SI20427A - Nova kristalinična oblika 6-hidroksi-3-(4-(2(piperidin-1-il) etoksi) fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo (b) tiofen hidroklorida - Google Patents

Abstract

Predlagani izum je usmerjen v novo kristalično obliko 6-hidroksi-3-(4-(2-(piperidin-1-il) etoksi) fenoski)-2-(4-metoksifenil) benzo (b) tiofen hidroklorida in njegovo uporabo na naslednjih področjih: zaviranje in preprečevanje bolezenskih stanj, ki so povezana s pomankanjem estrogena, vključno s srčnožilno boleznijo, hiperlipidemijo in osteroporozo, zaviranje in preprečevanje drugih bolezenskih stanj, kot so endometrioza, maternična fibroza, od estrogena odvisni rak (vključno z rakom na prsih in maternici), rak prostate, benigna hiperplazija prostate, motnje v centralnem živčnem sistemu, vključno z Alzheimerjevo boleznijo ter preprečevanjem raka na prsih in zviševanje aktivnosti ChAT.ŕ

Description

NOVA KRISTALINIČNA OBLIKA 6 - HIDROKSI - 3 - (4 - [2 - (PIPERIDIN-l-IL) ETOKSI]

FENOKSI) -2-(4- METOKSIFENIL) BENZO [b] TIOFEN HIDROKLORIDA

Teoretična podlaga izuma

- Hidroksi - 3 - (4 - [2 - (piperidin-1-il) etoksi] fenoksi) -2-(4- metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorid (arzoksifen, v izvirniku arzoxifene) je bil prvič generično opisan v Ameriškem patentu (U.S. Patent) št. 5,510,357, natančno pa je bil prikazan v Ameriškem patentu (U.S. Patent) št. 5,723,474 (‘474) in v Evropski patentni prijavi (European Patent Application) 0729956. Arzoksifen je nesteroidni mešani antagonist/agonist estrogena, ki je uporaben, med drugim, za zničevanje koncentracije holesterola v serumu ter za preprečevanje oz. zaviranje hiperlipidemije; osteoporoze; od estrogena odvisnih vrst raka, vključno z rakom na prsih in maternici; endometrioze; motenj v centralnem žičnem sistemu (CŽS), vključno z Alzheimerjevo boleznijo; proliferacije celic gladkega mišičja v aorti in restenoze.

Izrecno je bilo pokazano in tudi klinično preizkušeno, da je arzoksifen uporaben za zdravljenje na receptor pozitivnega metastaziranega raka na prsih; za pomožno zdravljenje na receptor pozitivnih pacientov po ustrezni sistemski ali lokalni terapiji; za zmanjšanje ponovnega pojavljanja invazivnih in neinvazivnih oblik raka na prsih; in za zmanjšanje pogostnosti invazivne oblike raka na prsih in raka na izvodilu mlečne žleze in situ. Arzoksifen je koristen tudi v kombinaciji z radio-terapijo, inhibitorji aromataze, analogi sprostitvenega hormona za luteinizirajoči hormon (LHRH) in inhibitorji acetilholinesteraze (AChE).

Rontgenska praškovna difrakcija (XRD), termogravimetrija (TGA), protonska jedrska magnetna resonanca (*H NMR), in analiza po Karlu Fischerju (KF) so pokazale, da je arzoksifen, ki ga dobimo s postopki, ki so opisani v patentu ‘474, hidratiran, slabo kristaliziran in vsebuje v svoji kristalni zgradbi različne količine hlapnih organskih snovi (etil acetat).

Za izdelavo farmcevtskih pripravkov je slabo kristaliziran material praviloma manj primeren kot dobro kristaliziran. Na splošno tudi ni zaželeno, da bi snovi, ki jih uporabljamo v farmacevtskih pripravkih, vsebovale občutnejše količine organskih topil (npr. etil acetata), saj so organska topila lahko toksična za prejemnika, povzročijo pa lahko tudi spremembo učinkovitosti zdravila.

Čeprav je arzoksifen, ki ga dobimo s postopki, ki so opisani v patentu ‘474, mogoče uporabiti v farmacevtskih preparatih, bi bilo zelo zaželjeno, da bi iznašli postopek, po katerem bi bilo mogoče v komercialno zanimivih količinah ponovljivo ter učinkovito pripraviti bolje kristalizirano obliko arzoksifena, ki ne bi vsebovala organskega topila v svoji kristalni mreži.

-2·

Kratek opis izuma

Prikazani izum se nanaša na novo ne-stehiometrično hidratirano kristalno obliko 6 hidroksi - 3 - (4 - [2 - (piperidin-1-il) etoksi] fenoksi) -2-(4- metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida (F-III), ki kaže rentgenski difrakcijski vzorec z naslednjimi vrhovi 4,6 ± 0,2; 7,8 ± 0,2; 9,3 ± 0,2; 14,0 ± 0,2; 17,6 ± 0,2; 20,8 ± 0,2; in 24,3 ± 0,2 pri 20 (dobljeno pri 25 ± 2 °C, pri 35 ± 10 % relativni vlagi in s pomočjo bakrovega izvora sevanja).

Poleg tega se prikazani izum nanaša na farmacevtski pripravek, ki vsebuje F-III; enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov; in po želji (opcijsko) estrogen, progestin, inhibitor aromataze, analog LHRH, ali inhibitor acetilholinesteraze (AChE).

Prikazani izum se nanaša tudi na postopke za uporabo F-III pri zaviranju in preprečevanju patoloških stanj kot so: fibroza materničnega tkiva, endometrioza, proliferacija celic gladkega mišičja v aorti, restenoz, rak na prsih, rak maternice, rak prostate, benigna hiperplazij a prostate, izguba kostne mase, osteoporoza, srčno-žilna bolezen, hiperlipidemija, motenje v centralnem žičnem sistemu in Alzheimerjeva bolezen, pa tudi na postopke uporabe FIII za izdelavo zdravil v ta namen.

Končno se prikazani izum nanaša tudi na postopke uporabe F-III za povečanje aktivnosti holinacetiltransferaze (ChAT) in na uporabo F-III za izdelavo zdravil v ta namen.

Kratek opis slik

Slika 1 prikazuje reprezentativni graf poteka diferencialne vrstične kalorimetrije (DSC)/TGA za S-II.

Slika 2 prikazuje reprezentativni graf poteka (DSC)/TGA za F-I.

Slika 3 prikazuje reprezentativni graf poteka (DSC)/TGA za F-III.

Slika 4 prikazuje izoterme vsrkavanja vlage za F-I in F-III.

Slika 5 prikazuje odvisnost desolvacije S-II od časa sušenja in temperature.

Natančnejši opis izuma

Arzoksifen, ki smo ga kot surovino pripravili po postopku, ki ga opisuje patent ‘474 (Primer 4, kristalizacija iz mešanice etanola in etil acetata, filtriranje in sušenje filterskega kolača v vakuumu do stalne teže pri sobni temperaturi), smo karakterizirali z XRD in ugotovili, daje slabo kristaliničen. Z *H NMR smo potrdili, da surovi material vsebuje 6% etil acetata.

-3Kristalizacijski postopek, ki je opisan v patentu ‘474, smo kasneje modificirali tako, da smo dodali etanol v suspenzijo surovega arzoksifena v refluksirajočem etil acetatu. Po ohlajevanju in vakuumski filtraciji smo po tako modificiranem postopku dobili dobro kristaliničen arzoksifen v obliki mešanega solvata z etil acetatom in vodo (v nadaljevanju označen kot S-II), ki je, kot je bilo ugotovljeno kasneje, izhodna snov za F-I (drugačna nestehiometrično hidratirana kristalinična oblika arzoksifena).

F-I lahko pripravimo z odstranjevanjem etil acetata iz kristalne mreže S-II s sušenjem SII v vakuumu pri povišani temperaturi. Čas in temperatura, ki sta potrebna za pretvorbo S-II v FI se razlikujeta od šarže do šarže, vendar je običajno potreben čas okrog 5 dni pri temperaturi okrog 100 °C. Pri tem postopku je potrebna visoka temperatura za pretvorbo S-II v F-I, saj posedanje S-II v vodi pri sobni temperaturi ali hranjenje vzorca pri 98% sobni vlagi ne omogoča pretvorbe v F-I. Prav tako samo s sušenjem S-II pri visoki temperaturi v konvekcijski peči nismo uspeli desolvirati materiala, kar kaže, daje za to, da potegnemo etil acetat iz kristalne mreže SII, potreben tudi vakuum. Po možnosti pripravimo F-I s kristalizacijo arzoksifena (ali kake od njegovih polimorfnih ali solvatnih oblik) iz tetrahidrofurana, kar brez težav poteka pri sobni temperaturi.

V skladu s tukaj predstavljenim izumom je F-III posebno primerna oblika arzoksifena, ki jo brez težav pripravimo in izoliramo pri sobni temperaturi. Za odstranitev majhnih količin preostalega v kristale vezanega topila zadostuje sušenje preparata v zmernih razmerah, kar redno vodi do zelo čiste kristalinične trdne snovi (brez preostankov organskega topila), zato z uporabo F-III odstranimo vse morebitne toksikološke težave, ki bi lahko bile povezane s preostalim organskim topilom v kristalni mreži arzoksifena. Poleg tega je priprava F-III preprosta in učinkovita in je za to primerna za proizvodnjo v večjih količinah.

F-III brez težav pripravimo in izoliramo pri sobni temperaturi s kristalizacijo arzoksifena (ali kateregakoli njegovega solvata oz. polimorfne oblike) iz zmesi izopropilalkohola (IPA) in vode. Praviloma suspendiramo arzoksifen v zmesi IPA in vode in suspenzijo grejemo, da se začetna količina arzoksifena raztopi. Ko to dosežemo, raztopino počasi ohladimo na sobno temperaturo, nato pa s pomočjo ledene kopeli ali hladilnika temperaturo znižamo med 0 in 5°C. Ko smo raztopino pustili stati dovolj časa, da trdni material kristalizira, lahko ločimo kristale z vakumsko filtracijo in jih osušimo do konstantne teže v vakuumu, s čemer dobimo F-III v izkoristku, kije večji od 80 %.

Primeren začetni material za zgoraj opisano kristalizacijo vključuje S-II, F-I, arzoksifen, ki ga pripravimo po postopku, kije opisan v patentu ‘474, ali katerokoli njihovo zmes, vendar ni

-4omejen le na te snovi. Ni pomembno katero obliko arzoksifena uporabimo kot izhodno snov, saj s kristalizacijo iz IPA in vode po postopku, ki je opisan tukaj, vedno dobimo F-III v kristalni obliki. Razmerje med vodo in IPA (v:v) je običajno med 1:1 in 9:1. Bolj zaželjeno je razmerje med 2,5 in 5,6 : 1, najbolj zaželjeno pa razmerje med 3 in 5,6 : 1. Po ločitvi kristalov z vakuumsko filtracijo lahko kolač F-III speremo z mrzlo deionizirano vodo, preden ga osušimo v vakuumu. Poleg tega se izkaže, da je za sušenje ugodna nekoliko povišana temperatura (okrog 50 °C za 12 do 24 ur). Pri sintezi F-III v večjih količinah in za komercialne namene je morda primemo, če sprožimo kristalizacijo s kristali F-III, kijih uporabimo kot kristalizacij ska jedra.

Pri postopku, ki ga priporočamo, pripravimo, izoliramo in očistimo F-III vzporedno s kemično odstranitvijo 6-izopropil hidroksi zaščitne skupine iz 6-izopropoksi-3-(4-[2-(piperidinl-il)etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida (izhodna snov A). Da bi popolnoma odstranili izopropilno zaščitno skupino, zasledujemo reakcijo odstranitve in ko je ta reakcija v glavnem končana, je zaželjeno, da protokol vključuje kristalizacijo v razmerah, ki vodijo do F-III, kakor je opisano zgoraj in v nadaljevanju. Postopke za pripravo izhodne snovi A in za odstranitev izopropilne skupine lahko najdemo v Ameriškem patentu (U.S. Patent) št. 5,723,474, kije tukaj vključen kot referenca.

