PL95666B1 - Sposob wytwarzania nowych podwojnych soli s-adenozylo-alfa-metioniny - Google Patents

Sposob wytwarzania nowych podwojnych soli s-adenozylo-alfa-metioniny Download PDF

Info

Publication number
PL95666B1
PL95666B1 PL17223674A PL17223674A PL95666B1 PL 95666 B1 PL95666 B1 PL 95666B1 PL 17223674 A PL17223674 A PL 17223674A PL 17223674 A PL17223674 A PL 17223674A PL 95666 B1 PL95666 B1 PL 95666B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sam
acid
solution
methionine
adenosyl
Prior art date
Application number
PL17223674A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed filed Critical
Publication of PL95666B1 publication Critical patent/PL95666B1/pl

Links

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych podwójnych soli S-adenozylo-L-metio- niny (SAM) o wlasciwosciach terapeutycznych. No¬ we sole, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, sa podwójnymi solami SAM z kwasem p-tolueno- sulfonowym i siarkowym o wzorze SAM+.HSO~4..H2S04.2CH306H4S03H oraz SAM+.HSO-4.H2SO^ CH3C6H4S03H. Bardziej dokladnie, wynalazek do¬ tyczy otrzymywania nowych, wyjatkowo trwalych soli SAM w sposób prosty i ekonomiczny w skali przemyslowej. Nowe sole stosuje sie w charakterze skladnika aktywnego kompozycji farmaceutycznych dla leczenia ludzi.S-adenozylo-L-metionina jest znanym zwiazkiem pochodzenia naturalnego, wystepujacym we wszy¬ stkich zywych organizmach od bakterii do roslin oraz od organizmów jednokomórkowych do naj¬ wyzej zorganizowanych ssaków, w tym takze ludzi.Struktura tego zwiazku jest znana od dluzszego czasu i wyraza sie wzorem 1, w którym X oznacza anion.W zywych organizmach SAM powstaje w wyni¬ ku dzialania enzymów (S-adenozylometioninosynte- taz lub S-adenozylotransferaz) w ukladzie cytopla- zmatycznym, z metionizy wprowadzonej z pokar¬ mem lub ATP obecnego w charakterze rezerwy energetycznej w kazdej zywej komórce.Jak obecnie wiadomo, SAM jest zwiazkiem o za¬ sadniczym znaczeniu w wielu biologicznych reak¬ cjach transmetylacji enzymatycznej, w wyniku cze- go jest ona bardzo cennym odczynnikiem bioche¬ micznym. Istnieje jednak powazny problem zwia¬ zany z wyjatkowa nietrwaloscia tego zwiazku w temperaturze pokojowej i powyzej pokojowej oraz z metodami wytwarzania, które sa trudne do prze¬ niesienia ze stali laboratoryjnej do przemyslowej.W ostatnich latach badania majace na celu uzy¬ skanie trwalej postaci S-adenozylo-L-metioniny, umozliwiajacej jej stosowanie w badaniach biolo¬ gicznych, skierowane byly na otrzymywanie soli trwalych w normalnych warunkach temperatury i wilgotnosci. Opracowano wiec sposób otrzymywa¬ nia chlorku i siarczanu SAM, sole te jednak mozna stosowac jedynie jako odczynniki biochemiczne i to w krótkim okresie czasu, gdyz nawet w postaci suchej i w niskiej temperaturze ich trwalosc jest ograniczona. Ponadto sposób ich wytwarzania po¬ zwala na uzyskiwanie tylko malych porcji a nie na produkcje w skali przemyslowej.Nieoczekiwanie udalo sie znalezc nowe sole SAM, nieograniczenie trwale w temperaturze do 45°C, które mozna wytwarzac w skali przemyslowej z duza wydajnoscia i w oplacalny ekonomicznie spo¬ sób. Sole te wykazuja niespodziewanie wysoka ak^ tywnosc w wielu róznych dziedzinach terapii ludz¬ kiej, czesto ze soba nawzajem nie zwiazanych.O wysokim stopniu osiagnietego postepu technicz¬ nego swiadcza dane przedstawione w ponizszej ta¬ blicy I, w której podano porównanie trwalosci w temperaturze 45°C, w postaci suchej dwu najbar- 95 6663 95666 4 dziej dotychczas trwalych soli SAM, tzn. chlorku i siarczanu, z trwaloscia nowego dwusiarczano- -dwu-p-toluenosulfonianu. Wyniki w tablicy poda¬ ne sa w °/o nierozlozonej S-adenozylo-L-metioniny we wskazanym czasie.Tablica I 1 Sól Chlorek Siarczan Dwusiarczano-dwu- OWBTffgy- 50 100,1 60 99,9 120 100.2 180 dni 110,4 | I Wartosci trwalosci uzyskane dla dwusiarczano- ll^ftfr^^^JOLprcj \ s3 calkowicie równowazne Jwttifeo&iMr^iizyslWfym dla dwusiarczano-dwu-p- -Kluehbsuffolniailu.,ur Sposób wedlug wynalazku wytwarzania nowych soli