DE60005693T2

DE60005693T2 - Eine kristalline form von 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-hydrochlorid

Info

Publication number: DE60005693T2
Application number: DE60005693T
Authority: DE
Inventors: Kay Julie BUSH; Charles Preston CONRAD; Gerard Merlyn FLOM
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-07-29
Filing date: 2000-07-17
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2020-07-18
Also published as: BE1013410A3; AT502317A1; HRP20000502B1; PL341748A1; ES2208384T3; IL137552A; CA2314685C; SV2002000134A; NO325594B1; TWI271403B; PT102501A; GR20000100264A; JP2001048880A; NL1015822A1; SG90737A1; FI20001721A0; SE0002793D0; ID26679A; IT1318659B1; LV12733B

Description

6-Hydroxy-3(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (Arzoxifen) wurde zuerst allgemein in US 5 510 357 A beschrieben und wurde speziell in US 5 723 474 A und in EP 0 729 956 A beschrieben. Arzoxifen ist ein nichtsteriodaler gemischter Östrogejnantagonist/Agonist, der unter anderem zur Verringerung des Serumcholesterins und zur Hemmung der Hyperlipidämie, Osteoporose, Östrogenabhängigen Krebsarten, wie Brust- und Uteruskrebs, Endometriose, ZNS Störungen, einschließlich Alzheimerscher Erkrankung, der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta und der Restenose brauchbar ist.
Genauer gesagt ist Arzoxifen zur Behandlung von Rezeptor-positivem metastatischem Brustkrebs, der der Zusatzbehandlung von Rezeptor-positiven Patienten nach einer geeigneten systemischen oder lokalen Therapie, der Verringerung des Wiederauftretens von invasivem und nicht-invasivem Brustkrebs und der Verringerung des Auftretens von invasivem Brustkrebs und dem duktalen Carzinom in situ (DCIS) brauchbar und wird hierfür klinisch evaluiert. Arzoxifen ist auch in Kombination mit der radioaktiven Therapie, Aromataseinhibitoren, LHRH Analoga und Acetylcholinesteraseinhibitoren (AChE) brauchbar.
Röntgenbeugung am Pulver (XRD), Thermogravimetrie (TGA), Protonenkernmagnetresonanz (¹H NMR) und Karl Fischer (KF) Analysen von Bulkarzoxifen, das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren isoliert wurde, zeigen an, dass das Material hydriert und wenig kristallin ist und in dessen Kristallgitter variable Mengen an organischen flüchtigen Bestandteilen (Ethylacetat) enthält.
Wenig kristalline Materialien sind typischerweise weniger für die Formulierungsverarbeitung erwünscht als hochkristalline Materialien. Zusätzlich ist es im allgemeinen nicht erwünscht, Pharmazeutika zu formulieren, die wesentliche Mengen an organischem Lösemittel (beispielsweise Ethylacetat) aufgrund einer potentiellen Lösemitteltoxizität für den Empfänger hiervon enthalten und aufgrund von Veränderungen in der Stärke des Pharmazeutikums als Funktion des Lösemittels.
Obwohl das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellte Arzoxifen als Pharmazeutikum verwendet werden kann, wäre es sehr erwünscht und vorteilhaft, eine kristallinere Form von Arzoxifen zu finden, die kein organisches Lösemittel in ihrem Kristallgitter enthält, die reproduzierbar und effizient auf einem industriellen Maßstab hergestellt werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue nicht-stöchiometrisch hydrierte, kristalline Form von 6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (F-III) mit einem Röntgenbeugungsmuster, das die folgenden Peaks aufweist: 4,6 ± 0,2, 7,8 ± 0,2, 9,3 ± 0,2, 14,0 ± 0,2, 17,6 ± 0,2, 20,8 f 0,2 und 24,3 ± 0,2 ° in 2 θ, wenn es bei 25 ± 2°C und 35 ± 10 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) mit einer Kupferbestrahlungsquelle erhalten wird. Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung, die F-III, einen oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe und wahlweise Östrogen, wahlweise Progestin, wahlweise einen Aromataseinhibitor, wahlweise ein LHRH Analogon und wahlweise einen Acetylcholinesteraseinhibitor (AChE) enthält.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verwendung von F-III zur Hemmung der pathologischen Zustände, wie Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne, prostatische Hyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, cardiovaskuläre Erkrankung, Hyperlipidämie, ZNS Störungen und Alzheimersche Erkrankung und die Verwendung von F-III zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung derselben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Verwendung von F-III zur Hochregulation von Cholinacetyltransferase (ChAT) und zur Verwendung von F-III zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hochregulierung derselben.
Die 1 ist eine repräsentative DSC/TGA Spur von F-III. Die 2 zeigt die Feuchtigkeitsisothermen für F-III.
Bulkarzoxifen, das durch das in US 5 723 474 A beschriebene Verfahren hergestellt wurde (Beispiel 41, Kristallisation aus einem Gemisch aus Ethanol und Ethylacetat, Filtration und Trocknung des Filterkuchens bis zu einem konstanten Gewicht bei Raumtemperatur) wird durch XRD charakterisiert und ist wenig kristallin. Die ¹H NMR bestätigt, dass das Bulkmaterial 6 % Ethylacetat enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine besonders bevorzugte Form von Arzoxifen F-III. F-III wird leicht bei Raumtemperatur hergestellt und isoliert. Es sind nur moderate Trocknungsbedingungen erforderlich, um geringe Mengen an restlichen Kristallisationslösernittel bei der Herstellung von F-III zu entfernen. Diese moderaten Trocknungsbedingungen führen konsistent zu einem Feststoff mit hoher Reinheit (das heißt frei von restlichem organischem Lösemittel) und Kristallinität und daher eliminiert die Verwendung von F-III die Toxikologie, die mit restlichem organischem Lösemittel und organischem Lösemittel im Kristallgitter assoziiert ist. Ferner ist die Herstellung von F-III einfach und effizient, das heißt für eine Bulkproduktion geeignet.
F-III wird leicht bei Umgebungstemperatur durch die Kristallisation von Arzoxifen (oder jedem Polymorph /Solvat hiervon) aus einem Gemisch aus Isopropylalkohol (IPA) und Wasser hergestellt und isoliert. Typischerweise kann Arzoxifen in einem Gemisch aus IPA und Wasser suspendiert und erhitzt werden, um die Auflösung des Arzoxifenausgangsmaterials zu bewirken. Wenn einmal die Auflösung erreicht ist, kann die Lösung langsam auf Raumtemperatur abkühlen und dann weiter (mit Hilfe eines Eisbads oder einer Kühlung) zwischen 0°C und 5°C. Nachdem eine ausreichende Zeitspanne für die Kristallisation verstrichen ist, können die Kristalle durch Vakuumfiltration gewonnen und im Vakuum bis zu einer Gewichtskonstanz unter Bildung von F-III mit Ausbeuten von mehr als 80 % getrocknet werden.
Geeignetes Arzoxifenausgangsmaterial für die obige Kristallisation umfasst unter anderem Arzoxifen, das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Es ist nicht entscheidend, mit welcher Arzoxifenform man beginnt, da die Kristallisation aus IPA und Wasser gemäß den hierin beschriebenen Verfahren zu F-III Kristallen führt. Das Verhältnis von Wasser zu IPA (V:V) beträgt im allgemeinen etwa 1:1 bis 9:1. Bevorzugter liegt das Verhältnis zwischen 2,5 und 5,6:1. Am bevorzugtesten liegt das Verhältnis zwischen 3 bis 5,6:1. Bei der Gewinnung der Kristalle durch Vakuumfiltration kann der nasse F-III Kuchen mit kaltem, entionisiertem Wasser vor der Trocknung im Vakuum gewaschen werden. Zusätzlich sind leicht erhöhte Temperaturen (etwa 50°C für 12 bis 24 Stunden) bevorzugt. Für die Synthese im kommerziellen Maßstab von F-III kann es vorteilhaft sein, die Kristallisation mit F-III zu beimpfen.
