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Die Erfindung betrifft die Gebiete
der pharmazeutischen und organischen Chemie und liefert neue 3-Benrylbenzofurane,
die mit Ether, Thioether, Amin, Hydrazino, Cyano oder Halogen α-substituiert
sind, die zur Behandlung der verschiedenen medizinischen Indikationen
brauchbar sind, die mit dem postmenopausalen Syndrom assoziiert
sind, wie auch der von Östrogen
abhängigen
Erkrankungen, einschließlich
Brust-, Uterus- und Gebärmutterhalskrebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Zwischenproduktverbindungen
und Verfahren, die zur Herstellung der pharmazeutisch wirksamen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, und pharmazeutische
Zusammensetzungen.
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Das J. Med. Chem. Band 32, Nr. 8
vom 8. August 1989, Washington US, Seiten 1700-1707 (Durani et al.)
beschreibt eine Strukturaktivitätsstudie
von verschiedenen Antiöstrogenen,
einschließlich
2-Phenyl-3-benzoylbenzofuranderivaten. Die Benzofuranderivate, die
hierin diskutiert werden, haben eine atypische Bindung mit dem Östrogenrezeptor.
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Die
US 5 354 861 A beschreibt eine Gruppe an 2-(Benzyl)-3-(substituiertes
Phenyl)-Benzofuranen als Antitumormittel und hypocholesterinämische Mittel.
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"Postmenopausales
Syndrom" ist ein
zur Beschreibung der verschiedenen pathologischen Zustände verwendeter
Ausdruck, die häufig
Frauen betreffen, die in die als Menopause bekannte physiologische
Umwandlung eingetreten sind oder diese vollzogen haben. Obwohl mehrere
pathologische Zustände
von der Verwendung dieses Ausdrucks umfaßt werden, sind drei Haupteffekte
des postmenopausalen Syndroms der Anlaß für die anhaltenden medizinschen
Hauptsorgen: Osteoporose, kardiovaskuläre Effekte, wie Hyperlipidämie, und östrogen-abhängiger Krebs,
insbesondere Brust- und Uteruskrebs.
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Osteoporose beschreibt eine Krankheitsgruppe,
die aus unterschiedlichen Ätiologien
hervorgeht, die aber durch den Nettoverlust an Knochenmasse und
der resultierenden Knochenfraktur pro Volumeneinheit gekennzeichnet
ist. Einer der häufigsten
Typen der Osteoporose ist der, der mit der Menopause assoziiert
ist. Die Folge dieses Verlusts an Knochenmasse ist das Versagen
des Skeletts, eine angemessene Strukturunterstützung für den Körper bereitzustellen. Die meisten
Frauen verlieren etwa 20% bis etwa 60% der Knochenmasse im Trabekelkompartiment
des Knochens innerhalb von 3 bis 6 Jahren nach dem Einstellen der
Menstruation. Dieser rapide Verlust geht im allgemeinen mit einer
Erhöhung
der Knochenresorption und Bildung einher. Jedoch ist der resorptive
Zyklus dominanter und das Ergebnis ist ein Nettoverlust an Knochenmasse.
Osteoporose ist eine bekannte und ernste Erkrankung bei postmenopausalen
Frauen.
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Es gibt alleine in den Vereinigten
Staaten geschätzte
25 Millionen Frauen, die von dieser Erkrankung betroffen sind. Die
Folgen von Osteoporose sind für
die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund
ihrer chronischen Erscheinung und dem Bedarf für eine ausgiebige und langanhaltende
Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen
verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt,
obwohl Osteooporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand
angesehen wird, daß die
Sterblichkeitsrate von 20% bis 30% mit Hüftfrakturen bei älteren Frauen
zusammenhängt.
Ein großer
Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler
Osteoporose zusammenhängen.
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Das anfälligste Gewebe im Knochen für die Wirkungen
der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen. Dieses
Gewebe wird oft als spongiöser
oder schwammiger Knochen bezeichnet und konzentriert sich insbesondere
an den Enden des Knochens (nahe den Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe
ist durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander
verbunden sind, wie auch durch das festere und dichtere cortikale
Gewebe, das die äußere Oberfläche und
den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses unter einander
verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale
Struktur und ist für
die biomechanische Stärke
der Gesamtstruktur entscheidend. Bei der postmenopausalen Osteoporose
ist es primär
die Nettoresorption und der Verlust der Trabekel, die zum Versagen
und zur Fraktur des Knochens führen.
In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen
ist es nicht überraschend,
daß die
meisten herkömmlichen
Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von
der Trabekelunterstützung
abhängen,
beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichttragenden Knochen,
wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüftfraktur,
Schenkelhalsfrakturen und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen
Osteoporose.
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Derzeit ist die einzige allgemein
akzeptierte Methode zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose
die Östrogenersatztherapie.
Obwohl die Therapie allgemein erfolgreich ist, ist die Patientenakzeptanz der
Therapie gering, da die Östrogenbehandlung
häufig
unerwünschte
Nebenwirkungen hervorruft.
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Vor der Menopause weisen die meisten
Frauen eine geringere Häufigkeit
für kardiovaskuläre Erkrankungen
auf, als gleichaltrige Männer.
Nach der Menopause erhöht
sich jedoch langsam die Rate der kardiovaskulären Erkrankung bei Frauen,
um die beim Mann beobachtete zu erreichen. Dieser Schutzverlust
wurde dem Verlust an Östrogen
und insbesondere dem Verlust der Fähigkeit des Östrogens
zugeschrieben, die Serumlipidspiegel zu regulieren. Die Art der
Fähigkeit
des Östrogens,
die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht gut verstanden, aber
Erkenntnisse deuten darauf hin, daß Östrogen die Rezeptoren für Lipid
niedriger Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin
zu entfernen. Zusätzlich scheint Östrogen
eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche
Effekte auf die kardiovaskuläre
Gesundheit zu haben.
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Es wurde in der Literatur berichtet,
daß postmenopausale
Frauen, die sich einer Östrogenersatztherapie
unterziehen, ein Zurückkehren
der Serumlipidkonzentrationen auf die des prämenopausalen Zustands erleben.
Daher scheint Östrogen
eine sinnvolle Behandlung für
diesen Zustand zu sein. Jedoch sind die Nebenwirkungen der Östrogenersatztherapie
nicht für
jede Frau akzeptabel, was die Verwendung dieser Therapie limitiert.
Eine ideale Therapie für
diesen Zustand wäre
ein Mittel, das die Serumlipidspiegel reguliert, wie dies Östrogen
tut, dem aber die Nebenwirkungen und Risiken fehlen, die mit einer Östrogentherapie
zusammenhängen.
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Der dritte pathologische Haupteffekt,
der mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängt, ist östrogenabhängiger Brustkrebs und in einem
geringeren Ausmaß östrogenabhängige Krebsarten
anderer Organe, insbesondere des Uterus. Obwohl solche Neoplasmen
nicht nur auf eine postmenopausale Frau beschränkt sind, sind sie bei der älteren,
postmenopausalen Population häufiger.
Die derzeitige Chemotherapie dieser Krebsarten basiert stark auf
der Verwendung von Antiöstrogenverbindungen,
wie beispielsweise Tamoxifen. Obwohl solche gemischten Agonist-Antagonisten
nützliche
Wirkungen bei der Behandlung dieser Krebsarten haben und die östrogenen
Nebenwirkungen in akut lebensbedrohenden Situationen tolerierbar
sind, sind sie nicht ideal. Beispielsweise können diese Mittel stimulierende
Wirkungen auf bestimmte Krebszellpopulationen im Uterus aufgrund
ihrer östrogenen
Wirkungen (Agonist) aufweisen und können daher in manchen Fällen kontraproduktiv
sein. Eine bessere Therapie für
die Behandlung dieser Krebsarten wäre ein Mittel, das eine Antiöstrogenverbindung
ist, die vernachlässigbare
oder keine Östrogenagonisteneigenschaften
auf Reproduktionsgewebe aufweist.
