Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych podwójnych soli S-adenozylo-L-metio- niny (SAM) o wlasciwosciach terapeutycznych. No¬ we sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, sa podwójnymi solami SAM z kwasem p-tolueno- sulfonowym i siarkowym o wzorze SAM+.HSO~4..H2S04.2CH306H4S03H oraz SAM+.HSO-4.H2SO^ CH3C6H4S03H. Bardziej dokladnie, wynalazek do¬ tyczy otrzymywania nowych, wyjatkowo trwalych soli SAM w sposób prosty i ekonomiczny w skali przemyslowej. Nowe sole stosuje sie w charakterze skladnika aktywnego kompozycji farmaceutycznych dla leczenia ludzi.S-adenozylo-L-metionina jest znanym zwiazkiem pochodzenia naturalnego, wystepujacym we wszy¬ stkich zywych organizmach od bakterii do roslin oraz od organizmów jednokomórkowych do naj¬ wyzej zorganizowanych ssaków, w tym takze ludzi.Struktura tego zwiazku jest znana od dluzszego czasu i wyraza sie wzorem 1, w którym X oznacza anion.W zywych organizmach SAM powstaje w wyni¬ ku dzialania enzymów (S-adenozylometioninosynte- taz lub S-adenozylotransferaz) w ukladzie cytopla- zmatycznym, z metionizy wprowadzonej z pokar¬ mem lub ATP obecnego w charakterze rezerwy energetycznej w kazdej zywej komórce.Jak obecnie wiadomo, SAM jest zwiazkiem o za¬ sadniczym znaczeniu w wielu biologicznych reak¬ cjach transmetylacji enzymatycznej, w wyniku cze- go jest ona bardzo cennym odczynnikiem bioche¬ micznym. Istnieje jednak powazny problem zwia¬ zany z wyjatkowa nietrwaloscia tego zwiazku w temperaturze pokojowej i powyzej pokojowej oraz z metodami wytwarzania, które sa trudne do prze¬ niesienia ze stali laboratoryjnej do przemyslowej.W ostatnich latach badania majace na celu uzy¬ skanie trwalej postaci S-adenozylo-L-metioniny, umozliwiajacej jej stosowanie w badaniach biolo¬ gicznych, skierowane byly na otrzymywanie soli trwalych w normalnych warunkach temperatury i wilgotnosci. Opracowano wiec sposób otrzymywa¬ nia chlorku i siarczanu SAM, sole te jednak mozna stosowac jedynie jako odczynniki biochemiczne i to w krótkim okresie czasu, gdyz nawet w postaci suchej i w niskiej temperaturze ich trwalosc jest ograniczona. Ponadto sposób ich wytwarzania po¬ zwala na uzyskiwanie tylko malych porcji a nie na produkcje w skali przemyslowej.Nieoczekiwanie udalo sie znalezc nowe sole SAM, nieograniczenie trwale w temperaturze do 45°C, które mozna wytwarzac w skali przemyslowej z duza wydajnoscia i w oplacalny ekonomicznie spo¬ sób. Sole te wykazuja niespodziewanie wysoka ak^ tywnosc w wielu róznych dziedzinach terapii ludz¬ kiej, czesto ze soba nawzajem nie zwiazanych.O wysokim stopniu osiagnietego postepu technicz¬ nego swiadcza dane przedstawione w ponizszej ta¬ blicy I, w której podano porównanie trwalosci w temperaturze 45°C, w postaci suchej dwu najbar- 95 6663 95666 4 dziej dotychczas trwalych soli SAM, tzn. chlorku i siarczanu, z trwaloscia nowego dwusiarczano- -dwu-p-toluenosulfonianu. Wyniki w tablicy poda¬ ne sa w °/o nierozlozonej S-adenozylo-L-metioniny we wskazanym czasie.Tablica I 1 Sól Chlorek Siarczan Dwusiarczano-dwu- OWBTffgy- 50 100,1 60 99,9 120 100.2 180 dni 110,4 | I Wartosci trwalosci uzyskane dla dwusiarczano- ll^ftfr^^^JOLprcj \ s3 calkowicie równowazne Jwttifeo&iMr^iizyslWfym dla dwusiarczano-dwu-p- -Kluehbsuffolniailu.,ur Sposób wedlug wynalazku wytwarzania nowych soli sklada sie z nastepujacych kolejnych etapów: (a) * wytwarzania roztworu bogatego w SAM, (b) stracania SAM z roztworu wodnego po przesacze¬ niu nasyconym roztworem wodnym kwasu pikro- lonowego lub roztworem tegoz kwasu w rozpusz¬ czalniku organicznym mieszajacym sie z woda, ta¬ kim jak alkohol metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, n-butylowy lub izobutylowy, aceton, keton metylowoetylowy, keton metylowoizobutyIo¬ wy, octan etylu, czterowodorofuran, 2-metoksyeta- nol, 2-eteksyetanol, dioksan lub dwumetyloform- amid, (c) rozpuszczanie odsaczonego osadu w mie¬ szaninie zawierajacej równe objetosci rozpuszczal¬ nika czesciowo mieszajacego sie z woda, takiego jak keton metylowoetylowy, keton metylowoizobu- tylowy, b-butanol lub izobutanol, oraz roztwór' kwasu siarkowego i p-toluenosulfonowego o takiej samej normalnosci, (d) oddzielenia fazy organicznej i dodanie do fazy wodnej ketonu lub alkoholu cal¬ kowicie mieszajacego sie z woda, (e) powtórnego rozpuszczenia osadu w 10—20% roztworze kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu i odbarwianie roztworu weglem aktywnym, i (f) dodania do ste¬ zonego roztworu rozpuszczalnika organicznego zdol¬ nego do wytracania czystej SAM w postaci krysta¬ licznej i dobrze sie saczacej.Proces ten moze prowadzic róznymi metodami przedstawiajacymi taka sama wartosc jesli idzie o otrzymywanie stezonego roztworu SAM.W celu otrzymania roztworu bogatego w SAM na drozdze (Saccharomyces Carevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis i inne), wzbogacone w SAM dzieki dodatkowi w odpowiednich warunkach me- tioniny (Schlenk, Enzymologia, 29, 283 (1965), dziala sie octanem etylu a nastepnie 0,1—0,5 korzystnie 0,35 n kwasem siarkowym, w temperaturze poko¬ jowej. Nastepnie wtedy liza komórek i 100% SAM zostaje