PL87381B1

PL87381B1 -

Info

Publication number: PL87381B1
Application number: PL1973164439A
Authority: PL
Priority date: 1972-08-02
Filing date: 1973-08-01
Publication date: 1976-06-30
Also published as: SE400085B; NL7310706A; IE37913L; ATA664173A; CH592112A5; YU203073A; CA1006872A; FI52466C; DE2336401A1; NO137941B; IE37913B1; DE2336401B2; DD107461A5; HU167266B; FR2194425A1; ZA734876B; AU474015B2; GB1425384A; BE802981A; IL42764A0

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowej soli enzymatycznej. Wynalazek dotyczy otrzy¬ mywania nowej, wyjatkowo trwalej soli S-adenozylo-L-metioniny(SAM) w sposób prosty i ekonomiczny w skali przemyslowej.

S-adenozylo-L-metionina jest znanym zwiazkiem pochodzenia naturalnego, wystepujacym we wszystkich zywych organizmach, od bakterii do roslin oraz od organizmów jednokomórkowych do najwyzej zorganizowa¬ nych ssaków, w tym takze ludzi Struktura tego zwiazku znana jest od dluzszego czasu i wyraza sie wzorem 1, w którym X'oznacza anion.

W zywych organizmach SAM powstaje w wyniku dzialania enzymów(S-adenozylometioninosyntetaz lub S-adenozylotransferaz) w ukladzie cytoplazmatycznym, z metioniny wprowadzonej z pokarmem lub z ATP obe¬ cnego w charakterze rezerwy energetycznej w kazdej zywej komórce.

Jak obecnie wiadomo SAM jest zwiazkiem o zasadniczym znaczeniu w wielu biologicznych reakcjach trans- metylacji enzymatycznej, w wyniku czego jest ona bardzo cennym odczynnikiem biochemicznymu Istnieje jednak powazny problem zwiazany z wyjatkowa nietrwaloscia tego zwiazku w temperaturze poko¬ jowej i powyzej pokojowej.

W ostatnich latach badania majace na celu uzyskanie trwalej postaci S-adenozylo-L-metiononony, umozli¬ wiajacej jej stosowanie w pracach biologicznych, skierowane byly na otrzymywanie soli trwalych w normalnych warunkach temperatury i wilgotnosci. Opracowano wiec sposób otrzymywania chlorku i siarczanu SAM, sole te jednak mozna stosowac, jedynie jako odczynniki biochemiczne i to w krótkim okresie czasu, gdyz nawet w posta¬ ci suchej ich trwalosc jest ograniczona. Ponadto sposób ich wytwarzania pozwala tylko na uzyskiwanie malych porcji a nie na produkcje w skali przemyslowej.

Nieoczekiwanie udalo sie znalezc nowa sól SAM; nieograniczenie trwala w temperaturze pokojowej, która mozna wytwarzac w skali przemyslowej z duza wydajnoscia i w oplacalny ekonomicznie sposób. Sól ta wykazuje niespodziewanie wysoka aktywnosc w wielu rozmaitych dziedzinach terapii ludzkiej.

Nowa sól bedaca przedmiotem niniejszego wynalazku, jest p-toluenosulfonianem-S-adenozylo-L-metioniny o wzorze SAMACH3C6«4S03"* 2CH3C6H4S03 lub w zapisie SAM • C21H23S309.2 87 381 O wysokim stopniu osiagnietego postepu technicznego swiadcza dane przedstawione w ponizszej tablicy I, w której podano porównanie trwalosci w temperaturze 25°C, w postaci stalej, dwu najbardziej dotychczas trwa¬ lych soli SAM, tzn. chlorku i siarczanu, z trwaloscia trój-p-toluenosulfonianu. Wyniki w tabeli podane sa w % nierozlozonej S-adenozylo-L-metioniny we wskazanym czasie.

T a b I i c a 1 ~Sól 30 Chlorek 65 Siarczan 91,7 Trój-p-toluenosul- fonian 98,5 Proces otrzymywania nowej soli sklada sie z nastepujacych kolejnych etapów: a) dzialanie na drozdze (Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida i inne), wzbogacone w SAM dzieki dodatkowi w odpowiednich warunkach metioniny) Schlenk, Enzymologa, 29, 283 (1965), octanem etylu lub octanem metylu w temperaturze pokojowej; nastepnie liza komórek i 100% S-adenozylo-L-lizyny zostaje wyekstrahowane przez rozpuszczalnik; b) adsorpcja przesaczonego roztworu na kolumnie ze slabokwasnym wymieniaczem kationowym w formie kwasowej; c) usuwanie zanieczyszczen na drodze przemywania kolumny kolejno woda i 0,025 n roztworem kwasu octowego; d) selektywna elucja SAM wodn>m roztworem kwasu p-toluenosulfonowego; e) zobojetnianie nadmiaru kwasu p-toluenosulfonowego za pomoca silnie — lub slabozasadowego wymie¬ niacza anionowego w formie OH", do osiagniecia zawartosci kwasu p-toluenosulfonowego wynoszacej 3—10, korzystnie okolo 6 moli, na mol S-adenczylo-L-metioniny; f) zatezanie roztworu wodnego w temperaturze pokojowej, pod zmniejszonym cisnieniem lub liofilizacja, do objetosci wynoszacej od 2/20 do 4/20, korzystnie 3/20, objetosci wyjsciowej; g) dodawanie do zatezonego roztworu mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika organicznego, np„ alkoholu etylowego, propylowego, izopropylowego, acetonu, ketonu metylowoetylowego, co powoduje wytracanie sie praktycznie czystej soli o wzorze SAM • C2 i H2 3S309.