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Als Reaktion auf den klaren Bedarf
für neue
pharmazeutische Mittel, die zur Linderung der Symptome unter anderem
des postmenopausalen Syndroms fähig
sind, liefert die vorliegende Endung neue Verbindungen, pharmazeutische
Zusammensetzungen hiervon und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur
Behand lung des postmenopausalen Syndroms und anderer mit Ösrogen zusammenhängender
pathologischer Zustände,
wie die später
erwähnten.
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Die Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung)
ist ein altes und allgegenwärtiges
klinisches Problem, das unter einer Vielzahl an Namen bekannt ist,
einschließlich
fibroide Uteruserkrankung, Uterushypertrophie, Uterusleiomyomata,
myometrische Hypertrophie, Fibrosis ureri und fibrotische Metritis.
Im wesentlichen ist die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine
störende
Ablagerung von fibroidem Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet.
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Dieser Zustand ist eine Ursache für Dysmenorrhoe
und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache dieses Zustands
ist wenig verstanden, aber Erkenntnisse legen nahe, daß eine gestörte Reaktion
des fibroiden Gewebes auf Östrogen
vorliegt. Ein solcher Zustand wurde in Kaninchen durch die tägliche Verabreichung
von Östrogen
für 3 Monate
hervorgerufen. In Meerschweinchen wurde der Zustand durch eine tägliche Verabreichung
von Östrogen
für vier
Monate hervorgerufen. Ferner verursacht Östrogen in Ratten eine ähnliche
Hypertrophie.
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Die häufigste herkömmliche
Behandlung der Uterusfibrose umfaßt operative Verfahren die
sowohl teuer als auch manchmal ein Anlaß für Komplikationen sind, wie
die Bildung von abdominalen Adhäsionen
und Infektionen. Bei manchen Patienten ist die anfängliche
Operation nur eine vorübergehende
Behandlung und die Fibroide wachsen wieder heran. In diesen Fällen wird
eine Hysterektomie durchgeführt,
die die Fibroide effektiv beendet aber auch das Reproduktionsleben
des Patienten. Es werden auch Antagonisten für Gonadotropin-freisetzendes
Hormon verabreicht, wobei aber ihre Verwendung durch die Tatsache
beschränkt
wird, daß sie
zu Osteoporose führen
können.
Daher besteht ein Bedarf für
neue Verfahren zur Behandlung der Uterusfibrose und die Verfahren
der vorliegenden Erfindung befriedigen den Bedarf.
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Endometriose ist ein Zustand schwerer
Dysmenorrhoe, der von schweren Schmerzen, Blutung in die endometrischen
Ansammlungen oder den Peritonealraum begleitet wird und oft zur
Unfruchtbarkeit führt.
Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopisches endometriales
Wachstum zu sein, das gegenüber
einer normalen hormonalen Kontrolle gestört reagiert und in gestörten Geweben
vorkommt. Aufgrund der gestörten
Orte für
endometriales Wachstum scheint das Gewebe lokale entzündungsähnliche
Reaktionen hervorzurufen, die eine Makrophageninfiltration und eine
Kaskade von Ereignissen verursachen, die zum Hervorrufen der schmerzhaften
Reaktion führen.
Die exakte Ätiologie
dieser Erkrankung ist nicht gut verstanden und ihre Behandlung durch
eine hormonale Therapie ist unterschiedlich, wenig definiert und
durch mehrere unerwünschte
und vielleicht gefährliche
Nebenwirkungen gekennzeichnet.
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Eine der Behandlungen für diese
Erkrankung ist die Verwendung von gering dosiertem Östrogen,
um das endometrische Wachstum über
einen negativ zurückwirkenden
Effekt auf die zentrale Gonadotropinfreisetzung und die anschließende Bildung
von Östrogen
im Ovar zu unterdrücken,
wobei es manchmal notwendig ist, kontinuierlich Östrogen zu verwenden, um die
Symptome zu kontrollieren. Diese Verwendung von Östrogen kann oft zu unerwünschten
Nebenwirkungen und sogar zum Risiko für Endometriumkrebs führen.
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Eine weitere Behandlung besteht aus
der kontinuierlichen Verabreichung von Progestinen, die Amenorrhoe
induzieren und durch die Unterdrückung
der ovarialen Östrogenbildung
eine Regression des endometrialen Wachstums verursachen können. Die
Verwendung einer chronischen Progestintherapie wird oft von unerwünschten
ZNS Nebenwirkungen der Progesine begleitet und führt oft zur Unfruchtbarkeit
aufgrund der Unterdrückung
der Ovarfunktion.
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Eine dritte Behandlung besteht aus
der Verabreichung von schwachen Androgenen, die bei der Kontrolle
der Endometriose wirksam sind, jedoch rufen sie schwere maskulinisierende
Wirkungen hervor. Einige der Behandlungen für Endometriose waren bei anhaltender
Therapie auch in der Verursachung eines geringen Grades an Knochenverlust
verwickelt. Daher sind neue Methoden zur Belandlung von Endometriose
erwünscht.
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Die Proliferation der glatten Muskelzellen
spielt eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, wie Atherosklerose
und Restenose. Es wurde gezeigt, daß die vaskuläre Restenose
nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA)
eine Gewebereaktion ist, die durch eine frühe und eine späte Phase
charakterisiert ist. Die frühe
Phase, die Stunden bis Tage nach der PTCA auftritt, beruht auf einer
Thrombose mit einigen Vasospasmen, während die späte Phase
von einer exzessiven Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen
der Aorta dominiert wird. Bei dieser Erkrankung trägt die erhöhte Zellmotilität und Kolonialisierung
durch solche Muskelzellen und Makrophagen signifikant zur Pathogenese
dieser Erkrankung bei. Die exzessive Proliferation und Migration
der vaskulären
glatten Muskelzellen der Aorta kann der primäre Mechanismus für den erneuten
Verschluß der
Koronarartieren nach einer PTCA, Atherektomie, Laserangioplastie
und arteriellen Bypasstransplantationsoperation sein. Siehe "Intimal Proliferation
of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary
Artery Stenosis alter Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty", Austin et al., Journal
of the American College of Cardiology 8: 369–375 (Aug. 1985).
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Die vaskuläre Restenose bleibt eine langanhaltende
Hauptkomplikation nach einem operativen Eingriff in blockierte Arterien
durch eine perkutane, transluminale Koronarangioplastie (PTCA),
Atherektomie, Laserangioplastie und arterielle Bypassttransplantationsoperation.
Bei etwa 35% der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, tritt
innerhalb von drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren ein Wiederverschluß auf. Die
derzeitigen Strategien zur Behandlung der vaskulären Restenose umfassen einen
mechanischen Eingriff durch Vorrichtungen, wie Stents oder pharmakologische
Therapien, einschließlich
Heparin, niedermolekulares Heparin, Kumarin, Aspirin, Fischöl, Calciumantangonist,
Stereoide und Prostacyclin. Diese Strategien konnten die Wiederverschlußrate nicht
verringern und waren für
die Behandlung und Verhinderung der vaskulären Restenose ineffektiv. Siehe "Prevention of Restenosis
alter Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search
for a 'Magic Bullet"', Hermans et al., American Heart Journal
122: 171–187
(Juli 1991).
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Bei der Pathogenese der Restenose
tritt die exzessive Zellproliferation und -migration als Folge von Wachstumsfaktoren
auf, die von Zellbestandteilen im Blut und der beschädigten arteriellen
Gefäßwand gebildet
werden, wobei die Faktoren die Proliferation der glatten Muskelzellen
bei der vaskulären
Restenose vermitteln.
