PT731100E - Compostos farmaceuticos de benzotiofeno - Google Patents

Description

DESCRICÀO "COMPOSTOS FARMACÊUTICOS DE BENZOTIOFENO"

Este invento refere-se aos domínios da química farmacêutica e orgânica e providencia novos compostos de benzotiofeno que são úteis para o tratamento de várias indicações médicas associadas com o síndrome de pós-menopausa, doença fíbróide uterina, endometriose, e proliferação celular do músculo liso da aorta. "Síndrome pós-menopausa" é um termo usado para descrever várias situações patológicas que afectam frequentemente as mulheres que entraram ou completaram a metamorfose fisiológica conhecida por menopausa. Apesar das várias patologias serem contempladas pelo uso deste termo, os três principais efeitos do síndrome pós-menopausa são a fonte do termo médico maior respeitante a: osteoporose, efeitos cardiovasculares tais como hiperlipidemia, e cancro dependente de estrogénios, em particular cancro da mama e cancro do útero. A osteoporose descreve um grupo de doenças que surgem das várias etiologias, mas que são caracterizadas pela perda pura de massa óssea por unidade de volume. A consequência desta perda de massa óssea e ffactura óssea resultante é a falta de esqueleto para providenciar suporte estrutural adequado para o corpo.

Um dos tipos mais vulgares de osteoporose é o que está associado com a menopausa. A maioria das mulheres perde entre cerca de 20% e cerca de -2- Uuj 60% da massa óssea no compartimento trabecular do osso dentro de 3 a 6 anos após o final da menstruação. Esta perda rápida está geralmente associada com um aumento de resorção e formação óssea. No entanto, o ciclo resortivo é mais dominante, e o resultado é uma perda pura de massa óssea. A osteoporose é uma doença vulgar e grave entre as mulheres em pós-menopausa.

Existe um valor estimado de 25 milhões de mulheres nos Estados Unidos da América, que são afectadas com esta doença. Os resultadados da osteoporose são auxiliados pessoalmente e também são considerados uma grande perda económica devido à sua cronicidade e à necessidade de suporte extensivo e prolongado (hospitalização e cuidados de assistência doméstica) das sequelas da doença. Isto acontece especialmente em doentes de mais idade. Em adição, apesar da osteoporose não ser considerada geralmente como uma situação de ameaça de vida, uma taxa de mortalidade de 20% a 30% está relacionada com fracturas da anca em mulheres de idade madura. Uma grande percentagem desta taxa de mortalidade pode estar directamente associada com a osteoporose pós-menopausa. O tecido mais vulnerável no osso aos efeitos de osteoporose pós-menopausa é o osso trabecular. Este tecido é referido muitas vezes como um osso esponjoso ou inválido e está particularmente concentrado perto das extremidades do osso (perto das articulações) e nas vértebras da espinha dorsal. O tecido trabecular está caracterizado por pequenas estruturas osteóides que se inter-ligam entre si, assim como o tecido cortical mais sólido e denso que forma a superfície exterior e veio central do osso. Esta rede inter-ligada de trabéculas dá suporte lateral à estrutura cortical exterior e é crítico em relação à dimensão biomecânica da estrutura total. Na osteoporose pós-menopausa, é, principalmente, a resorção pura e a perda das trabéculas que conduz à falha e fractura do osso. A luz da -3- Uuj perda das trabéculas em mulheres pós-menopausa, não é de surpreender que as fracturas mais comuns sejam as associadas com os ossos que estão altamente dependentes do suporte trabecular, por exemplo, as vértebras, colo dos ossos que suportam peso tais como fémur e o antebraço. Na verdade, a ffactura da anca, as fracturas de coles, e as fracturas de compressão vertebral são marcas de entrada de osteoporose de pós-menopausa.

Neste momento, o único método geralmente aceite para o tratamento de osteoporose pós-menopausa é a terapia de substituição de estrogénios. Apesar da terapia ser geralmente bem sucedida, a concordância do doente com a terapia é principalmente baixa porque o tratamento com estrogénios produz frequentemente efeitos laterais indesejáveis.

Durante o tempo de pré-menopausa, a maioria das mulheres tem menos incidência de doenças cardiovasculares do que os homens de igual idade. Depois da menopausa, contudo, a taxa de doenças cardiovasculares em mulheres aumenta lentamente para igualar a taxa vista nos homens. Esta perda de protecção tem estado ligada à perda de estrogénio e, em particular, à perda de capacidade dos estrogénios para regular os níveis de lípidos do soro. A natureza de capacidade dos estrogénios para regular os lípidos do soro não é bem compreendida, mas a evidência para datar indica que os estrogénios podem regular os receptores de lípidos de baixa densidade (LDL) no fígado para remover o excesso de colesterol. Adicionalmente, os estrogénios parecem ter algum efeito na biosíntese de colesterol, e outros efeitos benéficos na saúde cardiovascular.

Tem sido referido na literatura que a pós-menopausa nas mulheres -4- Umj com terapêutica de substituição de estrogénios tem uma reposição de níveis de lípidos do soro para concentrações como as do estado de pré-menopausa. Assim, os estrogénios irão apresentar-se como sendo um tratamento razoável para esta condição. No entanto, os efeitos laterais da terapêutica de substituição de estrogénios não são aceitáveis por muitas mulheres, limitando assim o uso desta terapêutica. Uma terapêutica ideal para esta situação será um agente que irá regular o nível de lípidos do soro como acontece com os estrogénios, mas irá ficar isento dos efeitos laterais e riscos associados com a terapêutica de estrogénios. A terceira maior patologia associada com o sindrome pós-menopausa é o cancro da mama dependente de estrogénios e, com menor extensão, cancros de outros órgãos dependentes de estrogénios, em particular o útero. Apesar destas neoplasias não estarem apenas limitadas a mulheres em pós-menopausa, são mais frequentes na população de mais idade em pós-menopausa. A quimioterapia corrente destes cancros tem aliviado pesadamente pelo uso de compostos anti-estrogénios tais como, por exemplo, tamoxifen. Apesar destas misturas de agonistas-antagonistas terem efeitos benéficos no tratamento destes cancros e dos efeitos laterais de estrogénios serem toleráveis em situações agudas de ameaça de vida, não são ideais. Por exemplo, estes agentes podem ter efeitos estimuladores em certas populações de células de cancro no útero devido às suas propriedades estrogénicas (agonistas) e podem ser, portanto, contraprodutivos em alguns casos. Uma melhor terapêutica para o tratamento destes cancros será um agente que é um composto anti-estrogénico contendo propriedades negligíveis ou não contendo propriedades agonistas de estrogénio em tecidos reprodutivos.

Em resposta à necessidade evidente para novos agentes -5- (4Λη (Μ™'1 farmacêuticos que são capazes de aliviar os sintomas de, inter alia, sindrome pós-menopausa, o presente invento providencia novos compostos de benzotiofeno, suas composições farmacêuticas, e métodos de uso destes compostos para o tratamento de sindrome pós-menopausa e outras situações patológicas relacionadas com estrogénios tais como as descritas atrás. A fíbrose uterina (doença do útero fibróide) é um problema clínico velho e sempre presente que é conhecida sob uma variedade de nomes, incluindo doença de útero fibróide, hipertrofia uterina, leiomiomatose uterina, hipertrofia do miométrio, fíbrose uterina e metrite fibrótica. Essencialmente, a fíbrose uterina é uma situação onde existe uma deposição inadequada de tecido fibróide na parede do útero.

