CS270420B2 - Method of mucopolysaccharides production with increased antitrombotic activity - Google Patents
Method of mucopolysaccharides production with increased antitrombotic activity Download PDFInfo
- Publication number
- CS270420B2 CS270420B2 CS857467A CS746785A CS270420B2 CS 270420 B2 CS270420 B2 CS 270420B2 CS 857467 A CS857467 A CS 857467A CS 746785 A CS746785 A CS 746785A CS 270420 B2 CS270420 B2 CS 270420B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- mixture
- chains
- usp
- titer
- mucopolysaccharide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby směsí mukopolysacharidů se zvýšenou antitrombotickou aktivitou.The present invention relates to a process for the preparation of mixtures of mucopolysaccharides with increased antithrombotic activity.
Je znáno, že směsi tohoto druhu lze získávat z heparinu extrakcí alkoholem nebo též depolymerací chemickým nebo enzymatickým postupem.It is known that mixtures of this kind can be obtained from heparin by alcohol extraction or also by depolymerization by chemical or enzymatic processes.
Obecně umožňují tyto postupy získávat směsi nebo frakce tvořené mukopolysacharidy (MPS), jejichž řetězce obsahují maximálně 25 až 30 skupin a mají vyšší aktivitu anti-Xa, měřeno titrem Yin Wessler (YW), než heparin, a nižší celkovou antikoagulační aktivitu, vyjádřenou titrem USP, než heparin, přičemž tento titr může mít sám o sobě velmi nízkou, ba prakticky nulovou hodnotu.In general, these processes allow to obtain mucopolysaccharide (MPS) mixtures or fractions whose chains contain no more than 25 to 30 groups and have a higher anti-Xa activity as measured by Yin Wessler (YW) titer than heparin and lower total anticoagulant activity as USP titer than heparin, which titer may in itself have a very low, or even zero, value.
Tyto produkty, vykazující specifičtější účinek než heparin v jistých etapách koagulačního postupu, nabývají nyní na významu.These products, which exhibit a more specific effect than heparin at certain stages of the coagulation process, are now gaining importance.
Pro danou léčbu se volí produkt podle svého titru YW a poměru svých titrů YM a USP.For a given treatment, the product is chosen according to its YW titer and the ratio of its YM to USP titers.
Se zřetelem к tomu, co bylo uvedeno, byly hledány prostředky, které by umožňovaly snadno získávat směsi odpovídající daným požadavkům, zejména pokud jde o jejich titr YW a jejich poměr titru YW к titru USP. Uskutečněné práce vedly ke konstatování, že při postupu za jistých podmínek lze izolovat takové produkty z jiných výchozích směsí mukopolysacharidů.In view of what has been said, means have been sought which make it possible to obtain easily the compositions corresponding to the requirements, in particular as regards their YW titer and their YW titer to USP titre ratio. The work carried out has led to the conclusion that, under certain conditions, such products can be isolated from other mucopolysaccharide starting mixtures.
Cílem tohoto vynálezu je tudíž získat nový způsob výroby směsi mukopolysacharidů se zvýšenou antitrombotickou aktivitou, který by spočíval ve zpracování jiné směsi mukopolysacharidů, jež je obsahuje, kterýžto způsob by uzmožňoval snadno získávat velmi užitečné produkty.It is therefore an object of the present invention to provide a novel process for the production of a mucopolysaccharide mixture with increased antithrombotic activity by treating another mucopolysaccharide mixture containing them, which method makes it possible to obtain very useful products easily.
Předmětem tohoto vynálezu je tudíž způsob výroby mukopolysacharidů se zvýšenou antiч trombotickou aktivitou, které jsou tvořené řetězci o průměrné molekulové hmotnosti 4 000 až 5 000 daltonů, zejména řádu 4 500, a mají poměr titrů YW/USP nižší nebo rovný 10, s výhodqu 6 až 3, zejména pak 4.Accordingly, it is an object of the present invention to provide mucopolysaccharides with increased anti-thrombotic activity consisting of chains having an average molecular weight of 4,000 to 5,000 daltons, particularly of the order of 4,500, and having a YW / USP titre ratio of less than or equal to 10, preferably 3, in particular 4.
i. . Podstata vynálezu je v tom, že se směsi, které jsou tvořené z řetězců mukopolysacha- ridů s molekulovou hmotností 1 800 až 8 000 daltonů a které mají titr YW a poměr titrůi. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is characterized in that mixtures consisting of mucopolysaccharide chains having a molecular weight of 1,800 to 8,000 daltons and having a YW titer and a titer ratio
YW/USP vyšší než heparin, podrobí alespoň v jedné etapě frakcionování pomocí směsi vody obsahující minerální sůl a organické rozpouštědlo, v němž alespoň více než polovina poΊ * žadovaných produktů je selektivně nerozpustná, přičemž se z výchozí směsi odstraní ales4 poňvíce než polovina řetězců mukopolysacharidů o molekulové hmotnosti nižší než 2 000YW / USP higher than heparin, subjected to at least one stage fractionation with a mixture of water containing a mineral salt and an organic solvent in which at least more than half of the desired products are selectively insoluble, with at least at least half of the mucopolysaccharide chains removed A molecular weight of less than 2 000
T a řetězců o vyšší molekulové hmotnosti, avšak majících nižší stupeň sulfatace než je průJ měrný počet řetězců směsi, načež se frakce zbavené těchto řetězců, které mají poměr titrů YW/USP nižší než výchozí směsi, avšak vyšší než heparin, u něhož je titr USP vyšší než u výchozích směsí, oddělí.T and chains of higher molecular weight but having a lower degree of sulphation than the average number of chains of the mixture, after which the fractions are stripped of these chains having a YW / USP titre ratio lower than the starting mixture but higher than heparin for which the USP titre higher than the starting mixtures, separated.