sklada sie z nastepujacych kolejnych etapów: (a) * wytwarzania roztworu bogatego w SAM, (b) stracania SAM z roztworu wodnego po przesacze¬ niu nasyconym roztworem wodnym kwasu pikro- lonowego lub roztworem tegoz kwasu w rozpusz¬ czalniku organicznym mieszajacym sie z woda, ta¬ kim jak alkohol metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, n-butylowy lub izobutylowy, aceton, keton metylowoetylowy, keton metylowoizobutyIo¬ wy, octan etylu, czterowodorofuran, 2-metoksyeta- nol, 2-eteksyetanol, dioksan lub dwumetyloform- amid, (c) rozpuszczanie odsaczonego osadu w mie¬ szaninie zawierajacej równe objetosci rozpuszczal¬ nika czesciowo mieszajacego sie z woda, takiego jak keton metylowoetylowy, keton metylowoizobu- tylowy, b-butanol lub izobutanol, oraz roztwór' kwasu siarkowego i p-toluenosulfonowego o takiej samej normalnosci, (d) oddzielenia fazy organicznej i dodanie do fazy wodnej ketonu lub alkoholu cal¬ kowicie mieszajacego sie z woda, (e) powtórnego rozpuszczenia osadu w 10—20% roztworze kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu i odbarwianie roztworu weglem aktywnym, i (f) dodania do ste¬ zonego roztworu rozpuszczalnika organicznego zdol¬ nego do wytracania czystej SAM w postaci krysta¬ licznej i dobrze sie saczacej.Proces ten moze prowadzic róznymi metodami przedstawiajacymi taka sama wartosc jesli idzie o otrzymywanie stezonego roztworu SAM.W celu otrzymania roztworu bogatego w SAM na drozdze (Saccharomyces Carevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis i inne), wzbogacone w SAM dzieki dodatkowi w odpowiednich warunkach me- tioniny (Schlenk, Enzymologia, 29, 283 (1965), dziala sie octanem etylu a nastepnie 0,1—0,5 korzystnie 0,35 n kwasem siarkowym, w temperaturze poko¬ jowej. Nastepnie wtedy liza komórek i 100% SAM zostaje wyekstrahowane przez rozpuszczalnik.Wode i octan etylu stosuje sie korzystnie w ilosci 1/20—1/5 wagi mokrej masy komórkowej. Czas operacji wynosi 15—45 minut, korzystnie 30 minut.Nastepnie dodaje sie kwas siarkowy i prowadzi sie lize w ciagu 1—2, korzystnie 1,5 godziny. Warto dodac, ze o wiele bardziej dogodnym jest prowa¬ dzenie lizy komórek drozdzy za pomoca mieszaniny rozpuszczalnika organicznego i rozcienczonego kwa* su siarkowego, w pokojowej temeperaturze, niz za pomoca zazwyczaj stosowanego dzialania kwasem B nadchlorowym w temperaturze pokojowej lub kwa¬ sem mrówkowym albo octowym w temperaturze 6Ó°C lub innych metod. Proces bowiem wtedy pro¬ wadzi sie w temperaturze pokojowej, co jest bar¬ dzo korzystne z punktu widzenia trwalosci SAM oraz w takich warunkach, ze roztwór mozna latwo odsaczyc od pozostalosci masy komórkowej i nie zawiera on zadnych zanieczyszczen w przypadku stosowania do lizy innych srodków, które to za¬ nieczyszczenia sa trudne! do usuniecia za pomoca znanych sposobów otrzymywania czystej • SAM.Ponadto roztwór bogaty w SAM mozna równiez . otrzymac na drodze enzymatycznej syntezy prowa¬ dzonej przy zastosowaniu enzymu ATP-metionino- adenozylotransferazy (E.C.2.4.2.12) w inkubowanej i0 mieszaninie zawierajacej adenozynotrójfosforan i metionine.W warunkach przemyslowych stosuje sie czysty enzym w postaci, która mozna izolowac zarówno z inkubowanej mieszaniny jak i z wyprodukowa- nej SAM.Sposób oczyszczania enzymu ATP-metioniono- adenozylotransferazy polega na zastosowaniu chro¬ matografii z powinowactwem oraz metode prowa¬ dzenia reakcji w kolumnie, która umozliwia pro- wadzenie procesu enzymatycznej syntezy.Chromatografie z powinowactwem specyficznego enzymu, prowadzi sie przepuszczajac jego roztwór, np. surowy ekstrakt z drozdzy lub Escherichia coli, przez kolumne wypelniona stalym nosnikiem za- wierajacym kowalentnie zwiazane grupy dzialajace jako kompetytywny inhibitor enzymu.