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Mittel, die die Proliferation und/oder
Migration von glatten Muskelzellen der Aorta hemmen, sind bei der
Behandlung und Verhinderung der Restenose brauchbar. Die vorliegende
Erfindung liefert die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren
der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen und daher als Inhibitoren
der Restenose.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Verbindungen der Formel I
worin R
1 für H, OH,
OCO(C
1-C
6 Alkyl),
OCO(Aryl), OSO
2(C
4-C
6 Alkyl), OCOO(C
1-C
6 Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C
1-C
6 Alkyl) oder OCON(C
1-C
6 Alkyl)
2 steht,
R
2 für
Aryl, C
1-C
6 Alkyl,
C
3-C
6 Cycloalkyl
oder 4-Cyclohexanol steht,
R
3 für O(CH
2)
2 oder O(CH
2)
3 steht,
R
4 und R
5 wahlweise
für CO(CH
2)
3, CO(CH
2), oder C
1-C
6 Alkyl stehen oder R
4 und
R
5 mit dem Stickstoff an den sie gebunden
sind, unter Bildung von Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, 3-Methylpyrrolidin,
3,3-Dimethylpyrrolidin, 3,4-Dimethylpyrrolidin, Azepin oder Pipecolin
kombinieren,
R
6 steht für O(C
1-C
6 Alkyl), O(Aryl),
O(C
1-C
6 Alkyl)aryl,
OCH
2CH
2-Cyano, O((C
1-C
6 Alkyl)-C
1-C
6-alkohol), OSO
2CH
3, OSO
2C
6H
4CH
3, SH, S(C
1-C
6 Alkyl), Cano, Halogen
worin jedes von R
7 und R
8 getrennt
betrachtet wird und für
H, C
1-C
6 Alkyl,
2-Hydroxyethyl oder 2-Fluorethyl steht oder sowohl R
7 als
auch R
8 mit dem Stickstoff zusammengenommen
werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin
oder Morpholin ist und wahlweise substituiert sein kann mit ein
oder zwei Methylgruppen, oder
worin jedes von R
10 und R
11 getrennt
betrachtet wird und für
H oder C
1-C
2 steht
oder sowohl R
10 als auch R
11 mit
dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der
Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise substituiert
sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, und R
12 für Wasserstoff, Methyl
oder Ethyl steht, und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ferner auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen
der Formel I enthalten, wahlweise Östrogen oder Progestin enthalten
und die Verwendung solcher Verbindungen alleine oder in Kombination
mit Östrogen
oder Progestin zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms,
insbesondere Osteoporose, kardiovaskuläre pathologische Zustände und östrogenabhängiger Krebs.
Wie hierin verwendet umfaßt
der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen
mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen
(Premarin®),
Pferdeöstrogen, 17β-Ethinylöstradiol,
und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit
progestiner Akivität,
wie beispielsweise Progesteron, Norethinodrel, Nongestrel, Megestrolacetat,
Norethindron und dergleichen.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch
zur Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung und der Endometriose
bei Frauen und der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta,
insbesondere der Restenose, bei Menschen brauchbar.
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Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung
umfaßt
Verbindungen der Formel I
worin R
1 für H, OH,
OCO(C
1-C
6 Alkyl),
OCO(Aryl), OSO
2(C
4-C
6 Alkyl), OCOO(C
1-C
6 Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C
1-C
6 Alkyl) oder OCON(C
1-C
6 Alkyl)
2 steht,
R
2 für
Aryl, C
1-C
6 Alkyl,
C
3-C
6 Cycloalkyl
oder 4-Cyclohexanol steht,
R
3 für O(CH
2)
2 oder O(CH
2)
3 steht,
R
4 und R
5 wahlweise
für CO(CH
2)
3, CO(CH
2)
4 oder C
1-C
6 Alkyl stehen
oder R
4 und R
5 mit
dem Stickstoff an den sie gebunden sind, unter Bildung von Piperidin,
Morpholin, Pyrrolidin, 3-Methylpyrrolidin, 3,3-Dimethylpyrrolidin,
3,4-Dimethylpyrrolidin, Azepin oder Pipecolin kombinieren,
R
6 steht für
O(C
1-C
6 Alkyl),
O(Aryl), O(C
1-C
6 Alkyl)aryl,
OCH
2CH
2-Cyano, O((C
1-C
6 Alkyl)-C
1-C
6-alkohol), OSO
2CH
3, OSO
2C
6H
4CH
3, SH, S(C
1-C
6 Alkyl), Halogen
worin jedes von R
7 und R
8 getrennt
betrachtet wird und für
H, C
1-C-
6 Alkyl,
2-Hydroxyethyl oder 2-Fluorethyl steht oder sowohl R
7 als
auch R
8 mit dem Stickstoff zusammengenommen
werden und einen Ring bilden, der Pyrrolidin, Piperidin, Azepin
oder Morpholin ist und wahlweise subsituiert sein kann mit ein oder
zwei Methylgruppen, oder
worin jedes von R
10 und R
11 getrennt
betrachtet wird und für
H oder C
1-C
2 steht
oder sowohl R
10 als auch R
11 mit
dem Stickstoff zusammengenommen werden und einen Ring bilden, der
Pyrrolidin, Piperidin, Azepin oder Morpholin ist und wahlweise subsituiert
sein kann mit ein oder zwei Methylgruppen, und R
12 für Wasserstoff Methyl
oder Ethyl steht, und
pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
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Allgemeine Ausdrücke, die bei der Beschreibung
der Verbindungen verwendet werden, haben die gewöhnlichen Bedeutungen. Beispielsweise
bezieht sich "Alkyl" auf gerade oder
verzweigte aliphatische Ketten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einschließlich Methyl,
Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl,
Isohexyl und dergleichen. Der Ausdruck "Aryl" bezieht
sich auf Phenyl und Phenyl, das einmal oder zweimal mit Alkyl, C1-C6 Alkoxy, Hydroxy,
Nitro oder Halogen substituiert ist. "Halogen" umfaßt Brom, Chlor, Iod und Fluor.
Der Ausdruck "(C1-C6 Alkyl)aryl" bezieht sich auf
eine Alkylkette, die mit Aryl substituiert ist. Der Ausdruck "(C1-C6 Alkyl)C1-C6-alkohol" bezieht
sich auf eine Alkylkette, die mit einem C1-C6 Alkohol substituiert ist, wie Methanol,
Ethanol, 1-Propanol und 1-Butanol.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gemäß etablierter
Verfahren hergestellt werden, wie denen, die in
US 4 133 814 A und
US 4 418 068 A beschrieben
sind. Beispiele zur Herstellung von analogen Verbindungen werden
in den oben diskutierten Patenten bereitgestellt.
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In den Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Verbindungen
ist das Ausgangsmaterial eine Verbindung der Formel II
worin R für eine Hydroxyschutzgruppe
steht, die gegenüber
einer Reduktion durch ein Reduktionsmittel resistent ist, und R
3, R
4 und R
5 wie oben definiert sind, oder ein Salz
hiervon.
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Verbindungen der Formel II sind in
der Technik bekannt.
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Im allgemeinen wird ein Vorläufer der
Formel III
durch bekannte Verfahren
hergestellt. Typischerweise werden die zwei Hydroxygruppen durch
bekannte Hydroxyschutzgruppen geschützt, die der Acylierung unter
Friedel-Crafts Bedingungen (Bildung der R Schutzgruppen der Verbindungen
der Formel II) und einer anschließenden Reduktion durch ein
starkes Reduktionsmittel standhalten. Bevorzugte Hydroxyschutzgruppen
sind C
1-C
4 Alkyl
und Methyl ist besonders bevorzugt. Siehe beispielsweise die oben
eingeführten
US Patente, J. W. Barton "Protective
Groups in Organic Chemistry",
J. G. W. McOmie (Herausgeber), Plenum Press, New York, NY, 1973,
Kapitel 2 und T. W. Green, "Protective
Groups in Organic Synthesis",
John Wiley and Sons, New York, NY, 1981, Kapitel 7.