' Jako organické rozpouštědlo se při postupu podle tohoto vynálezu používá s výhodou alkohol, zejména ethanol.The organic solvent used in the process according to the invention is preferably an alcohol, in particular ethanol.
- Jako minerální sůl se při postupu podle vynálezu používá sůl, která je mísitelná sThe mineral salt used in the process according to the invention is a salt which is miscible with
... použitým organickým rozpouštědlem, jako je chlorid sodný nebo chlorid draselný.... the organic solvent used, such as sodium chloride or potassium chloride.
Podle výhodného provedení způsobu podle tohoto vynálezu se hodnota pH reakční směsi upraví na hodnotu odpovídající kyselému prostředí, zejména na hodnotu pH nižší než 4.According to a preferred embodiment of the process according to the invention, the pH of the reaction mixture is adjusted to a value corresponding to an acid medium, in particular to a pH of less than 4.
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se к frakcionování používá í směsí mukopolysacharidů s poměrem titrů YW/USP alespoň 10 a s titrem YW kolem 200 ažAccording to a further preferred embodiment of the process according to the invention, mucopolysaccharide mixtures having a YW / USP titre ratio of at least 10 and a YW titre of about 200 to 200 are used for fractionation.
250 m/mg.250 m / mg.
Jiné výhodné provedení způsobu podle vynálezu předpokládá, že se do roztoku ve vodě uvádí 5 obj. % směsi mukopolysacharidů obsahující 10 g/1 chloridu sodného a po upravení pH na hodnotu 3,8 se uskutečňuje frakcionování přidáním jednoho objemu ethanolu, načež se vzniklá sraženina oddělí.Another preferred embodiment of the process of the invention envisages that 5 vol% of a mucopolysaccharide mixture containing 10 g / l of sodium chloride is introduced into water and after adjusting the pH to 3.8, fractionation is carried out by adding one volume of ethanol, whereupon the precipitate formed .
CS 270 420 B2CS 270 420 B2
Při dalším jiném výhodném provedení způsobu podle tohoto vynálezu se používají výchozí směsi mukopolysacharidů, které mají ke konci redukce skupinu se strukturou 2,5-anhydromanno, vybranou s výhodou ze skupin zahrnujících 2,5-anhydromannosu, 2,5-anhydromannitol nebo 2,5-anhydromannovou kyselinu.In another further preferred embodiment of the process according to the invention, starting mixtures of mucopolysaccharides are used which have, at the end of the reduction, a group having a structure of 2,5-anhydromanno, preferably selected from the group consisting of 2,5-anhydromannose, 2,5-anhydromannitol or 2,5 -anhydromannic acid.
Titru Yin a Wessler se používá jako míry aktivity anti-Xa podle autorů Yin E.T., Wessler 8., Butler J.V., viz Lab. Clin. Med. 1973, 81, str. 298 až 310.The Yin and Wessler titers are used as measures of anti-Xa activity according to Yin E.T., Wessler 8., Butler J.V., see Lab. Clin. Copper. 1973, 81, pp. 298-310.
Používané směsi mukopolysacharidů se s výhodou získávají částečnou depolymerací heparinu účinkem chemického činidla, jako je kyselina dusitá. Zde lze odkázat zejména na postup popsaný ve francouzském patentu č. 2 488 646, který je dodatkovým patentem к patentu č. 2 440 376.The mucopolysaccharide mixtures used are preferably obtained by partial depolymerization of heparin by the action of a chemical agent such as nitrous acid. Here, reference is made in particular to the procedure described in French Patent No. 2,488,646, which is an additional patent to Patent No. 2,440,376.
Podle jednoho výhodného provedení způsobu podle tohoto vynálezu se používá při depolymeraci postupu uvedeného druhu, avšak na bázi samovolné regulace depolymerační reakce, jak je popsáno ve francouzském patentu č. 2 503 714.According to a preferred embodiment of the process according to the invention, it is used in the depolymerization of a process of this kind, but based on the self-regulation of the depolymerization reaction, as described in French Patent No. 2,503,714.
Obecně se při samovolně regulovatelné depolymerací nechá reagovat heparin s kyselinou dusitou ve vodném prostředí při pH v rozsahu 2 až 3, s výhodou při 2,5, v takových množstvích, kdy koncentrace heparinu je alespoň přibližně 0,02 až 0,1 M, a po samočinném ukončení depolymerační reakce vlivem spotřebování kyseliny dusité se znovu získá směs mukopolysacharidů, které se srážejí organickým rozpouštědlem.Generally, in a self-regulating depolymerization, heparin is reacted with nitrous acid in an aqueous medium at a pH in the range of 2 to 3, preferably 2.5, in such amounts that the heparin concentration is at least about 0.02 to 0.1 M, and after the depolymerization reaction is automatically terminated due to the consumption of nitrous acid, a mixture of mucopolysaccharides is recovered which is precipitated by an organic solvent.
