DE69629500T2

DE69629500T2 - Benzothiophene Verbindungen als Pharmazeutika

Info

Publication number: DE69629500T2
Application number: DE69629500T
Authority: DE
Inventors: Henry Uhlman Indianapolis Bryant; Jeffrey Alan Indianapolis Dodge
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: ES2205702T3; AU697502B2; DE69609748D1; EP0731100B1; DK0731100T3; ATE195519T1; IL117398A; IL117398A0; DE69609748T2; ZA961883B; MX9706737A; ES2148681T3; BR9607775A; CA2214261A1; US6395755B1; SI0731100T1; PT731100E; EP0731100A1; AU5304896A; JPH11501930A

Description

Das vorliegende Patent ist eine Teilung aus der europäischen Patentanmeldung 96 301 534.2, jetzt EP 0 731 100 B1 .
Die Erfindung betrifft die Gebiete der pharmazeutischen und organischen Chemie und liefert neue Benzothiophenverbindungen, die zur Behandlung der verschiedenen medizinischen Indikationen brauchbar sind, die mit dem postmenopausalen Syndrom, der fibroiden Uteruserkrankung, der Endometriose und der Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta zusammenhängen.
Postmenopausales Syndrom ist ein zur Beschreibung der verschiedenen pathologischen Zustände verwendeter Ausdruck, die häufig Frauen betreffen, die in die als Menopause bekannte physiologische Umwandlung eingetreten sind oder diese vollzogen haben. Obwohl mehrere pathologische Zustände von der Verwendung dieses Ausdrucks umfaßt werden, sind drei Haupteffekte des postmenopausalen Syndroms der Anlaß für die anhaltenden medizinischen Hauptsorgen: Osteoporose, kardiovaskuläre Effekte, wie Hyperlipidämie, und östrogenabhängiger Krebs, insbesondere Brust- und Uteruskrebs.
Osteoporose beschreibt eine Krankheitsgruppe, die aus unterschiedlichen Ätiologien hervorgeht, die aber durch den Nettoverlust an Knochenmasse pro Volumeneinheit gekennzeichnet ist. Die Konsequenz dieses Verlusts an Knochenmasse und die daraus resultierende Knochenfraktur ist das Versagen des Skeletts, eine angemessene Strukturunterstützung für den Körper bereitzustellen.
Einer der bekanntesten Typen der Osteoporose ist der, der mit der Menopause zusammenhängt. Die meisten Frauen verlieren etwa 20% bis etwa 60% der Knochenmasse im Trabekellcompartiment des Knochens innerhalb von 3 bis 6 Jahren nach dem Aufhören der Menstruation. Dieser rapide Verlust geht im allgemeinen mit einer Erhöhung der Resorption und Bildung der Knochen einher. Jedoch ist der resorptive Zyklus dominanter, und das Ergebnis ist daher ein Nettoverlust an Knochenmasse. Osteoporose ist eine bekannte und ernste Erkrankung bei postmenopausalen Frauen.
Es gibt alleine in den Vereinigten Staaten geschätzte 25 Millionen Frauen, die von dieser Erkrankung betroffen sind. Die Folgen von Osteoporose sind für die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund ihrer chronischen Erscheinung und des Bedarfs an einer ausgiebigen und langanhaltenden Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt, obwohl Osteoporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand angesehen wird, daß die Sterblichkeitsrate von 20% bis 30% mit Hüftfrakturen bei älteren Frauen zusammenhängt. Ein großer Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler Osteoporose zusammenhängen.
Das anfälligste Gewebe im Knochen für die Wirkungen der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen. Dieses Gewebe wird oft als spongiöser oder schwammiger Knochen bezeichnet und konzentriert sich insbesondere an den Enden des Knochens (nahe den, Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe ist durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander verbunden sind, wie auch durch das festere und dichtere cortikale Gewebe, das die äußere Oberfläche und den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses untereinander verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale Struktur und ist für die biomechanische Stärke der Gesamtstruktur entscheidend. Bei der postmenopausalen Osteoporose ist es primär die Nettoresorption und der Verlust der Trabekel, die zum Versagen und zur Fraktur des Knochens führen. In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen ist es nicht übenaschend, daß die meisten herkömmlichen Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von der Trabekelunterstützung ab hängen, beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichttragenden Knochen, wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüftfraktur, Schenkelhalsfrakturen und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen Osteoporose.
Derzeit ist die einzige allgemein akzeptierte Methode zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose die Östrogenersatztherapie. Obwohl die Therapie allgemein erfolgreich ist, ist die Patientenakzeptanz der Therapie gering, da die Östrogenbehandlung häufig unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft.
Vor der Menopause weisen die meisten Frauen eine geringere Häufigkeit für kardiovaskuläre Erkrankungen auf als gleichaltrige Männer. Nach der Menopause erhöht sich jedoch langsam die Rate der kardiovaskulären Erkrankung bei Frauen, um die beim Mann beobachtete zu erreichen. Dieser Schutzverlust wurde dem Verlust an Östrogen und insbesondere dem Verlust der Fähigkeit des Östrogens zugeschrieben, die Serumlipidspiegel zu regulieren. Die Art der Fähigkeit des Östrogens, die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht ganz klar, doch deuten Erkenntnisse darauf hin, daß Östrogen die Rezeptoren für Lipid niedriger Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin zu entfernen. Zusätzlich scheint Östrogen eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche Effekte auf die kardiovaskuläre Gesundheit zu haben.
Es wurde in der Literatur berichtet, daß postmenopausale Frauen, die sich einer Östrogenersatztherapie unterziehen, ein Zurückkehren der Serumlipidkonzentrationen auf die des prämenopausalen Zustands erleben. Daher scheint Östrogen eine sinnvolle Behandlung für diesen Zustand zu sein. Jedoch sind die Nebenwirkungen der Östrogenersatztherapie nicht für jede Frau akzeptabel, was die Verwendung dieser Therapie limitiert. Eine ideale Therapie für diesen Zustand wäre ein Mittel, das die Serumlipidspiegel reguliert, wie dies Östrogen tut, dem aber die Nebenwirkungen und Risiken fehlen, die mit einer Östrogentherapie zusammenhängen.
Zum dritten pathologischen Haupteffekt, der mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängt, gehören östrogenabhängiger Brustkrebs und in einem geringeren Ausmaß östrogenabhängige Krebsarten anderer Organe, insbesondere des Uterus. Obwohl solche Neoplasmen nicht nur auf eine postmenopausale Frau beschränkt sind, sind sie bei der älteren, postmenopausalen Population häufiger. Die derzeitige Chemotherapie dieser Krebsarten basiert stark auf der Verwendung von Antiöstrogenverbindungen, wie beispielsweise Tamoxifen. Obwohl solche gemischte Agonist-Antagonisten nützliche Wirkungen bei der Behandlung dieser Krebsarten haben und die östrogenen Nebenwirkungen in akut lebensbedrohenden Situationen tolerierbar sind, sind sie nicht ideal. Beispielsweise können diese Mittel stimulierende Wirkungen auf bestimmte Krebszellpopulationen im Uterus aufgrund ihrer östrogenen Wirkungen (Agonist) aufweisen und können daher in manchen Fällen kontraproduktiv sein. Eine bessere Therapie für die Behandlung dieser Krebsarten wäre ein Mittel, das eine Antiöstrogenverbindung ist, die vernachlässigbare oder keine Östrogenagonisteneigenschaften auf Reproduktionsgewebe aufweist.