wyekstrahowane przez rozpuszczalnik.Wode i octan etylu stosuje sie korzystnie w ilosci 1/20—1/5 wagi mokrej masy komórkowej. Czas operacji wynosi 15—45 minut, korzystnie 30 minut.Nastepnie dodaje sie kwas siarkowy i prowadzi sie lize w ciagu 1—2, korzystnie 1,5 godziny. Warto dodac, ze o wiele bardziej dogodnym jest prowa¬ dzenie lizy komórek drozdzy za pomoca mieszaniny rozpuszczalnika organicznego i rozcienczonego kwa* su siarkowego, w pokojowej temeperaturze, niz za pomoca zazwyczaj stosowanego dzialania kwasem B nadchlorowym w temperaturze pokojowej lub kwa¬ sem mrówkowym albo octowym w temperaturze 6Ó°C lub innych metod. Proces bowiem wtedy pro¬ wadzi sie w temperaturze pokojowej, co jest bar¬ dzo korzystne z punktu widzenia trwalosci SAM oraz w takich warunkach, ze roztwór mozna latwo odsaczyc od pozostalosci masy komórkowej i nie zawiera on zadnych zanieczyszczen w przypadku stosowania do lizy innych srodków, które to za¬ nieczyszczenia sa trudne! do usuniecia za pomoca znanych sposobów otrzymywania czystej • SAM.Ponadto roztwór bogaty w SAM mozna równiez . otrzymac na drodze enzymatycznej syntezy prowa¬ dzonej przy zastosowaniu enzymu ATP-metionino- adenozylotransferazy (E.C.2.4.2.12) w inkubowanej i0 mieszaninie zawierajacej adenozynotrójfosforan i metionine.W warunkach przemyslowych stosuje sie czysty enzym w postaci, która mozna izolowac zarówno z inkubowanej mieszaniny jak i z wyprodukowa- nej SAM.Sposób oczyszczania enzymu ATP-metioniono- adenozylotransferazy polega na zastosowaniu chro¬ matografii z powinowactwem oraz metode prowa¬ dzenia reakcji w kolumnie, która umozliwia pro- wadzenie procesu enzymatycznej syntezy.Chromatografie z powinowactwem specyficznego enzymu, prowadzi sie przepuszczajac jego roztwór, np. surowy ekstrakt z drozdzy lub Escherichia coli, przez kolumne wypelniona stalym nosnikiem za- wierajacym kowalentnie zwiazane grupy dzialajace jako kompetytywny inhibitor enzymu.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze doskonalym wy¬ pelnieniem do tego rodzaju kolumny do oczyszcza¬ nia jest aktywowany zel polisacharydów, z który- 40 mi zwiazana jest kowalentnie L-lizyna. Powino¬ wactwo enzymu do reszt lizyny zwiazanych ze stala matryca powoduje opóznienie jego elucji z kolu¬ mny i tym samym umozliwia oddzielenie od in¬ nych substancji bialkowych i otrzymanie w bardzo 45 czystej postaci. Jednakze wydzielanie enzymu z eluatu, w celu powtórnego uzycia do nastepnej syntezy enzymatycznej, daje calkowicie niezado¬ walajace wyniki, gdyz natychmiast po wydzieleniu jego trwalosc zmniejsza sie w czasie. Ponadto po 50 jednorazowym uzyciu do syntezy SAM enzym zo¬ staje podczas izolacji SAM zniszczony.Stwierdzono, ze doskonale wyniki uzyskuje sie absorbujac specyficzny enzym na odpowiednim nosniku stalym i prowadzac katalityczna reakcje 55 pomiedzy metionina i ATP, prowadzaca do po¬ wstawania SAM, w kolumnie. Odpowiednim nos¬ nikiem stalym jest wielocukier aktywowany czyn¬ nikiem zdolnym do wiazania bialek, takim jak bromocyjan. Przepuszczajac przez kolumne roztwór 60 zawierajacy ATP i metionine w odpowiednim bu¬ forze otrzymuje sie w eluacie opuszczajacym ko¬ lumne S-adenozyio-L-metionine. Tak prowadzony pierwszy etap sposobu wedlug wynalazku umo¬ zliwia otrzymanie SAM w bardzo czystej postaci, 65 W srodowisku kwasnym jedynym zwiazkiem wy-95 666 6 tracanym przez kwas pikrolonowy jest SAM, co zostalo stwierdzone na podstawie chromatografii cienkowarstwowej wykonywanej wedlug Anal.Bichem. 4, 16—28 (1971). Kwas pikrolonowy wy¬ kazuje wiec niespodziewanie nieslychanie selekty¬ wne dzialanie. Inne srodki stosowane do chwili obecnej, takie np. jak kwas pikrynowy, sól Rei- necke'go lub kwas borowy, wytracaja bardzo za¬ nieczyszczony osad SAM, wymagajacy dalszego oczyszczania za pomoca kolumnowej chromatogra¬ fii na zywicach jonowymiennycli, który to proces jest nieslychanie drogi i trudny do prowadzenia w skali przemyslowej. Trudno jest takze w ten sposób otrzymac produkt o wymaganej czystosci.Zastosowanie roztworu kwasu pikrolonowego w wo¬ dzie lub w wyzej opisanych rozpuszczalnikach or¬ ganicznych nie stwarza zadnych problemów i moze byc prowadzone w temperaturze pokojowej.W nastepnym etapie (c) proces korzystnie pro¬ wadzi sie stosujac roztwór zawierajacy kwas p-to- luenosulfonowy i kwas siarkowy, oba 0,05—0,2 n, korzystnie 0,1 n, w rozpuszczalniku organicznym, szczególnie w rozpuszczalniku mieszajacym sie z woda, takim jak keton metylowoetylowy lub n-bu- tanol. Zastosowanie rozpuszczalnika organicznego umozliwia znaczne zredukowanie ilosci wodnego roztworu kwasu i praktycznie calkowite zuzycie kwasu pikrolonowego.W dalszym etapie (d) proces prowadzi sie stosu¬ jac korzystnie 4—8 objetosci (w odniesieniu do objetosci roztworu wodnego) rozpuszczalnika, ta¬ kiego jak aceton, alkohol metylowy, alkohol etylo¬ wy lub alkohol propylowy.Ponadto stwierdzono nieoczekiwanie, ze jesli w etapie (e) stosuje sie minimalna ilosc metanolu nie¬ zbedna do rozpuszczenia osadu z etapu (d), w na¬ stepnym etapie (f) otrzymuje sie podwójna sól o wzorze SAM+.HSO-4.H2S04.2CH3C6H4S03H. Jezeli natomiast stosuje sie co najmniej dwukrotny nad¬ miar metanolu w etapie (f), wytraca sie podwójna sól o wzorze SAM+.HSO-4.H2S04.CH3C6H4S03H. Za¬ stosowanie posredniej ilosci metanolu prowadzi di otrzymywania mieszaniny obu powyzszych soli.W procesie wytracania którejkolwiek z nowych soli w etapie (f) stosuje sie rozpuszczalniki organi¬ czne, takie jak metanol, eter etylowy, chloroform, n-propanol, izoptopanol, n-butanol, izobutanol, II- -rz.