Pri drugem priporočenem postopku pripravimo, izoliramo in očistimo F-III vzporedno s kemično redukcijo S-oksida in kemično odstranitvijo benzilne zaščitne skupine iz 6-hidroksi skupine v 6-benziloksi-3 -(4- [2-(piperidin-1 -il)etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo [bjtiofen(S-oksid) (izhodna snov B), Da bi popolnoma izvedli redukcijo sulfoksida v sulfid in odstranili benzil hidroksilno zaščitno skupino, zasledujemo redukcijo in reakcijo odstranitve in ko sta ti dve reakciji v glavnem končani, je zaželjeno, da protokol vključuje kristalizacijo v razmerah, ki vodijo do F-III, kakor je opisano v tem dokumentu. Postopke za pripravo izhodne snovi B, za odstranitev benzilne skupine in za redukcijo 1-sulfoksida v ustrezni sulfid lahko najdemo tudi v prej navedenem Ameriškem patentu (U.S. Patent) št. 5,723,474, ki je tukaj vključen kot referenca.

Neodvisno od postopkov, ki jih uporabimo za odstranitev zaščitnih skupin in za redukcijo, privede kristalizacija arzoksifena iz zmesi IPA/voda dosledno do zelo čistega kristaiiničnega F-III.

Karakterizacija S-II. F-I in F-III in razlikovanje med njimi

Za karakterizacijo S-II, F-I in F-III smo uporabili metode DSC/TGA in XRD. TGA je pogosto zelo uporabna metoda za razlikovanje med različnimi oblikami določene trdne snovi,

-5ker kaže vsak posamezen solvat ali polimorfna oblika svojo značilno temperaturo, pri kateri se snov spremeni. DSC je tehnika, ki jo pogosto uporabljajo za ugotavljanje prisotnosti različnih polimorfnih in solvatnih oblik pri posamezni snovi. Z XRD pa lahko opazujemo urejenost večjih delov kristalne mreže v kristaliničnih snoveh.

Arziksifen, ki ga dobimo po postopkih, ki so opisani v patentu ‘474, ima XRD vzorec z neugodnim razmerjem med signalom in šumom ter s povišano bazno linijo, kar kaže, daje snov slabo kristalizirana. Zato smo primerjali F-I in F-III s snovjo (S-II), ki smo jo pridobili z modificiranim postopkom kristalizacije arzoksifena, ki je opisan zgoraj, pri katerem smo suspenziji arzoksifena v refluksu etil acetata dodali etanol.

Reprezentativni grafi DSC/TGA za S-II, F-I in F-III so prikazani na slikah 1, 2 in 3. DSC diagram za S-II kaže široko endotermno spremembo z začetkom pri 62 °C, ki je posledica izgube etilacetata in vode iz kristalne mreže. Druga endotermna sprememba z začetkom pri 152 °C predstavlja taljenje S-II. Izguba teže za približno 2,5 %, ki jo kaže TGA, se zgodi vzporedno s prvim prehodom, medtem ko lahko preostali izgubi teže (0,5 %) sledimo prav do začetka taljenja, kar nakazuje, da so nekatere molekule topila trdneje vezane v kristalno mrežo.

DSC diagram za F-I kaže široko endotermno spremembo z začetkom pri okrog 75 °C, ki ji sledi druga endotermna sprememba, ki ustreza taljenju, z začetkom pri okrog 155 °C. TGA diagram za F-I kaže postopno izgubo teže za 0,3 %, ki ji z ostro mejo sledi hitra izguba teže za 1,5 %; obe spremembi predstavljata dehidracijo kristalne mreže. Začetka prvega DSC prehoda in ustrezne izgube teže, ki jo kaže TGA, sta nekoliko zamaknjena zaradi različnih režimov gretja. Začetna izguba teže predstavlja šibko vezano hidracijsko vodo, druga izguba teže pa ustreza približno 0,5 mola vode, ki je prisotna v kristalni mreži pri zelo nizki relativni vlagi (pod 5 % glej podatke o vsrkavanju vlage).

Za DSC diagram F-III je značilna široka, nizko-temperatuma endotermna sprememba pri okrog 30 °C, ki ji sledita druga relativno slabotna endotermna sprememba z začetkom pri okrog 70 °C ter končna sprememba z začetkom pri okrog 146 °C; slednja ustreza tališču. Hitra izguba teže za 1,5 % (~0,5 mola), z ostro mejo, ki jo kaže TGA in ki sovpada s prvo endotermno spremembo, ustreza izgubi šibko vezanih vodnih molekul, medtem ko dodatna izguba teže za ~1,6 % nad 60 °C predstavlja izgubo bolj trdno vezanih molekul vode, t.j. tistih, Li so prisotne pri zelo nizki relativni vlažnosti. Zmanjšanje teže, ki jo opazimo nad 170 °C ustreza razpadu FIII.

Grafi za F-I in F-III, ki smo jih dobili z XRD, imajo ostre vrhove in ravno bazno linijo, kar je značilno za dobro kristalinične snovi. Položaj odklonskih vrhov pri 20 in ustrezni podatki

-6' za I/Io reprezentativnih vzorcev F-I, F-III in S-II so podani v razpredelnici 1. Kljub temu, da se pojavlja mnogo intenzivnih odbojev pri v glavnem podobnih uklonskih kotih, pa vsaka od oblik arzoksifena kaže dovolj različno praškovno uklonsko sliko, daje mogoče jasno razlikovati med S-II, F-I in F-III.

V kristalografski stroki je znano, da se lahko relativne velikosti posameznih uklonskih vrhov pri vsaki od polimorfnih oblik določene snovi spreminjajo zaradi določene nenaključne usmerjenosti kristalov med analizo, kar je lahko posledica različnih dejavnikov, na primer morfologije kristalov. Kadar do tega pride, se spremenijo le velikosti vrhov, značilni položaji vrhov pa ostanejo nespremenjeni (Glej npr. United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, strani 1843-1844, 1995). Zato lahko na osnovi velikosti vrhov in njihovih položajev identificiramo F-III s pomočjo vrhov pri 4,6 ± 0,2; 7,8 ± 0,2; 9,3 ± 0,2; 14,0 ± 0,2; 17,6 ± 0,2; 20,8 ± 0,2; in 24,3 ± 0,2 ⁰ (20), kadar je spekter posnet s pomočjo bakrovega izvora sevanja pri 25 ± 2 °C in 35 ± 10 % relativni vlažnosti.

Razpredelnica 1

S-II	F-I	F-III
20 (°)	I/Io (%)	20 n	I/Io (%)	20 (°)	I/Io(%)
4,67	1,3	4,92	2,6	4,63	20,8
5,03	6	7,69	34,6	7,82	100
6,83	5,8	7,91	100	9,29	16,9
7,17	16,1	9,89	2,5	10,16	22,7
7,73	100	10,22	2	10,35	5,4
9,03	1,3	10,74	7,4	13,77	10,7
9,31	1,7	14,86	9,1	13,97	15,2
9,66	2,4	15,45	2,3	15,06	6,9
10,27	1,6	15,92	15,9	15,71	22,3
10,47	2,2	16,67	1,7	15,87	7,4
10,91	6,3	16,98	3,1	16,35	34,5
13,63	2,1	18,28	17,8	16,77	12,3
14,09	16	18,56	7	17,28	10
15,10	4,1	20,58	13,1	17,62	47,9
15,52	10,5	20,85	8,8	18,09	43,9
16,45	11	21,64	3,9	20,43 -	42
16,67	7,6	22,19	18	20,80	33,6
17,21	12	22,65	2,9	21,31	42,7
17,53	2,4	23,28	3,4	21,71	13
18,33	28,2	23,97	11,8	21,85	14,5
18,69	m	24,31	6,3	22,13	12,8
19,37	3,5	25,52	3,9	22,26	16,3
20,29	8,6	26,20	................ 3,4	23,51	13,2

S-II	F-I	F-	lil
20 (°)	I/Io (%)	20 (°)	I/I„ (%)	20 (°)	I/Io (%)
20,64	17,2	26,47	3,1	23,69	15,9
21,02	12,7	28,84	6,4	23,91	25,6
21,68	5,1	30,13	3,5	24,31	38,7
22,01	8,3	31,12	2,9	25,22	8
22,29	8			25,67	8,9
23,17	7,8			27,05	18,9
23,39	9,1			27,89	13,3
24,30	13,6			28,24	8,6
25,76	3,4			28,71	21,3
26,05	4			29,89	8,9
26,63	5,5			30,24	18,7
27,01	3,1			30,88	5,8
27,49	2,8			31,44	7,6
28,10	1,8			33,06	V
28,73	10,9			34,36	6
29,42	3,2
30,00	3,7
30,89	2,1
31,34	2,4
31,70	1,1
32,81	1
32,91	0,8
33,48	2

Nadaljna karakterizacija F-I in F-III

Proučevali smo tudi higroskopičnost F-I in F-ΙΠ. Izoterme, ki kažejo vsrkavanje vlage v F-I in F-III so na sliki 4. Ko smo izpostavili vzorce približno 5 % relativni vlažnosti, se je teža zaradi vsrkavanja vode takoj povečala za 1,5 % pri F-I in za 1,7 % pri F-III, kar ustreza približno 0,5 mola vode. Obe obliki kažeta kontinuirano vsrkavanje vlage preko celega razpona vlažnosti, kar je verjetno posledica vgrajevanja vodnih molekul v kristalno mrežo.

Razlika v količini vlage, ki jo sprejmeta obe obliki, verjetno odseva količino vode, ki se lahko vgradi v kristalno mrežo, t.j. količino razpoložljivih prostih mest v mreži, ki lahko sprejmejo molekule vode. Odsotnost vsakršnih histereznih pojavov v sorpcijskih in desorpcijskih izotermah F-I in F-III nakazuje, da kristalne oblike hitro dosežejo ravnotežje pri vsaki vrednosti vlažnosti.

-8Profila vsrkavanja vlage za F-I in F-III kažeta, da sta ti dve obliki arzoksifena v bistvu ne-stehiometrična hidrata. Pri sobni relativni vlažnosti (okrog 50 %), vsebuje F-I okrog 1,7 % vode, kar ustreza 0,5 mola vode, F-III pa okrog 3,0 % vode, kar ustreza 0,85 mola vode. Ker se celotna količina F-I in F-III hitro uravnoteži z vlažnostjo v atmosferi, je vsebnost vode, ki jo določimo z analitskimi postopki odvisna od relativne vlažnosti v času meritve. Razlike, ki smo jih opazili med šaržami pri analizah z DSC zato verjetno izvirajo iz različne stopnje hidratiranosti vzorcev, kar je posledica razlik v razmerah, v katerih so bili vzorci hranjeni.

Posneli smo XRD spektre vzorcev F-I in F-III, ki so bili hranjeni pri različni relativni vlažnosti (0, 22, 50 in 80 %). Opazili smo postopen pomik začetnih položajev (0 % relativne vlažnosti) glavnih vrhov spektra za F-III pri okrog 13,8; 17,6; 18,0; 20,5 in 24,0 ° (20), pa tudi majhen pomik manjših vrhov, če se je relativna vlažnost povečevala. Te spremembe kažejo, da se velikost osnovne celice F-III spreminja, verjetno zaradi vključitve šibko vezanih molekul vode v kristalno mrežo ob povečani relativni vlažnosti. Postopen pomik vrhov ob naraščajoči vlažnosti se dobro sklada s podatki o vsrkavanju vlage, ki kažejo postopno povečevanje teže vzorca preko tega razpona vlažnosti. Vse to kaže na tvorbo variabilnih hidratov.

Podoben eksperiment smo naredili tudi z F-I, da bi ugotovili, ali imajo spremembe relativne vlažnosti (0, 25, 52, 73 in 95 % relativna vlažnost) podoben učinek na njegovo kristalno mrežo. Ob naraščajoči vlažnosti smo opazili zelo majhen odmik vrhov pri 7,7; 18,3; 18,5; 20,5 in 20,8 ⁰ (20), ki smo jih izmerili v popolnoma suhi atmosferi (0 % relativne vlažnosti). Vrhovi pri 7,7; 20,8 in 24,1 so bili pri večji relativni vlažnosti manj ostri in nekoliko razširjeni, kar kaže na vsrkavanje vode v amorfni del snovi (snov je postala bolj plastična), posebno pri 73% in 95 % relativni vlažnosti. Premik vrhov v XRD spektru pri povečani relativni vlažnosti je pri F-I manj izražen kot pri F-III. To kaže,da se kristalna mreža F-I ne more toliko razširiti oziroma skrčiti kot kristalna mreža F-III.