Kyselina dusitá vzniká in sítu přidáním kyseliny, která obsahuje s výhodou biologicky vhodné anionty, jako je kyselina chlorovodíková nebo kyselina octová, к derivátu kyseliny dusité, zejména к dusitanu, etherátu a především pak к dusitanu, alkalického kovu nebo к dusitanu kovu alkalické zeminy. Používá se především dusitan sodný v molárním poměru 0,03 až 0,05 M.Nitrous acid is formed in situ by the addition of an acid which preferably contains biologically suitable anions, such as hydrochloric acid or acetic acid, to a nitrous acid derivative, in particular to a nitrite, an etherate, and in particular a nitrite, an alkali metal or an alkaline earth nitrite. Sodium nitrite is preferably used in a molar ratio of 0.03 to 0.05 M.
Při provádění způsobu podle tohoto vynálezu je výhodné používat dusitanu sodného v molárním poměru 0,040 až 0,046 M, především pak v molárním poměru 0,043 M.In carrying out the process according to the invention, it is advantageous to use sodium nitrite in a molar ratio of 0.040 to 0.046 M, in particular in a molar ratio of 0.043 M.
Podle způsobu přípravy obsahují směsi mukopolysacharidů ke konci redukce skupinu se strukturou 2,5-anhydromanno, jak již bylo uvedeno.According to the method of preparation, the mucopolysaccharide mixtures contain a group with the structure 2,5-anhydromanno at the end of the reduction as mentioned above.
Po upravení pH na hodnotu 3,8 se frakcionování mukopolysacharidů provádí pomocí organického rozpouštědla, které umožňuje selektivní srážení mukopolysacharidů, jež mají vyšší molekulovou hmotnost a/nebo jsou ze směsi nejvíce sulfatovány.After adjusting the pH to 3.8, the fractionation of the mucopolysaccharides is carried out with an organic solvent which allows selective precipitation of the mucopolysaccharides having a higher molecular weight and / or the most sulphated from the mixture.
Odstranění řetězců s nízkou molekulovou hmotností a nízkým počtem sulfátových skupin má za následek, že se ve frakcích mukopolysacharidů získá vyšší titr USP, přičemž titr YW zůstává prakticky zachován.Removal of low molecular weight chains with a low number of sulfate groups results in a higher USP titer in the mucopolysaccharide fractions, while virtually maintaining the YW titer.
Směsi mukopolysacharidů, jež se znovu získávají po srážení, lze obecně charakterizovat tak, že jsou tvořeny v podstatě řetězci (1) s průměrnou molekulovou hmotností 4000 až 5000 daltonů, zejména 4500, (2) jež mají titr YW přibližně 180 až 200 ju/mg a poměr titru YW/USP nižší než 10,zejména přibližně 6 až 3, především pak řádu 4.Mixtures of mucopolysaccharides recovered after precipitation can generally be characterized as consisting essentially of chains (1) having an average molecular weight of 4000 to 5000 daltons, in particular 4500, (2) having a YW titer of approximately 180 to 200 ju / mg and a YW / USP titer ratio of less than 10, especially about 6 to 3, especially of the order of 4.
Tyto směsi jsou kromě toho tvořené většinou řetězci ukončenými skupinami se strukturou 2,5-anhydromanno, pocházejí-li výchozí směsi z dusitanové depolymerace heparinu.In addition, these mixtures consist mostly of chain-terminated 2,5-anhydromanno groups when the starting mixtures originate from nitrite depolymerization of heparin.
Směsi získávané postupem podle tohoto vynálezu vykazují biologické aktivity, což především umožňuje kontrolovat s jejich pomocí specifikcky jisté etapy krevní koagulace.The compositions obtained by the process of the present invention exhibit biological activities, which makes it possible, in particular, to control certain stages of blood coagulation with their aid.
Jsou tudíž zvlášť cenné pro výrobu léčiv používaných zejména к prevenci a terapii trombů a stárnutí tkání. Těchto léčiv se používá ve formách určených к podávání a v obvyklých nosologiích pro vizuální indikace.They are therefore of particular value for the manufacture of medicaments used primarily for the prevention and therapy of thrombi and tissue aging. These drugs are used in forms for administration and in conventional nosologies for visual indications.
CS 270 420 D2CS 270 420 D1
JJ
Získávané směsi mukopolysacharidů se rovněž používají к přípravě biologických činidel používaných v laboratořích, zejména pro srovnávání při studiu jiných produktů, u nichž se testuje antikoagulační aktivita, zejména pokud jde o inhibici faktoru Xa.The mucopolysaccharide mixtures obtained are also used for the preparation of biological agents used in laboratories, in particular for comparison in the study of other products which are tested for anticoagulant activity, in particular with respect to the inhibition of factor Xa.
Pokud se jedná o produkty rozpustné ve směsi voda-organické rozpouštědlo, jež se к frakcionování používá, jsou zbaveny nebo prakticky zbaveny antitrombotických účinků.As regards the products soluble in the water-organic solvent mixture to be used for fractionation, they are devoid of or virtually devoid of antithrombotic effects.