In einem bevorzugten Verfahren wird F-III anschließend an die chemische Entfernung der 6-Isopropylhydroxyschutzgruppe von 6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (Vorläufer A) hergestellt, isoliert und gereinigt. Die Schutzgruppenabspaltungsreaktion wird für die vollständige Entfernung der Isopropylschutzgruppe verfolgt und wenn bestimmt wurde, dass die Entfernung im wesentlichen vollständig ist, umfasst die Aufarbeitung der Reaktion vorzugsweise eine Kristallisation unter den Bedingungen, die F-III liefern, wie dies oben und später diskutiert ist. Verfahren zur Herstellung des Vorläufers A und zur Entfernung der Isopropylgruppe kann man in US 5 723 474 A finden.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren wird F-II anschließend an die chemische Reduktion des S-Oxids und der chemischen Entfernung der Benzylschutzgruppe vom 6-Hydroxyl in 6-Benzyloxy-3-(4-[2-(pipertdin-1yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-metlioxyplienyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid) (Vorläufer B) hergestellt, isoliert und gereinigt. Die Reduktions- und Schutzgruppenabspaltungsreaktionen werden auf eine vollständige Reduktion des Sulfoxids zum Sulfid und der vollständigen Entfernung der Benzylhydroxyschutzgruppe verfolgt. Wenn bestimmt wird, dass die Reduktion / Entfernung im wesentlichen vollständig ist, umfasst die Aufarbeitung der Reaktion vorzugsweise eine Kristallisation unter den Bedingungen, die F-III wie hierin diskutiert liefern. Verfahren zur Herstellung des Vorläufers B, zur Entfernung der Benzylgruppe und zur Reduktion des 1-Sulfoxids zum entsprechenden Sulfid kann man auch in US 5 723 474 A finden.
Unabhängig von der in den Schutzgruppenabspaltungs- und Reduktionsschritten verwendeten Chemie liefert die Krtstallisation von Arzoxifen aus den hierin beschriebenen IPA / Wasser-Lösungen konsistent F-III Kristalle in hoher Reinheit.
Charakterisierung und Differenzierung von F-III
Es werden DSC/TGA und XRD Verfahren verwendet, um F-III zu charakterisieren. Die TGA ist oft sehr nützlich für die Unterscheidung zwischen unterschiedlichen festen Formen eines Materials, da die Temperaturen), bei der eine physikalische Änderung im Material auftritt, gewöhnlich für das Polymorph oder Solvat charakteristisch ist. Die DSC ist eine Technik, die oft zum Screenen von Verbindungen auf Polymorphismus und Solvatbildung verwendet wird. Schließlich ist die XRD eine Technik, die eine hohe Ordnung in einem krtstallinen Material detektiert.
Das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellte Arzoxifen gibt ein XRD Muster mit schwachem Signal-zu-Rausch Verhältnissen und eine erhöhte Grundlinie, was ein schwach kristallines Material anzeigt.
Die DSC Spur von F-III, wie sie in 1 gezeigt ist, zeigt eine breite Niedrigtemperaturendothermie bei etwa 30°C, gefolgt von einer zweiten breiten und relativ schwachen Endothermie, die bei etwa 70°C beginnt und einer schließlichen Umwandlung, die bei 146°C beginnt, was einer Schmelze entspricht. Der scharfe 1,5 % (~0,5 mol) betragende Gewichtsverlust im TGA, der mit der ersten Endothermie auftritt, entspricht einem Verlust an schwach gebundenen Wassermolekülen, während zusätzliche ~1,6 % Gewichtsverlust über 60°C den Verlust von fester gebundenen Wassermolekülen darstellen, das heißt die, welche bei sehr geringen relativen Luftfeuchtigkeiten vorkommen. Der nach 170°C beobachtete Gewichtsverlust entspricht einer Zersetzung von F-III.
Die XRD Muster von F-III zeigen scharfe Peaks und eine flache Grundlinie, was hoch kristallines Material anzeigt. Die Winkelpeakpositionen in 2 Θ und die entsprechenden I/I₀ Daten für eine repräsentative Probe von F-III sind in Tabelle 1 angegeben.
Es ist in der Kristallographietechnik gut bekannt, dass für jedes gegebene Polymorph die relativen Intensitäten der Beugungspeaks aufgrund der bevorzugten Orientierung variieren können, die aus Faktoren resultiert, wie Kristallmorphologie. Wenn die Effekte der bevorzugten Orientierung vorhanden sind, sind die Peakintensitäten verändert, aber die charakteristischen Peakpositionen des Polymorphs sind unverändert. Siehe beispielsweise The United States Pharmacopeia Nr. 23, National Formulary Nr. 18, Seiten 1843-1844, 1995. Daher kann basierend auf den Peakintensitäten wie auch der Peakposition F-III durch das Vorkommen der Peaks bei 4,6 ± 0,2, 7,8 ± 0,2, 9,3 ± 0,2, 14,0 ± 0,2, 17,6 ± 0,2, 20,8 ± 0,2 und 24,3 ± 0,2° in 2 Θ identifiziert werden, wobei das Muster bei 25 ± 2°C und 35 ± 10 % relativer Luftfeuchtigkeit von einer Kupferbestrahlungsquelle erhalten wird.
Tabelle 1
Weitere Charakterisierung von F-III
Es werden Hygroskopizitätszuntersuchungen mit F-III ausgeführt. Die Feuchtigskeitssorptionsisothermen für F-III sind in 2 gezeigt. Nach einer anfänglichen Exposition der Proben gegenüber etwa 5 % relativer Luftfeuchtigkeit findet eine unmittelbare Gewichtszunahme von 1,7 % Feuchtigkeit für F-III statt, was etwa zu 0,5 mol Wasser äquivalent ist. Diese Form zeigt eine kontinuierliche Sorption von Feuchtigkeit durch den gesamten Feuchtigkeitsbereich, was wahrscheinlich auf den Einbau von Wassermolekülen in das Kristallgitter beruht.
Das Fehlen einer Hysterese in den Sorption-Desorptions-Isothermen von F-III zeigt an, dass die Kristallform schnell bei jeder gegebenen Feuchtigkeit äquilibriert.
Das Feuchtigkeitssorptionsprofil für F-III zeigt, dass diese Formen im wesentlichen nicht-stöchiometrische Hydrate sind. Bei Umgebungsluftfeuchtigkeit (etwa 50 % relative Luftfeuchtigkeit) sorbiert F-III etwa 3,0 % Wasser, was etwa 0,85 mol Wasser entspricht. Die Bulkform von F-III äquilibriert schnell mit der Atmosphäre, so dass der durch analytische Techniken beobachtete Wassergehalt die relative Luftfeuchtigkeit zum Zeitpunkt der Datensammlung widerspiegelt. Lot-zu-Lot Unterschiede, die in den DSC Daten beobachtet werden, resultieren wahrscheinlich aus den Proben, die in unterschiedlichem Ausmaß aufgrund von unterschiedlichen Umgebungslagerbedingungen hydriert wurden.
Es werden XRD Muster für Proben von F-III erhalten, das bei unterschiedlichen relativen Luftfeuchtigkeiten gelagert wurde (0, 22, 50 und 80 %). Man findet eine graduelle Verschiebung der anfänglichen F-III Peaks (0 % relative Luftfeuchtigkeit) bei etwa 13,8, 17,6, 18,0, 20,5 und 24,0° in 2 Θ wie auch eine leichte Verschiebung von weniger intensiven Peaks, wenn die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die beobachteten Veränderungen in den XRD Mustern von F-III zeigen an, dass die Einheitszelldimensionen sich verändern, vermutlich um schwach gebundene Wassermoleküle zu halten, wenn die relative Luftfeuchtigkeit erhöht wird. Die kontinuierliche Verschiebung von Peaks mit Feuchtigkeit korreliert mit den Feuchtigkeitssorptionsdaten, die eine graduelle Gewichtszunahme über diesen relativen Luftfeuchtigkeitsbereich zeigen, was eine variable Hydratbildung nahelegt.
Es wurde festgestellt, dass F-III über den gesamten Bereich der relativen Luftfeuchtigkeit stabil ist. Material, das durch Kristallisation aus einer Lösung aus Ethanol und Ethylacetat, gefolgt von einer Vakuumtrocknung für nur wenige Stunden erzeugt wird, wie dies in US 5 723 474 A beschrieben ist, zeigt eine sehr geringe Kristallinität.