Ugotovili smo, da sta F-I in F-III stabilna v celotnem območju relativne vlažnosti, kljub temu, da lahko kristali F-III sprejmejo skoraj dvakrat več vode kot kristali F-I. Pokazalo se je tudi, da imata obe obliki primerljivo velikost in morfologijo kristalov, topnost v vodi in hitrost raztapljanja.

Raziskali smo tudi sušenje S-II, da bi lahko zasledovali desolvacijo te oblike v odvisnosti od časa sušenja in temperature (glej sliko 5). Po različnih časih sušenja smo posneli XRD spektre. Mnogo uklonskih vrhov, ki smo jih dobili pri desolvacijskih študijah S-II, se pojavlja pri podobnih kotih kot pri F-I, kar potrjuje, da sta kristalni mreži S-II in F-I zelo podobni. Že pri minimalnem sušenju S-II pa so vrhovi pri okrog 6,8; 7,2 in 14,0 ⁰ (20) izginili, kar nakazuje, da

-9je te odboje mogoče pripisati kristalografskim ravninam z delno elektronsko gostoto, ki pripadajo molekulam etilacetata.

Dolgotrajno sušenje solvatirane snovi v vakuumu in pri povišani temperaturi vodi v F-I. Kakor kažejo spektri XRD, je F-I, ki ga pripravimo po tem postopku, visoko kristaliničen. Iz tega sledi, daje produkt kristalizacije iz raztopine etanola in etilacetata, kiji sledi le kratkotrajno (nekaj ur) sušenje v vakuumu (skladno z navodili v patentu ‘474), slabo kristaliziran, ker pri takem postopku dobimo le delno desolvatiran S-II.

F-I in F-III kažeta več vrst prednosti v primerjavi s predhodnimi oblikami arzoksifena, ki so opisane zgoraj. V primetjavi z arzoksifenom, ki je narejen po postopku, ki je opisan v patentu ‘474, sta F-I in F-III stabilnejša pri sobni temperaturi in sta zato primernejša za farmacevtsko uporabo, t.j. za izdelavo pripravkov. Poleg tega sta F-I in F-III veliko bolj kristalinična kot oblika, ki jo opisuje patent ‘474. Krištalinične snovi so na splošno manj higroskopiČne in bolj stabilne (t.j. manj podvržene kemični razgradnji, s čemer se ohranja stalna učinkovitost) kot amorfne snovi in so zato bolj primerne za izdelavo pripravkov. Se več, za razliko od tiste oblike arzoksifena, ki jo dobimo po postopku, ki je opisan v patentu ‘474 in ki v svoji kristalni mreži vsebuje etilacetat in vodo, vsebujeta F-I in F-III le vodo.

Karakterizacij ske metode

DSC meritve smo izvajali z modularno DSC aparaturo TA Instruments 2920, ki je bila povezana z enoto Thermal Analyst 3100 in opremljena s hladilnim sistemom. Vzorce (3-5 mg) smo greli v nagubani aluminijasti posodi od 10 do 240 °C, hitrost gretja pa je bila 2 °C / min.

TGA analize smo naredili s pomočjo aparature TA Instruments 2050 Thermogravimetric Analyzer, ki je bila povezana z enoto Thermal Analyst 3100. Vzorce (5-10 mg) smo greli v odprti posodi od 25 °C do 250 °C s hitrostjo 5 °C / min.

XRD spektre smo izmerili s pomočjo rentgenskega praškovnega difraktometra Siemens D5000, opremljenega s CuKa izvorom (λ = 1,54056 A) in Kevex solid-state detektorjem, ki je deloval pri 50 kV in 40 mA. Spekter vsakega od vzorcev smo posneli med 4 ⁰ in 35 ⁰ (20). Pred meritvijo smo vzorec pustili 30 minut, da se je lahko uravnotežil z nastavljeno temperaturo in/ali relativno vlažnostjo.

Za merjenje higroskopičnosti F-I in F-III smo uporabili metodo VTI kot sledi. Vsakega od vzorcev smo sušili v vakuumu pri 60 °C do konstantne teže, pri čemer smo v merilnem prostoru dosegli 0 % relativno vlažnost. Izoterme za vsrkavanje vlage smo izmerili pri 25 °C s pomočjo VTI vakuumske tehtnice vlažnosti pri naslednjih razmerah: velikost vzorca 10-15 mg,

-10adsorpcijsko/desorpcijsko območje 0-95 % relativne vlažnosti, stopnja intervala 5 %, interval za en vzorec 10 minut.

Primeri, ki so navedeni v nadaljevanju, dodatno ilustrirajo postopke za pripravo hidrata, ki je predmet tega izuma. S temi primeri v nobenem smislu ne omejujemo opisanih postopkov in jih ne smemo tako razumeti.

Primeri

Primer 1

Priprava F-III iz 6-izopropoksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida

Raztopini 6-izopropoksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida (10 g, 18 mmol) v metilen kloridu (100 mL) smo v dušikovi atmosferi pri -10 do -20 °C dodali BC1_{3 (g}) (4,23 g; 34 mmol) s hitrostjo, ki je omogočila ohranjanje temperature pod -10 °C. Ko je bilo dodajanje končano, smo pustili, da je reakcija med mešanjem potekala še dodatni 2 uri. Nato smo v reakcijsko zmes pri temperaturi pod -10 °C počasi dodali izopropilalkohol (IPA, 12,35 mL, 167 mmol) in nadaljevali z mešanjem nadaljnih 30 minut. Drugo reagenčno steklenico smo napolnili s 100 mL vode in jo ohladili na ledeni kopili na približno 0 °C. Reakcijsko zmes iz prve steklenice smo prenesli v ohlajeno vodo s pomočjo kanile med intenzivnim mešanjem. Dobljeno belo usedlino smo mešali še eno uro pri 0 °C. Produkt smo ločili s filtriranjem in ga oplahnili s 25 mL 40 % raztopine CH2CI2 v vodi in nato še s 25 mL hladne vode. Produkt smo suspendirali v 60 mL IPA in 60 mL vode in suspenzijo greli do 60 °C. Snov se je raztopila pri 48 °C. Dodali smo še 120 mL vode in raztopino ohladili na 35 °C, pri čemer so se pojavili kristali, suspenzijo pa smo nato počasi ohladili na 0 - 5 °C in jo več ur mešali. Produkt smo ločili s filtriranjem in ga oprali z mrzlo deionizirano vodo (25 mL). Vlažni kolač F-III smo sušili do stalne teže v vakuumu pri 50 °C 12 do 24 ur in tako dobili F-III.

Primer 2

Priprava F-III iz 6-benziloksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen-(S-oksida)

-11 V 250 mL Parrovo steklenico smo dodali deionizirano vodo (5,25 mL), IM HCI (7,74 mL, 7,75 mmol), 10 % Pd/C (tip A32110, 1,37 g, 1,29 mmol Pd), 6-benziloksi-3-(4-[2piperidin-1 -il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen-(S-oksida) (3 g, 5,16 mmol) in izopropil alkohol (32 mL) pri sobni temperaturi. Steklenico smo vpeli v Parrov stresalnik, jo dvakrat zaporedoma evakuirali in napolnili z dušikom ter končno evakuirali in napolnili z vodikom do tlaka 30 psig. Stresalnik smo vklopili in segreli reakcijsko zmes na 60 °C. S HPLC analizo smo ugotovili, da je bila reakcija končana po približno 4 urah. Reakcijsko zmes smo filtrirali skozi plast diatomejske zemlje, ki smo jo sprali z 0,1 M HCI (2x10 mL). Topilo smo odstranili v vakuumu pri približno 50 °C. Dobljeni preostanek smo suspendirali v 50 % izopropilnem alkoholu v deionizirani vodi (30 mL) in previdno greli na parni kopeli, da se je raztopil. Raztopini smo dodali deionizirano vodo (22 mL) in celotno raztopino pustili ohladiti na sobno temperaturo, ko so izpadli kristali, nato pa smo suspenzijo ohladili do 0 °C. Dobljeni produkt smo ločili s filtriranjem, ga sprali z mrzlo deionizirano vodo (2x15 mL) in s sušenjem do stalne teže v vakuumu pri 50 °C dobili F-III.

Primer 3

Priprava F-III iz 6-izopropoksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen-(S-oksida)

Zmešali smo metilen klorid (105 L) in [6-izopropoksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil)] benzo [b] tiofen-(S-oksid) (10.5 kg) in zmes ohladili na -15 do -20 °C. Dodali smo borov triklorid (4,6 kg), pri čemer smo vzdrževali temperaturo med -10 in -20 °C. Z mešanje smo nadaljevali dokler površina vrhov pri HPLC za začetne snovi ni bila manjša kot 1 %. HPLC sistem: kolona Zorbax SB-Phenyl 4,6 mm ID x 25 cm; T = 30 °C; metanol : 0,01 N žveplova kislina = 70 : 30; pretok 1,5 mL / min; detektor 300 nm. Po končani reakciji smo dodali izopropanol (10,28 kg), pri čemer smo vzdrževali temperaturo med -10 in -20 °C. Reakcijsko zmes smo mešali 30 do 45 minut. Grobi reakcijski produkt smo dobili s prenosom reakcijske zmesi v 105 L na 2 do 7 °C ohlajene vode ob stalnem vzdrževanju temperature pri 2 do 7 °C, temu pa smo dodali tudi ohlajen metilen klorid (20 kg pri 2 do 7 °C) s katerim smo sprali reakcijsko posodo. Suspenzijo kristalov smo mešali dodatne 2 do 3 ure, jo filtrirali in filtrirano usedlino zaporedoma sprali z metilen kloridom (26 kg pri 2 do 7 °C) in vodo (53 L pri

- 122 do 7 °C). Grobi produkt smo v obliki mokre pogače dodali v vodo (42 L) in izopropanol (40 L) in suspenzijo greli na 65 do 70 °C, da se je raztopila. Vročo raztopino smo filtrirali in filter oprali najprej z zmesjo izopropanola (20 L) in vode (21 L), ki je bila ogreta na 65 do 70 °C, nato pa še z vodo (126 L), ki je bila prav tako ogreta na 65 do 70 °C. Raztopino smo ohladili na 40 do 45 °C, vnesli kristalizacij ska jedra in jo mešali pri tej temperaturi 2 do 3 ure, da so zrasli kristali. Suspenzijo smo ohladili na 0 do 5 °C, jo mešali nadaljne 3 do 4 ure in jo filtrirali. Filtrimi kolač smo sprali z vodo (122,6 L), ki je bila predhodno ohlajena na temperaturo 2 do 7 °C. Produkt smo sušili v vakuumu pri maksimalni temperaturi do 50 °C dokler sprememba teže kolača ni bila manjša od 0,05 kg v časovnem intervalu 2 - 4 ur. Izkoristek: 8,468 kg (87,3 %). Čistost (HPLC): 98,5 %. Vsebnost vode po Karlu Fischerju: 3,0 %. Celokupna količina sorodnih spojin (HPLC): 1,79 %.