Tyto produkty lze znovu získat filtrací na gelu, čímž se oddělí od rozpustného podílu. Použitím postupu chromatografické výměny iontů se umožňuje oddělit ze směsi, je-li to žádáno, různé typy oligosacharidů, především řetězce hexasacharidové, jež mají zvýšenou inhibiční aktivitu proti neoangiogenezi.These products can be recovered by gel filtration to separate them from the soluble fraction. Using the ion exchange chromatography procedure, it is possible to separate from the mixture, if desired, different types of oligosaccharides, especially hexasaccharide chains, which have an increased inhibitory activity against neoangiogenesis.
Regenerace produktů z frakcí se s výhodou provádí například srážením alkoholem nebo lyofilizací.The recovery of the products from the fractions is preferably carried out, for example, by alcohol precipitation or lyophilization.
Ostatní charakteristiky a výhody vynálezu vyplynou z následujících příkladů. Příklady 1 a 2 se týkají přípravy směsí mukopolysacharidů, jež mají poměr titrů YW к USP řádu 4, příklady 3 a 4 se týkají účinků protuktů získaných podle příkladů 1 a 2, a příklad 5 se týká přípravy produktů, prakticky zbavených antitrombotické aktivity, z rozpustných frakcí.Other characteristics and advantages of the invention will be apparent from the following examples. Examples 1 and 2 relate to the preparation of mucopolysaccharide mixtures having a YW to USP ratio of order 4, examples 3 and 4 relate to the effects of the products obtained according to examples 1 and 2, and example 5 relate to the preparation of practically devoid of antithrombotic activity fractions.
Příklad 1 Příprava směsí mukopolysacharidů s poměrem titrů YW/USP přibližně 4Example 1 Preparation of mucopolysaccharide mixtures with a YW / USP titer ratio of about 4
500 g injekčního heparinu ve formě sodné soli se přafede do roztoku ve 4500 ml demineralizované vody při teplotě 18 °C.500 g of injectable heparin sodium salt are dissolved in 4500 ml of demineralized water at 18 ° C.
Poměr YW/USP použitého heparinu je blízký 1, jeho titry mají hodnotu řádu 160 až 170.The YW / USP ratio of the heparin used is close to 1 and has titers of the order of 160-170.
Získaný roztok se intenzivně míchá a jeho pH se sníží na 2,5 přidáním konc. kyseliny chlorovodíkové. Potom se připojí 15 g dusitanu sodného rozpuštěného ve 300 ml vody. Hodnota pH reakčni směsi se upraví na 2,5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a celkový objem roztoku se doplní na 500 ml. Reakce se nechá probíhat 45 minut, potom se ověří, zda v reakčni směsi nezbývají Žádné dusitanové ionty, například použitím indikačního škrobového papírku impregnovaného jodidem draselným (v přítomnosti iontů NO2 nastává modrofialové zbarvení).The resulting solution was stirred vigorously and its pH was lowered to 2.5 by adding conc. hydrochloric acid. Then 15 g of sodium nitrite dissolved in 300 ml of water are added. The pH of the reaction mixture is adjusted to 2.5 with concentrated hydrochloric acid and the total volume of the solution is brought to 500 ml. The reaction is allowed to proceed for 45 minutes, then checked for any nitrite ions remaining in the reaction mixture, for example using potassium iodide-impregnated starch paper (blue-violet coloration occurs in the presence of NO 2 ions).
Reakce se nechá probíhat až do úplného vymizení dusitanových iontů a roztok pak již nereaguje na jodoŠkrobový papírek, přičemž se kontrola provádí každé 3 nebo 4 minuty.The reaction is allowed to proceed until the nitrite ions completely disappear and the solution no longer reacts to the iodo-starch paper, checking every 3 or 4 minutes.
Když již jsou tyto kontroly negativní, lze reakci pokládat za skončenou. Hodnota pH roztoku se pak zvýší na 10 pomocí koncentrovaného louhu sodného a přidá se 5 g tetrahydroboritanu sodného.When these controls are already negative, the reaction can be considered complete. The pH of the solution is then raised to 10 with concentrated sodium hydroxide solution and 5 g of sodium borohydride are added.
Roztok se míchá 15 hodin.The solution was stirred for 15 hours.
Nezreagovaný tetrahydroboritan se rozloží snížením pH na 3,0 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Roztok se míchá 15 minut, potom se pH znovu upraví na 7,0 přídavkem koncentrovaného louhu sodného.The unreacted borohydride is quenched by lowering the pH to 3.0 by adding concentrated hydrochloric acid. The solution was stirred for 15 minutes, then adjusted to pH 7.0 by addition of concentrated sodium hydroxide solution.
Reakčni produkty se získají přidáním 10 litrů ethanolu. Po 48 hodinách stání se produkt dekantuje a odstraní se vznášející se část.The reaction products are obtained by adding 10 liters of ethanol. After 48 hours of standing, the product is decanted and the hovering part is removed.
Sraženina se znovu rozpustí v 9 litrech demineralizované vody. Přidá se 100 g chloridu sodného a pH roztoku se sníží na 3,8 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Objem se doplní přesně na 10 litrů demineralizovanou vodou a za energického míchání se přidá 10 litrů ethanolu. Směs se nechá stát 48 hodin. Násoskou se stáhne vznášející se část, která se odstraní. Sraženina se oddělí, promyje ethanolem, rozetře a vysuší ve vakuu.The precipitate is redissolved in 9 liters of demineralized water. 100 g of sodium chloride are added and the pH of the solution is lowered to 3.8 by addition of concentrated hydrochloric acid. Make up the volume to exactly 10 liters with demineralised water and add 10 liters of ethanol with vigorous stirring. The mixture was allowed to stand for 48 hours. The hovering part retracts the hovering part and discards it. The precipitate was collected, washed with ethanol, triturated and dried in vacuo.