F-III besitzt mehrere Vorteile gegenüber der oben beschriebenen Arzoxifenform des Stands der Technik. Relativ zum Arzoxifenprodukt, das durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wird, ist F-III bei Raumtemperatur stabiler und ist daher für die pharmazeutische Entwicklung bevorzugter, das heißt zur Entwicklung einer Dosisformulierung. Zusätzlich ist F-III viel kristalliner als die in US 5 723 474 A beschriebene Form. Kristalline Materialien sind im allgemeinen weniger hygroskopisch und stabiler (beispielsweise weniger empfindlich gegenüber einem chemischen Abbau, Wirksamkeit bleibt erhalten) als amorphe Materialien und daher für die Formulierungsentwicklung erwünschter. Ferner enthält F-III im Gegensatz zur Arzoxifenform, die durch die in US 5 723 474 A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, die Ethylacetat und Wasser in ihrem Kristallgitter enthält, nur Wasser.
Die DSC Messungen werden auf einem TA Instruments 2920 Modulated DSC ausgeführt, das an einen Thermal Analyst 3100 angeschlossen ist und mit einem Kühlsystem ausgestattet ist. Die Proben (3-5 mg) werden in gefalteten Aluminiumschälchen von 10 bis 240°C bei einer Heizgeschwindigkeit von 2°C/min erhitzt.
Die TGA Analysen werden auf einem TA Instruments 2050 Thermogravimetric Analyser ausgeführt, der an einen Thermal Analyst 3100 angeschlossen ist. Die Proben (5-10 mg) werden in offenen Schälchen von 25°C bis 250°C mit einer Heizgeschwindigkeit von 5°C/min erhitzt.
Die XRD Muster erhält man von einem Siemens D5000 Röntgenpulverdiffraktometer, das mit einer CuKα Quelle (λ = 1,54056 Å und einem Kevex Festphasendetektor ausgestattet ist, das bei 50 kV und 40 mA betrieben wird. Jede Probe wird zwischen 40 und 350 in 2 θ gescannt. Die Proben können sich für mindestens 30 Minuten bei der gewünschten Temperatur und/oder relativen Luftfeuchtigkeit vor der Datengewinnung äquilibrieren.
Es werden Hygroskopizitätsmessungen für F-III mittels der VTI Methode wie folgt ausgeführt. Jede Probe wird unter Vakuum bei 60°C getrocknet, bis kein weiterer Gewichtsverlust detektiert wird, wonach die Probenkammer auf 0 % relative Luftfeuchtigkeit gebracht wird. Die Feuchtigkeitssorptionsisothermen erhält man bei 25°C mittels eines VTI Vakuumfeuchtigkeitsausgleichs mit den folgenden Bedingungen: Probengröße 10-15 mg, Adsorptions-/Desorptionsbereich 0-95 % relative Luftfeuchtigkeit, Stufenintervall 5 %, Probenintervall 10 Minuten.
Die folgenden Beispiele erläutern weiter die Verfahren zur Herstellung des Hydrats der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sollen den Schutzumfang der Verfahren nicht beschränken und sollen auch nicht so aufgefasst werden.
Beispiel 1
F-III aus 6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxylphenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid
Zu einer Methylenchloridlösung (100 ml) aus 6-Isopropoxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]plienoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid (10 g, 18 mmol) wird unter einer Stickstoffatmosphäre bei -10°C bis -20°C BCl₃ (g) (4,23 g, 34 mmol) mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die die Temperatur der Reaktion unter -10°C hält. Nachdem die Zugabe vollständig ist, kann die Reaktion für weitere 2 Stunden rühren. Es wird Isopropylalkohol (IPA, 12,35 ml, 167 mmol) langsam zur Reaktion bei weniger als -10°C gegeben und das Rühren wird für 30 Minuten fortgesetzt. Ein getrennter Kolben wird mit 100 ml Wasser befüllt und mit einem Eisbad auf etwa 0°C gekühlt. Die Produktlösung wird über eine Kanüle in das Wasser überführt, wobei weiterhin stark gerührt wird. Die entstehende weiße Aufschlämmung kann für 1 Stunde bei 0°C rühren. Das Produkt wird durch Filtration gewonnen . und mit 25 ml an 40 % CH₂Cl₂ / Wasser und dann mit 25 ml kaltem Wasser gewaschen. Das Produkt wird in 60 ml IPA und 60 ml Wasser suspendiert und auf 60°C erhitzt. Man erhält eine Lösung bei 48°C. Es wird zusätzliches Wasser (120 ml) zugegeben. Die Lösung kann sich auf 35°C abkühlen und die Aufschlämmung wird weiter langsam auf 0-5°C gekühlt und für mehrere Stunden gerührt. Das Produkt wird durch Filtration isoliert und mit kaltem entionisiertem Wasser (25 ml) gewaschen. Der nasse F-III Kuchen wird bis zu einem konstanten Gewicht im Vakuum bei 50°C für 12 bis 24 Stunden unter Bildung von F-III getrocknet.
Beispiel 2
F-III aus 6-Benzyloxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid)
Zu einer 250 ml fassenden Parr-Flasche wird entionisiertes Wasser (5,25 ml), 1 M HCl (7,74 ml, 7,75 mmol), 10 % Pd/C (Typ A32110, 1,37 g, 1,29 mmol Pd), [6-Benzyloxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)etlioxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophen-(S-oxid) (3 g, 5,16 mmol) und Isopropylalkohol (32 ml) bei Umgebungstemperatur gegeben. Die Flasche wird an einen Parr-Schüttler angebracht, zweimal nacheinander entgast und mit Stickstoff begast und anschließend evakuiert und mit Wasserstoffgas bis zu einem Druck von 2,07 bar (30 psig) gefüllt.
Der Schüttler wird gestartet und das Reaktionsgemisch wird af 60°C erhitzt. Die Reaktion wird gemäß HPLC Analyse nach etwa 4 Stunden als vollständig bestimmt. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Kissen aus Diatomäenerde filtriert und das Kissen wird mit 0,1 M HCl (2 × 10 ml) gewaschen. Das Lösemittel wird im Vakuum bei etwa 50°C entfernt. Der entstehende Rückstand wird in 50 % Isopropylalkohol/entionisiertem Wasser (30 ml) gelöst und sanft auf einem Dampfbad erhitzt, bis man eine Lösung erhält. Zur Lösung wird erstionisiertes Wasser (22 ml) gegeben und die Lösung kann sich auf Umgebungstemperatur abkühlen. Die Produktaufschlämmung wird weiter auf 0°C gekühlt. Das Produkt wird durch Filtration isoliert, mit kaltem erstionisiertem Wasser (2 x 15 ml) gewaschen und im Vakuum bei 50°C bis zur Gewichtskonstanz unter Bildung von F-III getrocknet.
Beispiel 3 F-III aus (6-Isopropoxy-3-[4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
Methylenchlorid (105 l) und [6-Isopropoxy-3-[4-[2-piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid) (10,5 kg) werden vereinigt und auf -15°C bis -20°C gekühlt. Bortrichlorid (4,6 kg) wird zugegeben, während die Reaktionstemperatur zwischen -10°C und -20°C gehalten wird. Das Rühren wird fortgesetzt, bis die Fläche des Ausgangsmaterials gemäß HPLC weniger als 1 % beträgt. HPLC System (4,6 mm ID × 25 cm Zorbax SB-Phenyl Säule 30°C, 70:30 Methanol : 0,01 N Schwefelsäure, Flussrate 1,5 ml/min, Detektor 300 nm). Isopropanol (10,28 kg) wird zugegeben, während die Reaktionstemperatur zwischen -10°C und -20°C gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird für 30 bis 45 Minuten gerührt. Das rohe Reaktionsprodukt wird durch die Zugabe des Reaktionsgemisches zu zusätzlichen 105 l Wasser isoliert, das auf 2 bis 7°C vorgekühlt ist, wobei die Reaktionstemperatur auf 2°C bis 7°C gehalten wird. Nach der Zugabe erfolgt ein Methylenchloridwaschschritt (20 ml), der auf 7°C bis 2°C vorgekühlt ist. Die kristalline Aufschlämmung wird für 2 bis 3 Stunden gerührt und filtriert und nacheinander gewaschen mit Methylenchlorid (26 kg), das auf 7°C bis 2°C vorgekühlt ist und Wasser (53 1), das auf 7°C bis 2°C vorgekühlt ist. Der rohe nasse Kuchen wird mit Wasser (421) und Isopropanol (401) vereinigt und wird auf 65 bis 70°C erhitzt, um die Auflösung zu bewirken. Die heiße Lösung wird filtriert. Nach der Filtration erfolgt ein Waschschritt, der aus einem Gemisch aus Isopropanol (20 l) und Wasser (21 l) besteht, das auf 65 bis 70°C erhitzt ist und ein Waschschritt, der aus Wasser (126 l) besteht, das auf 65 bis 70°C erhitzt ist. Die Lösung wird auf 40 bis 45°C gekühlt, angeimpft und bei dieser Temperatur für 2 bis 3 Stunden gerührt, um das Kristallwachstum zu erlauben. Die Aufschlämmung wird auf bis 5°C gekühlt, für 3 bis 4 Stunden gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser (122,6 l) gewaschen, das auf 2 bis 7°C vorgekühlt wurde. Das Produkt wird im Vakuum bei einer maximalen Temperatur von 50°C getrocknet, bis die Veränderung des Kuchengewichts über einen Zeitraum von 2 bis 4 Stunden weniger als 0,05 kg beträgt. Ausbeute: 8,468 kg (87,3 %). HPLC Gehalt: 98,5 %. Wasser nach Karl Fischer: 3,0 %. Gesamtnebenprodukte gemäß HPLC: 1,79 %.
