PL146770B1 - Method of obtaining mucopolysaccharides - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszanin mukopolisacharydowycoh o podwyzszonym dzialaniu antytrombocytowym. Mieszaniny tego typu otrzymuje sie z heparyny przez ekstrakcje alkoholem lub tez przez depolimeryzacje chemiczna albo enzymatyczne.Sposoby te pozwalaje otrzymywac mieszaniny lub frakcje utworzone z mukopolisacha- rydcw /MPs/, których lancuchy zawieraje od 25 do co najwyzej 30 jednostek oraz wykazuja¬ ce dzialanie anty-Xa, mierzone mianem Yin Wesslera /YW/, wyzsze niz heparyna oraz ogól¬ ne dzialanie antykoagulujace, wyrazone mianem USP, nizsze niz heparyna, przy czym miano to moze wykazywac wartosc bardzo male, az do praktycznie zerowej.Produkty te maje te zalete, ze w niektórych etapach procesu koagulacji wywiera- je dzialania bardziej specyficzne niz heparyna. Dla danego procesu leczenia dobiera sie produkt w zaleznosci od wartosci jego miana YW oraz stosunku jego mian YW i USP.Z tego wzgledu, podjeto badania nad znalezieniem srodków pozwalajacych latwo otrzymac mieszaniny odpowiadajece danemu profilowi, zwlaszcza w odniesieniu do ich miana YW oraz ich stosunku miana YW do USP. Wykonane prace doprowadzily do stwierdzenia, ze w okres¬ lonych warunkach mozliwe jest, wychodzec z innych mieszanin MPS wyodrebnianie takich produktów.Z opisu patentowego nr 135 948 znany jest sposób wytwarzania mukopolisacharydów o podwyzszonej aktywnosci anty-Xa, przez depolimeryzacje heparyny za pomoce kwasu azo¬ tawego w srodowisku wodnym i wytracanie rozpuszczalnikiem alkoholowym. Wade tego spo¬ sobu jest jednak to, ze otrzymane mukopolisacharydy maje male mase czesteczkowe, wyno- szece srednio 2500, a jak wynika z przykladów, stosunek mian YW/USP w produktach jest niepozedanie wysoki, znacznie wiekszy niz 10:1* Produkty te maje wprawdzie aktywnosc anty-Xa wyzsze niz heparyna, ale Ich dzialanie biologiczne nie jest w pelni zadowala- jece. Wynalazek umozliwia wytwarzanie mieszanin MPS nie majecych podanych wyzej wad, na drodze procesu latwego do prowadzenia i niekoeztownego.2 146 770 Sposobem wedlug wynalazku wytwarza eie nukopolieacharydy o naaie czasteczkowej ;.4apO.-50QP, majace stosunek YW/USP mniejszy niz 10 i miano YW 180-200 jm/mg. Ceche tego sposobu jest to, ze z mukopolisacharydów o masie czasteczkowej 2000-8000, majacych stosunek YW/U$P wynoszacy co najmniej 10 i miano YW okolo 200-250 Jm/mg, sporzadza sie .roztwór p stezeniu 5% wagowo/objetosciowych w wodzie zawierajecej 10 g chlorku sodo¬ wego na 1 litr i ustala wartosc pH roztworu nizsze od 4, po czym wytreca sie roztwór rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak alkohol, korzystnie etanol. Miano Yin-Wesslera «» stosuje sie tu jako miare aktywnosci anty-Xa, wedlug publikacji E.T.Yin, S.Wessler i J.V.Butler, J.Lab.Chim.Med. 81, str 298-310 /1972/. Miano to wyraza sie w jednostkach miedzynarodowych /jm/ na 1 mg.Stosowane mieszaniny MPS otrzymuje sie przez czesciowe depolimeryzacje hepary¬ ny metode podane w powolanym wyzej opisie patentowym, ale korzystnie stosuje sie spo¬ sób depolimeryzacji tego samego typu, lecz oparty na samoregulacji reakcji i depolime- ryzacji taki, jaki zostal opisany we francuskim zgloszeniu patentowym nr 8 107 283.Najogólniej, w samoregulowanej depolimeryzacji heparyne poddaje sie reakcji z kwasem azotawym w srodowisku wodnym przy wartosci pH rzedu 2-3, korzystnie 2,5, w ta¬ kich ilosciach, zeby stezenie heparyny wynosilo co