der Peakposition F-III durch das Vorkommen der Peaks bei 4,6 ± 0,2,
7,8 ± 0,2,
9,3 ± 0,2,
14,0 ± 0,2,
17,6 ± 0,2,
20,8 ± 0,2
und 24,3 ± 0,2° in 2 Θ identifiziert werden,
wobei das Muster bei 25 ± 2°C und 35 ± 10 %
relativer Luftfeuchtigkeit von einer Kupferbestrahlungsquelle erhalten
wird.
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Tabelle 1
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Weitere Charakterisierung
von F-III
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Es werden Hygroskopizitätszuntersuchungen
mit F-III ausgeführt.
Die Feuchtigskeitssorptionsisothermen für F-III sind in 2 gezeigt. Nach einer anfänglichen
Exposition der Proben gegenüber
etwa 5 % relativer Luftfeuchtigkeit findet eine unmittelbare Gewichtszunahme
von 1,7 % Feuchtigkeit für
F-III statt, was etwa zu 0,5 mol Wasser äquivalent ist. Diese Form zeigt
eine kontinuierliche Sorption von Feuchtigkeit durch den gesamten
Feuchtigkeitsbereich, was wahrscheinlich auf den Einbau von Wassermolekülen in das
Kristallgitter beruht.
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Das Fehlen einer Hysterese in den
Sorption-Desorptions-Isothermen von F-III zeigt an, dass die Kristallform
schnell bei jeder gegebenen Feuchtigkeit äquilibriert.
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Das Feuchtigkeitssorptionsprofil
für F-III
zeigt, dass diese Formen im wesentlichen nicht-stöchiometrische
Hydrate sind. Bei Umgebungsluftfeuchtigkeit (etwa 50 % relative
Luftfeuchtigkeit) sorbiert F-III etwa 3,0 % Wasser, was etwa 0,85
mol Wasser entspricht. Die Bulkform von F-III äquilibriert schnell mit der
Atmosphäre,
so dass der durch analytische Techniken beobachtete Wassergehalt
die relative Luftfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Datensammlung widerspiegelt.
Lot-zu-Lot Unterschiede, die in den DSC Daten beobachtet werden, resultieren
wahrscheinlich aus den Proben, die in unterschiedlichem Ausmaß aufgrund
von unterschiedlichen Umgebungslagerbedingungen hydriert wurden.
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Es werden XRD Muster für Proben
von F-III erhalten, das bei unterschiedlichen relativen Luftfeuchtigkeiten
gelagert wurde (0, 22, 50 und 80 %). Man findet eine graduelle Verschiebung
der anfänglichen
F-III Peaks (0 % relative Luftfeuchtigkeit) bei etwa 13,8, 17,6,
18,0, 20,5 und 24,0° in
2 Θ wie
auch eine leichte Verschiebung von weniger intensiven Peaks, wenn
die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die beobachteten Veränderungen
in den XRD Mustern von F-III zeigen an, dass die Einheitszelldimensionen
sich verändern,
vermutlich um schwach gebundene Wassermoleküle zu halten, wenn die relative
Luftfeuchtigkeit erhöht
wird. Die kontinuierliche Verschiebung von Peaks mit Feuchtigkeit
korreliert mit den Feuchtigkeitssorptionsdaten, die eine graduelle
Gewichtszunahme über
diesen relativen Luftfeuchtigkeitsbereich zeigen, was eine variable
Hydratbildung nahelegt.
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Es wurde festgestellt, dass F-III über den
gesamten Bereich der relativen Luftfeuchtigkeit stabil ist. Material,
das durch Kristallisation aus einer Lösung aus Ethanol und Ethylacetat,
gefolgt von einer Vakuumtrocknung für nur wenige Stunden erzeugt
wird, wie dies in
US
5 723 474 A beschrieben ist, zeigt eine sehr geringe Kristallinität.
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F-III besitzt mehrere Vorteile gegenüber der
oben beschriebenen Arzoxifenform des Stands der Technik. Relativ
zum Arzoxifenprodukt, das durch die in
US 5 723 474 A beschriebenen
Verfahren hergestellt wird, ist F-III bei Raumtemperatur stabiler
und ist daher für
die pharmazeutische Entwicklung bevorzugter, das heißt zur Entwicklung
einer Dosisformulierung. Zusätzlich
ist F-III viel kristalliner als die in
US 5 723 474 A beschriebene
Form. Kristalline Materialien sind im allgemeinen weniger hygroskopisch
und stabiler (beispielsweise weniger empfindlich gegenüber einem
chemischen Abbau, Wirksamkeit bleibt erhalten) als amorphe Materialien und
daher für
die Formulierungsentwicklung erwünschter.
Ferner enthält
F-III im Gegensatz zur Arzoxifenform, die durch die in
US 5 723 474 A beschriebenen
Verfahren hergestellt wurde, die Ethylacetat und Wasser in ihrem
Kristallgitter enthält,
nur Wasser.
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Die DSC Messungen werden auf einem
TA Instruments 2920 Modulated DSC ausgeführt, das an einen Thermal Analyst
3100 angeschlossen ist und mit einem Kühlsystem ausgestattet ist.
Die Proben (3-5 mg) werden in gefalteten Aluminiumschälchen von
10 bis 240°C
bei einer Heizgeschwindigkeit von 2°C/min erhitzt.
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Die TGA Analysen werden auf einem
TA Instruments 2050 Thermogravimetric Analyser ausgeführt, der
an einen Thermal Analyst 3100 angeschlossen ist. Die Proben (5-10
mg) werden in offenen Schälchen
von 25°C
bis 250°C
mit einer Heizgeschwindigkeit von 5°C/min erhitzt.
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Die XRD Muster erhält man von
einem Siemens D5000 Röntgenpulverdiffraktometer,
das mit einer CuKα Quelle
(λ = 1,54056 Å und einem
Kevex Festphasendetektor ausgestattet ist, das bei 50 kV und 40
mA betrieben wird. Jede Probe wird zwischen 40 und 350 in 2 θ gescannt.
Die Proben können
sich für
mindestens 30 Minuten bei der gewünschten Temperatur und/oder
relativen Luftfeuchtigkeit vor der Datengewinnung äquilibrieren.
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Es werden Hygroskopizitätsmessungen
für F-III
mittels der VTI Methode wie folgt ausgeführt. Jede Probe wird unter
Vakuum bei 60°C
getrocknet, bis kein weiterer Gewichtsverlust detektiert wird, wonach
die Probenkammer auf 0 % relative Luftfeuchtigkeit gebracht wird.
Die Feuchtigkeitssorptionsisothermen erhält man bei 25°C mittels
eines VTI Vakuumfeuchtigkeitsausgleichs mit den folgenden Bedingungen:
Probengröße 10-15
mg, Adsorptions-/Desorptionsbereich 0-95 % relative Luftfeuchtigkeit,
Stufenintervall 5 %, Probenintervall 10 Minuten.
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Die folgenden Beispiele erläutern weiter
die Verfahren zur Herstellung des Hydrats der vorliegenden Erfindung.
Die Beispiele sollen den Schutzumfang der Verfahren nicht beschränken und
sollen auch nicht so aufgefasst werden.
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Beispiel 1
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F-III aus 6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxylphenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid
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Zu einer Methylenchloridlösung (100
ml) aus 6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]plienoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid
(10 g, 18 mmol) wird unter einer Stickstoffatmosphäre bei -10°C bis -20°C BCl3 (g) (4,23 g, 34 mmol) mit einer Geschwindigkeit
zugegeben, die die Temperatur der Reaktion unter -10°C hält. Nachdem
die Zugabe vollständig
ist, kann die Reaktion für
weitere 2 Stunden rühren.