Beispiel 4
F-III aus [6-Benzyloxy-3-[4-(2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid)
Tetrahydrofuran (261 ml), Wasser (45 ml), konzentrierte Schwefelsäure (6,14 g) und [6-benzyloxy-3-[4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy)phenoxy]-2-(4-methoxyphenyl)]benzo[b]thiophen-(S-oxid) (HPLC Gehalt 99 %, HPLC Gesamtnebenprodukte 0,35 %) werden vereinigt und gerührt, bis sie homogen sind. 10 % Pd/C (5,6 g aufgeschlämmt in 22 ml Wasser) wird mit einer 5 ml Wasserspülung zugegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird evakuiert und mit 4,14 bar (60 psi) Wasserstoff überlagert. Die Reaktionstemperatur wird auf 30°C eingestellt. Nach
2 Stunden wird 10 % Pd/C (5,6 g) mit Wasser (30 ml) zugegeben. Die Hydrierung wird bei 14 bar (60 psi) und 30°C für weitere 22 Stunden fortgesetzt. Es werden zusätzliche 4,40 g an 10 % Pd/C in 30 ml Wasser zugegeben und die Hydrierung bei 4,14 bar (60 psi) und 30°C wird für weitere 2,5 Stunden fortgesetzt. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und der pH des Filtrats wird mit 50 % Natriumhydroxid auf 7,24 eingestellt. Natriumchlorid (8,66 g), das in Wasser (18 ml) gelöst ist, wird zugegeben und die biphasische Lösung wird für 30 Minuten gerührt. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit 50 ml Tetrahydrofuran rückextrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und durch eine atmosphärische Destillation auf ein Volumen von 50 ml konzentriert. Zum Konzentrat werden bei 24°C 180 ml Methanol über einen Zeitraum von 1 Stunde gegeben. Die entstehende kristalline Aufschlämmung wird für 30 Minuten bei 24°C gerührt, auf 0°C gekühlt und für 1 Stunde gerührt. Die Feststoffe werden durch Filtration entfernt und nacheinander mit 39 ml Wasser und nacheinander mit 39 ml Methanol gewaschen, gefolgt von einer Vakuumtrocknung bei 50°C isoliert. Ausbeute 15,52 g (67,8 %).
Isopropanol (33 ml), Wasser (66 ml) und 10 g oben isolierter Feststoff werden vereinigt. Zum gerührten Gemisch werden bei 25°C 1,8 M HCl (21 ml) gegeben. Die Feststoffe lösen sich schnell auf; wonach eine erneute Ausfällung des Hydrochloridsalzes erfolgt. Nach dem Rühren für 30 Minuten wird die Aufschlämmung auf 70°C zur Bewirkung der Auflösung aller Feststoffe erhitzt. Die Lösung wird auf 60°C abgekühlt und 33 ml Wasser werden zugegeben. Die entstehende Lösung wird über einen Zeitraum von 3 Stunden auf 25°C gekühlt, währenddessen das Hydrochloridsalz ausfällt. Die Aufschlämmung wird für etwa 3 Stunden bei 25°C gerührt, filtriert, mit Wasser (30 ml) gewaschen und im Vakuum über Nacht bei 50°C unter Bildung von 8,9 g (82,7 %) an F-III getrocknet. HPLC Gehalt: 96,5 %. Wasser nach Karl Fischer: 2,44 %. HPLC Nebenprodukte: 1,09 %.
Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "wirksame Menge" eine Menge an F-III, die zur Hemmung von Zuständen oder schädlichen Auswirkungen hiervon, wie sie hierin beschrieben sind, fähig ist. Wenn F-III zusammen mit Östrogen, Progestin, einem Aromataseinhibitor, einem LHRH Analogon oder einem AChE Inhibitor verabreicht wird, meint der Ausdruck "wirksame Menge" auch eine Menge eines solchen Mittels, das zur Ausbildung des beabsichtigten Effekts fällig ist.
Die Ausdrücke "hemmend" oder "hemmen" umfassen ihre allgemein anerkannte Bedeutung, das heißt die Verhinderung, Vermeidung, Unterdrückung, Linderung, Besserung, Verlangsamung, das Anhalten oder die Umkehr des Fortschreitens, der Schwere oder eines pathologischen Zustands oder der Folgen hiervon, wie dies hierin beschrieben ist.
Die Ausdrücke "Verhinderung" oder "Prävention von", "Prophylaxe", "prophylaktisch" und "verhindern" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf die Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass der Empfänger von F-III einen der pathologischen Zustände oder die Folgen hiervon bekommt oder entwickelt, wie dies hierin beschrieben ist.
Die Ausdrücke "östrogenarm" oder "Östrogenmangel" beziehen sich auf einen Zustand, der entweder natürlich auftritt oder klinisch induziert ist, wobei eine Frau nicht ausreichend endogene Östrogenhormone bilden kann, um die Östrogen-abhängigen Funktionen aufrechtzuerhalten, beispielsweise Menstruation, Homeostase der Knochenmasse, neuronale Funktion, cardiovaskulärer Zustand usw. Solche Östrogenmangelsituationen kommen unter anderem durch Menopause und operative oder chemische Ovarektomie zustande, einschließlich des funktionellen Äquivalents, beispielsweise der Arzneimittelbehandlung mit einem Aromataseinhibitor, GnRH Agonisten oder Antagonisten, ICI 182780 und dergleichen. Krankheitszustände, die mit einem Östrogenmangelzustand assoziiert sind, sind unter anderem: Knochenverlust, Osteoporose, cardiovaskuläre Erkrankung und Hyperlipidämie.
Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck "Östrogen". Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17ß-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin®), Pferdeöstrogen, 17ß-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung ist Premarin® und Norethylnodrel.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit progestiner Aktivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethylnodrel, Nongestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen. Norethindron ist ein bevorzugtes auf Progestin basierendes Mittel.
Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck "Aromataseinhibitor" Verbindungen, die zur Hemmung der Aromatase fällig sind, beispielsweise im Handel erhältliche Inhibitoren, wie Aminoglutemid (CYTANDREN®), Anastrazol (ARIMIDEX®), Letrozol (FEMARA®), Formetan (LENATRON®), Exemestan (AROMASIN®) und dergleichen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "LHRH Analogon" auf ein Analogon des das lutenisierende Hormon freisetzenden Hormons, das die Östrogenbildung bei einer prärmenopausalen Frau hemmt, einschließlich beispielsweise Goserlin (ZOLADEX®), Leuprolid (LUPRON®) und dergleichen.
Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "AChE Inhibitor" Verbindungen, die die Acetylcholinesterase hemmen, beispielsweise Physostigminsalicylat, Tacrinhydrochlorid, Donepezilhydrochlorid und dergleichen.