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze doskonalym wy¬ pelnieniem do tego rodzaju kolumny do oczyszcza¬ nia jest aktywowany zel polisacharydów, z który- 40 mi zwiazana jest kowalentnie L-lizyna. Powino¬ wactwo enzymu do reszt lizyny zwiazanych ze stala matryca powoduje opóznienie jego elucji z kolu¬ mny i tym samym umozliwia oddzielenie od in¬ nych substancji bialkowych i otrzymanie w bardzo 45 czystej postaci. Jednakze wydzielanie enzymu z eluatu, w celu powtórnego uzycia do nastepnej syntezy enzymatycznej, daje calkowicie niezado¬ walajace wyniki, gdyz natychmiast po wydzieleniu jego trwalosc zmniejsza sie w czasie. Ponadto po 50 jednorazowym uzyciu do syntezy SAM enzym zo¬ staje podczas izolacji SAM zniszczony.Stwierdzono, ze doskonale wyniki uzyskuje sie absorbujac specyficzny enzym na odpowiednim nosniku stalym i prowadzac katalityczna reakcje 55 pomiedzy metionina i ATP, prowadzaca do po¬ wstawania SAM, w kolumnie. Odpowiednim nos¬ nikiem stalym jest wielocukier aktywowany czyn¬ nikiem zdolnym do wiazania bialek, takim jak bromocyjan. Przepuszczajac przez kolumne roztwór 60 zawierajacy ATP i metionine w odpowiednim bu¬ forze otrzymuje sie w eluacie opuszczajacym ko¬ lumne S-adenozyio-L-metionine. Tak prowadzony pierwszy etap sposobu wedlug wynalazku umo¬ zliwia otrzymanie SAM w bardzo czystej postaci, 65 W srodowisku kwasnym jedynym zwiazkiem wy-95 666 6 tracanym przez kwas pikrolonowy jest SAM, co zostalo stwierdzone na podstawie chromatografii cienkowarstwowej wykonywanej wedlug Anal.Bichem. 4, 16—28 (1971). Kwas pikrolonowy wy¬ kazuje wiec niespodziewanie nieslychanie selekty¬ wne dzialanie. Inne srodki stosowane do chwili obecnej, takie np. jak kwas pikrynowy, sól Rei- necke'go lub kwas borowy, wytracaja bardzo za¬ nieczyszczony osad SAM, wymagajacy dalszego oczyszczania za pomoca kolumnowej chromatogra¬ fii na zywicach jonowymiennycli, który to proces jest nieslychanie drogi i trudny do prowadzenia w skali przemyslowej. Trudno jest takze w ten sposób otrzymac produkt o wymaganej czystosci.Zastosowanie roztworu kwasu pikrolonowego w wo¬ dzie lub w wyzej opisanych rozpuszczalnikach or¬ ganicznych nie stwarza zadnych problemów i moze byc prowadzone w temperaturze pokojowej.W nastepnym etapie (c) proces korzystnie pro¬ wadzi sie stosujac roztwór zawierajacy kwas p-to- luenosulfonowy i kwas siarkowy, oba 0,05—0,2 n, korzystnie 0,1 n, w rozpuszczalniku organicznym, szczególnie w rozpuszczalniku mieszajacym sie z woda, takim jak keton metylowoetylowy lub n-bu- tanol. Zastosowanie rozpuszczalnika organicznego umozliwia znaczne zredukowanie ilosci wodnego roztworu kwasu i praktycznie calkowite zuzycie kwasu pikrolonowego.W dalszym etapie (d) proces prowadzi sie stosu¬ jac korzystnie 4—8 objetosci (w odniesieniu do objetosci roztworu wodnego) rozpuszczalnika, ta¬ kiego jak aceton, alkohol metylowy, alkohol etylo¬ wy lub alkohol propylowy.Ponadto stwierdzono nieoczekiwanie, ze jesli w etapie (e) stosuje sie minimalna ilosc metanolu nie¬ zbedna do rozpuszczenia osadu z etapu (d), w na¬ stepnym etapie (f) otrzymuje sie podwójna sól o wzorze SAM+.HSO-4.H2S04.2CH3C6H4S03H. Jezeli natomiast stosuje sie co najmniej dwukrotny nad¬ miar metanolu w etapie (f), wytraca sie podwójna sól o wzorze SAM+.HSO-4.H2S04.CH3C6H4S03H. Za¬ stosowanie posredniej ilosci metanolu prowadzi di otrzymywania mieszaniny obu powyzszych soli.W procesie wytracania którejkolwiek z nowych soli w etapie (f) stosuje sie rozpuszczalniki organi¬ czne, takie jak metanol, eter etylowy, chloroform, n-propanol, izoptopanol, n-butanol, izobutanol, II- -rz.-butanol, alkohol izoamylowy lub czterowodoro- furan.Sole podwójne SAM, otrzymywane sposobem we¬ dlug wynalazku, mozna w postaci suchej przecho¬ wywac w ciagu nieograniczonego okresu czasu, nie stwierdzajac praktycznie zadnych zmian.Sposób wedlug .wynalazku nie wymaga w za¬ dnym etapie stosowania temperatury wyzszej niz pokojowa. Proces prowadzi sie w srodowisku kwa¬ snym, co ma duze znaczenie w zapobieganiu roz¬ kladu SAM. Proces powyzszy nie wymaga stoso¬ wania skomplikowanych i pracochlonnych metod, takich jak chromatografia kolumnowa na zywi¬ cach jonowymiennych lub na weglu, które to me¬ tody utrudniaja przeniesienie procesu do skali przemyslowej Z badan