W etapie (a) proces prowadzi sie stosujac octan w ilosci od 1/20 do 1/5, korzystnie 1/10, w stosunku do wagi wilgotnych komórek i prowadzac operacje w ciagu od 30 minut do 2 godzin, korzystnie 1 godziny. Warto zwrócic uwage, ze proces lizy komórek drozdzy za pomoca rozpuszczalników organicznych jest o wiele bardziej korzystny niz normalnie stosowane uzywanie kwasu nadchlorowego, kwasu mrówkowego lub kwasu octowego w temperaturze 60°C. Tak wysoka temperatura, w szczególnosci przy pH stosowanym podczas kwasnej lizy, wywiera niekorzystny wplyw na trwalosc S-adenozylo-L-metioniny. Natomiast nieobecnosc w roztworach sil¬ nych kwasów umozliwia uzywanie niewielkich tylko ilosci slabego kationitu i stosowanie normalnej aparatur/ bez obawy wystepowania korozji. Poza tym denaturacja protein jaka nastepuje w przypadku stosowania rozpu¬ szczalników organicznych ulatwia saczenie pozostalej masy komórkowej.

W etapie b) procesprowadzi sie korzystnie przy zastosowaniu kolumny wypelnionej slabym kationite.m, np. Amberlitem IRC—50, w formie wodorowej- Proces w etapie (d) prowadzi sie stosujac wodny roztwór kwasu p-toluenosulfonowego o stezeniu do jedns molarnego.

Stwierdzono, ze do zobojetniania nadmiaru kwasu p-toluenosulfonowego w etapie (b) szczególnie uzyte¬ czny jest wymieniacz jonowy Amberlit I RA 900 lub Amberlit IR 45. Istotnym jest uzyskanie w koncowym efekcie wlasciwego stosunku kwasu p-toluenosulfonowego do S-adenozylo-L-metioniny, warunkuje to ilosciowe stracenie soli, podczas gdy wszystkie kationy nieorganiczne oraz niewielka ilosc obecnych zanieczyszczen pozosta¬ ja w roztworze. Najlepsze wyniki w skali przemyslowej osiaga sie stosujac, opisany nizej, korzystny sposcD wytwarzania soli SAM * C21 H23S309. Niektóre, dajace dobre wyniki, modyfikacje korzystnego sposobu opisane sa w niniejszym opisie dalsze sa oczywiste dla znajacych zagadnienie.

Jest oczywiste, ze trój-p-toluenosulfonian-S-adenozylo-L-metioniny mozna wytracac z jakiegokolwiek roz¬ tworu wodnego. Moze to byc roztwór SAM pochodzacej z syntezy enzymatycznej lub chemicznej lub roztwór wodny którejkolwiek z jej rozpuszczalnych soli. W kazdym jednak z tych przypadków otrzymuje sie mniej czysty produkt z nizsza wydajnoscia.

Dalsza modyfikacja procesu polega na eluowaniu SAM zaadsorbowanej na slabokwasnym wymieniaczu kationowym wodnym roztworem kwasu solnego lub siarkowego zamiast bezposrednio kwasem p-toluenosulfono- 180 360 540 dni 61,0 92,2 84,2 80,187 381 3 wym. Aniony chlorkowe i siarczanowe mozna usuwac z roztworu, np. stosujac wymieniacz anionowy i dodajac obliczona ilosc kwasu p-toluenosulfonowego, w stosunku molowym takim samym jak w przypadku bezposrednie¬ go stracania.

Mozna takze wytracac z eluatów chlorek lub siarczan surowej S-adenozylo-L-metioniny, po uprzednim usunieciu nadmiaru kwasu za pomoca odparowania lub dzialaniem odpowiedniej zasady. Wytracony chlorek albo siarczan rozpuszcza sie w wodzie, usuwa anion i wytraca sól trój-p-toluenosulfonowa, dodajac kwas p-toluenosul- fonowy w stosunku molarnym podanym uprzednio. Mozna równiez stosowac w podobny sposób do eluowania SAM inne mocne kwasy, nie daje to jednak zadnych szczególnych korzysci.

Przyklad I. Do 90 kg drozdzy wzbogaconych w S-adenozylo-L-metionine w ilosci 5,5 g/kg w znany sposób (opisany przez Schlenka, Enzymologia, 29, 283 (1965) dodaje sie w temperaturze pokojowej w 9 litrów octanu etylu. Calosc miesza sie energicznie wciagu jednej godziny, rozciencza 40 litrami wody, saczy i prze¬ mywa, otrzymujac 140 litrów roztworu zawierajacego 3,55 g/litr SAM, co odpowiada 99,5% jej zawartosci w surowcu wyjsciowym. < 14 litrów roztworu absorbuje sie na 1 litrze wymieniacza jonowego Amberlit IRC 50 w formie wodorowej i nastepnie eluuje kolejno woda, 0,025 n roztworem kwasu octowego oraz 1 n roztworem kwasu p-toluenosulfo¬ nowego. Frakcje zawierajace praktycznie czysta SAM, oznaczane metoda chromatografii cienkowarstwowej (opi¬ sana w Anal. Biochim. 4/ 16-28 (1971), maja objetosc okolo 1,8 litra i zawieraja 85% produktu naniesionego na kolumne. Zebrane frakcje zawierajace SAM miesza sie nastepnie z 1,7 litra Amberlitu I RA 900 w formie wodoro¬ tlenkowej, saczy i przemywa zywice woda. Roztwór zawiera 2,2% kwasu p-toluenosulfonowego oraz 0,85% S-adenozylo-L-metioniny. Po zatezeniu pod zmniejszonym cisnieniem i w pokojowej temperaturze do objetosci 600 ml, dodaje sie acetonu. Wypada mikrokrystaliczna, hygroskopijna, nie posiadajaca zapachu sól, bardzo do¬ brze rozpuszczalna (powyzej 25%) w wodzie, dajaca bezbarwny roztwór. Sól ta jest zle rozpuszczalna w metanolu i etanolu a nierozpuszczalna w acetonie, ketonie metylowoetylowym, chloroformie, wyzszych alkoholach i ben¬ zenie. < Analiza elementarna: dla wzoru C36H46N60i4S4 (ciezar czasteczkowy — 915 I) Obliczono: C- 47,20% H - 5,15% - 9,18% S - 14,00% znaleziono: C-46.9% H - 5,3% N--9,2% S - 13,8% Kwas p-toluenosulfonowy — obliczono 56,4%, znaleziono — 55,8%, S-adenozylo-L-metionina — obliczono 43,6%, znaleziono- 42,5%.