Esta situação é uma causa de dismenorreia e infertilidade das mulheres. A causa exacta desta condição é uma sugestão pobremente compreendida mas evidente que é uma resposta inadequada de tecido fibróide ao estrogénio. Uma tal situação foi criada em coelhos por administrações diárias de estrogénio durante 3 meses. Em porquinhos da índia, a situação foi produzida por administração diária de estrogénio durante quatro meses. Também, em ratazanas, o estrogénio causa hipertrofia semelhante. O tratamento mais comum de fíbrose uterina envolve processos cirúrgicos mas dispendiosos e algumas vezes uma fonte de complicações tais como a formação de infecções e adesões abdominais. Em alguns doentes, a cirurgia inicial é apenas um tratamento temporário e os fibróides diminuem. Nesses casos é realizada a histerectomia que termina eficazmente os fibróides mas também a vida reprodutiva do doente. Também, podem ser administrados antagonistas de hormona libertadora de gonadotropina, ainda o seu uso é -6- Uuj acomodado pelo facto de que podem conduzir à osteoporose. Assim, existe uma necessidade para novos métodos para o tratamento de fibrose uterina, e os métodos do presente invento satisfazem a sua necessidade. A endometriose é uma situação de dismenorreia grave, que é acompanhado de dores graves, hemorragia nas massas do endométrio ou cavidade peritoneal e muitas vezes leva à infertilidade. A causa dos sintomas desta situação parece ser o crescimento do endométrio ectópico que responde inadequadamente ao controle hormonal normal e são localizados em tecidos inadequados. Devido às suas situações inadequadas para o crescimento do endométrio, os tecidos parecem iniciar respostas do tipo inflamatório causando infiltração de macrófagos e uma cascata de eventos conduzindo à iniciação da resposta dolorosa. A etiologia exacta desta doença não é bem compreendida e o seu tratamento por terapêutica hormonal é diversa, pobremente definida, e marcada por vários efeitos laterais não desejados e talvez perigosos.

Um dos tratamentos desta doença é o uso de dose baixa de estrogénio para suprimir o crescimento do endométrio através do efeito de ligação negativo na libertação de gonadotropina central e subsequente produção de estrogénio nos ovários; no entanto, é muitas vezes necessário usar estrogénio continuamente para controlar os sintomas. Este uso de estrogénio pode conduzir muitas vezes a efeitos laterais indesejáveis e ainda o risco de cancro do endométrio.

Outro tratamento consiste de administração contínua de progestinas que induz amenorreia e por supressão de produção de estrogénios nos ovários pode causar regressões de crescimentos do endométrio. O uso de terapia de progestina crónica é muitas vezes acompanhado pelos efeitos laterais de CNS -7-

indesejáveis de progestinas e leva muitas vezes à infertilidade devido à supressão da função dos ovários.

Um terceiro tratamento consiste da administração de androgénios fracos, que são eficazes no controle da endometriose; no entanto, induzem efeitos de masculinização graves. Muitos destes tratamentos para a endometriose também têm sido implicados em causar uma perda óssea de grau suave com terapia continuada. Assim, são desejáveis novos métodos de tratamento de endometriose. A proliferação das células musculares lisas da aorta desempenha um papel importante nas doenças tais como arteriosclerose e estenose. A estenose vascular após angioplastia coronária transluminal percutânea (PTCA) têm-se revelado como uma resposta tecidular caracterizada por uma primeira fase, e outra fase posterior. A primeira fase, que ocorre horas a dias depois de PTCA, deve-se à trombose com alguns vasospasmos, enquanto que a fase posterior parece ser dominada por proliferação e migração excessiva de células musculares lisas da aorta. Nesta doença, o aumento da mobilidade celular e colonização por estas células musculares e macrófagos contribuem significativamente para a patogénese da doença. A proliferação e migração excessivas das células musculares lisas vasculares da aorta podem ser o mecanismo primário à reoclusão das artérias coronárias seguindo PTCA, ateroctomia, angioplastia de laser e cirurgia de "bypass" arterial. Ver "Intimai Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty", Austin et al., Journal of the American College of cardiology. 8:369-375 (Aug. 1985). A restenose vascular permanece como a maior complicação prolongada após intervenção cirúrgica de artérias bloqueadas por angioplastia -8-coronária transluminal percutânea (PTCA), arterioctomia, angioplastia de laser e cirurgia de "bypass" arterial. Em cerca de 35% dos doentes que se submetem a PTCA ocorre reoclusão dentro de três a seis meses depois do processo. As estratégias correntes para o tratamento de restenose vascular incluem a intervenção mecânica por meios, tais como extensores ou terapias farmacológicas incluindo heparina, heparina de baixo peso molecular, cumarina, aspirina, óleo de peixe, antagonista de cálcio, esteróides e prostaciclina. Estas estratégias têm falhado para restringir a taxa de reoclusão e têm sido ineficazes para o tratamento e prevenção de restenose vascular. Ver "Prevention of Restenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a 'Magic Bullet', " Hermans et ai, American Heart Journal. 122: 171-187 (July 1991).

Na patogénese de restenose a proliferação e migração celular excessiva ocorrem como um resultado de factores de crescimento produzidos por constituintes celulares no sangue e as paredes dos vasos arteriais danificadas que interpõem a proliferação de células musculares lisas em restenose vascular.

Os agentes que inibem a proliferação e/ou migração de células musculares lisas da aorta são úteis no tratamento e prevenção de restenose. O presente invento providencia para o uso de compostos como inibidores de proliferação de células musculares lisas da aorta e, portanto inibidores de restenose. A Patente Europeia EP 0062 503 refere-se aos compostos 6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-[4-(2-piperidino)etoxi)benzoíl]benzo[b]tiofeno e 6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-3-[4-(3-metilpirrolidino)etoxi)benzoíl]benzo[b]tiofeno, como antiestrogénios e androgénios. -9-

Na Patente Europeia EP 0471 609 é revelado um processo para a preparação de benzofurano, benzotiofeno, e derivados de indole ou indozilina. A Patente Europeia EP 0641 791 refere-se a derivados de benzotiofeno substituídos na posição 2 por um átomo de halogénio, um grupo alquilo inferior, ou um grupo cicloalquilo ou cicloalquenilo substituído facultativamente por um grupo alquilo inferior, um grupo hidroxilo, um grupo aciloxi ou um grupo oxo, como antiestrogénios. A Patente Europeia EP 0516 257 revela os 2-fenil benzo[b]furano e derivados de tiofeno como antiestrogénios. A Patente DE-B-1300575 revela os compostos de benzotiofeno como agentes de antifertilidade.

O presente invento refere-se a compostos de fórmula I

em que Ri é H, OH, halo, OCO(alquilo Cj-Có), OCO(arilo), OS02(alquilo C4-C6), OCOO(alquilo CrC6), OCOO(arilo), OCONH(alquilo CrC6), ou OCON(alquilo Ci-C6)2; - 10- Um R2 é arilo, alquilo CrC6, cicloalquilo C3-C6, ou 4-ciclohexanol; R3 é 0(CH2)2 ou 0(CH2)3; R4 e R5 combinam-se para formar, com o azoto ao qual estão ligados, piperidina, morfolina, pirrolidina, 3-metilpirrolidina, 3,3-dimetilpirroli-dina, 3,4-dimetilpirrolidina, azepina, ou pipecolina; D , \ \ Ró e ^ C= CH2 ou C=CH (alquilo Q -C51, em que "arilo" em Ri e R2 é fenilo substituído facultativamente 1 a 3 vezes com alquilo Q-Cô, alcoxi Q-Q, halo, amino ou hidroxi; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. O presente invento refere-se também a composições farmacêuticas que contêm os compostos de fórmula I, contendo facultativamente estrogénio ou progestina, e o uso destes compostos, só, ou em combinação com estrogénio ou progestina, para alívio dos sintomas de síndroma pós-menopausa, em particular osteoporose, situações patológicas relacionadas cardiovasculares, e cancro dependente de estrogénio. Como aqui usado, o termo "estrogénio" inclui compostos esteróidais contendo actividade estrogénica tal como, por exemplo, 17P-estradiol, estrona estrogénio conjugado (Premarin®), equine estrogénio, 17β-etinil estradiol, e semelhantes. Como aqui usado, o termo "progestina" inclui os compostos contendo actividade progestacional tal como, por exemplo, progesterona, noretilnodrel, nongestrel, megestrol acetato, e noretindrone.

Os compostos do presente invento também são úteis para a inibição -11- Uuj da doença fibróide uterina e endometriose em mulheres e proliferação de células musculares lisas da aorta, em particular restenose em seres humanos.

Um aspecto do presente invento inclui os compostos de fórmula (I)

em que Rj é H, OH, halo, OCO(alquilo Ci-C6), OCO(arilo), OS02(alquilo C4-C6), OCOO(alquilo CrC6), OCOO(arilo), OCONH(alquilo C,-C6), ou OCON(alquilo CrC6)2; R2 é arilo, alquilo CpC6, cicloalquilo C3-Cô, ou 4-ciclohexanol; R3éO(CH2)2ouO(CH2)3; R4 e R5 combinam-se para formar, com o azoto ao qual estão ligados, piperidina, morfolina, pirrolidina, 3-metilpirrolidina, 3,3-dimetilpi-rrolidina, 3,4-dimetilpirrolidina, azepina, ou pipecolina; Ró e ^ C= CH2 ou C=CH (alquilo C, -C51. - 12- Ι/ΐΑη

em que "arilo" em R, e R2 é fenilo substituído facultativamente 1 a 3 vezes com alquilo Ci~C6, alcoxi Ci-C6, halo, amino ou hidroxi; e seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis.