Primer 4

Priprava F-III iz 6-benziloksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen-(S-oksida)

Zmešali smo tetrahidrofuran (261 ml), vodo (45 ml), koncentrirano žveplovo kislino (6,14 g) in 6-benziloksi-3-(4-[2-(piperidin-l-il) etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil) benzo [b] tiofen-(S-oksid) (HPLC čistost 99 %, celokupna količina sorodnih spojin (HPLC) 0,35 %) in mešali do homogenosti. Dodali smo 10 % Pd/C (5,6 g suspenzije v 22 ml vode) in še 5 ml vode, s katero smo sprali posodo s Pd/C. Dobljeno suspenzijo smo evakuirali in posodo napolnili z vodikom (60 psi). Reakcijsko temperaturo smo uravnali na 30 °C. Po dveh urah smo dodali 10 % Pd/C (5,6 g) skupaj s 30 ml vode. Hidrogenirali (pri 60 psi in 30 °C) smo še nadaljnih 22 ur, ko smo dodali še 4,40 g 10 % Pd/C ter 30 ml vode in nadaljevali s hidrogeniranjem pri 60 psi in 30 °C še dodatne 2,5 ure. S filtriranjem smo odstranili katalizator in uravnali pH filtrata na 7,24 s 50 % natrijevim hidroksidom. Dodali smo v vodi (18 ml) raztopljen natrijev klorid (8,66 g) in dobljeno dvofazno raztopino mešali 30 minut. Po ločitvi obeh faz smo vodno fazo re-ekstrahirali s 50 ml tertahidrofurana. Organski fazi smo združili in ju skoncentrirali na 50 ml z destilacijo pri atmosferskem tlaku. Pri 24 °C smo koncentratu počasi, v času 1 ure, dodali 180 ml metanola. Dobljeno kristalinično suspenzijo smo mešali 30 minut pri 24 °C, jo ohladili na 0 °C in jo mešali še 1 uro. Trdno snov smo ločili s filtracijo in jo dvakrat sprali, prvič z 39 ml vode in drugič z 39 ml metanola, čemur je sledilo vakuumsko sušenje preko noči pri 50°C. Izkoristek: 15,52 g (67,8%).

-13 10 g trdne snovi, ki smo jo dobili kot je opisano zgoraj, smo zmešali z izopropanolom (33 ml) in vodo (66 ml). Ob mešanju pri 25 °C smo dodali 1,8 M HCI (21 ml). Trdna snov seje hitro raztopila, nato pa se je oborila v obliki hidrokloridne soli. Po 30 minutnem mešanju smo suspenzijo segreli na 70 °C, da se je celotna količina trdne snovi raztopila, nato pa smo jo ohladili na 60 °C in ji dodali 33 ml vode. Dobljeno raztopino smo v času treh ur ohladili na 25 °C. V tem času se je oborila hidrokloridna sol. Suspenzijo smo mešali pri 25 °C še približno 3 ure, nato pa smo jo filtrirali, sprali z vodo (30 ml) in jo sušili v vakuumu pri 50 °C. Dobili smo F-III z izkoristkom 8,9 g (82,7 %). HPLC čistost: 96,5 %; voda po Karlu Fischerju: 2,44 %; sorodne spojine (HPLC); 1,09 %.

Izrazi

Izraz “učinkovita količina”, kot jo uporabljamo tukaj, pomeni tisto količino F-III, pri kateri je spojina sposobna ustvariti inhibitome razmere ali iz njih izvirajoče neugodne učinke, ki jih opisujemo v tem dokumentu. Kadar uporabimo F-III skupaj z estrogenom, progestinom, inhibitorjem aromataze, analogom LHRH ali inhibitorjem AchE, pomeni “učinkovita količina” tudi pri teh snoveh tisto količino, ki povzroči zaželeni učinek.

Izraza “inhibirati” in “inhibitomi” vključujeta njun splošno sprejeti pomen, t.j. preprečiti, ovirati, zaustaviti, zmanjšati, upočasniti, zavreti, preokreniti, pa tudi izboljšati napredovanje ali resnost patoloških razmer ali njihovih posledic, ki jih tukaj opisujemo.

Izrazi “preprečitev”, “preprečenje”, “profilaksa”, “profilaktičen”, “oviranje” in “ovirati” so v tem dokumentu uporabljeni v istem (t.j. zamenljivem) pomenu in se nanašajo na zmanjšano verjetnost, da se bodo pri prejemniku F-III pojavile oziroma razvile patološke razmere ali njihove posledice, kijih tukaj opisujemo.

Izraza “zmanjšanje oz. izguba estrogena” se v tem besedilu nanašata na stanje (naravno ali kot posledica kliničnih posegov), v katerem ženska ne more sintetizirati dovolj lastnih endogenih hormonov, ki so potrebni za vzdrževanje od estrogena odvisnih funkcij, npr. menstruacije, homeostaze kostne mase, normalnega delovanje živčevja, normalnega stanja srca in ožilja itd. Do takšne izgube ali zmanjšanja estrogena lahko privedejo stanja (a niso omejena le nanje), kot so menopavza oziroma kirurška ali kemična ovarektomija, vključno z njenimi funkcionalnimi ekvivalenti, kot so zdravljenje z inhibitorjem aromataze, z agonisti ali antagonisti GnRH, z ICI 182780 in podobnim. Bolezni, ki so povezane zmanjšanjem ali izgubo estrogena vključujejo (vendar niso omejena le nanje) izgubo kostne mase, osteoporozo, srčnožilne bolezni in hiperlipidemijo.

-14Izraz “estrogen”, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje steroidne spojine, ki imajo estrogeno aktivnost, kot so npr. 17p-estradiol, estron, konjugirani estrogen (Premarin®), konjski estrogen 17β-εΐϊηϋ estradiol in podobno. Zaželjeni spojini z estrogenim delovanjem sta Premarin® in noretilnodrel.

Izraz “progestin”, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje spojine s progestacijskim delovanjem, kot so progesteron, noretilnodrel, nongestrel, megestrol acetat, noretindron in podobne. Najbolj zaželjen med njimi je noretindron.

Izraz “inhibitor aromataze”, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje spojine, ki so sposobne inhibirati aromatazo, npr. na tržišču razpoložljivi inhibitorji kot aminoglutemid (CYTANDREN®), anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®), formestan (LENATRON®), eksemestan (AROMASIN®) in podobni.

Izraz “analog LHRH”, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na analog sprostitvenega hormona za luteinizirajoči hormon, ki zaustavlja sintezo estrogena pri ženskah pred menopavzo. Takšna analoga sta npr. goserlin (ZOLADEX®), levprolid (LUPRON®) in podobni.

Izraz “inhibitor AChE”, kot ga uporabljamo tukaj, vključuje spojine, ki inhibirajo acetilholinesterazo, npr. fizostigmin salicilat, takrin hidroklorid, donepezil hidroklorid in podobne.

Izraz “povečati aktivnost ChAT”, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na povečanje encimske aktivnosti ChAT, ki povzroči povečano pretvorbo holina v acetilholin. Povečana aktivnost vključuje tako večjo učinkovitost in/ali hitrost encimske reakcije, ki jo katalizira ChAT, kakor tudi povečano količino encima na mestu, kjer se reakcija vrši. Povečana količina encima je lahko posledica regulacije gena ali kake druge stopnje v sintezi encima ter/ali zmanjšanja deaktivacije oziroma metabolizma encima.

Izbrani postopki testiranja

Splošni postopek pri pripravi podgan: petinsedemdeset dni stare (kadar ni navedeno drugače) samice podgan vrste Sprague Dawley (težke med 200 in 225 g) smo dobili iz Charles River Laboratories (Portage, MI, ZDA). Na živalih je bila že v Charles Rivers Laboratories opravljena ali obojestranska ovariektomija (OVX) ali pa lažen kirurški postopek (kontrolne živali), en teden za tem pa so bile dostavljene v naše raziskovalne laboratorije, kjer so po tri ali štiri skupaj en teden prebivale v visečih kovinskih kletkah in so imele neomejen dostop do hrane (vsebnost kalcija v hrani je bila približno 0,5 %) in vode. V prostoru je bila stalna temperatura

1522,2 ± 1,7 °C, relativna vlažnost je bila 40 %, obdobje svetlobe in teme pa se je menjavalo vsakih 12 ur.

Dozirni režim in odvzem tkiva: po enotedenskem obdobju aklimatizacije (torej dva tedna po 0VX) smo pričeli z rednim dnevnim doziranjem F-III. 17a-etinil estradiol ali F-III smo dajali oralno (kadar ni omenjeno drugače) v obliki suspenzije v 1 % karboksimetilcelulozi ali raztopljen v 20 % ciklodekstrinu. Snovi smo dozirali dnevno po 4 dni. Po doziranju smo živali stehtali in jih anestrezirali z zmesjo ketamin : ksilazin (2:1, v:v). Vzorce krvi smo jim odvzeli s kardialnim punktiranjem, nato pa smo živali žrtvovali z zadušitvijo v CO₂. Z vzdolžno incizijo smo odvzeli maternico in določili njeno vlažno težo. 17a-etinil estradiol smo kupili pri Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO, ZDA.

Srčno-žilna bolezen / hiperlipidemija

Vzorce krvi, ki smo jih dobili, kot je opisano zgoraj, smo pustili koagulirati pri sobni temperaturi dve uri in ločili serum z 10-minutnim centrifugiranjem pri 3000 obratih na minuto (RPM). Količino holesterola v serumu smo določili s pomočjo visoko občutljivega holesterolnega testa s predpripravlj enimi reagenti (“kitom”) firme Boehringer Mannheim Diagnostics. Na kratko: holesterol se oksidira v holest-4-en-3-on in vodikov peroksid, ki v prisotnosti peroksidaze reagira s fenolom in 4-aminofenazonom v p-kinolinsko iminsko barvilo, ki ga lahko določimo spektrofotometrično pri 500 nm. Količino holesterola izračunamo iz umeritvene krivulje. Celoten postopek smo avtomatizirali s pomočjo Biomek-ove avtomatske aparature.

Test za eozinofilno peroksidazo (EPO) v maternici

Maternice, ki smo jih odvzeli, kot je popisano zgoraj, smo do encimske analize hranili pri 4 °C. Maternice smo homogenizirali v 50-kratnem volumnu 50 mM Tris pufra (pH = 8,0), ki je vseboval 0,005 % Tritona Χ-100. Po dodatku 0,01 % vodikovega peroksida in 10 mM Ofenilendiamina (končni koncentraciji) v Tris pufru smo eno minuto zasledovali naraščanje absorbnosti svetlobe pri valovni dolžini 450 nm. Prisotnost eozinofilcev v maternici je indikacija za estrogeno aktivnost spojine. Maksimalno hitrost v 15 sekundnem intervalu smo določili iz začetnega linearnega dela reakcijske krivulje.

Postopek za ugotavljanje inhibicije izgube kostne mase (osteoporoze)

V skladu s splošnim postopkom priprave podgan, ki je opisan zgoraj, smo petintrideset dni vsakodnevno tretirali podgane (6 podgan v skupini) in jih 36. dne žrtvovali z zadušitvijo v CO₂. Petintrideset dni je dovolj dolga doba, da pride do maksimalnega zmanjšanja kostne gostote, ki jo merimo, kot je opisano tukaj. Po žrtvovanju smo živalim odvzeli maternice, jih očistili vseh drugih tkiv, iztisnili tekočino in izmerili težo vlažnega organa, preden smo potrdili pomankanje estrogena, ki je bilo povezano s popolno ovariektomijo; teža maternice se po kompletni ovariektomiji praviloma zmanjša za 75 %. Za kasnejšo histološko analizo smo maternice shranili v 10 % formalinu, ki je bil zapufran pri nevtralnem pH.

Preparirali smo desne stegnenice, jih pri distalni metafizi rentgensko slikali, slike pa digitalizirali in analizirali z računalniškim programom (NIH image). Na podoben način smo skenirali proksimalni del golenice s pomočjo kvantitativne računalniške tomografije. V skladu z zgoraj opisanim postopkom smo testiranim živalim oralno dajali F-III ali etinil estradiol (EE₂) v 20 % hidroksipropil-O-ciklodekstrinu. F-III se je pokazal kot koristen tudi v kombinaciji z estrogenom ali progestinom.