CS 270 420 B2CS 270 420 B2
Získá se 230 g produktu, který má tyto vlastnosti:230 g of product are obtained having the following characteristics:
titr USP titr Yin A Wessler průměrná molekulová hmotnost ^il/mgUSP titer Yin A Wessler titer average molecular weight il1 / mg
225 jul/mg225 g / mg
4000 až 5000 daltonů4000 to 5000 Daltons
Příklad 2 Příprava frakcí mukopolysacharidů s titry YW a USP v poměru přibližně 4 5000 g injekčního heparinu se rozpustí ve 45 litrech demineralizované vody při 1B °c.Example 2 Preparation of mucopolysaccharide fractions with titers of YW and USP in a ratio of approximately 4,000 g of injectable heparin is dissolved in 45 liters of demineralized water at 1B ° C.
Postupuje se obdobně jako v příkladě 1, jenže s desetinásobnými dávkami reakčních složek, to znamená:The procedure is analogous to Example 1, but with ten-fold doses of the reactants, i.e.:
- přidá se 150 g dusitanu sodného v roztoku 3 litrů vody,- add 150 g of sodium nitrite in a solution of 3 liters of water,
- objem reakční směsi se upraví na 50 litrů,- adjust the volume of the reaction mixture to 50 liters,
- přidá se 50 g tetrahydroboritanu,,- 50 g of borohydride are added,
- sráží se pomocí 100 litrů ethanolu,- is precipitated with 100 liters of ethanol,
- znovu se rozpouští v 90 litrech vody,- redissolves in 90 liters of water,
- přidá se 1000 g chloridu sodného,- 1000 g of sodium chloride are added,
- konečný objem sc upraví na 100 litrů, -nakonec se přidá 100 litrů ethanolu.- adjust the final volume sc to 100 liters, - finally add 100 liters of ethanol.
Získá se takto 2230 g produktu, který má tyto vlastnosti:2230 g of a product having the following characteristics are obtained:
titr USP 54 jul/mg titr Yin a Wessler 232 дЯ/тд průměrná molekulová hmotnost 4000 až 5000 daltonů.USP titre 54 µg / mg Yin titer and Wessler 232 дЯ / тд average molecular weight 4000-5000 daltons.
Reakční produkty se regenerují přidáním 20 litrů ethanolu, následuje 48hodinové stání, dekantace a odstranění vznášející se Části.The reaction products are regenerated by adding 20 liters of ethanol, followed by standing for 48 hours, decanting and removing the hovering.
Sraženina se znovu rozpustí v 9 litrech demineralizované vody. Přidá se 1OO g chloridu sodného a pH roztoku se sníží na 3,8 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové.The precipitate is redissolved in 9 liters of demineralized water. 100 g of sodium chloride were added and the pH of the solution was lowered to 3.8 by addition of concentrated hydrochloric acid.
Objem se upraví přesně na 10 litrů demineralizovanou vodou a za energického míchání se přidá 10 litrů ethanolu. Směs se nechá 48 hodin stát. Vznášející se částice se stáhnou násoskou a odstraní. Sraženina se oddělí, promyje ethanolem, rozetře a vysuší ve vakuu.The volume is adjusted to exactly 10 liters with demineralized water and 10 liters of ethanol are added with vigorous stirring. The mixture was allowed to stand for 48 hours. The floating particles are squeezed and removed. The precipitate was collected, washed with ethanol, triturated and dried in vacuo.
Získá se 230 g produktu s těmito vlastnostmi:230 g of a product having the following characteristics are obtained:
titr USP titr Yin a Wessler průměrná molekulová hmotnost yUl/mgUSP titer Yin and Wessler average molecular weight yU1 / mg
225 ^ul/mg225 µl / mg
4000 až 5000 daltonů.4000 to 5000 Daltons.
V následujícím příkladě 3 jsou uváděny výsledky farmakologických pokusů, které byly prováděny s produkty připravenými postupem podle příkladu 1.The following Example 3 shows the results of pharmacological experiments carried out with the products prepared according to the procedure of Example 1.
Příklad 3 Stanovení in vitro aktivity produktůExample 3 Determination of in vitro activity of products
Na obrázcích 1 až 4 jsou znázorněny křivky získané stanovením in vitro změny času koagulace vyvolané v plasmech lidské krve v závislosti na vzrůstajících dávkách komerčního heparinu a produktu připraveného podle příkladu 1.Figures 1 to 4 show curves obtained by in vitro determination of the change in coagulation time induced in human blood plasma as a function of increasing doses of commercial heparin and the product prepared according to Example 1.
V pokusech odpovídajících výsledkům uvedeným v obrázcích 3 a 4 bylo použito placem zbavených destiček a ochuzených o faktor XI.In the experiments corresponding to the results shown in Figures 3 and 4, the strip depleted and depleted of Factor XI was used.