Strata na wadze po 12-godzinnym suszeniu w temperaturze pokojowej, pod zmniejszonym cisnieniem, nad . pieciotlenkiem fosforu, wyniosla 1,5—2%. Zawartosc wody oznaczana metoda K. Fischera — 1,5—2%.

W widmie w promieniowaniu nadfioletowym wystepuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 265 /xm. * Wartosc ekstynkcji molarnej w6n kwasie siarkowym, przy dlugosci fali 256/im wynosi 15,600, a przy Ph równym 7 i przy dlugosci fali 260 jum 16,300. • Wszystkie powyzsze dane fizyko-chemiczne odpowiadaja wzorowi 2. « Identycznosc nowego zwiazku potwierdzono równiez stosujac metody enzymatyczne, takie jak enzymaty¬ czne metylowanie amidu kwasu nikotynowego lub kwasu guanidynooctowego za pomoca S-adenozylo-L-metio¬ niny (G.L.Gahtoni, J.Biol.Chem., 189, 745 (1951) oraz 204, 403 (1953) i G.De La Hoba, G.A. Jamieson. SiH.

Mudd, H.H. Richards, J.Amer,Che.Soc, 81, 3975 (1959).

Przyklad II. 9 kg drozdzy poddaje sie lizie w sposób opisany w przykladzie I. Otrzymuje sie 13,8 li¬ trów roztworu zawierajacego 3,60 g/litr S-adenozylo-L-metioniny, co odpowiada 99% odzysku tego produktu.

Roztwór powyzszy absorbuje sie na 1 litrze wymieniacza Amberlitu IRC 50 w formie wodorowej a nastepnie eluuje woda, 0,025n roztworem kwasu octowego oraz 4n kwasem solnym. Frakcje zawierajace czysta S-adenozy¬ lo-L-metionine, oznaczane w sposób opisany w przykladzie I, zawieraja w objetosci 0,8 litra, 87% naniesionego na kolumne produktu. Po zatezeniu do sucha w temperaturze 40°C, pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje sie wody do uzyskania roztworu o stezeniu wynoszacym 5%. Roztwór ochladza sie do temperatury 0°C i dodaje wymieniacza Dowex 50 w formie wodorotlenkowej do zaniku reakcji na chlorki. Po odsaczeniu wymieniacza dodaje sie 110 g kwasu p-toluenosulfonowego i zateza roztwór do objetosci 600 ml, po czym dodaje sie alkoholu metylowego az do calkowitego wytracenia soli. Po odsaczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie trój-p-toluenosulfonian S-adenozylo-L-metioniny o wlasciwosciach identycznych jak w przykladzie I.

Przyklad III. 13,8 litra roztworu zawierajacego 3,60 g/litr S-adenozylo-L-metioniny, otrzymanego w wyniku lizy komórek drozdzy w sposób opisany w przykladzie I, absorbuje sie na 1 litrze Amberlitu IRC 50 w formie wodorowej a nastepnie eluuje kolejno woda, 0,025n roztworem kwasu octowego i 1n kwasem siarko¬ wym. Do 1,8 litra zebranych frakcji, zawierajacych 86% produktu naniesionego na kolumne, dodaje sie w tern-4 87 381 peraturze O C zawiesine wodorotlenku barowego az do calkowitego wytracenia siarczanów. Po odsaczeniu i prze¬ myciu siarczanu barowego dodaje sie do roztworu 108 g kwasu p-toluenosulfonowego i postepujac wst^ób opisany w przykladzie II otrzymuje sie trój-p-toluenosulfonian-S-adenozylo-L-metioniny o wlasciwosciach - t tycznych jak w przykladzie I.

Przyklad IV. 13,8 litra roztworu zawierajacego 43,3 g S-adenozylo-L-metioniny absorbuje sie n kolu¬ mnie z wymieniaczem jonowym i eluuje, podobnie jak w przykladzie II kwasem solnym* Frakcje ztv/:v;:<*iace SAM zateza sie do sucha, pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 40°C a nastepnie dodaje sie ero wody do uzyskania roztworu o stezeniu 10%, z którego wytraca sie sól za pomoca dodatku acetonu. Otrzymana sól zawiera 16,86% chlorków, 78,85% S-adenozylo-L-metioniny oraz 4,2% wody. g tej soli rozpuszcza sie w 200 ml wody i usuwa chlorki za pomoca Dowexu 50 w formie wodorotlen¬ kowej w temperaturze 0°C. Do wolnego od chlorków roztworu dodaje sie 19,7 g kwasu p-toluencj ? iowego, zateza do objetosci 80 ml pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 40°C i dodaje acetonu ces * wytrace¬ nia soli. Otrzymany trój-p-toluenosulfonian S-adenozylo-L-metioniny posiada wlasciwosci identyc^ ic z produ¬ ktem z przykladu I.