Als Reaktion auf den eindeutigen Bedarf für neue pharmazeutische Mittel, die zur Linderung der Symptome unter anderem des postmenopausalen Syndroms fähig sind, liefert die vorliegende Erfindung neue Benzothiophenverbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur Behandlung des postmenopausalen Syndroms und anderer mit Östrogen zusammenhängender pathologischer Zustände, wie sie später erwähnt werden.
Die Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung) ist ein altes und allgegenwärtiges klinisches Problem, das unter einer Vielzahl an Namen bekannt ist, einschließlich fibroide Uteruserkrankung, Uterushypertrophie, Uterusleiomyomata, myometrische Hypertrophie, Fibrosis uteri und fibrotische Metritis. Im wesentlichen ist die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine störende Ablagerung von fibroidem Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet.
Dieser Zustand ist eine Ursache für Dysmenonhoe und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache dieses Zustands ist alles andere als klar, doch Erkenntnisse legen nahe, daß eine gestörte Reaktion des fibroiden Gewebes auf Östrogen vorliegt. Ein solcher Zustand wurde in Kaninchen durch die tägliche Verabreichung von Östrogen für drei Monate hervorgerufen. In Meerschweinchen wurde der Zustand durch eine tägliche Verabreichung von Östrogen für vier Monate hervorgerufen. Ferner verursacht Östrogen in Ratten eine ähnliche Hypertrophie.
Die häufigste herkömmliche Behandlung der Uterusfibrose umfaßt operative Verfahren die sowohl teuer als auch manchmal ein Anlaß für Komplikationen sind, wie die Bildung von abdominalen Adhäsionen und Infektionen. Bei manchen Patienten ist die anfängliche Operation nur eine vorübergehende Behandlung und die Fibroide wachsen wieder heran. In diesen Fällen wird eine Hysterektomie durchgeführt, die die Fibroide effektiv beendet aber auch das Reproduktionsleben des Patienten. Es werden auch Antagonisten für Gonadotropin freisetzendes Hormon verabreicht, wobei deren Verwendung aber durch die Tatsache beschränkt wird, daß sie zu Osteoporose führen können. Daher besteht ein Bedarf für neue Verbindungen zur Behandlung der Uterusfibrose und die erfindungsgemäßen Verfahren befriedigen diesen Bedarf.
Endometriose ist ein Zustand schwerer Dysmenonhoe, der von schweren Schmerzen und Blutung in die endometrischen Ansammlungen oder den Peritoneakaum begleitet wird und oft zur Unfruchtbarkeit führt. Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopes endometriales Wachstum zu sein, das gegenüber einer normalen hormonalen Kontrolle gestört reagiert und in gestörten Geweben vorkommt. Aufgrund der gestörten Orte für endometriales Wachstum scheint das Gewebe lokale entzündungsähnliche Reaktionen hervorzurufen, die eine Makrophageninfiltration und eine Kaskade von Ereignissen verursachen, wodurch schmerzhafte Reaktionen hervorgerufen werden. Die exakte Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht ganz klar und ihre Behandlung durch eine hormonale Therapie ist unterschiedlich, wenig definiert und durch mehrere unerwünschte und vielleicht gefährliche Nebenwirkungen gekennzeichnet.
Eine der Behandlungen für diese Erkrankung ist die Verwendung von gering dosiertem Östrogen zwecks Unterstützung des endometrischen Wachstums durch einen negativen Rückeffekt auf die zentrale Gonadotropinfreisetzung und die anschließende Bildung von Östrogen im Ovar, wobei es aber manchmal notwendig ist, kontinuierlich Östrogen zu verwenden, um die Symptome zu kontrollieren. Diese Verwendung von Östrogen kann oft zu unerwünschten Nebenwirkungen und sogar zum Risiko für Endometriumkrebs führen.
Eine weitere Behandlung besteht aus der kontinuierlichen Verabreichung von Progestinen, die Amenonhoe induzieren und durch die Unterdrückung der ovarialen Östrogenbildung eine Regression des endometrialen Wachstums verursachen können. Die Verwendung einer chronischen Progestintherapie wird häufig von unerwünschten ZNS Nebenwirkungen der Progestine begleitet und führt oft zur Unfruchtbarkeit aufgrund der Unterdrückung der Ovarfunktion.
Eine dritte Behandlung besteht in der Verabreichung schwacher Androgene, die bei der Kontrolle der Endometriose wirksam sind, aber schwere maskulinisierende Wirkungen hervorrufen. Einige der Behandlungen für Endometriose verursachten bei anhaltender Therapie auch ein geringes Ausmaß an Knochenverlust. Daher sind neue Methoden zur Behandlung von Endometriose erwünscht.
Die Proliferation der glatten Muskelzellen in der Aorta spielt eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose. Es hat sich gezeigt, daß die vaskuläre Restenose nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA) eine Gewebereaktion ist, die durch eine frühe und eine späte Phase charakterisiert ist. Die frühe Phase, die Stunden bis Tage nach der PTCA auftritt, beruht auf einer Thrombose mit einigen Vasospasmen, während die späte Phase von einer exzessiven Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen der Aorta dominiert wird. Bei dieser Erkrankung trägt die erhöhte Zellmotilität und Kolonialisierung durch solche glatten Muskelzellen und Makrophagen signifikant zur Pathogenese dieser Erkrankung bei. Die exzessive Proliferation und Migration der vaskulären glatten Muskelzellen der Aorta kann der primäre Mechanismus für den erneuten Verschluß der Koronararterien nach einer PTCA, Atherektomie, Laserangioplastie und einer arteriellen Bypasstransplantationsoperation sein. Siehe "Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis alter Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty", Austin et al., Joumal of the American College of Cardiology 8: 369–375 (Aug. 1985).
Die vaskuläre Restenose bleibt eine langanhaltende Hauptkomplikation nach einem operativen Eingriff in blockierte Arterien durch eine perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA), Atherektomie, Laserangioplastie und arterielle Bypasstransplantationsoperation. Bei etwa 35% der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, tritt innerhalb von drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren ein Wiederverschluß auf. Die derzeitigen Strategien zur Behandlung der vaskulären Restenose umfassen einen mechanischen Eingriff durch Vorrichtungen, wie Stents oder durch pharmakologische Therapien, einschließlich Heparin, niedermolekulares Heparin, Kumarin, Aspirin, Fischöl, Calciumantagonisten, Steroide und Prostacyclin. Diese Strategien konnten aber die Wiederverschlußrate nicht verringern und waren für die Behandlung und Verhinderung der vaskulären Restenose unwirksam. Siehe "Prevention of Restenosis alter Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a 'Magic Bullet"', Hermans et al., American Heart Journal 122: 171 bis 187, 1991.
Bei der Pathogenese der Restenose tritt die exzessive Zellproliferation und Zellmigration als Folge von Wachstumsfaktoren auf, die von Zellbestandteilen im Blut und in der beschädigten arteriellen Gefäßwand gebildet werden, wobei die Faktoren die Proliferation der glatten Muskelzellen bei der vaskulären Restenose vermitteln.