-butanol, alkohol izoamylowy lub czterowodoro- furan.Sole podwójne SAM, otrzymywane sposobem we¬ dlug wynalazku, mozna w postaci suchej przecho¬ wywac w ciagu nieograniczonego okresu czasu, nie stwierdzajac praktycznie zadnych zmian.Sposób wedlug .wynalazku nie wymaga w za¬ dnym etapie stosowania temperatury wyzszej niz pokojowa. Proces prowadzi sie w srodowisku kwa¬ snym, co ma duze znaczenie w zapobieganiu roz¬ kladu SAM. Proces powyzszy nie wymaga stoso¬ wania skomplikowanych i pracochlonnych metod, takich jak chromatografia kolumnowa na zywi¬ cach jonowymiennych lub na weglu, które to me¬ tody utrudniaja przeniesienie procesu do skali przemyslowej Z badan biochemicznych wiadomo od kilku lat, ze S-adenozylo-L-metionina jest jednym specyficz¬ nym nosnikiem grup metylowych w zywych orga¬ nizmach w reakcjach biochemicznych przenoszenia grupy metylowej. Ta reakcja biochemiczna ma podstawowe znaczenie w przemianach tluszczo- g wyeh, bialkowych i weglowodanowych.Do niektórych, najbardziej waznych reakcji transmetylowania zaleznych od S-adenozylo-L-me- tioniny naleza: a) N-transmetylowanie adeniny, karnityny, kar- 19 nozyny, kreatyny, 2,6-dwuaminopuryny, adrenaliny, guaniny, hordeniny, N'-amidu kwasu nikotynowe¬ go, fosfatylodwucholiny, rycyniny, b) O-transmetylowanie N-acetyloserotoniny, do- paminy, epininy, d-adrenaliny, 1-adrenaliny, ergo- sterolu, 1-noradrenaliny, paktyny, ubichinonu, c) S-transmetylowanie 2,3-dwumerkaptopropano- lu, siarkowodoru, metioniny, metylomerkaptanu, kwasu S-merkaptopropionowego, tripirymidyny, tiuracylu, d) C-transmetylowanie cytozyny i tyminy.Oznacza to w odniesieniu do organizmu ludzkie¬ go, ze S-adenozylo-L-metionina uczestniczy w na¬ stepujacych przemianach:'biosynteza choliny, bio¬ synteza fosfatydylocholiny, dzialalnosc eao^iRów wymagajacych obecnosci grupy —SH, przemiana katecholamin, przemiany biogennych amin central¬ nego ukladu nerwowego, przemiany serotoniny, przemiany histaminy, przemiany witaminy B12 i kwasu foliowego, przemiany kreatyny, przemiany 80 miozyny, przemiany nistonów, przemiany RNA i DNA, przemiany substancji bialkowych, przemiany niektórych hormonów o budowie cyklopentanoper- hydrofenantrenu, których glównymi przedstawicie¬ lami sa estrogeny, oraz przemiany trój glicerydów.Wiadomym jest takze, ze S-adenozylo-L-metio¬ nina ulegajac demetylacji pod dzialaniem enzymów z grupy metylotransferaz, przeksztalcana jest — w S-adenozylohomocysteine (SAO). Zwiazek ten jest bezposrednim donorem grup tiolowych i tym 40 samym odgrywa wazna role w przemianach wszy¬ stkich zwiazków wymagajacych obecnosci grup —SH dla przeniesienia ich aktywnosci biologicznej.Szczególnie dotyczy to niektórych bioenzymówi za¬ wierajacych siarke aminokwasów. 45 S-adenozylohomocysteina ulega w organizmie de¬ karboksylacja produkt tej dekarboksyiacji jest glównym dawca grupy aminopropylowej, nieodzo- amej, zgodnie ze wspólczesnym poziomem wiedzy oiochemicznej, do biosyntezy poliamin. Proces ten 50 jest katalizowany przez rozmaite enzymy, z któ¬ rych specyficzna jest aminopropylotransferaza.Reasumujac mozna stwierdzic, ze obecnosc S~ade- nozylo-L-metioniny w organizmie Judzkim jest sci¬ sle zwiazana z nastepujacymi reakcjami bioche- gj micznymi: A — transmetylowanie (specyficzne przenoszenie grupy CH3), B — transsulfuracja (specyficzne przenoszenie grupy SH), 60 C — transaminopropylowanie (specyficzne prze¬ noszenie grupy aminopropylowej).Jak widac z przytoczonych danych, E-adenozylo- -L-metionina moze wykazywac dzialanie terapeu¬ tyczne w leczeniu stanów chorobowych zwiazanych 65 z brakiem lub niedoborem w organizmie niektó-95666 7 8 rych, wspomnianych wyzej substancji. Wyjatkowa jednak nietrwalosc S-adenozylo-L-metioniny i brak do chwili obecnej sposobu otrzymywania jej posta^ ci trwalej w normalnych warunkach uniemozliw wialy przeprowadzenie badan farmakologicznych i klinicznych i tym samym nie pozwalaly na wpro¬ wadzenie tego zwiazku do terapii ludzkiej. Dopiero wynalezienie nowych soli SAM, wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku, trwalych praktycznie nieogfaniczenie dlugo w pokojowej temperaturze, pozwolilo na przeprowadzenie szerokich badan kli¬ nicznych i farmakologicznych i doprowadzilo do odkrycia, ze nowe sole posiadaja wlasciwosci tera¬ peutyczne, zaskakujace pod wzgledem ich jakosci i skutecznosci.Z ogromnej ilosci danych farmakologicznych i klinicznych, dotyczacych nowych soli, przedsta¬ wiono w dalszej czesci opisu jedynie wybrane ele¬ menty, w ilosci wystarczajacej dla znajacych za¬ gadnienie, do zorientowania sie w podstawowych wlasciwosciach nowego produktu oraz mozliwo¬ sciach jego zastosowania w terapii ludzkiej.Dla uproszczenia, w dalszej czesci opisu stosuje sie