Przyklad V. 13,8 litra roztworu zawierajacego 3,60 g/litr S-adenozylo-L-metioniny, otrzymanej w spo¬ sób opisany w przykladzie I, absorbuje sie na Amberlicie IRC w formie wodorowej. Do zebranych frakcji zawie¬ rajacych S-adenozylo-L-metionine dodaje sie weglan barowy az do wyrównania stosunku molarnego siarczanu do SAM. Po przesaczeniu roztwór zateza sie do objetosci 500 ml i wytraca sól za pomoca acetonu. Analiza wyka¬ zala, ze sól ta zawiera 28,2% siarczanów, 58,9% S-adenozylo-L-metioniny oraz 5% wody. 10 g soli rozpuszcza sie w 120 ml i usuwa siarczany za pomoca wymieniacza Amberlit I RA 900 w formie wodorotlenkowej. Po odsacze¬ niu zywicy do roztworu dodaje sie 14,7 g kwasu p-toluenosulfonowego, zateza do objetosci 60 ml i dodaje acetonu, wytracajac sól p-toluenosulfonowa S-adenozylo-L-metioniny o wlasciwosciach identycznych jak w przykladzie I.

Przyklad VI. 1g jodku S-adenozylo-L-metioniny (równowartosc 600 mg SAM) rozpuszcza sie w 10 ml i usuwa jodki za pomoca wymieniacza Dowex 50 w formie wodorotlenkowej, w temperaturze 0°C. Po odsaczeniu wymieniacza dodaje sie 1,5 g kwasu p-toluenosulfonowego, roztwór zateza do objetosci 6 ml i dodaje acetonu, wytracajac trój-p-toluenian S-adenozylo-L-metioniny o wlasciwosciach identycznych jak w przykladzie I.

Z badan biochemicznych wiadomo od kilku lat, ze S-adenozylo-L-metionina jest jedynym specyficznym nosnikiem grup metylowych w zywych organizmach, biorac udzial w przenoszeniu grupy metylowej. Ta reakcja biochemiczna ma podstawowe znaczenie w przemianach tluszczowych, bialkowych i weglowodanowych.

Do niektórych, bardziej waznych reakcji transmetylowania zaleznych od S-adenozylo-L-metioniny naleli a) N-transmetylowanie adeniny, karnityny, karnozyny, kreatyny, 2,6-dwuaminopuryny, adrenaliny, guarv ny, nordeniny, N'-amidu kwasu nikotynowego, nikotyny, fosfatylodilkoliny, rycyniny; b) O-transmetylowanie N-acetylosperotoniny, dopaminy, epininy, d-adrenaliny, 1 adrenaliny, eholesi?'uU> ergosterolu, l-noradrenaliny, pektyny, ubichinonu; c) S-transmetylowanie 2,3-dwumerkaptopropanolu, siarkowodoru, metioniny, metylomerkaptanu, kwr-v S-merkaptopropionowego, S-merkaptoetanolu, tiopirymidyny, tiouracylu; d) C-transmetylowanie cytoniny i tyminy. • Oznacza to w odniesieniu do organizmu ludzkiego, ze S-adenozylo-L-metionina uczestniczy w nastepni i cych przemianach: biosynteza choliny, biosynteza fosfatydylocholiny, dzialalnosc enzymów wymagajacy obecnosci grupy —SH, przemiana katecholoamin, przemiany biogennych amin centralnego ukladu n^rv/ow przemiany serotoniny, przemiany histaminy, przemiany witaminy B12 i kwasu foliowego, przemiany kreat??*•';•¦ przemiany miozyny, przemiany histonów, przemiany RNA i DNA, przemiany substancji bialkowych, pr ^fr- > niektórych hormonów obudowie cyklopentanoperhydrofenantrenu, których glównymi przedstawien * estrogeny oraz przemiany trójglicerydów.

Wiadome jest takze, ze S-adenozylo-L-metionina ulegajac demetylacji pod dzialaniem enzymów >orv„ metylotransferaz, przeksztalcona jest w S-adenozylohomocysteine (SAO). Zwiazek ten jest bezpcsiea*", ; -/jcix- rem grup tiolowych i tym samym odgrywa wazna role w przemianach wszystkich zwiazków wym^j^cyc^ obecnosci grup —SH dla przeniesienia ich aktywnosci biologicznej. Szczególnie dotyczy to niektórych bioenzy mów i zawierajacych siarke aminokwasów. S-adenozylohomocysteina ulega w organizmie dekarboksyldcji. p*:? dukt tej dekarbosylacji jest glównym dawca grupy aminopropylowej, nieodzownej, zgodnie ze wspclczssnym poziomem wiedzy biochemicznej, do biosyntezy poliaminy. Proces ten katalizowany jest przez rozmaite enzymy, z których specyficzna jest aminopropylotransferaza. < Reasumujac, mozna stwierdzic, ze obecnosc S-adenozylo-L-metioniny w organizmie ludzkim jest sdsle zwiazana z nastepujacymi reakcjami biochemicznymi:87 381 5 A — transmetylowanie (specyficzne przenoszenie grupy CH3), B — transsulfuracja (specyficzne przenoszenie grupy SH), C,— transaminopropylowanie (specyficzne przenoszenie grupy aminopropylowej).