najmniej okolo 8% wagowych, a mo- lowosc kwasu azotawego od 0,02 do okolo 0,1 M i po samoistnym zahamowaniu reakcji de¬ polimeryzacji wskutek zuzycia kwasu azotawego odzyskuje sie mieszanine MPS dajacych sie wytracac za pomoca rozpuszczalnika organicznego. Kwas azotawy wytwarza sie in situ przez dodawanie kwasu, korzystnie zawierajacego aniony biologicznie dopuszczalne, takiego jak kwas solny lub kwas octowy, do pochodnej kwasu azotawego zwlaszcza soli, estru, a zwlaszcza soli metalu alkalicznego lub metalu ziem alkalicznych. W szczególnosci stosu¬ je sie roztwór azotynu sodowego o molernosci 0,03-0,05M, korzystnie 0,040-0,046M, a zwlaszcza rzedu 0,043M. Otrzymane tym sposobem mieszaniny MPS maja na krancu redukuja¬ cym jednostke struktury 2,5-anhydromannowej, korzystnie dobrana sposród grup 2,5-anhy- dromannozy, 2,5-anhydromannitu lub kwasu 2,5-anhydromannowego. 3ak wspomiano wyzej, mieszanine MPS rozpuszcza sie w wodzie zawierajacej chlo¬ rek sodowy w ilosci 10 g/litr, wytwarzajac roztwór o stezeniu 5% wagowo/objetosciowych Roztwór ten zakwasza sie do wartosci pH mniejszej niz 4 i traktuje alkoholem, korzystnie etanolem, powodujac selektywne wytracanie mieszanin MPS majacych najwieksza mase czas¬ teczkowa i/lub najwieksze zasiarczenie. Usuniecie lancuchów o malym ciezarze czastecz¬ kowym oraz lancuchów o niskiej zawartosci procentowej siarczanu prowadzi w konsekwen¬ cji do frakcji MPS o podwyzszonym mianie USP przy zachowaniu praktycznie tego samego miana YW. Mieszaniny MPS odzyskane podczas stracania charakteryzuja sie ogólnie tym, ze sa zasadniczo utworzone z lancuchów /l/ o sredniej masie czasteczkowej 4000-5000, zwlaszcza okolo 4500, /2/ maja miano YW od okolo 180 do 200 jm/mg oraz stosunek miana YW/USP nizszy od 10, zwlaszcza od okolo 6 do 3, a w szczególnosci rzedu 4. Mieszaniny te poza tym utworzone sa w wiekszosci z lancuchów zakonczonych jednostkami struktury 2,5-anhydromannowej, gdy stosuje sie mieszaniny wyjsciowe wytworzone w procesie depo¬ limeryzacji heparyny kwasem azotawym.Mieszaniny otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja dzialanie biologiczne pozwalajace im w szczególnosci kontrolowac w specyficzny sposób niektóre etapy koagu- lowania krwi. Sa wiec one szczególnie wartosciowe przy sporzadzaniu leków stosowanych zwlaszcza do zapobiegania i leczenia trombozy oraz starzenia sie tkanek. Leki te sto¬ suje sie w postaciach i w dawkach zwykle uzywanych dla tego typu wskazan. Mieszaniny otrzymanych mukopolisacharydów sa takze uzyteczne do przygotowania odczynników biolo¬ gicznych stosowanych w laboratorium zwlaszcza jako czynnik porównawczy dla badania innych produktów, u których testowane jest dzialanie antykoagulujace w szczególnosci w zakresie hamowania czynnika Xa.Produkty rozpuszczalne w uzytej do frakcjonowania mieszaninie wody i rozpuszczal¬ nika organicznego ea pozbawione lub praktycznie biorac pozbawione dzialania antytrombo- cytowego. Produkty te moga byc odzyskane z frakcji rozpuszczalnej poprzez filtracje146 770 3 na zelu. Wykorzystanie Jednego z etapów chromatografii jonowymiennej pozwala na oddziele¬ nie z mieszaniny, jesli to jest pozedane, róznego typu oligosacharydów, a w szczególnos¬ ci lancuchów szesciosacharydowych obdarzonych zwiekszonym dzialaniem hamujacym wzgledem neoangiogenezy. Odzyskiwanie produktów z frakcji przeprowadza sie korzystnie na przyklad poprzez wytrecanie alkoholem i liofilizacje.Inne cechy charakterystyczne oraz