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Nach der Herstellung des gewünschten
geschützten
Vorläufers
der Formel III wird der Vorläufer
mittels Standard-Friedel-Crafts-Bedingungen mit einer Verbindung
der Formel IV acyliert
worin
R
3,
R
4 und R
5 wie oben
definiert sind und
R für
Chlor, Brom, Iod oder eine aktivierende Estergruppe steht. Die Herstellung
der Verbindungen der Formel IV wie auch die bevorzugten Acylierungsmethoden
sind in den oben erwähnten
US Patenten beschrieben. Wenn R
4 und R
5 nicht kombiniert werden, sind C
1-C
4 Alkyl, Methyl
und Ethyl bevorzugt. Wenn R
4 und R
5 kombiniert werden, sind 1-Piperidinyl und
1-Pyrrolidinyl bevorzugt. Von diesen ist der Piperidinorest speziell
bevorzugt.
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Nach der Acylierung und damit der
Herstellung einer Verbindung der Formel II werden die Verbindungen
mit einem α-Carbinol
durch die Zugabe einer Verbindung der Formel II oder eines Salzes
hiervon zu einem geeigneten Lösemittel
und einer anschließenden
Umsetzung der Verbindung der Formel II mit einem Reduktionsmittel,
wie beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid (LAH) unter einem Inertgas,
wie Stickstoff hergestellt.
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Die Menge an Reduktionsmittel, die
in dieser Reaktion verwendet wird, ist eine Menge, die zur Reduktion
der Carbonylgruppe der Verbindung der Formel II unter Bildung einer
Carbinolverbindung der Formel IIa ausreicht,
worin R
3,
R
4 und R wie oben definiert sind, oder eines
Salzes hiervon. Im allgemeinen wird ein beliebiger Überschuß des Reduktionsmittels
pro Äquivalent
des Substrats verwendet.
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Geeignete Lösemittel umfassen jedes Lösemittel
oder Lösemittelgemisch,
das unter den Reduktionsbedingungen inert bleibt. Geeignete Lösemittel
sind unter anderem Diethylether, Dioxan und Tetrahydrofuran (THF).
Die wasserfreie Form der Lösemittel
ist bevorzugt und wasserfreies THF ist besonders bevorzugt.
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Die in diesem Schritt verwendete
Temperatur ist die, die zur Vervollständigung der Reduktionsreaktion ausreichend
ist. Umgebungstemperatur im Bereich von etwa 17°C bis etwa 25°C ist im
allgemeinen passend.
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Die Zeitspanne für diesen Schritt ist die Zeit,
die zum Ablaufen der Reaktion erforderlich ist. Typischerweise dauert
die Reaktion etwa 1 bis etwa 20 Stunden. Die optima1e Zeit kann
durch den Fortschritt der Reaktion über herkömmliche chromatographische
Techniken bestimmt werden.
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Die α-Carbinolprodukte aus dieser
Reaktion können
im wesentlichen über
das oben in Beispiel 1 beschriebene Verfahren extrahiert werden.
Die folgenden Schemata erläutern
die Herstellung der Verbindungen der Formel I.
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Das in Schema 1 gezeigte Schema kann
zur Herstellung der α-Ether-
und α-Thioetherverbindungen verwendet
werden. Im Fall der Ethersubstitutionen wird das α-Carbinol
einer Säure,
wie Trifluoressigsäure,
in einem geeigneten Lösemittel,
wie Methylenchlorid, etwa bei Raumtemperatur unterzogen. Danach
wird ein Alkoholethervorläufer
(R6aH) zugegeben und die Hydroxyschutzgruppen
werden durch eine bekannte Methodik entfernt. Im Alkoholethervorläufer steht
R6a für
O(C1-C6 Alkyl),
O(Aryl), O(C1-C6 Alkyl)aryl),
OCH2CH2-Cayano oder
O((C1-C6 Alkyl)C1-C6-alkohol).
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Für
die Thioethersubstitution wird erneut die α-Carbinolverbindung einer Säure, wie
Trifluoressigsäure,
in einem organischen Lösemittel
bei Raumtemperatur unterzogen. Danach wird ein Thiolthioethervorläufer (R6bH) zugegeben und die Hydroxyschutzgruppen
werden durch eine bekannte Methodik entfernt. Im Thiolthioethervorläufer steht
R6bH für
OSO2CH3, OSO2C6H4CH3, SH oder S(C1-C6 Alkyl).
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Das obige Schema 2 kann zur Herstellung
der Amino-, Hydrazino-, Cyano und Halogen-α-Substitutionen verwendet werden.
Im Fall der Amino- und Hydrazinosubstitution wird das α-Carbinol
einem oder mehreren Dehydratationsmitteln, wie Methansulfonylchlorid
und Triethylamin in einem Lösemittel,
wie Methylenchlorid bei etwa 0°C
unterzogen. Danach wird ein Aminovorläufer oder Hydrazinovorläufer
bei Raumtemperatur zugegeben.
Im Fall von Cyano werden erneut ein oder mehrere Dehydratationsmittel
wie oben verwendet und ein Cyanovorläufer, wie Kaliumcyanid, wird
zugegeben, wie auch ein Ligand, wie ein Kronenether, insbesondere
18-Kronen-6, um bei der Löslichkeit
zu helfen. Für
die Halogen-α-Substitution
werden erneut ein oder mehrere Dehydratationsmittel verwendet und
danach wird ein Halogenvorläufer,
wie ein Halogen-enthaltendes Salz, wie LiF, zugegeben, wie auch
ein Lösemittel,
wie ein Kronenether, insbesondere 12-Kronen-4, um bei der Löslichkeit
zu helfen.
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Andere Verbindungen werden durch
Ersetzen der 4'-
und 6-Hydroxygruppen durch einen unterschiedlichen Rest, wie -O-CO-(C
1-C
6 Alkyl), -O-CO-Ar,
worin Ar für
wahlweise substituiertes Phenyl steht, oder -O-SO
2-(C
4-C
6 Alkyl) durch
gut bekannte Verfahren hergestellt. Siehe beispielsweise obige
US 4 358 593 A .
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Wenn beispielsweise eine -O-CO-(C1-C6 Alkyl) oder
-O-CO-Ar Gruppe erwünscht
ist, wird die Dihydroxyverbindung der Formel I mit einem Mittel
umgesetzt, wie Acylchlorid, -bromid, -cyanid oder -azid oder mit einem
geeigneten Anhydrid oder gemischten Anhydrid. Die Umsetzungen werden
bequemerweise in einem basischen Lösemttel ausgeführt, wie
Pyridin, Lutidin, Chinolin oder Isochinolin oder in einem tertiären Aminlösemittel,
wie Triethylamin, Tributylamin, Methylpiperidin und dergleichen.
Die Umsetzung kann auch in einem inerten Lösemittel ausgeführt werden,
wie Ethylacetat, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Dimethoxyethan,
Acetonitril, Aceton, Methyletherketon und dergleichen, wozu mindestens
ein Äquivalent
eines Säurefängers, wie
ein tertiäres
Amin, zugegeben wurde. Falls erwünscht,
können
Acylierungskatalysatoren verwendet werden, wie 4-Dimethylaminopyridin oder 4-Pyrrolidinopyridin.
Siehe beispielsweise Haslam et al., Tetrahedron, 36: 2409–2433 (1980).
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Die Acylierungsreaktionen, die die
vorhergenannten R1 und R2 Gruppen
liefern, werden bei moderaten Temperaturen im Bereich von etwa –25°C bis etwa
100°C häufig unter
einer inerten Atmosphäre,
wie Stickstoffgas, ausgeführt.
Jedoch ist Umgebungstemperatur gewöhnlich für die Durchführung der
Reaktion ausreichend.
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Solche Acylierungen der Hydroxygruppe
können
auch durch die säurekatalysierten
Umsetzungen der geeigneten Carbonsäuren in inerten organischen-Lösemitteln
oder Hitze ausgeführt
werden. Säurekatalysatoren,
wie Schwefelsäure,
Polyphosphorsäure,
Methansulfonsäure
und dergleichen, werden verwendet.
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Die Gruppen R1 und
R2 können
auch durch die Bildung eines aktiven Esters der geeigneten Säure bereitgestellt
werden, wie die Ester, die durch die bekannten Reagenzien gebildet
werden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Acylimidazole, Nitrophenole,
Pentachlorphenol, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Siehe
beispielsweise Bull. Chem. Soc. Japan, 38: 1979 (1965) und Chem.