Der Ausdruck "hochregulieren von ChAT" bezieht sich auf die Erhöhung der enzymatischen Aktivität von ChAT, das heißt die Förderung der Umwandlung von Cholin zu Acetylcholin. Diese Förderung würde eine Erhöhung der Effizienz und/oder Geschwindigkeit der Umsetzung von ChAT und Cholin und/oder eine Erhöhung der Menge an ChAT, die an der Wirkstelle vorhanden ist umfassen. Diese Erhöhung der vorhandenen Enzymmenge kann auf der Genregulation oder einem anderen Syntheseschritt der Enzymbildung und/oder einer Abnahme der Deaktivierung und des Metabolismus des Enzyms beruhen.
Allgemeines Rattenpräparationsverfahren: Fünfundsiebzig Tage alte (falls nichts anderes angeben ist) weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten und haben für eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5 %) und Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen Luftfeuchte von 40 % gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
Dosierungsplan und Gewebeentnahme: Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit F-III begonnen. 17α-Ethinylöstradiol oder F-III werden als Suspension 1 % Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20 % Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2:1, V: V) betäubt. Es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO₂ getötet, der Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht des Uterus wird bestimmt. 17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4- en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
Uteruseosinophilenperoxidasetest (EPO)
Die Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005 % Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01 % Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme für eine Minute bei 450 nm verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im Uterus ist ein Zeichen für die östrogene Aktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden langen Intervalls wird über den anfänglichen, linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
Testverfahren auf die Hemmung des Knochenverlusts (Osteoporose)
Durch Befolgen des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) belhandelt und durch Kohlendioxiderstickung am 36. Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Wirkung auf die Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Nassgewichts entleert, und die mit der vollständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75 % verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10 % Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Untersuchung zu ermöglichen.
Die rechten Femuren werden entnommen und an der distalen Metaphyse werden digitale Röntgenstrahlen erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm analysiert (NIH Image). Der proximale Teil der Tibien aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt. Gemäß den obigen Verfahren werden F-III oder Ethinylöstradiol (EE₂) in 20 % Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin oral an die Testtiere verabreicht. F-III ist auch in Kombination mit Östrogen oder Progestin brauchbar.
MCF-7 Proliferationstest
MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) (V/V, L-Glutamin (2 mW), Natriumpyruvat (1mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM}, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (1 μg/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10 % mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) anstelle von 10 % FBS supplementiert ist (Testmedium), um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmediium entfernt (Ca²⁺/M b / g ²⁺ freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 ml (8000 Zellen) werden in Flachbodemnikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Trans
fer zu ermöglichen. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt und 50 ml werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 ml Testmedium auf ein Endvolumen von 200 ml überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert (1 μCi/Vertiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei -70°C für 24 Stunden beendet, wonach ein Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvesters erfolgt. Die Proben werden durch Flüssigscintillation mittels eines Wallac BetaPlace ß-Zählgeräts gemessen.
DMBA-induzierte Brusttumorhemmung
Es werden östrogenabhängige Abtasttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis, Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen (DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Turriors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, dass die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
F-III wird entweder über intraperitoneale Injektionen in 2 % Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird eimnal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.
Uterusfibrosetestverfahren
Test 1
Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man F-III. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate. Die Frauen werden während des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
Test 2
Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer dass der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
Test 3
Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer dass der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
Test 4
Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3-5 mal pro Woche durch Injektion für 2-4 Monate dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus F-III oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3-16 Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen und auf Tumorregression untersucht.
Test 5
Gewebe von humanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung kultiviert. Die Behandlung, die aus F-III oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri geerntet, um den Status des Organs zu untersuchen.
Test 6
Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nichttransformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachtumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-III und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
Test 7
F-III's Fähigkeit zur Hemmung der durch Östrogen stimulierten Proliferation von Leiomyoma-stammenden ELT Zelllinien wird im wesentlichen gemessen, wie dies in Fuchs-Young et al., "Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17(3): 151-159 (1996) beschrieben ist.
Endometriosetestverfahren
Test 1
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedein Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt. Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-III pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrischen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
Test 2
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedein Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-III pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrischen Explantate und Nebennieren werden entfernt und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen werden aufgezeichnet.
Test 3
Autographien von endometrischem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometrisches Gewebe wird im Peritoneum von 5-150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachtumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, und den Status des Endometriums zu bestimmen.
Test 4
Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird endogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus F-III, das durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.
Test 5 Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nichttransformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Ab- wesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf hre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-III und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
Östrogene, wie 17ß-Östradiol, regulieren die Gentranskription durch die Bindung an Östrogenrezeptoren (ER), die im Cytoplasma von bestimmten Zellpopulationen vorkommen. Die Ligandenaktivierung des ER ist ein Merkmal für den nukleären Transport des Komplexes, wo eine 13 Basenpaar lange palindromische DNA Konsensussequenz (Östrogenreaktionselement oder ERE) den Zusammenbau eines Transkriptionsapparats beginnt, der in der Aktivierung der geeigneten Zielgene gipfelt. Es wurde eine Vielzahl an Genen identifiziert, die durch Östrogen reguliert werden. Diese umfassen Cytosklelettproteine, Neurotransmitter, biosynthetische und metabolische Enzyme und Rezeptoren, wie auch andere Hormone und Neuropeptide. ERE's wurden in vielen auf Östrogen reagierenden Genen identifiziert, einschließlich Vitellogenin, c-fos, Prolactin und lutenisierendern Hormon.
Mit Bedeutung im zentralen Nervensystem werden ERE-ähnliche Sequenzen in p75^ngr und trkA identifiziert, die beide als Signalmoleküle für die Neurotrophine dienen: Nervenwachstumsfaktor (NGF), vom Gehirn stammender Nervenwachstumsfaktor (BDNGF) und Neurotrophin-3.
BDNF wie auch NGF fördern das Überleben von cholinergen Neuronen in Kultur. Es wird postuliert, dass falls die Wechselwirkungen zwischen Neurotrophinen und Östrogenen wichtig für die Entwicklung und das Überleben von basalen Großhirnneuronen sind (die bei der Alzheimerschen Erkrankung degenerieren), können klinische Zustände, bei denen eine Östrogendefizienz vorkommt (wie nach der Menopause), dann zu einem Verlust dieser Neuronen beitragen.
Das folgende Experiment wird in ovarektomierten Ratten (wie oben beschrieben präpariert) ausgeführt, um die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen F-III und Östrogen bei der Beeinflussung der Genexpression in verschiedenen Gehirnregionen zu bestimmen. Sechs Wochen alten Ratten verabreicht man subkutane Injektionen an Östradiolbenzoat (0,03 mg/kg), F-III oder Träger (Kontrolle). Nach 5 Wochen Behandlung werden die Tiere getötet und ihre Gehirne und Hippocampi werden durch Mikrochirurgie gewonnen. Die Hippocampi werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert. Die Gesamt RNA wird aus vereinigtem Gewebe aus den geeigneten Behandlungs- und Kontrollgruppen isoliert und mittels eines 3'-Oligonukleotidprimers transkribiert, der aus spezifischen mRNA (Poly-A+) Populationen ausgewählt wird. Die Polymerasekettenreaktionen (PCR) werden in einer Mischung ausgeführt, die besteht aus: Zufälligen 5'-Oligonukleotiden (10 Basenpaare lang, insgesamt 150), Reaktionspuffer, Taq Polymerase und ³²PdTCP.
Nach 40 Amplifizierungsrunden werden die Reaktionsprodukte nach Größe auf einem 6 % TBE-Harnstoffgel aufgetrennt, getrocknet und gegenüber einem Röntgenfilm exponiert. Die entstehende mRNA zeigt Muster, die zwischen den Behandlungsgruppen verglichen werden.
Peri- und postmenopausale Frauen unterziehen sich oft einer Hormonersatztherapie (HRT), um die negativen Konsequenzen zu bekämpfen, die mit dem Abfall an zirkulierendem, endogenem Östrogen assoziiert sind, beispielsweise zur Behandlung von Hitzewallungen. Jedoch wurde die HRT mit erhöhten Risiken für bestimmte Krebsarten assoziiert, einschließlich Uterus- und Brustkrebs. F-III kann in Zusammenhang mit HRT verwendet werden, um diese Risiken zu hemmen.