zalety wynalazku przedstawiono w ponizszych przykladach. Przyklady I i II dotycza wytwarzania mieszanin MPS majecych stosunek miana YW do USP rzedu 4 zas przyklady III i IV dotycze dzialania produktów otrzymanych w kaz¬ dym z przykladów I i II, zas przyklad V dotyczy wyosobniania rozpuszczalnych produktów, praktycznie pozbawionych dzialania antytrombocytowego.Przyklad I. Sposób otrzymywania mieszanin MPS majecych stosunek mian YW/USP okolo 4.2 500 g heparyny iniekcyjnej w postaci- soli sodowej sporzedza sie roz¬ twór w 4500 ml wody zdemineralizowanej w temperaturze 18°C. Stosunek YW/USP uzytej he¬ paryny jest bliski 1, zas miana te wykazuje wartosc rzedu 160-170. Otrzymany roztwór zakwaszono stezonym kwasem solnym do wartosci pH 2,5 razy silnym mieszaniu, nastepnie dodano 15 g azotynu sodowego, rozpuszczonego w 300 ml wody. Wartosc pH mieszaniny reak¬ cyjnej doprowadzono stezonym kwasem solnym ponownie do 2,5 i calkowite objetosc roztwo¬ ru do 5000 ml. Nastepnie odstawiono na przeciag 45 minut, po czym sprawdzono na obecnosc pozostalych jonów azotynowych w roztworze reakcyjnym, np. za pomoce papierka wskazni¬ kowego nasyconego jodkiem potasu i skrobie /wywolanie zabarwienia niebiesko-fioletowe - go w obecnosci jonów NO"/. Reakcje kontynuowano az do zupelnego zaniku jonów azotyno¬ wych i braku reakcji z papierkiem jodoskrobIowym, przeprowadzajec kontrole co 3 lub 4 minuty. Negatywne wyniki kontroli wskazuje, ze reakcje nalezy uwazac za zakonczone. Za pomoce stezonego wodorotlenku sodu podwyzszono nastepnie wartosc pH roztworu do 10 i do¬ dano 5 g czteroborowodorku sodu. Roztwór mieszano w ciegu 15 godzin. Nieprzereagowany czteroborowodorek sodu rozlozono przez obnizenie wartosci pH do 3,0 stezonym kwasem solnym.Roztwór, mieszano w ciegu 15 minut, a nastepnie zobojetniono stezonym wodorotlen¬ kiem sodu do wartosci pH 7,0. Produkty reakcji wytrecono przez dodanie 10 litrów etano¬ lu. Po 48 godzinach odstawania prudkt zdekantowano i usunieto warstwe wierzchnie. Osad rozpuszczono ponownie w 9 litrach wody zdemineralizowanej. Dodano 100 g chlorku sodo¬ wego i stezonym kwasem solnym zakwaszono do wartosci pH 3,8. Za pomoce zdemineralizowa¬ nej wody objetosc doprowadzono dokladnie do 10 litrów i energicznie mieszajec dodano 10 litrów etanolu, po czym pozostawiono do odstania na przecieg 48 godzin. Warstwe gór¬ ne usunieto, zebrano osad, przemyto go etanolem, rozdrobniono i osuszono pod zmniej¬ szonym cisnieniem.Uzyskano 230 g produktu o nastepujecych cechach charakterystycznych: miano USP * ¦52jm/mg, miano Yin-Wesslera * 225 jm/mg, srednia masa czesteczkowa * 4000 do 5000.Przyklad II. Sposób otrzymywania frakcji MPS majecych miano YW do USP wy¬ noszacy okolo 4. 5000 g heparyny iniekcyjnej rozpuszczono w temperaturze 18°C w 45 lit¬ rach wody zdemineralizowanej, postepujec w sposób podobny jak w przykladzie I, ale mno- zec ilosci odczynników przez 10, a mianowicie dodano roztwór 150 g azotynu sodowego w 3 litrach wody, doprowadzono objetosc mieszaniny reakcyjnej do 50 litrów, dodano 50 g czteroborowodorku sodu, wytrecono za pomoce 100 litrów etanolu, ponownie rozpuszczono w 90 litrach wody, dodano 1000 g chlorku sodowego, doprowadza objetosc koncowe do 100 litrów i wreszcie dodano 100 litrów etanolu.Uzyskano w ten sposób 2230 g produktu o nastepujecych cechach charakterystycz- mych: miano USP » 54 jm/mg, miano Yin-Wesslera * 232 jm/mg, srednia masa czesteczkowa = = 4000 do 5000.Produkty reakcji