MCF-7 proliferacijski test

MCF-7 celice raka na prsih (adenokarcinomske celice ATCC HTB 22) smo goljili v vzdrževalnem mediju, ki je bil sestavljen iz MEM (minimalni osnovni medij brez fenol-rdečega indikatorja, firme Sigma, St Louis, MO, ZDA) z naslednjimi dodatki: 10 % fetalni goveji serum (FBS) (V/V), L-glutamin (2 mM), natrijev piruvat (1 mM), HEPES {(N-[2hidroksietil]piperazin-N’-[2-etansulfonska kislina], 10 mM}, neesencielne aminokisline in goveji insulin (1 pg/mL). Deset dni pred testom smo celice MCF-7 prenesli v vzdrževalni medij, v katerem je bil namesto 10 % običajnega FBS prisoten 10 % fetalni goveji serum, ki je bil očiščen z aktivnim ogljem, ki je bilo predhodno nasičeno z dekstranom (DCC-FBS), z namenom, da bi odstranili vse notranje zaloge steroidov; ta medij imenujemo testni medij. MCF-7 celice smo ločili od stene posodic z medijem za disociacijo celic (HBSS brez Ca²⁺, Mg²⁺ in indikatorja fenol-rdeče, vendar z dodanim 10 mM HEPES-om ter 2 mM EDTA). Celice smo dvakrat sprali s testnim medijem in uravnali njihovo koncentracijo na 80.000 celic na mL. Približno 100 pL (8.000 celic) smo prenesli v vsako od posodic za mikrokulture z'ravnim dnom (Costar 3596) in jih inkubirali pri 37 °C v vlažnem inkubatorju s 5 % CO₂ za 48 ur, da so se celice prilepile in se je vzpostavilo ravnotežje. Pripravili smo serijo razredčitev zdravila in DMSO (topilo kot kontrola) v testnem mediju in po 50 mL dodali v tri paralelke mikrokulture skupaj s po 50 mL testnega medija in tako dobili po 200 mL končnega volumna v vsaki ·

posodici. Po dodatni 48-umi inkubaciji pri 37 °C v vlažnem inkubatorju s 5 % CO₂ smo v mikrokulture dodali triciiran timidin (1 pCi/stekleničko) za 4 ure, nakar smo kulture zamrznili na -70 °C za 24 ur, s čemer smo zaustavili njihovo rast. Za tem smo zamrznjene kulture odtalili in poželi celice s pomočjo Skatronovega polavtomatskega zbiralca celic. Radioaktivnost v vzorcih smo določili s pomočjo scintilacijskega β-števca Wallac BetaPlace.

Inhibicija tumorja na dojki, kije bil induciran z DMBA

Od estrogena odvisne tumorje na dojki smo inducirali v samicah podgan vrste SpragueDawley, ki smo jih kupili pri Harlan Industries, Indianapolis, Indiana, ZDA. Pri starosti okrog 55 dni so podgane dobile s hrano eno samo 20 mg dozo 7,12-dimetilbenz [aj antracena (DMBA). Po okrog šestih tednih smo pričeli z rednim vsakotedenskim iskanjem tumorjev pri teh živalih s tipanjem mlečnih žlez. Ko smo otipali enega ali več tumorjev, smo izmerili najkrajši in najdaljši premer vsakega tumorja, podatke zabeležili in žival uvrstili v eksperimentalne skupine. Trudili smo se, da bi v testni in kontrolni skupini uvrstili živali s po velikosti približno enakomerno razporejenimi tumorji. Testna in kontrolna skupina za vsak eksperiment je štela od 5 do 9 živali.

F-III smo dajali z intraperitonealno injekcijo v 2 % gumiarabikumu ali oralno. Za oralno uporabo je bila spojina raztopljena ali suspendirana v 0,2 mL koruznega olja. Testne živali so dobivale substanco enkrat dnevno, kontrolne pa istočasno le gumiarabikum ali koruzno olje. Vsak teden smo pri vseh živalih premerili velikost tumorjev po zgoraj opisanem postopku. Po treh do petih tednih smo meritve zaključili in pri vseh živalih določili končno površino tumorjev in iz tega izračunali spremembo srednje (povprečne) tumorske površine pri testni in kontrolni skupini.

Postopek za testiranje maternične fibroze

Test 1: Testni skupini 3 do 20 žensk z maternično fibrozo smo dajali F-III. Dnevni odmerek spojine je bil od 0,1 do 1000 mg, čas dajanja pa 3 mesece. Vpliv spojine na maternično fibrozo pri ženskah v testni skupini smo nadzorovali ves čas med dajanjem spojine in še 3 mesece po prenehanju.

Test 2: Postopek je bil enak kot pri testu 1, le čas dajanja pripravka je bil 6 mesecev.

-18Test 3: Postopek je bil enak kot pri testu 1, le čas dajanja pripravka je bil 1 leto.

Test 4: Pri spolno zrelih samicah morskega prašička smo uporabili podaljšano stimulacijo z estrogenom, da bi inducirali leiomiomatijo. Dva do štiri mesece oziroma do pojava tumorjev smo živalim iniciirali estradiol 3-5 krat tedensko. Za tem smo živalim 3 do 16 tednov dnevno dajali F-III ali pa le topilo (kontrolna skupina), nakar smo živali žrtvovali, zbrali maternice in v njih analizirali regresijo tumorjev.

Test 5: Človeško leiomiomatozno tkivo smo implantirali v peritonealno votlino ali/in v maternični miometrij spolno zrelih kastriranih samic golih mišk. Rast implantiranega tkiva smo inducirali z dodajanjem eksogenega estrogena. V nekaterih primerih smo zbrane tumorske celice pred implantacijo gojili in vitro. Živalim smo 3-16 tednov dnevno dajali F-III ali pa le topilo (kontrolna skupina) z želodčno lavažo, nakar smo implantate odvzeli in izmerili, da bi določili njihovo povečanje ali zmanjšanje. Ob žrtvavanju smo živalim odvzeli tudi maternice in preverili stanje organa.

Test 6: Tkivo iz človeških materničnih fibroidnih tumorjev smo zbrali in vzdrževali in vitro kot primarno netransformirano kulturo. Izrezano tkivo smo potisnili skozi sito ali pa smo ga raztrgali, da smo dobili suspenzijo posameznih celic, ki smo jih gojili v mediju, ki je vseboval 10 % serum in antibiotik. Zasledovali smo hitrost rasti celic v prisotnosti in odsotnosti estrogena. Celice smo testirali glede na sposobnost tvorbe C3 komponente komplementa ter glede na odzivnost na rastne faktoije in rastne hormone. Preizkušali smo proliferativno odzivnost in vitro kulture po učinkovanju s progestini, GnRH, F-III in topilom (nosilcem). Vsak teden smo preverjali raven receptorjev za steroidne hormone, da bi ugotovili ali se ta pomembna značilnost celic ohranja in vitro. Uporabili smo tkivo 5 do 25 pacientk.

Test 7: Sposobnost spojine F-III za inhibicijo z estrogenom vzpodbujene proliferacije ELT celične linije, ki izvira leiomiotičnega tkiva smo merili v glavnem tako, kot-je opisano v članku:

Fuchs-Young, et al., “Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by

Selective Estrogen Receptor Modulators”, Mol. Car., 17(3): 151-159 (1996); ugotovitve tega članka so tu vključene kot referenca.

Postopek za testiranje endometrioze

-19Test 1: Kot testne živali smo uporabili 12 do 30 odraslih samic podgan vrste CD. Razdelili smo jih v tri številčno enake skupine. Pri vseh živalih smo zasledovali njihov spolni cikel. Na dan ovulacije (proestrus) smo na vseh živalih izvedli operacije. Samicam v vseh skupinah smo odstranili levi rog maternice, ga razrezali na majhne dele in le-te ohlapno prišili na različna mesta v bližini mezenteričnega krvotoka. Poleg tega smo samicam v skupini 2 odstranili tudi jajčnike. Od dneva, ki je sledil operaciji, smo živalim v skupini 1 in 2 14 dni dajali intraperitonealne injekcije vode, živalim iz skupine 3 pa v istem obdobju intraperitonealne injekcije 1,0 mg F-III na kilogram telesne teže. Po 14 dnevni obravnavi smo vse živali žrtvovali, jim odstranili prišite koščke endometričnega tkiva, adrenalne žleze, preostanek maternice in jajčnike, kjer so bili še prisotni, in odvzeti material pripravili za histološko preizkavo. Jajčnike in adrenalne žleze smo stehtali.

Test 2: Kot testne živali smo uporabili 12 do 30 odraslih samic podgan vrste CD. Razdelili smo jih v dve številčno enaki skupini. Pri vseh živalih smo zasledovali njihov spolni cikel. Na dan ovulacije (proestrus) smo na vseh živalih izvedli operacije. Samicam v obeh skupinah smo odstranili levi rog maternice, ga razrezali na majhne dele in le-te ohlapno prišili na različna mesta v bližini mezenteričnega krvotoka. Od 50. dneva, ki je sledil operaciji, smo živalim v skupini 1 21 dni dajali intraperitonealne injekcije vode, živalim iz skupine 2 pa v istem obdobju intraperitonealne injekcije 1,0 mg F-III na kilogram telesne teže. Po 21 dnevni obravnavi smo vse živali žrtvovali, jim odstranili prišite koščke endometričnega tkiva in adrenalne žleze ter jih stehtali. Velikost odvzetih implantatov smo premerili, da bi ugotovili njihovo morebitno rast.

Test 3: Avtoimplantate endometričnega tkiva smo uporabili za indukcijo endometrioze pri podganah in/ali zajcih. Na spolno zrelih samicah smo opravili obojestransko ooforektomijo nakar smo jim dajali eksogeni estrogen in jim tako zagotovili določeno stalno raven tega hormona. Avtoimplantate endometričnega tkiva smo vstavili v peritonij 5 do 150 živali in jim dajali estrogen, da bi vzpodbudili rast implantiranega tkiva. Spojino, ki je predmet tega izuma, smo dajali živalim 3 do 16 tednov s pomočjo želodčne lavaže, nato pa smo odstranili implante ter jih premerili, da smo ugotovili njihovo rast ali zmanjšanje. Ob žrtvovanju smo živalim odvzeli tudi ohranjeni maternični rog za kontrolo stanja endometrija.

- 20 Test 4: Tkivo človeškega poškodovanega endometrija smo implantirali v peritonij spolno zrelih kastriranih samic golih miši, ki smo jim dajali eksogeni estrogen, da bi vzpodbudili rast implantiranega tkiva. V nekaterih primerih smo zbrane celice endometričnega tkiva pred implantacijo gojili in vitro. Eksogeni estrogen smo dajali živalim dnevno 3 do 16 tednov s pomočjo želodčne lavaže, nato pa smo odstranili implante ter jih premerili, da smo ugotovili njihovo rast ali zmanjšanje. Ob žrtvovanju smo živalim odvzeli maternice za kontrolo stanja endometrija.

Test 5: Tkivo človeškega poškodovanega endometrija smo gojili in vitro kot primarno netransformirano kulturo. Izrezano tkivo smo potisnili skozi sterilno sito ali pa smo ga raztrgali, da smo dobili suspenzijo posameznih celic, ki smo jih gojili v mediju, ki je vseboval 10 % serum in antibiotik. Zasledovali smo hitrost rasti celic v prisotnosti in odsotnosti estrogena. Celice smo testirali glede na sposobnost tvorbe C3 komponente komplementa ter glede na odzivnost na rastne faktorje in rastne hormone. Preizkušali smo proliferativno odzivnost in vitro kulture po učinkovanju s progestini, GnRH, F-III in topilom (nosilcem). Vsak teden smo preverjali raven receptorjev za steroidne hormone, da bi ugotovili ali se in vitro ohranjajo pomembne značilnosti celic. Uporabili smo tkivo 5 do 25 pacientk.

Motnje v centralnem žičnem sistemu vključno z Alzheimerjevo boleznijo

Estrogeni kot je 17p-estradiol uravnavajo prepisovanje genov preko vezave na estrogenski receptor (ER), ki se nahaja v citoplazmi določenih celic. Vezava liganda na ER in s tem njegova aktivacija je pogoj za prenos nastalega kompleksa v jedro, kjer se z vezavo kompleksa na 13 baznih parov dolg palindromičen ohranjen segment DNA zaporedja (estrogen response element, ERE) začne sestavljanje transkripcij skega aparata, ki povzroči aktivacijo ustreznih tarčnih genov. Doslej so identificirali vrsto genov, ki jih regulira estrogen, med njimi geni za citoskeletne proteine, za encime, ki so vključeni v biosintezo in metabolizem nevrotransmiterjev, pa tudi drugih hormonov in nevropeptidov. ERE so identificirali v mnogih genih, ki se odzivajo na estrogen, med drugim v genih za vitelogenin, c-fos, prolaktin in luteinizirajoči hormon.

Med tistimi geni, ki so pomembni za centralni živčni sistem, so našli zaporedja, ki so analogna ERE, v genih za p75^ngr in za trkA, dve substanci, ki delujeta kot signalni molekuli za nevrotrofine kot so živčni rastni faktor (nerve growth factor, NGF), možganski živčni rastni faktor (BDNGF) in nevrotrofin-3.

