DD239798A5 - Verfahren zur herstellung von mucopolysaccharid-zusammensetzungen mit erhoehter antithrombotischer aktivitaet - Google Patents
Verfahren zur herstellung von mucopolysaccharid-zusammensetzungen mit erhoehter antithrombotischer aktivitaet Download PDFInfo
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Abstract
Gemaess dem Verfahren der Erfindung unterzieht man Mucopolysaccharid-Zusammensetzungen mit erhoehter antithrombotischer Aktivitaet und einem hoeheren Verhaeltnis der Titer YW/USP als dem von Heparin, mindestens einer Fraktionierungsetappe, um die Ketten, die nicht mehr als sechs Strukturanordnungen enthalten, abzutrennen.
Description
Hierzu 2 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung hat ein Verfahren zur Herstellung von Mucopolysaccharid-Zusammensetzungen zum Gegenstand, die eine erhöhte antithrombotische Aktivität aufweisen. >
Es ist bekannt, daß Zusammensetzungen dieses Typs ausgehend von Heparin durch alkoholische Extraktion oder auch durch Depolymerisation auf chemischem oder enzymatischem Wege erhalten wurden.
Im großen und ganzen ermöglichen es diese Verfahren, Zusammensetzungen oder Fraktionen von Mucoplysacchariden, oder MPS, zu erhalten, deren Ketten höchstens ungefähr 25 bis 30 Strukturanordnungen umfassen und die eine anti-Xa-Aktivität besitzen, gemessen durch den Titer Yin Wessler (YW), höher als derjenige von Heparin, und eine allgemeine Anti-koagülations-Aktivität aufweisen, ausgedrückt durch den USP-Titer und niedriger als der von Heparin, wobei dieser Titer sogar einen sehr geringen Wert aufweisen und praktisch null werden kann.
Diese Produkte weisen von Vorteil auf, bei gewissen Etappen, die bei Koagulations-Prozessen ins Spiel gebracht wurden, eine spezifischere Wirkung auszuüben als Heparin.
Für eine durchzuführende Behandlung wählt man das Produkt in Abhängigkeit von dem Wert seines YW-Titers und dem Verhältnis seiner Titer YW und USP aus.
In dieser Hinsicht haben die Erfinder nach Mitteln gesucht, die Zusammensetzungen, die einem vorgegebenen Profil entsprechen, in bequemer Art und Weise zu erhalten und was dieses Profil betrifft, insbesondere in bezug auf ihren YW-Tite; :jnd auf das Verhältnis der Titer YW zu USP. Die durchgeführten Arbeiten haben ergeben, daß es unter Berücksichtigung bestimmter Bedingungen möglich ist, derartige Produkte ausgehend von anderen MPS-Zusammensetzungen zu isolieren.
Ziel der Erfindung(
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von MPS-Zusammensetzungen mit erhöhter antithrombotischer Aktivität.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete MPS-Zusammensetzung so zu behandeln, daß auf einfache Weise vorteilhafte Produkte, insbesondere solche mit erhöhter antithrombischer Aktivität erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man MPS-Zusammensetzungen, die aus einer Mehrzahl von MPS-Ketten mit einem Molekulargewicht (PM) von ungefähr 1800 bis 8000 Dalton gebildet sind und die einen höheren YW Titer und ein höheres Verhältnis der Titer YW/USP als Heparin besitzen, mindestens einer Fraktionierungsetappe unterzieht, um" selektiv von diesen Zusammensetzungen mindestens den Großteil der PM-Ketten mit weniger als ungefähr 2000 und den höheren PM-Ketten-Anteil abzutrennen, der aber einen niedrigeren Sulfatierungsgrad besitzt, als der mittlere Grad eier K. tten der Mischung, und daß man die von diesen Ketten befreiten Fraktionen sammelt. Diese Fraktionen weisen ein geringeres Verhältnis der Titer YW zu USP als die Ausgangszusammensetzungen auf, jedoch ein höheres als das von Heparin, mit einem höheren USP-Titer als der der Ausgangszusammensetzungen
Vorzugsweise wird die Etappe der Fraktionierung mit Hilfe einer Mischung aus
a) Wasser, dasein Mineralsalz enthält, und
b) einem organischen Lösungsmittel
durchgeführt, wobei dieses Lösungsmittel so ausgewählt wird, daß darin mindestens der größte Teil der gesuchten Produkte selektiv unlöslich ist und ausfällt.