Ber., 788 und 2024 (1970).
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Jede der obigen Techniken, die R1 und R2 Gruppen
liefert, wird in Lösemitteln
ausgeführt,
wie sie oben beschrieben sind. Diese Techniken, die kein Säureprodukt
im Verlauf der Reaktion bilden, erfordern natürlich keine Verwendung eines
Säurefängers im
Reaktionsgemisch.
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Wenn eine Verbindung der Formel I
gewünscht
wird, worin R1 und R2 für -O-SO2-(C4-C6 Alkyl)
stehen, wird die Dihydroxyverbindung der Formel I beispielsweise
mit einem Derivat der geeigneten Sulfonsäure umgesetzt, wie einem Sulfonylchlorid,
-bromid oder Sulfonylammoniumsalz, wie dies von King und Monoir,
J. Am. Chem. Soc., 97: 2566–2567
(1975) beschrieben ist. Die Dihydroxyverbindung kann auch mit dem
geeigneten Sulfonsäureanhydrid
umgesetzt werden. Solche Reaktionen werden unter Bedingungen ausgeführt, wie
sie oben in der Diskussion der Umsetzung mit Säurehalogeniden und dergleichen
erklärt
sind.
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Ferner können dann die Verbindungen
der Formel I wie gewünscht
gebildet werden. Bestimmte Herstellungen der erfindungsgemäßen Verbindungen
sind später
beschrieben. Es können
Modifikationen der obigen Verfahren erforderlich sein, um reaktive
Funktionalitäten
von bestimmten Substituenten zu erhalten. Solche Modifikationen
sind dem Fachmann bekannt oder können
leicht von diesem nachvollzogen werden.
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Obwohl die Verbindungen der Formel
I in Form der freien Base in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden
können
ist es bevorzugt, eine pharmazeutisch annehmbare Salzform herzustellen
und zu verwenden. So bilden die in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Verbindungen primär
pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze
mit einer großen
Vielzahl an organischen und anorganischen Säuren und umfassen die physiologisch
annehmbaren Salze, die oft in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden.
Solche Salze sind auch Teil der Erfindung. Typische anorganische
Säuren,
die zur Bildung von Salzen verwendet werden, umfassen Chlorwasserstoff-,
Bromwasserstoff , Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-,
Hypophosphorsäure
und dergleichen. Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen
Mono- und Dicarbonsäuren,
phenylsubstituierten Alkansäuren,
Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen
und aromatischen Sulfonsäuren,
können
ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze
sind daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat,
Ascorbat, Benzoat, Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat,
Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybenzoat, Naphthalin-2-benzoat,
Bromid, Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat, Butin-1,4-dioat,
Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat, Citrat, Formiat,
Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat, Malat, Maleat,
Hydroxymaleat, Malonat, Mandelat, Mesylat, Nicotinat, Isonicotinat,
Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat, Monohydrogenphosphat,
Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Propiolat, Propionat,
Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat, Suberat, Sulfat,
Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat, Benzolsulfonat,
p-Brombenzolsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat, 2-Hydroxyethansulfonat,
Methansulfonat, Naphthalin-1-sulonat, Naphthalin-2-sulfonat, p-Toluolsulfonat,
Xylolsulfonat, Tartrat und dergleichen. Ein bevorzugtes Salz ist
das Hydrochloridsalz.
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Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze
werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel
I mit einer äquimolaren
oder überschüssigen Menge
einer Säure
gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen
Lösemittel
vereinigt, wie Diethylether oder Ethylacetat. Das Salz fällt normalerweise
innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus
und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel
kann durch herkömmliche
Verfahren abgezogen werden.
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Die pharmazeutisch annehmbaren Salze
weisen im allgemeinen erhöhte
Löslichkeitseigenschaften verglichen
mit der Verbindung, von der sie stammen, auf, und sind daher bei
der Formulierung als Flüssigkeiten
oder Emulsionen oft beliebter.
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Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt,
um die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter zu
erläutern.
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Zu einer Aufschlämmung aus Lithiumaluminiumhydrid
(1,1 g, 29,0 mmol) in Tetrahydrofuran (175 ml) wird bei 0°C tropfenweise
eine Lösung
des Ketons (8,00 g, 11,6 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) gegeben. Das
Gemisch wird für
1 Stunde bei 0°C
gerührt
und dann tropfenweise mit Wasser (1,1 ml), 15% (G/G) NaOH (4,4 ml)
und Wasser (1,1 ml) gestoppt. Die Aufschlämmung wird durch Celite filtriert
und unter Bildung des gewünschten
Produkts als weißer
Schaum (5,2 g, 65%) zur Trockne eingedampft (Silicagel, MeOH/CHCl3 Gradient). 1H NMR
stimmt mit der Struktur überein,
FD (MS) 687 (M-), Elementaranalyse für C40H57NO5Si2 Berechnet/Gefunden: C 69,82/70,00, H 8,35/8,36,
N 2,04/2,02.
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Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol) in CH2Cl2 (100
ml) wird bei RT Trifluoressigsäure
(0,34 ml, 4,35 mmol) gegeben. Zu dieser gerührten Lösung wird MeOH (0,17 ml, 4,35
mmol) gegeben. Die entstehende Lösung
wird über
Nacht gerührt
und dann zweimal mit NaHCO3 und zweimal
mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende braune Öl wird in
Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst
und HF/NaF (12,0 ml eines pH = 5 Puffers, der aus 7,0 g NaF, 0,21
ml 48% HF (wäßrig) und
50 ml Wasser besteht) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch
wird über
Nacht bei Rückfluß gerührt. Die
organische Lösung
wird zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Der entstehende weiße Schaum
wird durch Radialchromatographie (MeOH/ CHCl3 Gradient)
unter Bildung des gewünschten
Produkts als brauner Feststoff (1,3 g, 80%) gereinigt. Die 1H NMR stimmt mit der Struktur überein,
FD (MS) 490 (M+), Elementaranalyse für C29H31NO4S
Berechnet/Gefunden: C 71,14/71,21, H 6,38/6,43, N 2,86/3,12.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,26 ml, 3,15 mmol), EtOH
(0,19 ml, 2,13 mmol), CH2Cl2 (40
ml), Bu4NF (3,6 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet.
Das Gemisch wird viermal mit Kochsalzlösung (300 ml Portionen) gewaschen
und durch Radialchromatographie (MeOH, CHCl3/Hexan-Gradient)
gewaschen.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,0 g, 0,98 mmol), Trifluoressigsäure (0,12 ml, 1,5 mmol), n-PrOH
(0,055 ml, 1,5 mmol), CH2Cl2 (60
ml), Bu4NF (2,4 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 2,4 mmol) und CH2Cl2 (20 ml) verwendet. Das Gemisch wird durch
Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan-Gradient)
gereinigt.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), i-PrOH
(0,24 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (40
ml), Bu4NF (3,8 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 3,8 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan-Gradient)
gereinigt.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), n-BuOH
(0,29 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (40
ml), Bu4NF (3,8 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 3,8 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan-Gradient)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), BzOH
(0,32 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (40
ml), Bu4NF (4,0 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 4,0 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan-Gradient)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), 3-Hydroxypropionitril
(0,22 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (40
ml), Bu4NF (3,6 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (40 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), Ethylenglycol
(0,18 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (100
ml), Bu4NF (4,0 ml einer 1,0 M Lösung in
Tetrahydrofuran, 4,0 mmol) und Tetrahydrofuran (100 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (40 ml), MeSH
(Gas für
10 Minuten durchgeblasen) Bu4NF (4,2 ml einer
1,0 M Lösung
in Tetrahydrofuran, 4,2 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Das Verfahren von Beispiel 1 wird
mittels der Verbindung von Präparation
1 (1,45 g, 2,1 mmol), Trifluoressigsäure (0,24 ml, 3,0 mmol), CH2Cl2 (50 ml), EtSH
(Gas für
10 Minuten durchgeblasen) Bu4NF (3,6 ml einer
1,0 M Lösung
in Tetrahydrofuran, 3,6 mmol) und Tetrahydrofuran (50 ml) verwendet.