Os termo gerais usados na descrição de compostos aqui descritos contêm os seus significados usuais. Por exemplo, "alquilo" refere-se a cadeias alifáticas principais ou ramificadas de 2 a 6 átomos de carbono incluindo etilo, propilo, isopropilo, butilo, n-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo e isohexilo. Analogamente, o termo "alqueno C2-C6" representa alquenos principais ou ramificados contendo 2 a 6 átomos de carbono e inclui propileno, etileno, isopropileno, butileno, n-butileno, hexileno, e pentileno. O termo "arilo" inclui fenilo substituído facultativamente 1 a 3 vezes com alquilo Q-Cô, alcoxi Ci-C6, halo, amino, nitro, ou hidroxi.

Preparação de Benzotiofeno

Os compostos do presente invento são derivados de benzo[b]tio- feno que é designado e numerado de acordo com o índex do Anel, The American Chemical Society, como se segue

Nos processos para a preparação dos compostos do presente invento, o material inicial é um composto de fórmula II ,3. Uuj

em que R7 é um grupo de protecção hidroxi; e R3, R4 e R5 são como atrás definidos; ou um seu sal.

Apesar da base livre de um composto de fórmula II ser um material inicial aceitável, a forma de um sal de adição ácida, em particular o sal hidrocloreto, é muitas vezes 0 mais conveniente.

Os compostos de fórmula II são conhecidos no domínio e são preparados essencialmente através dos métodos descritos nas Patentes dos Estados Unidos da América Nos. 4 133 813; 4 380 635; e 4 418 068, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Em geral um precursor de benzotiofeno de fórmula III

III - 14- ί/luj é preparado através de processos conhecidos. Tipicamente, os dois grupos hidroxi são protegidos por grupos de protecção hidroxi conhecidos que são capazes de resistir à acilação sob condições padrão de Fiedel-Crafts (formando os grupos de protecção R5 dos compostos de fórmula II) e subsequente redução por um agente de redução forte. Os grupos de protecção hidroxi preferidos são alquilo C1-C4, e é especialmente preferido o metilo. Ver, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos da América atrás incorporadas, J. W. Barton, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie (ed.), Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 2, and T. W. Green, "protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981, Chapter 7.

Seguindo a preparação do desejado precursor de fórmula III protegido, o precursor é acilado, usando condições de Friedel-Crafts padrão, com um composto de fórmula IV

em que n, R3, R4 e R5 são como atrás definidos; e R é cloro, bromo, iodo, ou um grupo éster de activação. A preparação dos compostos de fórmula IV, assim como os métodos de acilação preferidos, são revelados nas Patentes dos Estados Unidos da América atrás referidas.

I I - 15 . ί/ÍMy R4 e R5 são combinados, sendo preferidos 1-piperidinilo e 1-pirrolidinilo. Destes, o grupo piperidino é especialmente preferido.

Depois da acilação e, portanto, preparação de um composto de fórmula II, os compostos do presente invento em que R7 é -OH são preparados por adição de um composto de fórmula II ou de um seu sal, a um solvente apropriado, e depois reacção do composto de fórmula II com um agente de redução tal como por exemplo, hidreto de alumínio e lítio (LAH), sob um gás inerte tal como azoto.

Os solventes apropriados incluem qualquer solvente ou mistura de solventes que ficará inerte sob condições de redução. Os solventes adequados incluem éter dietílico, dioxano, e tetrahidrofurano (THF). A forma anidra destes solventes é preferida, e é especialmente preferido o THF anidro. A temperatura utilizada neste passo é aquela que é suficiente para efectuar o final da reacção de redução. A temperatura ambiente, na gama de 17°C a 25°C, é em geral adequada. O período de tempo para este passo é a quantidade necessária para ocorrer a reacção. Tipicamente, esta reacção leva 1 a 20 horas. O tempo óptimo pode ser determinado por controle do progresso da reacção através de técnicas cromatográficas convencionais. O carbono-α (carboxi) pode então ser modificado nos grupos definidos por Rg.

Quando Ró é um grupo da fórmula >C=CH(alquilo C1-C5), um composto apropriado de fórmula Ia num solvente adequado é arrefecido entre 16 - 10°C e -25°C. Em seguida, o hidroxi é eliminado. Esta eliminação pode ser realizada por adição de uma base tal como dimetilaminopiridina (DMAP) seguido por adição de cloreto de metanossulfonilo, seguido outra vez por DMAP. Alternadamente, os alquenos desejados podem ser preparados por reacção do composto carbonilo com ileto de fosfónio, tal como R2+P-CH(alquilo C]-C5). Também podem ser utilizados outros compostos organofosforosos, tais como Ar2P(0)CHR ou (R0)2P(0)CHR, (Boutagy et ai., Chem. Reviews, 74, 87 (1974)). São preparados outros compostos por substituição dos grupos hidroxi R] e R2 com um grupo da fórmula -0-CO-(alquilo Ci-C6), -O-CO-Ar em que Ar é facultativamente fenilo substituído, ou -0-S02-(alquilo C4-C6) através de processos bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos da América N°. 4 358 593, supra.

Por exemplo, quando é desejado um grupo -0-CO-(alquilo CrC6) ou -O-CO-Ar, faz-se reagir o composto dihidroxi de fórmula I com um agente tal como cloreto de acilo, brometo, cianeto, ou azida, ou com um anidrido apropriado ou misturado com anidrido. As reacções são efectuadas convenientemente num solvente básico tal como piridina, lutidina, quinolina ou isoquinolina, ou num solvente de amina terciária tal como trietilamina, tributilamina, metilpiperidina, e semelhantes. A reacção também pode ser efectuada num solvente inerte tal como acetato de etilo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, dioxano, dimetoxietano, acetonitrilo, acetona, metil etil cetona, e semelhantes, ao qual foi adicionado pelo menos um equivalente de um eliminador de ácido, tal como amina terciária. Se desejado, podem ser usados catalisadores de acilação tais como 4-dimetilaminopiridina ou 4-pirrolidinopiridina. Ver, por exemplo, Haslam, et al, Tetrahedron. 36: 2409-2433 (1980). - 17- U*l 4*^

As reacções de acilação que providenciam os grupos Ri e R2 atrás referidos são efectuadas a temperaturas moderadas na gama de -25°C a 100°C, ffequentemente sob uma atmosfera de azoto tal como azoto gasoso. No entanto, a temperatura ambiente é em geral adequada para a reacção se realizar.

Estas acilações do gmpo hidroxi também podem ser realizadas por reacções catalizadas por ácido dos ácidos carboxílicos apropriados em solventes orgânicos inertes ou aquecidos. São usados os catalisadores ácidos tais como ácido sulfurico, ácido polifosfórico, e metanossulfónico.

Os grupos Ri e R2 também podem ser obtidos por formação de um éster activo do ácido apropriado, tal como os ésteres formados por estes reagentes conhecidos tais como diciclohexilcarbodiimida, acilimidazoles, nitrofenóis, pentaclorofenol, N-hidroxisuccinimida, e 1-hidroxibenzotriazole. Ver, por exemplo, Buli. Chem. Soc. Japan, 38: 1979 (1965), e Chem. Ber.. 788 e 2024 (1970).

Cada uma das técnicas anteriores que providencia os grupos -O-CO-(alquilo CrC6) e -O-CO-Ar é efectuada em solventes como atrás discutidas. Estas técnicas que não produzem um produto ácido no decorrer da reacção, não necessitam evidentemente, do uso de um eliminador de ácido na mistura reaccional.

Quando é desejado um composto de fórmula I em que Rj e R2 é -O-S02-(alquilo CrC6), faz-se reagir o composto dihidroxi de fórmula I, por exemplo, com um derivado do ácido sulfónico apropriado tal como um cloreto de sulfonilo, brometo, ou um sal de sulfonil amónio, como referido por King and Monoir, J. Am. Chem. Soc.. 97 2566-2567 (1975). O composto dihidroxi também se pode fazer reagir com o anidrido sulfónico apropriado. Estas reacções são - 18-

efectuadas sob condições tais como foram atrás explicadas na discussão de reacção com os halogenetos ácidos.