Jak wynika z przytoczonych danych S-adenozylo—l-metionina moze wykazywac dzialanie terapeutyczne w leczeniu stanów chorobowych zwiazanych z brakiem lub niedoborem w organizmie niektórych, wspomnianych wyzej substancji. Wyjatkowa jednak nietrwalosc S-adenozylo—L-metioniny i brak do chwili obecnej sposobu otrzymywania jej postaci trwalej w normalnych warunkach, uniemozliwialy przeprowadzenie badan farmakolo¬ gicznych i klinicznych i tym samym nie pozwalaly na wprowadzenie tego zwiazku do terapii ludzkiej. Dopiero wynalezienie nowej soli, bedacej przedmiotem niniejszego wynalazku, mianowicie trój-p-toluenosulfonianu-S-a- denozylo-L-metioniny, pozwolilo na przeprowadzenie szerokich badan klinicznych i farmakologicznych i dopro¬ wadzilo do odkrycia, ze sól ta posiada wlasciwosci terapeutyczne, zaskakujace pod wzgledem ich jakosci i sku¬ tecznosci. « Z ogromnej ilosci danych farmakologicznych i klinicznych, dotyczacych nowej soli, przedstawiono w dal¬ szej czesci niniejszego opisu jedynie wybrane elementy, w ilosci wystarczajacej dla znajacych zagadnienie, do zorientowania sie w podstawowych wlasciwosciach nowego zwiazku oraz mozliwosciach jego zastosowania w te- rapi ludzkiej.

Toksycznosc. Trój-p-toluenosulfonian S-adenozylo-L-metioniny nie wykazuje zadnej absolutnie toksy¬ cznosci zarówno ostrej jak i przewleklej jak równiez nietolerancji miejscowej i dzialan ubocznych. Wartosc LD50 dla szczurów i myszy jest wyzsza niz 5 g/kg wagi ciala.

Badania tolerancji i toksycznosci przewleklej przeprowadzono na szczurach rasy Wistar i Sprague-Dowley, podajac preparat wciagu 12 miesiecy w ilosci 2—10 mg/kg wagi ciala dziennie. Po zakonczeniu podawania preparatu rozmaite organy zwierzatek doswiadczalnych nie wykazywaly zadnych zmian patologicznych. Test na teratogennosc przeprowadzono na królikach i szczurach. Okazalo sie, ze nawet przy podawaniu ogromnych ilosci trój-p-toluenosulfonianu S-adenozylo-L-metioniny, okolo 10—krotnie wyzszych od najwyzszej dawki terapeuty¬ cznej, nie stwierdza sie dzialania teratogennego lub zmian zarodków albo plodu.

Dodanie 0,1—0,2 mg/ml preparatu nie wywoluje zadnych zmian w hodowlach tkankowych limifocytów ludzkich oraz komórek watrobowych myszy.

Podczas podawania dozylnego w ilosci do 20 mg/kg nie zaobserwowano u królików dzialania goraczko- twórczego. Podawanie dozylne w ilosci do 40 mg/kg nie powoduje u królików i kotów zadnych zmian w cisnieniu tetniczym, czestotliwosci pracy serca i oddechu oraz nie zmienia zapisu elektrokardiograficznego. Tolerancja miejscowa przy iniekcjach domiesniowych nawet przy podawaniu powtarzanym w przeciagu 15—20 dni, oraz przy iniekcjach dozylnych w brzeznych naczyniach malzowiny usznej, jest doskonala. ¦ Badania na ludziach prowadzono wykorzystujac mlodych, zdrowych ochotników obojga plci, o przeciet¬ nej wadze 70 kg. Preparat podawano na drodze iniekcji dozylnych lub wlewów w ilosci 10—500 mg. Jednoczesnie prowadzone badania najwyzszego i najnizszego cisnienia, pulsu i czestotliwosci oddechu po 1, 5, 15, 20, 30,60 minutach oraz po 2, 3, 6, 8, 10, 12 i 24 godzinach nie wykazaly odstepów od normalnych wartosci. Zapis elektrokardiograficzny nie wykazal zadnych zmian w wartosciach pQ, w przedziale ST ani tez skurczu przed¬ wczesnego lub innych zaburzen po 30 sekundach oraz 1, 2, 3, 5, 10 i 20 minutach od czasu podania leku. Nie stwierdzono równiez w systemie krwiotwórczym oraz w pracy watroby i nerek zadnych statystycznie uchwyt¬ nych odstepów od stanu normalnego. < Farmakologia, W celu oznaczenia sposobu dystrybucji trój-p-toluenosulfonianu-S-adenozylo-L-metioniny miedzy poszczególne tkanki, zastosowano preparat znaczony izotopem wegla C14 w grupie metylowej, o akty¬ wnosci 45 /zC/milimol. Preparat ten podawano swinkom morskim o wadze 200 g w ilosci 1 juC/g. Po uplywie 15 minut od chwili podania obserwowano znaczna radioaktywnosc, oznaczana metoda histoautoradiograficzna, w mózgu, rdzeniu kregowym, watrobie, plucach, nerkach, gruczolach nadnercza i tarczycy oraz w przewodzie zoladkowo-jelitowym.

