JPS61101502A - 抗トロンビン活性の高いムコ多糖組成物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は大きな抗トロンビン活性を有するムコ多糖組成
物の製法に係る。

周知の如くこの種の組成物はアルコール抽出により、又
は化学的もしくは酵１ｇＫよる解重合によってへ、？ｌ
Ｊンから形成されてきた。

通常これらの方法は、鎖が約２５から最高３０までのパ
ターンを含み且つイン・ウニスラー（ＹｔｎＷｓｓｓｌ
ａｒ　”　ＹＷ　）力価で測定される抗Ｘａ作用がヘパ
リンより大きく、ＵＳＰ力価で表わされる全体的抗凝血
作用がヘパリンより小さくて殆んどゼロに近いような極
めて低い値さえ示し得るムコ多糖即ちＭＰＳからなる組
成物又は分画を製造せしめる。

これらの生成物は凝血プロセスで用いられる成る種のス
テップに対して、ヘパリンより特異性の高い作用を及ぼ
すという利点を有する。

所定の処理の場合、生成物の選択はＹＷ力価の値とＹＷ
力価対ＵＳＰ力価の比とに応じて行なわれる。

そこで本発明者等は特にＹＷ力価とＹＷ力価対ＵＳＰ力
価の比とに関して所定のプロフィルを示す組成物を容易
に形成せしめるような方法を研究した。研究の結果本発
明者等は、特定の条件下で操作すれば前述の如き生成物
を他のＭＰＳ組成物から分離し得ることを確信するに至
った。

従って本発明はより高い抗トロンビン作用を持りｂｘｐ
ｓ組成物を得るための下記の如き新規製法を提供する。

この方法の基本はこれら組成物を含有する別のＭＰＳ組
成物を処理することにあり、この方法を使用すれば有用
性の高い生成物を容易に得ることができる。

本発明の方法の峙琶は、分子量（ＰＭ）が約１８００〜
５０００ダルトンであシＹＷ力価とＹＷｄＵＳＰ力価比
とがヘパリンより大き贋ようなＭＰＳｆＡの大部分で後
或されたＭＰＳ組底組成少なくとも１回分別処理して、
これら組成物からＰＭ約２０００以下の鎖と、分子量は
より大きいが硫酸化￥々マ誌掠劇靭のｔ負０手廁顧イヒ
牽より小さい鎖とを少なくとも大部分選択的に分離し、
最早これらの鎖を含まない分画を回収することＫある。

このような分画はＵＳＰ力価が出発組成物より大きく、
ＹＷ力価対ＵＳＰ力価の比が出発組成物よりは小さいか
へ／９リンよりは大きい。

分別処理は好ましくは、ａ）無機塩含有水とｂ）実機溶
媒との混合物を用いて行なう。この溶媒は所望の生成物
の少なくとも大部分がその中で不溶性を示し選択的に沈
殿するような溶剤から迅択する。

前記無機塩及び溶媒の相対比は所望のＭＰＳ鎖を沈殿さ
せるべく媒質のＰＨに応じてＨｏｇする。

本発明の好ましい方法では前記有機溶媒が有利にはアル
コール溶媒、特にエタノールである。

別の好ましい方法では使用有機溶媒に混和し得る塩、例
えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムを前記無機塩とし
て使用する。

更に別の好ましい方法では前記反応混合物のｐｌ（をｎ
！ｉ　ｐＨＩＣ該当する値、より特定的には４以下のｐ
Ｈに調整する。

本発明の好ましい実施例では分別に使用されるＭＰＳ組
成物がｆｉ＋約１８００〜８０００の分子量。

（２）少なくとも約ｌＯのＹＷ対ＵＳＰ力価比、（３）
約使用するＭＰＳ組成物は亜硝酸の如き化学＋”ａｉの
作用下でヘノｑりンを部分的に解重合させる方法によっ
て得ると有利である。特に、１９７８年１１月６日付仏
ｌ特許第７８３１３５７号明細書に対する１９８０年３
月２０日付第２追加特許出願＋’ｉ’、　８００６２８
２号明細書に本出願人によって記載されている方法を使
用し得る。