Gemäß der Definition funktionieren die Ovarien einer postmenopausalen Frau nicht. Ihre einzige Quelle für Östrogen ist durch die Umwandlung von Androgenen aus der Nebenniere zu Östrogenen durch das Enzym Aromatase, das in peripheren Geweben gefunden wird (einschließlich Fett, Muskel und dem Brusttumor selbst). Daher verringern Arzneimittel, die die Aromatase hemmen (Aromataseinhibitoren) das zirkulierende Östrogen der postmenopausalen Frau. Östrogenmangel durch Aromatasehemmung ist eine wichtige Behandlungsoption für Patienten mit metastasiertem Brustkrebs. Während der Therapie mit einem Aromataseinhibitor, kann das Fehlen von zirkulierendem Östrogen negative, unbeabsichtigte Nebenwirkungen verursachen, beispielsweise auf die Serumlipidspiegel. F-III kann verwendet werden, um diese negativen Effekte zu hemmen.
Die kontinuierliche Exposition gegenüber einem LHRH (luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon) Analogon hemmt die Östrogenbildung bei der prämenopausalen Frau durch das Unempfindlichmachen der Hypophyse, die dann nicht länger die Ovarien zur Bildung von Östrogen stimuliert. Der klinische Effekt ist eine "medizinische Oophorektomie", die bei der Einstellung des LHRH Analogons reversibel ist. Während der Therapie mit einem LHRH Analogon, kann das Fehlen von zirkulierendem Östrogen negative, unbeabsichtigte Nebenwirkungen haben, beispielsweise auf die Serumlipidspiegel. F-III kann zur Hemmung dieser negativen Effekte verwendet werden.
Es ist bekannt, dass Patienten, die an Alzheimerscher Erkrankung leiden, eine deutlich kleinere Menge an cholinergen Neuronen im Hippocampus aufweisen, als nicht-Alzheimer Menschen. Der progressive Verlust dieser cholinergen Neuronen scheint den progressiven Verlust von Gedächtnis und Wahrnehmungsfunktion bei diesen Patienten widerzuspiegeln. Man glaubt, dass ein Grund für die Abnahme dieser Neuronen der Verlust oder die verringerte Funktion des Neurotransmitters Acetylcholin ist.
Die Menge an Acetylcholin in einem Neuron wird im Grunde da bestimmt, wo das Gleichgewicht zwischen der Biosynthese und Bioabbau liegt. Das Enzym Cholinacetyltransferase (ChAT) ist primär für die Synthese und Acetylcholinesterase (AChE) für dessen Abbau verantwortlich.
Um die Wirkung von F-III auf die Menge an ChAT zu bestimmen, wird das folgende Experiment ausgeführt: Nach dem allgemeinen oben beschriebenen Rattenpräparationsverfahren erhalten 40 Ratten täglich durch eine subkutane Injektion oder orale Verabreichung von F-III mit 3 mg/kg/Tag in einem Träger, der 10 % Cyclodextrin enthält, Östradioalbenzoat mit 0,03 oder 0,3 mg/kg/Tag oder Trägerkontrolle. Die Tiere werden für 3 oder 10 Tage behandelt. Es sind 20 Tiere in jedem Dosierungsplan. Nach geeigneten Zeiträumen werden die Tiere getötet und ihre Gehirne werden entnommen. Die bestimmten Bereiche der Gehirne werden homogenisiert und getestet. Homogenate aus dem Hippocampus und dein frontalen Cortex werden verarbeitet und die Bestimmung der ChAT Aktivität wird durch einen radioaktiv markierten Test der Biosynthese von Acetylcholin ausgeführt. Dieses Verfahren kann in Schoepp et al., 7. Neural Transmiss., 78: 183-193, 1989 gefunden werden.
Wie erwartet, sind die ChAT Mengen in den OVX Tieren um > 50 % (p < 0,001) im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen verringert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird F-III in Kombination mit einem AChE Inhibitor verwendet. Die Verwendung eines AChe Inhibitors erhöht die Mengen an Acetylcholin durch die Blockierung des Abbaus über die Hemmung von AChE.
Benigne, prostatische Hyperplasie (BPH)
Als Hintergrundinformation über die Verbindung zwischen der Östrogenwirkung und der Behandlung von BPH und Prostatacarzinom ist die WO 98/07274 A vom 15.Oktober 1998 geeignet.
In den unten beschriebenen Experimenten wird die Fähigkeit von F-III zur Bindung an Östrogenrezeptoren in mehreren humanen Prostatakrebszelllinien evaluiert.
Lysate der humanen Prostatakrebszelllinien LNCaP, DU-45 und PC-3 werden in einem TEG Medium hergestellt, das 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,4 M KCl, 10 % Glycerin, 0,5 mM 2-ME und 10 mM Natriummolybdat umfasst und ferner die Proteaseinhibitoren Pepstatin (1 mg/ml), Leupeptid (2 mg/ml), Aprotinin (5 mg/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 0,1 mM) enthält (TEGP).
Die Zelllysate werden zentrifugiert und die Pellets werden in kaltem TEGP (1 ml TEGP / 100 mg Pellet) resuspendiert und für 30 Sekunden auf einem Branson Modell 450 Ultraschallgerät ultrabeschallt (Betriebszyklus 70 %, Stärke 1,8). Die Lysate werden durch Zentrifugation bei 10 000 x g für 15 Minuten bei 4°C pelletiert, wonach die Überstände abgezogen werden und entweder sofort verwendet oder bei -70°C gelagert werden.
Kompetitiver Bindungstest: Der Bindungspuffer ist TEG, worin 0,4 M KCl durch 50 mM NaCI ersetzt wurde und wozu 1 mg/ml Ovalbumin weiter zugegeben wurde (TEGO). F-III wird in TEGO auf 20 nM verdünnt, wovon dreifach Reihenverdünnungen hergestellt werden. Die Tests werden in Rundbodenpolypropylenmikrotiterplatten dreifach in Mikrovertiefungen ausgeführt. Jede Vertiefung erhält 35 μl tritiiertes 17ß-Östradiol (0,5 nM, spezifische Aktivität 60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) und 35 μl kalte Kompetitionstestverbindung (0,1 nM – 5 mM) oder TEGO und nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 4°C unter Schütteln dann 70 μl des MCF-7 Zelllinienlysats.
Die Platten werden für 24 Stunden bei 4°C inkubiert, wonach 70 μl Dextran-beschichtete Aktivkohle (DCC) zu jeder Vertiefung gefolgt von starkem Schütteln für 8 Minuten bei 4°C zugegeben werden. Die Platten werden dann bei 1500 × g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird aus jeder Vertiefung in eine flexible Polystyrolmikrotiterplatte für eine Scintillationszählung in einem Wallac Microbeta Modell 1450 Gerät überführt. Die Radioaktivität wird als Zerfälle pro Minute (DPM) nach der Korrektur für die Zählausbeute (35-40 %) und dem Hintergrund ausgedrückt. Zusätzliche Kontrollen sind die Gesamtzählung und die Gesamtzählung + DCC, um die untere Grenze der DCC exrtrahierbaren Zählungen zu definieren. Die Ergebnisse dieser kompetitiven Bindungstests werden als mittlere prozentuale Bindung (% Bindung) f Standardabweichung mittels der folgenden Formel ausgedrückt:
Die Erfindung betrifft auch die Verabreichung von F-III an einen Empfänger, der einem Risiko ausgesetzt ist, de novo Brustkrebs zu entwickeln. Der Ausdruck "de novo" meint, wie er hierin verwendet wird, das Auftreten einer Transformation oder Metamorphose von normalen Brustzellen zu krebsartigen oder malignen Zellen zum ersten Mal. Eine solche Transformation kann in Stufen in derselben Zellen oder in Tochterzellen über einen evolutortschen Prozess ablaufen oder kann in einem einzelnen, pivotalen Ereignis auftreten. Dieser de novo Prozess steht im Gegensatz zu Metastasierung, Kolonialisierung oder Verbreitung von bereits transfomierten oder malignen Zellen aus der primären Tumorstelle an neue Orte.
Eine Person, die keinem besonderen Risiko ausgesetzt ist, Brustkrebs zu entwickeln, ist eine, die de novo Brustkrebs entwickeln kann und keine Evidenz oder keinen Verdacht für ein Krankheitspotential oberhalb eines normalen Risikos aufweist und bei der nie eine Diagnose der Erkrankung gestellt wurde. Der größte Risikofaktor, der zur Entwicklung von Brustcarzinom beiträgt, ist eine persönliche Geschichte, an dieser Erkrankung zu leiden oder ein früheres Auftreten der Erkrankung, sogar wenn sie sich in Remission ohne Evidenz von deren Anwesenheit befindet. Ein weiterer Riskofaktor ist die Familiengeschichte der Erkrankung.