Z uzyskanych wyników mozna wnioskowac, ze nowa sól latwo przekracza bariere naczyn wiencowych i przenosi grupy metylowe do tkanek wymagajacych ukladów transmetylujacych. Innymi slowy stwierdzono w ten sposób zdolnosc umiejscawiania sie nowego preparatu w narzadach wymagajacych obecnosci czynników transmetylujacych. Obserwacje te zostaly nastepnie potwierdzone przez szereg testów farmakologicznych. Testy te przeprowadzone na szczurach wykazaly, ze nowy zwiazek wykazuje znaczne dzialanie zapobiegajace w przypadkach stluszczenia watroby wywolanego dieta z nadmiarem tluszczów i bialek wedlug Handlera, w przypadkach stluszczenia wywolywanego ostrym zatruciem alkoholowym lub innymi czynnikami toksy¬ cznymi. Dzialanie takie uzyskuje sie juz przy podawaniu preparatu w ilosci 10 mg/kg. Badania zarówno morfo- histochemiczne jak i analityczne wykazaly, ze S-adenozylo-L-metionina hamuje odkladanie sie tluszczów w watrobie.6 87 381 W wywolywanym doswiadczalnie u szczurów, np. przy zastosowaniu preparatu Triton S, nadmiarze lipi¬ dów we krwi, trój-p-toluenosulfonian S-adenozylo-L-metioniny wykazuje dzialanie obnizajace poziom lipidów, w stosunku do zastosowanej dawki, wynoszacej 10 mg/kg, znacznie silniejsze niz inne substancje o tymze dziala¬ niu. < Podawanie pozajelitowe nowej soli, w ilosci 10 mg/kg, kurczetom hodowanym na diecie wywolujacej zmiany miazdzycowe, bogatej w cholesterol i fruktoze, redukuje poziom cholesterolu we krwi i w duzym stopniu lagodzi uszkodzenia wykryte w aorcie brzusznej i piersiowej, jak równiez w malych naczyniach mózgowych- • W odniesieniu do przemian fosfolipidów stwierdzono doswiadczalnie zwiekszenie poziomu fosfatydylo- choliny w tkankach watroby szczurów o niewyrównanej przemianie sterolowej. Stwierdzono równiez wyrazny wzrost poziomu fosfatydylocholiny badajac poziom a-lipoprotein w surowicy krwi, podczas wywolywanych doswiadczalnie zaburzen w stosunku a- do 0-1ipoprotein, Wszystkie te testy wskazuja wyraznie na dzialanie lecznicze trój-p-toluenosulfonianu-S-adenozylo-L-metioniny w przypadkach nieprawidlowej przemiany tluszczo¬ wej.

Nastepna seria testów przeprowadzonych na szczurach wykazala, ze podawanie nowej soli w ilosci 2 mg/kg, wywoluje gromadzenie sie rezerw glikogenowych w watrobie i miesniach, jak to wynika z prób histo- chemicznych i oznaczen ilosciowych. W doswiadczalnej cukrzycy wywolywanej alloksanem okazalo sie, ze ilosc insuliny niezbednej do utrzymania normalnego poziomu cukru we krwi znacznie sie zmniejsza przy jednocze¬ snym podawaniu 5 mg/kg nowej soli S-adenozylo—L—metioniny. Doswiadczenia te wskazuja na wyrazny dodatni wplyw nowej soli na przemiane weglowodanów. « W ostatniej serii doswiadczen podawano 10 mg/kg trój-p-toluenosulfonianu SAM szczurom w doswiadczal¬ nie wywolywanymi stanami obnizenia ilosci bialka we krwi. Stwierdzono, ze uzyskuje sie powrót do normalnego poziomu calkowitego bialek we krwi wraz ze znacznym zwiekszeniem ilosci albumin, co swiadczy, o silnym stymulowaniu anabolizmu bialkowego. "Pe, oraz inne podobne testy, swiadcza o dzialaniu leczniczym nowego zwiazku w stanach zwiazanych z zaburzeniami przemian bialkowych.

Badania kliniczne. Poslugujac sie danymi uzyskanymi z badan farmakologicznych przeprowadzono badania kliniczne w stanach chorobowych, które wydaja sie byc bezposrednio lub posrednio zwiazane z zaburzeniami: 1 — przemian tluszczów, 2 — przemian weglowodanów, 3 — przemian bialkowych, 4 — przemian katecholoamin i biogennych. « 1. Podczas badan klinicznych przeprowadzanych na setkach pacjentów, zaobserwowano, ze przy podawa¬ niu rozmaitych ilosci trój-p-toluenosulfonianu SAM uzyskuje sie szybki spadek poziomu lipidów watrobowych w stanach stluszczenia watroby o róznej patogenozic Oceny dokonywano po zakonczeniu podawania preparatu oraz nastepnie po 60 dniach,, Podawanie nowego preparatu powoduje równiez znaczny spadek wysokiego pozio¬ mu cholesterolu i lipidów we krwi oraz normalizuje zmiany stosunku a- do /Mipoprotein i stosunku pre !-0-do jCMipoprotein, w przypadku niewyrównanych stanów zwiazanych z nadmiernie wysokim poziomem lipidów we krwi. Obnizanie poziomu cholesterolu i lipidów we krwi jest zalezne od wielkosci dawki i wystepuje juz przy podawaniu 5—10 mg. Równolegle obserwacje wykazaly wyraznie, ze obnizenie poziomu cholesterolu i tlusz¬ czów we krwi wywolywane przez nowy preparat, jest zauwazalne takze u pacjentów, którzy nie reaguja na zwykle leki i ograniczenia w diecie. • W czystej miazdzycy polaczonej w kliniczna manifestacja zaburzen psychicznych, ze zmianami w centra¬ lnym ukladzie nerwowym, wywolywanymi przez zmiany sklerotyczne naczyn mózgowych i zjawisko niedotle¬ nienia mózgu, podawanie trój-p-toluenosulfonianu S-adenozylo-L-metioniny na drodze iniekcji domiesniowych, lub w ciezszych przypadkach iniekcji dozylnych albo powolnych wlewów dozylnych, w ilosci 20—40 mg, wywo¬ luje korzystna zmiane objawów chorobowych. W< szczególnosci w stanach wyraznego niedotlenienia uzyskiwanie powrotu normalnych funkcji zyciowych jest bardzo szybkie i statystycznie znaczace.

