DE69721358T2

DE69721358T2 - Benzothiophene, deren Zusammensetzungen und Verfahren

Info

Publication number: DE69721358T2
Application number: DE69721358T
Authority: DE
Inventors: George Joseph Trafalgar Cullinan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2017-02-20
Also published as: EP0791590A1; AU1959697A; US6432982B1; JP2000505453A; DE69721358D1; CA2247130A1; WO1997030985A1; ATE239009T1; ES2197301T3; EP0791590B1

Description

"Postmenopausales Syndrom" ist ein zur Beschreibung der verschiedenen pathologischen Zustände verwendeter Ausdruck, die häufig Frauen betreffen, die in die als Menopause bekannte physiologische Umwandlung eingetreten sind oder diese vollzogen haben. Obwohl mehrere pathologische Zustände von der Verwendung dieses Ausdrucks umfaßt werden, sind drei Haupteffekte des postmenopausalen Syndroms der Anlaß für die anhaltenden medizinischen Hauptsorgen: Osteoporose, kardiovaskuläre Effekte, wie Hyperlipidämie, und östrogen-abhängiger Krebs, insbesondere Brust- und Uteruskrebs.
Die US 5 484 798 A betrifft neue Benzothiophenverbindungen, die zur Behandlung der verschiedenen medizinischen Indikationen brauchbar sind, die mit dein postmenopausalen Syndrom und der fibroiden Uteruserkrankung, der Endometriose und der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta assoziiert sind.
Die WO 95/10513 A betrifft Benzothiophene und verwandte Verbindungen, die Östrogenagonisten sind, welche zur Behandlung von Syndromen und Erkrankungen brauchbar sind, die durch eine Östrogendefizienz verursacht werden.
Osteoporose beschreibt eine Krankheitsgruppe, die aus unterschiedlichen Ätiologien hervorgeht, die aber durch den Nettoverlust an Knochenmasse pro Volumeneinheit gekennzeichnet ist. Osteoporose ist eine bekannte und ernste Erkrankung bei postmenopausalen Frauen.
Es gibt alleine in den Vereinigten Staaten geschätzte 25 Milionen Frauen, die von dieser Erkrankung betroffen sind. Die Folgen von Osteoporose sind für die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund ihrer chronischen Erscheinung und dein Bedarf für eine ausgiebige und langanhaltende Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt, obwohl Osteroporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand angesehen wird, daß die Sterblichkeitsrate von 20% bis 30% mit. Hüftfrakturen bei älteren Frauen zusammenhängt. Ein großer Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler Osteoporose zusammenhängen.
Das anfälligste Gewebe im Knochen für die Wirkungen der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen. Dieses Gewebe wird oft als spongiöser oder schwammiger Knochen bezeichnet und konzentriert sich insbesondere an den Enden des Knochens (nahe den Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe ist durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander verbunden sind, wie auch durch das festere und dichtere cortikale Gewebe, das die äußere Oberfläche und den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses untereinander verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale Struktur und ist für die biomechanische Stärke der Gesamtstruktur entscheidend. Bei der postmenopausalen Osteoporose ist es primär die Nettoresorption und der Verlust der Trabekel, die zum Versagen und zur Fraktur des Knochens führen. In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen ist es nicht überraschend, daß die meisten herkömmlchien Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von der Trabekelunterstützung abhängen, beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichittragenden Knochen, wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüfüraktur, Schenkelhalsfrakturen und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen Osteoporose.
Derzeit ist die einzige allgemein akzeptierte Methode zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose die Östrogenersatztherapie. Obwohl die Therapie allgemein erfolgreich ist, ist die Patientenakzeptanz der Therapie gering, da die Östrogenbehandlung häufig unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft.
Vor der Menopause weisen die meisten Frauen eine geringere Häufigkeit für kardiovaskuläre Erkrankungen auf, als gleichaltrige Männer. Nach der Menopause erhöht sich jedoch die Rate der kardiovaskulären Erkran kung bei Frauen, um die beim Mann beobachtete zu erreichen. Dieser Schutzverlust wurde dem Verlust an Östrogen und insbesondere dem Verlust der Fähigkeit des Östrogens zugeschrieben, die Serumlipidspiegel zu regulieren. Die Art der Fähigkeit des Östrogens, die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht gut verstanden, aber Erkenntnisse deuten darauf lun, daß Östrogen die Rezeptoren für Lipid niedriger Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin zu entfernen. Zusätzlich scheint Östrogen eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche Effekte auf die kardiovaskuläre Gesundheit zu haben.
Es wurde in der Literatur berichtet, daß postmenopausale Frauen, die sich einer Östrogenersatztherapie unterziehen, ein Zurückkehren der Serumlipidkonzentrationen auf die des prämenopausalen Zustands erleben. Daher scheint Östrogen eine sinnvolle Behandlung für diesen Zustand zu sein. Jedoch sind die Nebenwirkungen der Östrogenersatztherapie nicht für jede Frau akzeptabel, was die Verwendung dieser Therapie limitiert. Eine ideale Therapie für diesen Zustand wäre ein Mittel, das die Serumlipidspiegel reguliert, wie dies Östrogen tut, dem aber die Nebenwirkungen und Risiken fehlen, die mit einer Östrogentherapie zusammenenhängen.
Der dritte pathologische Haupteffekt, der mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängt, ist östrogenabhängiger Brustkrebs und in einem geringeren Ausmaß östrogenabhängige Krebsarten anderer Organe, insbesondere des Uterus. Obwohl solche Neoplasmen nicht nur auf eine postmenopausale Frau beschränkt sind, sind sie bei der älteren, postmenopausalen Population häufiger. Die derzeitige Chemiotherapie dieser Krebsarten basiert stark auf der Verwendung von Antiöstrogenverbindungen, wie beispielsweise Tamoxifen. Obwohl solche gemischten Agonist-Antagonisten nützliche Wirkungen bei der Behandlung dieser Krebsarten haben und die östrogenen Nebenwirkungen in akut lebensbedrohenden Situationen tolerierbar sind, sind sie nicht ideal. Beispielsweise können diese Mittel stimulierende Wirkungen auf bestimmte Krebszeilpopulationen im Uterus aufgrund ihrer östrogenen Wirkungen (Agonist) aufweisen und können daher in manchen Fällen kontraproduktiv sein. Eine bessere Therapie für die Behandlung dieser Krebsarten wäre ein Mittel, das eine Antiöstrogenverbindung ist, die vernachlässigbare oder keine Östrogenagonisteneigenschaften auf Reproduktionsgewebe aufweist.
Als Reaktion auf den klaren Bedarf für neue pharmazeutische Mittel, die zur Linderung der Symptome unter anderem des postmenopausalen Syndroms fähig sind, liefert die vorliegende Erfindung neue Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur Behandlung des postmenopausalen Syndroms und anderer mit Östrogen zusammnenhängender pathologischer Zustände, wie die später erwähnten.
Die Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung) ist ein altes und allgegenwärtiges klinisches Problem, das unter einer Vielzahl an Namen bekannt ist, einschließlich fibroide Uteruserkrankung, Uterushypertrophie, Uterusleiomyomata, myometrische Hypertroplie, Fibrosis uteri und fibrotische Metritis. Im wesentlichen ist die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine störende Ablagerung von fibroidem Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet.