Die Induktion von Brustumoren bei Ratten durch die Verabreichung des Carzinogens N-Nitroso-Nmethylharnstoff ist ein gut akzeptiertes Tiermodell für die Untersuchung von Brustkrebs und hat sich als geeignet zur Analyse der Wirkung von chemopräventiven Mitteln herausgestellt.
In zwei getrennten Untersuchungen wird 55 Tage alten weiblichen Sprague-Dawley Ratten eine intravenöse (Studie 1) oder intraperitoneale (Studie 2) Dosis von 50 mg N-Nitroso-N-methylharnstoff pro Kilogramm Körpergewicht eine Woche vor dem freien Zugang zu einem Futter verabreicht, in das unterschiedliche Mengen an F-III, (Z)-2-[4-(1,2-Diphenyl-1-butenyl)phenoay]-N,N-dimethylethanaminbase (Tamoxifenbase) oder die Kontrolle gemischt wurden.
In Studie 1 entsprechen die Nahrungsmitteldosen von 60 mg/kg der Nahrung und 20 mg/kg der Nahrung ungefähr vergleichbaren Dosierungen von 3 und 1 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere.
In Studie 2 entsprechend die Nahrungsmittelsdosen von 20, 6, 2 und 0,6 mg/kg der Nahrung ungefähr vergleichbaren Dosierungen von 1, 0,3, 0,1 und 0,03 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere.
Die Ratten werden auf das Auftreten einer Toxizität beobachtet und einmal pro Woche auf eine Tumorbildung palpiert. Die Tiere werden nach 13 Wochen (Studie 1) oder 18 Wochen (Studie 2) getötet und die Tumoren werden bestätigt und bei der Autopsie gewogen.
Der Ausdruck "pharmazeutisch" meint, wenn er hierin als Adjektiv verwendet wird, dass es im wesentlichen nicht schädlich für den behandelten Säuger ist. Mit "pharmazeutische Formulierung" ist gemeint, dass der Träger, das Verdünnungsmittel, die Hilfsstoffe und Wirkstoffe mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sind.
F-III wird vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert. Die Auswahl der Formulierung sollte vom behandelnden Arzt entschieden werden, wobei dieselben Faktoren in Betracht gezogen werden, wie bei der Bestimmung der wirksamen Menge.
Die gesamten Wirkstoffe umfassen in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Vorzugsweise sind in dieser Formulierung nicht mehr als 2 Wirkstoffe enthalten. Das bedeutet, dass es bevorzugt ist, F-III mit einem zweiten Wirkstoff zu formulieren, ausgewählt aus Östrogen, Progestin, Aromataiseinhibitor, LHRH Analogon und AChE Inhibitor. Die am meisten bevorzugten Formulierungen sind die, worin F-III der einzige Wirkstoff ist.
Die pharmazeutischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung werden durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe hergestellt. Beispielsweise wird F-III entweder alleine oder in Kombination mit einem Östrogen, Progestin, Aromataseinhibitor, LHRH Analogon oder einer AChE Inhibitorverbindung mit herkömmlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Lösungen, Injektionslösungen, Aerosolen, Pulvern und dergleichen formuliert.
Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung zzur parenteralen Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen, wie auch sterile Pulver, die unmittelbar vor der Verabreichung in sterile Lösungen oder Suspensionen rekonstituiert werden. Beispiele für geeignete sterile wässrige und nicht-wässrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösemittel oder Vehikel sind unter anderem Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ethano1, Polyole (wie Glycerin, Propylenglycol, Poly(ethylenglycol) und dergleichen) und geeignete Germische hiervon, Pflanzenöle (wie Ölivenöl) und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Die richtige Fluidität wird beispielsweise durch die Verwendung von Beschichtungsmaterialien aufrechterhalten, wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der richtigen Partikelgröße im Fall von Dispersionen und Suspensionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln.
Parenterale Zusammensetzungen können auch Adjuvantien enthalten, wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel. Die Prävention der Einwirkung von Mikroorganismen wird durch die Einarbeitung von Mitteln gegen Bakterien und Pilze sichergestellt, wie beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann auch erwünscht sein, isotonische Mittel einzuarbeiten, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleiclen. Eine verlängerte Absorption von injizierbaren Formulierungen kann durch die Einarbeitung von Mitteln, die die Absorption verzögern, herbeigeführt werden, wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
In einigen Fällen ist es zur Verlängerung der Wirkung des Arzneimittels erwünscht, die Absorption des Arzneimittels nach einer subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch die Verwendung einer flüssigen Suspension aus kristallinem Material mit geringer Wasserlöslichkeit oder durch Lösen oder Suspendieren des Arzneimittels in einem Ölträger erreicht werden. Im Fall einer subkutanen oder intramuskulären Injektion einer Suspension, die eine Form des Arzneimittels mit geringer Wasserlöslichkeit enthält, hängt die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneimittels von der Auflösungsgeschwindigkeit ab.
Injizierbare "Depotformulierungen" von F-III werden durch die Bildung von mikroverkapselten Matrizes des Arzneimittels in bioabbaubare Polymere hergestellt, wie Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere der Milch- und Glycolsäure, Polyorthoester und Polyanliydride, wobei diese Materialien in der Technik beschrieben sind. In Abhängigkeit des Verhältnisses von Arzneimittel zu Polymer und den Eigenschaften des im einzelnen verwendeten Polymers kann die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung kontrolliert werden.
Die injizierbaren Formulierungen werden sterilisiert, beispielsweise mittels Filtration durch Bakterienzurückhaltende Filter oder durch eine Vorsterilisation der Komponenten des Gemisches vor deren Mischung entweder zum Zeitpunkt der Herstellung oder direkt vor der Verabreichung (wie im Beispiel der Doppelkammerspritzenpackung).
Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung sind unter anderem Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula. In solchen festen Dosierungsformen wird F-III mit zumindest einem inerten pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln, wie Stärkearten, Zuckern, wie Lactose und Glucose, Mannit und Kieselsäure, (b) Bindemitteln, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidin, Saccharose und Alcaziengummi, (c) Befeuchtungsmitteln, wie Glycerin, (d) Zerfallhilfsmitteln, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kartoffel- oder Tapiocastärke, Alginsäure, Silicate und Natriumcarbonat, (e) Befeuchtungsmittel, wie Glycerin, (f) Auflösungsverzögernden Mitteln, wie Paraffin, (g) absorptionsbeschleunigenden Mitteln, wie quaternäre Ammoniumverbindungen, (h) Netzmitteln, wie Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, (i) Absorptionsmitteln, wie Kaolin und Bentoniterde und (j) Gleitmitteln, wie Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyetylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische hiervon. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform auch puffernde Mittel enthalten.
Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch die Füllung in Weich- oder Hartgelatinekapseln mittels Hilfsstoffen, wie Lactose und auch hochmolekularen Polyethylenglycolen und dergleichen umfassen. Feste Dosierungsformen, wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granula können auch mit Beschichtungen oder Hüllen hergestellt werden, wie enterische Beschichtungen und andere Beschichtungen, die in der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind. Die Beschichtungen können Deckmittel oder Mittel enthalten, die die Wirkstoffe in einem bestimmten Teil des Verdauungstrakts freisetzen, wie beispielsweise säurelösliche Beschichtungen zur Freisetzung der Wirkstoffe im Magen oder basenlösliche Beschichtungen zur Freisetzung der Wirkstoffe im Intestinaltrakt.
Die Wirkstoffe können auch in einer verzögert freisetzenden Beschichtung mikroverkapselt werden, wobei die Mikrokapseln Teil einer Pille der Kapselformulierung sind.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung von F-III sind unter anderern Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den Wirkstoffen können die flüssigen Formulierungen inerte Verdünnungsmittel umfassen, die herkömmlich in der Technik verwendet werden, wie Wasser oder andere pharmazeutisch annehmbare Lösemittel, Löslichkeitsvermittler und Emulgiermittel, wie Ethano1, Isopropanol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkolhol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle (insbesondere Öl aus Baumwolle, Erdnuß, Maiskeimen, Olive, Rizinus und Sesam), Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyetliylenglycole, Fettsäureester von Sorbit und Gemische hiervon.