Mittel, die die Proliferation und/oder Migration von glatten Muskelzellen der Aorta hemmen, sind bei der Behandlung und Verhinderung der Restenose brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert nun die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen und daher als Inhibitoren der Restenose.
Die EP 0 062 503 A betrifft 6-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-3-[4-(2-piperidino)ethoxy)benzoyl]benzo[b]thiophen und 6-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-3-[4-(3-methylpyrrolidino)ethoxy)benzoyl]benzo[b]thiophenverbindungen als Antiöstrogene und Androgene.
Ein Verfahren zur Herstellung von Benzofuran-, Benzothiophen-, Indol- oder Indozilinderivaten ist in EP 0 471 609 A beschrieben.
Die EP 0 641 791 A betrifft Benzothiophenderivate, die an der Position 2 substituiert sind durch ein Halogenatom, eine Niederalkylgruppe oder eine Cycloalkyl- oder Cycloalkenylgruppe, welche wahlweise substituiert sind mit einer Niederalkylgruppe, Hydroxylgruppe, Acyloxygruppe oder Oxogruppe, als Antiöstrogene.
Die EP 0 516 257 A beschreibt 2-Phenylbenzo[b]furan- und -thiophenderivate als Antiöstrogene. Die DE 1300575 B beschreibt Benzothiophenverbindungen als Antifertilitätsmittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I
worin R₁ für H, OH, Halogen, OCO(C₁-C₆ Alkyl), OCO(Aryl), OSO₂(C₄-C₆ Allcyl), OCOO(C₁-C₆ Alkyl), O-COO(Aryl), OCONH(C₁-C₆ Alkyl) oder OCON(C₁-C₆ Alkyl)₂ steht,
R₂ für Aryl, C₁-C₆ Alkyl, C₁-C₆ Cycloalkyl oder 4-Cyclohexanol steht,
R₃ für O(CH₂)₂ oder O(CH₂)₃ steht, und
R₆ für
steht,
und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I und wahlweise Östrogen oder Progestin enthalten, und die Verwendung solcher Verbindungen alleine oder in Kombination mit Östrogen oder Progestin zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms, insbesondere Osteoporose, kardiovaskuläre pathologische Zustände und östrogenabhängiger Krebs. Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin^®), Pferdeöstrogen, 17β-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin"Verbindungen mit progestiner Aktivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethylnodrel, Norgestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen.
Die erfmdungsgemäßen Verbindungen sind auch zur Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung und Endometriose bei Frauen und der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen, insbesondere der Restenose, beim Menschen brauchbar.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verbindungen der Formel I
worin R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ wie oben definiert sind, und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Allgemeine Ausdrücke, die in der Beschreibung der hierin beschriebenen Verbindungen verwendet werden, haben die gewöhnlichen Bedeutungen. Beispielsweise bezieht sich "Alkyl" auf gerade oder verzweigte aliphatische Ketten mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, einschließlich Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl und Isohexyl. Ähnlich steht der Ausruck "C₂-C₆ Alken" für gerade oder verzweigte Alkene mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und umfaßt Propylen, Ethylen, Isopropylen, Butylen, n-Butylen, Hexylen und Pentylen.
Der Ausdruck "Aryl" umfaßt Phenyl, das wahlweise ein- bis dreimal mit C₁-C₆ Alkyl, C₁-C₆ Alkoxy, Halogen, Amino, Nitro oder Hydroxy substituiert ist.
Benzothiophenherstellung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Benzo[b]thiophenderivate, die gemäß dem Ring Index, The American Chemical Society folgendermaßen benannt und nummeriert sind:
In den Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist das Ausgangsmaterial eine
worin
R₇ für eine Hydroxyschutzgruppe steht, und
R₃, R₄ und R₅ wie oben definiert sind, oder ein Salz hiervon.
Obwohl die Form der freien Base einer Verbindung der Formel II ein annehmbares Ausgangsmaterial ist, ist eine Säureadditionssalzform, insbesondere das Hydrochloridsalz, oft zweckmäßiger.
Verbindungen der Formel II sind in der Technik bekannt und werden im wesentlichen durch Verfahren hergestellt, die in US 4 133 813 A , US 4 380 635 A und US 4 418 068 A beschrieben sind.
Im allgemeinen wird ein Benzothiophenvorläufer der Formel III
durch bekannte Verfahren hergestellt. Typischerweise werden die zwei Hydroxygruppen durch bekannte Hydroxyschutzgruppen geschützt, die einer Acylierung unter Fiedel-Crafts Bedingungen (Bildung der R₅ Schutzgruppen der Verbindungen der Formel II) und einer anschließenden Reduktion durch ein starkes Reduktionsmittel standhalten. Bevorzugte Hydroxyschutzgruppen sind C₁-C₄ Alkyl, wobei Methyl besonders bevorzugt ist. Siehe beispielsweise die oben eingeführten US Patente, J. W. Barton "Proctective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie (Herausgeber), Plenum Press, New York, NY, 1973, Kapitel 7, und T. W. Green, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981, Kapitel 7.
Nach der Herstellung des gewünschten geschützten Vorläufers der Formel III wird der Vorläufer mittels Standard-Fiedel-Crafts-Bedingungen mit einer Verbindung der Formel IV acyliert
worin
n, R₃, R₄ und R₅ wie oben definiert sind und
R für Chlor, Brom, Iod oder eine aktivierende Estergruppe steht. Die Herstellung der Verbindungen der Formel IV wie auch die bevorzugten Acylierungsmethoden sind in den oben eingeführten US Patenten beschrieben. Stehen R₄ und R₅ jeweils für C₁-C₄ Alkyl, dann sind Methyl und Ethyl bevorzugt. Sind R₄ und R₅ kombiniert, dann sind 1-Piperidinyl und 1-Pyrrolidinyl bevorzugt, wobei der Piperidinrest besonders bevorzugt ist.
Nach Acylierung und damit Herstellung einer Verbindung der Formel II werden die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin R₇ für -OH steht, hergestellt durch Zugabe einer Verbindung der Formel II oder eines Salzes hiervon zu einem geeigneten Lösemittel und anschließende Umsetzung der Verbindung der Formel II mit einem Reduktionsmittel, wie beispielsweise Lithiumaluminiumhydrid (LAH), unter einem Inertgas, wie Stickstoff.
Geeignete Lösemittel umfassen jedes Lösemittel oder Lösemittelgemisch, das unter den Reduktionsbedingungen inert bleibt. Geeignete Lösemittel sind unter anderem Diethylether, Dioxan und Tetrahydrofuran (THF). Die wasserfreie Form der Lösemittel ist bevorzugt, wobei wasserfreies THF besonders bevorzugt ist.
Die in diesem Schritt verwendete Temperatur ist die, die zur Vervollständigung der Reduktionsreaktion ausreicht. Umgebungstemperatur im Bereich von 17°C bis 25°C ist im allgemeinen passend.
Die Zeitspanne für diesen Schritt ist die Zeit, die zum Ablauf der Reaktion erforderlich ist. Typischerweise dauert die Reaktion 1 bis 20 Stunden. Die optimale Zeit kann durch Überwachung des Verlaufs der Reaktion mittels herkömmlicher chromatographischer Techniken bestimmt werden.