okreslenie sól SAM, która dotyczy obu podwój¬ nych soli wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku, gdyz ich zastosowanie jest absolutnie iden¬ tyczne. Podajac dane farmakologiczne i kliniczne stosowano dla uproszczenia okreslenie SAM dla soli SAM+.HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H. Jakkolwiek w badaniach stosowano zawsze powyzsza sól, uzy¬ skane dane odnosza sie równiez dobrze takze i do drugiej podwójnej soli.Toksycznosc. Sól SAM wytworzona sposobem wedlug wynalazku nie wykazuje absolutnie zadnej toksycznosci, zarówno ostrej jak i przewleklej jak równiez nietolerancji miejscowej i dzialan ubocz¬ nych. Wartosc LD50 dla myszy przy podawaniu do¬ ustnym jest wyzsza niz 6 g/kg, a przy podawaniu dootrzewnym 2,5 g/kg wagi ciala.Badania tolerancji i toksycznosci przewleklej przeprowadzono na szczurach rasy Wister i Sprauge- -Dowley, podajac preparat w ciagu 12 miesiecy w ilosci 10—26 mg/kg wagi ciala dziennie. Po zakon¬ czeniu podawania preparatu rozmaite organy zwie¬ rzat tak doswiadczanych nie wykazywaly zadnych zmian patologicznych. Test na teratogennosc prze¬ prowadzano na królikach i szczurach. Okazalo sie, ze nawet przy podawaniu ogromnych ilosci SAM, okolo 10-krotnie wyzszych od najwyzszej dawki terapeutycznej, nie stwierdza sie dzialania terato¬ gennego lub zmian zarodków albo plodu.Dodanie 0,1—0,2 mg/ml preparatu nie wywoluje zadnych zmian w hodowlach tkankowych limfo¬ cytów ludzkich oraz komórek watrobowych myszy.Podczas podawania dozylnego w ilosci do 40 mg/ /kg nie zaobserwowano u królików dzialania gora- czkotwórczego. Podawanie dozylne w ilosci 40 mg/kg nie powoduje u królików i kotów zadnych zmian w cisnieniu tetniczym, czestotliwosci pracy serca i oddechu oraz nie zmienia zapisu elektrokardio¬ graficznego. Tolerancja miejscowa przy iniekcjach domiesniowych, nawet przy podawaniu powtarza¬ nych w ciagu 180 dni, oraz przy iniekcjach do¬ zylnych w brzeznych naczyniach malzowiny usznej, jest doskonala.Badania na ludziach przeprowadzono wykorzy¬ stujac mlodych, zdrowych ochotników obojga plci, o przecietnej wadze 70 kjg. Preparat podano na drodze iniekcji dozylnych lub wlewów w ilosci —300 mg. Jednoczesnie prowadzone badanie najwyzszego i najnizszego cisnienia, pulsu i czesto¬ tliwosci oddechu po 1, 5, 15, 20, 30 i 60 minutach oraz po 2, 3, 6, 8, 10, 12 i 24 godzinach nie wyka¬ zaly odstepstw od normalnych wartosci.Zapis elektrokardiograficzny nie wykazywal zad¬ nych zmian w wartosciach p w przedziale ST ani tez skurczu przedwczesnego lub innych zaburzen po 30 sekundach oraz po 1, 2, 3, 5, 10 i 20 minu¬ tach od czasu podania leku.Nie stwierdzono równiez w systemie krwiotwór¬ czym oraz w pracy watroby i nerek zadnych sta¬ tystycznie uchwytnych odstepstw od stanu normal¬ nego.Farmakologia. Równiez w badaniach farmakolo¬ gicznych jesli jest mowa o podawaniu SAM, nale¬ zy rozumiec, ze stosowano nastepujace sole: SAM *\ :HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H i/lub SAM+.HS04^..CH3C5H4SO3H. * W celu oznaczenia sposobu dystrybucji SAM mie¬ dzy poszczególne tkanki, stosowano preparat zna¬ czony izotopem wegla C14 w grupie metylowej. Dy¬ strybucje preparatu badano podajac go szczurom w ilosci 10 mg/kg, co odpowiada 24 ^Ci preparatu radioaktywnego. Aktywnosc wlasciwa preparatu wynosila 58 mCi/mmol. Równolegle prowadzono badania autoradiograficzne na myszach. Wyniki obu serii doswiaczen wykazaly, ze SAM rozprze¬ strzenia sie bardzo szybko do wszystkich tkanek.Dla przykladu podano w ponizszej tabeli czesc da¬ nych dotyczacych poszczególnych organów.Dystrybucja SAM w niektórych tkankach szczurów (wartosci podano w \ig/g) Tkanka Watroba Gruczoly Sledziona nadnercze Przysadka Podwzgórze Kora Plazma mi¬ nut 4,02 4,26 3,15 ,6 0,7 0,6 18,6 1 7,47 8,46 2,96 ,8 1,5 1,1 ,2 4 13,1 JW 8,1 19,5 2,4 1,8 ,3 8 13,4 ,8 6,2 11,3 3,0 2,1 4,5 24 go¬ dziny 13,5 ,9 6,7 ,3 3.2 2,3 3,1 Z uzyskanych wyników mozna wnioskowac, iz nowe sole przenosza grupy metylowe do tkanek wymagajacych ukladów transmetylujacych. Innymi slowy, stwierdzono w ten sposób zdolnosc umiej¬ scawiania sie nowego preparatu w narzadach wy¬ magajacych obecnosci czynników transmetyluja¬ cych. Obserwacje te zostaly nastepnie potwierdzo¬ ne przez szereg testów farmakologicznych. Seria doswiadczen wykonanych na szczurach wykazala, ze nowe zwiazki wykazuja znaczne dzialanie zapo¬ biegajace w przypadkach stluszczenia watroby wy¬ wolywanego dieta z nadmiarem tluszczów i bialek wedlug Handlera oraz w przypadkach stluszczenia 40 45 50 55 609 95 666 wywolywanego ostrym zatruciem alkoholem lub innymi substancjami toksycznymi, takimi jak czte¬ rochlorek wegla lub bromobenzen. Dzialanie takie uzyskuje sie juz przy podaniu preparatu dootrzew- nowo w ilosci 15 mg/kg. Badania zarówno morfo- histochemiczne jak* i analityczne wykazaly, ze SAM znacznie hamuje odkladanie sie tluszczów w wa¬ trobie, natomiast sprzyja odtworzeniu sie normal¬ nego poziomu fosfolipidów, obnizonego po zatruciu czterochlorkiem wegla.Poziom fosfolipidów w watrobie szczurów po zatruciu czterochlorkiem wegla i podaniu SAM Roztwór fizjologiczny Czterochlorek