Neben inerten Verdünnungsmitteln können die flüssigen oralen Formulierungen auch Adjuvantien enthalten, wie Netzmittel, Emulgier- und Suspendiermttel und Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Geruchsstoffe.
Die flüssige Suspension kann zusätzlich zu den Wirkstoffen Suspendiermittel enthalten, wie ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyetliylensorbitol und -sorbitanester, mikrokristalline Zellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentoniterde, Agar-Agar und Tragacanth und Gemische hiervon.
Zusammensetzungen für die rektale oder intravaginale Verabreichung werden durch Mischen von F-III mit geeigneten nicht-reizenden Hilfsstoffen hergestellt, wie Kakaobutter, Polyethylenglycol oder jedes Zäpfchenwachs, das bei Raumtemperatur fest ist, aber bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Rektum oder Vaginalraum schmilzt, um die Wirkstoffe freizusetzen. Die Verbindungen werden im geschmolzenen Wachs gelöst, in die gewünschte Form gebracht und können in die fertige Zäpfchenformulierung aushärten.
F-III kann auch in Form von Liposomen verabreicht werden. Wie es in der Technik bekannt ist, leiten sich die Liposomen im allgemeinen von Phospholipiden oder anderen Lipidsubstanzen ab. Die Liposomeunformulierungen werden durch mono- oder multilamellar hydrierte Flüssigkristalle gebildet, die in einem wässrigen Medium dispergiert werden. Jedes nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbare und metabolisierbare Lipid, das zur Bildung von Liposomen fähig ist, kann verwendet werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen in Liposomenform können zusätzlich zu F-III Stabilisatoren, Hilfsstoffe, Konservierungsmittel und dergleichen enthalten. Die bevorzugten Lipide sind Phospholipide und Phosphatidylcholine (Lecithine), die sowohl natürlich als auch synthetisch sein können.
Verfahren zur Bildung von Liposomen sind in der Technik bekannt, wie sie beispielsweise in Prescott, Herausgeber, Methods in Cell Biology, Band XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976) Seite 33 und folgende beschrieben sind.
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind erläutert und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Formulierung 1: Gelatinekapseln
Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt:
Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung init den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
Eine Tablettenformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:
Formulierung 2: Tabletten
Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepresst.
Formulierung 3: Tabletten, die jeweils etwa 10 und 50 mg an F-III enthalten, können folgendermaßen hergestellt werden
Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepresst.
Alternativ dazu werden Tabletten, die 2,5 – 1000 mg an F-III enthalten, folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 4: Tabletten
F-III, die Stärke und die Cellulose werden durch ein 355 μl (Nr. 45 Mesh) US Sieb gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein 1400 um (Nr. 14 Mesh US) Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C – 60°C getrocknet und durch ein 1000 um (Nr. 18 Mesh US) Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein 250 um (Nr. 60 Mesh US) Sieb gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt werden.
Suspensionen, die jeweils 0,1 – 1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 5: Suspensionen
Das Arzneimittel wird durch ein 355 um (Nr. 45 Mesh US) Sieb gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen herzustellen.
Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:
Formulierung 6: Aerosol
F-III wird mit Ethano1 gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22, auf -30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.
Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 7: Zäpfchen
F-III wird durch ein 250 μm (Nr. 60 Mesh U.S.) Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 8: Intravenöse Lösung
Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Formulierung 9: Kombinationskapsel I
Formulierung 10: Kombinationskapsel II
Formulierung 11: Kombinationstablette
Die spezifische Dosis von F-III, die gemäß der Erfindung verabreicht wird, wird durch die einzelnen Umstände bestimmt, die jede Situation umgeben. Die Umstände umfassen den Verabreichungsweg, die vorhergehende medizinische Vergangenheit des Patienten, den pathologischen Zustand oder das zu behandelnde Symptom, die Schwere des zu behandelnden Zustands/Symptoms und das Alter und das Geschlecht des Patienten.
Im allgemeinen beträgt eine effektive, minimale Tagesdosis von F-III etwa 1, 5, 10, 15 oder 20 mg. Typischerweise beträgt eine effektive Maximaldosis etwa 800, 100, 60, 50 oder 40 mg. Am typischsten reicht die Dosis von 15 mg bis 60 mg. Die exakte Dosis kann gemäß dem Standardverfahren in der Medizin der "Dosistitration" des Patienten bestimmt werden, wobei anfänglich eine geringe Dosis der Verbindung verabreicht wird und die Dosis graduell erhöht wird, bis man die gewünschte therapeutische Wirkung beobachtet.
Obwohl es notwendig ist, den Patienten in Bezug auf die oben diskutierten Kombinationstherapien auf die Dosis einzustellen, sind typische Dosen für andere Wirkstoffe als F-III die folgenden: Ethinylöstrogen (0,01 – 0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05 – 0,15 mg/Tag), konjugierte Östrogenhormone (beispielsweise Premarin®, Wyeth-Ayerst, 0,3 – 2,5 mg/Tag), Medroxyprogesteron (2,5 – 10 mg/Tag), Norethylnodrel (1,0 – 10,0 mg/Tag), Nonethindron (0,5 – 2,0 mg/Tag), Aminoglutemid (250 – 1250 mg/Tag, vorzugsweise 250 mg viermal am Tag), Anastrazol (1 – 5 mg/Tag, vorzugsweise 1 mg einmal am Tag), Letrozol (2,5 – 10 mg/Tag, vorzugsweise 2,5 mg einmal am Tag), Formestan (250 – 1250 mg pro Woche, vorzugsweise 250 mg zweimal wöchentlich), Exemestan (25 – 100 mg/Tag, vorzugsweise 25 mg einmal pro Tag) Goserlin (3 – 15 mg/drei Monate, vorzugszugsweise 3,6 mg einmal alle 3 Monate) und Leuprolid (3 – 15 mg/Monat, vorzugsweise 3,75 – 7,5 mg einmal pro Monat).
F-III kann auf eine Vielzahl an Wegen verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen oder Progestin basierenden Mittels stimmt mit dein überein, das in der Technik bekannt ist. F-III alleine oder in Kombination mit Östrogen, Progestin oder einem AChE Inhibitor wird im allgemeinen in einer bequemen Formulierung verabreicht.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können Menschen und anderen Säugern (beispielsweise Hunden, Katzen, Pferden, Schweinen und dergleichen) oral, rektal, intravaginal, parenteral, topisch, bukkal, sublingual oder nasal verabreicht werden. Der Ausdruck "parenterale Verabreichung" bezieht sich hierin auf Verabreichungsverfahren, die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subkutane oder intraarterielle Injektion oder Infusion umfassen.
Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren wird F-III kontinuierlich ein- bis dreimal täglich oder so oft wie erforderlich verabreicht, um eine wirksame Menge an F-III an den Empfänger zu verabreichen. Die cyclische Therapie kann speziell bei der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle(1 bis 6 Monate) nach medizinischen Verfahren, wie Angioplastie, beschränkt sein.

Claims

Kristallines 6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)etlioxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochloridhydrat (F-III), das ein Röntgenbeugungsmuster aufweist, welches die folgenden Peaks umfaßt: 4,6 ± 0,2, 7,8 ± 0,2, 9,3 ± 0,2, 14,0 f 0,2, 17,6 ± 0,2, 20,8 f 0,2 und 24,3 ± 0,2 ° in 2 Θ, wenn es bei 25 ± 2°C und 35 ± 10 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Kupferbestrahlungsquelle (CuKα( λ = 1,54056 Å) erhalten wird.
Pharmazeutische Formulierung, die eine kristalline Verbindung nach Anspruch 1 und ein oder mehrere pharmazeutische Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1 zur Hemmung eines pathologischen Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne, prostatische Hyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, Hyperlipidämie, CNS Störungen und Alzheimersche Erkrankung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung eines pathologischen Zustands, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Uterusfibrose, Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta, Restenose, Brustkrebs, Uteruskrebs, Prostatakrebs, benigne prostatische Hyperplasie, Knochenverlust, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, Hyperlipidämie, ZNS Störungen und Alzheimersche Erkrankung.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, das die Kristallisation von 6-Hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1-yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophenhydrochlorid aus einem Gemisch aus Isopropanol und Wasser umfaßt.