有利には、本出願人名！１９８）年４月１０日付仏国特
許出願第８）　０７２８３号ＦＡ細書に記÷、シの如き
解１合反応の自動論姫に基づく前述タイプの解重合法を
使用するや この自動−１ｉ解重合の最も一般的な態様ではｐｈ約２
〜３．１利には２．５の水性媒質中でヘパリ／と亜硝酸
とを、へＡリン凝度が少なくとも約８亀愈−になシ且つ
亜硝酸のモル濃度が約０．０２〜０．１Ｍになるような
鰍で反応させ、亜硝酸の消耗によって一％−バリンの解
重合反応が停止したら有機溶媒により沈殿し得るタイプ
のＭＰＳ混合物ｆ、ｉｇｌ収する。

亜硝酸１は、有利には生物学的に許容し得るアニオンを
含む酸１例えば塩酸又は酢酸を亜硝酸の誘導体、特に塩
、エーテル塩いよ１特定的にはアルカリ金属塩又はアル
カリ土類金属塩、に加えることによりその場で生成する
。より特定的には亜硝酸ナトリウムを０．０３〜０．０
５Ｍのモル濃度で使用する。

本発明の方法の実施には（１０４０〜０．０４６Ｍ、よ
り特定的に紘約０．０４３ＭのＮａＮＯｘを使用するの
が好ましい。

その製法に起因してこれらＭＰＳ組成物は還元末端に２
，５−アンヒドロマンノ構造、好ましくａ２，５−アン
ヒドロマンノース、２．５−アンヒドロマンノ−ス又は
２，５−アンヒト四マンノン酸の中から選択した構造の
パターンを有する。

使用出発ＭＰＳ組成物は１０　ｆ／ｌのＮａＣ２を含有
する水中に５Ｓｐ／ｖで溶解する。

ｐＨを３．８に調整した後、最も大きい分子量を持ｌ及
・ジ／又１．Ｆ１糺阻〜を勿Ｑ最り高い硫酸電導・っ鎖
有棲楳事を有するＭＰＳを選択的に沈殿させる有機溶媒
を用いて前記ＭＰＳの分別処理を行なう。

有機溶媒はより特定的にはアルコール溶媒、特にエタノ
ールからなる。

分子量の小さい鎖及び硫酸塩率の小さい鎖を除去すると
ＵＳＰ力価のより大きいＭＰＳ分画が得られる。ＹＷ力
価は殆んど変らない。

沈殿時に回収されるＭＰＳ＃を酸物は一般的に、（１′
３４０００〜５０００ダルトン、’ｌ？に約４５００グ
ルトンには約４のＹＷｔｌＵｓｐ力価比とを有する鎖で
本質的に後或されるという特徴を有する。

これらの組成物は、また、出発組成物をへ／Ｑ＋）ンの
亜硝酸による解重合によって得た場合には２゜５−アン
上１冒マンノ構造のノｑターンで終わる鎖の大部分くよ
って後或される。

本発明の方法によって得られる組成物は。特に凝血のス
テップのうち成るものを特異的に制御できるようにする
生物学的活性を有する。

従ってこれらの組成物は、主として血栓病及び組織老化
の予防及び治療に使用し得る薬剤を製造する上で特に貴
重である。この種の薬剤は覆々の投与形態で且つ対象適
応症に関して通常用いられる薬用量で使用される。

本発明の方法で得られるムコ多糖組成物は、また、特に
Ｘａ因子抑制レベルでの抗凝血活性をテストしたい別の
生成物の研究で、主に比較対照として実験室で使用し得
る生物学的試薬を製造する上でも有用である。

分別に用いられる水／有機溶媒混合物中に溶解し得る生
成物は抗トロンビン活性を全く又は殆んど示さない。

これらの生成物は可溶分画をゲルで濾過することによっ
て回収し得る。イオン交換クロマトグラフィ処理を使用
すると、所望であれば該組成物から種々のタイプのオリ
ゴ糖、特にネオ血管形成に対して大きな抑制作用を示す
ヘキサｒ１鎖を分離することができる。