Es wird Isopropylalkohol (IPA, 12,35 ml, 167 mmol) langsam zur Reaktion
bei weniger als -10°C
gegeben und das Rühren
wird für
30 Minuten fortgesetzt. Ein getrennter Kolben wird mit 100 ml Wasser
befüllt
und mit einem Eisbad auf etwa 0°C
gekühlt.
Die Produktlösung
wird über
eine Kanüle
in das Wasser überführt, wobei weiterhin
stark gerührt
wird. Die entstehende weiße
Aufschlämmung
kann für
1 Stunde bei 0°C
rühren.
Das Produkt wird durch Filtration gewonnen . und mit 25 ml an 40
% CH2Cl2 / Wasser
und dann mit 25 ml kaltem Wasser gewaschen. Das Produkt wird in
60 ml IPA und 60 ml Wasser suspendiert und auf 60°C erhitzt.
Man erhält
eine Lösung
bei 48°C.
Es wird zusätzliches
Wasser (120 ml) zugegeben. Die Lösung
kann sich auf 35°C abkühlen und
die Aufschlämmung
wird weiter langsam auf 0-5°C
gekühlt
und für
mehrere Stunden gerührt. Das
Produkt wird durch Filtration isoliert und mit kaltem entionisiertem
Wasser (25 ml) gewaschen. Der nasse F-III Kuchen wird bis zu einem
konstanten Gewicht im Vakuum bei 50°C für 12 bis 24 Stunden unter Bildung von
F-III getrocknet.
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Beispiel 2
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F-III aus 6-Benzyloxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid)
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Zu einer 250 ml fassenden Parr-Flasche
wird entionisiertes Wasser (5,25 ml), 1 M HCl (7,74 ml, 7,75 mmol),
10 % Pd/C (Typ A32110, 1,37 g, 1,29 mmol Pd), [6-Benzyloxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)etlioxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid)
(3 g, 5,16 mmol) und Isopropylalkohol (32 ml) bei Umgebungstemperatur
gegeben. Die Flasche wird an einen Parr-Schüttler angebracht, zweimal nacheinander
entgast und mit Stickstoff begast und anschließend evakuiert und mit Wasserstoffgas
bis zu einem Druck von 2,07 bar (30 psig) gefüllt.
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Der Schüttler wird gestartet und das
Reaktionsgemisch wird af 60°C
erhitzt. Die Reaktion wird gemäß HPLC Analyse
nach etwa 4 Stunden als vollständig
bestimmt. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Kissen aus Diatomäenerde filtriert
und das Kissen wird mit 0,1 M HCl (2 × 10 ml) gewaschen. Das Lösemittel
wird im Vakuum bei etwa 50°C
entfernt. Der entstehende Rückstand
wird in 50 % Isopropylalkohol/entionisiertem Wasser (30 ml) gelöst und sanft
auf einem Dampfbad erhitzt, bis man eine Lösung erhält. Zur Lösung wird erstionisiertes Wasser
(22 ml) gegeben und die Lösung
kann sich auf Umgebungstemperatur abkühlen. Die Produktaufschlämmung wird
weiter auf 0°C
gekühlt.
Das Produkt wird durch Filtration isoliert, mit kaltem erstionisiertem
Wasser (2 x 15 ml) gewaschen und im Vakuum bei 50°C bis zur
Gewichtskonstanz unter Bildung von F-III getrocknet.
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Beispiel 3 F-III aus (6-Isopropoxy-3-[4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
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Methylenchlorid (105 l) und [6-Isopropoxy-3-[4-[2-piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
(10,5 kg) werden vereinigt und auf -15°C bis -20°C gekühlt. Bortrichlorid (4,6 kg)
wird zugegeben, während
die Reaktionstemperatur zwischen -10°C und -20°C gehalten wird. Das Rühren wird
fortgesetzt, bis die Fläche
des Ausgangsmaterials gemäß HPLC weniger
als 1 % beträgt.
HPLC System (4,6 mm ID × 25
cm Zorbax SB-Phenyl Säule
30°C, 70:30
Methanol : 0,01 N Schwefelsäure,
Flussrate 1,5 ml/min, Detektor 300 nm). Isopropanol (10,28 kg) wird
zugegeben, während
die Reaktionstemperatur zwischen -10°C und -20°C gehalten wird. Das Reaktionsgemisch
wird für
30 bis 45 Minuten gerührt.
Das rohe Reaktionsprodukt wird durch die Zugabe des Reaktionsgemisches
zu zusätzlichen
105 l Wasser isoliert, das auf 2 bis 7°C vorgekühlt ist, wobei die Reaktionstemperatur
auf 2°C
bis 7°C
gehalten wird. Nach der Zugabe erfolgt ein Methylenchloridwaschschritt
(20 ml), der auf 7°C
bis 2°C
vorgekühlt
ist. Die kristalline Aufschlämmung
wird für
2 bis 3 Stunden gerührt
und filtriert und nacheinander gewaschen mit Methylenchlorid (26
kg), das auf 7°C bis
2°C vorgekühlt ist
und Wasser (53 1), das auf 7°C
bis 2°C
vorgekühlt
ist. Der rohe nasse Kuchen wird mit Wasser (421) und Isopropanol
(401) vereinigt und wird auf 65 bis 70°C erhitzt, um die Auflösung zu
bewirken. Die heiße
Lösung
wird filtriert. Nach der Filtration erfolgt ein Waschschritt, der
aus einem Gemisch aus Isopropanol (20 l) und Wasser (21 l) besteht,
das auf 65 bis 70°C
erhitzt ist und ein Waschschritt, der aus Wasser (126 l) besteht,
das auf 65 bis 70°C
erhitzt ist. Die Lösung
wird auf 40 bis 45°C
gekühlt,
angeimpft und bei dieser Temperatur für 2 bis 3 Stunden gerührt, um
das Kristallwachstum zu erlauben. Die Aufschlämmung wird auf bis 5°C gekühlt, für 3 bis
4 Stunden gerührt
und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser (122,6 l) gewaschen,
das auf 2 bis 7°C
vorgekühlt
wurde. Das Produkt wird im Vakuum bei einer maximalen Temperatur
von 50°C
getrocknet, bis die Veränderung
des Kuchengewichts über
einen Zeitraum von 2 bis 4 Stunden weniger als 0,05 kg beträgt. Ausbeute:
8,468 kg (87,3 %). HPLC Gehalt: 98,5 %. Wasser nach Karl Fischer:
3,0 %. Gesamtnebenprodukte gemäß HPLC:
1,79 %.
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Beispiel 4
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F-III aus [6-Benzyloxy-3-[4-(2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
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Tetrahydrofuran (261 ml), Wasser
(45 ml), konzentrierte Schwefelsäure
(6,14 g) und [6-benzyloxy-3-[4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
(HPLC Gehalt 99 %, HPLC Gesamtnebenprodukte 0,35 %) werden vereinigt
und gerührt,
bis sie homogen sind. 10 % Pd/C (5,6 g aufgeschlämmt in 22 ml Wasser) wird mit
einer 5 ml Wasserspülung
zugegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird evakuiert und mit
4,14 bar (60 psi) Wasserstoff überlagert.
