DE69714504T2

DE69714504T2 - Benzothiopene, diese enthaltende Zubereitungen und Verfahren

Info

Publication number: DE69714504T2
Application number: DE69714504T
Authority: DE
Inventors: Michael Paul Clay; Charles Alan Frolik; Charles David Jones; Terry Donald Lindstrom
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-05-09
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 2003-04-03
Anticipated expiration: 2017-05-07
Also published as: EP0806420A1; ES2180893T3; AR007012A1; US5843984A; AU2932197A; WO1997041851A1; DE69714504D1; JP2000511515A; EP0806420B1; CA2253858A1

Description

Die Erfindung betrifft die Gebiete der pharmazeutischen und organischen Chemie und liefert Benzothiophenverbindungen, die zur Behandlung von verschiedenen medizinischen Indikationen brauchbar sind, die assoziiert sind mit dem postmenopausalen Syndrom, fibroider Uteruserkrankung, Endometriose und Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen.
"Postmenopausales Syndrom" ist ein zur Beschreibung der verschiedenen pathologischen Zustände verwendeter Ausdruck, die häufig Frauen betreffen, die in die als Menopause bekannte physiologische Umwandlung eingetreten sind oder diese vollzogen haben. Obwohl mehrere pathologische Zustände von der Verwendung dieses Ausdrucks umfaßt werden, sind drei Haupteffekte des postmenopausalen Syndroms der Anlaß für die anhaltenden medizinischen Hauptsorgen: Osteoporose, kardiovaskuläre Effekte, wie Hyperlipidämie, und Östrogen-abhängiger Krebs, insbesondere Brust- und Uteruskrebs.
Osteoporose beschreibt eine Krankheitsgruppe, die aus unterschiedlichen Ätiologien hervorgeht, die aber durch den Nettoverlust an Knochenmasse pro Volumeneinheit gekennzeichnet ist. Die Konsequenz dieses Verlusts an Knochenmasse und die daraus resultierende Knochenfraktur ist das Versagen des Skeletts, eine angemessene Strukturunterstützung für den Körper bereitzustellen. Einer der bekanntesten Typen der Osteoporose ist der, der mit der Menopause zusammenhängt. Die meisten Frauen verlieren etwa 20% bis etwa 60% der Knochenmasse im Trabekelkompartiment des Knochens innerhalb von 3 bis 6 Jahren nach dem Einstellen der Menstruation. Dieser rapide Verlust geht im allgemeinen mit einer Erhöhung der Knochenresorption und Bildung einher. Jedoch ist der resorptive Zyklus dominanter und das Ergebnis ist ein Nettoverlust an Knochenmasse. Osteoporose ist eine bekannte und ernste Erkrankung bei postmenopausalen Frauen.
Es gibt alleine in den Vereinigten Staaten geschätzte 25 Millionen Frauen, die von dieser Erkrankung betroffen sind. Die Folgen von Osteoporose sind für die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund ihrer chronischen Erscheinung und dem Bedarf für eine ausgiebige und langanhaltende Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt, obwohl Osteroporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand angesehen wird, daß die Sterblichkeitsrate von 20% bis 30% mit Hüftfrakturen bei älteren Frauen zusammenhängt. Ein großer Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler Osteoporose zusammenhängen.
Das anfälligste Gewebe im Knochen für die Wirkungen der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen. Dieses Gewebe wird oft als spongiöser oder schwammiger Knochen bezeichnet und konzentriert sich insbesondere an den Enden des Knochens (nahe den Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe ist durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander verbunden sind, wie auch durch das festere und dichtere cortikale Gewebe, das die äußere Oberfläche und den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses untereinander verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale Struktur und ist für die biomechanische Stärke der Gesamtstruktur entscheidend. Bei der postmenopausalen Osteoporose ist es primär die Nettoresorption und der Vertust der Trabekel, die zum Versagen und zur Fraktur des Knochens führen. In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen ist es nicht überraschend, daß die meisten herkömmlichen Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von der Trabekelunterstützung abhängen, beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichttragenden Knochen, wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüftfraktur, Schenkelhalsfrakturen und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen Osteoporose.
Derzeit ist die hauptsächliche Methode zur Behandlung der postmenopausalen Osteoporose die Östrogenersatztherapie. Obwohl die Therapie allgemein erfolgreich ist, ist die Patientenakzeptanz der Therapie gering, da die Östrogenbehandlung häufig unerwünschte Nebenwirkungen hervorruft. Kürzlich wurde eine neue Behandlung für die postmenopausale Osteoporose entwickelt, nämlich die Behandlung mit Bisphosphonaten. Obwohl diese Therapie wirksam ist, hat sie den Nachteil, daß sie nur den Osteoporoseaspekt des postmenopausalen Syndroms behandelt. Zusätzlich haben viele Berichte über die Verwendung von Bisphosphonaten unerwünschte gastrointestinale Nebenwirkungen hervorgebracht.
Vor der Menopause weisen die meisten Frauen eine geringere Häufigkeit für kardiovaskuläre Erkrankungen auf, als gleichaltrige Männer. Nach der Menopause erhöht sich jedoch langsam die Rate der kardiovaskulären Erkrankung bei Frauen, um die beim Mann beobachtete zu erreichen. Dieser Schutzverlust wurde dem Verlust an Östrogen und insbesondere dem Verlust der Fähigkeit des Östrogens zugeschrieben, die Serumlipidspiegel zu regulieren. Die Art der Fähigkeit des Östrogens, die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht gut verstanden, aber Erkenntnisse deuten darauf hin, daß Östrogen die Rezeptoren für Lipid niedriger Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin zu entfernen. Zusätzlich scheint Östrogen eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche Effekte auf die kardiovaskuläre Gesundheit zu haben.
Es wurde in der Literatur berichtet, daß postmenopausale Frauen, die sich einer Östrogenersatzrtherapie unterziehen, ein Zurückkehren der Serumlipidkonzentrationen auf die des prämenopausalen Zustands erleben. Daher scheint Östrogen eine sinnvolle Behandlung für diesen Zustand zu sein. Jedoch sind die Nebenwirkungen der Östrogenersatztherapie nicht für jede Frau akzeptabel, was die Verwendung dieser Therapie limitiert. Eine ideale Therapie für diesen Zustand wäre ein Mittel, das die Serumlipidspiegel reguliert, wie dies Östrogen tut, dem aber die Nebenwirkungen und Risiken fehlen, die mit einer Östrogentherapie zusammenhängen.
Der dritte pathologische Haupteffekt, der mit dem postmenopausalen Syndrom zusammenhängt, ist östrogenabhängiger Brustkrebs und in einem geringeren Ausmaß östrogenabhängige Krebsarten anderer Organe, insbesondere des Uterus. Obwohl solche Neoplasmen nicht nur auf eine postmenopausale Frau beschränkt sind und die Verwendung der vorliegenden Verbindungen hiermit nicht beschränkt ist, sind sie bei der älteren, postmenopausalen Population häufiger. Die derzeitige Chemotherapie dieser Krebsarten basiert stark auf der Verwendung von Antiöstrogenverbindungen, wie beispielsweise Tamoxifen. Obwohl solche gemischten Agonist-Antagonisten nützliche Wirkungen bei der Behandlung dieser Krebsarten haben und die östrogenen Nebenwirkungen in akut lebensbedrohenden Situationen tolerierbar sind, sind sie nicht ideal. Beispielsweise können diese Mittel stimulierende Wirkungen auf bestimmte Krebszellpopulationen im Uterus aufgrund ihrer östrogenen Wirkungen (Agonist) aufweisen und können daher in manchen Fällen kontraproduktiv sein. Eine bessere Therapie für die Behandlung dieser Krebsarten wäre ein Mittel, das eine Antiöstrogenverbindung ist, die vernachlässigbare oder keine Östrogenagonisteneigenschaften auf Reproduktionsgewebe aufweist.
Als Reaktion auf den klaren Bedarf für neue pharmazeutische Mittel, die zur Linderung der Symptome unter anderem des postmenopausalen Syndroms fähig sind, liefert die vorliegende Erfindung Benzothiophenverbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon und Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen zur Behandlung des postmenopausalen Syndroms und anderer mit Östrogen zusammenhängender pathologischer Zustände, wie die später erwähnten.