Uvedené obrázky ukazují změny časů ve vteřinách trombinu (obrázek 1), cefalin-kaolinu (obr. 2), koagulace v přítomnosti koncentrované tromboplastiny (obr. 3) a zředěné tromboplastiny (obr. 4), vyvolané testovanými sloučeninami, a to produkty podle příkladu 1 (křivky a^, a^ a a^) a heparinu (křivky b^, b2, a v závislosti na jednotlivě použitých dávkách.The figures show the time changes in seconds of thrombin (Figure 1), cephalin-kaolin (Figure 2), coagulation in the presence of concentrated thromboplastin (Figure 3) and diluted thromboplastin (Figure 4) induced by the test compounds, according to Example products. 1 (curve a ^, a ^ AA ^) and heparin (curve b ^, b 2, and depending on the dosages individually.
CS 270 420 B2CS 270 420 B2
Časy trombinu a Časy cefalin-kaolinu představují oba druhy měření, jež odrážejí spíše účinek zkoumaných preparátů jednotlivě na inhibici aktivovaného faktoru II a celkovou koagulaci. Ze studia křivek na obrázcích 1 a 2 vyplývá, že mukopolysacharidy podle vynálezu mají zřetelně nižší účinek než má heparin na inhibici aktivace protrombinu a na hladinu celkové koagulace. Obrázky 3 a 4, které znázorňují daný jev bezprostředněji vztažený na úsek enzymatické reakce, charakteristiky vedlejší koagulace (zejména v podmíněné nepřítomnosti faktoru Xla),ukazují výhodný účinek mukopolysacharidů připravených postupem podle tohoto vynálezu ve srovnání s heparinem.The thrombin times and the cephalin-kaolin times represent both types of measurements, which rather reflect the effect of the investigated preparations individually on inhibition of activated factor II and overall coagulation. The study of the curves in Figures 1 and 2 shows that the mucopolysaccharides of the invention have a significantly lower effect than heparin on inhibition of prothrombin activation and on the level of total coagulation. Figures 3 and 4, which show the phenomenon more directly related to the enzymatic reaction region, side coagulation characteristics (particularly in the conditional absence of factor XIa), show the beneficial effect of the mucopolysaccharides prepared by the process of the invention over heparin.
Následující příklad 4 se týká výsledků získaných při pokusech provedených in vivo na králících při aplikaci mukopolysacharidů připravených postupem podle příkladu 2.The following Example 4 relates to the results obtained in in vivo experiments on rabbits using mucopolysaccharides prepared according to the procedure of Example 2.
Příklad 4 Stanovení antitrombotických účinků produktu připraveného podle příkladu 2 na králícíchExample 4 Determination of antithrombotic effects in rabbits of the product prepared according to Example 2
Podáním 500 yu YW králíku se vyvolá výrazný účinek anti-Xa, zatímco celkový antikoagulační účinek zůstává poměrně slabý.Administration of 500 yu of a YW rabbit induces a pronounced anti-Xa activity, while the overall anticoagulant effect remains relatively weak.
Dvě hodiny po podání je účinek YW řádu 0,88 yu/ml, kdežto čas cefalin-kaolin je 0,09 yul/ml.Two hours after administration, the effect of YW is of the order of 0.88 yu / ml, while the time of cephalin-kaolin is 0.09 yul / ml.
Pokusy provedenými in vitro a in vivo lze tudíž dokázat zřetelně selektivnější účinek mukopolysacharidů připravených postupem podle tohoto vynálezu, zejména pokud se jedná o hodnotu inhibice faktoru Xa, ve srovnání s účinkem heparinu.Thus, in vitro and in vivo experiments show a markedly more selective effect of the mucopolysaccharides prepared by the process of the invention, particularly as regards the factor Xa inhibition value compared to the action of heparin.
Příklad 5 Příprava frakcí mukopolysacharidů prakticky zbavených antitrombotických účinkůExample 5 Preparation of fractions of mucopolysaccharides practically devoid of antithrombotic effects
Rozpustná frakce z příkladu 1 se regeneruje. Tato frakce obsahuje řetězce se 2 až 14 skupinami.The soluble fraction of Example 1 is recovered. This fraction contains chains of 2 to 14 groups.
Jeden stupeň dodatečného alkoholického řrakcionování této řrakce vede к získání sraženiny, jež se oddělí a rozpustné frakce, z níž se znovu získá směs y. Tato směs je v podstatě tvořena řetězci s maximálně 6 až 8 skupinami a mají titr YW nižší než 70 a titr USP nižší než 5.One step of additional alcoholic fractionation of this fraction results in a precipitate which is separated and a soluble fraction from which the mixture of y is recovered. This mixture consists essentially of chains with a maximum of 6 to 8 groups and has a YW titer of less than 70 and a USP titer of less than 5.
Podrobí-li se směs у filtraci na gelu postupem podle klasické techniky, získají se znovu hexasacharidové směsi. Tyto směsi jsou prakticky zcela zbaveny celkové antikoagulační aktivity a aktivity YW.If the mixture is subjected to gel filtration by a conventional technique, hexasaccharide mixtures are recovered. These mixtures are virtually completely devoid of total anticoagulant activity and YW activity.
Příklad 6 Aktivita na neoangiogenezi směsí у a zExample 6 Activity on neoangiogenesis of у and z mixtures
Pokusy in vitro vzhledem na antiangiogenezní aktivitu se provádějí na chlorioallantoidní membráně 6denních kuřecích embryí kultivací v Petriho miskách.In vitro experiments for anti-angiogenesis activity were performed on the chlorioallantoid membrane of 6-day-old chicken embryos by cultivation in Petri dishes.