Os compostos de fórmula I podem ser preparados de modo que e R2 contenham diferentes grupos de protecção biológicos ou, de preferência, são preparados de modo que Rj e R2 contenham cada um deles o mesmo grupo de protecção biológico. Os grupos de protecção preferidos incluem -OCH3, -O-CO-C(CH3)3, -0-C0-C6H5, e -O-S02-(CH2)3-CH3.

Apesar da forma de base livre dos compostos de fórmula I poder ser usada nos métodos do presente invento, é preferido preparar e usar uma forma de sal farmaceuticamente aceitável. Assim, os compostos usados nos métodos deste invento formam principalmente sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis com uma grande variedade de ácidos orgânicos e inorgânicos, e incluem os sais fisiologicamente aceitáveis que são usados muitas vezes em química farmacêutica. Tais sais também são parte deste invento. Os ácidos inorgânicos típicos usados para formar estes sais incluem os ácidos clorídrico, bromídrico, iodídrico, nítrico, sulfurico, fosfórico, e hipofosfórico. Os sais derivados de ácidos orgânicos, tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos fenilo substituído, ácidos hidroxialcanóicos e hidroxialcanodióicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos aromáticos e alifáticos também podem ser usados. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis incluem assim acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoa-to, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, brometo, isobutirato, fenilbutirato, β-hidroxibutirato, butino-l,4-dioato, hexino-l,4-dioato, caprato, caprilato, cloreto, cinamato, citrato, formato, fumarato, glicolato, heptanoato, hipurato, lactato, malato, maleato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, isonicotinato, nitrato, oxalato, ftalato, tereftalato, fosfato, monohidrogenofosfato, -19- (/l/Uuj dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, propiolato, propionato, fenilpro-pionato, salicilato, sebacato, succinato, suberato, sulfato, bissulfato, pirosulfato, sulfito, bissulfíto, sulfonato, benzenossulfonato, p-bromofenilsulfonato, cloro-benzenossulfonato, etanossulfonato, 2-hidroxietanossulfonato, metanossulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, p-toluenossulfonato, xilenossulfo-nato, e tartarato. Um sal preferido é o sal hidrocloreto.

Os sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis são formados tipicamente por reacção de um composto de fórmula I com uma quantidade equimolar ou quantidade em excesso de ácido. Os reagentes são combinados em geral num solvente mútuo tal como éter dietílico ou acetato de etilo. O sal precipita geralmente da solução dentro de cerca de uma hora a 10 dias e pode ser isolado por filtração ou o solvente pode ser retirado por métodos convencionais.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis aumentaram geralmente as características de solubilidade comparadas com o composto a partir do qual são derivados, e assim são muitas vezes mais responsáveis pela formulação como líquidos ou emulsões.

Os exemplos seguintes são apresentados em adição para ilustrar a preparação de compostos do presente invento. Não se pretende que o invento seja limitativo no âmbito de quaisquer dos exemplos seguintes.

Os valores de H RMN e C RMN são medidos como indicado a 300 e 75, respectivamente. Os deslocamentos químicos de 'H RMN são registados como valores de δ em ppm relativo ao solvente de RMN utilizado. As constantes de ligação de *H RMN são registadas em Hertz (Hz) e referem-se a multiplicidades aparentes. A multiplicidade é indicada como se segue: s (singuleto); δ (dupleto), t (tripleto), q (quarteto); m (multipleto); comp -20- (complexo), br (largo), e app (aparente). A cromatografía em coluna é realizada de acordo com o método de Still (Still, W. C.; Kahn, M.; Mitra, A J. Org. Chem. 1978, 43, 2923) excepto quando indicado de outro modo com sílica gel EM Science (porosidade 230-400 ASTM). A cromatografía radial é realizada num Chromatotron usando pratos de 1, 2 ou 4 mm. Todas as reacções ao ar e/ou sensíveis à humidade são realizadas em atmosfera de árgon ou azoto em material de vidro seco rigorosamente. Em todos os casos, as concentrações são realizadas sob pressão reduzida com um evaporador rotativo.

Preparação 1

A uma solução de 1,00 g (1,96 mmol) de raloxifeno com agitação em 20 mL de THF à temperatura ambiente é adicionado 1,00 g (8,2 mmol) de Ν,Ν-dimetilaminopiridina seguido por 0,90 g de cloreto de t-butildimetilsililo (6 mmol). Após 12 horas, a reacção é diluída com água e extraída com clorofórmio. Os extractos orgânicos combinados são secos (sulfato de sódio) e concentrados. O óleo é extraído em acetato de etilo e o precipitado resultante é filtrado. O filtrado é concentrado e purificado por cromatografía rápida (sílica gel, acetato de etilo) para dar 1,1 g (80%) do produto desejado sob a forma de um óleo amarelo espesso:

Espectro de 'H-RMN (300 MHz, CDC13) δ=7,76 (d, J=8,9 Hz, 2H), 7,68 (d, J=9,0 Hz, 1H), 7,22-7,29 (m, 3H), 6,88 (dd, J=8,9, 3,1 Hz, 1H), 6,72 (d, J=9,l Hz, 2H), 6,63 (d, J=9,l Hz, 2H), 4,10 (larga, 2H), 2,79 (larga, 2H), 2,54 (larga, -21 -

4Η), 1,62 (larga, 4H), 1,25 (larga, 2H), 1,01 (s, 9H), 0,93 (s, 9H), 0,22 (s, 6H), 0,06 (s, 6H);Espectro de Massa (FD) 701 (M+); IV (CHC13) 2934, 1642, 1599, 1259 cm'1;

Análise Elementar: Valores teóricos/valores encontrados C (68,43/68,53), H (7,97/7,92), N (2,00/2,23).

Preparação 2

A uma solução de 2,04 g (2,91 mmol) do produto da Preparação 1 com agitação a -78°C em 10 mL de THF é adicionado gota a gota 4,16 mL de uma solução 1,4 M em éter dietílico (5,82 mmol). Após 15 minutos, a reacção é arrefecida com excesso de bicarbonato de sódio aquoso saturado e extraído com acetato de etilo. Os extractos orgânicos combinados são lavados com salmoura, secos (MgS04), filtrados e concentrados. O material resultante é purificado por cromatografia radial (sílica gel, 4mm, mistura 2,5:2,5:0,1:0,1 de hexano.acetato de etilo:trietilamina:MeOH) para dar 1,70 g (81 %) do produto desejado sob a forma de uma espuma esbranquiçada:

Espectro de 'H-RMN (300 MHz, CDC13) 5=7,31-7,36 (m, 5H), 7,17 (d, J=2,9 Hz, 1H), 6,81 (d, J=8,9 Hz, 4H), 6,84 (dd, J=9,0, 2,9 Hz, 1H), 4,12 (larga, 2H), 2,81 (larga, 2H), 2,59 (larga, 4H), 1,65 (s, 3H), 1,63 (larga, 4H), 1,45 (larga, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,97 (s, 9H), 0,21 (s, 6H), 0,19 (s, 6H);Espectro de Massa (FD) 718 (M+); IV (CHC13) 2934, 1606,1467, 1525 cm·1; - 22 - (/14η

Análise Elementar: (Valores teóricos/valores encontrados): C (68,57/68,93), H (8,28/8,26), N (1,95/2,10).

Preparação 3

A uma solução de 1,70 g (2,36 mmol) do produto da Preparação 2 com agitação em 20 mL de CH2C12 a 0°C é adicionado 461 mg (3,78 mmol) de Ν,Ν-dimetilaminopiridina seguido por 0,27 mL (3,55 mmol) de cloreto de metanossulfonilo. Após meia hora, é adicionado uma segunda porção de 461 mg (3,78 mmol) de Ν,Ν-dimetilaminopiridina e a solução é deixada aquecer até à temperatura ambiente. Depois de 20 horas, a mistura reaccional é vertida em salmoura e extraída subsequentemente com acetato de etilo. Os extractos orgânicos combinados são lavados com salmoura, secos (MgS04), filtrados, e concentrados. A purificação através de cromatografia radial (sílica gel, 2 mm, mistura 2,5:2,5:0,1:0,1 de hexano:acetato de etilo:trietilamina:MeOH) dá 1,56 g (94%) do produto desejado sob a forma de uma espuma branca:

Espectro de 'H-RMN (300 MHz, CDC13) δ=7,44 (d, J=2,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J=8,8 Hz, 2H), 7,22 (t ap, J=9,0 Hz, 3H), 6,78-6,86 (complexo, 5H), 5,96 (s, 1H), 5,17 (s, 1H), 4,00 (t, J=4,l Hz, 2H), 2,60 (t, J=4,0 Hz, 2H), 2,38-2,41 (complexo, 4H), 1,41-1,50 (complexo, 4H), 1,38-1,40 (m, 2H), 0,98 (s, 9H), 0,92 (s, 9H), 0,22 (s, 6H), 0,18 (s, 6H); Espectro de Massa (FD) 700 (M+); IV (CHC13) 2934, 1605,1466,1265 cm'1; -23-

Análise Elementar: (Valores teóricos/valores encontrados): C (70,34/70,49), H (8,21/8,14), N (2,00/2,10).