wegla Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo 150 gm/kg SAM Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo 150 gm/kg SAM Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo ATP + metio¬ nina 15 mg/kg Poziom fosfolipi¬ dów w mg/g ,57+1,18 18,87+1,06 27,20 + 1,25 ,87+0,42 19,9 +0,92 Podane wyniki sa srednimi statystycznymi z 10 oznaczen dla kazdej grupy. W badaniach stosowano doswiadczalne urzadzenie wywolujace u szczurów tak zwana cholesterolowa degeneracje watroby (Ridout i wsp., Biochem. J., 52, 99 (1952). Przy za¬ stosowaniu tej metody i odpowiedniej diety, uzy¬ skuje sie znaczny wzrost poziomu tluszczów i cho¬ lesterolu w watrobie zwierzatek doswiadczalnych.Substancje, które dzialaja na przemiane tluszczowa, zmniejszaja lub znosza ten wzrost.Zwierzeta podzielono na szesc grup. Pierwsza otrzymywala dowolna diete, drugiej podawano podstawowa diete Ridouta w ilosci 20 g dziennie, pozostale grupy otrzymywaly te sama diete ale wzbogacona 0,2 g/dzien cholesterolu. Doswiadcze¬ nie trwalo trzy tygodnie. Zwierzetom z grupy 4, 5 i 6 podawano dootrzewnowe 1, 2 lub 5 mg/kg SAM dziennie. Po uplywie trzech tygodni wszystkie zwie¬ rzeta zabijano, wyjmowano watrobe i oznaczano calkowita zawartosc tluszczów wedlug Besta i wsp., Biochem. J., 40, 368 (1956) i cholesterolu wedlug Sperry'ego i Branda, J. Biol. Chem. 150, 315 (1943).Uzyskane wyniki wykazaly, ze zwierzeta, którym podano SAM w ilosci 1—2 mg/kg byly malo chro¬ nione, natomiast zwierzeta, którym podawano 5 mg/ /kg SAM byly calkowicie chronione przed nadmia¬ rem cholesterolu.W nastepnym tescie farmakologicznym badano dzialanie przeciwzapalne i znieczulajace SAM.Z wielu mozliwych testów wybrano najbardziej klasyczny test na ostre zapalenie, polegajace na wywolywaniu obrzeku przez podawanie karageniny lub bialka z jaj oraz test na zapalenie przewlekle polegajacy na wywolywaniu ziarniniaka pigulkami z waty lub zapalenia stawów przez odpowiednie adjuwanty. We wszystkich przypadkach SAM wy¬ kazywal aktywnosc, zarówno przy podaniu doust¬ nym w ilosci 20—100 mg/kg jak i pozajelitowym Poziom cholesterolu w watrobie po zakonczeniu doswiadczenia (srednia z jednej serii) Grupa I II.III IV V .VI Waga swiezej watroby w g 18 16 17 16 16 Calkowita zawartosc tluszczów g 1,41 1,93 3,84 3,70 3,5 2,0 % 9,4 ,6 24,0 21,6 21,9 12,5 Cholesterol mg 40 68 92 90 67 61 " % 2,6 3,7 ,7 ,2 4,1 3,8 w ilosci 10 i 20 mg/kg, w porównaniu z innymi, znanymi preparatami farmaceutycznymi, np. Ibu- profenem i Indometacina. Testy na dzialanie znie¬ czulajace stosowano w postaci testu goracej plytki, dzialania kwasem octowym i testu Randala i Se- litto u szczurów. Nowe preparaty wykazaly w tych testach aktywnosc w porównaniu ze znanymi srod¬ kami farmaceutycznymi o takim samym dzialaniu.W nastepnym tescie badano dzialanie SAM na czas spania wywolywanego podawaniem barbitura¬ nów. W tym celu grupie myszy podawano dootrze¬ wnowe heksobarbital w ilosci 80 mg/kg, poslugujac sie metoda opisana przez Holtena i Larsena, w Acta Pharacol. Toxicol. 12, 346 (1956). Jedna z grup pozostawiono jako kontrolna, drugiej podawano' do¬ otrzewnowe SAM w ilosci 10 mg/kg.Kontrola SAM, 10 mg/kg, dootrzewnowo Czas spania w minutach i 24,4±2,7 41,2+5,8 Jak wynika z powyzszych danych SAM przedluza czas spania wywolywanego heksobarbitalem.Badania kliniczne. Jesli jest mowa o podawaniu SAM, nalezy to rozumiec jako stosowanie SAM+..HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H i/lub SAM+.HS04"..H2SO4.CH3C5H4SO3H.Poslugujac sie danymi uzyskanymi z badan far¬ makologicznych przeprowadzono badania kliniczne w stanach chorobowych, które wydaja sie byc bez¬ posrednio lub posrednio zwiazane z zaburzeniami: 1 — przemian tluszczów, 2 — przemian bialkowych i weglowodanowych, 3 — przemian katecholoamin i amin biogennych. 1. Podczas badan klinicznych, przeprowadzonych na setkach pacjentów, zaobserwowano, ze przy po¬ daniu SAM w róznych dawkach, uzyskuje sie szyb¬ ki spadek poziomu lipidów watrobowych w sta¬ nach stluszczenia watroby o róznej patogenezie.Oceny dokonywano po zakonczeniu podawania pre¬ paratu oraz nastepnie po uplywie 60 dni. Podawa¬ nie nowego preparatu powoduje równiez znaczny spadek wysokiego poziomu cholesterolu i lipidów we krwi oraz normalizuje zmiany stosunku p- do a-lipoprotein, w przypadkach niewyrównanych sta¬ li 40 45 50 55 6095 666 11 12 nów zwiazanych z nadmiernie wysokim poziomem lipidów we krwi.Obnizanie poziomu cholesterolu i lipidów we krwi jest zalezne od wielkosci dawki i wystepuje juz przy podaniu 20—30 mg, 2—3 razy dziennie.W czystej miazdzycy polaczonej z kliniczna ma¬ nifestacja zaburzen psychicznych, ze zmianami w centralnym ukladzie nerwowym, wywolywanymi przez zmiany sklerotyczne naczyn mózgowych i zja¬ wisko niedotlenienia mózgu, podawanie SAM na drodze iniekcji domiesniowych, lub w ciezszych przypadkach iniekcji dozylnych albo powolnych wlewów dozylnych, w ilosci 20—40 mg, 3—4 razy dziennie, wywoluje korzystna zmjane objawów cho¬ robowych. W szczególnosci w stanach wyraznego niedotlenienia uzyskiwanie powrotu normalnych funkcji zyciowych jest bardzo szybkie i statystycz¬ nie znaczace. W objawach wystepujacych po pe¬ knieciu naczyn mózgowych stwierdzono bardzo szybka poprawe obrazu klinicznego. 