ｉＩＳ記分画からの前記生成物の回収は例えばアルコー
ルによる沈殿及び凍結乾燥などによって行なうと有利で
ある。

以下実施例を挙げて本発明の他の特徴及び利点を明らか
にする。尚、実施例１及び２は約４の１″Ｗ対ＵＳＰ力
価比を持つＭＰＳ＠成物の酸物に係り、実施例３及び４
は夫々実施例１及び２で得られた生成物の活性に係り、
実施例５は可溶分画から抗トロンビン活性を殆んど持た
ない生成物を得る方法に係る。

（舅１・余白） 実施例１：約４のＹＷＮＵＳＰ力価比を有するＭＰＳ組
成物の調法 ナトリウム塩形態の注入可能ヘパリン５００１をれら力
価の値は約１６０〜１７０である。

得られた溶液を激しく撹拌し、濃塩酸の添加【よってＩ
）Ｈを２，５にエイる。次いで水３００　ｍｌに溶解し
た亜硝酸ナトリウム１５．９を加える。亀塩酸により該
反応溶液のｐ）（を２．５に調整し、総体積１に５００
０−にする。４５分間反応させた後、例えば糊つけした
ヨードカリウム含浸試験紙を用いて前記反応溶液中の残
留亜硝酸イオンの有無を調べる（Ｎｏ！−イオンの存在
下では色が紫がかった青に変化）。

亜硝酸イオンが完全に消滅して糊つけヨード試験紙に反
応が見られなくなる１で、３〜４分毎に検査を行ないな
から反応を継続させる。

検葺結果が陰になれは反応は終了したと見なされる。反
応が終了したら旋ソーダを用いて溶ｈ１のｐＨを工０に
上け、５Ｆの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４：　
ｔ＠ｔｒａｈｙｄｒｕｒｏｂｏｒａｔｅ　ｄｅ　ｓｏｃ
ｌｉｍ　）を加える。

この溶液を１５時間攪拌する。

濃塩酸によりｐＨを３０に下げて、反応しなかった水素
化ホウ素ナトリウムを破壊する。この溶液を１５分間攪
拌し、次いで濃ソーダによりｐＨを７．０に再調整する
。

１０ノのエタノールを加えることにより反応生成物を回
収する。４８時間放置した後生成物のデカンテーション
を行なって上げみを除去する。

沈殿物を９１の脱鉄物質水中に再溶解する。塩化す）　
ＩＪウム１００　ＩＩを添加した後濃塩酸によって溶液
のｐＨを３．８に下ける。脱鉱物質水を用いて溶液量を
正確に１０１に調整し、激しく１５ｊ拝しながら１０ノ
のエタノールを加える。４８時間放置する。上置みをサ
イホンで吸上けて除去し、沈殿物を回収してエタノール
で洗浄し、粉砕した後真空下で乾燥させる。

下３ピの特性を持つ生成物がｚ３ｏｔｔ得られる。

ＵＳＰ力価＝　５２　ｕ　Ｉ　／　”？■力価＝２２５
ｕＩ／ｑ 平均分子ｆ　＝　４０００〜５０００　ｆル）　ｙ実施
例２：ＹＷ力価及びＵＳＰ力価を約４の比で有するへ４
ＰＳ分画の製法 ５０００　＃の注入可卵ヘパリンを４５ノの脱鉱物質水
に１８Ｃで溶解する。

実施例１と同様に、但し試薬量を１０倍にして、即ち −１５０Ｎの亜硝酸ナトリウムを３ノの水に溶解し。

一反応溶液の量を５０ノに調整し、 −ｓ　ｏ　ｙの水素化ホウ累ナトリウムを加え、−１０
０４のエタノールを用いて沈殿させ、−９０ノの水く再
溶解し、 −１０００，９の塩化ナトリウムを加え、−最終量を１
００ノにｆＪ４整し、 −最後に１００ノのエタノールを加えて操作を行なう。

その結果下記の如き特徴を持つ生成物が２２３０１得ら
れる。

ＵＳＰ力価＝５４　ｕＩ／ｓｖ 冑力価工２３２ｕＩ／） 平均分子量＝　４０００〜５０００グルトン１０ノのエ
タノールを加えて反応生成物を回収し、４８時間放置し
た後デカンテーションによって上澄みを除去する。