Exemplo 1

A uma solução de 0,42 g (0,61mmol) do produto da Preparação 3 com agitação em 5 mL de THF, a 0°C, é adicionado fluoreto de tetrabutilamónio (1,51 mL de uma solução 1,0 M em THF, 1,51 mmol). Após 15 minutos, é adicionado à reacção bicarbonato de sódio aquoso saturado e a mistura é extraída subsequentemente com acetato de metilo. Os extractos orgânicos combinados são lavados com salmoura, secos (MgS04), filtrados, e concentrados. O material resultante é purificado por cromatografia radial (sílica gel, 2 mm, mistura 2,5:2,5:0,70:0,30 de hexanos:acetato de etilo:MeOH:trietilamina) para dar 250 mg (87%) do produto desejado, sob a forma de um sólido branco:

Espectro de lH-RMN (300 MHz, CDC13) δ=9,80 (s, 2H),7,36 (d, J=9,2 Hz, 2H), 7,23-7,30 (complexo, 3H), 7,04 (d, J=9,0 Hz, 1H), 6,84 (d, J=9,l Hz, 2H), 6,74 (dd, J=8,9, 2,5 Hz, 1H), 6,70 (d, J=9,l Hz, 2H), 5,96 (s, 1H), 5,11 (s, 1H), 4,01 (t, J=3,8 Hz, 2H), 2,60 (t, J=3,9 Hz, 2H), 2,40 (m, 4H), 1,37-1,51 (séries de m, 6H); Espectro de Massa (FD) 472 (M+); IV (CHC13) 3530, 2934, 1605, 1465, 1264 cm'1 24. ^

Processo Teste

Processo Geral de Preparação

Nos exemplos que ilustram os métodos, foi usado um modelo pós-menopausa em que foram determinados os efeitos de diferentes tratamentos por circulação de lípidos. São obtidas ratazanas-fêmeas Sprague Dawley com setenta e cinco dias de idade (gama de pesos de 200 a 225 g) a partir de Charles River Laboratories (Portage, MI). Os animais são ovariectomizados bilateralmente (OVX) ou expostos a um processo de cirurgia Sham em Charles River Laboratories, e depois remetidos após uma semana. Depois da chegada, são guardados em gaiolas de metal suspensas em grupos de 3 ou 4 por gaiola e têm acesso a comida ad libitum (conteúdo de cálcio aproximadamente de 0,5%) e água durante uma semana. A temperatura ambiente é mantida entre 22,2°±1,7°C com uma humidade relativa mínima de 40%. O fotoperíodo na câmara é de luz durante 12 horas e escuro durante 12 horas.

Coleccão de Regímen de Doseamento a Tecidos. Depois de um período de aclimatização de uma semana ( portanto, duas semanas post-OVX) é iniciado o doseamento diário com o composto teste. O 17a-etinil estradiol ou o composto teste é dado oralmente, excepto quando estabelecido de outro modo, sob a forma de uma suspensão em 1% de carboximetilcelulose ou dissolvido em 20% de ciclodextrina. Os animais foram doseados diariamente durante 4 dias. Seguindo o regímen de doseamento, os animais foram pesados e anesteziados com uma mistura 2:1 de cetaminaixilazina (V:V) e é recolhido uma amostra de sangue por punção cardíaca. Os animais são depois sacrificados por asfixia com CO2, 0 útero é removido através de uma incisão na linha média, e é determinado um peso do útero humedecido. .25.Uuj

Análise de Colesterol. As amostras de sangue são deixadas coagular à temperatura ambiente durante 2 horas, e o soro é obtido depois de centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm. O colesterol no soro é determinado usando um ensaio de colesterol de alta resolução Boehringer Mannheim Diagnostics. O colesterol é rapidamente oxidado em colestenona-4,3 e peróxido de hidrogénio. Faz-se depois reagir o peróxido de hidrogénio com fenol e 4-aminofenazona na presença de peroxidase para produzir um pigmento de p-quinona imina, que é lido espectrofotometricamente a 500 nm. A concentração de colesterol é depois calculada em relação a uma curva padrão. O ensaio total é automatizado usando um Biomek Automated Workstation.

Ensaio de Peroxidase Eosinófilo Uterino (ΈΡΟ). Os úteros são mantidos a 4°C até ao momento da análise enzimática. Os úteros são depois homogeneizados em 50 volumes de tampão 50mM Tris (pH-8,0) contendo 0,005% Triton X-100. Por adição de peróxido de hidrogénio a 0,1% e O-fenilenodiamina 10 mM (concentrações finais) em tampão Tris, o aumento na absorvância é controlado durante um minuto a 450 nm. A presença de eosinófilos nos úteros é uma indicação de actividade estrogénica de um composto. A velocidade máxima de um intervalo de 15 segundos é determinada pela porção linear, inicial, da curva de reacção.

Fonte de Composto: O 17a-etinil estradiol foi obtido a partir de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

Influência de Compostos de Fórmula I no Colesterol do Soro e Determinação de Actividade Agonista/Não-Agonista

Os valores obtidos mostram resultados comparativos entre -26- (/Λη ratazanas ovariectomizadas, ratazanas tratadas com 17a-etinil estradiol (EE2; uma forma de estrogénio disponível oralmente), e ratazanas tratadas com certos compostos do presente invento. Apesar de EE2 ter causado uma diminuição no colesterol do soro quando administrado oralmente a 0,1 mg/kg/dia, exerceu também uma acção estimuladora no útero de modo que o peso do útero EE2 era substancialmente superior ao peso do útero de animais teste ovariectomizados. Esta resposta do útero ao estrogénio é bem reconhecida no domínio. Não só os compostos do presente invento reduzem geralmente o colesterol do soro comparado com os animais controlo ovariectomizados, mas o peso do útero foi apenas aumentado minimamentepara diminuição ligeira com a maioria dos compostos da fórmula testados. Comparado com os compostos estrogénicos conhecidos no domínio, o benefício da redução do colesterol do soro sem afectar adversamente o peso de úteros é bastante raro e desejável. A estrogenicidade também foi alcançada por avaliação da resposta adversa de infiltração de eosinófilos no útero. Os compostos do presente invento não causaram qualquer aumento no número de eosinófilos observados na camada estromal de ratazanas ovariectomizadas, enquanto que o estradiol causa um aumento substancial, esperado em infiltração de eosinófilos.

Em adição às vantajens demonstradas dos compostos do presente invento, em especial quando comparado com o estradiol, os compostos de Fórmula I não são miméticos de estrogénio. Além disso, não foram observados efeitos toxicológicos prejudiciais (sobrevivência) com qualquer tratamento.

Processo Teste de Osteoporose

Seguindo o Processo de Preparação Geral, infra, as ratazanas são -27- (/Λη tratadas diariamente durante 35 dias (6 ratazanas por grupo de tratamento) e sacrificadas por asfixia de dióxido de carbono no 36° dia. O período de tempo de 35 dias é suficiente para permitir a redução máxima na densidade óssea, medida como aqui descrito. No momento do sacrifício, os úteros são removidos, dissecados livres de tecido estranho, e os conteúdos de fluido são expelidos antes da determinação de peso humedecido com o fim de confirmar a deficiência de estrogénios associada com a ovariectomia. Os úteros são depois colocados em 10% de formalina tamponizada neutra para permitir a análise histológica subsequente.

Os fémures direitos são cortados e os raios-X digitalizados gerados e analizados por um programa de análise de imagem (NIH image) na metáfise distai. O aspecto próximo das tíbias destes animais são também varridos por tomografia computarizada quantitativamente.

De acordo com os processos anteriores, os compostos do presente invento e o etinil estradiol (EE2) em 20% de hidroxipropil β-ciclodextrina são administrados oralmente para testar os animais.