Der α-Kohlenstoff (Carboxy) kann dann zu den durch R₆ definierten Gruppen umgewandelt werden.
Steht dabei R₆ für
Aryl dann gibt man eine Gruppe, wie RLi, RMgX oder eine sonstige nukleophile Spezies des Kohlenstoffs, worin R für C₁-C₅ Alkyl, C₂-C₅ Alkenyl oder Aryl steht, zu einer Verbindung der Formel II in einem geeingneten Lösemittel der oben definierten Art bei einer Temperatur von 0°C bis –85°C. Sodann lässt man die Umsetzung über eine zur Vervollständigung der Reaktion ausreichende Zeitdauer (15 min bis 20 h) laufen, gibt wassriges Natriumbicarbonat zu und extrahiert das Gemisch, worauf die vereinigten Extrakte gewaschen, getrocknet, filtriert, eingeengt und gereinigt werden, wodurch eine Verbindung der Formel Ia gebildet wird.
Steht dabei R₆ für
dann wird die α-Hydroxygruppe der Verbindung der obigen Formel Ia mit einem Reduktionsmittel, wie Triethylsi-lan, unter anschließender Zugabe einer Säure, wie Trifluoressigsäure, reduziert. Nach einer ausreichenden Umsetzungszeit (15 min bis 24 h) wird die Reaktion abgeschreckt, wie durch Verwendung eines Gemisches aus Ethylacetat und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat. Nach Extraktion des Gemisches wird die organische Phase gewaschen, getrocknet, filtriert, eingeengt und gereinigt, wodurch man eine Verbindung der Formel Ib erhält. Zu anderen Verfahren, um dies zu bewerktstelligen, gehören (a) Trialkylsilan mit einer Lewis-Säure, wie Et₂AlCl₂ oder BF₃·Et₂O (Bornifluoridetherat), und (b) eine Hydrogenolyse (H₂) mit einem Katalysator, wie Palladium-auf-Kohle. Ein Zusatz von Dichlordimethylsilan unter anschließender Zugabe von Natriumiodid ist wirksam.
Andere Verbindungen werden hergestellt durch Ersatz der Hydroxygruppen R₁ und R₂ durch Reste der Formeln -O-CO-(C₁-C₆ Alkyl), -O-CO-Ar, worin Ar für wahlweise substituiertes Phenyl steht, oder -O-SO₂-(C₁-C₆ Alkyl) unter Anwendung wohlbekannter Maßnahmen. Siehe US 4 358 593 A .
Möchte man beispielsweise eine Gruppe -O-CO-(C₁-C₆ Alkyl) oder -O-CO-Ar haben, dann wird die Dihydroxyverbindung der Formel I umgesetzt mit einem Reagenz, wie Acylchlorid, -bromid, -cyanid oder -acid, oder mit einem geeigneten Anhydrid oder gemischten Anhydrid. Diese Umsetzungen werden zweckmäßigerweise in einem basischen Lösemittel, wie Pyridin, Lutidin, Chinolin oder Isochinolin, oder in einem tertiären Amin als Lösemittel durchgeführt, wie Triethylamin, Tributylamin, Methylpiperidin und dergleichen. Die Umsetzung kann auch in einem inerten Lösemittel durchgeführt werden, wie Ethylacetat, Dimethylforinamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Dimethoxyethan, Acetonitril, Aceton, Methylethylketon und dergleichen, welchem wenigstens ein Äquivalent eines Säwefängers, wie eines tertiären Amins, zugesetzt worden ist. Gewünschtenfalls können hierzu auch Acylierungskatalysatoren verwendet werden, wie 4-Dimethylaminopyridin oder 4-Pyrrolidinopyridin. Siehe beispielsweise Haslam et al., Tetrahedron, 36: 2409 bis 2433 (1980).
Die Acylierungsreaktionen, welche die oben erwähnten Gruppen R₁ und R₂ ergeben, werden bei mäßigen Temperatwen im Bereich von etwa –25°C bis etwa 100°C und häufig unter inerter Atmosphäre, wie Stickstoffgas, durchgeführt. Raumtemperatur ist gewöhnlich aber ausreichend für den Ablauf der Reaktion.
Solche Acylierungen der Hydroxygruppe können auch durch säwekatalysierte Reaktionen der geeigneten Carbonsäuren in inerten organischen Lösemitteln oder ohne durchgeführt werden. Hierzu werden Säwekatalysatoren verwendet, wie Schwefelsäwe, Polyphosphorsäwe, Methansulfonsäwe und dergleichen.
Die oben erwähnten Gruppen R₁ und R₂ können auch erhalten werden durch Bildung eines aktiven Esters der geeigneten Säwe, wie der Ester, die durch bekannte Reagenzien gebildet werden, wie Dicyclohexylcarbodümid, Acylimidazole, Nitrophenole, Pentachlorphenol, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol. Siehe beispielsweise Bull. Chem. Soc. Japan, 38: 1979 (1965), und Chem. Ber., 788 und 2024 (1970).
Jede der obigen Techniken, die die Gruppen -O-CO-(C₁-C₆ Alkyl) und -O-CO-Ar ergibt, kann in Lösemitteln der oben diskutierten Art durchgeführt werden. Dabei ist bei Techniken, welche im Verlauf der Reaktion kein Säweprodukt ergeben, die Verwendung eines Säwefängers im Reaktionsgemisch natürlich nicht erforderlich.
Möchte man eine Verbindung der Formel I haben, worin R₁ und R₂ für -O-SO₂-(C₄-C₆ Alkyl) steht, dann wird die Dihydroxyverbindung der Formel I beispielsweise umgesetzt mit einem Derivat der geeigneten Sulfonsäure, wie einem Sulfonylchlorid, Sulfonylbromid oder Sulfonylammoniuinsalz, wozu hingewiesen wird auf King und Monoir, J. Am Chem. Soc., 97: 2566 bis 2567 (1975). Die Dihydroxyverbindung kann auch mit dem geeigneten Sulfonsäureanhydrid umgesetzt werden. Solche Reaktionen werden unter Bedingungen durchgeführt, wie sie oben bei der Diskussion der Umsetzung mit Säwehalogeniden und dergleichen erläutert worden sind.
Verbindungen der Formel I können so hergestellt werden, dass R₁ und R₂ unterschiedliche biologische Schutzgruppen tragen, oder lassen sich so herstellen, dass R₁ und R₂ jeweils die gleiche biologische Schutzgruppe aufweisen. Zu hierfür bevorzugten Schutzgruppen gehören unter anderem -OCH₃, -O-CO-C(CH₃)₃, -O-CO-C₆H₅ und -O-SO₂-(CH₂)₃.