odzyskano przez dodanie 10 litrów etanolu, odstawienie na przecieg 48 godzin, dekantacje i usuniecie warstwy górnej. Osad rozpuszczono ponownie w 9 litrach wody zdemineralizowanej, dodano 100 g chlorku sodowego i stezonym kwasem solnym zakwa¬ szono do wartosci pH 3,8. Nastepnie doprowadzono objetosc dokladnie do 10 litrów za pomoce zdemineralizowanej wody i nieszajec energicznie dodano 10 litrów etanolu.4 146 770 Pozostawiono do odstania na przecieg 48 godzin, po czym usunieto warstwe górne, a osad przemyto etanolem, rozdrobniono i osuszono pod zmniejszonym cisnieniem.Uzyskano 230 g produktu o nastepujecych cechach charakterystycznych: miano USP ¦ « 52 jm/mg, miano Yin-Wesslera - 225 Jm/mg, srednia masa czesteczkowa - 4000 do 5000.W ponizszym przykladzie III przedstawiono wyniki prób farmakologicznych przepro¬ wadzonych z produktem z przykladu I.Przyklad III. Badanie in vitro dzialania produktów z przykladu I. Na rysunku przedstawiono krzywe otrzymane wyniku badania in vitro zmian czasów koagulacji wywolanych w plazmie krwi ludzkiej wzrastajecymi dawkami handlowej heparyny oraz pro¬ duktu z przykladu I. W próbach odpowiadajecych wynikim podanym na figurach 3 i 4 stoso¬ wano plazme pozbawione plytek krwi i zubozone w czynnik XI. Mianowicie, krzywe te poda¬ je w sekundach zmiany czasów trombiny /fig. 1/ kefaliny-kaolinu /fig. 2/, koagulacji w obecnosci stezonej tromboplastyny /fig. 3/ oraz rozcienczonej tromboplastyny /fig. 4/ wywolane badanymi produktami to znaczy produktem z przykladu I /krzywa al, a2, a3 i a4/ oraz heparyne /krzywe bl, b2, b3 i b4/» w zaleznosci od uzytych poszczególnych dawek.Czasy trombiny oraz czasy kefaliny-kaolinu stanowie typy pomiaru odzwierciedla- jecego raczej dzialanie badanych preparatów na zahamowanie aktywowanego czynnika XI i ogólne koagulacje. Badanie krzywych z fig. 1 i 2 wykazuje, ze MPS otrzymane sposobem wedlug wynalazku wywieraje dzialanie wyraznie bardziej slabsze niz dzialanie heparyny na zahamowanie aktywacji protrombiny i w zakresie koagulacji ogólnej. Figury 3 14, bedece reprezentatywnymi dla zjawisk bardziej bezposrednio zwiezanych z kolej noscie reakcji enzymatycznych, charakterystycznych dla koagulacji zewnetrznej /zwlaszcza przy wzglednej nieobecnosci czynnika XIa/ wykazuje korzystne dzialanie MPS otrzymanych spo¬ sobem wedlug wynalazku w porównaniu z dzialaniem heparyny.Przyklad IV dotyczy wyników prób in vlvo, przeprowadzonych na królikach z MPS z przykladu II.Przyklad IV. Badania dzialania antytrombocytowego produktu z przykladu II na króliku. Podawanie 500 jednostek YW królikowi wywoluje powazne dzialanie anty-Xa, podczas gdy ogólne dzialanie antykoagulujece pozostaje wzglednie slabe. Po dwóch go¬ dzinach od chwili podania dzialanie YW jest rzedu 0,88 jm/mg podczas gdy czas kefaliny- -kaolinu wynosi 0,09 jm/mg.Próby in vitro oraz in vivo wykazuje wiec znacznie bardziej selektywne dzialanie MPS otrzymanych sposobem wedlug wynalazku, zwlaszcza w zakresie zahamowania czynnika Xa, niz w przypadku heparyny.Przyklad. V.. Sposób otrzymywania frakcji i MPS praktycznie pozbawionych dzialania antytrombocytowego. Frakcje rozpuszczalne z przykladu I, zawierajece lancu¬ chy o 2-14 jednostkach, potraktowano dodatkowo etanolem, powodujec wytracenie sie osa¬ du. Osad ten oddzielono od frakcji rozpuszczalnej y, stanowiece mieszanine utworzone glównie z lancuchów majecych 6, a najwyzej 8 jednostek i wykazujece miano YW nizsze od 70 mj/ng i miano USP