Die Reaktionstemperatur wird auf 30°C eingestellt. Nach
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2 Stunden wird 10 % Pd/C (5,6 g)
mit Wasser (30 ml) zugegeben. Die Hydrierung wird bei 14 bar (60 psi)
und 30°C
für weitere
22 Stunden fortgesetzt. Es werden zusätzliche 4,40 g an 10 % Pd/C
in 30 ml Wasser zugegeben und die Hydrierung bei 4,14 bar (60 psi)
und 30°C
wird für
weitere 2,5 Stunden fortgesetzt. Der Katalysator wird durch Filtration
entfernt und der pH des Filtrats wird mit 50 % Natriumhydroxid auf
7,24 eingestellt. Natriumchlorid (8,66 g), das in Wasser (18 ml)
gelöst
ist, wird zugegeben und die biphasische Lösung wird für 30 Minuten gerührt. Die
Phasen werden getrennt und die wässrige
Phase wird mit 50 ml Tetrahydrofuran rückextrahiert. Die organischen
Phasen werden vereinigt und durch eine atmosphärische Destillation auf ein
Volumen von 50 ml konzentriert. Zum Konzentrat werden bei 24°C 180 ml
Methanol über
einen Zeitraum von 1 Stunde gegeben. Die entstehende kristalline
Aufschlämmung
wird für
30 Minuten bei 24°C
gerührt,
auf 0°C
gekühlt
und für
1 Stunde gerührt.
Die Feststoffe werden durch Filtration entfernt und nacheinander
mit 39 ml Wasser und nacheinander mit 39 ml Methanol gewaschen,
gefolgt von einer Vakuumtrocknung bei 50°C isoliert. Ausbeute 15,52 g
(67,8 %).
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Isopropanol (33 ml), Wasser (66 ml)
und 10 g oben isolierter Feststoff werden vereinigt. Zum gerührten Gemisch
werden bei 25°C
1,8 M HCl (21 ml) gegeben. Die Feststoffe lösen sich schnell auf; wonach
eine erneute Ausfällung
des Hydrochloridsalzes erfolgt. Nach dem Rühren für 30 Minuten wird die Aufschlämmung auf
70°C zur
Bewirkung der Auflösung
aller Feststoffe erhitzt. Die Lösung
wird auf 60°C
abgekühlt
und 33 ml Wasser werden zugegeben. Die entstehende Lösung wird über einen
Zeitraum von 3 Stunden auf 25°C
gekühlt,
währenddessen
das Hydrochloridsalz ausfällt.
Die Aufschlämmung
wird für
etwa 3 Stunden bei 25°C
gerührt,
filtriert, mit Wasser (30 ml) gewaschen und im Vakuum über Nacht
bei 50°C
unter Bildung von 8,9 g (82,7 %) an F-III getrocknet. HPLC Gehalt:
96,5 %. Wasser nach Karl Fischer: 2,44 %. HPLC Nebenprodukte: 1,09 %.
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Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "wirksame Menge" eine Menge an F-III,
die zur Hemmung von Zuständen
oder schädlichen
Auswirkungen hiervon, wie sie hierin beschrieben sind, fähig ist.
Wenn F-III zusammen mit Östrogen,
Progestin, einem Aromataseinhibitor, einem LHRH Analogon oder einem
AChE Inhibitor verabreicht wird, meint der Ausdruck "wirksame Menge" auch eine Menge
eines solchen Mittels, das zur Ausbildung des beabsichtigten Effekts
fällig
ist.
-
Die Ausdrücke "hemmend" oder "hemmen" umfassen ihre allgemein anerkannte
Bedeutung, das heißt die
Verhinderung, Vermeidung, Unterdrückung, Linderung, Besserung,
Verlangsamung, das Anhalten oder die Umkehr des Fortschreitens,
der Schwere oder eines pathologischen Zustands oder der Folgen hiervon,
wie dies hierin beschrieben ist.
-
Die Ausdrücke "Verhinderung" oder "Prävention
von", "Prophylaxe", "prophylaktisch" und "verhindern" werden austauschbar
verwendet und beziehen sich auf die Verringerung der Wahrscheinlichkeit,
dass der Empfänger
von F-III einen der pathologischen Zustände oder die Folgen hiervon
bekommt oder entwickelt, wie dies hierin beschrieben ist.
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Die Ausdrücke "östrogenarm" oder "Östrogenmangel" beziehen sich auf
einen Zustand, der entweder natürlich
auftritt oder klinisch induziert ist, wobei eine Frau nicht ausreichend
endogene Östrogenhormone
bilden kann, um die Östrogen-abhängigen Funktionen
aufrechtzuerhalten, beispielsweise Menstruation, Homeostase der
Knochenmasse, neuronale Funktion, cardiovaskulärer Zustand usw. Solche Östrogenmangelsituationen
kommen unter anderem durch Menopause und operative oder chemische
Ovarektomie zustande, einschließlich
des funktionellen Äquivalents,
beispielsweise der Arzneimittelbehandlung mit einem Aromataseinhibitor,
GnRH Agonisten oder Antagonisten, ICI 182780 und dergleichen. Krankheitszustände, die
mit einem Östrogenmangelzustand
assoziiert sind, sind unter anderem: Knochenverlust, Osteoporose,
cardiovaskuläre Erkrankung
und Hyperlipidämie.
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Wie hierin verwendet umfasst der
Ausdruck "Östrogen". Steroidverbindungen
mit östrogener
Aktivität, wie
beispielsweise 17ß-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen
(Premarin®),
Pferdeöstrogen,
17ß-Ethinylöstradiol,
und dergleichen. Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung
ist Premarin® und
Norethylnodrel.
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Wie hierin verwendet, umfasst der
Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit
progestiner Aktivität,
wie beispielsweise Progesteron, Norethylnodrel, Nongestrel, Megestrolacetat,
Norethindron und dergleichen. Norethindron ist ein bevorzugtes auf
Progestin basierendes Mittel.
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Wie hierin verwendet umfasst der
Ausdruck "Aromataseinhibitor" Verbindungen, die
zur Hemmung der Aromatase fällig
sind, beispielsweise im Handel erhältliche Inhibitoren, wie Aminoglutemid
(CYTANDREN®), Anastrazol
(ARIMIDEX®),
Letrozol (FEMARA®),
Formetan (LENATRON®),
Exemestan (AROMASIN®)
und dergleichen.
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Wie hierin verwendet, bezieht sich
der Ausdruck "LHRH
Analogon" auf ein
Analogon des das lutenisierende Hormon freisetzenden Hormons, das
die Östrogenbildung
bei einer prärmenopausalen
Frau hemmt, einschließlich
beispielsweise Goserlin (ZOLADEX®),
Leuprolid (LUPRON®)
und dergleichen.
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Wie hierin verwendet, umfasst der
Ausdruck "AChE Inhibitor" Verbindungen, die
die Acetylcholinesterase hemmen, beispielsweise Physostigminsalicylat,
Tacrinhydrochlorid, Donepezilhydrochlorid und dergleichen.
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Der Ausdruck "hochregulieren von ChAT" bezieht sich auf
die Erhöhung
der enzymatischen Aktivität von
ChAT, das heißt
die Förderung
der Umwandlung von Cholin zu Acetylcholin. Diese Förderung
würde eine Erhöhung der
Effizienz und/oder Geschwindigkeit der Umsetzung von ChAT und Cholin
und/oder eine Erhöhung
der Menge an ChAT, die an der Wirkstelle vorhanden ist umfassen.
Diese Erhöhung
der vorhandenen Enzymmenge kann auf der Genregulation oder einem
anderen Syntheseschritt der Enzymbildung und/oder einer Abnahme
der Deaktivierung und des Metabolismus des Enzyms beruhen.
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Allgemeines Rattenpräparationsverfahren:
Fünfundsiebzig
Tage alte (falls nichts anderes angeben ist) weibliche Sprague Dawley
Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River
Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig
ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den
Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche
geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in
Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig
gehalten und haben für
eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5 %) und
Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen
Luftfeuchte von 40 % gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht
und 12 Stunden Dunkelheit.
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Dosierungsplan und Gewebeentnahme:
Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX)
wird die tägliche
Dosierung mit F-III begonnen. 17α-Ethinylöstradiol
oder F-III werden als Suspension 1 % Carboxymethylcellulose oder
gelöst
in 20 % Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben
ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan
werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin
(2:1, V: V) betäubt.