沈殿物を９ノの脱鉱物質水に再溶解する。塩化ナトリウ
ム１００　＃を加えた後、製塩ａＫよって該溶液の９Ｈ
を３．８に下げる。脱鉱物質水を用いて債を正確に１０
１に調整し、激しく攪拌しなガニら１０ノのエタノール
を加える。４８時間放置した後上澄みをサイホンで吸上
ヴて除去する。沈殿物を回収し、エタノールで洗浄し、
粉砕後真空下で乾燥させる。

下記の特徴を持つ生成物が２３１１（ａられる。

ＵＳＰ力価＝５２ｕＩ／ｑ ＹＷ力価＝２２５ｕＩ／： 平均分子Ｊｉ＝４０００〜５００ｏミニ４０００〜５０
０ｏグルトフ例１の生成物を用いて行なった薬理学テス
トの結果を述べる。

実施例３：実施例ｌの生成物の活性のインビトロ検査。

市販ヘパリン及び実施例１の生成物の儀を漸増するとと
Ｋよりヒト血漿中で誘発される凝血時間の変化をインビ
）ｏで調べて得られた曲線を第１図から第４図番て示す
。

第３図及び第４図に示した結果に対応するテストでは、
血小板を除去した；＝考Ｘ　Ｉ因子が少ない血漿を使用
した。

トロンビン時間（ｍ１図）及びセフ７リンーカオリン時
間（第２図）は双方共夫々活性化第１因子の抑制及び全
体的凝血に関するテスト調製物の作用を主として反映す
るタイプの−り定値である。

第１図及び第２図の曲線から明らかなように１本発明の
ＭＰ８はプロトロンビンの活性化の抑制、且つ全体的凝
血レベルに胸してはヘパリンより明らかに小さい効果を
及ばず。外因性凝血（特にＸｌａ因子が相対的に存在し
ない場合）の特徴でおる一連の酵素反応により直接的Ｖ
Ｃ関連する現象を表わす第３図及び第４図は本発明のＭ
ＰＳがへ、ｅ１７ノより有利な効果をもたらすことを明
示している。

次の実施例４はウサギを用いて実施例２の生成物のイン
ビボ検査を行なった場合の結果を示す。

実施例４：ウサギにおける実施例２の生成物の抗トロン
ビン活性。

ｓｏｏ　ｕ　ｙｗをウサギに投与すると大きな抗）（ａ
活性が得られるが、全体的抗凝血作用は比較的小さいま
まである。

投与後２時間目のＹＷ活性は約０．８８ｕ／−であるか
、セファリンー力オリ°ン時間は約０．０９ｕＩ／−で
ある。

従ってこれらインビトロテスト及びインビトロテストは
本発明のＭＰＳが特にＸａ因子抑制レベルでへ７１７ン
より明らかに選択的な活性を示すことを表わしている。

実施例５．抗トロンビン活性を実質的に有さないＭＰＳ
画分の判決 実施例１の可溶画分を回収する。この画分は２個〜１４
個の／にターンからなる鎖を有する。

この画分を更にアルコール分別処理して沈殿物と可溶画
分とに分け、該沈殿物を分離し、該可溶画分から組成物
ｙを回収する。この組成物は本質的に６〜８個のパター
７までの鎖からなり、７０以下のＹＷ力価と５以下のＵ
ＳＰ力価とを有する。

前記組成物ｙを従来の方法に従いデルによって炉遇し、
ヘキサ糖組成物２を回収する。この種の組成物は全体的
抗凝血活性とＹＷ活性とを実質的に全く示さない。

実施例６：組成物ｙ及び２のネオ血管形成に対する作用 ペトリ皿で６日間ｉ＠養したニワトリ胎児の漿尿膜を用
いて抗血管形成活性に関するインビトロテストを行なっ
た。

５μＩのヒドロコルチゾンを１０μノのメチルセルロー
スに混入し、次いで組成物ｙ及び２を５μ９〜１００μ
Ｉの用量で加えてベレットを形成する。

これらペレットを乾燥させた後前記漿尿膜上に配置して
付着させる。各テスト毎に４個の卵を使用する。

４８時間インキュベートした後無血管ゾーンの存在を調
べる。血管ゾーンの大幅な縮小が観察される。これらの
結果は僅か６ｔｈｌｉのテスト生成物で顕著に生じる。

実施例７：マウスのＢ１６型メラノーマに対するヘキサ
多糖組成物２の作用 Ｂ１６メラノーマを有するＣ５７ＢＩ、／６マウスを用
いてテストを行なう。

処理は１５日に惺って行なう。各マウス毎に一日２回の
皮下注射により０．１５ＩＩＩＦのへキサ多糖組成物と
酢酸コルチゾンとを投与する。酢酸コルチゾンの用量は
処理期間中に２５０岬／−７日から４０〜５０岬／に９
７日まで漸減させる。１５日間の処理終了後、＠劫の成
長停止が確認される。