Die relativen Verhältnisse von Mineralsalz und Lösungsmittel werden in Abhängigkeit vom p-Wert des Mediums eingestellt um die Fällung der gesuchten MPS-Ketten zu erreichen.
Nach einer bevorzugsten Ausführungsform der Erfindung ist das organische Lösungsmittel vorteilhafterweise ein alkoholisches Lösungsmittel und insbesondere Ethanol.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das verwendete Mineralsalz insbesondere aus einem in dem eingesetzten organischen Lösungsmittel mischbaren Salz, wie aus Natrium- oder Kaliumchlorid.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Reaktionsmischung auf einen entsprechenden sauren Wert eingestellt, insbesondere auf einen pH-Wert unter 4.
Gemäß einer bevorzugten Art der Realisierung der Erfindung enthalten die für die Fraktionierung verwendeten MPS-Zusammensetzungen eine Mehrzahl an Ketten (1) vom Molekulargewicht (PM) von ungefähr 1800 bis 8000, weisen (2) ein Verhältnis der Titer YW zu USP von mindestens etwa 10 auf und (3) einen YW-Titer von ungefähr 200 bis 250 u/mg. Es wird daran erinnert, daßderYin-Wesseler-Titerals Maß für die anti-Xa-Aktivität verwendet wird, gemäß Yin, E.T., Wesseler, S.,Bülter,J.V. inJ.Lab.Clin.med. 1973,81, S.298-310. '
Die verwendeten MPS-Zusammensetzungen werden vorteilhafterweise nach einem partiellen Depolymerisations-Verfah^en von Heparin erhalten, unter Einwirkung eines chemischen Mittels wiesalpetriger Säure. Dabei wurde insbesondere bezug genommen auf ein Verfahren, das durch die Anmelderin in der zweiten Zusatzanmeldung Nr.8006282 vom 20. März 1980 zum FR-PS 7831357 vom 6. November 1978 beschrieben wurde.
Nach einer vorteilhaften Art und Weise führt man ein Depolymerisationsverfahren dieses Typs durch, jedoch basierend auf der Selbstregulierung derDepolymerisationsreaktion, wie beschrieben in der französischen Patentanmeldung 81 07283 vorr 10. April 1981 auf den Namen der Anmelderin.
Gemäß einem ganz allgemeinen Aspekt dieser autoregulierien Depolymerisation führt man die Reaktion von Heparin mit salpetriger Säure im wäßrigen Medium durch,.bei einem pH-Wert in der Größenordnung von 2 bis 3,.vorzugsweise 2,5, wobei die Konzentration an Heparin mindestens etwa 8Gew.-% und die Molarität von salpetriger Säure etwa 0,02 bis 0,1 M betragen Nachdem die Depolymerisation durch Verbrauch der salpetrigen Säure von selbst zum Stillstand gekommen ist, sammelt man die MPS-Mischung des Typs, der in einem organischen Lösungsmittel ausgefällt werden kann.