Die Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung) ist ein altes und allgegenwärtiges klinisches Problem, das unter einer Vielzahl an Namen bekannt ist, einschließlich fibroide Uteruserkrankung, Uterushypertrophie, Uterusleiomyomata, myometrische Hypertrophie, Fibrosis uteri und fibrotische Metritis. Im wesentlichen ist die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine störende Ablagerung von fibroidem Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet.
Dieser Zustand ist eine Ursache für Dysmenorrhoe und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache dieses Zustands ist wenig verstanden, aber Erkenntnisse legen nahe, daß eine gestörte Reaktion des fibroiden Gewebes auf Östrogen vorliegt. Ein solcher Zustand wurde in Kaninchen durch die tägliche Verabreichung von Östrogen für 3 Monate hervorgerufen. In Meerschweinchen wurde der Zustand durch eine tägliche Verabreichung von Östrogen für vier Monate hervorgerufen. Ferner verursacht Östrogen in Ratten eine ähnliche Hypertrophie.
Die häufigste herkömmliche Behandlung der Uterusfibrose umfaßt operative Verfahren die sowohl teuer als auch manchmal ein Anlaß für Komplikationen sind, wie die Bildung von abdominalen Adhäsionen und Infektionen. Bei manchen Patienten ist die anfängliche Operation nur eine vorübergehende Behandlung und die Fibroide wachsen wieder heran. In diesen Fällen wird eine Hysterektomie durchgeführt, die die Fibroide effektiv beendet aber auch das Reproduktionsleben des Patienten. Es werden auch Antagonisten für Gonadotropin-freisetzendes Hormon verabreicht, wobei aber ihre Verwendung durch die Tatsache beschränkt wird, daß sie zu Osteoporose führen können. Daher besteht ein Bedarf für neue Verfahren zur Behandlung der Uterusfibrose und die erfindungsgemäßen Verfahren befriedigen diesen Bedarf.
Endometriose ist ein Zustand schwerer Dysmenorrhoe, der von schweren Schmerzen, Blutung in die endometrialen Ansammlungen oder den Peritonealraum begleitet wird und oft zur Unfruchtbarkeit führt. Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopes endometriales Wachstum zu sein, das gegenüber einer normalen hormonalen Kontrolle gestört reagiert und in gestörten Geweben vorkommt. Aufgrund der gestörten Orte für endometriales Wachstum scheint das Gewebe lokale entzündungsähnliche Reaktionen hervorzurufen, die eine Makrophageninfiltration und eine Kaskade von Ergebnisse verursachen, die zum Hervorrufen der schmerzhaften Reaktion führen. Die exakte Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht gut verstanden und ihre Behandlung durch eine hormonale Therapie ist unterschiedlich, wenig definiert und durch mehrere unerwünschte und vielleicht gefährliche Nebenwirkungen gekennzeichnet.
Eine der Behandlungen für diese Erkrankung ist die Verwendung von gering dosiertem Östrogen, um das endometriale Wachstum über einen negativ zurückwirkenden Effekt auf die zentrale Gonadotropinfreisetzung und die anschließende Bildung von Östrogen im Ovar zu unterdrücken, wobei es manchmal notwendig ist, kontinuierlich Östrogen zu verwenden, um die Symptome zu kontrollieren. Diese Verwendung voll Östrogen kann oft zu unerwünschten Nebenwirkungen und sogar zum Risiko für Endometriumkrebs führen.
Eine weitere Behandlung besteht aus der kontinuierlichen Verabreichung von Progestinen, die Amenorrhoe induzieren und durch die Unterdrückung der ovarialen Östrogenbildung eine Regression des endometrialen Wachstums verursachen können. Die Verwendung einer chronischen Progestintherapie wird oft von unerwünschten ZNS Nebenwirkungen der Progestine begleitet und führt oft zur Unfruchtbarkeit aufgrund der Unterdrückung der Ovarfunktion.
Eine dritte Behandlung besteht aus der Verabreichung von schwachen Androgenen, die bei der Kontrolle der Endometriose wirksam sind, jedoch rufen sie schwere maskulinisierende Wirkungen hervor. Einige der Behandlungen für Endometriose waren bei anhaltender Therapie auch in der Verursachung eines geringen Grades an Knochenverlust verwickelt. Daher sind neue Methoden zur Behandlung von Endometriose erwünscht.
Die Proliferation der glatten Muskelzellen in der Aorta spielt eine wichtige Rolle bei Erkrankungen, wie Atherosklerose und Restenose. Es wurde gezeigt, daß die vaskuläre Restenose nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTC A) eine Gewebereaktion ist, die durch eine frühe und eine späte Phase charakterisiert ist. Die frühe Phase, die Stunden bis Tage nach der PTCA auftritt, beruht auf einer Thrombose mit einigen Vasospasmen, während die späte Phase von einer exzessiven Proliferation und Migration der glatten Muskelzellen der Aorta dominiert wird. Bei dieser Erkrankung trägt die erhöhte Zellmotilität und Kolonialisierung durch solche glatten Muskelzellen und Makrophagen signifikant zur Pathogenese dieser Erkrankung bei. Die exzessive Proliferation und Migration der vaskulären glatten Muskelzellen der Aorta kann der primäre Mechanismus für den erneuten Verschluß der Koronararterien nach einer PTCA, Atherektomie, Laserangioplastie und einer arteriellen Bypasstransplantationsoperation sein. Siehe "Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis after Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty", Austin et al., Journal of the American College of Cardiology 8: 369-375 (Aug. 1985).
Die vaskuläre Restenose bleibt eine langanhaltende Hauptkomplikation nach einem operativen Eingriff in blockierte Arterien durch eine perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA), Atherektomie, Laserangioplastie und arterielle Bypasstransplantationsoperation. Bei etwa 35% der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, tritt innerhalb von drei bis sechs Monaten nach dem Verfahren ein Wiederverschluß auf. Die derzeitigen Strategien zur Behandlung der vaskulären Restenose umfassen einen mechanischen Eingriff durch Vorrichtungen, wie Stents oder pharmakologische Therapien, einschließlich Heparin, niedermolekulares Heparin, Kumarin, Aspirin, Fischöl, Calciumantagonist, Steroide und Prostacyclin. Diese Strategien konnten die Wiederverschlußrate nicht verringern und waren für die Behandlung und Verhinderung der vaskulären Restenose ineffektiv. Siehe "Prevention of Restenosis after Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty: The Search for a 'Magic Bullet'", Hermans et al., American Heart Journal 122: 171-187 (Juli 1991).
Bei der Pathogenese der Restenose tritt die exzessive Zellproliferation und -migration als Folge von Wachstumsfaktoren auf, die von Zellbestandteilen im Blut und der beschädigten arteriellen Gefäßwand gebildet werden. wobei die Faktoren die Proliferation der glatten Muskelzellen bei der vaskulären Restenose vermitteln.
Mittel, die die Proliferation und/oder Migration von glatten Muskelzellen der Aorta hemmen, sind bei der Behandlung und Verhinderung der Restenose brauchbar. Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung der Verbindungen als Inhibitoren der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen und daher als Inhibitoren der Restenose.
Die EP 0 617 030 A betrifft Sulfonat- und Carbamatderivate von 3-Aroylbenzo[b]thiophenen, ihre Verwendung zur Hemmung des Knochenverlusts, der Verringerung der Serumcholesterinspiegel und der therapeutischen Behandlung von hormonabhänigem Sängerbrustkrebs und Uteruscarzinomen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel I
worin
R¹ für Wasserstoff Hydroxy, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, -OCOO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCOAr, worin Ar für Phenyl oder wahlweise substituiertes Phenyl steht, -SO&sub2;-(geradkettiges C&sub4;-C&sub6; Alkyl) oder -OSO&sub3;H steht,
R² für R¹, Cl oder F steht, mit der Maßgabe, daß zumindest eines von R¹ oder R² für -OSO&sub3;H steht.
R³ für 1-Piperidinyl, 1-Pyrrolidinyl, Methyl-1-pyrrolidinyl, Dimethyl-1-pyrrolidino, 4-Morpholino, Dimethylamino, Diethylamino, Diisopropylamino oder 1-Hexamethylenimino steht und