-21Za BDNF in NGF so pokazali da pomagata pri preživetju holinergičnih nevronov v kulturi. Domnevajo, da takrat, kadar je interakcija med nevrotrofini in estrogeni pomembna za razvoj in preživetje bazalnih nevronov prednjih možganov (le-ti degenerirajo pri Alzheimerjevi bolezni), klinične razmere, za katere je značilno pomanjkanje estrogenov (kot n.pr. pri menopavzi) pripomorejo k izgubi the nevronov.

Da bi odkrili podobnosti in razlike med F-III in estrogenom pri vplivu na izražanje genov v različnih predelih možganov smo izvedli naslednji eksperiment na ovariektomiziranih podganah, ki smo jih pripravili, kot je opisano zgoraj. Šest tednov starim podganam smo dnevno dajali podkožne injekcije estradiol benzoata (0,03 mg/kg), F-III ali pa le topilo (nosilec). Po pettedenski obravnavi smo živali žrtvovali in z mikrodisekcijo odvzeli hipokampuse, ki smo jih na hitro zamrznili s tekočim dušikom in jih hranili pri -70 °C. Iz zbranega tkiva v okviru vsake poskusne skupine smo pripravili celotno RNA in izvedli obratno prepisovanje (reverzno transkripcijo) z uporabo 3’ oligonukleotidnih primerskih sekvenc, ki smo jih izbrali za določene mRNA (poli-A+) populacije. Polimerazno verižno reakcijo (PCR) smo izvedli v raztopini, ki je vsebovala naključne 5’ oligonukleotide (dolžine 10 baznih parov, celotno število oligonukleotidov je bilo 150), reakcijski pufer, Taq polimerazo in PdCTP.

Po 40 krogih pomnoževanja smo frakcionirali produkte na 6% TBE-urea gelu, ki smo ga za tem osušili in izpostavili na rontgenske žarke občutljivemu filmu. Dobljene radiografske vzorce mRNA, ki smo jih dobili za vsako eksperimentalno skupino, smo primerjali med seboj.

Uporaba F-III v kombinaciji z estrogenom

Ženske v času mene in po njej pogosto dobivajo nadomestno hormonsko terapijo (hormone replacement therapy, HRT), da laže prebrodijo težave, ki so povezane z zmanjšano koncentracijo endogenega estrogena, t. i. naval krvi v obraz, ki ga spremlja občutek vročine. Vendar pa HRT povezujejo s povečanim tveganjem za določene vrste raka, vključno z rakom na prsih in maternici. F-III lahko uporabimo v kombinaciji s HRT, da tveganje za raka zmanjšamo.

Uporaba F-III v kombinaciji z inhibitorjem aromataze

Praviloma jajčniki žensk po meni ne delujejo več. Zato je za te ženske edini vir estrogena tisti estrogen, v katerega se pretvori del androgenih hormonov s pomočjo encima aromataze, ki se nahaja v perifernem tkivu kot je npr. maščevje, mišičje in tumor na prsih sam. Tako lahko zdravila, ki inhibirajo aromatazo (inhibitorji aromataze) preprečijo nastanek še tega estrogena in s tem povzročijo, da v krvotoku žensk po menopavzi sploh ni več estrogena. Izguba estrogena

-22kot posledica inhibicije aromataze predstavlja pomembno terapevtsko možnost pri pacientih z metastaziranim rakom na prsih. Med terapijo z inhibitorjem aromataze pa lahko pomanjkanje estrogena povzroči neugodne in nezaželene stranske vplive, npr, na količino serumskih lipidov. Za preprečitev teh neugodnih učinkov lahko uporabimo F-III.

Uporaba F-III v kombinaciji z analogom LHRH

Stalna izpostavljenost analogom LHRH (luteinizing hormone releasing hormone, sprostitveni faktor za luteinizirajoči hormon) zavre tvorbo estrogena pri ženskah pred meno, ker pride do desenzibilizacije hipofize, tako da le-ta ne vzpodbuja več jajčnikov, da bi tvorili estrogen. Klinični učinek tega je t.i. “oofrektomija kot posledica zdravil”, ki pa je reverzibilna, če ustavimo dajanje analoga LHRH. Med terapijo z analogom LHRH pa lahko pomanjkanje estrogena povzroči neugodne in nezaželene stranske vplive, npr, na količino serumskih lipidov. Za preprečitev teh neugodnih učinkov lahko uporabimo F-III.

Povečana koncentracija acetilholina

Znano je, da imajo pacienti, ki trpijo za Alzheimerjevo boleznijo, v hipokampusu občutno zmanjšano količino holinergičnih nevronov v primerjavi z zdravimi ljudmi. Kaže, da se pri teh pacientih napredujoča izguba holinergičnih nevronov odraža v napredujoči izgubi spomina in kognitivnih funkcij. Domnevajo, da je eden od vzrokov za propad teh nevronov zmanjšano ali popolnoma ustavljeno delovanje prenašalca živčnega impulza acetilholina. Količina acetilholina v nevronu je v osnovi določena z ravnotežjem med njegovo sintezo in biološko razgradnjo. Encim holinacetiltransferaza (ChAT) je predvsem odgovoren za sintezo, encim acetilholinesteraza pa za razgradnjo acetilholina.

Da bi spoznali vpliv F-III na aktivnost ChAT, smo izvedli naslednji poskus: 40 podganam, ki smo jih pripravili, kot je opisano zgoraj, smo dnevno dajali oralno ali pa smo jim podkožno iniciirali F-III (3 mg/kg/dan) v nosilcu, kije vseboval 10 % ciklodekstrin, ali estradiol benzoat (0,03 do 0,3 mg/kg/dan), ali pa le nosilec za kontrolo. Živali so dobivale opisane snovi 3 ali 10 dni. V vsaki skupini je bilo 20 živali. Po ustreznem času smo živali žrtvovali, jim odvzeli možgane in določene dele možganov izrezali, jih homogenizirali in testirali. V homogenatih iz hipokampusa ter frontalnega korteksa smo določali aktivnost ChAT z merjenjem sinteze acetilholina s pomočjo radioaktivnih izotopov po proceduri, ki je opisana v članku Schoepp et al., J. Neural Transmiss., 78: 183-193, 1989, ki ga tu navajamo kot referenco.

-.23.Kot smo pričakovali, je bila aktivnost ChAT pri živalih z obojestransko ovariektomijo (OVX živali) zmanjšana za več kot 50 % (p<0,001) v primerjavi s kontrolnimi živalmi z lažno operacijo.

V drugi vrsti poskusov smo uporabili F-III v kombinaciji z inhibitorjem AChE. Ob uporabi inhibitorja AChE se je koncentracija acetilholina povečala, ker je bila njegova razgradnja zavrta zaradi inhibicije AChE.

Benigna prostatična hiperplazija (BPH)

Za osnovno poznavanje povezave med delovanjem estrogena in zdravljenjem BPH ter raka na prostati glej Prijavo PCT št. WO 98/07274, dan mednarodne objave: 15. oktober 1998.

S spodaj opisanimi poskusi smo ovrednotili sposobnost F-III za vezavo na estrogenske receptorje v različnih celičnih linijah človeškega raka na prostati.

Pripravili smo lizate celičnih linij človeškega raka na prostati vrste LNCaP, DU-45 ter PC-3 v TEG mediju, ki je vseboval 50 nM Tris-HCl (pH 7,4), 1,5 mM etilendiaminotetraocetne kisline (EDTA), 0,4 M KC1, 10 % glicerol, 0,5 mM 2-ME in 10 mM natrijevega molibdata, poleg tega pa še inhibitorje proteinaz: pepstatin (1 mg/mL), leupeptin (2 mg/mL), aprotinin (5 mg/mL) in fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF, 0,1 mM); ta medij smo označili kot TEGP.

Celične lizate smo centrifugirali, oborino smo ponovno suspendirali v hladnem TEGP (1 ml TEGP/lOOmg oborine) in za 30 sekund izpostavili ultrazvoku (70 % delovni cikel, jakost izhoda 1,8) v aparaturi Branson Model 450. Nato smo lizate oborili s 15-minutnim centrifugiranjem pri 10000 x g in 4°C, ločili supematante in jih takoj uporabili ali pa jih shranili pri -70 °C.

Kompeticiiski test vezave: Pufer pri vezavnih študijah je bil TEG, pri katerem smo 0,4 M KC1 zamenjali s 50 mM NaCI in mu dodali še 1 mg/mL ovalbumina; ta pufer smo označili s TEGO. F-III smo razredčili v TEGO na 20 nM in iz te matične raztopine pripravili trikratno serijsko razredčitev. Test smo izvedli v polipropilenskih mikroploščicah s trojnimi vdolbinicami s polkrožnim dnom. V vsako vdolbinico smo dali 35 mL triciiranega 17P-estradiola (0,5 nM, specifična aktivnost 60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA, ZDA) in 35 mL hladne testirane kompetirajoče spojine (0,1 nM - 5mM) ali TEGO ter po 5 minutah inkubacije med stresanjem pri 4 °C še 70 mL lizata iz celic MCF-7.

Ploščice smo 24 ur inkubirali pri 4 °C, nakar smo v vse vdolbinice dodali z dekstranom obdelano aktivno oglje (dextran-coated charcoal - DCC) in ploščice intenzivno stresali 8 minut pri 4 °C. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 1500 x g pri 4 °C smo supematante prenesli v

-24-.

fleksibilne polistirenske mikroploščice in v njih določili radioaktivnost s pomočjo števca radioaktivnosti Wallac Micobeta Model 1450. Radioaktivnost smo korigirali z upoštevanjem ozadja ter izkoristka aparature in jo izrazili kot število razpadov na minuto (DPM). Za dodatno kontrolo smo uporabili celotno količino dodane radioaktivnosti ter celotno količino dodane radioaktivnosti po obdelavi z DCC (celotna radioaktivnost + DCC), da smo določili spodnjo mejo radioaktivnosti, ki jo izločimo z DCC. Rezultate smo izrazili kot srednji odstotek vezave (% vezave) +/- standardna deviacija in uporabili formulo:

DPMtestna spojina - DPM_Celotna radioaktivnost + DCC % vezave - ------------------------------------------------------- x 100

DPMbrez testne spojine ~ DPM_celotna radioaktivnost + DCC

Preprečevanje raka na prsih

Ta izum se nanaša tudi na predpisovanje F-III osebi, kije ogrožena, da se pri njej razvije rak na prsih de novo. Izraz “Je novo”, kot ga uporabljamo tukaj, pomeni primarno transformacijo ali metamorfozo normalnih celic v tkivu prsi v rakove ali maligne celice. Takšna transformacija se lahko zgodi v več stopnjah v isti ali v hčerinski celici preko procesa evolucije ali pa se zgodi kot enkraten ključen dogodek. De novo proces je nasproten dogodkom kot so metastaziranje, kolonizacija ali razširjenje že transformiranih ali malignih celic iz kraja primarnega tumorja na nove lokacije.

Oseba, pri kateri ni nobenega posebnega tveganja za razvoj raka na prsih, je tista oseba, pri kateri se lahko razvije rak na prsih de novo, pri kateri ni znakov ali suma za tveganje za razvoj raka na prsih, ki bi bilo večje od normalnega tveganja in pri kateri raka na prsih doslej niso še nikoli diagnosticirali. Največji dejavnik tveganja za raka na prsih je predhodno pojavljanje te bolezni v preteklosti, tudi če je v fazi pomiritve in je trenutno ne opažamo več. Drugi dejavnik tveganja je pojavljanje bolezni v družini.

Povzročitev raka na prsih pri podganah z uporabo kancerogene snovi N-nitrozo-N-metiluree je splošno priznan živalski model za proučevanje raka na prsih, ki se je pokazal za primernega za analizo učinkov kemičnih spojin, ki preprečujejo nastanek ali zavirajo rast tumorjev (kemopreventivne snovi).

-25V dveh ločenih raziskavah smo dali 55 dni starim samicam podgan vrste SpragueDawley intravenozno (raziskava 1) ali intraperitonealno (raziskava 2) po 50 mg N-nitrozo-Nmetil-uree, nakar smo jim po enem tednu v hrano, ki jim je bila na voljo ad libidum, primešali različne količine F-III, ali (Z)-2-[4-( 1,2-difenil-1-buteniljfenoksijALV-dimetiletanamina (baza tamoksifena), ali pa nič (za kontrolo).