有利なことに１　これら原動の退行さ、、を観察される
。

【図面の簡単な説明】

第１図はテスト生成物即ち第１案施例の生成物（曲線ａ
ｌ、ａ２．ａ３及びａ４）及びへ／ｅリン（曲線ｂ１．
ｂ２．ｂ３及びｂ４）によってＨＬ４されるトロンビン
時間（秒）の変化を夫々の使用量の関数として示すグラ
フ、第２図は第１図と同条件下のセファリン−カオリン
時間の変化を示すグラフ、第３図は濃縮トロンボプラス
チンの存在下での凝血時間変化を前記条件で示すグラフ
、第４図は希釈トロンボプラスチンの存在下での凝血時
間変化を前記条件で示すグラフである。 出輿入　　刃γイヱスアー 代珂ス　責庁ト用　口　義　雄

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗トロンピン活性の高いムコ多糖即ちＭＰＳの製
   法であり、約１８００〜８０００ダルトンの分子量とヘ
   パリンより大きいＹＷ力価及び ＹＷ対ＵＳＰ力価比とを有するＭＰＳ鎖の大部分からな
   る組成物を少なくとも１回の分別処理にかけて、これら
   組成物から分子量約２０００以下の鎖と分子量はより大
   きいが硫酸化率が該組成物の鎖の平均硫酸化率より小さ
   い鎖とを少なくとも大部分分離し、これら鎖を最早有さ
   ない分画、即ちＵＳＰ力価が出発組成物より大きくＹＷ
   対ＵＳＰ力価比が出発組成物よりは小さいがヘパリンよ
   りは大きい分画を回収することを特徴とする製法。
2. （２）無機塩含有水と所望の生成物の少なくとも大部分
   を選択的に不溶状態で保持し得る有機溶媒との混合物を
   用いて前記分別処理を行なうことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）平均分子量が４０００〜５０００ドルトン、特に
   約４５００であり、ＹＷ対ＵＳＰ力価比が約１０以下、
   好ましくは約６〜３、より特定的には約４であり、ＹＷ
   力価が約１８０〜２００ｕ／ｍｇであるような鎖からな
   るＭＰＳを選択的に沈殿せしめる有機溶媒を用いて前記
   分別処理を行なうことを特徴とする特許請求の範囲第２
   項に記載の方法。
4. （４）前記有機溶媒がアルコール溶媒、より特定的には
   エタノールであることを特徴とする特許請求の範囲第２
   項又は第３項に記載の方法。
5. （５）使用無機塩が特に使用する有機溶媒に混和し得る
   塩、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムからなるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の方法。
6. （６）反応混合物のｐＨを酸ｐＨに対応する値、より特
   定的には４以下のｐＨに調整することを特徴とする特許
   請求の範囲第２項から第５項のいずれかに記載の方法。
7. （７）分別処理に使用されるＭＰＳ組成物が少なくとも
   約１０のＹＷ対ＵＳＰ力価比と約２００〜２５０ｕ／ｍ
   ｇのＹＷ力価とを有することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項から第６項のいずれかに記載の方法。
8. （８）２０ｇ／ｌのＮａＣｌを含むＭＰＳ組成物を５％
   ｐ／ｖで水に溶解し、ｐＨを３．８に調整した後或る量
   のエタノールを加えて分別処理を行ない、形成された沈
   殿物を回収することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。
9. （９）出発ＭＰＳ組成物が還元末端に好ましくは２，５
   −アンヒドロマンノース、２，５−アンヒドロマンニト
   ール又は２，５−アンヒドロマンノン酸の中から選択し
   た２，５−アンヒドロマンノ構造のパターンを有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項から第８項のいず
   れかに記載の方法。