Em resumo, a ovariectomia dos animais teste causa uma redução significativa na densidade femural comparada com os controles tratados de veículo intacto. O etinil estradiol (EE2) administrado oralmente impediu esta perda, mas o risco de estimulação uterina com este tratamento está ainda presente.

Os compostos do presente invento impedem a perda óssea de uma forma dependente da dose em geral. De acordo, os compostos do presente invento são úteis para o tratamento de sindroma pós-menopausa, em particular a osteoporose. -28-

Ensaio de Proliferação MCF-7 Células adenocarcinoma de peitos MCF-7 (ATCC HTB 22) são mantidas em MEM (meio mínimo essencial, fenol, Sigma, St. Lois, MO) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) (V/V), L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), HEPES {(N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 2-etanossulfónico] 10 mM}, aminoácidos não essenciais e insulina bovina (1 μg/mL) (meio de manutenção). Dez dias antes do ensaio, as células MCF-7 são sacudidas para manter o meio suplementado com 10% de dextrano revestido de carvão extraído do soro bovino fetal (DCC-FBS) meio de ensaio) em vez de 10% FBS para esvaziar os pontos internos de esteróides. As células MCF-7 são removidos a partir de balões de manutenção usando meio de dissociação celular (Ca++/Mg++ HBSS livre (fenol livre) suplementado com HEPES 10 mM e EDTA 2 mM). As células são lavadas duas vezes com meio de ensaio e ajustado para 80 000 células/mL. São adicionados 100 pL (8 000 células) aproximadamente a fontes de microculturas de fundo redondo (Costar 3596) e incubados a 37°C num incubador humidificado de CO2 a 5% durante 48 horas para permitir a aderência celular e equilíbrio depois da transferência. As séries de diluições de medicamentos ou DMSO como um controle de diluente são preparados num meio de ensaio e 50 pL transferidos para triplicar microculturas seguido por um meio de ensaio de 50 pL para um volume final de 200 pL. Depois de mais 48 horas a 37°C num incubador humidificado de C02 a 5%, as microculturas são pulsadas com timidina (luCi/fonte) durante 4 horas. As culturas são terminadas por congelação a -70°C durante 24 horas seguido por derreter e colher de microculturas usando um Skatron Semiautomatic Cell Harvester. As amostras são contadas por cintilação líquida usando um contador Wallac Beta Place β.

29 Uuf

Inibição de Tumor Mamário Induzido-DMBA

Os tumores mamários dependentes de estrogénio são produzidos em ratazanas fêmeas Sprague-Dawley que são obtidas a partir de Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. A cerca de 55 dias de idade, as ratazanas recebem uma administração oral simples de 20 mg de 7,12-dimetilbenzeno[a]an-traceno (DMBA). A cerca de 6 semanas após a administração de DMBA, as glândulas mamárias são palpadas todas as semanas para detectar o aparecimento de tumores. Sempre que aparece um ou mais tumores, são medidos os diâmetros maior e mais pequeno de cada tumor com um calibrador métrico, são registadas as medições, e o animal é seleccionado para experiência. É feita uma tentativa para distribuir uniformemente as várias dimensões de tumores nos grupos tratados e de controle de modo que os tumores com tamanho médio são distribuídos equivalentemente entre os grupos teste. Os grupos controle e os grupos teste para cada experiência contêm 5 a 9 animais.

Os compostos de Fórmula I são administrados quer através de injecções intraperitoneal em 2% de acácia, quer oralmente. Os compostos administrados oralmente são quer dissolvidos quer suspensos em 0,2 mL de óleo de milho. Cada tratamento, incluindo os tratamentos controle de acácia e óleo de milho, é administrado uma vez por dia a cada animal teste. Seguindo a medida do tumor inicial e a selecção de animais teste, os tumores são medidos cada semana pelo método atrás referido. O tratamento e as medições de animais continuam durante 3 a 5 semanas, altura em que as áreas finais dos tumores são determinadas. Para cada composto e tratamento controle, é determinado a variação da área média do tumor. -30-

Processos Teste de Fibrose Uterina

Teste 1 São administrados com um composto do presente invento entre 3 e 20 mulheres com fibrose uterina. A quantidade de composto administrado é de 0,1 a 1000 mg/dia, e o período de administração é de 3 meses.

As mulheres são observadas durante o período de administração, e até 3 meses depois da administração descontínua, para efeitos na fibrose uterina.

Teste 2 É usado o mesmo processo que no Teste 1, excepto que o período de administração é de 6 meses.

Teste 3 É usado o mesmo processo que no Teste 1, excepto que o período de administração é de 1 ano.

Teste 4 A. Indução de tumores fibróides em porquinhos da índia E usado estimulação de estrogénio prolongada para induzir leiomiomatose em porquinhos da índia fêmeas sexualmente maduras. Os animais são doseados com estradiol 3 a 5 vezes por semana por injecção durante 2 a 4 meses ou até aumentar os tumores. Os tratamentos consistindo de um composto -31 -

Uuf do invento ou veículo é administrado diariamente durante 3-16 semanas e depois os animais são sacrificados e os úteros são pesados e analizados para regressão de tumor B. Implantação de tecido fibróide uterino humano em ratinhos nus

Os tecidos de leiomiomas humanos são implantados na cavidade peritoneal e ou miométrio uterino de ratinhos nus, fêmeas, castrados sexualmente maduros. Os estrogéneos exógenos são fornecidos para induzir o crescimento do tecido explantado. Em alguns casos, são feitas culturas de células de tumor mais pesadas in vitro antes da implantação. O tratamento consistindo de um composto ou veículo do presente invento é fornecido por lavagem gástrica numa base diária durante 3 a 16 semanas e os implantes são removidos e medidos para crescimento ou regressão. No tempo de sacrifício, o útero é pesado para se avaliar o estado do órgão.

Teste 5 A O tecido de tumores fibróides uterinos humanos é pesado e mantido, in vitro, como culturas primárias não transformadas. As espécimens cirúrgicas são empurradas através de uma rede esterilizada ou filtro, ou alternadamente retiradas do tecido em redor para produzir uma simples suspensão celular. As células são mantidas em meio contendo 10% de soro e antibiótico. São determinadas as taxas de crescimento na presença e ausência de estrogénio. As células são ensaiadas em relação à sua capacidade para produzir complemento da componente C3 e a sua resposta aos factores de crescimento e desenvolvimento hormonal. As culturas in vitro são avaliadas em relação à sua resposta proliferativa seguindo o tratamento com progestinas, GnRH, um composto e um veículo do presente invento. Os níveis de esteróides hormonais nos receptores são avaliados semanalmente para

-32- i/Um determinar se as características importantes da célula são mantidas in vitro. São utilizados os tecidos de 5 a 25 doentes. A actividade em pelo menos um dos testes anteriores indica que os compostos do presente invento são eficazes no tratamento de fibrose uterina.

Processo Teste de Endometriose

Nos Testes 1 e 2, podem ser observados os efeitos da administração de compostos do presente invento no 14° dia e no 21° dia no crescimento de tecido endométrio explantado.

Teste 1 São usados doze a trinta ratazanas adultas fêmeas de espécie CD como animais teste. São divididos em três grupos de igual número. O ciclo estrual de todos os animais é controlado. No dia de pró-estro, é realizada a cirurgia em cada fêmea. As fêmeas em cada grupo têm as pontas dos úteros esquerdos removidos, seccionados em pequenos quadrados, e os quadrados são suturados livremente em vários pontos adjacentes ao fluxo sanguíneo mesentérico. Em adição, as fêmeas no Grupo 2 têm os ovários removidos.

No dia seguinte à cirurgia, os animais nos Grupos 1 e 2 Teceberam injecções intraperitoneais de água durante 14 dias enquanto que os animais no Grupo 3 receberam injecçõs intraperitoneais de 1,0 mg de um composto do presente invento por kilograma de peso do corpo para a mesma duração. Depois de 14 dias de tratamento, cada fêmea é sacrificada e os explantes de endométrio, supra-renais, útero restante, e ovários, quando aplicáveis, são removidos e preparados para exame histológico. Os ovários e supra-renais são pesados. -33- l/lM^

Teste 2 São usados doze a trinta ratazanas adultas fêmeas de espécie CD como animais teste. São divididos em três grupos de igual número. O ciclo estrual de todos os animais é controlado. No dia de pró-estros, é realizada a cirurgia em cada fêmea. As fêmeas em cada grupo têm as pontas dos úteros esquerdos removidos, seccionados em pequenos quadrados, e os quadrados são suturados livremente em vários pontos adjacentes ao fluxo sanguíneo mesentérico.