n für 2 oder 3 steht,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Verbindungen der Formel I enthalten, wahlweise Östrogen oder Progestin enthalten und die Verwendung solcher Verbindungen alleine oder in Kombination mit Östrogen oder Progestin zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms, insbesondere Osteoporose, kardiovaskuläre pathologische Zustände und östrogenabhängiger Krebs. Wie hierin verwendet umfaßt der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen mit östrogener Aktivität, wie beispielsweise 17β- Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen (Premarin®), Pferdeöstrogen, 17β-Ethinylöstradiol, und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit progestiner Aktivität, wie beispielsweise Progesteron, Norethylnodrel, Norgestrel, Megestrolacetat, Norethindron und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch zur Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung und Endometriose bei Frauen und der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen, insbesondere der Restenose, beim Menschen brauchbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erkenntnis, daß eine ausgewählte Gruppe an 2-Aryl-3-arylbenzo[b]thiophenen, das heißt die Verbindungen der Formel I, zur Behandlung oder Prävention der Symptome und Pathologien von postmenopausalen Syndrom. Osteoporose und Hyperlipidämie, östrogenabhängigen Krebsarten. Uterusfibrose, Endometriose oder Restenose bei Säugern, einschließlich dem Menschen, brauchbar sind.
Der Ausdruck "hemmen" ist so definiert, daß er die allgemein anerkannte Bedeutung umfaßt, die die Verhinderung, Vermeidung. Unterdrückung und Verlangsamung, das Anhalten oder die Umkehr des Fortschreitens, der Schwere oder eines entstehenden Symptoms umfaßt. Daher beinhaltet das vorliegende Verfahren die medizinisch therapeutische und/oder prophylaktische Verabreichung, wie dies geeignet ist.
In der obigen Formel stellt der Ausdruck "C&sub1;-C&sub6; Alkyl" für eine gerade oder verzweigte Alkylkette mit I bis 6 Kohlenstoffatomen. Typische C&sub1;-C&sub6; Alkylgruppen sind unter anderem Methyl, Ethyl, n-Propyl und n-Butyl. Der Ausdruck "C&sub1;-C&sub4; Alkoxy" steht für Gruppen, wie Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy und n-Butoxy.
Wahlweise substituiertes Phenyl umfaßt Phenyl und Phenyl, das einmal oder zweimal substituiert ist mit C&sub1;-C&sub6; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Hydroxy, Nitro, Chlor, Fluor oder Trichlormethyl oder Trifluormethyl.
Der Ausdruck "Solvat" steht für ein Aggregat, das ein oder mehrere Moleküle des Soluts, wie einer Verbindung der Formel I, und ein oder mehrere Lösemittelmoleküle umfaßt.
Das Ausgangsmaterial zur Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung der Formel II
worin
R1a für Wasserstoff, Hydroxy oder C&sub1;-C&sub4; Alkoxy steht.
R2a für Wasserstoff, Hydroxy, -Cl, -F oder C&sub1;-C&sub4; Alkoxy steht, mit der Maßgabe, daß zumindest eines von R1a und
R2a für Hydroxy steht, und
R³ und n ihre vorherigen Bedeutungen haben.
Die Verbindungen der Formel II sind in der Tecknik gut bekannt und werden im wesentlichen hergestellt, wie dies in US 4 133 814 A. US 4 418 068 A und US 4 380 635 A beschrieben ist. Siehe auch C. D. Jones et al., J. Med. Chem. 27: 107-1066 (1984).
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird im allgemeinen eine monophenolische Verbindung der Formel II unter Bildung eines Hydrogensulfatderivats der Formel Ia sulfatiert. Die Monosulfatprodukt kann als solches gereinigt werden, wobei man die neutrale zwitterionische Form erhält. Es kann auch in eine Vielzahl an pharmazeutisch annehmbaren Salzen umgewandelt werden,
worin
R1b für Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy oder -OSO&sub3;H steht,
R2b für Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, -Cl, -F oder -OSO&sub3;H steht, mit der Maßgabe, daß R1b oder R2b für -OSO&sub3;H stehen muß, und
R³ und n ihre vorherigen Bedeutungen haben.
Andere Verbindungen (Formel Ib) der vorliegenden Erfindung können aus den Verbindungen der Formel II hergestellt werden, worin R1a und R2a beide für Hydroxyle stehen. Diese Verbindungen können mittels eines einzigen Äquivalents Sulfatierungsreagenz und eines einzigen Äquivalents einer starken Base zur Ionisierung eines der Phenole monosulfatiert werden, was zu einem Isomerengemisch führt. Das entstehende Gemisch an Derivaten (Monosulfat-Monohydroxy) kann direkt durch Techniken isoliert werden, wie Fällung oder Umkristallisation, die in der Technik bekannt sind. Alternativ dazu können die Derivate durch Normalphasen- oder Umkehrphasenchromatographie gereinigt werden. Die so erhaltenen Monosulfat-Monohydroxyderivate können weiter durch die geeignete Acylierung oder Sulfonierung des phenolischen Hydroxyls durch in der Technikbekannte Verfahren in andere Verbindungen der Formel Ib umgewandelt werden. Solche Verfahren kann man in den oben angegebenen Literaturangaben oder in US 5 482 949 A finden. Durch solche chemischen Transformationen können die Verbindungen der Formel Ia und Ib erhalten werden, die zusammen die Verbindungen der Formel I darstellen.
worin
R1c für Hydroxy, -OCOO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCOAr, worin Ar für Phenyl oder wahlweise substituiertes Phenyl steht, -OSO&sub2;(C&sub4;-C&sub6; geradkettiges Alkyl), oder -OSO&sub3;H steht.
R2c für R1c steht, mit der Maßgabe, daß zumindest eines von R1c oder R2c für -OSO&sub3;H steht.
R³ für 1-Piperidinyl, 1-Pyrrolidinyl, Methyl-1-pyrrolidinyl, Dimethyl-1-pyrrolidino, 4-Morpholino, Dimethylamino, Diethylamino, Diisopropylamino oder 1-Hexamethylenimino steht, und
n für 2 oder 3 steht.
Im Sulfatierungsschritt des vorliegenden Verfahrens wird eine phenolische Verbindung der Formel II in das Mono- (oder Di-)-sulfatderivat durch ein Einschrittverfahren umgewandelt, wie dies im wesentlichen von E. E. Gilbert et al Chemical Rev. 62: 549-589 (1962) beschrieben ist. Im wesentlichen wird ein phenolisches Ausgangsmaterial der Formel II mit einem Sulfatierungsreagenz, wobei Schwefeltrioxid (SO&sub3;), SO&sub3;-Pyridin, SO&sub3;- Trimethylamin, SO&sub3;-Triethylamin, SO&sub3;-Dimethylanilin, SO&sub3;-Dioxan, SO&sub3;-Thioxan, SO&sub3;-2-Methylpyridin, SO&sub3;- Chinolin, SO&sub3;-Dimethylformamid, SO&sub3;-Trimethylamin und dergleichen besonders bevorzugt sind, in einem geeigneten inerten Lösemittel in Gegenwart eines Säurefängers, wie einer Alkalimetallbase oder einem tertiären Amin in Kontakt gebracht.
Geeignete inerte Lösemittel umfassen beispielsweise Alkohole, Ether, polare Lösemittel, wie DMF oder DMSO und insbesondere Wasser.
Eine bevorzugte Alkalilösung für die Sulfatierungsreaktion enthält Natrium- oder Kaliumhydroxid in einem inerten Lösemittel, wie Wasser. In dieser Lösung kommen die Hydroxygruppen des Phenolausgangsmaterials der Formel II als Phenoxidion vor, das leicht an der Sulfatierungsreaktion durch die Umsetzung mit Schwefeltrioxid oder einem Derivat hiervon teilnimmnt.
Wenn sie unter den bevorzugten Reaktionsbedingungen gefahren wird, dauert die Sulfatierungsreaktion etwa 12 bis etwa 72 Stunden, bis sie vollständig ist.
Die folgenden Beispiele werden gezeigt, um die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter zu erläutern.
Die NMR Daten für die folgenden Beispiele werden auf einem GE GE 300 MHz NMR Gerät erzeugt und es wird wasserfreies d-6 DMSO als Lösemittel verwendet, falls nichts anderes angegeben ist. Beispiel 1A [2-[4-Hydroxyphenyl)-6-hydrogensulfoyloxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanon
[6-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)benzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanonhydrochloridsalz (Raloxifenhydrochlorid, 2,02 g, 4 mmol) wird 16 ml 16 N NaOH unter Bildung einer dunkelrotbraunen Lösung gemischt, zu der SO&sub3;-Me&sub3;N (0,66 g, 4 mmol) bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird bei Umgebungstemperatur für 4 Tage gerührt, wonach eine Dünnschichtchromatographie (Silicagel, 8 : 1 : 1 V/V CHCl&sub3; : MeOH : Et&sub3;N) anzeigt, daß sich ein Gemisch aus Ausgangsmaterial (Rf 0,7), dem 4'- Monosulfat (Beispiel 1B) (Rf 0,5), dem 6-Monosulfat (Beispiel 1A) (Rf 0.4) und dem 4',6'-Disulfat (Beispiel 2) gebildet hat. Eine chromatographische Analyse durch HPLC (Novapak C-18 Säule, 3,9 mm · 150 mm mit einer UV Detektion bei 280 mm und einer Flußrate von 1 ml/min mit isokratischem 20 : 80 Acetonitril : 0,5% wäßrigem NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; Puffer) zehn an, daß die gebildeten Verbindungen in einem prozentualen Flächenverhältnis von jeweils 1,0 : 0,5 : 1,2 : 0,2 gebildet wurden. Ein Viertel des Reaktionsgemisches, das eine dunkelgelbbraune Lösung ist, wird direkt auf zwei RP18 Waters Kartuschen für eine Reinigung auf dem LC 2000 Gerät aufgetragen. Die Kartuschen werden mit 10 : 90 Acetonitril : 0,5% wäßrigem NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; Puffer voräquilibriert und 5 ml entionisiertes Wasser wird direkt vor und direkt nach der Probenauftragung aufgetragen, um das Ausfallen der Probe zu minimieren. Die Säule wird dann mit einer Geschwindigkeit von 150 ml pro Minute mit einem Gradientensystem eluiert, das anfangs aus 10 : 90 Acetonitril : Ammoniumdihydrogenphosphatpuffer (siehe oben) besteht und linear auf 40 : 60 Acetonitril : Puffer ansteigt. Die Elution wird dann für weitere 10 Minuten bei einem 40 : 60 Gemisch fortgesetzt. Es werden Fraktionen von etwa 200 ml gesammelt und durch HPLC analysiert und die geeigneten Fraktionen werden kombiniert. Der Rest des Reaktionsgemisches wird ansatzweise auf eine ähnliche Art gereinigt, obwohl eine beträchtliche Überlappung der den zwei Monosulfaten entsprechenden Peaks besteht, wobei der mit dem 6-Monosulfat angereicherte Eluent vom dem mit dem 4'-Monosulfat angereicherten abgetrennt wird. Die angereicherten Fraktionen jedes Isomers werden einzeln bis fast zur Trockne konzentriert und der Rückstand wird mit Wasser gewaschen, um die anorganischen Salze zu entfernen, und die schlecht löslichen Monosulfate werden durch Filtration gewonnen. Bei der letzten Reinigung wird jedes Monosulfat in wäßriger NaOH (pH 11) rückgelöst und im wesentlichen wie oben beschrieben erneut chromatographiert. Nach der Vereinigung und der Konzentration der geeigneten Fraktionen wird das Fällverfahren unter Bildung von 142 mg (7%) an [2-[4-Hydroxyphenyl)-6-hydrogensulfoyloxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanon als nicht ganz weißer, leicht pinkfarbener, amorpher Feststoff wiederholt, der gemäß HPLC Test zu > 97% rein ist.
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,79 (s, 1H), 9,17 (bs, 1H), 7,84 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,30 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,24 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,19 (dd, J = 2,2 Hz, J = 8,7 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,70 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,38 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 1,48-3,33 (m, 4H), 2,97 (m, 2H), 1,80 (m, 2H), 1,65 (m, 3H), 1,37 (m, 1H), MS (FAB + Ionenmodus) m/e 554 (MH&spplus;), Analyse berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub7;NO&sub7;S&sub2;: C 60,74, H 4,92, N 2,53. Gefunden: C 60,03, H 5,02, N 2,14. Beispiel 1B [2-[4-Hydrogensulfoyloxyphenyl)-6-hydroxybenzo[b]thien-3-yl][4[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanon
Aus Beispiel 1A werden durch ein ähnliches Endreinigungsverfahren, eine erneute Chromatographie, eine Konzentrierung und Fällung 196 mg (9%) der Titelverbindung als cremefarbener, amorpher Feststoff mit einer Reinheit > 98% gemäß HPLC Analyse erhalten.
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,84 (s, 1H), 9,16 (bs, 1H), 7,70 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,08 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,90 (dd, J = 2,2 Hz, J = 8,7 Hz, 1H), 4,35 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,48 (m, 4H), 2,98 (m, 2H), 1,80 (m, 5H), 1,66 (m, 1H), 1,38 (m, 1H), MS (FAB + Ionenmodus) m/e 554 (MH&spplus;), Analyse berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub7;NO&sub7;S&sub2;: C 60,74, H 4,92, N 2,53, Gefunden: C 60,78, H 5,11, N 2,33. Beispiel 2 [2-[4-Hydrogensulfoyloxyphenyl)-6-hydrogensulfoyloxybenzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1- piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanon als Triethylaminsalz
[6-Hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)benzo[b]thien-3-yl][4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]methanonhydrochloridsalz (Raloxifenhydrochlorid, 1,02 g, 2,0 mmol) wird mit 8,0 1 N NaOH und Wasser (30 ml) vereinigt und das Gemisch wird unter einer Stickstoffatmosphäre in einem 60ºC Ölbad erhitzt, bis man eine dunkelgelbbraune Lösung erhält. Ohne die Lösung zu kühlen wird SO&sub3;Me&sub3;N (1,11 g, 8,0 mmol) zugegeben und das Erhitzen wird im 60ºC Bad für 72 Stunden fortgesetzt, wonach das meiste der dunklen Farbe verschwunden ist. Ein HPLC Test mittels 30 : 70 Acetonitril : 0,5% wäßrigem NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; Puffer zeigt eine Bildung des gewünschten Disulfatderivats von > 96 %. Weniger als 2% des Ausgangsmaterials eines der Monosulfate verbleibt am Ende der Reaktion. Das blaßgelbe Reaktionsgemisch wird mit 3 N HCl auf pH 8,4 eingestellt, filtriert und direkt auf zwei RPC18 Kartuschen (Waters LC2000 Gerät) aufgetragen, wobei die Kartuschen mit 10 90 Acetonitril: 0,5% wäßrigem NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; Puffer äquilibriert wurden. Die Elution mit einer Flußrate von 125 ml/min verwendet ein Gradientensystem, das anfänglich aus 10 : 90 Acetontril : 0,5% wäßrigem NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; Puffer besteht und dann linear über 40 Minuten auf ein 30 : 70 Acetonitril : Puffergemisch und schließlich über 5 Minuten auf ein 50 : 50 Acetonitril : Puffergemisch wechselt. Fraktionen mit jeweils etwa 200 ml werden gesammelt und die, die nur das 4',6-Disulfat enthalten sollten, werden vereinigt und durch HPLC getestet, die eine Reinheit von > 98% anzeigt. Die kombinierten Fraktionen werden unter verringertem Druck und einer Temperatur eingedampft, die unter 30ºC liegt. Um das meiste Acetonitril zu verdampfen. Das Konzentrat, das etwa 450 ml umfaßt, wird unmittelbar auf zwei Waters C18 Kartuschen aufgetragen, die mit 10 : 90 Acetonitril : Wasser voräquilibriert wurden. Eine verlängerte Elution der Säule mit 3 l 10 : 90 Acetonitril : Wasser dient zur Entfernung der anorganischen Salze. Dann dient ein lineares Gradientensystem; das anfänglich aus 10 : 90 Acetonitril : Wasser besteht und dann linear über 40 Minuten zu einem 30 : 70 Acetonitril : Wassergemisch und schließlich zu einem 50 : 50 Gemisch derselben Lösemittel über 5 Minuten wechselt, zur Elution des gewünschten Produkts. Die geeigneten Fraktionen (jeweils etwa 200 ml) werden unter Bildung von insgesamt 1,1 l vereinigt, die im HPLC Test eine einzige Komponente enthalten. Ein 300 ml Aliquot der vereinigten Fraktionen wird bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 1 ml Triethylamin und 9 ml Wasser behandelt. Die entstehende klare und farblose Lösung wird auf einem Rotationsverdampfer fast bis zur Trockne eingedampft, wobei die Temperatur unter 45ºC gehalten wird. Der farblose Rückstand wird bei Raumtemperatur unter Hochvakuum unter Bildung eines amorphen Feststoffs mit 295 mg (74% Ausbeute) getrocknet, der gemäß HPLC Analyse eine einzelne Komponente ist.
¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,16 (bs, 1H), 8,82 (bs, 1H), 7,86 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,22 (dd, J = 2,2 Hz, J = 8,7 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,98 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,37 (m, 2H), 3,55-3,32 (m, 4H), 3,18-3,05 (m, 6H), 3,05-2,88 (m, 2H), 1,85-1,57 (m, 5H), 1,50-1,25 (m, 1H), MS (FAB + Ionenmodus) m/e 735,3 (MH&supmin;), es wird keine exakte Elementaranalyse für Kohlenstoff erhalten: Analyse berechnet für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub0;S&sub3;: C 55,57, H 5,76, N, 3,81. Gefunden: C 53,89, H 5,67, N 3,85.
Die folgenden Beispiele erläutern die Verfahren zur Verwendung der Verbindungen der Formel I in Experimentalmodellen oder klinischen Studien.