Die salpetrige Säure wird in situ erzeugt, durch Zugabe einer Säure., die vorteilhafterweise biologisch, akzeptable A" ionen enthält, wie Salzsäure oder Essigsäure, zu einem Derivat der salpetrigen Säure, insbesondere einem Salz, einem Eth··- 3a!? wä besonders einem Alkali- oder Erdalkalisalz! Man verwendet insbesondere Natriumnitrit in einer Molarität von 0,03 bis 0,05 M. Um das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen, ist vorzugsweise NaNO1 in einer Konzentration vor; 0,- iü bis 0,046M zu verwenden, insbesondere in der Größenordnung von 0,043 M. In Abhängigkeit von derHerstellungsmethode besitzen die MPS-Zusammensetzungen an dem Reduktionsende eine Anordnung der 2.5-Anhydromanno-Struktur, « vorzugsweise ausgewählt unter den Gruppen 2,5-Anhydromannose, 2,5-Anhydromannitol oder 2,5-AnhydromannonSiLt a. Die verwendeten MPS-Ausgangs-Zusarnmensetzungen werden im Verhältnis von 5% (Gew./Vol.) in Wasser, das ' ig/l NaC enthält, in Lösung gebracht.
Nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 3,8 wird die Fraktionierung dieser MPS mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels durchgeführt, das es ermöglicht, die MPS mit dem höchsten Molekulargewicht und/oder dem größten Sulfatir-rungsgrad, selektiv zu fällen.
Das organische Lösungsmittel besteht insbesondere aus einem alkoholischen Lösungsmittel, speziell Ethanol Die Entfernung derKetten mit niedrigem Molekulargewicht oder mit einem geringen Sultaigenalt hat zur Folge, daß MPS-Fraktionen mit weiter erhöhtem USP-Titer erhalten werden, wobei der YW-Titer praktisch unverändert bleibt. Die bei der Fällung gesammelten MPS-Zusammensetzungen sind im allgemeinen dadurch charakterisiurt, daß sie im wesentlichen (1) aus Ketten mit einem mittleren Molekulargewicht von-4000 bis 500C) Dalton, insbesondere etwa 4500, gebildet sind, (2) einen YW-Titer von etwa 180 bis 200u/mg besitzen und ein Verhältnis der Titer YW/USP von niedrigeren 10, insbesondere von 6 bis 3, speziell in der Größenordnung von 4 aufweisen.
Diese Zusammensetzungen sind außerdem aus einer Mehrzahl von Ketten gebildet, die von 2,5-Anhydromanno-Strukturanordnungen begrenzt sind, wenn die Ausgangs-Zusammensetzungen von einem salpetrigsauren Depolymerisationsverfahren von Heparin stammen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Zusammensetzungen sind mit biologischen Wirkungen .ersehen, die es ermöglichen, sie insbesondere zur spezifischen Kontrolie gewisser Etappen der Blut-Koagulation einzusetzen. Sie sind daher insbesondere wertvoll für die Schaffung von Medikamenten, die besonders zur Vorbeugung und Behandlung von Thrombosen und Alterserscheinungen des Gewebes verwendet werden können. Diese Medikamente werden in den für den vorgesehenen Indikationstyp üblichen Verabreichungsformen und Dosierungen eingesetzt.
i '
Die erhaltenen Mucopolysaccharid-Zusammensetzungen werden ebenfalls zur Herstellung von biologischen Reagenzien herangezogen, die im Laboratorium verwendet werden, beispielsweise als Referenz-Titer für den Vergleich mit anderen Produkten, von denen die Antikoagulierungswirkung getestet wird, insbesondere im Bereich der Inhibierung des Faktors Xa.
Was die in der für die Fraktionierung verwendeten Mischung Wasser/organisches Lösungsmittel löslichen Produkte betrifft, so sind diese ohne oder praktisch ohne antithrombotische Aktivität.
Diese Produkte können durch Filtration der löslichen Fraktion über ein Gel gewonnen werden. Die Anwendung einer Stufe der lonenaustauschchromatographie ermöglicht die Abtrennung dieser Zusammensetzungen, wenn man es wünscht, und zwar verschiedener Typen an Oligosaccharide^ insbesondere Hexasaccharid-Ketten mit einer gegenüber der Neoangiogenese erhöhten Inhibitor-Wirkung.
Die Gewinnung der Produkte aus den Fraktionen wird vorteilhafter durchgeführt, inderh man beispielsweise eine alkoholische^ Fällung und Lyophilisation vornimmt.