2. Setkom pacjentów o wtórnym niskim pozio¬ mie bialkowym, rozkojarzeniu przemiany bialko¬ wej, trwalych lub ostrych uszkodzeniach watroby, stanach przed marskoscia i stanach marskosci wa¬ troby, objawach zlego wchlaniania bialek oraz ob¬ jawach deficytu bialkowego, podawano SAM w dawkach dziennych wynoszacych 20—200 mg. Daw¬ ki te, podawane na drodze iniekcji domiesniowych lub dozylnych, w zaleznosci od powagi przypadku, powodowaly statycznie znaczacy wzrost poziomu bialka we krwi, wzrost ilosci albumin i normalizo¬ wanie zaklóconego stosunku frakcji elektrofore- tycznych w surowicy krwi. Temu dzialaniu wzma¬ gajacemu metabolizm bialkowy czesto towarzyszyla znaczna poprawa samopoczucia oraz obiektywna poprawa ogólnego stanu pacjenta i zaobserwowana we wszystkich testach normalizacja funkcjonowa¬ nia watroby. 3. Szczególnie zaskakujace wyniki uzyskiwano podczas badan klinicznych, stosujac nowe sole en¬ zymatyczne wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku, w stanach chorobowych wyraznie zwiaza¬ nych z zaburzeniami w wymianie amin biogen¬ nych, np.: a) w zaburzeniach neuropsychicznych, b) w chorobie Perkinsona i perkinsonizmie o roz¬ maitej etiopatogenezie, c) w stanach zapalnych i bólowych zwiazanych z zapaleniem stawów i kosci oraz bólach pocho¬ dzenia neurologicznego, d) w zaburzeniach cyklicznosci snu i czuwania.Co cie tyczy punktu a), to rozlegle badania pole¬ gajace na obserwacjach klinicznych zachowywania sie i testach Hamiltona i Wittenberga, wykazaly wyraznie, ze .podawanie SAM, w ilosci 20—50 mg, 3—4 razy dziennie, w ciagu 5—15 dni, powoduje, bez stosowania innych rodzajów terapii, znaczne zmniejszenie glównych objawów znamiennych dla stanów depresyjnych.W punkcie b), w zwiazku z leczeniem choroby Parkinsona i parkinsonizmu stwierdzono, ze: 1. Podawanie soli SAM, w ilosci 10—40 mg dzien¬ nie, na drodze iniekcji domiesniowej lub dozylnej, albo doustnie, w zaleznosci od powagi przypadku, w polaczeniu z normalna kuracja za pomoca Levo- dopa, daje statystycznie znaczniejsza poprawe w wypadkach akinazy i w stanach spastycznych niz w przypadku leczenia pacjentów tylko za pomoca Levodopa. Stwierdzono takze znaczne dzialanie w przypadku drzaczki zwiazanej z choroba Parkin¬ sona, której nie mozna leczyc tylko przez podawa¬ nie Levodopa. 2. Podawanie soli SAM zmniejsza znacznie zabu¬ rzenia psychiczne zwiazane ze stosowaniem Levo- dopa, szczególnie stany depresyjne i objawy roz¬ draznienia. 3. Podawanie soli SAM, w ilosciach podanych po¬ wyzej, znacznie zapobiega wystepowaniu objawów ubocznych zwiazanych ze stosowanie Levodopa a dotyczacych rozmaitych organów i narzadów.Szczególnie dotyczy to mdlosci, wymiotów, braku apetytu, nadcisnienia, oslabienia, nadmiernego po¬ cenia i bezsennosci Odnosnie punktu c), sól SAM, która w badaniach farmakologicznych wykazywala wyrazne dzialanie przeciwzapalne i przeciwbólowe,, okazala sie byc aktywna w stosunku do wszystkich postaci zapale¬ nia stawów i kosci, przy podawaniu na drodze iniekcji domiesniowych lub dozylnych, w dawce dwa razy po 30 mg dziennie w pierwszym oraz 30— 50 mg, cztery razy dziennie, w drugim przypadku.Juz po siedmiodniowym leczeniu skurcz miesni, ograniczenia ruchowe, bóle lokalne i drzaczka, ule¬ gaja w porównaniu z placebo, znacznej poprawie.Badania krwi w kale nie wykazywaly zadnych zmian podczas podawania leku. Sól SAM, w po¬ równaniu z niesterydowymi lekami przeciwzapal¬ nymi, stosowanymi w badaniach slepoty, wykazuje skutecznosc terapeutyczna równa indometacynie.Dzialanie przeciwbólowe soli SAM sprawdzono takze u pacjentów z róznymi objawami neurologi¬ cznymi, takimi jak zapalenie nerwów, zapalenie wielonerwowe, rwa kulszowa, zapalenie okreznicy, krecz szyi. Efekt terapeutyczny uzyskuje sie po pierwszym dniu podawania, w ilosci 15 mg, dwa razy dziennie,, na drodze iniekcji' domiesniowej lub —50 mg, 3—4 razy dziennie, przy podawaniu do¬ ustnym. Analogiczne wyniki uzyskiwano podajac lek doustnie, w postaci tabletek do zucia, pacjen¬ tom .cierpiacym na trwale lub nawracajace mi¬ greny.Odnosnie punktu c), to znaczy zaburzen w cykli¬ cznosci snu i czuwania, szczególnie zas bezsennosci, nowy zwiazek podawany doustnie w ilosci 10— mg, w znacznej mierze usuwa te przypadlosci, wywolujac sen fizjologiczny bez koniecznosci sto¬ sowania barbituranów lub innych substancji dzia¬ lajacych na kore i centralne osrodki mózgowe.Jak wynika z przytoczonych danych, nowy lek otwiera liczne, nieoczekiwane perspektywy w te¬ rapii ludzkiej. Reasumujac, mozna stwierdzic, ze dzialanie nowego leku zostalo przebadane w naste¬ pujacych dziedzinach terapii: uszkodzenia watroby, stany z podwyzszona iloscia bialka we krwi, uogól¬ niona lub miejscowa arterioskleroza, zaburzenia psychiczne typu depresyjnego i neurologicznego, choroby stawów, bóle typu neurologicznego oraz zaburzenia rytmu snu i czuwania. Wiele innych dziedzin terapii trzeba natomiast jeszcze przebadac.Najbardziej korzystne jest podawanie nowych 40 45 50 55 6013 95 666 14 soli SAM w postaci iniekcji domiesniowych