Es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die
Tiere werden dann durch Erstickung mit CO2 getötet, der
Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht
des Uterus wird bestimmt. 17α-Ethinylöstradiol
erhält
man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
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Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden
gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten
bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests
von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das
Cholesterin zu Cholest-4- en-3-on
und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann
mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter
Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch
bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann
aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels
einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
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Uteruseosinophilenperoxidasetest
(EPO)
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Die Uteri werden bis zur enzymatischen
Analyse bei 4°C
aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer
(pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005 % Triton-X 100 enthalten sind.
Nach der Zugabe von 0,01 % Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin
(Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme
für eine
Minute bei 450 nm verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im
Uterus ist ein Zeichen für
die östrogene
Aktivität
einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden
langen Intervalls wird über
den anfänglichen,
linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
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Testverfahren auf die
Hemmung des Knochenverlusts (Osteoporose)
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Durch Befolgen des oben beschriebenen
allgemeinen Präparationsverfahrens
werden die Ratten täglich
für 35
Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) belhandelt und durch Kohlendioxiderstickung
am 36. Tag getötet.
Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Wirkung
auf die Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben
gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und
der Flüssigkeitsinhalt
wird vor der Bestimmung des Nassgewichts entleert, und die mit der
vollständigen
Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz
zu bestätigen.
Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion
auf die Ovarektomie um etwa 75 % verringert. Die Uteri werden dann in
neutral gepufferte 10 % Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische
Untersuchung zu ermöglichen.
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Die rechten Femuren werden entnommen
und an der distalen Metaphyse werden digitale Röntgenstrahlen erzeugt und durch
ein Bildanalyseprogramm analysiert (NIH Image). Der proximale Teil
der Tibien aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie
gescannt. Gemäß den obigen
Verfahren werden F-III oder Ethinylöstradiol (EE2)
in 20 % Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin
oral an die Testtiere verabreicht. F-III ist auch in Kombination
mit Östrogen
oder Progestin brauchbar.
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MCF-7 Proliferationstest
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MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC
HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei,
Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10 % fetalem Rinderserum
(FBS) (V/V, L-Glutamin (2 mW), Natriumpyruvat (1mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10
mM}, nicht essentiellen Aminosäuren
und Rinderinsulin (1 μg/ml)
supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden
die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10 % mit dextranbeschichteter
Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) anstelle von
10 % FBS supplementiert ist (Testmedium), um die internen Steroidvorräte abzubauen.
Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmediium
entfernt (Ca2+/M b / g
2+ freies
HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert
ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf
80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 ml (8000 Zellen) werden in
Flachbodemnikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem
befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 48 Stunden
inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Trans
-
fer zu ermöglichen. Es werden serielle
Verdünnungen
der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium
hergestellt und 50 ml werden in dreifach angelegten Mikrokulturen
gefolgt von 50 ml Testmedium auf ein Endvolumen von 200 ml überführt. Nach
weiteren 48 Stunden bei 37°C
in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 werden
die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert
(1 μCi/Vertiefung).
Die Kulturen werden durch Einfrieren bei -70°C für 24 Stunden beendet, wonach ein
Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic
Cell Harvesters erfolgt. Die Proben werden durch Flüssigscintillation
mittels eines Wallac BetaPlace ß-Zählgeräts gemessen.
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DMBA-induzierte Brusttumorhemmung
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Es werden östrogenabhängige Abtasttumoren in weiblichen
Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis,
Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten
die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen
(DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen
Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein
oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten
Durchmesser jedes Turriors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen
werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es
wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den
Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, dass die
Tumoren der mittleren Größe zwischen
den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und
die Testgruppen für
jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
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F-III wird entweder über intraperitoneale
Injektionen in 2 % Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte
Verbindungen werden entweder gelöst
oder in 0,2 ml Maisöl
suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen
mit Akaziengummi und Maisöl,
wird eimnal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen
Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede
Woche durch das oben erwähnte
Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden
für 3 bis
5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt
werden. Für
jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung
der mittleren Tumorfläche
berechnet.
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Uterusfibrosetestverfahren
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Test 1
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Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine
Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man F-III. Die Menge an verabreichter
Verbindung beträgt
0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate.
Die Frauen werden während
des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung
der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
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Test 2
-
Es wird dasselbe Testverfahren wie
in Test 1 verwendet, außer
dass der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
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Test 3
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Es wird dasselbe Verfahren wie in
Test 1 verwendet, außer
dass der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
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Test 4
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Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung
der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet.
Die Tiere werden mit Östradiol
3-5 mal pro Woche durch Injektion für 2-4 Monate dosiert, oder
bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus F-III oder einem
Träger
bestehen, werden täglich
für 3-16
Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen
und auf Tumorregression untersucht.
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Test 5
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Gewebe von humanen Leiomyomen wird
in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell
reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen
verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In einigen Fällen
werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung
kultiviert. Die Behandlung, die aus F-III oder einem Träger besteht,
wird durch Gastrolavage täglich
für 3-16
Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder
Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri geerntet, um den Status des Organs zu untersuchen.
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Test 6
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Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren
wird entnommen und in vitro als primäre nichttransformierte Kulturen
gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder
Sieb gedrückt
oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension
herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum
und Antibiotikum enthalten. Die Wachtumsraten werden in Gegenwart und
Abwesenheit von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach
der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-III und einem Träger untersucht.
Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu
bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten
bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
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Test 7
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F-III's Fähigkeit
zur Hemmung der durch Östrogen
stimulierten Proliferation von Leiomyoma-stammenden ELT Zelllinien
wird im wesentlichen gemessen, wie dies in Fuchs-Young et al., "Inhibition of Estrogen-Stimulated
Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17(3): 151-159
(1996) beschrieben ist.
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Endometriosetestverfahren
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Test 1
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Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten
vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei
Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus
aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedein Weibchen
eine Operation durchgeführt.
Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt,
in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene
Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen
in Gruppe 2 die Ovarien entfernt. Am Tag nach der Operation erhalten
die Tiere in den Gruppen 1 und intraperitoneale Wasserinjektionen
für 14
Tage, während
die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-III
pro Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und
die endometrischen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus
und die Ovarien, wo dies möglich
ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert.
Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
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Test 2
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Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten
vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei
gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet.
Am Tag des Proöstrus
wird bei jedein Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder
Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten
und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart
zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Etwa
50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere
intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die
Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-III
pro Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen
getötet
und die endometrischen Explantate und Nebennieren werden entfernt
und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen
werden aufgezeichnet.
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Test 3
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Autographien von endometrischem Gewebe
werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen
verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer
beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt,
um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen.
Autologes endometrisches Gewebe wird im Peritoneum von 5-150 Tieren
implantiert und Östrogen
wird zur Wachtumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt.
Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird
durch Gastrolavage täglich
für 3-16
Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum
oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
wird das intakte Horn des Uterus entnommen, und den Status des Endometriums
zu bestimmen.
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Test 4
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Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird
in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen
Nacktmäusen
implantiert. Es wird endogenes Östrogen
bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In manchen Fällen
werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in
vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus F-III, das durch Gastrolavage
täglich
für 3-16
Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und
auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri
entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.
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Test 5 Das Gewebe aus humanen endometrialen
Läsionen
wird gewonnen und in vitro als primäre nichttransformierte Kulturen
gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder
Sieb gedrückt
oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension
herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum
und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart
und Ab- wesenheit
von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf hre Proliferationsreaktion nach
der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-III und einem Träger untersucht.
Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu
bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten
bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
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Östrogene,
wie 17ß-Östradiol,
regulieren die Gentranskription durch die Bindung an Östrogenrezeptoren
(ER), die im Cytoplasma von bestimmten Zellpopulationen vorkommen.