Obwohl die freie Basenform der Verbindungen der Formel I in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird bevorzugt eine pharmazeutisch annehmbare Salzform hergestellt und verwendet. Daher bilden die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen mit einer großen Vielzahl an organischen und anorganischen Säuren primär pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze und beinhalten die physiologisch annehmbaren Salze, die oft in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden. Solche Salze sind auch Teil der Erfindung. Typische anorganische Säuren, die zur Bildung solcher Salze verwendet werden, sind unter anderem Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor- und Hypophosphorsäwe. Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, phenylsubstituierten Alkansäwen, Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäwen, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäwen, können ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbare Salze sind daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat, Ascorbat, Benzoat, Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybemoat, Naphthalin-2-benzoat, Bromid, Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat, Citrat, Formiat, Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat, Malat, Maleat, Hydroxymaleat, Malonat, Mandelat, Mesylat, Nicotinat, Isonicotinat, Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Propiolat, Propionat, Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat, Suberat, Sulfat, Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat, Benzolsulfonat, p-Bromphenylsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat, 2-Hydroxyethansulfonat, Methansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, p-Toluolsulfonat, Xylolsulfonat und Tartrar. Ein bevorzugtes Salz ist das Hydrochloridsalz.
Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge einer Säure gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether oder Ethylacetat. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze weisen im allgemeinen erhöhte Löslichkeitseigenschaften verglichen mit der Verbindung, von der sie stammen, auf, und sind daher bei der Formulierung als Flüssigkeiten oder Emulsionen oft beliebter.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter zu erläutern. Es ist nicht beabsichtigt, daß die Erfindung auf eines der folgenden Beispiele beschränkt wird.
¹H-NMR und ¹³C-NMR werden jeweils bei 300 und 75 MHz gemessen. Chemische Verschiebungen im ¹H-NMR werden als δ Werte in ppm relativ zum verwendeten NMR Lösemittel angegeben. Die Kopplungskonstanten im ¹H-NMR werden in Herz (Hz) angegeben und beziehen sich auf scheinbare Multiplizitäten. Die Multiplizität wird folgendermaßen angegeben: s (Sigulett), d (Duplett), t (Triplett), q (Quartett), m (Multiplett), comp (komplex), br (breit) und app (scheinbar). Die Säulenchromatographie wird gemäß dem Verfahren von Still et al., (W. C. Still, M. Kahn, A. Mitra, 7. Org. Chem. 1978, 43: 2923) mit EM Science Silicagel (230–400 Mesh ASTM) durchgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Die Radialchromatographie wird auf einem Chromatotron mittels 1, 2 oder 4 min dicken Platten durchgeführt. Alle Luft- und/oder feuchtigkeitsempfindlichen eaktionen werden unter einer Argonoder Stickstoffatmosphäre in vollkommen getrockneter Glasware durchgeführt. In allen Fällen werden Konzentrierungen unter verringertem Druck mit einem Rotationsverdampfer durchgeführt.
Präparation 1
Zu einer Lösung aus Raloxifen (1,00 g, 1,96 mmol), die in THF (20 ml) bei Raumtemperatur rührt, wird N,N-Dimethylaminopyridin (1,00 g, 8,2 mmol) gefolgt von t-Butyldimethylsilylchlorid (0,90 g, 6 mmol) gegeben. Nach 12 h wird die Reaktion mit Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden getrocknet (Natriumsulfat) und konzentriert. Das Öl wird in Ethylacetat aufgenommen und der entstehende Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wird konzentriert und durch Blitzchromatographie (Silicagel, Ethylacetat) unter Bildung von 1,1 g (80%) des gewünschten Produkts als dickes gelbes Öl gereinigt: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,76 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,68 (d, 9,0 Hz, 1H), 7,22–7,29 (m, 3H), 6,88 (dd, J = 8,9, 3,1 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 6,63 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 4,10 (br, 2H), 2,79 (br, 2H), 2,54 br, 4H), 1,62 (br, 4H), 1,25 (br, 2H), 1,01 (s, 9H), 0,93 (s, 9H), 0,22 (s, 6H), 0,06 (s, 6H), MS (FD) 701 (M⁺), IR (CHCl₃) 2934, 1642, 1599, 1259 cm', Elementaranalyse (berechnet/gefunden) C (68,43/68,53), H (7,90/7,92), N (2,00/2,23).
Beispiel 1
Zu einer Lösung des Produkts der Präparation 1 (2,04 g, 2,91 mmol), die bei –78°C in THF (10 ml) rührt, wird MeLi (4,16 ml einer 1,4 M Lösung in Diethylether, 5,82 mmol) tropfenweise gegeben. Nach 15 Minuten wird die Reaktion durch überschüssiges wäßriges Natriumbicarbonat gestoppt und mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und konzentriert. Das entstehende Material wird durch Radialchromatographie (Silicagel, 4 mm, 2,5 : 2,5 : 0,1 : 0,1 aus Hexan : Ethylacetat : Triethylamin : MeOH) unter Bildung von 1,70 g (81%) des gewünschten Produkts als nicht ganz weißer Schaum gereinigt: ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7,31–7,36 (m, 5H), 7,17 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,9 Hz, 4H), 6,84 (dd, J = 9,0, 2,9 Hz, 1H), 4,12 (br, 2H), 2,81 (br, 2H), 2,59 (br, 4H), 1,65 (s, 3H), 1,63 (br, 4H), 1,45 (br, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,97 (s, 9H), 0,21 (s, 6H), 0,19 (s, 6H) MS (FD) 718 (M⁺), IR (CHCl₃) 2934, 1606, 1467, 1525 cm^–1, Elementaranalyse (berechnet/gefunden) C (68,57/68,93), H (8,28/8,26), N (1,95/2,10).
Beispiel 2
Eine Lösung des Produkts von Beispiel 1 (0,50 g, 0,69 mmol) wird unter Rühren bei 0°C in THF (5 ml) mit Tetrabutylammoniumfluorid (1,74 ml einer 1,0 M Lösung in THF, 1,74 mmol) versetzt. Nach 15 min wird gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat zur Reaktion gegeben und das Gemisch anschließend mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das erhaltene Material wird durch Radialchromatographie (Silicagel, 2 mm, 2,5 : 2,5 : 0,1 : 0,1 Hexan Ethylacetat : MeOH : Triethylamin) gereinigt, wodurch man eine quantitative Ausbeute des gewünschten Produkts als einen weißen Feststofferhält. 'H-NMR (300 MHZ, CDCl₃) δ 9,81 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 7,53 (d, 7 = 9,2 Hz, 1H), 7,24 (app t, J = 9,0 Hz, 4H), 7,03 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 6,80 überlappende d, J = 9,1 Hz, 6,61 (dd, J = 8,9, 2,9 Hz, 1H), 5,72 (s, 1H), 3,98 (tm J = 4,0 Hz, 2H), 2,61 (br, 2H), 2,41 (br, 4H), 1,24–1,55 (Serie an m, 9H), MS (FD) 490 (M⁺),
Beispiel 3
Zu einer Lösung des Produkts von Beispiel 1 (1,77 g, 2,46 mmol) gibt man unter Rühren in CH₂Cl₂ (50 ml) bei 0°C zuerst Triethylsilan (2,36 ml, 14,8 mmol) und dann Trifluoressigsäure (4,72 ml). Nach 15 min stoppt man die Reaktion durch vorsichtiges Eingießen des Reaktionsgemisches in ein Gemisch aus Ethylacetat und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat. Das aus zwei Phasen bestehende Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das erhaltene Material wird durch Radialchromatographie (Silicagel, 2 mm, 2,5 : 2,5 : 0,1 : 0,1 Hexane : Ethylacetat : Triethylamin : MeOH) gereinigt, wodurch man 1,5 g (87%) des gewünschten Produkts als einen weißen Schaum erhält. ¹H-NMR (300 MHZ, CDCl₃) δ 77,36 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,17– 7,21 (komplex, 4H), 6,86 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,80 (s, J = 9,0 Hz, 2H), 6,68 (dd, J = 9,0, 2,8 Hz, 1H), 4,57 (q, J = 4,0 Hz, 1H), 4,17 (br, 2H), 2,84 (br, 2H), 2,62 (br, 4H), 1,62–1,74 (komplex, 7H), 1,49 (br, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,97 (s, 9H), 0,22 (s, 6H), 0,20 (s, 6H), MS (FD) 703 (M⁺), IR (CHCl₃) 2935, 1605, 1468, 1265 cm^–1, Elementaranalyse (berechnebgefunden) C (17,13/69,78), H (8,47/8,62), N (2,00/2,11).