Testverfahren

Allgemeines Präparationsverfahren

In den Beispielen, die die Verfahren erläutern, wird ein postmenopausales Modell verwendet, worin die Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungen auf die zirkulierenden Lipide bestimmt werden.
Fünfundsiebzig Tage alte weibliche Sprague Dawley Rattert (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig gehalten und haben für eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5%) und Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2ºC ± 1,7ºC mit einer minimalen relativen Luftfeuchte von 40% gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit.

Dosierungsplan zur Gewebeentnahme

Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche Dosierung mit der Testverbindung begonnen, 17α-Ethinylöstradiol oder die Testverbindung werden als Suspension 1% Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2 : 1, V : V) betäubt und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen. Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO&sub2; getötet, der Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Naßgewicht des Uterus wird bestimmt.

Cholesterinanalyse

Die Blutproben können bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das Cholesterin zu Cholest-4- en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert. Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird. Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet. Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation automatisiert.

Uteruseosinophilenperoxidasetest (EPO)

Die Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4ºC aufbewahrt. Die Uteri werden dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin 0,005%. Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01% Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen) in Tris-Puffer, wird die Absorptionszunahme für eine Minute bei 450 um verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen im Uterus ist ein Zeichen für die östrogene Aktivität einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden langen Intervalls wird über den anfänglichen, linearen Teil der Reaksionskurve bestimmt.

Quelle der Verbindung

17α-Ethinylöstradiol erhält man von Sigma Chemical Co.., St. Louis. MO.
Hyperlipidämie:
Die in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Daten zeigen vergleichende Ergebnisse zwischen ovarektomierten Ratten, Ratten, die mit 17α-Ethinylöstradiol (EE&sub2;) behandelt wurden und Ratten, die mit bestimmten erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt wurden. Obwohl EE&sub2; eine Verringerung beim Serumcholesterin verursacht, wenn es oral mit 0,1 mg/kg/Tag verabreicht wird, ruft es auch eine deutliche stimulatorische Wirkung auf den Uterus hervor, so daß das Uterusgewicht von EE&sub2; behandelten Ratten wesentlich höher ist, als das Uterusgewicht von ovarektomierten Tieren. Die Uterusreaktion gegenüber Östrogen ist in der Technik gut bekannt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen verringern nicht nur das Serumcholesterin im Vergleich zu ovarektomierten Tieren, sondern das Uterusgewicht wird nur minimal erhöht. Im Vergleich zu in der Technik bekannten Östrogenverbindungen, ist der Vorteil der Verringerung des Serumcholesterins ohne schädliche Beeinflussung des Uterusgewichts ziemlich selten und erwünscht.
Wie es in den folgenden Daten ausgedrückt ist, wird die Östrogenität auch durch die Evaluierung der schädlichen Reaktion der Eosinophileninfiltration in den Uterus ermittelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen verursachen keine große Erhöhung der Anzahl der Eosinophilen, die in der Stromaschicht von ovarektomierten Rattenuteri beobachtet werden, EE&sub2; verursacht eine wesentliche, erwartete Erhöhung der Eosinophileninfiltration.
Die in der Tabelle 1 gezeigten Daten spiegeln die Reaktion von 5 bis 6 Ratten pro Behandlungsgruppe wider. Tabelle 1
a 17-α-Ethinylöstradiol
b Prozentuale Uterusgewichtszunahme gegenüber den ovarektomierten Kontrollen
c Eosinophilenperoxidase Vmax
d Serumcholesterinabnahme gegenüber den ovarektomierten Kontrollen
* p < 0,05

Osteoporosetestverfahren

Durch Befolgen des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden die Ratten täglich für 35 Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Erstickung mit Kohlendioxid am 36, Tag getötet. Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Reduktion der Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und der Flüssigkeitsinhalt wird vor der Bestimmung des Naßgewichts entleert, um die mit der vollständigen Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz zu bestätigen. Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion auf die Ovarektomie um etwa 75% verringert. Die Uteri werden dann in neutral gepufferte 10% Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische Untersuchung zu ermöglichen.
Die rechten Femuren werden entnommen und digitalisierte Röntgenstrahlen werden an der distalen Metaphyse erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm (NIH image) analysiert. Der proximale Bereich der Tibia aus diesen Tieren wird auch durch quantitative Computertomographie gescannt.
Gemäß den obigen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Verbindungen und Ethinylöstradiol (EE&sub2;) in 20% Hydroxypropyl-β-cyclodextrin oral an Testtiere verabreicht.
Zusammengefaßt verursacht die Ovarektomie der Testtiere eine signifikante Verringerung der Femurdichte verglichen mit intakten, nur mit Träger behandelten Kontrollen. Oral verabreichtes Ethinylöstradiol (EE&sub2;) verhindert diesen Verlust aber das Risiko der Uterusstimulierung mit dieser Behandlung ist immer gegenwärtig.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindern den Knochenverlust auf eine allgemeine, dosisabhängige Art. Demnach sind die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung des postmenopausalen Syndroms insbesondere der Osteoporose brauchbar.