Die Ligandenaktivierung des ER ist ein Merkmal für den nukleären Transport des Komplexes,
wo eine 13 Basenpaar lange palindromische DNA Konsensussequenz (Östrogenreaktionselement
oder ERE) den Zusammenbau eines Transkriptionsapparats beginnt,
der in der Aktivierung der geeigneten Zielgene gipfelt. Es wurde
eine Vielzahl an Genen identifiziert, die durch Östrogen reguliert werden. Diese
umfassen Cytosklelettproteine, Neurotransmitter, biosynthetische und
metabolische Enzyme und Rezeptoren, wie auch andere Hormone und
Neuropeptide. ERE's
wurden in vielen auf Östrogen
reagierenden Genen identifiziert, einschließlich Vitellogenin, c-fos,
Prolactin und lutenisierendern Hormon.
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Mit Bedeutung im zentralen Nervensystem
werden ERE-ähnliche
Sequenzen in p75ngr und trkA identifiziert,
die beide als Signalmoleküle
für die
Neurotrophine dienen: Nervenwachstumsfaktor (NGF), vom Gehirn stammender
Nervenwachstumsfaktor (BDNGF) und Neurotrophin-3.
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BDNF wie auch NGF fördern das Überleben
von cholinergen Neuronen in Kultur. Es wird postuliert, dass falls
die Wechselwirkungen zwischen Neurotrophinen und Östrogenen
wichtig für
die Entwicklung und das Überleben
von basalen Großhirnneuronen
sind (die bei der Alzheimerschen Erkrankung degenerieren), können klinische
Zustände,
bei denen eine Östrogendefizienz
vorkommt (wie nach der Menopause), dann zu einem Verlust dieser
Neuronen beitragen.
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Das folgende Experiment wird in ovarektomierten
Ratten (wie oben beschrieben präpariert)
ausgeführt,
um die Ähnlichkeiten
und Unterschiede zwischen F-III und Östrogen bei der Beeinflussung
der Genexpression in verschiedenen Gehirnregionen zu bestimmen.
Sechs Wochen alten Ratten verabreicht man subkutane Injektionen
an Östradiolbenzoat
(0,03 mg/kg), F-III oder Träger
(Kontrolle). Nach 5 Wochen Behandlung werden die Tiere getötet und
ihre Gehirne und Hippocampi werden durch Mikrochirurgie gewonnen.
Die Hippocampi werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren
und bei -70°C
gelagert. Die Gesamt RNA wird aus vereinigtem Gewebe aus den geeigneten
Behandlungs- und Kontrollgruppen isoliert und mittels eines 3'-Oligonukleotidprimers
transkribiert, der aus spezifischen mRNA (Poly-A+) Populationen
ausgewählt
wird. Die Polymerasekettenreaktionen (PCR) werden in einer Mischung
ausgeführt,
die besteht aus: Zufälligen 5'-Oligonukleotiden
(10 Basenpaare lang, insgesamt 150), Reaktionspuffer, Taq Polymerase
und 32PdTCP.
-
Nach 40 Amplifizierungsrunden werden
die Reaktionsprodukte nach Größe auf einem
6 % TBE-Harnstoffgel
aufgetrennt, getrocknet und gegenüber einem Röntgenfilm exponiert. Die entstehende
mRNA zeigt Muster, die zwischen den Behandlungsgruppen verglichen
werden.
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Peri- und postmenopausale Frauen
unterziehen sich oft einer Hormonersatztherapie (HRT), um die negativen
Konsequenzen zu bekämpfen,
die mit dem Abfall an zirkulierendem, endogenem Östrogen assoziiert sind, beispielsweise
zur Behandlung von Hitzewallungen. Jedoch wurde die HRT mit erhöhten Risiken
für bestimmte
Krebsarten assoziiert, einschließlich Uterus- und Brustkrebs.
F-III kann in Zusammenhang mit HRT verwendet werden, um diese Risiken
zu hemmen.
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Gemäß der Definition funktionieren
die Ovarien einer postmenopausalen Frau nicht. Ihre einzige Quelle
für Östrogen
ist durch die Umwandlung von Androgenen aus der Nebenniere zu Östrogenen
durch das Enzym Aromatase, das in peripheren Geweben gefunden wird
(einschließlich
Fett, Muskel und dem Brusttumor selbst). Daher verringern Arzneimittel,
die die Aromatase hemmen (Aromataseinhibitoren) das zirkulierende Östrogen
der postmenopausalen Frau. Östrogenmangel
durch Aromatasehemmung ist eine wichtige Behandlungsoption für Patienten
mit metastasiertem Brustkrebs. Während
der Therapie mit einem Aromataseinhibitor, kann das Fehlen von zirkulierendem Östrogen
negative, unbeabsichtigte Nebenwirkungen verursachen, beispielsweise
auf die Serumlipidspiegel. F-III kann verwendet werden, um diese
negativen Effekte zu hemmen.
-
Die kontinuierliche Exposition gegenüber einem
LHRH (luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon) Analogon hemmt
die Östrogenbildung
bei der prämenopausalen
Frau durch das Unempfindlichmachen der Hypophyse, die dann nicht
länger
die Ovarien zur Bildung von Östrogen
stimuliert. Der klinische Effekt ist eine "medizinische Oophorektomie", die bei der Einstellung
des LHRH Analogons reversibel ist. Während der Therapie mit einem
LHRH Analogon, kann das Fehlen von zirkulierendem Östrogen
negative, unbeabsichtigte Nebenwirkungen haben, beispielsweise auf
die Serumlipidspiegel. F-III kann zur Hemmung dieser negativen Effekte
verwendet werden.
-
Es ist bekannt, dass Patienten, die
an Alzheimerscher Erkrankung leiden, eine deutlich kleinere Menge
an cholinergen Neuronen im Hippocampus aufweisen, als nicht-Alzheimer
Menschen. Der progressive Verlust dieser cholinergen Neuronen scheint
den progressiven Verlust von Gedächtnis
und Wahrnehmungsfunktion bei diesen Patienten widerzuspiegeln. Man
glaubt, dass ein Grund für
die Abnahme dieser Neuronen der Verlust oder die verringerte Funktion
des Neurotransmitters Acetylcholin ist.
-
Die Menge an Acetylcholin in einem
Neuron wird im Grunde da bestimmt, wo das Gleichgewicht zwischen
der Biosynthese und Bioabbau liegt. Das Enzym Cholinacetyltransferase
(ChAT) ist primär
für die
Synthese und Acetylcholinesterase (AChE) für dessen Abbau verantwortlich.
-
Um die Wirkung von F-III auf die
Menge an ChAT zu bestimmen, wird das folgende Experiment ausgeführt: Nach
dem allgemeinen oben beschriebenen Rattenpräparationsverfahren erhalten
40 Ratten täglich durch
eine subkutane Injektion oder orale Verabreichung von F-III mit
3 mg/kg/Tag in einem Träger,
der 10 % Cyclodextrin enthält, Östradioalbenzoat
mit 0,03 oder 0,3 mg/kg/Tag oder Trägerkontrolle. Die Tiere werden für 3 oder
10 Tage behandelt. Es sind 20 Tiere in jedem Dosierungsplan. Nach
geeigneten Zeiträumen
werden die Tiere getötet
und ihre Gehirne werden entnommen. Die bestimmten Bereiche der Gehirne
werden homogenisiert und getestet. Homogenate aus dem Hippocampus
und dein frontalen Cortex werden verarbeitet und die Bestimmung
der ChAT Aktivität
wird durch einen radioaktiv markierten Test der Biosynthese von
Acetylcholin ausgeführt.
Dieses Verfahren kann in Schoepp et al., 7. Neural Transmiss., 78:
183-193, 1989 gefunden werden.
-
Wie erwartet, sind die ChAT Mengen
in den OVX Tieren um > 50
% (p < 0,001) im
Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen verringert.