lub do¬ zylnych albo doustnie lub w postaci tabletek pod- jezykowych lub kapsulek.Przyklad I. Do 90 kg drozdzy wzbogaconych w S-adenozylo-L-metionine w ilosci 6,88 g/kg, w sposób opisany przez Schlenka w Enzymologia, 29, 283 (1965), dodaje sie 11 litrów octanu etylu i 11 li¬ trów wody, w pokojowej temperaturze. Calosc mie¬ sza sie energicznie w ciagu 30 minut, dodaje 50 li¬ trów 0,35 n kwasu siarkowego i kontynuuje mie¬ szanie w ciagu dalszej 1,5 godziny. Po przesaczeniu i przemyciu woda otrzymuje sie 140 litrów roztwo¬ ru zawierajacego 4,40 g/litr SAM, co odpowiada 99,5 jej zawartosci w surowcu wyjsciowym.Do powyzszego roztworu dodaje sie, podczas mie¬ szania, roztwór 2,3 kg kwasu pikrólonowego, w 25 litrach ketonu metylowoetylowego. Nastepnego dnia oddziela sie wytracony osad za pomoca odwiro¬ wania i przemywa go woda.Do otrzymanego' w ten sposób osadu dodaje sie, podczas mieszania, 0,1 n roztwór kwasu siarkowego i p-toluenosulfonowego oraz 18 litrów ketonu me¬ tylowoetylowego. Po odstaniu oddziela sie faze or¬ ganiczna, która kieruje sie do regeneracji kwasu pikrólonowego. Do warstwy wodnej dodaje sie nieco ketonu metylowoetylowego w celu usuniecia resztek pikrólonowego a nastepnie wegla aktyw¬ nego i saczy. 16,5 litra otrzymanego roztworu zawiera 33,8 g/litr SAM, co odpowiada 90% ilosci obecnej w droz¬ dzach. Chromatografia cienkowarstwowa, wykona¬ na wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28 (1971), wyka¬ zuje obecnosc tylko SAM bez sladów produktów rozkladu lub innych zasad organicznych. Powyzszy roztwór wlewa sie, podczas mieszania do 100 litrów acetonu. Po odstaniu roztwór dekantuje sie a otrzy¬ many osad rozpuszcza sie w 3,3 kg 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu. Do roz¬ tworu dodaje sie wegiel aktywny, saczy i wlewa do 25 litrów eteru etylowego.Otrzymuje sie 1184 g krystalicznego osadu, latwe¬ go do saczenia, malo higroskopijnego, i dobrze roz¬ puszczalnego w wodzie (ponad 20%), tworzacego bezbarwny roztwór. Sól jest slabo rozpuszczalna w metanolu i etanolu oraz nierozpuszczalna w ace¬ tonie, ketonie metylowoetylowym, chloroformie, wyzszych alkoholach i benzenie. Chromatografia cienkowarstwowa wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28 (1971) wykazuje, ze produkt nie zawiera zadnych zanieczyszczen.Analiza elementarna: obliczono dla wzoru Cr9H42N6019S5 i ciezaru czasteczkowego 938,98: C — 37,09%, H — 4,51%, S — 17,07%, N — 8,95%, zna¬ leziono: C — 36,39%, H — 4,6%, N — 8,8%, S —. 16,7%. Kwas siarkowy: obliczono — 20,89%, zna¬ leziono — 20,5%, kwas p-toluenosulfonowy: obli¬ czono — 36,67%, znaleziono — 36,0%, S-adenozylo- -L-metionina: obliczono — 41,54%, znaleziono — 41,7%. Zawartosc wody oznaczana metoda Fischera wynosi 1,7—2%. W widmie w nadfiolecie wystepuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 260nm oraz Efcm = l82.Powyzsze dane odpowiadaja zwiazkowi o wzo¬ rze 2. Identycznosc nowego zwiazku potwierdzono równiez stosujac metody enzymatyczne oparte na enzymatycznym metylowaniu amidu kwasu nikoty¬ nowego lub octanu guanidyny S-adenozylo-Tj-me- tionina (G-L. Cantoni, J. Bil. Chern,, 189, 745 (1951) s oraz G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd i H.H. Richards, J. Amer. Chem. Soc., '81, 3975 (1959).Przyklad II. Roztwór zawierajacy 1,15 kg kwasu pikrólonowego w 10 litrach alkoholu buty- io lowego dodaje sie do 70 litrów roztworu pochodza¬ cego z lizy komórek drozdzy, otrzymanego przy za¬ stosowaniu takiego samego surowego materialu i takich samych metod, jak stosowane w przykla¬ dzie I. Po odstawieniu na okres nocy oddziela sie wytracony osad za pomoca odwirowania.Do osadu dodaje sie 9 litrów 0,1 n roztworu kwa¬ su siarkowego i kwasu p-toulenosulfonowego oraz 9 litrów ketonu metylowoizobutylowego. Po odsta¬ niu, oddziela sie warstwe organiczna, a wodna przemywa mala iloscia ketonu metylowoizobutylo¬ wego celem odmycia resztek kwasu pikrólonowego.Do warstwy wodnej dodaje sie wegiel aktywny, saczy i przesacz wlewa do 70 litrów alkoholu me¬ tylowego. Po wytraceniu sie osadu dekantuje sie rozpuszczalnik, a osad rozpuszcza sie w 1,65 kg % roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w me¬ tanolu. Po odbarwieniu weglem aktywnym prze¬ sacz dodaje sie do 10 litrów chloroformu, otrzymu- jac latwy do saczenia, krystaliczny dwusiarczano- 3o -dwu-p-toluenosulfonian SAM, w ilosci 1110 g. Wy¬ niki analiz sa identyczne jak dla produktu otrzy¬ manego w przykladzie I.Przyklad III. 1,15 kg kwasu pikrólonowego rozpuszczonego w 12 litrach n-butanolu dodaje sie do 70 litrów roztworu pochodzacego z lizy komórek drozdzy i otrzymanego w sposób opisany w przy¬ kladzie I.Nastepnego dnia odwirowuje sie wytracony osad i dodaje do niego 9 litrów 0,1 n kwasu siarkowe- 40 go i p-toluenosulfonowego oraz 12 litrów n-buta¬ nolu. Warstwe organiczna oddziela sie a wodna przemywa mala iloscia n-butanolu w celu usunie¬ cia sladów kwasu pikrólonowego. Po odbarwieniu weglem aktywnym, przesacz wlewa sie do 65 li- 45 trów alkoholu n-propylowego.Wytracony osad oddziela sie od rozpuszczalni¬ ka przez dekantacje a nastepnie rozpuszcza w 1,65 kg 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowe¬ go w metanolu. Po odbarwieniu weglem aktyw- 50 nym przesacz wlewa sie do 14 litrów n-butanolu.Otrzymuje sie latwy do saczenia krystaliczny osad dwusiarczario-dwu-p-toluenosulfonianiu SAM, w ilosci 1155 g. Wyniki analiz sa identyczne jak dla produktu otrzymanego w przykladzie I. 55 Przyklad IV. Oczyszczanie specyficznego enzymu. 