Ausführungsbeispielv
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. Aus den folgenden Beispielen werden weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ersichtlich. Die Beispiele 1 und 2 beziehen sich auf die Herstellung der MPS-Zusammensetzungen mit einem Verhältnis der Titer YW zu USP in der Größenordnung von 4, die Beispiele 3 und 4 auf die Aktivität der gemäß Beispiel 1 und 2 jeweils erhaltenen Produkte, und Beispiel 5 auf die Gewinnung der praktisch ohne antithrombotische Wirkung versehenen Produkte ausden löslichen Fraktionen.
Verfahren zur Herstellung von MPS-Zusammensetzungen mit einem Verhältnis der Titer YW/USP von etwa 4.
500 g injizierbares Heparin in Form des Natriumsalzes werden in 4500 ml entmineralisiertem Wasser bei einer Temperatur von 18°Cin Lösung gebracht. Das Verhältnis YW/USP des verwendeten Heparins beträgt ungefähr 1, diese Titer weisen einen Wert in der Größenordnung von 160-170 auf.
Die erhaltene Lösung wird kräftig gerührt und ihr pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 2,5 gesenkt. Dann gibt man 15g Natriumnitrit, gelöst in 300 ml Wasser, hinzu. Der pH-Wert der Reaktion wird mittels konzentrierter Salzsäure auf 2,5 eingestellt und das Gesamtvolumen der Lösung auf 5000ml erhöht.
Man läßt die Reaktion 45 Minuten lang ablaufen und überprüft dann die Abwesenheit von restlichen Nitrit-Ionen in der Reaktionslösung, beispielsweise mittels Indikatorpapier, das mit Kalium-Iod-Stärke imprägniert ist (Entwicklung einer blauvioletten Färbung in Anwesenheit von NGvionen).
Man läßt die Reaktion noch bis zum völligen Verschwinden der Nitrit-Ionen und dem Ausbleiben der Reaktion auf lod-Stärke-
Papier fortsetzen, indem man die Kontrolle alle 3 oder 4 Minuten durchführt. f
Wenn diese Kontrollen negativ ausfallen, wird die Reaktion als beendet angesehen. Der pH-Wert der Lösung wird dann mit Hilfe von konzentrierter Natriumhydroxid-Lösung auf 10 angehoben und man setzt 5g Natriumbortetrahydrid hinzu.
Anschließend wird die Lösung 15 Stunden lang gerührt.
Das nicht umgesetzte Natriumbortetrahydrid wird dann durch Absenken des pH-Wertes mittels konzentrierter Salzsäure auf 3,0 zersetzt. Die Lösung wird dann 15 Minuten lang gerührt und anschließend mittels konzentrierter Natriumhydroxid-Lösung wieder auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht.
Die Reaktionsprodukte werden durch Zugabe von 10 Litern Ethanol gewonnen. Nach 48stündigem Stehenlassen wird das Produkt dekantiert und man entfernt den überstehenden Teil.
Der Niederschlag wird wieder in 9 Litern entmineralisiertem Wasser gelöst. Man setzt 100g Natriumchlorid hinzu und senkt den pH-Wert der Lösung mit Hilfe von konzentrierter Salzsäure auf 3,8. Das Volumen wird dann mit entmineralisiertem Wasser genau auf 10 Liter aufgefüllt und unter kräftigem Rühren gibt man 10 Liter Ethanol hinzu. Dann läßt man 48 Stunden lang stehen. Man zieht die überstehende Flüssigkeit mit einem Saugheber ab und entfernt sie. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Ethanol gewaschen, zerkleinert und unter Vakuum getrocknet. Man erhält 230g Produkt mit den folgenden Charakteristika:
Titer USP = 52ul/mg
Titer Yin und Wesseler = 225ul/mg
mittleres Molekulargewicht = 4000bis5000Dalton
Verfahren zur Herstellung von MPS-Fraktionen mit einem Verhältnis der Titer YW/USP von etwa 4.