biochemicznych wiadomo od kilku lat, ze S-adenozylo-L-metionina jest jednym specyficz¬ nym nosnikiem grup metylowych w zywych orga¬ nizmach w reakcjach biochemicznych przenoszenia grupy metylowej. Ta reakcja biochemiczna ma podstawowe znaczenie w przemianach tluszczo- g wyeh, bialkowych i weglowodanowych.Do niektórych, najbardziej waznych reakcji transmetylowania zaleznych od S-adenozylo-L-me- tioniny naleza: a) N-transmetylowanie adeniny, karnityny, kar- 19 nozyny, kreatyny, 2,6-dwuaminopuryny, adrenaliny, guaniny, hordeniny, N'-amidu kwasu nikotynowe¬ go, fosfatylodwucholiny, rycyniny, b) O-transmetylowanie N-acetyloserotoniny, do- paminy, epininy, d-adrenaliny, 1-adrenaliny, ergo- sterolu, 1-noradrenaliny, paktyny, ubichinonu, c) S-transmetylowanie 2,3-dwumerkaptopropano- lu, siarkowodoru, metioniny, metylomerkaptanu, kwasu S-merkaptopropionowego, tripirymidyny, tiuracylu, d) C-transmetylowanie cytozyny i tyminy.Oznacza to w odniesieniu do organizmu ludzkie¬ go, ze S-adenozylo-L-metionina uczestniczy w na¬ stepujacych przemianach:'biosynteza choliny, bio¬ synteza fosfatydylocholiny, dzialalnosc eao^iRów wymagajacych obecnosci grupy —SH, przemiana katecholamin, przemiany biogennych amin central¬ nego ukladu nerwowego, przemiany serotoniny, przemiany histaminy, przemiany witaminy B12 i kwasu foliowego, przemiany kreatyny, przemiany 80 miozyny, przemiany nistonów, przemiany RNA i DNA, przemiany substancji bialkowych, przemiany niektórych hormonów o budowie cyklopentanoper- hydrofenantrenu, których glównymi przedstawicie¬ lami sa estrogeny, oraz przemiany trój glicerydów.Wiadomym jest takze, ze S-adenozylo-L-metio¬ nina ulegajac demetylacji pod dzialaniem enzymów z grupy metylotransferaz, przeksztalcana jest — w S-adenozylohomocysteine (SAO). Zwiazek ten jest bezposrednim donorem grup tiolowych i tym 40 samym odgrywa wazna role w przemianach wszy¬ stkich zwiazków wymagajacych obecnosci grup —SH dla przeniesienia ich aktywnosci biologicznej.Szczególnie dotyczy to niektórych bioenzymówi za¬ wierajacych siarke aminokwasów. 45 S-adenozylohomocysteina ulega w organizmie de¬ karboksylacja produkt tej dekarboksyiacji jest glównym dawca grupy aminopropylowej, nieodzo- amej, zgodnie ze wspólczesnym poziomem wiedzy oiochemicznej, do biosyntezy poliamin. Proces ten 50 jest katalizowany przez rozmaite enzymy, z któ¬ rych specyficzna jest aminopropylotransferaza.Reasumujac mozna stwierdzic, ze obecnosc S~ade- nozylo-L-metioniny w organizmie Judzkim jest sci¬ sle zwiazana z nastepujacymi reakcjami bioche- gj micznymi: A — transmetylowanie (specyficzne przenoszenie grupy CH3), B — transsulfuracja (specyficzne przenoszenie grupy SH), 60 C — transaminopropylowanie (specyficzne prze¬ noszenie grupy aminopropylowej).Jak widac z przytoczonych danych, E-adenozylo- -L-metionina moze wykazywac dzialanie terapeu¬ tyczne w leczeniu stanów chorobowych zwiazanych 65 z brakiem lub niedoborem w organizmie niektó-95666 7 8 rych, wspomnianych wyzej substancji. Wyjatkowa jednak nietrwalosc S-adenozylo-L-metioniny i brak do chwili obecnej sposobu otrzymywania jej posta^ ci trwalej w normalnych warunkach uniemozliw wialy przeprowadzenie badan farmakologicznych i klinicznych i tym samym nie pozwalaly na wpro¬ wadzenie tego zwiazku do terapii ludzkiej. Dopiero wynalezienie nowych soli SAM, wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku, trwalych praktycznie nieogfaniczenie dlugo w pokojowej temperaturze, pozwolilo na przeprowadzenie szerokich badan kli¬ nicznych i farmakologicznych i doprowadzilo do odkrycia, ze nowe sole posiadaja wlasciwosci tera¬ peutyczne, zaskakujace pod wzgledem ich jakosci i skutecznosci.Z ogromnej ilosci danych farmakologicznych i klinicznych, dotyczacych nowych soli, przedsta¬ wiono w dalszej czesci opisu jedynie wybrane ele¬ menty, w ilosci wystarczajacej dla znajacych za¬ gadnienie, do zorientowania sie w podstawowych wlasciwosciach nowego produktu oraz mozliwo¬ sciach jego zastosowania w terapii ludzkiej.Dla uproszczenia, w dalszej