Das Gemisch wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan)
gereinigt, dann in destilliertem Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst und ausgiebig
mit Kochsalzlösung
gewaschen und getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation
1 (1,93 g, 2,8 mmol) in CH2Cl2 (100
ml) werden bei 0°C
Et3N (1,6 ml, 11,4 mmol) und Mesylchlorid
(0,26 ml, 1,23 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten
gerührt
und dann wird Me2HN Gas für 10 Minuten
durchgeblasen und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt. Das
Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO3 und
zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Material
wird in Tetrahydrofuran (40 ml) gelöst und Bu4NF
(5,8 ml einer 1,0 M Lösung
in Tetrahydrofuran, 5,8 mmol) wird bei 0°C zugegeben. Die organische
Lösung
wird zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende gelbe Öl wird durch
Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan-Gradient)
gereinigt, eingedampft und in Tetrahydrofuran (50 ml) gelöst, zweimal
mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und unter Bildung des gewünschten Produkts eingedampft.
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Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol) in CH2Cl2 (100
ml) werden bei 0°C
Et3N (1,6 ml, 11,4 mmol) und Mesylchlorid
(0,26 ml, 3,5 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten
gerührt
und dann wird MeH2N Gas für 10 Minuten
durchgeblasen und das Reaktionsgemisch wird über Nacht gerührt. Das
Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO3 und
zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende braune Öl wird in
Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst
und HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5 hergestellt aus 7,0
g NaF, 0,21 ml 48% HF (wäßrig) und
50 ml Wasser) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch
wird über
Nacht bei Rückfluß gerührt. Die
organische Lösung
zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4), filtriert
und zur Trockne eingedampft. Der entstehende weiße Schaum wird durch Radialchromatographie
(MeOH/CHCl3-Gradient) gereinigt, in EtOAc
(50 ml) gelöst
und es wird HCl Gas durchgeblasen. Der entstehende weilte Niederschlag
wird unter Bildung des gewünschten
Produkts als weißer
Feststoff filtriert (1,04 g, 65%). Die 1H
NMR stimmt mit der Struktur überein,
hochauflösende
Massenspektrometrie berechnet für
C30H35N2O3S = 503,2368, Gefunden = 503,2331.
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Das Verfahren von Beispiel 11 wird
unter Verwendung der Verbindung von Präparation 1 (0,5 g, 0,7 mol),
Et3N (0,5 ml, 3,5 mmol), Mesylchlorid (0,07
ml, 0,8 mmol) und Tetrahydrofuran (25 ml) verwendet. Zu dieser Lösung werden
bei 0°C
eine Aufschlämmung
von KCN (0,46 g, 7,9 mmol) und 18-Kronen-6 (0,93 g, 2,5 mmol) in
Tetrahydrofuran (75 ml) gegeben. Die entstehende Aufschlämmung wird
für 20
Stunden am Rückfluß erhitzt,
zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Gemisch wird
durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/Hexan
als Gradient) gereinigt.
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Zu einer Lösung der Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 3,0 mmol) in CH2Cl2 (100
ml) bei 0°C
werden Et3N (1,6 ml, 11,6 mmol) und Mesylchlorid
(0,27 ml, 3,5 mmol) gegeben. Diese Lösung wird bei 0°C für 15 Minuten
gerührt
und dann wird Pyrolidin (1,21 ml, 14,5 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch
wird über Nacht
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wird zweimal mit NaHCO3 und
zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Die entstehende rohe Verbindung
wird in Tetrahydrofaran (100 ml) gelöst und HF/NaF (12,0 ml eines
pH = 5 Puffers, hergestellt aus 7,0 g NaF, 0,21 ml 48% HF (wäßrig) und
50 ml Wasser) wird bei Umgebungstemperatur zugegeben. Dieses Gemisch
wird am Rückfluß über Nacht
gerührt.
Die organische Lösung
wird zweimal mit Kochsalzlösung
gewaschen, getrocknet (Na2SO4),
filtriert und zur Trockne eingedampft. Das entstehende Gemisch wird
durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3 als
Gradient) gereinigt und zur Trockne eingedampft. Die entstehende
Verbindung wird in EtOAc (125 ml) gelöst und HCl Gas wird für 10 min
durchgeblasen und der entstehende Niederschlag wird filtriert und im
Vakuumofen getrocknet.
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Die Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et3N (1,6 ml, 11,6
mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), Hexamethylenimin (1,6 ml,
14,5 mmol), CH2Cl2 (100
ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF
(7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und
Wasser (50 ml)) werden verwendet. Es wird durch Radialchromatographie
(MeOH/CHCl3/NH3 Gradient)
gereinigt.
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Die Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et3N (1,6 ml, 11,6
mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), 2-Ethanolamin (0,9 ml,
14,5 mmol), CH2Cl2 (100
ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF
(7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und
Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (50 ml) werden verwendet. Es
wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3 Gradient)
gereinigt.
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Die Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et3N (1,6 ml, 11,6
mmol), Mesylchlorid (0,27 ml, 3,5 mmol), 2-Fluorethylaminhydrochlorid
(1,15 ml, 11,6 mmol), CH2Cl2 (100
ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF
(7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und
Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (150 ml) werden verwendet. Es
wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/NH3 Gradient) gereinigt.
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Die Verbindung von Präparation
1 (2,0 g, 2,9 mmol), Et3N (1,6 ml, 11,6
mmol), Mesylchlorid (0,29 ml, 3,5 mmol), N-Aminopiperidin (1,6 ml,
14,5 mmol), CH2Cl2 (100
ml), HF/NaF (12,0 ml eines Puffers mit pH = 5, hergestellt aus NaF
(7,0 g), HF (12,0 ml 48% (wäßrig) und
Wasser (50 ml)) und Tetrahydrofuran (50 ml) werden verwendet. Es
wird durch Radialchromatographie (MeOH/CHCl3/NH3 Gradient) gereinigt.
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Testverfahren
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Allgemeines Präparationsverfahren
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In den Beispielen, die die Verfahren
erläutern,
wird ein postmenopausales Modell verwendet, worin die Wirkungen
der unterschiedlichen Behandlungen auf die zirkulierenden Lipide
bestimmt werden.
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Fünfundsiebzig
Tage alte weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis
225 g) erhält man
von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden
entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren
bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer
Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in
Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten
und haben für
eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und
Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen
Luftfeuchte von 40% gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden
Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
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Dosierungsplan zur Gewebeentnahme
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Nach einer Woche Akklimatisierungszeit
(daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit der Testverbindung
begonnen. 17α-Ethinylöstradiol
oder die Testverbindung werden als Suspension 1% Carboxymethylcellulose
oder gelöst
in 20% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben
ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan
werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin
(2 : 1, V : V) betäubt
und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen.
Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO2 getötet, der
Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht
des Uterus wird bestimmt.
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Cholesterinanalyse
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Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden
gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten
bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests
von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das
Cholesterin zu Cholest-4-en-3-on
und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann
mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter
Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch
bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann
aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels
einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
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Uteruseosinophilenperoxidasetest
(EPO)
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Die Uteri werden bis zur enzymatischen
Analyse bei 4°C
aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer
(pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005% Triton-X 100 enthalten sind.
Nach der Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin
(Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme
für eine
Minute bei 450 mn verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im
Uterus ist ein Zeichen für
die östrogene
Aktivität
einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden
langen Intervalls wird über
den anfänglichen,
linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
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Quelle der Verbindung
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17α-Ethinylöstradiol
erhält
man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
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Einfluß der Verbindungen der Formel
I auf das Serumcholesterin
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Die in der folgenden Tabelle 1 präsentierten
Daten zeigen die Ergebnisse, wenn Ratten mit bestimmten Verbindungen
der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
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Osteoporosetestverfahren
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Durch Befolgen des oben beschriebenen
allgemeinen Präparationsverfahrens
werden die Ratten täglich
für 35
Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung
mit Kohlendioxid am 36. Tag getötet.
Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Reduktion
der Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben
gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und
der Flüssigkeitsinhalt
wird vor der Bestimmung des Naßgewichts
entleert, um die mit der vollständigen
Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz
zu bestätigen.
Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion
auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann
in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische
Untersuchung zu ermöglichen.
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Die rechten Femuren werden entnommen
und digitalisierte Röntgenstrahlen
werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm
(NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen
Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt.
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Gemäß den obigen Verfahren werden
die erfindungsgemäßen Verbindungen
oral an Testtiere verabreicht. Ein positiver Einfluß im obigen
Test wird durch eine Hemmung des Knochenverlusts gezeigt, die durch die
Verbindungen der Formel I bewirkt wird.
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MCF-7 Proliferationstest
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MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC
HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei,
Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum
(FBS) (V/V), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10
mM}, nicht essentiellen Aminosäuren
und Rinderinsulin (1 μg/ml)
supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden
die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter
Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserm (DCC-FBS) anstelle von
10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen.
Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmedium entfernt
(Ca2+/Mg2+ freies
HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert
ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf
80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 μl (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten
(Costar 3596) gegeben und bei 37°C
in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 für 48 Stunden
inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Transfer
zu ermöglichen.
Es werden serielle Verdünnungen
der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium
hergestellt und 50 μl
werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 μl Testmedium
auf ein Endvolumen von 200 μl überführt. Nach
weiteren 48 Stunden bei 37°C
in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 werden
die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden
markiert (1 μCi/Vertiefung).
Die Kulturen werden durch Einfrieren bei –70°C für 24 Stunden gefolgt von einem
Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic
Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigscintillation
mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen.
Die Wirkung der Verbindungen der Formel I zeigt sich durch ihre
Auswirkung in diesem Test. Die im folgenden in der Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse
zeigen die ED50 für bestimmte erfindungsgemäße Verbindungen.
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DMBA-induzierte Brusttumorhemmung
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Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen
Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis,
Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten
die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenzo[a]anthrazen
(DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen
Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein
oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten
Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen
werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es
wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den
Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren
der mittleren Größe zwischen
den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und
die Testgruppen für
jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
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Die Verbindungen der Formel I werden
entweder über
intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht.
Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder
in 0,2 ml Maisöl
suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen
mit Akaziengummi und Maisöl,
wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen
Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede
Woche durch das oben erwähnte
Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden
für 3 bis
5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt
werden. Für
jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung
der mittleren Tumorfläche
berechnet.
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Uterusfibrosetestverfahren
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Test 1
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Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine
Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man eine erfindungsgemäße Verbindung.
Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und
der Verabreichungszeitraum beträgt
3 Monate.
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Die Frauen werden während des
Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung
auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
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Test 2
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Es wird dasselbe Testverfahren wie
in Test 1 verwendet, außer
daß der
Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
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Test 3
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Es wird dasselbe Verfahren wie in
Test 1 verwendet, außer
daß der
Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
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Test 4
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A. Induktion von fibroiden
Tumoren in Meerschweinchen
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Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung
der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet.
Die Tiere werden mit Östradiol
3–5 mal
pro Woche durch Injektion für
2–4 Monate
dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus
einer erfindungsgemäßen Verbindung
oder einem Träger
bestehen, werden täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen
und auf Tumorregression untersucht.
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B. Implantierung von humanem
fibroidem Uterusgewebe in Nacktmäuse
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Gewebe von humanen Leiomyomen wird
in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell
reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen
verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In einigen Fällen
werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung
kultiviert. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung
oder einem Träger
besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht und
die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression
gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entnommen, um den Status des Organs zu untersuchen.
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Test 5
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A. Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren
wird entnommen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen
gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder
Sieb gedrückt
oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension
herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum
und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart
und Abwesenheit von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach
der Behandlung mit Progestinen, GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung
und einem Träger
untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich
untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften
in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
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Die Aktivität in mindestens einem der obigen
Tests zeigt, daß die
erfindungsgemäßen Verbindungen potentiell
zur Behandlung der Uterusfibrose geeignet sind.
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Endometriosetestverfahren
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Im Test 1 und 2 können die Wirkungen einer 14
Tage und 21 Tage dauernden Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
auf das Wachstum des explantierten endometrialen Gewebes untersucht werden.
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Test 1
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Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten
vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei
Gruppen mir gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus
aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen
eine Operation durchgeführt.
Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt,
in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene
Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenält. Zusätzlich werden den Weibchen
in Gruppe 2 die Ovarien entfernt.
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Am Tag nach der Operation erhalten
die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen
für 14
Tage, während
die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer
erfindungsgemäßen Verbindung
pro Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen
getötet
und die endometrialen Emplantate, Nebennieren, der verbleibende
Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt
und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren
werden gewogen.
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Test 2
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Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten
vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei
gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet.
Am Tag des Proöstrus
wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder
Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten
und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart
zum Mesenteriumblutfluß angenäht.
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Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten
die zur Gruppe 1 gehörenden
Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die
Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer
erfindungsgemäßen Verbindung
pro Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen
getötet
und die endometrialen Explantate und Nebennieren werden entfernt und
gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen
werden aufgezeichnet.
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Test 3
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A. Operative Induktion
der Endometriose
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Autographien von endometrialem Gewebe
werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen
verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer
beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt,
um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen.
Autologes endometriales Gewebe wird im Peritoneum von 5–150 Tieren
implantiert und Östrogen
wird zur Wachstumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt.
Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird
durch Gastrolavage täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum
oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums
zu bestimmen.
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B. Implantierung von humanem
endometrialem Gewebe in Nacktmäuse
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Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird
in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen
Nacktmäusen
implantiert. Es wird exogenes Östrogen
bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In manchen Fällen
werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in
vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus einer erfindungsgemäßen Verbindung,
die durch Gastrolavage täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder
Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums
zu untersuchen.
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Test 4
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A. Das Gewebe aus humanen endometrialen
Läsionen
wird gewonnen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen
gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder
Sieb gedrückt
oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension
herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum
und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart
und Abwesenheit von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach
der Belandlung mit Progestinen, GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung
und einem Träger
untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich
untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften
in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
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Die Aktivität in mindestens einem der obigen
Tests zeigt, daß die
erfindungsgemäßen Verbindungen zur
Behandlung der Endometriose geeignet sind.
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Testverfahren zur Hemmung
der Proliferation der glatten Aortazellen /Restenose
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein
Potential zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen.
Dies kann durch Verwendung der kultivierten glatten Zellen gezeigt
werden, die von der Kaninchenaorta stammen, wobei die Proliferation
durch die Messung der DNA Synthese bestimmt wird. Die Zellen werden
durch das Explantationsverfahren erhalten, das in Ross, J. of Cell.
Bio. 50: 172 (1971) beschrieben ist. Die Zellen werden für 5 Tage
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen
werden konfluent und das Wachstum stoppt. Die Zellen werden dann
in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) überführt, das 0,5–2% Blutplättchen-armes
Plasma, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin,
1 mCi/ml 3H-Thymidin, 20 ng/ml aus Blutplättchen-stammender
Wachstumsfaktor und verschiedene Konzentrationen der vorliegenden
Verbindungen enthält.
Die Stammlösung
der Verbindungen wird in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann auf
eine geeignete Konzentration (0,01–30 mM) im obigen Testmedium
verdünnt.
Die Zellen werden dann bei 37°C
für 24
Stunden unter 5% CO2/95% Luft inkubiert.
Am Ende der 24 Stunden werden die Zellen in Methanol fixiert. Der 3H Thymidineinbau in die DNA wird dann durch
Scintillationszählung
bestimmt, wie dies in Bonin et al, Exp. Cell. Res. 181: 475–482 (1989)
beschrieben ist.