MCF-7 Proliferationstest

MCF-7 Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential Medium, Phenolrot-frei, Sigma. St. Louis. MO) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (V/V). L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM). HEPES {(N-[2-Hydroxyethyl[piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 10 mM}, nicht essentiellen Aminosäuren und Rinderinsulin (1 ug/ml) supplementiert ist (Erhaltungsmedium). Zehn Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Erhaltungsmedium überführt, das mit 10% mit dextranbeschichteter Aktivkohle behandeltem fetalem Rinderserum (DCC-FBS) anstelle von 10% FBS supplementiert ist, um die internen Steroidvorräte abzubauen. Die MCF-7 Zellen werden aus dem Erhaltungskolben mittels Zelldissoziationsmedium entfernt (Ca²&spplus;/Mg²&supmin;) freies HBSS (Phenolrot-frei), das mit 10 mM HEPES und 2 mM EDTA supplementiert ist). Die Zellen werden zweimal mit Testmedium gewaschen und auf 80 000 Zellen/ml eingestellt. Etwa 100 ul (8000 Zellen) werden in Flachbodenmikrotiterkulturplatten (Costar 3596) gegeben und bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; für 48 Stunden inkubiert, um die Zellhaftung und die Äquilibrierung nach dem Transfer zu ermöglichen. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel oder von DMSO als Verdünnungskontrolle in Testmedium hergestellt und 50 ul werden in dreifach angelegten Mikrokulturen gefolgt von 50 ul Testmedium auf ein Endvolumen von 200 ul überführt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; werden die Mikrokulturen mit Tritium-versetztem Thymidin für 4 Stunden markiert (1 uCi/Vertiefung). Die Kulturen werden durch Einfrieren bei -70ºC für 24 Stunden gefolgt von einem Auftauen und Ernten der Mikrokulturen mittels eines Skatron Semiautomatic Cell Harvester beendet. Die Proben werden durch Flüssigscintillation mittels eines Wallac BetaPlace β-Zählgeräts gemessen.

DMBA-induzierte Brusttumorhemmung

Es werden östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Sprague-Dawley Ratten gebildet, die von Harlan Industries, Indianapolis, Indiana bezogen werden. Bei einem Alter von etwa 55 Tagen erhalten die Ratten eine einzelne orale Gabe aus 20 mg 7,12-Dimethylbenzo[a]anthrazen (DMBA). Etwa 6 Wochen nach der DMBA Verabreichung werden die Brustdrüsen in wöchentlichen Intervallen auf das Vorkommen von Tumoren palpiert. Immer wenn ein oder mehrere Tumoren auftreten, werden die längsten und kürzesten Durchmesser jedes Tumors mit einem Mikrometer gemessen, die Messungen werden aufgezeichnet und das Tier wird für das Experiment ausgewählt. Es wird der Versuch unternommen, die verschiedenen Tumorgrößen in den Behandlungs- und Kontrollgruppen so gleich zu verteilen, daß die Tumoren der mittleren Größe zwischen den zwei Testgruppen gleich verteilt sind. Die Kontrollgruppen und die Testgruppen für jedes Experiment enthalten 5 bis 9 Tiere.
Die Verbindungen der Formel I werden entweder über intraperitoneale Injektionen in 2% Akaziengummi oder oral verabreicht. Oral verabreichte Verbindungen werden entweder gelöst oder in 0,2 ml Maisöl suspendiert. Jede Behandlung, einschließlich Kontrollbehandlungen mit Akaziengummi und Maisöl, wird einmal am Tag jedem Testtier verabreicht. Nach der anfänglichen Tumormessung und der Auswahl der Testtiere werden die Tumoren jede Woche durch das oben erwähnte Verfahren gemessen. Die Behandlung und die Messungen der Tiere werden für 3 bis 5 Wochen fortgesetzt, wonach die schließlichen Tumorflächen bestimmt werden. Für jede Verbindung und die Kontrollbehandlung wird die Veränderung der mittleren Tumorfläche berechnet.

Uterusfibrosetestverfahren

Test 1

Zwischen 3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man eine erfindungsgemäße Verbindung. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und der Verabreichungszeitraum beträgt 3 Monate.
Die Frauen werden während des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.

Test 2

Es wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.

Test 3

Es wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer daß der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.

Test 4

A. Induktion von fibroiden Tumoren in Meerschweinchen

Es wird eine verlängerte Östrogenstimulierung zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol 3-5 mal pro Woche durch Injektion für 2-4 Monate dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger bestehen, werden täglich für 3-16 Wochen verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen und auf Tumorregression untersucht.

B. Implantierung von humanem fibroidem Uterusgewebe in Nacktmäuse

Gewebe von humanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen implantiert. Es wird exogenes Östrogen verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren, in einigen Fällen werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung kultiviert. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder einem Träger besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des Organs zu untersuchen.

Test 5

A. Gewebe aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen. GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen potentiell zur Behandlung der Uterusfibrose geeignet sind.

Endometriosetestverfahren

Im Test 1 und 2 können die Wirkungen einer 14 Tage und 21 Tage dauernden Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf das Wachstum des explantierten endometrialen Gewebes untersucht werden.

Test 1

Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ruten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Zusätzlich werden den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt.
Am Tag nach der Operation erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen für 14 Tage, während die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrialen Explantate. Nebennieren, der verbleibende Uterus und die Ovarien, wo dies möglich ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert. Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.

Test 2

Zwölf bis dreißig erwachsene weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluß angenäht.
Etwa 50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht für dieselbe Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und die endometrialen Explantate und Nebennieren werden entfernt und gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen werden aufgezeichnet.

Test 3

A. Operative Induktion der Endometriose

Autographien von endometrialem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen und Östrogen wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometriales Gewebe wird im Peritoneum von 5-150 Tieren implantiert und Östrogen wird zur Wachstumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt. Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums zu bestimmen.

B. Implantierung von humanem endometrialem Gewebe in Nacktmäuse

Gewebe von humanen Endometriumläsionen wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen Nacktmäusen, implantiert. Es wird exogenes Östrogen bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren. In manchen Fällen werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus einer erfindungsgemäßen Verbindung, die durch Gastrolavage täglich für 3-16 Wochen verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums zu untersuchen.

Test 4

A. Das Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in vitro als primäre nicht-transformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10% Serum und Antibiotikum enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit von Östrogen bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht. Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach der Behandlung mit Progestinen. GnRH einer erfindungsgemäßen Verbindung und einem Träger untersucht. Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten bleiben. Es wird Gewebe von 5-25 Patienten verwendet.
Die Aktivität in mindestens einem der obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung der Endometriose geeignet sind.