czesci opisu stosuje sie okreslenie sól SAM, która dotyczy obu podwój¬ nych soli wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku, gdyz ich zastosowanie jest absolutnie iden¬ tyczne. Podajac dane farmakologiczne i kliniczne stosowano dla uproszczenia okreslenie SAM dla soli SAM+.HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H. Jakkolwiek w badaniach stosowano zawsze powyzsza sól, uzy¬ skane dane odnosza sie równiez dobrze takze i do drugiej podwójnej soli.Toksycznosc. Sól SAM wytworzona sposobem wedlug wynalazku nie wykazuje absolutnie zadnej toksycznosci, zarówno ostrej jak i przewleklej jak równiez nietolerancji miejscowej i dzialan ubocz¬ nych. Wartosc LD50 dla myszy przy podawaniu do¬ ustnym jest wyzsza niz 6 g/kg, a przy podawaniu dootrzewnym 2,5 g/kg wagi ciala.Badania tolerancji i toksycznosci przewleklej przeprowadzono na szczurach rasy Wister i Sprauge- -Dowley, podajac preparat w ciagu 12 miesiecy w ilosci 10—26 mg/kg wagi ciala dziennie. Po zakon¬ czeniu podawania preparatu rozmaite organy zwie¬ rzat tak doswiadczanych nie wykazywaly zadnych zmian patologicznych. Test na teratogennosc prze¬ prowadzano na królikach i szczurach. Okazalo sie, ze nawet przy podawaniu ogromnych ilosci SAM, okolo 10-krotnie wyzszych od najwyzszej dawki terapeutycznej, nie stwierdza sie dzialania terato¬ gennego lub zmian zarodków albo plodu.Dodanie 0,1—0,2 mg/ml preparatu nie wywoluje zadnych zmian w hodowlach tkankowych limfo¬ cytów ludzkich oraz komórek watrobowych myszy.Podczas podawania dozylnego w ilosci do 40 mg/ /kg nie zaobserwowano u królików dzialania gora- czkotwórczego. Podawanie dozylne w ilosci 40 mg/kg nie powoduje u królików i kotów zadnych zmian w cisnieniu tetniczym, czestotliwosci pracy serca i oddechu oraz nie zmienia zapisu elektrokardio¬ graficznego. Tolerancja miejscowa przy iniekcjach domiesniowych, nawet przy podawaniu powtarza¬ nych w ciagu 180 dni, oraz przy iniekcjach do¬ zylnych w brzeznych naczyniach malzowiny usznej, jest doskonala.Badania na ludziach przeprowadzono wykorzy¬ stujac mlodych, zdrowych ochotników obojga plci, o przecietnej wadze 70 kjg. Preparat podano na drodze iniekcji dozylnych lub wlewów w ilosci —300 mg. Jednoczesnie prowadzone badanie najwyzszego i najnizszego cisnienia, pulsu i czesto¬ tliwosci oddechu po 1, 5, 15, 20, 30 i 60 minutach oraz po 2, 3, 6, 8, 10, 12 i 24 godzinach nie wyka¬ zaly odstepstw od normalnych wartosci.Zapis elektrokardiograficzny nie wykazywal zad¬ nych zmian w wartosciach p w przedziale ST ani tez skurczu przedwczesnego lub innych zaburzen po 30 sekundach oraz po 1, 2, 3, 5, 10 i 20 minu¬ tach od czasu podania leku.Nie stwierdzono równiez w systemie krwiotwór¬ czym oraz w pracy watroby i nerek zadnych sta¬ tystycznie uchwytnych odstepstw od stanu normal¬ nego.Farmakologia. Równiez w badaniach farmakolo¬ gicznych jesli jest mowa o podawaniu SAM, nale¬ zy rozumiec, ze stosowano nastepujace sole: SAM *\ :HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H i/lub SAM+.HS04^..CH3C5H4SO3H. * W celu oznaczenia sposobu dystrybucji SAM mie¬ dzy poszczególne tkanki, stosowano preparat zna¬ czony izotopem wegla C14 w grupie metylowej. Dy¬ strybucje preparatu badano podajac go szczurom w ilosci 10 mg/kg, co odpowiada 24 ^Ci preparatu radioaktywnego. Aktywnosc wlasciwa preparatu wynosila 58 mCi/mmol. Równolegle prowadzono badania autoradiograficzne na myszach. Wyniki obu serii doswiaczen wykazaly, ze SAM rozprze¬ strzenia sie bardzo szybko do wszystkich tkanek.Dla przykladu podano w ponizszej tabeli czesc da¬ nych dotyczacych poszczególnych organów.Dystrybucja SAM w niektórych tkankach szczurów (wartosci podano w \ig/g) Tkanka Watroba Gruczoly Sledziona nadnercze Przysadka Podwzgórze Kora Plazma mi¬ nut 4,02 4,26 3,15 ,6 0,7 0,6 18,6 1 7,47 8,46 2,96 ,8 1,5 1,1 ,2 4 13,1 JW 8,1 19,5 2,4 1,8 ,3 8 13,4 ,8 6,2 11,3 3,0 2,1 4,5 24 go¬ dziny 13,5 ,9 6,7 ,3 3.2 2,3 3,1 Z uzyskanych wyników mozna wnioskowac, iz nowe sole przenosza grupy metylowe do tkanek wymagajacych