Dieser Zustand ist eine Ursache für Dysmenorrhoe und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache dieses Zustands ist wenig verstanden, aber Erkenntnisse legen nahe, daß eine gestörte Reaktion des fibroiden Gewebes auf Östrogen vorliegt. Ein solcher Zustand wurde in Kaninchen durch die tägliche Verabreichung von Östrogen für 3 Monate hervorgerufen. In Meerschweinchen wurde der Zustand durch eine tägliche Verabreichung von Östrogen für vier Monate hervorgerufen. Ferner verursacht Östrogen in Ratten eine ähnliche Hypertrophie.
Die häufigste herkömmliche Behandlung der Uterusfibrose umfaßt operative Verfahren die sowohl teuer als auch manchmal ein Anlaß für Komplikationen sind, wie die Bildung von abdominalen Adhäsionen und Infektionen. Bei manchen Patienten ist die anfängliche Operation nur eine vorübergehende Behandlung und die Fibroide wachsen wieder heran. In diesen Fällen wird eine Hysterektomie durchgeführt, die die Fibroide effektiv beendet aber auch das Reproduktionsleben des Patienten. Es werden auch Antagonisten für Gonadotropin-freisetzendes Hormon verabreicht, wobei aber ihre Verwendung durch die Tatsache beschränkt wird, daß sie zu Osteoporose führen können. Daher besteht ein Bedarf für neue Verfahren zur Behandlung der Uterusfibrose und die Verfahren der vorliegenden Erfindung befriedigen den Bedarf.
Endometriose ist ein Zustand schwerer Dysmenorrhoe, der von schweren Schmerzen, Blutung in die endometrischen Ausammlungen oder den Peritonealraum begleitet wird und oft zur Unfruchtbarkeit führt. Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopisches endometriales Wachstum zu sein, das gegenüber einer normalen hormonalen Kontrolle gestört reagiert und in gestörten Geweben vorkommt. Aufgrund der gestörten Orte für endometriales Wachstum scheint das Gewebe lokale entzündungsähnliche Reaktionen hervorzurufen, die eine Makrophageninfiltration und eine Kaskade von Ereignissen verursachen, die zum Hervorrufen der schmerzhaften Reaktion führen. Die exakte Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht gut verstanden und ihre Behandlung durch eine hormonale Therapie ist unterschiedlich, wenig definiert und durch mehrere unerwünschte und vielleicht gefährliche Nebenwirkungen gekennzeichnet.
Eine der Behandlungen für diese Erkrankung ist die Verwendung von gering dosiertem Östrogen, um das endometrische Wachstum über einen negativ zurückwirkenden Effekt auf die zentrale Gonadotropinfreisetzung und die anschließende Bildung von Östrogen im Ovar zu unterdrücken, wobei es manchmal notwendig ist, kontinuierlich Östrogen zu verwenden, um die Symptome zu kontrollieren. Diese Verwendung von Östrogen kann oft zu unerwünschten Nebenwirkungen und sogar zum Risiko für Endometriumkrebs führen.
Eine weitere Behandlung besteht aus der kontinunierlichen Verabreichung von Progestinen, die Amenorrhoe induzieren und durch die Unterdrückung der ovarialen Östrogenbildung eine Regression des endometrialen Wachstums verursachen können. Die Verwendung einer chronischen Progestintherapie wird oft von unenvünschten ZNS Nebenwirkungen der Progestine begleitet und führt oft zur Unfruchtbarkeit aufgrund der Unterdrückung der Ovarfunktion.
Eine dritte Behandlung besteht aus der Verabreichung von schwachen Androgenen, die bei der Kontrolle der Endometriose wirksam sind, jedoch rufen sie schwere maskulinisierende Wirkungen hervor. Einige der Behandlungen für Endometriose waren bei anhaltender Therapie auch in der Verursachung eines geringen Grades an Knochenverlust verwickelt. Daher sind neue Methoden zur Behandlung von Endometriose erwünscht.
Die Proliferation der glatten Muskelzellen spielt eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose. Es wurde gezeigt, daß die vaskuläre Restenose nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA) eine Gewebereaktion ist, die durch eine frühe und eine späte Phase charikterisiert ist. Die frühe Phase, die Stunden bis Tage nach der PTCA auftritt, beruht auf einer Thrombose mit einigen Vasospasmen, während die späte Phase von einer exzessiven Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen der Aorta dominiert wird. Bei dieser Erkrankung trägt die erhöhte Zellmotilität und Kolonialisierung durch solche Muskelzellen und Makrophagen signifikant zur Pathogenese dieser Erkrankung bei. Die exzessive Proliferation und Migration der vaskulären glatten Muskelzellen der Aorta kann der primäre Mechanismus für den erneuten Verschluß der Koronarartieren nach einer PTCA, Laserangioplastie und arteriellen Bypasstransplantationsoperation sein. Siehe "Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis alter Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty". Austin et al., Journal of the American College of Cardiolagy 8: 369–375 (Aug. 1985).
Die vaskuläre Restenose bleibt eine langanhaltende Huptkomplikation nach einem operativen Eingriff in blockierte Arterien durch eine (PTCA), Atherektomie, Laserangioplastie und arterielle Bypassttransplantationsoperation. Bei etwa 35% der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, tritt innerhalb von drei bis sechs Monaten nach dein Verfahren ein Wiederverschluß auf. Die derzeitigen Strategien zur Behandlung der vaskulären Restenose umfassen einen mechanischen Eingriff durch Vorrichtungen, wie Agentien oder pharmakologische Therapien, einschließlich Heparin, niedermolekulares Heparin, Kumarin, Aspirin, Fischöl, Calciumantagonist, Stereoide und Prostacyclin. Diese Strategien konnten die Wiederverschlußrate nicht verringern und waren für die Behandlung und Verhinderung der vaskulären Restenose ineffektiv. Siehe "Prevention of Restenosis alter Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a'Magic Bullet"', Hermans et al., American Heart Journal 122: 171–187 (Juli 1991).
Bei der Pathogenese der Restenose tritt die exzessive Zellproliferation und -migration als Folge von Wachstumsfaktoren auf, die von Zellbestandteilen im Blut und der beschädigten arteriellen Gefäßwand gebildet werden, wobei die Faktoren die Proliferation der glatten Muskelzellen bei der vaskulären Restenose vermitteln.