Pri raziskavi 1 ustrezata dozi 60 oziroma 20 mg/kg hrane približno primerljivima dozama 3 oziroma 1 mg/kg telesne teže testnih živali.

Pri raziskavi 2 ustrezajo doze 20, 6, 2 oziroma 0,6 mg/kg hrane približno primerljivim dozam 1, 0,3, 0,1 oziroma 0,03 mg/kg telesne teže testnih živali.

Pri podganah smo opazovali, ali se pojavljajo kaki znaki toksičnosti, jih tehtali in s palpacijo enkrat tedensko ugotavljali pojavljanje tumorjev. Po 13 (raziskava 1) oziroma 18 tednih (raziskava 2) smo podgane žrtvovali, pregledali tumorje in ji po avtopsiji stehtali.

Pripravki

Pridevnik “farmacevtski” uporabljamo tukaj v pomenu v bistvu neškodljiv za prejemnika. Z izrazom “farmacevtski pripravek” pa mislimo na nosilec, topilo ali razredčilo, akscipiens in aktivno(e) sestavino(e), ki morajo biti skladne z drugimi sestavinami v pripravku, ki ne sme biti škodljiv za prejemnika.

Pripravek F-III je najbolje pripraviti pred uporabo. O vrsti pripravka naj se odloči lečeči zdravnik, pri čemer naj pri določanju učinkovite doze upošteva vse dejavnike, ki lahko vplivajo na delovanje.

Celotna količina aktivnih snovi predstavlja od 0,1% do 99,9% celotne teže pripravka. Zaželjeno je, da bi v pripravku ne bili več kot dve aktivni sestavini, to je F-III in še ena aktivna snov, ki jo izberemo izmed estrogena, progestina, inhibitorja aromataze, analoga LHRH in inhibitorja AChE. Najbolj paje zaželjeno, daje v pripravku F-III edina aktivna snov.

Farmacevtske pripravke, ki so predmet tega izuma, pripravljamo v skladu s postopki, ki so znani v farmacevtski stroki in z uporabo dobro poznanih in razpoložljivih sestavin. Tako lahko F-III, samostojno ali v kombinaciji s še eno aktivno spojino, ki jo izberemo izmed estrogena, progestina, inhibitorja aromataze, analoga LHRH ali inhibitorja AChE,'pripravimo z uporabo običajnih ekscipiensov, nosilcev, topil ali razredčil, in to v obliki tablet, kapsul, suspenzij, raztopin, injekcijskih raztopin, aerosolov, praškov in podobnega.

Farmacevtski pripravki za parenteralno uporabo, ki so predmet tega izuma, vključujejo sterilne vodne in nevodne raztopine, disperzije, suspenzije ali emulzije, pa tudi sterilne praške,

-26iz katerih neposredno pred uporabo pripravimo sterilne raztopine ali suspenzije. Primeri ustreznih sterilnih vodnih in nevodnih nosilcev, razredčil, topil ali prenašalcev vključujejo vodo, fiziološko raztopino soli, etanol, poliole (npr. glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, in podobne) in njihove primerne zmesi, rastlinska olja (npr. olivno olje) in organske estre (npr. etiloleat), ki jih lahko injiciramo. Ustrezno fluidnost dosežemo z uporabo premaznih sredstev kot je lecitin, v primeru suspenzij in disperzij pa z uporabo delcev ustrezne velikosti in z dodatkom površinsko aktivnih snovi.

Sestavina za parenteralno uporabo lahko vsebuje tudi dodatke, kot so zaščitna sredstva ter sredstva za omočenje, emulgiranje ali disperzijo. Delovanje mikroorganizmov preprečimo z dodatkom antibakterijskih in antifungicidnih sredstev, npr. s parabenom, klorobutanolom, fenolsorbinsko kislino in podobnim. Včasih je zaželjen dodatek snovi za vzpostavljanje izotoničnosti, kot so sladkorji, natrijev klorid in podobno. Podaljšano absorpcijo injiciranih pripravkov lahko dosežemo s sredstvi, ki zadržujejo absorpcijo, kot sta npr. aluminijev monostearat in želatina.

V nekaterih primerih, ko je predpisano podaljšano delovanje zdravila je zaželjeno počasno absorbiranje zdravila vbrizgano pod kožo ali v mišico. To je lahko doseženo z uporabo tekoče suspenzije kristaličnega materiala z nizko topljivostjo v vodi ali z raztopitvijo ali odložitvijo zdravila v nekem oljnem sredstvu. V primeru vbrizganja pod kožo ali v mišico suspenzijske vsebine zdravila z obliko nizke topljivosti v vodi je razmerje absorbcije zdravila odvisno od razmerja njegove raztopitve.

Pripravki z F-III »s skladiščenjem« za injiciranje so narejeni s formiranjem mikrokapsulskih matric zdravila v bio razgradiljivem polimeru kot je poli ( mlečna kislina), poli (glikolne kisline), kopolimeri mlečne in glikolne kisline, poli (ortoesteri) in poli (anhidridi), ki so opisani v stanju tehnike. V odvisnosti od razmerja zdravila in polimera ter karakteriastik posamerznih uporabljenih polimerov je možno kontrolirati sprostitev zdravila.

Pripravke za injiciranje lahko steriliziramo s filtriranjem skozi filter, ki zadrži bakterije, ali pa s predhodno sterilizacijo vseh sestavin, in to že v času izdelave ali pa neposredno pred uporabo (npr. v kompletu z brizgo z dvema komorama).

Pripravki v trdni obliki za oralno uporabo vključujejo kapsule, tablete, pilule, praške in zrnca. V takšnih pripravkih zamešamo F-III z vsaj enim inertnim farmacevtskim nosilcem kot je natrijev citrat ali dikalcijev fosfat ter/ali (a) s polnilom kot so škrob, sladkorji (npr. laktoza ali glukoza), manitol in sialična kislina; (b) z vezivnimi sredstvi kot so karboksimetilceluloza in drugi derivati celuloze, alginati, želatina, polivinilpirolidin, saharoza in gumiarabikum; (c) absorpcijska sredstva za vodo, kot je glicerol; (d) desintegracijska sredstva, kot agaragar,

- 27 kalcijev karbonat, natrijev bikarbonat, škrob iz krompirja ali tapioke, alginska kislina, silikati in natrijev karbonat; (e) omočilna sredstva, kot je glicerol; (f) sredstva, ki zadržujejo prehod snovi v raztopino, kot npr. parafin; (g) sredstva, ki pospešujejo absorpcijo, kot so kvartarne amonijeve spojine; (h) vlažilna sredstva, kot sta cetilni alkohol in glicerol monostearat; (i) absorbenti, kot sta kaolinska ali bentonitna glina; in (j) maziva, kot so smukec (talk), kalcijev stearat, magnezijev stearat, trdni polietilen glikoli, natrijev lavril sulfat in njihove zmesi. Kapsule, tablete in pilule lahko vsebujejo tudi snovi za pufranje.

Trdni pripravki lahko v mehkih ali trdih kapsulah iz želatine vključujejo tudi polnilo iz ekscipiensov, kot je laktoza ali pa polietilen glikoli z visoko molsko maso in podobno.

Trdni pripravki v obliki tablet, dražejev, kapsul, pilul in zrnc imajo lahko tudi zaščitne sloje, kot je npr. enterični sloj ali kak drug zaščitni sloj, kar je dobro znano v stroki. Ti sloji lahko vsebujejo sredstva, ki jih naredijo neprozorne ali pa sredstva, ki omogočajo sproščanje aktivne snovi v čisto določenem delu prebavil, npr. sredstva, ki se raztopijo v kislini in ki sproščajo aktivno spojino v želodcu, ali pa sredstva, ki se raztopijo v bazičnem mediju in ki sprostijo aktivne snovi v črevesju.

Aktivne snovi lahko pripravimo tudi v mikrokapsulah z ovojem za zadrževano sproščanje in jih v taki obliki vključimo v pilule ali kapsule.

Tekoči pripravki za oralno doziranje F-III vključujejo raztopine, emulzije, suspenzije, sirupe in eliksirje. Poleg aktivnih spojin lahko taki pripravki vsebujejo še inertna razredčila, ki se običajno uporabljajo v farmacevtski stroki, npr. vodo ali druga farmacevtska topila, solubilizacijske snovi in emulgatorje, kot so etanol, izopropanol, etilkarbonat, etilacetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilenglikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, olja (predvsem iz bombažnega semena, arašidov, koruze, kalčkov, oliv, ricinusa in sezama), estri maščobnih kislin s sorbitolom in zmesi naštetih snovi.

Tekoči oralni pripravki lahko poleg inertnih razredčil vsebujejo še dodatke, kot so omočila, sredstva za emulgiranje in suspendiranje, kakor tudi sladila ter sredstva za izboljšanje okusa in vonja.

Tekoče suspenzije lahko vsebujejo poleg aktivnih snovi tudi sredstva za suspendiranje, kot so etoksilirani izostearilni alkoholi, polietilen sorbitolne in sorbitanske estre, mikrokristalinično celulozo, aluminijev metahidroksid, bentonitno glino, agaragar, tragakant ali njihove zmesi.

Pripravke za rektalno in intravaginalno uporabo pripravimo z vmešavanjem F-III v ustrezen nedražeč ekscipiens, kot je kakavovo maslo, polietilen glikol ali katerikoli vosek za

-28-svečke, ki je trden pri sobni temperaturi, pri telesni temperaturi pa se utekočini in zato v votlini rektuma ali vagine sprosti aktivno snov. Spojino raztopimo v staljenem vosku, ki ga oblikujemo v zaželjeno obliko in strdimo v končan pripravek v obliki svečke.

F-III lahko dajemo tudi v liposomih. Kot je znano v stroki, lahko liposome naredimo iz fosfolipidov ali kakih drugih lipidov. Liposomski pripravki so v obliki mono- ali multilamelnih hidratiranih tekočih kristalov, ki so dispergirani v vodnem mediju. Uporabimo lahko katerikoli netoksičen farmacevtsko ustrezen lipid, ki metabolizira. Liposomski pripravek lahko poleg F-III vsebuje še stabilizatorje, ekscipiense, zaščitne snovi in podobno. Najprimernejši lipidi za pripravo liposomov so fosfolipidi in fosfatidilholini (lecitini), in to tako naravni kot umetni.

Postopki za pripravo liposomov so v stroki poznani in opisani, npr. v članku: Prescott, Ed., Methods in Celi Biology, Volumen XIV, Academic Press, New York, Ν.Υ., ZDA (1976), stran 33 et seq.

Pripravki, ki sledijo so prikazani le kot ilustracija in nikakor ne omejujejo okvirja predlaganega izuma.

Pripravek 1: Kapsule iz želatine

Trde kapsule iz želatine pripravimo iz naslednjih sestavin	Količina (mg/kapsulo)
F-III	0,1 - 1000
Škrob, NF	0 - 650
Škrob (“tekoči” prah)	0 - 650
Siliconska tekočina (350 centistoke)	0 - 15

Zgornji pripravek je mogoče ustrezno spremeniti, če so na voljo smiselne različice navedenih sestavin.

Pripravek v obliki tablet izdelamo iz naslednjih sestavin:

Pripravek 2: Tablete

Sestavina	Količina (mg/tableto)
F-III	2,5 - 1000

Celuloza, mikrokristalinična	200 - 650
Silicijev dioksid, oparjen	10 - 650
Stearinska kislina	5 - 15

Sestavine zmešamo in jih stisnemo v tablete.

Pripravek 3: Tablete, ki vsebujejo približno 10 oziroma 50 mg F-III, lahko pripravimo tako:

Sestavina	Količina (mg/tableto)	Količina (mg/tableto)
F-III	11,3	56,5
Laktoza (brezvodna)	176,8	128,2
Laktoza (sušena s pršenjem, specialna)	44,2	32,0
Povidon	11,0	13,0
Polisorbat 80	2,5	2,6
Zamrežen povidon (Crosspovidone); znotraj	6,25	6,5
Zamrežen povidon (Crosspovidone); zunaj	6,25	6,5
Magnezijev stearat	1,5	1,7
Mikrokristalinična celuloza; zunaj	0,0	13,0

Sestavine zmešamo in jih stisnemo v tablete.