Aproximadamente 50 dias depois da cirurgia, os animais do Grupo 1 receberam injecções intraperitoneais de água durante 21 dias enquanto que os animais do Grupo 2 receberam injecções intraperitoneais de 1,0 mg de um composto do presente invento por kilograma de peso do corpo para a mesma duração. Depois de 21 dias de tratamento, cada fêmea é sacrificada e os explantes de endométrio e supra-renais são removidos e pesados. Os explantes são medidos como uma indicação de crescimento. Os ciclos estruais são controlados.

Teste 3 A Indução cirúrgica de endometriose São usados autógrafos de tecido endométrio para induzir endometriose em ratazanas e/ou coelhas. Os animais fêmeas com maturidade reprodutiva são submetidos a oforectomia bilateral, e o estrogénio é fornecido exogenamente obtendo-se assim um nível de hormona específico e constante. O tecido de endométrio autólogo é implantado no peritoneu de 5 a 150 animais e o estrogénio é fornecido para induzir o crescimento do tecido explantado. É fornecido o tratamento consistindo de um composto do presente invento por lavagem gástrica numa base diária durante 3 a 16 semanas, e os implantes são -34- Ι/ίΛη removidos e medidos em relação ao crescimento ou regressão. No momento de sacrifício, a ponta intacta do útero é pesada para avaliar o estado do endométrio. B. Implantação de tecido endométrio humano em ratinhos nús O tecido de lesões do endométrio humano é implantado no peritoneu de ratinhos nus, fêmeas, castrados, sexualmente maduros. O estrogénio exógeno é fornecido para induzir o crescimento do tecido explantado. Em alguns casos, são feitas culturas de células do endométrio pesadas in vitro antes da implantação. O tratamento consistindo de um composto do presente invento fornecido por lavagem gástrica numa base diária durante 3 a 16 semanas, e os implantes são removidos e medidos em relação ao crescimento ou regressão. No momento de sacrifício, o útero é pesado para avaliar o estado do endométrio intacto.

Teste 4 A O tecido de lesões do endométrio humano é pesado e mantido, in vitro, como culturas primárias não transformadas. As espécimens cirúrgicas são empurradas através de uma rede esterilizada ou filtro, ou alternadamente retiradas do tecido em redor para produzir uma simples suspensão celular. As células são mantidas em meio contendo 10% de soro e antibiótico. São determinadas as taxas de crescimento na presença e ausência de estrogénio. As células são ensaiadas em relação à sua capacidade para produzir complemento da componente C3 e à sua resposta aos factores de crescimento e desenvolvimento hormonal. As culturas in vitro são avaliadas em relação à sua resposta proliferativa seguindo o tratamento com progestinas, GnRH, um composto e um veículo do presente invento. Os níveis de esteróides hormonais nos receptores são avaliados semanalmente para determinar se as características importantes da célula são mantidas in vitro. São utilizados os tecidos de 5 a 25 doentes. -35- [/&/>η A actividade em quaisquer dos ensaios anteriores indica que os compostos do presente invento são úteis no tratamento de endometriose.

Inibição de Proliferação Celular Lisa da Aorta/Restenose Processo Teste

Os compostos do presente invento têm a capacidade para inibir a proliferação celular lisa da aorta. Isto pode ser demonstrado por utilização de culturas de células lisas derivadas de aorta de coelhos, sendo a proliferação determinada pela medida de síntese de DNA. As células são obtidas por método de explante como descrito em Ross, J. of Cell Bio. 50: 172 (1971). As células são colocadas em placas de microtitulação de 96 cavidades durante cinco dias. As culturas tomam-se confluentes e crescem em repouso. As células são depois transferidas para um meio Eagle Modified Dulbecco (DMEM) contendo 0,5 a 2% de plasma pobre em plaquetas, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, lmC/ml de H-timidina, 20 ng/ml de factor de crescimento derivado de plaquetas, e variando as concentrações dos presentes compostos. A solução guardada dos compostos é preparada em dimetil sulfóxido e depois diluída na concentração apropriada (0,01-30 mM) no meio de ensaio anterior. As células são depois incubadas a 37°C durante 24 horas sob uma atmosfera de 5% de COz/95% de ar. No fim de 24 horas, as células são fixadas Λ em metanol. A incorporação de H-timidina em DNA é depois determinada por contagem de cintilação como descrito em Bonin, et al., Exp. Cell Res. 181: 475-482 (1989).

A inibição de proliferação celular de músculo liso da aorta pelos compostos do presente invento são também demonstrados por determinação dos seus efeitos em células de crescimento exponencial. As células de músculo liso da aorta de coelhos são semeadas em 12 pratos de cultura de tecido em DMEM

Um, ^ 7 contendo 10% de soro de bovino fetal, 2mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina. Depois de 24 horas, as células são ligadas e o meio é substituído com DMEM contendo 10% de soro, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, e as concentrações desejadas dos compostos. As células são deixadas em crescimento durante quatro dias. As células são tratadas com tripsina e o número de células em cada cultura é determinado por contagem usando um contador ZM-Coulter. A actividade nos testes anteriores indica que os compostos do presente invento são importantes no tratamento de restenose. O presente invento providencia também um método de alívio do síndroma pós-menopausa em mulheres que compreende o método atrás referido usando compostos de Fórmula I e compreende também a administração a uma mulher de uma quantidade eficaz de estrogénio ou progestina. Estes tratamentos são particularmente úteis para o tratamento de osteoporose e descida de colesterol no soro devido ao facto do doente receber as vantajens de cada agente farmacêutico enquanto que os compostos do presente invento irão inibir os efeitos laterais indesejáveis de estrogénio e progestina. A actividade destes tratamentos de combinação em qualquer dos testes pós-menopausa, infra, indica que os tratamentos de combinação são úteis para o alívio dos sintomas de pós-menopausa em mulheres.

As várias formas de estrogénio e progestina estão comercialmente disponíveis. Os agentes com base em estrogénio são, por exemplo, etinil estrogénio (0,01-0,03 mg/dia), mestranol (0,05-0,15 mg/dia), e e hormonas estrogénicas conjugadas tais como Premarin® (Wyeth-Ayerst; 0,3-2,5 mg/dia). Os agentes com base em progestina incluem, por exemplo, medroxiprogesterona tal como Proverá® (Upjohn; 2,5-10 mg/dia), noretilnodrel (1,0-10,0 mg/dia), e nonetindrona (0,5-2,0 mg/dia). Um composto preferido com base em estrogénio é -37-

Uuf a Premarin, e os agentes com base em progestina preferidos são noretilnodrel e noretindrona. O método de administração de cada agente com base em estrogénio e progestina é consistente com o que é conhecido no domínio. Para a maioria dos métodos do presente invento, os compostos de Fórmula I são administrados continuamente., de 1 a 3 vezes por dia. No entanto, a terapêutica cíclica pode ser especialmente útil no tratamento de endometriose ou pode ser usado com perspicácia durante ataques dolorosos da doença. No caso de restenose, a terapêutica pode ser limitada a curtos intervalos (1 a 6 meses) seguindo-se os processos médicos tais como angioplastia.

Como aqui usado, o termo "quantidade eficaz" representa uma quantidade de composto do presente invento que é capaz de aliviar os sintomas das várias condições palológicas aqui descritas. A dose específica de um composto administrado de acordo com este invento será, evidentemente, determinado pelas circunstâncias particulares à volta do caso incluindo, por exemplo, o composto administrado, a via de administração, o estado de saúde do doente, e a situação patológica a ser tratada. Uma dose diária típica irá conter um nível de dosagem não tóxico de cerca de 5 mg até cerca de 600 mg/dia de um composto do presente invento. As doses diárias preferidas serão em geral de cerca de 15 mg a cerca de 80 mg/dia.

Os compostos deste invento podem ser administrados por uma variedade de vias incluindo oral, rectal, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, e intranasal. Estes compostos são formulados de preferência antes da administração, selecção que será decidida pela opinião do médico assistente. Assim, outro aspecto do presente invento é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, contendo facultativamente uma quantidade -38- (/^ eficaz de estrogénio ou progestina, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Os ingredientes activos totais nestas formulações compreendem de 0,1% a 99,9% em peso da formulação. Por "farmaceuticamente aceitável" pretende-se representar o veículo, diluente, excipientes e sal deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação, e não prejudiciais ao seu recipiente.