Mittel, die die Proliferation und/oder Migration von glatten Muskelzellen der Aorta hemmen, sind bei der Belandlung und Verhinderung der Restenose brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen und daher als Inhibitoren der Restenose.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Endung liefert neue Benzotthiophene der Formel (I):
worin
R¹ für -H, -OH, -O-C₁-C₄ Alkyl, -O-C(O)-C₁-C₆ Alkyl, -OSO₂-C₄-C₆ Alkyl oder -OC(O)Ar steht, worin Ar für wahlweise substituiertes Phenyl steht,
R² für -H, -OH, -O-C₁-C₄ Alkyl, -O-C(O)-C₁-C₆ Alkyl, -OSO₂-C₄-C₆ Alkyl oder -OC(O)Ar, worin Ar für wahlweise substituiertes Phenyl steht, -Cl oder -Br steht,
R³ für -H, -F, -Cl, -C₁-C₄ Alkyl, -CN oder -O(C₁-C₃ Alkyl) steht,
R⁴ für -H, -F, -Cl, -C₁-C₄ Alkyl, -CN oder -O(C₁-C₃ Alkyl) steht,
R⁵ für -H, -F, -Cl, -C₁-C₄ Alkyl oder -O(C₁-C₃ Alkyl) steht,
R⁶ für -H, -F, -Cl, -C₁-C₄ Alkyl oder -O(C₁-C₃ Alkyl) steht,
mit der Maßgabe, daß R₃, R₄, R₅ und R₆nicht alle für Wasserstoff stehen können,
Y für -CO-, -CHOH- und -CH₂- steht,
R⁷ und R⁸ unabhängig für C₁-C₄ Alkyl stehen oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, 1-Piperidinyl. 1-Pyrrolidinyl, 1-Hexamethylenimino oder Morpholino bilden. oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung, worin R₁ und R₂ jeweils für Hydroxy stehen, R₅ und R₆ für Wasserstoff stehen, R₃ und R₄ jeweils für Methyl stehen und R₇ und R₈ einen Piperidinylrest bilden, nämlich [2-(4-Hydroyphenyl)-6-hydroybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3,5-dimethylphenyl]methanon und dessen Hydrochloridsalz.
Eine am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung, worin R₁ und R₂ jeweils für Hydroxy stehen, R₄, R₅ und R₆ jeweils für Wasserstoff stehen, R₃ für Fluor steht und R₇ und R₈ einen Piperidinylrest bilden, nämlich [2-(4-Hydroyphenyl)-6-hydroaybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-fluorphenyl]methanon und dessen Hydrochloridsalz.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel I und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen Träger enthalten.
Im Umfang der Verbindungen der Formel I befinden sich Isomere mit asymmetrischen Zentren und cis/trans-Isomere, die mit Alkenylresten assoziiert sind.
Die vorliegende Endung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I enthalten, wahlweise Östrogen oder Progestin enthalten und die Verwendung solcher Verbindungen alleine oder in Kombination mit Östrogen oder Progestin zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms, insbesondere Osteoporose, kardiovaskuläre pathologische Zustände und östrogenabhängiger Krebs. Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin®), Pferdeöstrogen, 17α-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit progestiner Aktivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethinodrel, Norgestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung einer neuen Reihe an Benzo[b]thiophenen, die in Formel I gezeigt sind. Diese Verbindungen sind zur Hemmung von pathologischen Zuständen brauchbar, die mit dein postmenopausalen Syndrom zusammenhängen.
Der Ausdruck "hemmen" umfaßt die allgemein anerkannte Bedeutung, die die Verhinderung, Vermeidung, Unterdrückung und Verlangsamung, das Anhalten oder die Umkehr des Fortschreitens, der Schwere oder eines entstehenden Symptoms umfaßt. Daher beinhaltet das vorliegende Verfahren die medizinisch therapeutische und/oder prophylaktische Verabreichung, wie dies geeignet ist.
Allgemeine Ausdrücke, die bei der Beschreibung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, haben die gewöhnlichen Bedeutungen. Beispielsweise bezieht sich "C₁-C₄ Alkyl" auf gerade oder verzweigte aliphatische Ketten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen einschließlich Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl und dergleichen und "C₁-C₆ Alkyl" umfaßt die in der Definition von "C₁-C₄ Alkyl" enthaltenen Gruppen zusätzlich zu Gruppen, wie Pentyl, Isopentyl, Hexyl und dergleichen. Die Ausnahme z dieser Terminologie ist der Fall der Sulfonylderivate, das heißt "-O-SO₂-(C₄-C₆ Alkyl)", worin er nur n-Butyl, n-Pentyl oder n-Hexyl meint.
Der Ausdruck "substituiertes Phenyl" bezieht sich auf eine Phenylgruppe mit einem oder mehreren Substituenten ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus C₁-C₄ Alkyl. C₁-C₃ Alkoxy, Hydroxy, Nitro, Chlor, Fluor oder Tri(Chlor oder Fluor)methyl. "C₁-C₃ Alkoxy" steht für eine C₁-C₃ Alkylgruppe, die über eine Sauerstoffbrücke gebunden ist, beispielsweise Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy und Isopropoxy.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, das heißt die Verbindungen der Formel I, können im wesentlichen hergestellt werden, wie dies in US 4 133 814 A vom 9. Januar 1979, US 4 358 593 A vom 9. November 1982, US 4 418 068 A vom 29. November 1983, US 5 393 763 A vom 28. Februar 1995 und US 5 482 949 A vom 9. Januar 1996 beschrieben ist.
Kurz gesagt können die Verbindungen der Formel II an der Position 3 des Benzothiophenkerns mit aktivierten Carboaylresten der Verbindungen der Formel III unter Friedel-Crafts Standardbedingungen acyliert werden. Im allgemeinen wären die Acylierungsbedingungen die Verwendung einer Lewissäure, wie AlCl₃, BF₃ und dergleichen in einem geeigneten Lösemittel, wie einem halogenierten Kohlenwasserstoff bei Temperaturen von 0–100°C. Die aktivierten Carboylreste der Verbindungen der Formel III sind Acylhalogenide, gemischte Anhydride und dergleichen, bevorzugt wäre das Säurechlorid. Die Verbindungen der Formel II können gemäß den in US 4 133 814 A beschriebenen Verfahren lergestellt werden. Es ist für den Fachmann der organischen Chemie verständlich, daß die Liganden R₁ und R₂ mit den Acylierungsbedingungen zur Bildung der Verbindungen der Formel I kompatibel sein müssen und daher wäre ein bevorzugtes Zwischenprodukt eines, worin R₁ und R₂ für -OMe stehen. Die aktivierten Carboxyle der Verbindungen der Formel III können aus im Handel erhältlichen Carbonsäuren oder in der Technik bekannten Verfahren mit Mitteln hergestellt werden, wie dein Thionylchlorid
worin R₁ und R₂die vorherigen Bedeutungen haben

und R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ und R₈ ihre vorherigen Bedeutungen haben und X für einen aktivierenden Rest steht, wie -Cl, Br, OAc und dergleichen.
Andere Verbindungen der Formel I, worin R₁ und R₂ für Ester oder Sulfonate stehen, können durch Demethylierung der Dimethoxyverbindung mit AlCl₃, BCl₃ usw. und einer Acylierung mit dem geeigneten Acyl- oder Sulfonylrest abgeleitet werden.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, das zur Herstellung der bevorzugten Verbindungen der Erfindung besonders bevorzugt ist, wäre die Acylierung der Position 3 einer Verbindung der Formel II mit einer Verbindung der Formel IV mittels Friedel-Crafts Standardbedingungen unter Bildung der Verbindung der Formel V. Die 4-OMe-Gruppe des Benzoylrests kann selektiv mittels NaSEt unter Bildung der Verbindungen der Formel VI entfernt werden. Die Verbindungen der Formel VI können mit den Verbindungen der Formel VII mit einer anorganischen Base, wie K₂CO₃, Cs₂CO₃ und dergleichen unter Bildung der schließlichen Verbindungen der Formel I O-alkyliert werden
worin R₃, R₄, R₅ und ihre vorherigen Bedeutungen haben
worin R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ ihre vorherigen Bedeutungen haben
worin R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ ihre vorherigen Bedeutungen haben
worin R₇ und R₈ ihre vorherigen Bedeutungen haben.