Testverfahren zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen/Restenose

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben ein Potential zur Hemmung der Proliferation der glatten Aortazellen. Dies kann durch Verwendung der kultivierten glatten Zellen gezeigt werden, die von der Kaninchenaorta stammen, wobei die Proliferation durch die Messung der DNA Synthese bestimmt wird. Die Zellen werden durch das Explantationsverfahren erhalten, das in Ross. J. of Cell. Bio. 50: 172 (1971) beschrieben ist. Die Zellen werden für 5 Tage in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen werden konfluent und das Wachstum stoppt. Die Zellen werden dann in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) überführt, das 0,5-2% Blutplättchen-armes Plasma, 2 mM L-Glutamin. 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 1 mCi/ml ³H-Thymidin. 20 ng/ml aus Blutplättchen-stammender Wachstumsfaktor und verschiedene Konzentrationen der vorliegenden Verbindungen enthält. Die Stammlösung der Verbindungen wird in Dimethylsulfoxid hergestellt und dann auf eine geeignete Konzentration (0.01-30 mM) im obigen Testmedium verdünnt. Die Zellen werden dann bei 37ºC für 24 Stunden unter 5% CO&sub2;/95% Luft inkubiert. Am Ende der 24 Stunden werden die Zellen in Methanol fixiert. Der 3H Thymidineinbau in die DNA wird dann durch Scintillationszählung bestimmt, wie dies in Bonin et al. Exp. Cell. Res. 181: 475-482 (1989) beschrieben ist.
Die Hemmung der Proliferation der glatten Aortamuskelzellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wird ferner durch Bestimmung ihrer Wirkungen auf die exponentiell wachsenden Zellen gezeigt. Es werden glatte Muskelzellen aus Kaninchenaorten in Gewebekulturplatte; n mit 12 Vertiefungen in DMEM geimpft, das 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthält. Nach 24 Stunden haften die Zellen und das Medium wird durch DMEM ersetzt, das das 10% Serum, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und gewünschte Konzentrationen der Verbindungen enthält. Die Zellen läßt man für vier Tage wachsen. Die Zellen werden mit Trypsin behandelt und die Anzahl an Zellen in jeder Kultur wird durch Zählen mittels eines ZM-Coultercounters bestimmt.
Die Aktivität in den obigen Tests zeigt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen ein Potential bei der Behandlung der Restenose aufweisen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Linderung des postmenopausalen Syndroms bei Frauen, das gekennzeichnet ist durch das oben erwähnte Verfahren mittels Verbindungen der Formel I und umfaßt ferner die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Östrogens oder Progestins an eine Frau. Diese Behandlungen sind besonders bei der Behandlung der Osteoporose und der Verringerung des Serumcholesterins brauchbar, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen Mittels erhält, während die erfindungsgemäßen Verbindungen die unerwünschen Nebenwirkungen von Östrogen und Progestin verhindern würden. Die Wirkung dieser Kombinationsbehandlungen in einem der obigen postmenopausalen Tests zeigt, daß die Kombinationsbehandlungen für die Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms bei Frauen brauchbar sind.
Es sind verschiedene Formen von Östrogen und Progestin im Handel erhältlich. Auf Östrogen basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen (0,01-0,03 mg/Tag), Mestranol (0,05-0,15 mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone, wie Premarin® (Wyeth-Ayerst, 0,3-2,5 mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise Medroxyprogesteron, wie Provera® (Upjohn. 2,5-10 mg/Tag), Norethylnodrel (1,0-10,0 mg/Tag) und Norethindron (0,5-2,0 mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen basierende Verbindung ist Premarin und Norethylnodrel und Norethindron sind bevorzugte auf Progestin basierende Mittel.
Das Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen und Progestin basierenden Mittels stimmt mit dem überein, was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal täglich verabreicht. Jedoch kann die zyklische Therapie insbesondere bei der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose kann die Therapie auf kurze Intervalle (1-6 Monate) nach medizinischen Verfahren beschränkt werden, wie der Angioplastie.
Wie hierin verwendet, meint der Ausdruck "effektive Menge" eine Menge einer Verbindung der Formel I, die zur Linderung der Symptome von verschiederten pathologischen Zuständen fähig ist, wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung wird natürlich von den besonderen den Fall umgebenden Umständen bestimmt, wie beispielsweise der verabreichten Verbindung, des Verabreichungswegs, des Zustands des Patienten und des zu behandelnden pathologischen Zustands. Eine typische Tagesdosis enthält eine nicht-toxische Dosismenge von etwa 0,1 mg bis etwa 1000 mg/Tag einer erfindungsgemäßen Verbindung und bevorzugter etwa 15 mg bis etwa 80 mg/Tag.
Wie der Fachmann erkennt, kommen die Verbindungen der Formel I meistens als Zwitterionen vor, die die tertiäre Aminstruktur von R³ und eine Monohydrogensulfatgruppe umfassen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden auch pharmazeutisch annehmbare Säure- und Basenadditionssalze (beispielsweise an der R³ Gruppe, am Hydrogensulfatrest oder am Hydrogensulfatrest eines Zwitterions) mit einer großen Vielzahl an organischen und anorganischen Säuren und Basen und umfassen die physiologisch annehmbaren Salze, die oft in der pharmazeutischen Chemie verwendet werden. Solche Salze sind ebenfalls Teil der Erfindung. Typische anorganische Säuren, die zur Bildung solcher Salze verwendet werden, sind unter anderem Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-, Hypophosphorsäure und dergleichen, Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, phenylsubstituierten Alkansäuren, Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäuren, können ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat, Ascorbat, Benzoat, Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybenzoat, Naphthalin-2-benzoat, Bromid, Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat, Butin-1,4- dioat, Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat, Citrat, Formiat, Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat, Malat, Maleat, Hydroxymalcat, Malonalt, Mandelat, Mesylat, Nicotinat, Isonicotinat, Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Propiolat, Propionat, Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat, Suberat, Sulfat, Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat, Benzolsulfonat, p-Bromphenylsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat, 2- Hydroxyethansulfonat, Methansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, p-Toluolsulfonat, Xylolsulfonat, Tartrat und dergleichen. Ein bevorzugtes Salz ist das Hydrochloridsalz.
Die pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge einer Säure gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether oder Benzol. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Basen, die herkömmlich zur Bildung von Salzen verwendet werden, beinhalten Ammoniumhydroxid und Alkali- und Erdalkalimetallhydroxide und Carbonate hiervon, wie auch aliphatische und primäre, sekundäre und tertiäre Amine und aliphatische Diamine. Basen, die zur Herstellung der Additionssalze besonders geeignet sind, sind unter anderem Ammoniumhydroxid, Kaliumcarbonat, Methylamin, Diethylamin, Ethylendiamin und Cyclohexylamin.
Die pharmazeutisch annehmbaren Basenadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge einer Base gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether, EtOAc, Alkoholen oder Benzol. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Verbindungen, die zwei Sulfatreste aufweisen, können durch die Umsetzung des Zwitterions mit einem Äquivalent Base in ein Basenadditionssalz und ein zwitterionisches Salz umgewandelt werden. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem gemeinsamen Lösemittel vereinigt, wie Diethylether, EtOAc, Alkoholen oder Benzol. Das Salz fällt normalerweise innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel kann durch herkömmliche Verfahren abgezogen werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze weisen in allgemeinen erhöhte Löslichkeitseigenschaften verglichen mit der Verbindung, von der sie stammen, auf und sind daher bei der Formulierung als Flüssigkeiten oder Emulsionen oft beliebter.
Es ist im allgemeinen bevorzugt, eine Verbindung der Formel I in Form eines Säureadditionssalzes zu verabreichen, wie es gewöhnlich bei der Verabreichung von. Pharmazeutika der Fall ist, die eine basische Gruppe tragen, wie den Piperidinoring. Es ist auch vorteilhaft, eine solche Verbindung auf dem oralen Weg zu verabreichen. Für solche Zwecke sind die folgenden oralen Dosierungsformen erhältlich.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Diese Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert, wobei die Auswahl hiervon durch den behandelnden Arzt entschieden wird. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon und wahlweise eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff hierfür enthält.
Die Gesamtwirkstoffe umfassen in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, daß der Träger, das Verdünnungsmittel, die Hilfsstoffe und das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sind.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen können durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannten und leicht verfügbaren Inhaltsstoffen hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen der Formel I mit oder ohne einer Östrogen- oder Progestinverbindung mit herkömmlichen Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Trägern formuliert und zu Tabletten. Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen geformt werden. Beispiele für Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und Träger, die für solche Formulierungen geeignet sind, beinhalten die folgenden: Füllstoffe und Streckmittel, wie Stärke, Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate, Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon. Netzmittel, wie Glycerin, Desintegrationsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat, Mittel zur Verzögerung der Auflösung, wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quarternäre Ammoniumverbindungen, oberflächenaktive Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, adsorptive Träger, wie Kaolin und Bentonit und Gleitmittel, wie Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglycole.
Die Verbindungen können auch formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung oder als Lösungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise auf intramuskulärem, subkutanem oder intravenösem Weg. Zusätzlich sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so gestaltet werden, daß sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise an einem bestimmten physiologischen Ort möglicherweise über eine bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen. Umhüllungen und Schutzmatrizes können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt werden.
Verbindungen der Formel I werden alleine oder in Kombination mit einem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel in einer bequemen Formulierung verabreicht. Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd.