W objawach wystepujacych po peknieciach naczyn mózgowych stwierdzono bardzo szybka poprawe obra¬ zu klinicznego, zwiazana prawodopodobnie z dzialaniem przeciwzakrzepowym nowej soli S-adenozylo-L-metio¬ niny, udowodnionym zarówno w warunkach laboratoryjnych jak równiez podczas badan na obiektach zywych.

Ze wzgledu na specyficzna aktywnosc skierowana przeciw zakrzepom przeprowadzono badania w warunkach laboratoryjnych i na zywych objektach, stosujac wielkie ilosci materialu klinicznego w postaci plazmy bogatej w plytki krwi. Stwierdzono, ze nowy zwiazek wykazuje wyrazne dzialanie przeciwdzialajace sklejaniu sie plytek przy podawaniu rozmaitych jego ilosci. Np. 0,8 mg preparatu wystarcza do znacznego zahamowania sklejania sie plytek krwi wywolywanego podaniem 40 mikromoli adenozynodwufosforanu. Krzywa sklejania sie plytek po87 381 7 podaniu 4 mikromoli adenozynodwufosforanu ulega znacznym zmianom, w sensie zmniejszania sie sklejania, po podaniu trój-p-tolueno ..Jfonianu S-adenozylo—L—metioniny, droga wlewu dozylnego w ilosci 2 mg/kg. Prakty¬ cznie rzecz biorac nowa sól wykazuje silna aktywnosc terapeutyczna w a) zapobieganiu i leczeniu zakrzepów naczyn wiencowych i mózgowych oraz b) w profilaktyce zakrzepów, szczególnie w niektórych typach operacji chirurgicznych, zwlaszcza ginekologicznych i polozniczych. « 2. Podawanie nowej soli, w ilosci 5—10 mg dziennie, wielu pacjentom chorym na cukrzyce, lacznie z ma¬ lymi ilosciami insuliny, na drodze iniekcji domiesniowych i dozylnych, wywoluje znaczne zwiekszenie aktywno¬ sci insuliny i tym samym zmniejszenie nadmiaru cukru we krwi a takze umozliwia znaczne zmniejszenie dawek insuliny. 3. Trój-p-toluenosulfonian S-adenozylo-L-metioniny podawano setkom pacjentów o wtórnym niskim pozio¬ mie bialkowym, rozkojarzeniu przemiany bialkowej, trwalych lub ostrych uszkodzeniach watroby, stanach przed marskoscia i stanach marskosci watroby, objawach zlego wchlaniania bialek oraz objawach deficytu bial¬ kowego. Dawki wynoszace 50—200 mg dziennie, podawane na drodze iniekcji domiesniowych lub dozylnych, w zaleznosci od powagi przypadku, powodowaly statystycznie znaczacy wzrost poziomu bialek we krwi wzrost ilosci albumin i normalizowanie zaklóconego stosunku frakcji elektroforetycznych w surowicy krwi. Temu dzia¬ laniu wzmagajacemu anabolizm bialkowy czesto towarzyszyla znaczna poprawa samopoczucia oraz objektywna poprawa ogólnego stanu pacjenta. 4. Szczególnie zaskakujace wyniki uzyskiwano stosujac nowa sól w stanach chorobowych zwiazanych z zabu •. rzeniami w wymianie amin biogennych, npt: « a) w zaburzeniach neuropsychicznych, b) w chorobie Parkinsona i parkinsonizmie o rozmaitej etiopatogenezie, c) zaburzeniach cyklicznosci snu i czuwania* Co sie tyczy punktu a), to rozlegle badania polegajace na obserwacjach klinicznych zachowywania sie i testach Hamiltona i Wittenberga, wykazaly wyraznie, ze podawanie nowej soli S-adenozyno-L-metioniny, w ilosci od 20 do 50 mg dziennie, w ciagu 20—40 dni, powoduje bez stosowania innych rodzajów terapii, znacz¬ nie zmniejszenie glównych objawów znamiennych dla stanów depresyjnych. ¦ ¦ . W punkcie b), w zwiazku z leczeniem choroby Parkinsona i parkinsonizmu stwierdzono, ze: 1. Podawanie nowej soli, w ilosci 10—40 mg dziennie, na drodze iniekcji domiesniowej lub dozylnej, w za¬ leznosci od powagi przypadku, w polaczeniu z normalna kuracja za pomoca levodopa, daje statystycznie znacz¬ niejsza poprawe w wypadkach akjnazy i w stanach spastycznych niz w przypadku leczenia pacjentów tylko za pomoca Levodopa. Stwierdzono takze znaczne dzialanie w przypadku drzaczki zwiazanej z choroba Parkinsona, której nie mozna leczyc tylko przez podawanie Levodopa. « 2.. Podawanie nowej soli zmniejsza znacznie, zwiazane ze stosowaniem Levodopa, zaburzenia psychiczne, szczególnie stany depresyjne i objawy rozdraznienia. < 3. Podawanie nowej soli S-adenozylo-L-metioniny, w ilosciach podanych powyzej znacznie zapobiega wystepowaniu objawów ubocznych zwiazanych ze stosowaniem Levodopa a dotyczacych rozmaitych organów i narzadów. Szczególnie dotyczy to mdlosci, wymiotów, braku apetytu, nadcisnienia, oslabienia, migren, nad¬ miernego pocenia i bezsennosci.