Andere Verbindungen der Formel I, worin Y für ein Carbinol oder Methylen steht, können auf folgende Weise hergestellt werden.
Die Reduktion des Carbonyls zum Carbinol und weiter zum Methylen kann schrittweise oder vom Carbonyl zum Methylen in einem einzigen Schritt erreicht werden.
Kurz gesagt kann die Carbonylverbindung zum Carbinol mit LiAlH₄, NaBH₄ oder dergleichen in geeigneten Lösemitteln, wie Chlorkohlenstoffen, THF, Ether usw. bei Temperaturen von 0–30°C reduziert werden. Das Carbinol kann zum Methylen mit Silanen, beispielsweise Triethylsilan, in geeigneten Lösemitteln, wie Methylenchlorid oder THF mit einer starken Säure, wie Trifluoressigsäure, bei Umgebungstemperaturen reduziert werden. Alternativ dazu kann die Carbonylverbindung direkt mittels LiAlH₄ in einem hochsiedenen Lösemittel, wie Propylbenzol bei Rückflußtemperatur zum Methylen reduziert werden.
Herstellungen von Proben sind im folgenden angegeben, sind für Erläuterungszwecke gedacht und sollen in keiner Weise beschränkend wirken.
Präparation I
[2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2(1-piperidinyl)ethox]-3-fluorphenyl]methanonhydrochlorid
Es werden 960 mg (1,85 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-fluorphenyl]methanon in 30 ml Methylenchlorid gelöst und auf 0°C gekühlt und 2,5 g (18,5 mmol) an AlCl₃ werden in Portionen über einen 10 Minuten Intervall zugegeben. Zu diesem Reaktionsgemisch werden 2,75 ml (37 mmol) EtSH gegeben und die Reaktion wird für 15 Minuten gerührt. Die Reaktion wird am Rückfluß erhitzt und kann für 1,5 Stunden weiterlaufen. Die Reaktion kann sich abkühlen und wird mit 100 ml Eiswasser gestoppt. Das rohe Produkt fällt aus und wird durch Dekantieren der Flüßigkeiten gesammelt. Der Feststoff wird in 50 ml MeOH gelöst und auf einer Silicagelsäule mit einem Lösemittel aus MeOH-CHCl₃ (1 : 9) eluiert. Die geeigneten Fraktionen werden durch TLC bestimmt und vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml MeOH gelöst und durch Zugabe von MeOH-HCl Lösung gefällt, bis kein Niederschlag mehr gebildet wird. Die Flüßigkeit wird abdekantiert und das Salz wird in einer minimalen Menge an MeOH rückgelöst. Dann wird Ether zugegeben und das Produkt kann bei –20°C kristallisieren. Dies ergibt 470 mg der Titelverbindung.
¹H NMR: in Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 492 (M-HCl) FD
Exakte MS: Berechnet: 492,1645. Gefunden: 492,1647. C₂₈H₂₇FNO₄S
Präparation 2
[2-(4-Metoxynhenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-fluorphenyl]methanon
Es werden 900 mg (2,20 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b][thien-3-yl][3-fluor-4-hydroayphenyl]methanon in 12 ml DMF gelöst und 810 mg (4,4 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidinhydrochlorid werden zugegeben. Zu dein Reaktionsgemisch werden 3,3 g (10 mmol) an Cs₂CO₃ gegeben und am Rückfluß für eine Stunde erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Entfernung der Feststoffe filtriert. Die Lösemittel werden durch Eindampung entfernt und der Rückstand wird auf einer Silicagelsäule mit einem linearen Gradienten eluiert, der mit CHCl₃ beginnt und mit MeOH-CHCl₃ (1 : 19) endet. Die gewünschten Fraktionen werden durch TLC bestimmt, vereinigt und zu einem Feststoff eingedampft. Dies ergibt 960 mg der Titelverbindung als hellbraunen amorphen Feststoff.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 3
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][3-fluor-4-hydroxyphenyl]methanon
Es werden 500 mg (1,2 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][3-fluor-4-methoxyphenyl]methanon in 6 ml DMF gelöst und 200 mg (2,4 mmol) an NaSEt werden zugegeben. Die Reaktion wird unter einer Stickstoffatmosphäre für 1,5 Stunden auf 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird schnell über eine Silicagelsäule filtriert, die mit CHCl₃ unter Entfernung der Feststoffe und Austausch des Lösemittels eluiert wird. Der Effluent aus der Säule wird zu einem Feststoff eingedampft und in EtOAc rückgelöst. Die EtOAc Lösung wird auf einer Silicagelsäule mit einem linearen Gradienten eluiert, der mit EtOAc-Hexan (3 : 7) beginnt und mit EtOAc-Hexan (1 : 1) endet. Die geeigneten Fraktionen werden durch TLC bestimmt, vereinigt und zur Trockne eingedampft. Dies ergibt 200 mg der Titelverbindung als hellbraunen amorphen Feststoff.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 4
12-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][3-fluor-4-methoxyphenyl]methanon
Es werden 5 g (29,4 mmol) an 3-Fluor-4-methoxybenzoesäure in 25 ml Thionylchlorid und 3 Tropfen DMF gelöst und am Ruckfluß für eine Stunde erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird zu einem Öl eingedampft und ohne weitere Retinigung verwendet. Das Säurechlorid wird zu 50 ml Dichlormethan und 5,3 g (19,5 mmol) an 2-(4-Methoxyphenyn-6-methoxybenzo[b]thiophen gegeben. Es werden vier Portionen an AlCl₃ (gesamt 16 g (120 mmol)) über 30 Minuten zugegeben und das Reaktionsgemisch wird für einige Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Reaktion wird durch Gießen in Eiswasser gestoppt und die organische Phase wird abgetrennt. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und durch Filtration durch wasserfreies Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das rohe Produkt wird über eine Silicagelsäure (HPLC) mit einem linearen Gradienten eluiert, der mit EtOAc – Hexan (1 : 19) beginnt und mit EtOAc – Hexan (1 : 1) endet. Die geeigneten Fraktionen werden durch TLC bestimmt, vereinigt und zu einem Feststoff eingedampft. Das Produkt wird aus Aceton – Ether kristallisiert. Dies ergibt 1 g der Titelverbinduug.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
Präparation 5
(2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroabenzo[b]thien-3-yl][4-(2-(1-pigeridinyl)ethoxy]-3,5-dimethylphenyllmethanonhydrochlorid
Es werden 920 mg der Titelverbindung aus 2,9 g (5,5 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoaybenzo-[b]then-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoay]-3,5-dimethylphenylmethanon in einer ähnlichen Weise zu der von Präparation 1, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmnung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 502 (M-HCl) FD
Exkte MS: Berechnet: 502,2052. Gefunden: 502,2045. C₃₀H₃₂NO₄S
Präparation 6
[2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-(2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-t-butyl-5-methylphenylmethanonhydrochlorid
Es werden 620 mg der Titelverbindung aus 1,3 g (2,3 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo-[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-t-butyl-5-methylphenylmethanon in einer ähnlichen Weise zu der von Präparation 1, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 543 (M-HCl) FD
Exakte MS: Berechnet: 544,2522. Gefunden: 544,2518. C₃₃H₃₈NO₄S
Präparation 7
(2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-chlorphenyl]methanonhydrochlorid