-
In einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird F-III in Kombination mit einem AChE
Inhibitor verwendet. Die Verwendung eines AChe Inhibitors erhöht die Mengen
an Acetylcholin durch die Blockierung des Abbaus über die
Hemmung von AChE.
-
Benigne, prostatische
Hyperplasie (BPH)
-
Als Hintergrundinformation über die
Verbindung zwischen der Östrogenwirkung
und der Behandlung von BPH und Prostatacarzinom ist die WO 98/07274
A vom 15.Oktober 1998 geeignet.
-
In den unten beschriebenen Experimenten
wird die Fähigkeit
von F-III zur Bindung an Östrogenrezeptoren
in mehreren humanen Prostatakrebszelllinien evaluiert.
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Lysate der humanen Prostatakrebszelllinien
LNCaP, DU-45 und PC-3 werden in einem TEG Medium hergestellt, das
50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
0,4 M KCl, 10 % Glycerin, 0,5 mM 2-ME und 10 mM Natriummolybdat
umfasst und ferner die Proteaseinhibitoren Pepstatin (1 mg/ml),
Leupeptid (2 mg/ml), Aprotinin (5 mg/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF, 0,1 mM) enthält (TEGP).
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Die Zelllysate werden zentrifugiert
und die Pellets werden in kaltem TEGP (1 ml TEGP / 100 mg Pellet) resuspendiert
und für
30 Sekunden auf einem Branson Modell 450 Ultraschallgerät ultrabeschallt
(Betriebszyklus 70 %, Stärke
1,8). Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 10 000 x g für 15 Minuten
bei 4°C
pelletiert, wonach die Überstände abgezogen
werden und entweder sofort verwendet oder bei -70°C gelagert
werden.
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Kompetitiver Bindungstest: Der Bindungspuffer
ist TEG, worin 0,4 M KCl durch 50 mM NaCI ersetzt wurde und wozu
1 mg/ml Ovalbumin weiter zugegeben wurde (TEGO). F-III wird in TEGO
auf 20 nM verdünnt, wovon
dreifach Reihenverdünnungen
hergestellt werden. Die Tests werden in Rundbodenpolypropylenmikrotiterplatten
dreifach in Mikrovertiefungen ausgeführt. Jede Vertiefung erhält 35 μl tritiiertes
17ß-Östradiol
(0,5 nM, spezifische Aktivität
60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) und 35 μl kalte Kompetitionstestverbindung
(0,1 nM – 5
mM) oder TEGO und nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 4°C unter Schütteln dann
70 μl des
MCF-7 Zelllinienlysats.
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Die Platten werden für 24 Stunden
bei 4°C
inkubiert, wonach 70 μl
Dextran-beschichtete Aktivkohle (DCC) zu jeder Vertiefung gefolgt
von starkem Schütteln
für 8 Minuten
bei 4°C
zugegeben werden. Die Platten werden dann bei 1500 × g für 10 Minuten
bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wird aus jeder Vertiefung in eine flexible Polystyrolmikrotiterplatte
für eine
Scintillationszählung
in einem Wallac Microbeta Modell 1450 Gerät überführt. Die Radioaktivität wird als
Zerfälle
pro Minute (DPM) nach der Korrektur für die Zählausbeute (35-40 %) und dem
Hintergrund ausgedrückt.
Zusätzliche
Kontrollen sind die Gesamtzählung
und die Gesamtzählung +
DCC, um die untere Grenze der DCC exrtrahierbaren Zählungen
zu definieren. Die Ergebnisse dieser kompetitiven Bindungstests
werden als mittlere prozentuale Bindung (% Bindung) f Standardabweichung
mittels der folgenden Formel ausgedrückt:
Die Erfindung betrifft auch
die Verabreichung von F-III an einen Empfänger, der einem Risiko ausgesetzt
ist, de novo Brustkrebs zu entwickeln. Der Ausdruck "de novo" meint, wie er hierin
verwendet wird, das Auftreten einer Transformation oder Metamorphose
von normalen Brustzellen zu krebsartigen oder malignen Zellen zum ersten
Mal. Eine solche Transformation kann in Stufen in derselben Zellen
oder in Tochterzellen über
einen evolutortschen Prozess ablaufen oder kann in einem einzelnen,
pivotalen Ereignis auftreten. Dieser de novo Prozess steht im Gegensatz
zu Metastasierung, Kolonialisierung oder Verbreitung von bereits
transfomierten oder malignen Zellen aus der primären Tumorstelle an neue Orte.
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Eine Person, die keinem besonderen
Risiko ausgesetzt ist, Brustkrebs zu entwickeln, ist eine, die de novo
Brustkrebs entwickeln kann und keine Evidenz oder keinen Verdacht
für ein
Krankheitspotential oberhalb eines normalen Risikos aufweist und
bei der nie eine Diagnose der Erkrankung gestellt wurde. Der größte Risikofaktor,
der zur Entwicklung von Brustcarzinom beiträgt, ist eine persönliche Geschichte,
an dieser Erkrankung zu leiden oder ein früheres Auftreten der Erkrankung,
sogar wenn sie sich in Remission ohne Evidenz von deren Anwesenheit
befindet. Ein weiterer Riskofaktor ist die Familiengeschichte der
Erkrankung.
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Die Induktion von Brustumoren bei
Ratten durch die Verabreichung des Carzinogens N-Nitroso-Nmethylharnstoff
ist ein gut akzeptiertes Tiermodell für die Untersuchung von Brustkrebs
und hat sich als geeignet zur Analyse der Wirkung von chemopräventiven
Mitteln herausgestellt.
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In zwei getrennten Untersuchungen
wird 55 Tage alten weiblichen Sprague-Dawley Ratten eine intravenöse (Studie
1) oder intraperitoneale (Studie 2) Dosis von 50 mg N-Nitroso-N-methylharnstoff
pro Kilogramm Körpergewicht
eine Woche vor dem freien Zugang zu einem Futter verabreicht, in
das unterschiedliche Mengen an F-III, (Z)-2-[4-(1,2-Diphenyl-1-butenyl)phenoay]-N,N-dimethylethanaminbase
(Tamoxifenbase) oder die Kontrolle gemischt wurden.
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In Studie 1 entsprechen die Nahrungsmitteldosen
von 60 mg/kg der Nahrung und 20 mg/kg der Nahrung ungefähr vergleichbaren
Dosierungen von 3 und 1 mg/kg Körpergewicht
für die
Testtiere.
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In Studie 2 entsprechend die Nahrungsmittelsdosen
von 20, 6, 2 und 0,6 mg/kg der Nahrung ungefähr vergleichbaren Dosierungen
von 1, 0,3, 0,1 und 0,03 mg/kg Körpergewicht
für die
Testtiere.
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Die Ratten werden auf das Auftreten
einer Toxizität
beobachtet und einmal pro Woche auf eine Tumorbildung palpiert.
Die Tiere werden nach 13 Wochen (Studie 1) oder 18 Wochen (Studie
2) getötet
und die Tumoren werden bestätigt
und bei der Autopsie gewogen.
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Der Ausdruck "pharmazeutisch" meint, wenn er hierin als Adjektiv
verwendet wird, dass es im wesentlichen nicht schädlich für den behandelten
Säuger
ist. Mit "pharmazeutische
Formulierung" ist
gemeint, dass der Träger,
das Verdünnungsmittel,
die Hilfsstoffe und Wirkstoffe mit den anderen Inhaltsstoffen der
Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sind.
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F-III wird vorzugsweise vor der Verabreichung
formuliert. Die Auswahl der Formulierung sollte vom behandelnden
Arzt entschieden werden, wobei dieselben Faktoren in Betracht gezogen
werden, wie bei der Bestimmung der wirksamen Menge.
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Die gesamten Wirkstoffe umfassen
in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung.