nizsze od 5 jm/mg. Frakcje te przeseczono znane metode przez zel, otrzymujec mieszaniny szesciosacharydowe, pozbawione praktycznie calkowicie dzialania antykoagulujecego i aktywnosci YW.Przyklad VI. Dzialanie mieszanin szesciosecharydowych y i z na neoangio- geneze. Próby in vitro odno6zece sie do dzialania przeciwko angiogenezie przeprowadza¬ no na przeponie chorioallantoinowej szesciodniowych zarodków kurczet hodowanych na plyt¬ kach Petriego. Formowano pastylki mieszajec 5 jag hydrokortyzonu z 10 yul metylocelulozy i dodajec mieszaniny! z w dawkach 5 yug - 100 jjg. Utworzone pastylki suszono, a nastep¬ nie umieszczano na przeponie chorioallantoinowej do której przywieraly. Do kazdej pró¬ by stosowano 4 jajka. Po 48 godzinach Inkubacji badano obecnosc etref pozbawionych naczyn* Stwierdzono znaczne zmniejszenie stref naczyniowych. Wyniki te otrzymano bardzo wyraznie przy uzyciu Jedynie 6 yug testowanych produktów.146 770 5 Przyklad VII* Dzialania mieszaniny ezesciosacharydowej z na czarniakach typu B16 u myszy. Próby prowadzono na myszach C57 BL/6, bedecych nosicielkami czerniaków B16. Leczenie przeprowadzono w ciegu 15 dni* Kazdej myszy podawano dwa razy dziennie poprzez zastrzyk podskórny 0,15 mg nleszanln szesciosacharydów i octanu kortyzonu w daw¬ kach malejecych od 250 mg/kg/dzlen do 40-50 mg/kg/dzlen* Po uplywie 15 dni stwierdzono zahamowanie rozwoju nowotworowi zaobserwowano nawet korzystne regresje tychze nowotworów.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania mukopolisacharydów o sredniej masie czasteczkowej 4000-5000, majacych stosunek YW/USP mniejszy niz 10 i miano Yin-Wesslera /YW/ okolo 180-200 Jm/mg, znamienny tym, ze z mukopolisacharydów o masie czasteczkowej 2000-8000, ma¬ jacych stosunek YW/USP wynoszecy co najmniej 10 i miano YW okolo 200-250 jm/mg, sporza¬ dza sie roztwór o stezeniu 5% wagowo/objetosciowych w wodzie zawierajecej 10 g chlorku sodowego na 1 litr i ustala wartosc pH roztworu nizsze od 4, a nastepnie wytreca pro¬ dukt rozpuszzalnikiem organicznym, takim jak alkohol* 2* Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tym, ze procesowi poddaje sie mukopolisacharydy maja.ce na krancu redukujecym ugrupowanie o strukturze 2,5-anhydroman- nowej, korzystnie takie jak w 2,5-anhydromannozie, 2,5-anhydromannicie lub w kwasie 2,5-anhydromannowym*146 770 i«f 2SJ- sL " « v w ,4 R6.4 « 0—0—«T~TS" ¦w Pracownit Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 eaz.Gena 400zl PL PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania mukopolisacharydów o sredniej masie czasteczkowej 4000-5000, majacych stosunek YW/USP mniejszy niz 10 i miano Yin-Wesslera /YW/ okolo 180-200 Jm/mg, znamienny tym, ze z mukopolisacharydów o masie czasteczkowej 2000-8000, ma¬ jacych stosunek YW/USP wynoszecy co najmniej 10 i miano YW okolo 200-250 jm/mg, sporza¬ dza sie roztwór o stezeniu 5% wagowo/objetosciowych w wodzie zawierajecej 10 g chlorku sodowego na 1 litr i ustala wartosc pH roztworu nizsze od 4, a nastepnie wytreca pro¬ dukt rozpuszzalnikiem organicznym, takim jak alkohol*

2. * Sposób wedlug zastrz* 1, znamienny tym, ze procesowi poddaje sie mukopolisacharydy maja.ce na krancu redukujecym ugrupowanie o strukturze 2,5-anhydroman- nowej, korzystnie takie jak w 2,5-anhydromannozie, 2,5-anhydromannicie lub w kwasie 2,5-anhydromannowym*146 770 i«f 2SJ- sL " « v w ,4 R6.4 « 0—0—«T~TS" ¦w Pracownit Poligraficzna UP PRL. Naklad 100 eaz. Gena 400zl PL PL PL PL PL