Es werden 700 mg der Titelverbindung aus 1,3 g (2,42 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoaybenzo-[b]then-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-chlorphenylmethanon in einer ähnlichen Weise zu der von Präparation 1, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 508 (M-HCl) FD
Exakte MS: Berechnet: 508,1349. Gefunden: 508,1360. C₂₈H₂₇ClNO₄S
EA: Berechnet: C 61,77, H 5,00, N 2,57. Gefunden: C 61,09, H 5,47. N 2,34. C₂₈H₂₆ClNO₄S- HCl
Prägaration 8
[2-(4-Hvdroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxyl-2-chlorphenyl]methanonhydrochlorid
Die Titelverbindung wird aus [2-(4-Methoyphenyl)-6-methoybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)-ethoy]-2-chlorphenyl]methanon in einer ähnlichen Weise zu der von Präparation 1, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 508 (M-HCl) FD
Exakte MS: Berechnet 508,1349. Gefunden: 508,1355. C₂₈H₂₇ClNO₄S
Präparation 9
[2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxyl]-3-cyanophnyl]methanonhydrochlorid
Die Titelverbindung wird durch Lösen von 1,6 g (3,04 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoybenzo-[b]then-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-cyanophenyhnethanonhydrochlorid in 20 ml Dichlorethan hergestellt. Es werden 2,1 ml kondensiertes BCl₃ zugegeben und in einem Gefäß bei Raumtemperatur verschlossen. Die Reaktion kann für sechzehn Stunden fortgesetzt werden. Die Reaktion wird durch Gießen auf Eis gestoppt. Das rohe Produkt wird in der organischen Phase gesammelt und zu einem Feststoff eingedampft. Das Produkt wird weiter durch Chromatographie gereinigt und das Hydrochlorid wird wie in Präparation 1 hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
MS: m/e = 499 (M-HCl) FD
Exakte MS: Berechnet: 499,1629. Gefunden: 499,1703. C₂₉H₂₇N₂O₄S
Präparation 10
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-1 2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-cyanophenyl]methanonhydrochlorid
Es werden 1,6 g der Titelverbindung aus 1,45 g (3,49 mmol) an [2-(4-Methoyphenyl)-6-methoxybenzo-[b]then-3-yl][3-cyano-4-hydroxyphenyl]methanon, 1,3 g (7 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidin und 4,9 g (15 mmol) an Cs₂CO₃ auf ähnliche Weise zu der von Präparation 2 hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 11
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][3-cyano-4-hydroxyphenyl]methanon
Es werden 1,45 g der Titelverbindung aus 1,5 g (3.49 mmol) an [2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo-[b]then-3-yl][3-cyano-4-methoxyphenyl]methanon und 590 mg (6,98 mmolan NaSEt auf ähnliche Weise zu der von Präparation 3 hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 12
[2-(4-Methoxyphhenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][3-cyano-4-methoxyphenyl]methanon
Es werden 1,8 g der Titelverbindung aus 3,9 g (3,9 mmol) an 3-Cyano-4-methoybenzoesäure (umgewandelt in das Säurrechlorid mit 30 ml SOCl₂ und drei Tropfen DMF), 6 g (22 mmol) an 2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thiophen und 14,7 g (110 mmol) an AlCl₃, auf ähnliche Weise zu der von Präparation 4 hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
MS: m/e = 429 (M) FD
EA: Berechnet: C 69,91, H 4,46, N 3,26. Gefunden: C 69,65, H 4,47, N 3,27. C₂₅H₁₉NO₄S
Präparation 13
[2-(4-Methoxyphenyl]-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxyl-3-chlorphenyl]methanon
Es werden 2,6 g (8,12 mmol) an 4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]-3-chlorbenzoesäurehydrochlorid in 25 ml Dichlormethan gelöst und 50 ml SOCl₂ mit drei Tropfen an DMF werden zugegeben. Die Reaktion wird für 16 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockne eingedampft und dann in 50 ml Dichlormethan rückgelöst. Es werden 2,2 g (8,12 mmol) an 2-(4-Methoyphenyl)-methoxybenzo[b]thiophen zu der Lösung gegeben und auf 0°C gekühlt. Es werden 7,6 g (56,8 mmol) an AlCl₃ in drei Portionen zu dem Reaktionsgemisch gegeben und es kann für 1,5 Stunden weiterreagieren. Die Reaktion wird durch Gießen in Eis gestoppt. Die organische Phase wird getrennt und mit Na₂CO₃ Lösung und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird durch Filtration durch Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Das rohe Material wird auf einer Silicagelsäule (HPLC) mit einem linearen Gradienten chromatographiert, der mit CHCl₃ beginnt und mit MeOH-CHCl₃ (1 : 9) endet. Die gewünschten Fraktionen werden durch TLC bestimmt, vereinigt und zur Trockne eingedampft. Dies ergibt 1,3 g der Titelverbindung als gelben amorphen Schaum.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 14
4-(2-(1-Piperidinyl)ethoxyl-3-chlorbenzoesäure
Es werden 7,1 g (35,4 mmol) an 3-Chlor-4-hydroxyethylbenzoat in 250 ml DMF gelöst und 13,1 g (71 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidinhydrochlorid und 52 g (160 mmol) an Cs₂CO₃ werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für vier Stunden am Rückfluß erhitzt. Die Reaktion kann abkühlen und wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 80 ml MeOH gelöst und 40 ml an 1N NaOH werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für zwei Stundenam Ruckfluß erhitzt und aus 0°C abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5N HCl angesäuert und bei –20°C für sechzehn Stunden stehen gelassen. Das Produkt kristallisiert aus und wird abfiltriert. Dies ergibt 26 g der Titelverbindung als weißes Pulver.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 15
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-2-chlorphenyl][methanon
Es werden 2,5 g (7,81 mmol) an 2-Chlor-4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]benzoesäurehydrochlorid in 50 ml Dichlormethan gelöst und 25 ml an SOCl₂ und fünf Tropfen an DMF werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für sechzehn Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wird zur Trockne eingedampft und zweimal mit CCl₄ behandelt.
Es werden 2 g (7,5 mmol) an 2-(4-Methoyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thiophen in 120 ml Dichlormethan gelöst und das Säurechlorid (oben) wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf 0°C gekühlt und 4,2 g (31,24 mmol) an AlCl₃ werden in mehreren Portionen über einen Zeitraum von zehn Minuten zugegeben. Die Reaktion kann für mehrere Stunden bei 0°C fortfahren. Die Reaktion wird durch Gießen auf Eis gestoppt und die organische Phase wird abgetrennt. Die organische Phase wird mit gesättigter NaHCO₃ Lösung und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Das rohe Produkt wird auf einer Silicagelsäule unter Elution mit einem linearen Gradienten eluiert, der mit CHCl₃ beginnt und mit CHCl₃-MeOH (19 : 1) endet. Dies ergibt 2,91 g der Titelverbindung als gelbes Öl.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur
Präparation 16
2-Chlor-4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]benzoesäurehydrochlorid
Es werden 6 g der Titelverbindung als weißes kristallines Pulver aus 5 g (26,8 mmol) an 2-Chlor-4-hydroxymethylbenzoat, 9,9 g (53,6 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidinhydrochlorid und 30 g (108 mmol) an Cs₂CO₃ auf eine ähnliche Weise zu der in Präparation 14 verwendeten, hergestellt.