Odnosnie punktu c), to znaczy zaburzen w cyklicznosci snu i czuwania, szczególnie zas bezsennosci nowy zwiazek podawany w ilosci 5—10 mg w znacznej mierze usuwa te przypadlosci, wywolujac sen fizjologiczny bez koniecznosci stosowania barbituranów lub innych substancji o dzialaniu na kore i centralne osrodki mózgowe. « Jak wynika z przytoczonych danych, nowy zwiazek otwiera liczne, nieoczekiwane perspektywy w terapii ludzkiej. Reasumujac, mozna stwierdzic, ze dzialanie nowego leku zostalo przebadane w nastepujacych dziedzi¬ nach terapii: uszkodzenia watroby stany z podwyzszona iloscia bialka we krwi, uogólniona lub miejscowa arterio- skleroza, zaburzenia psychiczne typu depresyjnego i neurologicznego. Wiele innych dziedzin terapii trzeba nato¬ miast jeszcze przebadac.

Najbardziej korzystnym jest podawanie trój-p-toluenosulfonianu S-adenozylo-L-metioniny na drodze inie¬ kcji domiesniowej i dozylnej.

We wszystkich tych kompozycjach skladnik aktywny jest rozcienczany zwyklymi, dopuszczalnymi w far¬ macji nosnikami farmaceutycznymi (patrz: Sivano Casadio "Technologia farmaceutica", wydawca Ed. Cisalpino, Mediolan, 1960).

Generalnie mozna stwierdzic, ze wielkosc dawek leczniczych trój-p-toluenosulfonianu S-adenozylo-L-me¬ tioniny wynosi od 5 do 200 mg dziennie w zaleznosci od rodzaju i stopnia zaawansowania choroby.8 87 381

Claims

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania trój-p-toluenosulfonianu S-adenozylo-L-metioniny o wzorze 2, znamienny t y m , ze do wodnego roztworu S-adenozylo-L-metioniny dodaje sie kwas p-toluenosulfonowy w ilosci 3—10, korzystnie 6 moli na mol SAM; roztwór wodny zateza sie do malej objetosci i wytraca sól za pomoca dodatku mieszajacego sie z woda rozpuszczalnika organicznego. <

2. „ Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze roztwór wodny zateza sie w temperaturze pokojo¬ wej, pod zmniejszonym cisnieniem lub liofilizuje do objetosci wynoszacej od 2/20 do 4/20, korzystnie 3/20 objetosci wyjsciowej. «

3. Sposób wedlug zastrz. 2; z n a m i e n n y tym ze w charakterze rozpuszczalnego w wodzie rozpusz¬ czalnika organicznego stosuje sie alkohol metylowy, alkohol etylowy, alkohol propylowy, alkohol izopropylowy, aceton lub keton metylowo-etylowy. «

4. Sposób wedlug zastrz. 1; z n a m i e n n y tym, ze wodny roztwór S-adenozylo-L-metioniny otrzy¬ muje sie na drodze lizy komórek drozdzy zawierajacych ten zwiazek za pomoca octanu etylu lub octanu metylu, w pokojowej temperaturze.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wodny roztwór S-adenozylo-L-metioniny absor¬ buje sie na kolumnie zawierajacej slabokwasny wymieniacz kationowy w formie kwasowej.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze S-adenozylo-L-metionine eluuje sie selektywnie za pomoca wodnego roztworu kwasu p-toluenosulfonowego.

7. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze kolumne przemywa sie wstepnie woda, a nastepnie 0,025 n roztworem kwasu octowego. ¦

8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze nadmiar kwasu p-toluenosulfonowego zobojetnia sie za pomoca silnie — lub slabozasadcwego wymieniacza anionowego do osiagniecia zawartosci kwasu wynosza¬ cej 3—10, korzystnie 6 moli, na mol S-adenozylo-L-metioniny. ¦

9. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze S-adenozylo—L-metionine eluuje sie selektywnie wodnym roztworem silnego kwasu, korzystnie kwasu solnego lub siarkowego. 10o Sposób wedlug zastrz. 9; z n a m i e n n y tym, ze eluat zobojetnia sie wymieniaczem anionowym w formie wodorotlenkowej oraz odpowiednia zasada, saczy i dodaje kwasu p-toluenosulfonowego w ilosci 3—10, korzystnie 6 moli, na mol S-adenozyno-L-rnetioniny„ < 11. Sposób wedlug zastrz. 9; z n a m i e n n y tym, ze chlorek lub siarczan S-adenozylo-L-metioniny wytraca sie z eluatu, rozpuszcza w wodzie i dodaje kwasu p-toluenosulfonowego w ilosci 3—10, korzystnie 6 moli, na mol S-adenozylo-L-metioniny. »87 381 NH- N N W CHo I J NH< CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-COOH OH OH Wzór 1 VV CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2-CH2-CH-COOH2CH3-C6HAS03H CH, NH^ OH OH CH3-C3HAS03 Wzór 2 CZYTELNIA Urzedo Pafcewlcwego r<-W\2\ .izcrzypoW- e| Lu «'-*i