Beispiel 4
Eine Lösung des Produkts von Beispiel 3 (0,50 g, 0,71 mmol) in THF (5 ml) versetzt man unter Rühren bei 0°C mit Tetrabutylammoniumfluorid (1,78 ml einer 1,0 M Lösung in THF, 1,78 mmol). Nach 15 min wird die Reaktion durch Zugabe von wässrigem Natriumbicarbonat gestoppt. Das erhaltene Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte werden der Reihe nach mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das erhaltene Material wird durch Radialchromatographie (Silicagel, 2 mm, 2,5 : 2,5 : 0,75 : 0,25 Hexane : Ethylacetat : MeOH : Triethylamin) gereinigt, wodurch man 314 mg (93%) des gewünschten Produkts als einen weißen Feststoff erhält. ¹H-NMR (300 MHZ, CDCl₃) δ 9,71 (s, 1H), 9,50 (s, 1H), 7,30 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 7,08–7,17 (komplex, 4H), 6,81–6,88 (komplex, 4H), 6,63 (dd, J = 9,1, 2,8 Hz, 1H), 4,41 (q, J = 4,2 Hz, 1H), 3,98 (t, J = 3,8 Hz, 2H), 2,60 (br, 2H), 2,41 (br, 4H), 1,84 (d, J = 4,0 Hz, 3H), 1,35–1,51 (Serie an br m, 6H), MS (FD) 474 (M⁺).
Beispiel 5
Eine Lösung des Produkts der Präparation 1 (1,00 g, 1,42 mmol) wird unter Rühren bei –78°C mit PhLi (1,6 ml einer 1,8 M Lösung, 2,84 mmol) versetzt. Nach 15 min gibt man gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat zu und extrahiert das erhaltene Gemisch mit Ethylacetat. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das erhaltene Rohmaterial wird durch Radialchromatographie (4 min, Silicagel, 2,5 : 2,5 : 0,01 : 0,0051 Ethylacetat : Hexane : Triethylamin : MeOH) gereinigt, wodurch man 0,81 g (73%) des gewünschten Produkts als einen weißen Schaum erhält. ¹H-NMR (300 MHZ, CDCl₃) δ 7,11– 7,22 (komplex, 10H), 6,93 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 6,57–6,78 (Serie an m, 4H), 4,18 (br, 2H), 2,90 (br, 2H), 2,61 (br, 4H), 1,40–1,80 (br, 6H), 0,98 (s, 9H), 0,97 (s, 9H), 0,19 (s, 6H), 016 (s, 6H), MS (FD) 781 (M⁺), Elementaranalyse (berechnet/gefunden) C (70,81/71,05), H (7,88/7,94), N (1,80/1,97).
Beispiel 6
Eine Lösung des Produkts von Beispiel 7 (0,50 g, 0,64 mmol) in THF (5 ml) wird unter Rühren bei 0°C mit Tetrabutylammoniumfluorid (1,60 ml einer 1,0 M Lösung in THF, 1,60 mmol) versetzt. Nach 15 min wird gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat zugesetzt und das erhaltene Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄), filtriert und eingeengt. Das erhaltene Material wird durch Radialchromatographie (Silicagel, 2 nun, 2,5 : 2,5 : 0,1 : 0,1 Hexane : Ethylacetat MeOH : Triethylamin) gereinigt, wodurch man 323 mg (91%) des gewünschten Produkts als einen weißen Feststoff erhält. ¹H-NMR (300 MHZ, CDCl₃) δ 9,35 (br, 2H), 7,38 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,00–7,20 (komplex, 7H), 6,86 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 6,58 (komplex, 3H), 6,40 (s, 1H), 6,31 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,91 (t, J = 3,9 Hz, 2H), 2,60 (br, 2H), 2,41 (br, 4H), 1,38–1,51 (Serie an m, 6H), MS (FD) 552 (M+), Elementaranalyse (berechnet/gefiinden) C 74,02/73,79), H (6,03/6,26), N (2,54/2,60).
Testverfahren
Allgemeines Präparationsverfahren
In den Beispielen, die die Verfahren erläutern, wird ein postmenopausales Modell verwendet, worin die Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungen auf die zirkulierenden Lipide bestimmt werden.
Fünfundsiebzig Tage alte weibliche Sprague Dawley Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten und haben für eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen Luftfeuchte von 40% gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
Dosierungsulan zur Gewebeentnahme
Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit der Testverbindung begonnen. 17α-Ethinylöstradiol oder die Testverbindung werden als Suspension 1% Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben ist. Die Tiere erhalten die Dosen täglich 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2 : 1, V : V) betäubt und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO₂ getötet, der Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht des Uterus wird bestimmt.
Cholesterinanalvse
Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation automatisiert.
Uteruseosino hilen eroxidasetest EPO
Die Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005% Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme für eine Minute bei 450 nm verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im Uterus ist ein Zeichen für die östrogene Aktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden langen Intervalls wird über den anfänglichen, linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
Ouelle der Verbindung
17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co, St. Louis, MO.
Einfluß der Verbindungen der Formel I auf das Serumcholesterin und die Bestimmung der Agonist/Antagonistaktivität
Die in der folgenden Tabelle I angegebenen Daten zeigen vergleichende Ergebnisse zwischen ovarektomierten Ratten, Ratten, die mit 17α-Ethinylöstradiol (EE₂, eine oral verfügbare Form von Östrogen) behandelt wurden und Ratten, die mit bestimmten erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt wurden. Obwohl EE₂ eine Verringerung beim Serumcholesterin verursacht, wenn es oral mit 0,1 mg/kg/Tag verabreicht wird, ruft es auch eine deutliche stimulatorische Wirkung auf den Uterus hervor, so daß das Uterusgewicht von EE₂ behandelten Ratten wesentlich höher ist, als das Uterusgewicht von ovarektomierten Testtieren. Die Uterusreaktion gegenüber Östrogen ist in der Technik gut bekannt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen verringern nicht nur allgemein das Serumcholesterin im Vergleich zu ovarektomierten Kontrolltieren, sondern die Mehrzahl der getesteten Verbindungen erhöht oder verringert das Uterusgewicht nur minimal. Im Vergleich zu den in der Technik bekannten östrogenen Verbindungen ist der Vorteil der Verringerung des Serumcholesterins ohne schädliche Beeinflussung des Uterusgewichts ziemlich selten und erwünscht.