ukladów transmetylujacych. Innymi slowy, stwierdzono w ten sposób zdolnosc umiej¬ scawiania sie nowego preparatu w narzadach wy¬ magajacych obecnosci czynników transmetyluja¬ cych. Obserwacje te zostaly nastepnie potwierdzo¬ ne przez szereg testów farmakologicznych. Seria doswiadczen wykonanych na szczurach wykazala, ze nowe zwiazki wykazuja znaczne dzialanie zapo¬ biegajace w przypadkach stluszczenia watroby wy¬ wolywanego dieta z nadmiarem tluszczów i bialek wedlug Handlera oraz w przypadkach stluszczenia 40 45 50 55 609 95 666 wywolywanego ostrym zatruciem alkoholem lub innymi substancjami toksycznymi, takimi jak czte¬ rochlorek wegla lub bromobenzen. Dzialanie takie uzyskuje sie juz przy podaniu preparatu dootrzew- nowo w ilosci 15 mg/kg. Badania zarówno morfo- histochemiczne jak* i analityczne wykazaly, ze SAM znacznie hamuje odkladanie sie tluszczów w wa¬ trobie, natomiast sprzyja odtworzeniu sie normal¬ nego poziomu fosfolipidów, obnizonego po zatruciu czterochlorkiem wegla.Poziom fosfolipidów w watrobie szczurów po zatruciu czterochlorkiem wegla i podaniu SAM Roztwór fizjologiczny Czterochlorek wegla Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo 150 gm/kg SAM Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo 150 gm/kg SAM Czterochlorek wegla + do- otrzewnowo ATP + metio¬ nina 15 mg/kg Poziom fosfolipi¬ dów w mg/g ,57+1,18 18,87+1,06 27,20 + 1,25 ,87+0,42 19,9 +0,92 Podane wyniki sa srednimi statystycznymi z 10 oznaczen dla kazdej grupy. W badaniach stosowano doswiadczalne urzadzenie wywolujace u szczurów tak zwana cholesterolowa degeneracje watroby (Ridout i wsp., Biochem. J., 52, 99 (1952). Przy za¬ stosowaniu tej metody i odpowiedniej diety, uzy¬ skuje sie znaczny wzrost poziomu tluszczów i cho¬ lesterolu w watrobie zwierzatek doswiadczalnych.Substancje, które dzialaja na przemiane tluszczowa, zmniejszaja lub znosza ten wzrost.Zwierzeta podzielono na szesc grup. Pierwsza otrzymywala dowolna diete, drugiej podawano podstawowa diete Ridouta w ilosci 20 g dziennie, pozostale grupy otrzymywaly te sama diete ale wzbogacona 0,2 g/dzien cholesterolu. Doswiadcze¬ nie trwalo trzy tygodnie. Zwierzetom z grupy 4, 5 i 6 podawano dootrzewnowe 1, 2 lub 5 mg/kg SAM dziennie. Po uplywie trzech tygodni wszystkie zwie¬ rzeta zabijano, wyjmowano watrobe i oznaczano calkowita zawartosc tluszczów wedlug Besta i wsp., Biochem. J., 40, 368 (1956) i cholesterolu wedlug Sperry'ego i Branda, J. Biol. Chem. 150, 315 (1943).Uzyskane wyniki wykazaly, ze zwierzeta, którym podano SAM w ilosci 1—2 mg/kg byly malo chro¬ nione, natomiast zwierzeta, którym podawano 5 mg/ /kg SAM byly calkowicie chronione przed nadmia¬ rem cholesterolu.W nastepnym tescie farmakologicznym badano dzialanie przeciwzapalne i znieczulajace SAM.Z wielu mozliwych testów wybrano najbardziej klasyczny test na ostre zapalenie, polegajace na wywolywaniu obrzeku przez podawanie karageniny lub bialka z jaj oraz test na zapalenie przewlekle polegajacy na wywolywaniu ziarniniaka pigulkami z waty lub zapalenia stawów przez odpowiednie adjuwanty. We wszystkich przypadkach SAM wy¬ kazywal aktywnosc, zarówno przy podaniu doust¬ nym w ilosci 20—100 mg/kg jak i pozajelitowym Poziom cholesterolu w watrobie po zakonczeniu doswiadczenia (srednia z jednej serii) Grupa I II.III IV V .VI Waga swiezej watroby w g 18 16 17 16 16 Calkowita zawartosc tluszczów g 1,41 1,93 3,84 3,70 3,5 2,0 % 9,4 ,6 24,0 21,6 21,9 12,5 Cholesterol mg 40 68 92 90 67 61 " % 2,6 3,7 ,7 ,2 4,1 3,8 w ilosci 10 i 20 mg/kg, w porównaniu z innymi, znanymi preparatami farmaceutycznymi, np. Ibu- profenem i Indometacina. Testy na dzialanie znie¬ czulajace stosowano w postaci testu goracej plytki, dzialania kwasem octowym i testu Randala i Se- litto u szczurów. Nowe preparaty wykazaly w tych testach aktywnosc w porównaniu ze znanymi srod¬ kami farmaceutycznymi o takim samym dzialaniu.W nastepnym tescie badano dzialanie SAM na czas spania wywolywanego podawaniem barbitura¬ nów. W tym celu grupie myszy podawano dootrze¬ wnowe heksobarbital w ilosci 80 mg/kg, poslugujac sie metoda opisana przez Holtena i Larsena, w Acta Pharacol. Toxicol. 