Präparation 17
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl]][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3,5-dimethylphenyl]methanon
Es werden 2,9 g der Titelverbindung aus 2 g an 2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxbenz[b]thiophen und 4-[2-(1-Piμeridinyl)ethoxy]-3,5-dimethylbenzoesäure auf eine ähnliche Weise zu der in Präparation 15 verwendeten, hergestellt.
Präparation 18
4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]-3,5-dimethylbenzoesäure
Die Titelverbindung wird aus 5 g (25,7 mmol) an 3,5-Dimethyl-4-hydroxyethylbenzoat, 18,4 g (100 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidinhydrochlorid und 49 g (150 mmol) an Cs₂CO₃ auf eine ähnliche Weise zu der in Präparation 14 verwendeten, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 19
[2-(4-Methoxyphenyl)-6-methoxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-3-t-butyl-5-methylphenyl]methanon
Es werden 1,3 g der Titelverbindung (als hellbraunes amorphes Pulver) aus 2 g (5,62 mmol) an 3-Methyl-4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-5-t-butylbenzoesäure, 1,5 g (5,6 mmol) an 2-(4-Methoxyphenyl)-6-methxoybenzo[b]thiophen und 5,25 g (39,3 mmol) an AlCl₃ auf eine ähnliche Weise zu der in Präparation 15 verwendeten, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Präparation 20
3-Methyl-4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]-5-t-butylbenzoesäure
Es werden 4,25 g der Titelverbindung (als weißer kristalliner Feststoff aus 4 g (16,9 mmol) an 3-Methyl-4-hydroxy-5-t-butylethylbenzoat, 9,33 g (50,7 mmol) an 1-(2-Chlorethyl)piperidinhydrochlorid und 27,7 g (85 mmol) an Cs₂CO₃ auf ähnliche Weise zu der in Präparation 14 beschriebenen, hergestellt.
¹H NMR: In Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Struktur.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden mit einer großen Vielzahl an organischen und anorganischen Säuren und Basen pharmazeutisch annelumbare Säure- und Basenadditionssalze und beinhalten die physiologisch annehmbaren Salze, die oft in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden. Solche Salze sind ebenfalls Teil der Erfindung. Typische anorganische Säuren, die zur Bildung solcher Salze verwendet werden, sind unter anderem Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-, Hypophosphorsäure und dergleichen. Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, phenylsubsütuierten Alkansäuren, Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäuren, können ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat, Ascorbat, Benzoat Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybenzoat, Naphthalin-2-benzoat, Bromid, Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat, Citrat, Formiat, Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat, Malat, Maleat, Hydroaxymaleat, Malonat, Mandelat, Mesylat, Nicotinat, Isonicotinat, Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Propiolat, Propionat, Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat, Suberat, Sulfat, Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat, Benzolsulfonat, p-Bromphenylsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat, 2-Hydroxyethansulfonat, Methansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, p-Toluolsulfonat, Xylolsulfonat, Tartrat und dergleichen. Ein bevorzugtes Salz ist das Hydrochloridsalz.
Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge einer Säure gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether oder Benzol. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Basen, die herkömmlich zur Bildung von Salzen verwendet werden, beinhalten Ammomiumhydroxid und Alkali- und Erdalkalimetallhydroxide, Carbonate und Bicarbonate hiervon, wie auch aliphatische und aromatische Amine, aliphatische Diamine und Hydroxalkylamine. Basen, die zur Herstellung der Additionssalze besonders geeignet sind, sind unter anderem Ammoniuhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Caliumhydroxid, Methylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Cyclohexylamin und Ethanolamin.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze weisen im allgemeinen erhöhte Löslichkeitseigenschaften verglichen mit der Verbindung, von der sie stammen, auf und sind daher bei der Formulieruug als Flüssigkeiten oder Emulsionen oft beliebter.
Pharmazeutische Formulierungen können durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen mit herkömmlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen geformt werden. Beispiele für Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Träger, die für solche Formulierungen geeignet sind, beinhalten die folgenden: Füllstoffe und Streckmittel, wie Stärke, Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate, Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon, Befeuchtungsmittel, wie Glycerin, Zerfallshilfsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat, Mittel zur Verzögerung der Auflösung, wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quarternäre Ammoniumverbindungen, oberflächenaktive Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, adsorptive Träger, wie Kaolin und Bentonit und Gleitmittel, wie Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglycole.
Die Verbindungen können auch formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung oder als Lösungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise intramuskulärem, subkutanem oder intravenösem Weg. Zusätzlich sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so gestaltet werden, daß sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise in einen bestimmten Teil des Verdauungstrakts möglicherweise über eine bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen, Umhüllungen und Schutzmatrizes können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Linderung des Östrogenmangels bei Frauen, das das vorher erwähnte Verfahren mittels Verbindungen der Formel umfaßt und ferner gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen Menge an Östrogen oder Progestin an eine Frau. Die Behandlungen sind besonders brauchbar zur Behandlung der Osteoporose und der Verringerung des Serumcholesterins, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen Mittels erhält, während die erfindungsgemäßen Verbindungen die unerwünschten Nebenwirkungen von Östrogen und Progestin hemmen würden. Die Aktivität dieser Kombinationsbehandlungen in jedem der späteren postmenopausalen Tests zeigt, daß die Kombinationsbehandlungen zur Linderung der Symptome der postmenopausalen Symptome bei Frauen brauchbar sind.
Es sind verschiedene Formen von Östrogen und Progestin im Handel erhältlich. Auf Östrogen basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen (0,01–0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05–0,15 mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone, wie Premarin® (Wyeth-Ayerst, 0,3–2,5 mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise Medroxyprogesteron, wie Provera® (Upjohn, 2,5–10 mg/Tag), Norethylnodrel (1,0–10,0 mg/Tag) und Norethindron (0,5–2,0 mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung ist Premarin und Norethylnodrel und Norethindron sind bevorzugte auf Progestin basierende Mittel.
Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen und Progestin basierenden Mittels stimmt mit dein überein, was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal täglich verabreicht. Jedoch kann die zyklische Therapie insbesondere bei der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle (1–6 Monate) nach medizinischen Verfahren beschränkt werden, wie der Angioplastie.
Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "effektive Menge" oder "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die zur teilweisen oder vollständigen Linderung der Symptome von verschiedenen pathologischen Zuständen fähig ist, wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung wird natürlich von den besonderen den Fall umgebenden Umständen bestimmt, wie beispielsweise der verabreichten Verbindung, dem Verabreichungsweg, dem Zustand des Patienten und der Schwere des zu behandelnden pathologischen Zustands. Eine typische Tagesdosis enthält eine nicht toxische Dosismenge von etwa 5 mg bis etwa 600 mg/Tag einer erfindungsgemäßen Verbindung. Bevorzugte Tagesdosen umfassen im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 80 mg/Tag.
Im folgenden sind Formulierungen für die Verbindungen der Formel I aufgeführt. Diese Formulierungen werden zur Erläuterung angegeben und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken. Der Ausdruck "Wirkstoff" meint eine Verbindung der Formel I.