5000g injizierbares Heparin werden in 45 Litern entmineralisiertem Wasser bei einer Temperatur von 18°Cge:öst.
Man verfährt in gleicherweise wie in Beispiel 1 beschrieben, indem man die Mengen der Reaktionspartner mir 10 multiplizier, das heißt:
— unter Zugabe von 150g Natriumnitrit in Lösung von 3 Litern Wasser,
— unter Auffüllung des Reaktionsvolumes auf 50 Liter,
— unter Zugabe von 50g Natriumbortetrahydrid,
— unter Fällung mit Hilfe von 100 Litern Ethanol,
— unter Wiederauflösung in 90 Litern Wasser,
— unter Zugabe von 100g Natriumchlorid,
— unter Auffüllung auf ein Endvolumen von 100 Litern,
— unter End-Zugabe von 100 Litern Ethanol.
Man erhält auf diese Weise 2230g Produkt mit den folgenden Charakteristika: Titer USP = 54ul/mg
Titer Yin und Wesseler = 232u!/mg
mittleres Molekulargewicht = 4000bis5000Dalton
Die Reaktionsprodukte werden durch Zugabe von 10 Litern Ethanol, 48 Stunden Stehenlassen, Dekantieren und Entfernen des überstehenden Teiles gewonnen.
Der Niederschlag wird wieder in 9 Litern entmineralisiertem Wasser gelöst. Man setzt 100g Natriumchlorid hinzu und senkt den pH-Wert der Lösung mit Hilfe von konzentrierter Salzsäure auf 3,8. Das Volumen wird dann mit entmineralisiertem Wasser genau auf 10 Liter aufgefüllt und unter kräftigem Rühren gibt man 10 Liter Ethanol hinzu. Dann'läßt man 48 Stunden lang stehen. Man zieht die überstehende Flüssigkeit mit einem Saugheber ab und entfernt sie. Der Niederschlag wird gesammelt, mit Ethanol gewaschen, zerkleinert und unter Vakuum getrocknet.
Man erhält 230g Produkt mit den folgenden Charakteristika:
Titer USP = 52ul/mg
TiterYin undWesseler = 225ul/mg
mittleres Molekulargewicht = 4000bis5000Dalton
In dem nachfolgenden Beispiel 3 wird auf die Resultate der mit dem Produkt von Beispiel 1 durchgeführten pharmakologischen Untersuchungen bezug genommen.
Untersuchung der Aktivität der Produkte von Beispiel 1 in vitro.
In den Figuren 1 bis 4 sind die in dem in-vitro-Versuch erhaltenen Kurven dargestellt, und zwar die Veränderung der Zeiten der in Human-Blutplasma durch steigende Dosierungen eines handelsüblichen Heparins und des Produktes von Beispiel 1 induzierten Koagulation.
In den Versuchen, die den in den Figuren 3 und 4 angegebenen Resultaten entsprechen, wurde von Plättchen oefreites Plasma verwendet und um den Faktor Xl verwässert.
Diese Figuren zeigen die Veränderungen in Sekunden von Thrombin (Figur 1), von Cephalin-Kaolin (Figur 2), von Koagulation in Anwesenheit von konzentriertem Thromboplastin (Figur 3) und von verdünntem Thromboplastin (Figur 4), induziert durch die getesteten Produkte, nämlich dem Produkt von Beispiel 1 (Kurven a 1, a 2, a3 und a4) und Heparin (Kurven b1, b2, b3und b4) in Abhängigkeit der jeweils angewendeten Dosierungen.