Připraví se pastilky smícháním 5 ug hydrokortisonu s 10 ul methylcelulozy, potom se přidají směsi у a z, jejichž dávky jsou 5 ug až 100 yug. Vytvořené pastilky se suší, potom se umístí na chlorioallantoidní membránu, к níž přilnou. Pro každý pokus se používá 4 vajec.Pastilles are prepared by mixing 5 µg of hydrocortisone with 10 µl of methylcellulose, then δ and z mixtures are added at doses of 5 µg to 100 µg. The lozenges formed are dried, then placed on a chloroallantoic membrane to which they adhere. Four eggs are used for each experiment.
Po 48 hodinách inkubace se zkoumá výskyt avaskulárních zón. Zjišřuje se důležité zmenšení vaskulárních zón. Tyto pozorovatelné výsledky se získají již s pouhými 6 yug testovaných výrobků.After 48 hours of incubation, the presence of avascular zones is examined. An important reduction in vascular zones is being investigated. These observable results are obtained with only 6 µg of tested products.
Příklad 7 Působení hexasacharidové směsi z na melanom typu В 16 u myšíExample 7 Treatment of Hexasaccharide Mixture Z on Melanoma Type V16 in Mice
Pokusy se provádějí na myších C57 BL/6 majících melanomy В 16.The experiments were performed on C57 BL / 6 mice having V 16 melanomas.
Testování se provádí po dobu 15 dní. Každé myši se injekčně podává subkutánně dvakrát denně 0,15 mg směsí hexasacharidů a kortisonacetátu v dávkách, jež se během oŠetřo6Testing is performed for 15 days. Each mouse is injected subcutaneously twice daily with 0.15 mg of a mixture of hexasaccharides and cortisone acetate at dosages which are
CS 270 420 B2 vání zmenšují z 250 mg/kg/den na 40 až 50 mg/kg/den. Po 15 dnech se zjistí, že tumor přestává bujet.CS 270 420 B2 reduced from 250 mg / kg / day to 40 to 50 mg / kg / day. After 15 days, the tumor is found to stop growing.
Lze rovněž jasně pozorovat regresi těchto tumorů.Regression of these tumors is also clearly observed.
Claims (7)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8415978A FR2572080B1 (en) | 1984-10-18 | 1984-10-18 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MUCOPOLYSACCHARIDE COMPOSITIONS WITH HIGH ANTITHROMBOTIC ACTIVITY, THE COMPOSITIONS OBTAINED AND THEIR APPLICATION AS MEDICAMENTS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS746785A2 CS746785A2 (en) | 1989-11-14 |
| CS270420B2 true CS270420B2 (en) | 1990-06-13 |
Family
ID=9308784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS857467A CS270420B2 (en) | 1984-10-18 | 1985-10-18 | Method of mucopolysaccharides production with increased antitrombotic activity |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61101502A (en) |
| KR (1) | KR920006002B1 (en) |
| AR (1) | AR243539A1 (en) |
| CS (1) | CS270420B2 (en) |
| DD (1) | DD239798A5 (en) |
| DZ (1) | DZ844A1 (en) |
| EG (1) | EG17478A (en) |
| FI (1) | FI81810C (en) |
| FR (1) | FR2572080B1 (en) |
| HU (1) | HU197931B (en) |
| IL (1) | IL76701A (en) |
| MA (1) | MA20554A1 (en) |
| NO (1) | NO166369C (en) |
| PL (1) | PL146770B1 (en) |
| SU (1) | SU1570651A3 (en) |
| UA (1) | UA5929A1 (en) |
| YU (1) | YU45285B (en) |
| ZA (1) | ZA857902B (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69005251T2 (en) * | 1989-10-04 | 1994-05-05 | Akzo Nv | Sulphated glycosaminoglykuronans with antithrombotic effects. |
| JPWO2012036152A1 (en) * | 2010-09-14 | 2014-02-03 | 国立大学法人 宮崎大学 | High purity heparin and method for producing the same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2478646A2 (en) * | 1980-03-20 | 1981-09-25 | Choay Sa | MUCOPOLYSACCHARIDIC COMPOSITION HAVING A COAGULATION REGULATING ACTIVITY, MEDICAMENT CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR OBTAINING THE SAME |
| FR2440376A1 (en) * | 1978-11-06 | 1980-05-30 | Choay Sa | MUCOPOLYSACCHARIDIC COMPOSITION HAVING REGULATORY COAGULATION ACTIVITY, MEDICAMENT CONTAINING SAME AND METHOD FOR OBTAINING SAME |
| FR2495935A1 (en) * | 1980-12-15 | 1982-06-18 | Choay Sa | Muco:polysaccharide fractions derived from heparin - with selective inhibitory action against factor Xa but low anticoagulant activity |
| FR2503714B1 (en) * | 1981-04-10 | 1986-11-21 | Choay Sa | PROCESS FOR OBTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE MUCOPOLYSACCHARIDES, OF HIGH PURITY, BY DEPOLYMERIZATION OF HEPARIN |
-
1984
- 1984-10-18 FR FR8415978A patent/FR2572080B1/en not_active Expired
-
1985
- 1985-02-27 KR KR1019850007686A patent/KR920006002B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-13 EG EG650/85A patent/EG17478A/en active
- 1985-10-14 DZ DZ850225A patent/DZ844A1/en active
- 1985-10-14 IL IL76701A patent/IL76701A/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-15 AR AR85301959A patent/AR243539A1/en active