As formulações farmacêuticas do presente invento podem ser preparadas por processos conhecidos no domínio usando ingredientes bem conhecidos e facilmente disponíveis. Por exemplo, os compostos de fórmula I, com ou sem um composto de estrogénio ou progestina, podem ser formulados com vulgares excipientes, diluentes, ou veículos, e formados em comprimidos, cápsulas, suspensões, pós, e semelhantes. Exemplos de excipientes, diluentes, e veículos que são adequados para tais formulações incluem o seguinte ragentes de enchimento e de extensão tais como amido, açúcares, manitol, e derivados silícicos; agentes de ligação tais como carboximetil celulose e outros derivados de celulose, alginatos, gelatina, e polivinilpirrolidona; agentes humidificantes tais como glicerol; agentes desintegrantes tais como carbonato de cálcio e bicarbonato de sódio; agentes para retardar a dissolução tal como parafina; aceleradores de resorção tais como compostos de amónio quaternário; agentes de superfície activa tais como álcool cetílico, glicerol monostearato; veículos de adsorção tais como caulino e bentonite; e lubrificantes tais como taco, estearato de cálcio e de magnésio, e polietil glicóis sólidos.

Os compostos também podem ser formulados como elixires ou soluções para administração oral conveniente ou como soluções apropriadas para administração parenteral, por exemplo, por vias intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Em adição, os compostos são bem adequados para formulação como -39- 1/ί4η formas de dosagem de libertação prolongada e semelhantes. As formulações podem ser assim constituídas e libertam o ingrediente activo só ou de preferência num ponto fisiológico particular, possivelmente durante um período de tempo. Os revestimentos, envelopes, e matrizes de protecção pode ser feitos, por exemplo, a partir de substâncias poliméricas ou ceras.

Os compostos de fórmula I, só ou em combinação com um agente farmacêutico do presente invento, será administrado em geral numa formulação conveniente. Os exemplos de formulação seguintes são apenas ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito do presente invento.

Formulações

Nas formulações que se seguem, o "ingrediente activo" representa um composto de fórmula I, ou um seu sal ou solvato.

Formulação !: Cápsulas de Gelatina

As cápsulas de gelatina dura são preparadas usando o seguinte.

Ingrediente Quantidade (mg/cápsula) Ingrediente activo 0,1 - 1000 Amido, NF 0-650 Pó fluido de Amido 0-650 Fluido de silicone 350 3centistokes 0-15 A formulação anterior pode ser variada de acordo com as variações razoáveis fornecidas.

Uma formulação de comprimido é preparada usando os ingre dientes anteriores:

Formulação 2: Comprimidos

Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente activo 2,5 - 1000 Celulose, microcristalina 200 - 650 Dióxido de silício, micronizado 10-650 Acido Esteárico 5- 15 Os componentes são misturados e comprimidos para formar comprimidos. Altemativamente, os comprimidos são preparados contendo cada um 2,5 - 1000 mg de ingrediente activo como se segue: Formulação 3: Comprimidos Ingrediente Quantidade (mg/comprimido) Ingrediente activo 25 - 1000 Amido 45 Celulose, microcristalina 35 Polivinilpirrolidona (como 10% de solução em água) 4 Carboximetil celulose de Sódio 4,5 Estearato de magnésio 0,5 Talco 1 -41. (Μη Ο ingrediente activo, amido, e celulose são passados através de um crivo de malha U.S. No. 45 e totalmente misturado. A solução de polivinilpirrolidona é misturada com os pós resultantes que são depois passados através de um crivo de malha U.S. No. 14. Os grânulos assim produzidos são secos entre 50°-60°C e passados através de um crivo de malha U.S. No. 18. O amido de carboximetil de sódio, estearato de magnésio, e talco, previamente passados através de um crivo de malha U.S. No. 60, são depois adicionados aos grânulos que, depois da mistura, são levados a compressão numa máquina de fazer comprimidos para dar comprimidos.

As suspensões contendo cada uma 0,1 a 1000 mg de medicamento por 5 ml de dose são preparados como se segue:

Formulação 4: Suspensões

Ingrediente Quantidade (mg/5ml) Ingrediente activo 0,1 -1000 mg Carboximetilcelulose de Sódio 50 mg Xarope 1,25 Solução de ácido benzóico 0,10 mL Aroma q.v. Corante q.v. Agua purificada para perfazer 5 mL O medicamento é passado através de um crivo de malha U.S. No. 45 e misturado com a carboximetilcelulose e xarope para formar uma pasta

-42- l/Uη suave. A solução de ácido benzóico, aroma e corante é diluída com uma parte da água e adicionada, com agitação. É depois adicionado água suficiente para produzir o volume necessário.

Uma solução de aerossol é preparada contendo os seguintes ingredientes:

Formulação 5: Aerossol

Ingrediente Quantidade (%, em peso) Ingrediente activo 0,25 Etanol 25,75 Propelante 22 (Clorodifluorometano) 70,00 O ingrediente activo é misturado com etanol e a mistura é adicionada a uma porção do propelante 22, arrefecida até 30°C, e transferida para um aparelho de enchimento. A quantidade necessária é depois conduzida para um reservatório em aço inoxidável e diluída com o propelante restante. As unidades de válvula são depois equipadas no reservatório.

Os supositórios são preparados como se segue:

Formulação 6: Supositórios

Ingrediente Quantidade (mg/supositório) Ingrediente activo 0,25 Gliceridos de ácido gordo saturado 2 000 -43 - Ι/ίΛη Ο ingrediente activo é passado através de um crivo de malha U.S. No. 60 e suspenso nos gliceridos de ácido gordo saturado previamente fundidos usando o calor mínimo necessário. A mistura é depois vertida num molde de supositório de capacidade nominal de 2 g e é deixada arrefecer.

Uma formulação infravermelho é preparada como se segue:

Formulação 7: Solução Intravenosa

Ingrediente Quantidade Ingrediente activo 50 mg Solução salina isotónica 1 000 mL A solução dos ingredientes anteriores é administrada intravenosamente a um doente com a velocidade de cerca de 1 mL por minuto. Formulação 8: Combinação da Cápsula I Ingrediente Quantidade (mg/cápsula) Ingrediente activo 50 Premarin 1 Avicel pH 101 50

Amido 1500 117,5 Óleo de silicone 2

Tween 80 0,50

Cab-O-Sil 0,25 -44- Formulacão 9: Combinação de Cápsula II Ingrediente Quantidade(mg/cápsula) Ingrediente activo 50 Noretilnodrel 5 Avicel pH 101 82,50 Amido 1500 90 / Oleo de silicone 2 Tween 80 0,50 Formulação 10: Combinação de Comprimidos Ingrediente Quantidade (mg/cápsula) Ingrediente activo 50 Premarin 1 Amido de Milho NF 50 Povidona, K29-32 6 Avicel pH 101 41,50 Avicel pH 102 136,50 Crospovidona XL10 2,50 Estearato de Magnésio 0,50 Cab-O-Sil 0,50

Lisboa, 25 de Outubro de 2000 LUIS SILVA CARVALHO Agente Oficial da Propriedade Industrial

RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (2)

1. - 1 - (/ΐΑη <>U^s REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I

   em que Rj é H, OH, halo, OCO(alquilo C,-C6), OCO(arilo), OS02(alquilo C4-C6), OCOO(alquilo CrC6), OCOO(arilo), OCONH(alquilo C,-C6) ou OCON(alquilo CrC6)2; R2 ér arilo, alquilo C]-C6, cicloalquilo C3-C6 ou 4-ciclohexanol; R3 é 0(CH2)2 ou 0(CH2)3; R4 e R5 combinam-se para formar, com o azoto ao qual estão ligados, piperidina, morfolina, pirrolidina, 3-metilpirrolidina, 3,3-dimetilpirro-lidina, 3,4-dimetilpirrolidina, azepina ou pipecolina; Ré é c-ch2 ou \ ^.C=Ctt (alquilo Q -C5 \.
2. -2- em que "arilo" em e R2 é fenilo substituído facultativamente 1 a 3 vezes com alquilo Q-Có, alcoxi C]-C6, halo, amino, ou hidroxi e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Lisboa, 25 de Outubro de 2000 LUIS SILVA CARVALHO f Industnal 1200 LISBOA