Die Zeiten von Thrombin und die von Cephalin-Kaolin stellen Messungstypen dar, die eher die Wirkung der jeweils untersuchten Präparationen auf die Inhibierung des aktiven Faktors Il und die Gesamtkoagulation widerspiegeln. Der Versuch der Kurven ti r Figuren 1 und 2 zeigt, daß die erfindungsgemäßen MPS eine deutlich geringere Wirkung auf die Inhibierung eier Aktivierung von Prothrombin im Bereich der Gesamtkoagulation ausüben als das bei Heparin der Fall ist. Die Figuren 3 und 4, die für Phänomenecharakteristisch sind, die direkter mit der Sequenz der enzymatischen Reaktionen als Merkmal der äußerlichen Koagulation (insbesondere in relativer Abwesenheit des Faktors XIa) in Zusammenhang stehen, zeigen die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen MPS im Verhältnis zu Heparin
Das untenstehende Beispiel 4 betrifft die Ergebnisse der Versuche in vivo am Kaninchen mit den MPS von Beispiel 2.
Untersuchung der antithrombotischen Aktivität des Produkts von Beispiel 2 am Kaninchen.
Die Verabreichung von 50Ou YW an das Kaninchen provoziert eine bedeutende anti-Xa-Aktivität, während die Gesamt-Antikdagulations-Aktivität relativ gering bleibt.
Zwei Stunden nach der Verabreichung liegt die YW-Aktivität in der Größenordnung von 0,88 u/ml, während die Zeit von Cephalin-Kaolin 0,09ul/ml beträgt.
Die Versuche in vivo und in vitro zeigensomit eine deutlich selektivere Wirkung der erfindungsgemäßen MPS, insbesondere auf dem Niveau der Inhibierung des Faktors Xa, als das bei Heparin der Fall ist.
Verfahren zur Herstellung von MPS-Fraktionen praktisch ohne antithrombotische Aktivität.
Man sammelt die lösliche Fraktion von Beispiel 1. Diese Fraktion enthält Ketten mit 2 bis 4 Strukturanordnungen.
Eine Etappe der zusätzlichen alkoholischen Fraktionierung dieser Fraktion führt zu einem Niederschlag, der abgetrennt wire* ind zu einer lösliöhen Fraktion, von der ausgehend man die Zusammensetzung y sammelt. Diese Zusammensetzung wird im wesentlichen aus Ketten mit höchstens 6 bis 8 Strukturanordnungen gebildet und besitzt einen YW-Titer von niedriger als 70 ui .·) einen USP-Titer von niedriger als 5.
Indem man die Zusammensetzung y einer Stufe der Gel-Filtration nach klassischen Techniken unterzieht, gewinnt man Hexasaccharid-Zusammensetzungen. Diese Zusammensetzungen sind praktisch völlig ohne Gesamt-Antikoagulationsakiivita'
und ohne YW-Aktivität. ' ,
Aktivität der Zusammensetzungen y und ζ auf die Neoangiogonese. Die auf die Anti-Angiogenese bezogenen Versuche in vi; :
wurden an der Chorio-allantoin-Membran von 6 Tage alten Hühnerembryos in Petri-Schalenkultur durchgeführt.
Man stellt Pastillen her^ indem man 5μg Hydrocortison zu 10/xl Methylzellulose mischt, dann gibt man die Zusammense;. ir <i;e::
y und ζ gemäß Dosierungen von 5/ng bis 100/^g hinzu. Die fertigen Pastillen werden getrocknet und anschließend auf die Chorio-Allantoin-Membran gebracht, an der sie festkleben.
Für jeden Versuch verwendet man vier Eier. Nach 48 Stunden Inkubation prüft man die Anwesenheit von avaskulären Zoner· ; Man beobachtet eine erhebliche Verringerung der vaskulären Zonen. Diese Resultate werden in bemerkenswerter Art und Weise mit nur 6μg der getesteten Produkte erhatten.
Beispiel 7 . '
Wirkung der Hexasacchand-Zusammensetzungen ζ auf ein Melanom vom Typ B16 bei der Maus. Man führt diese Versuche an Mäusen C57 BI/6 durch, die Melanome B16 tragen.