- 1985-10-15 ZA ZA857902A patent/ZA857902B/en unknown
- 1985-10-17 SU SU853965564A patent/SU1570651A3/en active
- 1985-10-17 DD DD85281840A patent/DD239798A5/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-17 UA UA3965564A patent/UA5929A1/en unknown
- 1985-10-17 YU YU1660/85A patent/YU45285B/en unknown
- 1985-10-18 HU HU854046A patent/HU197931B/en unknown
- 1985-10-18 PL PL1985255832A patent/PL146770B1/en unknown
- 1985-10-18 CS CS857467A patent/CS270420B2/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-18 JP JP60233118A patent/JPS61101502A/en active Granted
- 1985-10-18 FI FI854073A patent/FI81810C/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-18 MA MA20778A patent/MA20554A1/en unknown
- 1985-10-18 NO NO854154A patent/NO166369C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SU1570651A3 (en) | 1990-06-07 |
| KR860003275A (en) | 1986-05-21 |
| PL146770B1 (en) | 1989-03-31 |
| MA20554A1 (en) | 1986-07-01 |
| IL76701A (en) | 1990-09-17 |
| FR2572080B1 (en) | 1987-06-26 |
| ZA857902B (en) | 1987-03-25 |
| JPH0552841B2 (en) | 1993-08-06 |
| NO854154L (en) | 1986-04-21 |
| CS746785A2 (en) | 1989-11-14 |
| NO166369B (en) | 1991-04-02 |
| DZ844A1 (en) | 2004-09-13 |
| DD239798A5 (en) | 1986-10-08 |
| IL76701A0 (en) | 1986-02-28 |
| HU197931B (en) | 1989-06-28 |
| EG17478A (en) | 1991-03-30 |
| JPS61101502A (en) | 1986-05-20 |
| YU166085A (en) | 1988-06-30 |
| HUT38657A (en) | 1986-06-30 |
| FI854073A0 (en) | 1985-10-18 |
| FR2572080A1 (en) | 1986-04-25 |
| KR920006002B1 (en) | 1992-07-25 |
| UA5929A1 (en) | 1994-12-29 |
| FI81810B (en) | 1990-08-31 |
| FI854073L (en) | 1986-04-19 |
| FI81810C (en) | 1990-12-10 |
| NO166369C (en) | 1991-07-17 |
| YU45285B (en) | 1992-05-28 |
| PL255832A1 (en) | 1987-02-09 |
| AR243539A1 (en) | 1993-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK173982B1 (en) | Depolymerized heparin derivatives, processes for their preparation and pharmaceutical composition and biological reagent containing them | |
| AU643531B2 (en) | Mixtures of low molecular weight polysaccharides, and their preparation and use | |
| JP5371167B2 (en) | Derivatives of partially desulfated glycosaminoglycans that have anti-angiogenic activity and no anticoagulant activity | |
| EP0040144B1 (en) | Sulfated polysaccharides, process for their preparation and their use as medicines | |
| EP0302034A1 (en) | Novel heparin derivatives, a process for their preparation and their use in pharmaceuticals | |
| WO1990006755A1 (en) | Heparin fragments as inhibitors of smooth muscle cell profileration | |
| USRE38743E1 (en) | Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events | |
| EP0577756A1 (en) | New non-anticoagulant heparin derivatives | |
| HUT59828A (en) | Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis | |
| JPH03500788A (en) | Oligosaccharide heparin fragments as inhibitors of the complement cascade | |
| CZ279081B6 (en) | N,o-sulfated heparosanes, process of their preparation and pharmaceutical compositions containing said n,o-sulfated heparosanes and a strain escherichia coli (k5) sebr 3282 | |
| HU188657B (en) | Process for the preparation of anticoagulant mycopolysaccharides | |
| EP0214879A2 (en) | Process for sulfating glycosaminoglycanes, glycosaminoglycanes obtained and their biological applications | |
| WO1992017188A1 (en) | New non-anticoagulant heparin derivatives | |
| KR20010030803A (en) | Novel glycosaminoglycan and drug compositions containing the same | |
| US4788307A (en) | Oligosaccharidic fractions devoid or practically devoid of antithrombotic activity | |
| CS270420B2 (en) | Method of mucopolysaccharides production with increased antitrombotic activity | |
| CA2678166A1 (en) | Heparins including at least one covalent bond with biotin or a biotin derivative, method for preparing same and use thereof | |
| EP0956027B1 (en) | Semi-synthetic sulphaminoheparosansulphates having high anti-metastatic activity and reduced haemorrhagic risk | |
| KR20160029817A (en) | Sulfated polygulonic acid polysaccharide or pharmaceutical salt thereof, preparation method therefor and use thereof | |
| DK172887B1 (en) | Process for preparing high antithrombotic mucopolysaccharides | |
| US20050158146A1 (en) | Method of preparing purified biologically active oligosaccharide libraries | |
| US20060069044A1 (en) | Modified glycosaminoglycans, pharmaceutical compositions and methods for oral delivery thereof | |
| JP2005036031A (en) | Sulfated polyfucose and its manufacturing method | |
| CS260347B1 (en) | Method of lichenan insulation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20001018 |