12, 346 (1956). Jedna z grup pozostawiono jako kontrolna, drugiej podawano' do¬ otrzewnowe SAM w ilosci 10 mg/kg.Kontrola SAM, 10 mg/kg, dootrzewnowo Czas spania w minutach i 24,4±2,7 41,2+5,8 Jak wynika z powyzszych danych SAM przedluza czas spania wywolywanego heksobarbitalem.Badania kliniczne. Jesli jest mowa o podawaniu SAM, nalezy to rozumiec jako stosowanie SAM+..HS04-.H2S04.2CH3C6H4S03H i/lub SAM+.HS04"..H2SO4.CH3C5H4SO3H.Poslugujac sie danymi uzyskanymi z badan far¬ makologicznych przeprowadzono badania kliniczne w stanach chorobowych, które wydaja sie byc bez¬ posrednio lub posrednio zwiazane z zaburzeniami: 1 — przemian tluszczów, 2 — przemian bialkowych i weglowodanowych, 3 — przemian katecholoamin i amin biogennych. 1. Podczas badan klinicznych, przeprowadzonych na setkach pacjentów, zaobserwowano, ze przy po¬ daniu SAM w róznych dawkach, uzyskuje sie szyb¬ ki spadek poziomu lipidów watrobowych w sta¬ nach stluszczenia watroby o róznej patogenezie.Oceny dokonywano po zakonczeniu podawania pre¬ paratu oraz nastepnie po uplywie 60 dni. Podawa¬ nie nowego preparatu powoduje równiez znaczny spadek wysokiego poziomu cholesterolu i lipidów we krwi oraz normalizuje zmiany stosunku p- do a-lipoprotein, w przypadkach niewyrównanych sta¬ li 40 45 50 55 6095 666 11 12 nów zwiazanych z nadmiernie wysokim poziomem lipidów we krwi.Obnizanie poziomu cholesterolu i lipidów we krwi jest zalezne od wielkosci dawki i wystepuje juz przy podaniu 20—30 mg, 2—3 razy dziennie.W czystej miazdzycy polaczonej z kliniczna ma¬ nifestacja zaburzen psychicznych, ze zmianami w centralnym ukladzie nerwowym, wywolywanymi przez zmiany sklerotyczne naczyn mózgowych i zja¬ wisko niedotlenienia mózgu, podawanie SAM na drodze iniekcji domiesniowych, lub w ciezszych przypadkach iniekcji dozylnych albo powolnych wlewów dozylnych, w ilosci 20—40 mg, 3—4 razy dziennie, wywoluje korzystna zmjane objawów cho¬ robowych. W szczególnosci w stanach wyraznego niedotlenienia uzyskiwanie powrotu normalnych funkcji zyciowych jest bardzo szybkie i statystycz¬ nie znaczace. W objawach wystepujacych po pe¬ knieciu naczyn mózgowych stwierdzono bardzo szybka poprawe obrazu klinicznego. 2. Setkom pacjentów o wtórnym niskim pozio¬ mie bialkowym, rozkojarzeniu przemiany bialko¬ wej, trwalych lub ostrych uszkodzeniach watroby, stanach przed marskoscia i stanach marskosci wa¬ troby, objawach zlego wchlaniania bialek oraz ob¬ jawach deficytu bialkowego, podawano SAM w dawkach dziennych wynoszacych 20—200 mg. Daw¬ ki te, podawane na drodze iniekcji domiesniowych lub dozylnych, w zaleznosci od powagi przypadku, powodowaly statycznie znaczacy wzrost poziomu bialka we krwi, wzrost ilosci albumin i normalizo¬ wanie zaklóconego stosunku frakcji elektrofore- tycznych w surowicy krwi. Temu dzialaniu wzma¬ gajacemu metabolizm bialkowy czesto towarzyszyla znaczna poprawa samopoczucia oraz obiektywna poprawa ogólnego stanu pacjenta i zaobserwowana we wszystkich testach normalizacja funkcjonowa¬ nia watroby. 3. Szczególnie zaskakujace wyniki uzyskiwano podczas badan klinicznych, stosujac nowe sole en¬ zymatyczne wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku, w stanach chorobowych wyraznie zwiaza¬ nych z zaburzeniami w wymianie amin biogen¬ nych, np.: a) w zaburzeniach neuropsychicznych, b) w chorobie Perkinsona i perkinsonizmie o roz¬ maitej etiopatogenezie, c) w stanach zapalnych i bólowych zwiazanych z zapaleniem stawów i kosci oraz bólach pocho¬ dzenia neurologicznego, d) w zaburzeniach cyklicznosci snu i czuwania.Co cie tyczy punktu a), to rozlegle badania pole¬ gajace na obserwacjach klinicznych zachowywania sie i testach Hamiltona i Wittenberga, wykazaly wyraznie, ze .podawanie SAM, w ilosci 20—50 mg, 3—4 razy dziennie, w ciagu 5—15 dni, powoduje, bez stosowania innych rodzajów terapii, znaczne zmniejszenie glównych objawów znamiennych dla stanów depresyjnych.W punkcie b), w zwiazku z leczeniem choroby Parkinsona i parkinsonizmu stwierdzono, ze: 1. Podawanie soli SAM, w ilosci 10—40 mg dzien¬ nie, na drodze iniekcji domiesniowej lub dozylnej, albo doustnie, w zaleznosci od powagi przypadku, w polaczeniu z normalna kuracja za pomoca Levo- dopa, daje statystycznie znaczniejsza poprawe w wypadkach akinazy i w stanach spastycznych niz w przypadku leczenia pacjentów tylko za pomoca Levodopa. Stwierdzono takze znaczne dzialanie w przypadku drzaczki zwiazanej z choroba Parkin¬ sona, której nie mozna leczyc tylko przez podawa¬ nie Levodopa. 