Alternativno lahko tablete, ki vsebujejo od 2,5 do 1000 mg F-III, pripravimo tako:

Pripravek 4: Tablete

Sestavina	Količina (mg/tableto)
F-III	25 - 1000
Škrob	45
Celuloza, mikrokristalinična	35
Polivinilpirolidon (kot 10% raztopina v vodi)	4
Natrijeva karboksimetil celuloza	4,5
Magnezijev stearat	0,5
Smukec (Talk)	1

-30F-III, škrob in celulozo presejemo skozi sito (št. 45 mesh USA) in skrbno zmešamo. Dobljeni prašek vmešamo v raztopino polivinilpirolidona in raztopino spustimo skozi sito (št. 14 mesh USA). Zrnca, ki jih tako dobimo, posušimo pri 50 - 60 °C in presejemo skozi sito (št. 18 mesh USA). Zrncem dodamo natrijevo karboksimetil celulozo, magnezijev stearat in smukec (talk), ki smo jih predhodno presejali skozi sito (št. 60 mash USA), in po mešanju maso stisnemo v tablete.

Suspenzije, ki vsebujejo od 0,1 do 1000 mg zdravila v 5 ml, lahko pripravimo tako:

Pripravek 5: Suspenzije

Sestavina	Količina (mg/5 ml)
F-III	0,1 - 1000 mg
Natrijeva karboksimetil celuloza	50 mg
Sirup	Č25 mg
Raztopina benzoeve kisline	0,10 mL
Snov za okus	q.v.
Barvilo	q.v.
Prečiščena voda	5 mL

Zdravilo presejemo skozi sito (št. 45 mesh USA) in zmešamo z natrijevo karboksimetil celulozo ter sirupom v gladko pasto. Raztopino benzoeve kisline, sredstva za okus in barvilo razredčimo z nekaj vode in dodamo ob mešanju. Končno dodamo še potrebno količino vode, da dobimo ustrezen volumen.

Aerosolno raztopino pripravimo iz naslednjih sestavin:

Pripravek 6: Aerosol

Sestavina	Količina (utežni %)
F-III	0,25
Etanol	25,75 .
Potisni plin 22 (klorodifluorometan)	70,00

F-III vmešamo v etanol, dobljeno zmes pa dodamo v del potisnega plina 22, ki je bil predhodno ohlajen na -30 °C in prenesemo v polnilno napravo. S potrebno količino te zmesi napolnimo

-31 posodico iz nerjavečega jekla in razredčimo s preostankom potisnega plina. Posodico zapremo s pokrovom, ki je opremljen z ventilom.

Svečke pripravimo tako-le:

Pripravek 7: Svečke

Sestavina	Količina (mg/svečko)
F-III	250
Gliceridi z nasičenimi maščobnimi kislinami	2000

F-III presejemo skozi sito (št. 60 mesh USA) in ga suspendiramo v gliceridih z nasičenimi maščobnimi kislinami, ki smo jih predhodno raztalili, pri čemer smo uporabili najmanjšo možno temperaturo. Dobljeno zmes nalijemo v model za svečke (nazivna količina je 2 g) in jo ohladimo.

Raztopino za intravenozno injiciranje pripravimo tako:

Pripravek 8: Raztopina za intravenozno injiciranje

Sestavina	Količina
F-III	25 mg
Izotonična razopina soli	1000 mL

Raztopino, ki vsebuje zgoraj navedene sestavine, injiciramo pacientu intravenozno s hitrostjo 1 mL na minuto.

Pripravek 9: Kombinirane kapsule I

Sestavina	Količina (mg/kapsulo)
F-III	50
Premarin	1
Avicel pH 101	50
Škrob 1500	117,50
Silikonsko olje	2
Tween 80	0,50
Cab-O-Sil	0,25

Pripravek 10: Kombinirane kapsule II

Sestavina	Količina (mg/kapsulo)
F-III	50
Noretilnodrel	50
Avicel pH 101	82,50
Škrob 1500	90
Silikonsko olje	2
Tween 80	0,50

Pripravek 11: Kombinirane tablete

Sestavina	Količina (mg/kapsulo)
F-III	50
Premarin	1
Koruzni škrob NF	50
Povidon, K29-23	6
Avicel pH 101	41,50
Avicel pH 102	136,50
Krospovidon, XL10	2,50
Magnezijev stearat	0,50
Cab-O-Sil	0,50

Doziranje

Specifično dozo za dajanje F-III v skladu s tem izumom določimo glede na posamezne okoliščine pri vsaki uporabi posebej. Te okoliščine vključujejo način dajanja zdravila, dotedanje zdravstveno stanje in potek bolezni pri pacientu, patološko stanje oziroma simptom, ki ga zdravimo, resnost patološkega stanja oziroma simptoma, ki ga zdravimo ter starost in spol pacienta.

Na splošno je minimalna dnevna doza F-III okrog 1, 5, 10, 15 ali 20 mg. Tipična maksimalna učinkovita doza pa je okrog 800, 100, 60, 50 ali 40 mg. Najbolj običajne so doze med 15 in 60 mg. Natančno dozo pa je mogoče določiti s titriranjem doze, kar je ustaljena praksa v medicinski stroki. To naredimo tako, da najprej dajemo majhno dozo spojine, nato pa jo postopoma povečujemo, dokler ne dosežemo željenega terapevtskega učinka.

Ne glede na to, da bomo morda morali pri pacientih titrirati dozo z ozirom na različne vrste kombinirane terapije, ki smo jih opisali zgoraj, pa tukaj podajamo tipične doze za aktivne snovi, ki jih v kombinacijah dajamo poleg F-III: etinil estrogen (0,01 - 0,03 mg/dan); mestranol (0,05 -0,15 mg/dan); konjugirani estrogeni hormoni (npr. Premarin®, Wyeth-Ayerst; 0,3-2,5

-33 mg/dan); medroksiprogesteron (2,5 - 10 mg/dan); noretilnodrel (1,0 - 10,0 mg/dan), nonetindron (0,5 - 2,0 mg/dan); aminoglutemid (250 - 1250 mg/dan, po možnosti 250 mg 4-krat dnevno); anastrazol (1-5 mg/dan, po možnosti 1 mg enkrat dnevno); letrozol (2,5 - 10 mg/dan, po možnosti 2,5 mg enkrat dnevno); formestan (250 - 1250 mg na teden, po možnosti 250 mg dvakrat tedensko); eksemestan (25 - 100 mg/dan, po možnosti 25 mg enkrat dnevno); goserlin (3-15 mg/tri mesece, po možnosti 3,6 - 7,2 mg enkrat vsake tri mesece); in levprolid (3-15 mg/mesec, po možnosti 3,75 - 7,5 mg enkrat vsak mesec).

Načini dajanja zdravila

F-III lahko dajemo na različne načine, ki vključujejo oralno, rektalno, transdermalno, subkutano, intravensko, intramuskulamo in intranazalno dajanje. Izbrana metoda dajanja vsakega na estrogenu in progestinu temelječega zdravila naj bo v skladu s tem, kar je znano v medicinski stroki. Na splošno dajemo F-III samostojno ali v kombinaciji z estrogenom, progestinom ali inhibitorjem AChE v ustreznem pripravku.

Farmacevtske pripravke, ki so predmet tega izuma, lahko dajemo ljudem in drugim sesalcem (npr. psom, mačkam, konjem, prašičem in podobno) oralno, rektalno, intravaginalno, parenteralno, topično, bukalno ali sublingvalno ter nazalno. Izraz “parenteralno dajanje” se tukaj nanaša na tiste načine dajanja, ki vključujejo intravensko, intramuskulamo, intraperitonealno, intrasternalno, subkutano ali intraartikulamo injiciranje ali infuzijo.

Režim in dolžina dajanja zdravila

Pri veliki večini postopkov, ki so predmet tega izuma, dajemo F-III kontinuirno, od 1- do

3-krat dnevno, ali pa tako pogosto kot je potrebno, da dosežemo za pacienta učinkovito količino

F-III. Ciklična terapija je lahko posebej koristna pri zdravljenju endometrioze ali pa jo lahko uporabimo akutno med napadi bolezni, ki so boleči. V primeru restenoze lahko terapijo omejimo na krajša obdobja (1-6 mesecev), ki sledijo drugačni medicinski obravnavi, npr. angioplastiki.

Claims (19)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Hidratirana kristalna oblika 6 - hidroksi - 3 - (4 - [2 - (piperidin-1 -il) etoksi] fenoksi) - 2 - (4 - metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida (F-III), označena s tem, da kaže rontgenski difrakcijski vzorec z naslednjimi vrhovi 4,6 ± 0,2; 7,8 ± 0,2; 9,3 ± 0,2; 14,0 ± 0,2; 17,6 ± 0,2; 20,8 ± 0,2; in 24,3 ± 0,2 pri 20 (dobljeno pri 25 ± 2 °C, pri 35 ± 10 % relativni vlagi in s pomočjo bakrovega izvora sevanja).
2. 2. Farmacevtski pripravek, označen s tem, da vsebuje kristalinično obliko spojine po zahtevku 1, enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov, estrogen (opcijsko), progestin (opcijsko), inhibitor aromataze (opcijsko), LHRH analog (opcijsko) in (opcijsko) inhibitor acetilholinesteraze (AChE).
3. 3. Pripravek po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje kristalinično obliko spojine po zahtevku 1, enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov in estrogen.
4. 4. Pripravek po zahtevku 3, označen s tem, daje estrogen v njem Premarin®.
5. 5. Pripravek po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje kristalinično obliko spojine po zahtevku 1, enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov in progestin.
6. 6. Pripravek po zahtevku 5, označen s tem, da je progestin v njem izbran iz skupine, ki jo sestavljata noretilnodrel in noretindron.
7. 7. Pripravek po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje kristalinično obliko spojine po zahtevku 1, enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov in inhibitor AChE.
8. 8. Pripravek po zahtevku 7, označen s tem, daje inhibitor AChE v njem izbran iz skupine, ki jo sestavljajo fizostigmin (eserin) salicilat, takrin hidroklorid in donepezil hidroklorid.
9. 9. Pripravek po zahtevku 2, označen s tem, da vsebuje kristalinično obliko spojine po zahtevku 1, enega ali več farmacevtskih nosilcev, razredčil ali ekscipiensov, estrogen in progestin.

   -35-
10. 10. Postopek za pripravo spojine po zahtevku 1, označen s tem, da vključuje kristalizacijo 6 hidroksi - 3 - (4 - [2 - (piperidin-1-il) etoksij fenoksi) -2-(4- metoksifenil) benzo [b] tiofen hidroklorida iz zmesi izopropanola in vode.
11. 11. Postopek po zahtevku 10, označen s tem, daje razmerje med vodo in izopropanolom med 1 in 9 proti 1 (v: v).
12. 12. Postopek po zahtevku 11, označen s tem, daje razmerje med 2,5 in 5,6 proti 1.
13. 13. Postopek po zahtevku 11, označen s tem, daje razmerje med 3 in 5,6 proti 1.
14. 14. Spojina po zahtevku 1, označena s tem, da preprečuje ali zavira patološka stanja, ki so vključena v skupino, ki jo sestavljajo: maternična fibroza, endometrioza, proliferacija celic gladkega mišičja aorte, restenoza, rak na prsih, rak maternice, rak na prostati, benigna hiperplazija prostate, izguba kostne mase, osteoporoza, srčnožilna bolezen, hiperlipidemija, motnje v centralnem živčnem sistemu in Alzheimerjeva bolezen.
15. 15. Spojina po zahtevku 14, označena s tem, da preprečuje ali zavira raka na prsih.
16. 16. Spojina po zahtevku 15, označena s tem, da je zaviranje in preprečevanje raka na prsih profilaktične narave.
17. 17. Spojina po zahtevku 14, označena s tem, da preprečuje ali zavira raka na jajčnikih.
18. 18. Spojina po zahtevku 14, označena s tem, da preprečuje ali zavira raka endometrija.
19. 19. Spojina po zahtevku 1, označena s tem, da zvišuje aktivnost holinacetiltransferaze (ChAT) pri sesalcih.