Formulierung 1
Eine Verbindung der Formel I (0,5–3,0 mg) und 0,1 mg β-Cyclodextrin werden in 1,5 ml DMSO gelöst und 0,1 mg Batriumoxid werden zugegeben. Das Gemisch wird erhitzt (50°C), um es in Lösung zu bringen und es kann sich darin auf Raumtemperatur abkühlen. Es wird steriles Wasser zugegeben, um das Volumen auf 2 ml zu bringen.
Formulierung 2
Eine Verbindung der Formel I (0,5–3,0 mg) wird in 1 ml DMSO gelöst. Triton X (0,1 mg) und Bariuinoxid (0,1 mg) werden zusammen mit 1 ml Glycerin zugegeben. Das Gemisch wird sorgfältig gemischt.
Formulierung 3: Gelatinekapseln
Hartelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt
Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
Eine Tabletteformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:
Formulierung 4: Tabletten
Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt.
Alternativ dazu werden Tabletten, die jeweils 2,5–1000 mg Wirkstoff enthalten, folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 5: Tabletten
Der Wirkstoff die Stärke und die Cellulose werden durch ein 0,3 mm (Nr. 45 Mesh US) Sieb gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein 1,5 mm (Nr. 14 Mesh US) Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C–60°C getrocknet und durch ein 1 m (Nr. 18 Mesh US) Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein 02 mm (Nr. 60 Mesh US) Sieb gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben, die nach dein Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt werden.
Suspensionen, die jeweils 0,1–1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 6: Suspensionen
Das Arzneimittel wird durch ein 0,3 mm (Nr. 45 Mesh US) Sieb gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dein Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen herzustellen.
Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:
Formulierung 7: Aerosol
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dein Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschheßend am Behälter angebracht.
Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 8: Zäpfchen
Der Wirkstoff wird durch ein 0,2 mm (Nr. 60 Mesh U. S.) Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer normalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 9: Intravenöse Lösung
Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Formulierung 10: Kombinationskapsel I
Formulierung 11: Kombinationskapsel II
Formulierung 12: Kombinationstablette
Der Wirkstoff umfaßt in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazentisch annehmbar" ist gemeint, daß der Träger, das Verdünnungsmittel, der Hilfsstoff oder das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger hiervon nicht schädlich ist.
In den Beispielen, die die Verfahren erläutern, wird ein postmenopausales Modell verwendet, worin die Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungen auf die zirkulierenden Lipide bestimmt werden.
Fünfundsiebzig Tage alte weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten und haben für eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen Luftfeuchte von 40% gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
Dosierungsplan zur Gewebeentnahmne
Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit der Testverbindung begonnen. 17α-Ethinylöstradiol oder die Testverbindung werden als Suspension 1% Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2 : 1, V : V) betäubt und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO₂ getötet, der Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht des Uterus wird bestimmt.
Cholesterinanalyse
Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4- en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
Die in der späteren Tabelle 1 gezeigten Daten zeigen vergleichende Ergebnisse bei ovarektomierten Ratten, Ratten, die mit 17α-Ethinylöstradiol (EE₂) behandelt wurden und Rattten, die mit bestimmten erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt wurden. Obwohl EE₂ bei einer oralen Verabreichung mit 0,1 mg/kg/Tag eine Verringerung im Serumcholesterin verursacht, übt es auch eine stimulierende Wirkung auf den Uterus aus, so daß das EE₂ Uterusgewicht wesentlich größer ist, als das Uterusgewicht von ovarektomierten Tieren. Diese Uterusreaktion auf Östrogen ist in der Technik gut verstanden.
Die erfindungsgemäße Verbindung verringert das Serumcholesterin im Vergleich zu den ovarektomierten Kontrolltieren nicht nur, sondern das Uterusgewichts wird nur minimal erhöht. Im Vergleich zu den in der Technik bekannten Östrogenverbindungen ist der Nutzen einer Serumcholesterinverringerung ohne offenkundige Östrogeneffekte auf das Uterusgewicht ungewöhnlich und erwünscht.
Wie es in den folgenden Daten zum Ausdruck kommt, wird die Östrogenität auch durch die Evaluierung der schädlichen Reaktion der Eosinophileninfiltration in den Uterus untersucht. Die erfindungsgemäßen Verbindungen verursachen keine große Erhöhung der Anzahl an Eosinophilen, die in der Stromaschicht des Uterus von ovarektomierten Ratten beobachtet werden. EE₂ verursacht eine wesentlich und erwartete Erhöhung der Eosinophileninfiltration.
Die in der Tabelle 1 gezeigten Daten spiegeln die Reaktion von 5 oder 6 Ratten pro Behandlungsgruppe wider.
Tabelle 1
Eine zusätzliche Demonstration des Verfahrens zur Behandlung der Hyperlipidämie aufgrund eines Östrogenmangels wäre das folgende:
Einhundert Patienten würden ausgewählt werden, die gesunde postmenopausale Frauen im Alter von 45–60 sind und die normalenveise als Kandidaten für eine Östrogenersatztherapie in Betracht kommen würden. Dies schließt Frauen mit einem intakten Uterus ein, die die letzte Menstruation vor mehr als sechs Monaten aber weniger als sechs Jahren hatten. Patienten, die von der Studie ausgeschlossen werden, wären die, die Östrogene, Progestine oder Corticosteroide genommen haben.
Fünfzig Frauen (Testgruppe) würden 60–100 mg einer Verbindung der Formel I, beispielsweise mittels Formulierung 1 (oben), pro Tag erhalten. Die anderen fünfzig Frauen (Kontrollgruppe) würden ein gleiches Plazebo pro Tag erhalten.
Die Studie wäre doppelt blind angelegt. Weder die Untersuchenden noch die Patienten würden wissen, welcher Gruppe der Patient angehört.
Eine Grundzustandsuntersuchung jedes Patienten umfaßt eine Serumbestimmung von Cholesterin- und Triglyceridspiegeln. Am Ende der Untersuchungsperiode (sechs Monate) würde von jedem Patienten das Serumlipidprofil abgenommen werden. Die Analysen der Daten würden eine Verringerung der Serumlipide, beispielsweise Cholesterin und/oder Triglyceride in der Testgruppe gegenüber der Kontrollgruppe bestätigen.
Uteruseosinophilenperoxidasetest (EPO)
Die Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005% Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme für eine Minute bei 450 nm verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im Uterus ist ein Zeichen für die östrogene Aktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden langen Intervalls wird über den anfänghlichen, linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
Quelle der Verbindung
17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Osteoporosetestverfahren
Gemäß des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung mit Kohlendioxid am 36. Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine Verringerung der Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Naßgewichts entleert, um die mit der vollständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Untersuchung zu ermöglichen.
Die rechten Femuren werden entnommen und digitalisierte Röntgenstrahlen werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm (NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt.
Gemäß den obigen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen und Ethinylöstradiol (EE₂) in 20% Hydroypropyl-β-cyclodextrin oral an Testtiere verabreicht.
MCF-7 Proliferationstest
MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (V/V, L-Glutamin (2 mM) Natriumpyruvat (1 mM, HEPES{(N-[2-Hydrosyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM;, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (I μg/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) anstelle von 10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationmedium entfernt (Ca²⁺/Mg²⁺ freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 μl (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dein Transfer zu ermöglichen. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt und 50 μl werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 μl Testmedium auf ein Endvolumen von 200 μl überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂- werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert (1 μCi/rtiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei –70°C für 24 Stunden gefolgt von einem Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigscintillation mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen.