50 ml sefarozy (wielocukier produko¬ wany przez Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsa¬ la, Szwecja) zawiesza sie w wodzie i traktuje bro- mocyjanem, stosujac postepowanie znane w przy- 60 padkach osadzania substancji zawierajacych gru- pv aminowe na matrycach preparowanych z zelu wielocukru. Do tak przygotowanego zelu dodaje sie nadmiar L-lizyny, po czym przemywa kolejno destylowana woda, buforem o wartosci pH = 8,5 65 oraz buforem o wartosci pH = 4,5. Otrzymanym15 95 666 16 zelem zaladowuje sie kolumne o srednicy 1,5 cm i wysokosci 30 cm, przez która nastepnie prze¬ puszcza sie roztwór bufprowy o wartosci pH = 8,0 zawierajacy 0,05 mola trójetanoloaminy i 0,01 mo¬ la kwasu siarkowego az do jej calkowitego zrów¬ nowazenia. Na kolumne nanosi sie 2 ml wyciagu drozdzowego zawierajacego enzym, przygotowane¬ go na drodze dzialania ultradzwiekami lub homo¬ genizacji w suchym lodzie i ewentualnie wzboga¬ conego w specyficzny enzym.Do elucji stosuje roztwór buforowy, taki sam jaki uzywa sie do równowazenia kolumny a ko¬ lejne frakcje bialkowe oznacza sie stosujac po¬ miary absorpcji w nadfiolecie. Jednoczesnie oznacza sie w poszczególnych frakcjach eluatu aktywnosc enzymu, poslugujac sie metoda opisana przez J.A.Stekola w Methods in Enzymology, 6, 566 (1963).Frakcje wykazujace odpowiednia aktywnosc laczy sie otrzymujac roztwór o aktywnosci co najmniej dwudziestokrotnie wyzszej od wyjsciowego wycia¬ gu. Roztwór zawierajacy enzym mozna dalej zate- zac stosujac wytracanie za pomoca soli lub roz¬ puszczalników organicznych albo inne metody, sto¬ sowane do zatezenia roztworów zawierajacych substancje bialkowe.Wytwarzanie SAM. 30 ml napecznialego zelu Se- farozy aktywuje sie bromocyjanem albo w inny sposób stosowany w procesach osadzania bialek na zelach wielocukrów. Do aktywowanego zelu do¬ daje sie 4 ml roztworu specyficznego enzymu za¬ wierajacego okolo 100 mg bialka, przygotowanego w sposób opisany powyzej. Zawiesine aktywowa¬ nego zelu i roztworu enzymu miesza sie w ciagu 18 godzin, w temperaturze 4°C a nastepnie prze¬ mywa woda. W wodzie po przemyciu znajduje sie okolo 70% calkowitej aktywnosci enzymatycznej.Natomiast okolo 20% enzymu zostaje zwiazane z wielocukrem, co stwierdza sie inkubujac Sefa- roze w sposób opisany uprzednio dla oznaczania aktywnosci enzymu. Tak przygotowana Sefaroze zaladowuje sie do kolumny o srednicy 1,5 cm i wy¬ sokosci 20 cm a nastepnie przez kolumne prze¬ puszcza sie roztwór zawierajacy 0,675 m trójeta¬ noloaminy, 0,150 m siarczanu magnezu, 0,05 m ATP, 0,05 m L-metioniny oraz 0,01 m chlorku po¬ tasu, z szybkoscia 5 ml/godz. w temperaturze 25— 27°C. Analiza eluatów z kolumny wykazuje, ze SAM otrzymuje sie z 30% wydajnoscia.Wytwarzanie podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i kwasem p-toluenosulfonowym. 103 ml eluatu zawierajacego 6 g/litr SAM za¬ kwasza sie kwasem siarkowym do wartosci pH = = 3 a nastepnie dodaje sie, podczas mieszania, roz¬ twór 2,3 g kwasu pikrolonowego w 25 ml ketonu metylowoetylowego. Nastepnego dnia odsacza sie osad i przemywa go woda, po czym rozpuszcza w 18 ml 0,1 n roztworu kwasu siarkowego i p-to- luenosulfonowego w 18 ml ketonu metylowoetylo¬ wego. Calosc miesza sie i oddziela faze organiczna.Warstwe wodna przemywa sie mala iloscia ketonu metylowoetylowego w celu usuniecia resztek kwa- su pikrolonowego. Po odbarwieniu weglem aktyw¬ nym otrzymuje sie 16,5 ml bezbarwnego roztworu wodnego, zawierajacego 33,8 g/litr SAM, co odpo¬ wiada 90% ilosci zawartej w wyjsciowym eluacie.Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze roztwór zawiera tylko S-adenozy-10-L-metionine. 16,5 ml powyzszego roztworu wlewa sie do 100 ml acetonu, miesza i po odstaniu dekantuje rozpusz¬ czalnik. Osad rozpuszcza sie w 6,6 g 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu. Roztwór odbarwia sie weglem aktywnym, saczy i przesacz wlewa do 25 ml eteru etylowego. Po odsaczeniu otrzymuje sie 0,967 g krystalicznej soli o wzorze SAM+.HS04-.H2S04.CH3C6H4S03H. Analiza elemen¬ tarna: obliczono dla wzoru C22H84016N6S4; C — 34,46%, H — 4,47%, N — 10,96%, S — 16,72%, zna¬ leziono: C — 33,68%, H — 4,65%, N — 10,8%, S — 16,5%.Zawartosc SAM+ — 50,5%, wody — 2,1%, kwasu siarkowego — 25,3%, kwasu p-toluenosulfonowe¬ go — 21,7%.W widmie w nadfiolecie wystepuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 260 nm oraz EJ0/£m = 179.Powtarzajac opisane powyzej postepowanie ale stosujac 3,3 g 15% roztworu kwasu p-toluenosul¬ fonowego w metanolu i 25 ml eteru etylowego do wytracania, otrzymuje sie 1,18 g soli o wzorze SAM+.H2iS04.2CH3C6H4S03H identycznej z otrzy¬ mana w przykladzie I.¦ CHj-S -CH2-CH2-CH -COOH X" Wzór 1 CH3 NH9 CH-CH-CH-CH-CH-S-CH2CH2-CH-COOH.H2S04.2CH3C6H4S03H j ÓH ÓH I I n—I HSO/.Wzór PL