Formulierung

In den folgenden Formulierungen meint "Wirkstoff" eine Verbindung der Formel I oder ein Salz oder Solvat hiervon.

Formulierung 1: Gelatinekapseln

Hartgelatinekapseln werden folgendermaßen hergestellt:
Bestandteil Menge (mg/Kapsel)
Wirkstoff 0,1-1000
Stärke, NF 0-650
Stärke, fließfähiges Pulver 0-650
Siliconflüssigkeit 350 Centistoke 0-15
Die obige Formulierung kann in Übereinstimmung mit den angegebenen sinnvollen Variationen verändert werden.
Eine Tablettettformulierung wird mittels der folgenden Bestandteile hergestellt:

Formulierung 2: Tabletten

Bestandteil Menge (mg/Tablette)
Wirkstoff 2,5-100
Cellulose, mikrokristallin 200-650
Siliciumdioxid, pyrogen hergestellt 10-650
Stearinsäure 5-15
Die Komponenten werden gemischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt.
Alternativ dazu werden Tabletten, die jeweils 2,5-1000 mg Wirkstoff enthalten, folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 3: Tabletten

Bestandteil Menge (mg/Tablette)
Wirkstoff 25-1000
Stärke 45
Cellulose, mikrokristallin 35
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser) 4
Natriumcarboxymethylcellulose 4,5
Magnesiumstearat 0,5
Talkum 1
Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Sieb mit 4 · 10&supmin;&sup4; m großen Öffnungen (Nr. 45 Mesh US) gegeben und gründlich gemischt. Die Lösung des Polyvinylpyrrolidons wird mit den entstehenden Pulvern gemischt, die dann durch ein Sieb mit 1,25 · 10&supmin;³ m großen Öffnungen (Nr. 14 Mesh US) gegeben werden. Die so hergestellten Granula werden bei 50ºC-60ºC getrocknet und durch ein Sieb mit 10&supmin;³ m großen Öffnungen (Nr. 18 Mesh US) gegeben. Die Natriumcarboxymethylcellulose, das Magnesiumstearat und das Talkum, die vorher durch ein Sieb mit 2,5 · 10&supmin;&sup4; in großen Öffnungen (Nr. 60 Mesh US) gegeben wurden, werden dann zu den Granula gegeben, die nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt werden.
Suspensionen, die jeweils 0,1-1000 mg Arzneimittel pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 4: Suspensionen

Bestandteil Menge (mg/5 ml)
Wirkstoff 0,1-1000 mg
Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg
Sirup 1,25 mg
Benzoesäurelösung 0,10 ml
Geschmacksstoff q.v.
Farbstoff q.v.
gereinigtes Wasser auf 5 ml
Das Arzneimittel wird durch ein Sieb mit 4 · 10&supmin;&sup4; m großen Öffnungen (Nr. 45 Mesh US) gegeben und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup unter Bildung einer glatten Paste vermischt. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacks- und der Farbstoff werden mit etwas Wasser verdünnt und unter Rühren zugegeben. Dann wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Vol unten herzustellen.
Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:

Formulierung 5: Aerosol

Bestandteil Menge (Gewichtsprozent)
Wirkstoff 0,25
Ethanol 25,75
Propellant 22 (Chlordifluormethan) 77,000
Der Wirkstoff wird Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf -30ºC abgeküllt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.
Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 6: Zäpfchen

Bestandteil Menge (mg/Zäpfchen)
Wirkstoff 250
Gesättigte Fettsäureglyceride 2000
Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit 15 · 10&supmin;&sup4; in großen Öffnungen (Nr. 10 Mesh US) gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceride suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.
Eine intravenöse Formulierung wird folgendermaßen hergestellt:

Formulierung 7: Intravenöse Lösung

Bestandteil Menge
Wirkstoff 50 mg
Isotonische Kochsalzlösung 1000 ml
Die Lösung der obigen Bestandteile wird einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.

Formulierung 8: Kombinationskapsel I

Bestandteil Menge (mg/Kapsel)
Wirkstoff 50
Premarin 1
Avicel pH 101 50
Stärke 1500 117,50
Siliconöl 2
Twen 80 0,50
Cab-O-Sil 0,25

Formulierung 9: Kombinationskapsel 1I

Bestandteil Menge (mg/Kapsel)
Wirkstoff 50
Norethylnodrel 5
Avicel pH 101 82,50
Stärke 1500 90
Siliconöl 2
Tween 80 0,50

Formulierung 10: Kombinationstablette

Bestandteil Menge (mg/Kapsel)
Wirkstoff 50
Premarin 1
Maisstärke NF 50
Povidon K29-32 6
Avicel pH 101 41,50
Avicel pH 102 136,50
Crospovidon XL 10 2,50
Magnesiumstearat 0,50
Cab-O-Sil 0,50

Claims

1. Verbindung der Formel I

worin

R¹ für Wasserstoff, Hydroxy, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, -OCOO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCO(C&sub1;-C&sub6; Alkyl), -OCOAr, worin Ar für Phenyl oder wahlweise substituiertes Phenyl steht, oder -OSO&sub2;-(geradkettiges C&sub4;-C&sub6; Alkyl) oder -OSO&sub3;H steht,

R² für R¹, Cl oder F steht, mit der Maßgabe, daß zumindest eines von R¹ oder R² für -OSO&sub3;H steht,

R³ für 1-Piperidinyl, 1-Pyrrolidinyl, Methyl-1-pyrrolidinyl, Dimethyl-1-pyrrolidino, 4-Morpholino, Dimethylamino, Diethylamino, Diisopropylamino oder 1-Hexamethylenimino steht und

n für 2 oder 3 steht,

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ und R² jeweils für -OSO&sub3;H stehen.

3. Verbindung nach Anspruch 1, worin R¹ für Hydroxy steht und R¹ für -OSO&sub3;H steht.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R² für Hydroxy steht und R¹ für -OSO&sub3;H steht.

5. Verbindung nach Anspruch 1, worin n für 2 steht.

6. Verbindung nach Anspruch 5, worin R³ für 1-Piperidinyl steht.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon und wahlweise eine wirksame Menge an Östrogen oder Progestin in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.

8. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms, wobei das postmenopausale Syndrom ausgewählt ist aus Osteoporose oder einer kardiovaskulären Erkrankung.

9. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Östrogen-abhängigem Krebs.

10. Verwendung einer Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der fibroiden Uteruserkrankung. Endometriose, Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta oder Restenose.

11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon zur Verwendung als Pharmazeutikum.