Die Behandlung wird 15 Tage lang durchgeführt. Man verabfolgt jeder Maus mittels subkutaner Injektion zweimal pro Tag 0,15 mg Hexasaccharid-Zusammensetzungen und Cortison-Acetat gemäß Dosierungen, die sich im Verlauf der Behandlung von \ 250mg/kg/Tag bis auf 40-50mg/kg/Tag verringern.
Nach Ablauf der 15 Tage stellt man einen Entwicklungsstillstand des Tumors fest.
Es wird sogar eine Rückbildung dieses Turmors in günstigen Fällen beobachtet.
Claims (9)
- Erfindungsanspruch: '1. Verfahren zur Herstellung von Mucopolysacchariden oder MPS mit erhöhter antithrombotischer Aktivität, gekennzeichnet dadurch, daß man Zusammensetzungen, die aus einer Mehrzahl von MPS-Ketten mit einem PM vpn ungefähr 1800 bis / 8000 Dalton gebildet sind und die einen höheren YW-Titer und έτη höheres Verhältnis der Titer YW/USP als Heparin besitzen, mindestens einer Fraktionierungsetappe unterzieht, um selektiv von diesen Zusammensetzungen mindestens den Großteil der PM-Ketten mit weniger als ungefähr 2000 und den höheren PM-Ketten-Anteil abzutrennen, der aber einen niedrigeren Sulfatierungsgrad besitzt, als der mittlere Grad der Ketten der Mischung, und daß man die von diesen Ketten befreiten Fraktionen sammelt, wobei diese Fraktionen ein geringeres Verhältnis der Titer YW zu USP als die Ausgangszusammensetzungen aufweisen, jedoch ein höheres als das von Heparin, mit einem höheren USP-Titer als der der Ausgangszusammensetzungen. *
- 2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die Fraktionierung mit Hilfe einer Wassermischung durchgeführt wird, die ein Mineralsalz und ein organisches Lösungsmittel umfaßt, in dem mindestens der größte Teil der gesuchten Produkte selektiv unlöslich ist.
- 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Fraktionierung mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels durchführt, das die selektive Fällung der gebildeten MPS gestattet, die aus PM-Ketten im Mittel von 4000 bis 5000 Dalton, insbesondere in der Größenordnung von 4500 Dalton gebildet wurden, wobei sie ein Verhältnis der Titer YW zu USP von niedriger als ungefähr 10, vorzugsweise von ungefähr 6 bis 3 und speziell von nahe 4 besitzt, mit einem YW-Titer von ungefähr 180bis200u/mg. ,
- 4. Verfahren nach Punkt 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Lösungsmittel ein alkoholisches Lösungsmittel, insbesondere Ethanol, ist. #
- 5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß das verwendete Mineralsalz insbesondere aus einem in dem eingesetzten Lösungsmittel mischbaren Salz besteht, wie beispielsweise aus Natrium- oder Kaliumchlorid.
- 6. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 2 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man den pH-Wert der Reaktionsmischung auf einen entsprechenden sauren pH-Wert einstellt, insbesondere auf einen pH-Wert unter 4.
- 7. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die für die Fraktionierung verwendeten MPS-Zusammensetzungen ein Verhältnis der Titer YW zu USP von mindestens etwa 10 und einen YW-Titer von etwa 200 bis 250u/mg aufweisen.
- 8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man 5% (Gew./Vol.) MPS-Zusammensetzungen, die 20g/l NaCI enthalten, in eine wäßrige Suspension bringt und man nach Einstellung des pH-Wertes auf 3,8 die Fraktionierung durch Zugabe eines Volumens Ethanol durchführt, wonach man den gebildeten Niederschlag sammelt.
- 9. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Ausgangs- MPS-Zusammensetzungen an dem Reduktionsende eine Anordnung der 2,5-Anhydromanno-Struktur besitzen, vorzugsweise ausgewählt unter den Gruppen 2,5-Anhydromannose, 2,5-Anhydro-mannitol oder 2,5-Anhydromannon-säure.
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