Vorzugsweise sind in dieser Formulierung nicht mehr als 2 Wirkstoffe
enthalten. Das bedeutet, dass es bevorzugt ist, F-III mit einem
zweiten Wirkstoff zu formulieren, ausgewählt aus Östrogen, Progestin, Aromataiseinhibitor,
LHRH Analogon und AChE Inhibitor. Die am meisten bevorzugten Formulierungen
sind die, worin F-III der einzige Wirkstoff ist.
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Die pharmazeutischen Formulierungen
der vorliegenden Erfindung werden durch in der Technik bekannte
Verfahren mittels gut bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe hergestellt.
Beispielsweise wird F-III entweder alleine oder in Kombination mit
einem Östrogen,
Progestin, Aromataseinhibitor, LHRH Analogon oder einer AChE Inhibitorverbindung
mit herkömmlichen
Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln
oder Trägern
formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Lösungen,
Injektionslösungen,
Aerosolen, Pulvern und dergleichen formuliert.
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Pharmazeutische Zusammensetzungen
dieser Erfindung zzur parenteralen Verabreichung umfassen sterile
wässrige
oder nicht-wässrige
Lösungen,
Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, wie auch sterile Pulver,
die unmittelbar vor der Verabreichung in sterile Lösungen oder
Suspensionen rekonstituiert werden. Beispiele für geeignete sterile wässrige und
nicht-wässrige
Träger,
Verdünnungsmittel,
Lösemittel
oder Vehikel sind unter anderem Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ethano1,
Polyole (wie Glycerin, Propylenglycol, Poly(ethylenglycol) und dergleichen)
und geeignete Germische hiervon, Pflanzenöle (wie Ölivenöl) und injizierbare organische
Ester, wie Ethyloleat. Die richtige Fluidität wird beispielsweise durch
die Verwendung von Beschichtungsmaterialien aufrechterhalten, wie
Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der richtigen Partikelgröße im Fall
von Dispersionen und Suspensionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln.
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Parenterale Zusammensetzungen können auch
Adjuvantien enthalten, wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel
und Dispergiermittel. Die Prävention
der Einwirkung von Mikroorganismen wird durch die Einarbeitung von
Mitteln gegen Bakterien und Pilze sichergestellt, wie beispielsweise
Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann
auch erwünscht
sein, isotonische Mittel einzuarbeiten, wie Zucker, Natriumchlorid
und dergleiclen. Eine verlängerte
Absorption von injizierbaren Formulierungen kann durch die Einarbeitung
von Mitteln, die die Absorption verzögern, herbeigeführt werden,
wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
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In einigen Fällen ist es zur Verlängerung
der Wirkung des Arzneimittels erwünscht, die Absorption des Arzneimittels
nach einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen.
Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension aus kristallinem
Material mit geringer Wasserlöslichkeit
oder durch Lösen
oder Suspendieren des Arzneimittels in einem Ölträger erreicht werden. Im Fall
einer subkutanen oder intramuskulären Injektion einer Suspension,
die eine Form des Arzneimittels mit geringer Wasserlöslichkeit enthält, hängt die
Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneimittels von der Auflösungsgeschwindigkeit
ab.
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Injizierbare "Depotformulierungen" von F-III werden durch die Bildung
von mikroverkapselten Matrizes des Arzneimittels in bioabbaubare
Polymere hergestellt, wie Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere
der Milch- und Glycolsäure,
Polyorthoester und Polyanliydride, wobei diese Materialien in der
Technik beschrieben sind. In Abhängigkeit
des Verhältnisses
von Arzneimittel zu Polymer und den Eigenschaften des im einzelnen verwendeten
Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung kontrolliert
werden.
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Die injizierbaren Formulierungen
werden sterilisiert, beispielsweise mittels Filtration durch Bakterienzurückhaltende
Filter oder durch eine Vorsterilisation der Komponenten des Gemisches
vor deren Mischung entweder zum Zeitpunkt der Herstellung oder direkt
vor der Verabreichung (wie im Beispiel der Doppelkammerspritzenpackung).
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Feste Dosierungsformen für die orale
Verabreichung sind unter anderem Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver
und Granula. In solchen festen Dosierungsformen wird F-III mit zumindest
einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt, wie Natriumcitrat
oder Dicalciumphosphat und/oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln,
wie Stärkearten,
Zuckern, wie Lactose und Glucose, Mannit und Kieselsäure, (b)
Bindemitteln, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate,
Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidin, Saccharose und Alcaziengummi,
(c) Befeuchtungsmitteln, wie Glycerin, (d) Zerfallhilfsmitteln,
wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kartoffel- oder
Tapiocastärke,
Alginsäure,
Silicate und Natriumcarbonat, (e) Befeuchtungsmittel, wie Glycerin,
(f) Auflösungsverzögernden
Mitteln, wie Paraffin, (g) absorptionsbeschleunigenden Mitteln,
wie quaternäre
Ammoniumverbindungen, (h) Netzmitteln, wie Cetylalkohol und Glycerinmonostearat,
(i) Absorptionsmitteln, wie Kaolin und Bentoniterde und (j) Gleitmitteln,
wie Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyetylenglycole, Natriumlaurylsulfat
und Gemische hiervon. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen
kann die Dosierungsform auch puffernde Mittel enthalten.
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Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen
Typs können
auch die Füllung
in Weich- oder Hartgelatinekapseln mittels Hilfsstoffen, wie Lactose
und auch hochmolekularen Polyethylenglycolen und dergleichen umfassen.
Feste Dosierungsformen, wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen
und Granula können
auch mit Beschichtungen oder Hüllen
hergestellt werden, wie enterische Beschichtungen und andere Beschichtungen,
die in der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind.
Die Beschichtungen können
Deckmittel oder Mittel enthalten, die die Wirkstoffe in einem bestimmten
Teil des Verdauungstrakts freisetzen, wie beispielsweise säurelösliche Beschichtungen
zur Freisetzung der Wirkstoffe im Magen oder basenlösliche Beschichtungen zur
Freisetzung der Wirkstoffe im Intestinaltrakt.
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Die Wirkstoffe können auch in einer verzögert freisetzenden
Beschichtung mikroverkapselt werden, wobei die Mikrokapseln Teil
einer Pille der Kapselformulierung sind.
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Flüssige Dosierungsformen zur
oralen Verabreichung von F-III sind unter anderern Lösungen,
Emulsionen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu
den Wirkstoffen können
die flüssigen
Formulierungen inerte Verdünnungsmittel
umfassen, die herkömmlich
in der Technik verwendet werden, wie Wasser oder andere pharmazeutisch
annehmbare Lösemittel,
Löslichkeitsvermittler
und Emulgiermittel, wie Ethano1, Isopropanol, Ethylcarbonat, Ethylacetat,
Benzylalkolhol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol,
Dimethylformamid, Öle
(insbesondere Öl
aus Baumwolle, Erdnuß,
Maiskeimen, Olive, Rizinus und Sesam), Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol,
Polyetliylenglycole, Fettsäureester
von Sorbit und Gemische hiervon.
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Neben inerten Verdünnungsmitteln
können
die flüssigen
oralen Formulierungen auch Adjuvantien enthalten, wie Netzmittel,
Emulgier- und Suspendiermttel und Süßstoffe, Geschmacksstoffe und
Geruchsstoffe.
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Die flüssige Suspension kann zusätzlich zu
den Wirkstoffen Suspendiermittel enthalten, wie ethoxylierte Isostearylalkohole,
Polyoxyetliylensorbitol und -sorbitanester, mikrokristalline Zellulose,
Aluminiummetahydroxid, Bentoniterde, Agar-Agar und Tragacanth und
Gemische hiervon.