Wie es in den folgenden Daten ausgedrückt ist, wird die Östrogenität auch durch die Evaluierung der schädlichen Reaktion der Eosinophileninfiltration in den Uterus ermittelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen verursachen keine Erhöhung der Anzahl der Eosinophilen, die in der Stromaschicht von ovarektomierten Ratten beobachtet werden, während Östradiol eine wesentliche, erwartete Erhöhung der Eosinophileninfiltration verursacht. Die in der folgenden Tabelle I enthaltenen Daten zeigen die Reaktion der Ratten pro Behandlung.
Tabelle 1
Zusätzlich zu den gezeigten Vorteilen der erfmdungsgemäßen Verbindungen, insbesondere im Vergleich zu Östradiol, belegen die obigen Daten eindeutig, dass die Verbindungen der Formel I keine Östrogen-Mimetika sind. Ferner lassen sich bei keiner Behandlung schädliche toxologische Effekte (Überleben) beobachten.
Osteoporosetestverfahren
Durch Befolgung des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung mit Kohlendioxid am 36. Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Wirkung auf die Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt und von andersartigem Gewebe befreit, und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Naßgewichts entleert, um die mit der voll-ständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Analyse zu ermöglichen.
Die rechten Femuren werden entnommen und digitalisierte Röntgenstrahlen werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm (NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt.
Gemäß der obigen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen und Ethinylöstradiol (EE₂) in 20% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin oral an Testtiere verabreicht.
Zusammenfassend verursacht die Ovarektomie der Testtiere eine signifikante Verringerung der Femurdichte im Vergleich zu intakten, mit Träger behandelten Kontrollen. Oral verabreichtes Ethinylöstradiol (EE₂) verhindert diesen Verlust, aber das Risiko der Uterusstimulierung durch diese Behandlung ist immer vorhanden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindern auch allgemein den Knochenverlust in einer dosisabhängigen Weise. Demnach sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung des postmenopausalen Syndroms, insbesondere der Osteoporose, brauchbar.
MCF-7 Proliferationstest
MCF-7 Brustadenokarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma, St. Louis, MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (VN), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM}, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (1 μg/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter Aktivkohle be handeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) (Testmedium) anstelle von 10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmedium entfernt (Ca²⁺/Mg²⁺ freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 μl (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Transfer zu ermöglichen. Es werden Reihenverdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt, und 50 μl werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 μl Testmedium auf ein Endvolumen von 200 μl überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin fiir 4 Stunden markiert (1 μCi/ Vertiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei –70°C für 24 Stunden gefolgt von einem Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigszintillation mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen.
DMBA-induzierte Brusttumorhemmune
Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis, Indiana, bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenz[a]anthrazen (DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, wobei die Messungen aufgezeichnet werden und das Tier wird das Experiment ausgewählt wird. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
Die Verbindungen der Formel I werden entweder über intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumoiflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.
Uterusfibrosetestverfahren
Test 1
Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man eine erfindungsgemäße Verbindung. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum 3 Monate.
Die Frauen werden während des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
Test 2
Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
Test 3
Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
Test 4
A. Induktion von fibroiden Tumoren in Meerschweinchen Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3 bis 5 mal pro Woche durch Injektion für 2 bis 4 Monate oder solange dosiert bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3 bis 16 Wochen verabreicht, und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnonunen und auf Tumorregression untersucht.
B. Implantation von humanem fibroidem Uterusgewebe in Nacktmäuse
Gewebe von humanen Leiomyomen wird in den Peritoneahaum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, terilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantation kultiviert. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3 bis 16 Wochen verabreicht, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des Organs zu untersuchen.
Test 5
A. Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5 bis 25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen potentiell zur Behandlung der Uterusfibrose geeignet sind.
Endometriosetestverfahren
Im Test 1 und 2 können die Wirkungen einer 14 Tage und 21 Tage dauernden Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf das Wachstum des explantierten endometrialen Gewebes untersucht werden.
Test 1
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östrusryklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt und in kleine Quadrate geschnitten, und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt.
Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet, worauf die endometrialen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert werden. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
Test 2
Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Utenishorn entfernt und in kleine Quadrate geschnitten, und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht.
Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro kg Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet, worauf die endometrischen Explantate und Nebennieren entfernt und gewogen werden. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östrusryklen werden aufgezeichnet.
Test 3
A. Operative Induktion der Endometriose
Autographien von endometrischem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um für einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel zu sorgen. Autologes endometriales Gewebe wird im Peritoneum von 5 bis 150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachstumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3 bis 16 Wochen verabreicht, worauf die Implantate entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen werden. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums zu bestimmen.
B. Implantation von humanem endometrialem Gewebe in Nacktmäuse
Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantation in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus einer erfindungsgemäßen Verbindung, die durch Gastrolavage täglich für 3 bis 16 Wochen verabreicht wird, worauf die Implantate entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen werden. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.
Test 4
A. Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen, GnRH, einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5 bis 25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Endometriose geeignet sind.
Testverfahren zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen/ Restenose
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein Potential zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen. Dies kann durch Verwendung kultivierter glatter Zellen gezeigt werden, die von der Kaninchenaorta stammen, wobei die Proliferation durch Messung der DNA Synthese bestimmt wird. Die Zellen werden durch das Explantationsverfahren erhalten, das in Ross, 7. of Cell. Bio. 50: 172 (1971) beschrieben ist. Die Zellen werden für 5 Tage in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen werden konfiuent, und das Wachstum stoppt. Die Zellen werden dann in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) überführt, das 0,5 bis 2% an Blutplättchen armes Plasma, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 1 mCi/ml ³H-Thymidin, 20 ng/ml aus Blutplättchen-stammendem Wachstumsfaktor und verschiedene Konzentrationen der vorliegenden Verbindungen enthält. Die Stammlösung der Verbindungen wird in Dimethylsulfoxid hergestellt und auf eine geeignete Konzentration (0,01 – 30 mM) im obigen Testmedium verdünnt. Die Zellen werden dann bei 37°C für 24 Stunden unter 5% CO₂/95% Luft inkubiert. Am Ende der 24 Stunden werden die Zellen in Methanol fixiert. Der ³H Thymidineinbau in die DNA wird dann durch Szintillationszählung bestimmt, wie dies in Bonin et al, Exp. Cell. Res. 181: 475–482 (1989) beschrieben ist.
Die Hemmung der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wird auch durch Bestimmung ihrer Wirkungen auf die exponentiell wachsenden Zellen gezeigt. Es werden glatte Muskelzellen aus Kaninchenaorten in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen in DMEM geimpft, das 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Nach 24 Stunden haften die Zellen. und das Medium wird durch DMEM ersetzt, das 10% Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Peni cillin, 100 μg/ml Streptomycin und gewünschte Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindungen enthält. Die Zellen läßt man für vier Tage wachsen. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt, und die Anzahl an Zellen in jeder Kultur wird durch Zählung mittels eines ZM-Coultercounters bestimmt.