Beispielsweise hemmt die Verbindung der Präparation 5, eine bevorzugte Verbindung, die Proliferation dieser Zellen mit einer HK₅₀ von 40 nM. Die Konzentrationen für 50% Hemmung der Testarzneimittel (HK₅₀) werden gegenüber der Kontrolle (DMSO) bestimmt.
DMBA-induzierte Brusttumorhemmung
Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis, Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen (DMBA). Etwa G Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
Die Verbindungen der Formel I werden entweder über intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.
Uterusfibrosetestverfahren
Test 1
Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man eine erfindungsgemäße Verbindung. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate.
Die Frauen werden während des Verabreichnungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
Test 2
Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
Test 3
Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
Test 4
A. Induktion von fibroiden Tumoren in Meerschweinchen
Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3–5 mal pro Woche durch Injektion für 2–4 Monate dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3–16 Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen und auf Tumorregression untersucht.
B. Implantierung von humanen fibroidem Uterusgewebe in Nacktmäuse
Gewebe von hummanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung kultiviert. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri geerntet, um den Status des Organs zu untersuchen.
Test 5
A. Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehal ten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, einer erfidungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen potentiell zur Behandlung der Uterusfibrose geeignet sind.
Endometriosetestverfahren
Im Test 1 und 2 können die Wirkungen einer 14 Tage und 21 Tage dauernden Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf das Wachstum des explantierten endometrischen Gewebes untersucht werden.
Test 1
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Steilen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt.
Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrischen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
Test 2
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, im kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht.
Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrischen Explantate und Nebennieren werden entfernt und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen werden aufgezeichnet.
Test 3
A. Operative Induktion der Endometriose
Autographien von endometrischem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometrisches Gewebe wird im Peritoneum von 5–150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachstumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Emdometriums zu bestimmen.
B. Implantierung von humanem endometrialem Gewebe in Nacktmäusen
Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus einer erfidungsgemäßen Verbindung, die durch Gastrolavage täglich für 3–16 Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.
Test 4
A. Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5–25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Endometriose geeignet sind.
Testverfahren zur Heimmung der Prohferation der glatten Aortazellen/Restenose
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein Potential zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen. Dies kann durch Verwendung der kultivierten glatten Zellen gezeigt werden, die von der Kaninchenaorta stammen, wobei die Proliferation durch die Messung der DNA Synthese bestimmt wird. Die Zellen werden durch das Explantationsverfahren erhalten, das in Ross, J. of Cell, Bio. 50: 172 (1971) beschrieben ist. Die Zellen werden für 5 Tage in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen werden konfluent und das Wachstum stoppt. Die Zellen werden dann in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) überführt, das 0,5–2% Blutplätt chen-armes Plasma, 2 mM L-Glutmin, 100 E/ml Penicillin. 100 μg/ml Streptomycin, 1 mC/ml ³H-Thymidin, 20 ng/ml aus Blutplättchen-stammender Wachstumsfaktor und verschiedene Konzentrationen der vorliegenden Verbindungen enthält. Die Stammlösung der Verbindungen wird in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann auf eine geeignete Konzentration (0,01–30 mM im obigen Testmedium verdünnt. Die Zellen werden dann bei 37°C für 24 Stunden unter 5% CO₂/95% Luft inkubiert. Am Ende der 24 Stunden werden die Zellen in Methanol fixiert. Der ³H Thymidineinbau in die DNA wird dann durch Scintillationszählung bestimmt, wie dies in Bonin et al., Esp. Cell. Res. 181: 475–482 (1989) beschrieben ist.
Die Hemmung der Proliferation der glatten Aortamuske1zellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wird ferner durch Bestimmung ihrer Wirkungen auf die exponentiell wachsenden Zellen gezeigt. Es werden glatte Muskelzellen aus Kaninchenaorten in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen in DMEM geimpft, das 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Nach 24 Stunden heften die Zellen und das Medium wird durch DMEM ersetzt, das 10% Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und gewünschte Konzentrationen der Verbindungen enthält. Die Zellen läßt man für vier Tage wachsen. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und die Anzahl an Zellen in jeder Kultur wird durch Zählen mittels eines ZM-Coultercounters bestimmt.
Die Aktivität in den obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Potential bei der Behandlung der Restenose aufweisen.

Claims

Verbindung der Formel I
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon, worin R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff -OH, -O-C₁-C₄ Alkyl, -O-C(O)-C₁-C₆ Alkyl, -OSO₂-C₄-C₆ Alkyl, worin "C₄-C₆ Alkyl" für n-Butyl, n-Pentyl oder n-Hexyl steht, und -OC(O)Ar, worin Ar für unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht, das substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₃ Alkoy, Hydroxy, Nitro, Trichlormethyl und Trifluormethyl, R² ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff Chlor, Brom, Hydroxy, -O-C₁-C₄ Alkyl, -OC(O)-C₁-C₆ Alkyl, -OSO₂-C₄-C₆ Alkyl und -OC(O)Ar, worin Ar für unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl steht, das mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₃ Alkoxy, Hydroxy, Nitro, Trichlormethyl und Trifluormethyl, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff Fluor, Chlor, Cyano, C₁-C₄ Alkyl und -O-C₁-C₃ Alkyl, R⁵ und R⁶ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Wasserstoff Fluor, Chlor, C₁-C₄ Alkyl und - O-C₁-C₃ Alkyl, R⁷ und R⁸ unabhägig ausgewählt sind aus C₁-C₄ Alkyl oder zusammen mit dein Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, unter Bildung von 1-Piperidinyl, 1-Pyrrolidinyl, 1-Hexamethylenimino oder Morpholino kombinieren, und Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus -C(O)-, -CH(OH)- und -CH₂-, mit der Maßgabe, daß R³, R⁴, R⁵ und R⁶ nicht alle für Wasserstoff stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y für -C(O)- steht.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y für -CH(OH)- steht.
Verbindung nach Anspruch 1, worin Y für -CH₂- steht. g
Verbindung nach Anspruch 2, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus [2-(4-Hydroayphenyl)-6-hydroybenzo[b]thien-3-yl]-[4-(2-(1-piperidinyl)ethoxy)-3,5-dimethylphenyl]methanon und [2-(4-Hydroxyphenyl)-6-hydroybenzo[b]thien-3-yl]-[4-(2-(1-piperidinyl)ethoy)-3-fluorphenyl]methanon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff umfaßt.
Pharmazeutische Zusmmensetzung nach Anspruch 6, die ferner eine wirksame Menge an Östrogen enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die ferner eine wirksame Menge an Progestin enthält.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Linderung der Symptome der Osteoporose bei einer postmenopausalen Frau, die einer solchen Behandlung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Behandlung der Hyperlipidämie bei einer Frau, die einer solchen Behandlung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Behandlung der Uterusfibrose bei einer Frau, die einer solchen Behandung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Hemmung der Endometriose bei einer Frau, die einer solchen Behandlung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Hemmung der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta bei einer Frau, die einer solchen Be-handlung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Hemmung der Restenose bei einer Frau, die einer solchen Behandlung bedarf.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zur Verwendung bei der Hemmung von Östrogen-abhängigem Krebs bei einer Frau, die einer solchen Behandlung bedarf.