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Zusammensetzungen für die rektale
oder intravaginale Verabreichung werden durch Mischen von F-III mit
geeigneten nicht-reizenden Hilfsstoffen hergestellt, wie Kakaobutter,
Polyethylenglycol oder jedes Zäpfchenwachs,
das bei Raumtemperatur fest ist, aber bei Körpertemperatur flüssig ist
und daher im Rektum oder Vaginalraum schmilzt, um die Wirkstoffe
freizusetzen. Die Verbindungen werden im geschmolzenen Wachs gelöst, in die
gewünschte
Form gebracht und können
in die fertige Zäpfchenformulierung
aushärten.
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F-III kann auch in Form von Liposomen
verabreicht werden. Wie es in der Technik bekannt ist, leiten sich
die Liposomen im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen
ab. Die Liposomeunformulierungen werden durch mono- oder multilamellar
hydrierte Flüssigkristalle
gebildet, die in einem wässrigen
Medium dispergiert werden. Jedes nicht-toxische, pharmazeutisch
annehmbare und metabolisierbare Lipid, das zur Bildung von Liposomen
fähig ist,
kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomenform
können
zusätzlich
zu F-III Stabilisatoren, Hilfsstoffe, Konservierungsmittel und dergleichen enthalten.
Die bevorzugten Lipide sind Phospholipide und Phosphatidylcholine
(Lecithine), die sowohl natürlich als
auch synthetisch sein können.
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Verfahren zur Bildung von Liposomen
sind in der Technik bekannt, wie sie beispielsweise in Prescott, Herausgeber,
Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y.
(1976) Seite 33 und folgende beschrieben sind.
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Die folgenden Formulierungsbeispiele
sind erläutert
und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
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Formulierung 1: Gelatinekapseln
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Hartgelatinekapseln werden
folgendermaßen
hergestellt:
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Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung
init den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
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Eine Tablettenformulierung wird mittels
der folgenden Bestandteile hergestellt:
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Formulierung 2: Tabletten
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Die Komponenten werden gemischt und
unter Bildung von Tabletten gepresst.
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Formulierung 3: Tabletten,
die jeweils etwa 10 und 50 mg an F-III enthalten, können folgendermaßen hergestellt
werden
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Die Komponenten werden gemischt und
unter Bildung von Tabletten gepresst.
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Alternativ dazu werden Tabletten,
die 2,5 – 1000
mg an F-III enthalten, folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung 4: Tabletten
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F-III, die Stärke und die Cellulose werden
durch ein 355 μl
(Nr. 45 Mesh) US Sieb gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des
Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt,
die dann durch ein 1400 um (Nr. 14 Mesh US) Sieb gegeben werden.
Die so hergestellten Granula werden bei 50°C – 60°C getrocknet und durch ein 1000
um (Nr. 18 Mesh US) Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das
Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein 250 um (Nr.
60 Mesh US) Sieb gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben,
die nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten
gepreßt
werden.
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Suspensionen, die jeweils 0,1 – 1000 mg
Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung 5: Suspensionen
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Das Arzneimittel wird durch ein 355
um (Nr. 45 Mesh US) Sieb gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose
und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der
Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und
unter Rühren
zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche
Volumen herzustellen.
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Eine Aerosollösung wird hergestellt, die
die folgenden Bestandteile enthält:
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Formulierung 6: Aerosol
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F-III wird mit Ethano1 gemischt und
das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22, auf -30°C abgekühlt und
in ein Abfüllgerät gegeben.
Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und
mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden
anschließend
am Behälter
angebracht.
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Zäpfchen
werden folgendermaßen
hergestellt:
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Formulierung 7: Zäpfchen
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F-III wird durch ein 250 μm (Nr. 60
Mesh U.S.) Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden
suspendiert, die vorher bei möglichst
geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in
eine Zäpfchenform
mit einer nominalen Kapazität
von 2 g gegossen und abgekühlt.
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Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung 8: Intravenöse Lösung
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Die Lösung der obigen Bestandteile
wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute
intravenös
verabreicht.
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Formulierung 9: Kombinationskapsel
I
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Formulierung 10: Kombinationskapsel
II
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Formulierung 11: Kombinationstablette
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Die spezifische Dosis von F-III,
die gemäß der Erfindung
verabreicht wird, wird durch die einzelnen Umstände bestimmt, die jede Situation
umgeben. Die Umstände
umfassen den Verabreichungsweg, die vorhergehende medizinische Vergangenheit
des Patienten, den pathologischen Zustand oder das zu behandelnde
Symptom, die Schwere des zu behandelnden Zustands/Symptoms und das
Alter und das Geschlecht des Patienten.
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Im allgemeinen beträgt eine
effektive, minimale Tagesdosis von F-III etwa 1, 5, 10, 15 oder
20 mg. Typischerweise beträgt
eine effektive Maximaldosis etwa 800, 100, 60, 50 oder 40 mg. Am
typischsten reicht die Dosis von 15 mg bis 60 mg. Die exakte Dosis
kann gemäß dem Standardverfahren
in der Medizin der "Dosistitration" des Patienten bestimmt
werden, wobei anfänglich
eine geringe Dosis der Verbindung verabreicht wird und die Dosis
graduell erhöht
wird, bis man die gewünschte
therapeutische Wirkung beobachtet.
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Obwohl es notwendig ist, den Patienten
in Bezug auf die oben diskutierten Kombinationstherapien auf die
Dosis einzustellen, sind typische Dosen für andere Wirkstoffe als F-III
die folgenden: Ethinylöstrogen
(0,01 – 0,03
mg/Tag), Mestranol (0,05 – 0,15
mg/Tag), konjugierte Östrogenhormone
(beispielsweise Premarin®, Wyeth-Ayerst,
0,3 – 2,5
mg/Tag), Medroxyprogesteron (2,5 – 10 mg/Tag), Norethylnodrel
(1,0 – 10,0
mg/Tag), Nonethindron (0,5 – 2,0
mg/Tag), Aminoglutemid (250 – 1250
mg/Tag, vorzugsweise 250 mg viermal am Tag), Anastrazol (1 – 5 mg/Tag,
vorzugsweise 1 mg einmal am Tag), Letrozol (2,5 – 10 mg/Tag, vorzugsweise 2,5 mg
einmal am Tag), Formestan (250 – 1250
mg pro Woche, vorzugsweise 250 mg zweimal wöchentlich), Exemestan (25 – 100 mg/Tag, vorzugsweise
25 mg einmal pro Tag) Goserlin (3 – 15 mg/drei Monate, vorzugszugsweise
3,6 mg einmal alle 3 Monate) und Leuprolid (3 – 15 mg/Monat, vorzugsweise
3,75 – 7,5
mg einmal pro Monat).
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F-III kann auf eine Vielzahl an Wegen
verabreicht werden, einschließlich
oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal.
Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen oder Progestin basierenden
Mittels stimmt mit dein überein,
das in der Technik bekannt ist. F-III alleine oder in Kombination
mit Östrogen,
Progestin oder einem AChE Inhibitor wird im allgemeinen in einer
bequemen Formulierung verabreicht.
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Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
der Erfindung können
Menschen und anderen Säugern (beispielsweise
Hunden, Katzen, Pferden, Schweinen und dergleichen) oral, rektal,
intravaginal, parenteral, topisch, bukkal, sublingual oder nasal
verabreicht werden. Der Ausdruck "parenterale Verabreichung" bezieht sich hierin
auf Verabreichungsverfahren, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale,
intrasternale, subkutane oder intraarterielle Injektion oder Infusion
umfassen.
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Für
die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren
wird F-III kontinuierlich ein- bis dreimal täglich oder so oft wie erforderlich
verabreicht, um eine wirksame Menge an F-III an den Empfänger zu
verabreichen. Die cyclische Therapie kann speziell bei der Behandlung
der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller Attacken
der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die
Therapie auf kurze Intervalle(1 bis 6 Monate) nach medizinischen
Verfahren, wie Angioplastie, beschränkt sein.