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Die Hemmung der Proliferation der
glatten Aortamuskelzellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen
wird ferner durch Bestimmung ihrer Wirkungen auf die exponentiell
wachsenden Zellen gezeigt. Es werden glatte Muskelzellen aus Kaninchenaorten
in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen in DMEM geimpft, das
10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und
100 μg/ml
Streptomycin enthält. Nach
24 Stunden haften die Zellen und das Medium wird durch DMEM ersetzt,
das 10% Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin
und gewünschte
Konzentrationen der Verbindungen enthält. Die Zellen läßt man für vier Tage
wachsen. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und die Anzahl
an Zellen in jeder Kultur wird durch Zählen mittels eines ZM-Coultercounters
bestimmt.
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Die Aktivität in den obigen Tests zeigt,
daß die
erfindungsgemäßen Verbindungen
ein Potential bei der Behandlung der Restenose aufweisen.
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Die vorliegende Erfindung liefert
auch ein Verfahren zur Linderung des postmenopausalen Syndroms bei
Frauen, das gekennzeichnet ist durch das oben erwähnte Verfahren
mittels Verbindungen der Formel I und umfaßt ferner die Verabreichung
einer wirksamen Menge eines Östrogens
oder Progestins an eine Frau. Diese Behandlungen sind besonders
bei der Behandlung der Osteoporose und der Verringerung des Serumcholesterins
brauchbar, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen Mittels
erhält,
während
die erfindungsgemäßen Verbindungen
die unerwünschen
Nebenwirkungen von Östrogen
und Progestin verhindern würden. Die
Wirkung dieser Kombinationsbehandlungen in einem der obigen postmenopausalen
Tests zeigt, daß die Kombinationsbehandlungen
für die
Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms bei Frauen brauchbar
sind.
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Es sind verschiedene Formen von Östrogen
und Progestin im Handel erhältlich.
Auf Östrogen
basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen
(0,01–0,03
mg/Tag), Mestranol (0,05–0,15
mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone,
wie Premarin® (Wyeth-Ayerst,
0,3–2,5
mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise
Medroxyprogesteron, wie Provera® (Upjohn,
2,5–10
mg/Tag), Norethylnodrel (1,0–10,0
mg/Tag) und Norethindron (0,5–2,0
mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen
basierende Verbindung ist Premarin und Norethylnodrel und Norethindron
sind bevorzugte auf Progestin basierende Mittel.
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Das Verabreichungsverfahren jedes
auf Östrogen
und Progestin basierenden Mittels stimmt mit dem überein,
was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren
werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal
täglich
verabreicht. Jedoch kann die zyklische Therapie insbesondere bei
der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller
Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose
kann die Therapie auf kurze Intervalle (1–6 Monate) nach medizinischen
Verfahren beschränkt
werden, wie der Angioplastie.
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Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "effektive Menge" eine Menge einer
Verbindung der Formel I, die zur Linderung der Symptome von verschiedenen
pathologischen Zuständen
fähig ist,
wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten
Verbindung wird natürlich
von den besonderen den Fall umgebenden Umständen bestimmt, wie beispielsweise
der verabreichten Verbindung, des Verabreichungswegs, des Zustands
des Patienten und des zu behandelnden pathologischen Zustands. Eine
typische Tagesdosis enthält
eine nicht-toxische Dosismenge von etwa 5 mg bis etwa 600 mg/Tag
einer erfindungsgemäßen Verbindung
und bevorzugter etwa 15 mg bis etwa 80 mg/Tag.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf
eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral,
rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal.
Diese Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert,
wobei die Auswahl hiervon durch den behandelnden Arzt entschieden
wird. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung
der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon
und wahlweise eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin und
einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff
hierfür
enthält.
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Die gesamten Wirkstoffe umfassen
in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung.
Mit "pharmazeutisch
annehmbar" ist gemeint,
daß der
Träger,
das Verdünnungsmittel,
die Hilfsstoffe und das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung
kompatibel und für
den Empfänger
hiervon nicht schädlich
sind.
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Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen
können
durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannten und
leicht verfügbaren
Inhaltsstoffen hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen
der Formel I mit oder ohne einer Östrogen- oder Progestinverbindung
mit herkömmlichen
Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln
oder Trägern
formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen
geformt werden. Beispiele für
Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel
und Träger,
die für
solche Formulierungen geeignet sind, beinhalten die folgenden: Füllstoffe
und Streckmittel, wie Stärke,
Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate,
Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate,
Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon, Netzmittel, wie Glycerin,
Desintegrationsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat,
Mittel zur Verzögerung
der Auflösung,
wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quarternäre Ammoniumverbindungen,
oberflächenaktive
Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, adsorptive Träger, wie
Kaolin und Bentonit und Gleitmittel, wie Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat
und feste Polyethylenglycole.
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Die Verbindungen können auch
formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung
oder als Lösungen,
die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise
auf inframuskulärem,
subkutanem oder intravenösem
Weg. Zusätzlich
sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende
Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so
gestaltet werden, daß sie
den Wirkstoff nur oder vorzugsweise an einem bestimmten physiologischen
Ort möglicherweise über eine
bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen, Umhüllungen
und Schutzmatrizes können beispielsweise
aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt werden.
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Verbindungen der Formel I werden
alleine oder in Kombination mit einem erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Mittel in einer bequemen Formulierung verabreicht. Die folgenden
Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd.
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Formulierungen
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In den folgenden Formulierungen meint "Wirkstoff' eine Verbindung
der Formel I oder ein Salz oder Solvat hiervon.
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Formulierung
1: Gelatinekapseln
Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt:
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Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung
mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
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Eine Tablettenformulierung wird mittels
der folgenden Bestandteile hergestellt:
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Formulierung
2: Tabletten
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Die Komponenten werden gemischt und
unter Bildung von Tabletten gepreßt.
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Alternativ dazu werden Tabletten,
die jeweils 2,5–1000
mg Wirkstoff enthalten, folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung
3: Tabletten
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Der Wirkstoff die Stärke und
die Cellulose werden durch ein Sieb mit 4 × 10–4 in
großen Öffnungen
(Nr. 45 Mesh US) gegeben und gründlich
gemischt. Die Lösung
des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt,
die dann durch ein Sieb mit 1,25 × 10–3 m
großen Öffnungen
(Nr. 14 Mesh US) gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden
bei 50°C–60°C getrocknet
und durch ein Sieb mit 10–3 m großen Öffnungen
(Nr. 18 Mesh US) gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das
Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein Sieb mit 2,5 × 10–4 m
großen Öffnungen
(Nr. 60 Mesh US) gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben,
die nach dem Mischen in einer Tablettemnaschine unter Bildung von
Tabletten gepreßt
werden.
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Suspensionen, die jeweils 0,1–1000 mg
Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung
4: Suspensionen
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Das Arzneimittel wird durch ein Sieb
mit 4 × 10 m großen Öffnungen
(Nr. 45 Mesh US) gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose
und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der
Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und
unter Rühren
zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, im das erforderliche
Volumen herzustellen.
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Eine Aerosollösung wird hergestellt, die
die folgenden Bestandteile enthält:
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Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt
und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und
in ein Abfüllgerät gegeben.
Die erforderliche Menge wird anschleßend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und
mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden
anschließend
am Behälter
angebracht.
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Zäpfchen
werden folgendermaßen
hergestellt:
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Der Wirkstoff wird durch ein Sieb
mit 2,5 × 10–4 in
großen Öffnungen
(Nr. 60 Mesh US) gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden
suspendiert, die vorher bei möglichst
geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in
eine Zäpfchenform
mit einer nominalen Kapazität
von 2 g gegossen und abgekühlt.
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Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
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Formulierung
7: Intravenöse
Lösung
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Die Lösung der obigen Bestandteile
wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute
intravenös
verabreicht.
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Formulierung
8: Kombinationskapsel I
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Formulierung
9: Kombinationskapsel II
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Formulierung
10: Kombinationstablette