Die Aktivität in den obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Potential bei der Behandlung der Restenose aufweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Linderung des postmenopausalen Syndroms bei Frauen, das das oben erwähnte Verfahren unter Verwendung von Verbindungen der Formel I und auch eine Verabreichung einer wirksamen Menge eines Östrogens oder Progestins an eine Frau umfasst. Diese Behandlungen sind besonders bei der Behandlung der Osteoporose und der Verringerung des Serumcholesterins brauchbar, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen Mittels erhält, während die erfindungsgemäßen Verbindungen die unerwünschen Nebenwirkungen von Östrogen und Progestin verhindern würden. Die Wirkung dieser Kombinationsbehandlungen in einem der obigen postmenopausalen Tests zeigt, daß die Kombinationsbehandlungen für die Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms bei Frauen brauchbar sind.
Es sind verschiedene Formen von Östrogen und Progestin im Handel erhältlich. Auf Östrogen basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen (0,01 bis 0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05 bis 0,15 mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone, wie Premarin® (Wyeth-Ayerst, 0,3 bis 2,5 mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise Medroxyprogesteron, wie Provera^® (Upjohn, 2,5 bis 10 mg/Tag), Norethyhiodrel (1,0 bis 10,0 mg/Tag) und Norethindron (0,5 bis 2,0 mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung ist Premarin, wobei Norethylnodrel und Norethindron bevorzugte Mittel sind, die auf Progestin basieren.
Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen und Progestin basierenden Mittels stimmt mit dem überein, was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal täglich verabreicht. Es kann aber auch eine zyklische Therapie insbesondere bei der Behandlung von Endometriose brauchbar sein oder akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle (1 bis 6 Monate) nach medizinischen Verfahren beschränkt werden, wie der Angioplastie.
Wie hierin verwendet, ist unter dem Ausdruck effektive Menge eine Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung zu verstehen, die zur Linderung der Symptome verschiedener pathologischer Zustände fähig ist, wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung wird natürlich bestimmt von den besonderen Umständen des jeweiligen Falls, wie der verabreichten Verbindung, dem Verabreichungsweg, dem Zustand des Patienten und dem zu behandelnden pathologischen Zustand. Eine typische Tagesdosis enthält eine nicht toxische Dosismenge von etwa 5 mg bis etwa 600 mg/Tag einer erfindungsgemäßen Verbindung. Bevorzugte Tagesdosen umfassen im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 80 mg/Tag.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf eine Vielzahl an Wegen verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Diese Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert, wobei die jeweilige Auswahl durch den behandelnden Arzt entschieden wird. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und wahlweise eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff hierfür enthält.
Die Gesamtwirkstoffe umfassen in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung, wobei unter pharmazeutisch annehmbar zu verstehen ist, daß der Träger, das Verdünnungsmittel, die Hilfsstoffe und das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und fiir den Empfänger nicht schädlich sind.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulieringen können durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannter und leicht verfügbarer Inhaltsstoffe hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen der Formel I mit oder ohne eine Östrogen- oder Progestinverbindung mit herkömmlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen geformt werden. Zu Beispielen für Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Träger, die für solche Formulierungen geeignet sind, gehören ua Füllstoffe und Streckmittel, wie Stärke, Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate, Bindemittel, wie Carboxyrnethylcellulose, andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpynolidon, Netzmittel, wie Glycerin, Zerfallhilfsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat, Mittel zur Verzögerung der Auflösung, wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumverbindungen, oberflächenaktive Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinnionostearat, adsorptive Träger, wie Kaolin und Bentonit, und Gleitmittel, wie Talk, Calciumstearat und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglycole.
Die Verbindungen können auch formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung oder als Lösungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise auf intramuskulärem, subkutanem oder intravenösem Weg. Zusätzlich sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so gestaltet werden, daß sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise an einem bestimmten physiologischen Ort möglicherweise über eine bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen, Umhüllungen und Schutzmatrizes können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt sein.
Die Verbindungen der Formel I werden alleine oder in Kombination mit einem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel in einer passenden Formulierung verabreicht. Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Formulierungen
In den folgenden Formulierungen ist unter Wirkstoff eine Verbindung der Formel I oder ein Salz oder Solvat hiervon zu verstehen.
Formulierung 1: Gelatinekapseln
Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt:
Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
Eine Tablettenformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:
Formulierung 2: Tabletten
Die Komponenten werden gemischt und zu Tabletten verpreßt.
Alternativ dazu werden Tabletten, die jeweils 2,5 bis 1000 mg Wirkstoff enthalten, folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 3: Tabletten
Der Wirkstoff die Stärke und die Cellulose werden durch ein 45 Mesh US Sieb gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein 14 Mesh US Sieb gegeben werden. Die so hergestellten Granulate werden bei 50°C bis 60°C getrocknet und durch ein 18 Mesh US Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und der Talk, die vorher durch ein 60 Mesh US Sieb gegeben werden, werden dann zu den Granulaten gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettiemiaschine zu Tabletten verpreßt werden.
Suspensionen, die jeweils 0,1 bis 1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 4: Suspensionen
Das Arzneimittel wird durch ein 45 Mesh US Sieb gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmackstoff und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rührung zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu bilden.
Eine Aerosollösung wird unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:
Formulierung 5: Aerosol
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt, worauf das Gemisch zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C gekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben wird. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Sodann werden die Ventileinheiten auf den Behälter gesetzt.
Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 6: Zäpfchen
Der Wirkstoff wird durch ein 60 Mesh U.S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Hierauf wird das Gemisch in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:
Formulierung 7: Intravenöse Lösung
Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro min intravenös verabreicht.
Formulierung 8: Kombinationskapsel I
Formulierung 9: Kombinationskapsel II
Formulierung 10. Kombinationstablette

Claims

Verbindung der Formel I
worin R₁ für H, OH, Halogen, OCO(C₁-C₆ Alkyl), OCO(Aryl), OSO₂(C₄-C₆ Alkyl), OCOO(C₁-C₆ Alkyl), OCOO(Aryl), OCONH(C₁-C₆ Alkyl) oder OCON(C₁-C₆ Alkyl)₂ steht, R₂ für Aryl, C₁-C₆ Alkyl, C₃-C₆ Cycloallcyl oder 4-Cyclohexanol steht, R₃ für O(CH₂)₂ oder O(CH₂)₃ steht, R₄ und R₅ wahlweise für CO(CH₂)₂CH₃, CO(CH₂)₃CH₃ oder C₁-C₆ Alkyl stehen oder R₄ und R₅ unter Kombination mit dem Stickstoff, an den sie gebunden sind, Piperidin, Morpholin, Pynolidin, 3-Methylpyrrolidin, 3,3-Dimethylpyrrolidin, 3,4-Dimethylpynolidin, Azepin oder Pipecolin bilden, R6 für
Aryl steht und Aryl für Phenyl steht, das wahlweise ein- bis dreimal mit C₁-C₆ Alkyl, C₁-C₆ Alkoxy, Halogen, Amino, Nitro oder Hydroxy substituiert ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₃ für -O(CH₂)₂ steht.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R₄ und R₅ Piperidin bilden.
Verfahren nach Anspruch 3, worin R₁ für -OH steht und R₂ für 4-Hydroxyphenyl steht.
Verbindung nach Anspruch 4, worin R₆ für
steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon und, wahlweise, eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer fibroiden Uteruserkrankung.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Endometriose.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung einer Proliferation der glatten Aortamuskelzellen oder einer Restenose.