2. Podawanie soli SAM zmniejsza znacznie zabu¬ rzenia psychiczne zwiazane ze stosowaniem Levo- dopa, szczególnie stany depresyjne i objawy roz¬ draznienia. 3. Podawanie soli SAM, w ilosciach podanych po¬ wyzej, znacznie zapobiega wystepowaniu objawów ubocznych zwiazanych ze stosowanie Levodopa a dotyczacych rozmaitych organów i narzadów.Szczególnie dotyczy to mdlosci, wymiotów, braku apetytu, nadcisnienia, oslabienia, nadmiernego po¬ cenia i bezsennosci Odnosnie punktu c), sól SAM, która w badaniach farmakologicznych wykazywala wyrazne dzialanie przeciwzapalne i przeciwbólowe,, okazala sie byc aktywna w stosunku do wszystkich postaci zapale¬ nia stawów i kosci, przy podawaniu na drodze iniekcji domiesniowych lub dozylnych, w dawce dwa razy po 30 mg dziennie w pierwszym oraz 30— 50 mg, cztery razy dziennie, w drugim przypadku.Juz po siedmiodniowym leczeniu skurcz miesni, ograniczenia ruchowe, bóle lokalne i drzaczka, ule¬ gaja w porównaniu z placebo, znacznej poprawie.Badania krwi w kale nie wykazywaly zadnych zmian podczas podawania leku. Sól SAM, w po¬ równaniu z niesterydowymi lekami przeciwzapal¬ nymi, stosowanymi w badaniach slepoty, wykazuje skutecznosc terapeutyczna równa indometacynie.Dzialanie przeciwbólowe soli SAM sprawdzono takze u pacjentów z róznymi objawami neurologi¬ cznymi, takimi jak zapalenie nerwów, zapalenie wielonerwowe, rwa kulszowa, zapalenie okreznicy, krecz szyi. Efekt terapeutyczny uzyskuje sie po pierwszym dniu podawania, w ilosci 15 mg, dwa razy dziennie,, na drodze iniekcji' domiesniowej lub —50 mg, 3—4 razy dziennie, przy podawaniu do¬ ustnym. Analogiczne wyniki uzyskiwano podajac lek doustnie, w postaci tabletek do zucia, pacjen¬ tom .cierpiacym na trwale lub nawracajace mi¬ greny.Odnosnie punktu c), to znaczy zaburzen w cykli¬ cznosci snu i czuwania, szczególnie zas bezsennosci, nowy zwiazek podawany doustnie w ilosci 10— mg, w znacznej mierze usuwa te przypadlosci, wywolujac sen fizjologiczny bez koniecznosci sto¬ sowania barbituranów lub innych substancji dzia¬ lajacych na kore i centralne osrodki mózgowe.Jak wynika z przytoczonych danych, nowy lek otwiera liczne, nieoczekiwane perspektywy w te¬ rapii ludzkiej. Reasumujac, mozna stwierdzic, ze dzialanie nowego leku zostalo przebadane w naste¬ pujacych dziedzinach terapii: uszkodzenia watroby, stany z podwyzszona iloscia bialka we krwi, uogól¬ niona lub miejscowa arterioskleroza, zaburzenia psychiczne typu depresyjnego i neurologicznego, choroby stawów, bóle typu neurologicznego oraz zaburzenia rytmu snu i czuwania. Wiele innych dziedzin terapii trzeba natomiast jeszcze przebadac.Najbardziej korzystne jest podawanie nowych 40 45 50 55 6013 95 666 14 soli SAM w postaci iniekcji domiesniowych lub do¬ zylnych albo doustnie lub w postaci tabletek pod- jezykowych lub kapsulek.Przyklad I. Do 90 kg drozdzy wzbogaconych w S-adenozylo-L-metionine w ilosci 6,88 g/kg, w sposób opisany przez Schlenka w Enzymologia, 29, 283 (1965), dodaje sie 11 litrów octanu etylu i 11 li¬ trów wody, w pokojowej temperaturze. Calosc mie¬ sza sie energicznie w ciagu 30 minut, dodaje 50 li¬ trów 0,35 n kwasu siarkowego i kontynuuje mie¬ szanie w ciagu dalszej 1,5 godziny. Po przesaczeniu i przemyciu woda otrzymuje sie 140 litrów roztwo¬ ru zawierajacego 4,40 g/litr SAM, co odpowiada 99,5 jej zawartosci w surowcu wyjsciowym.Do powyzszego roztworu dodaje sie, podczas mie¬ szania, roztwór 2,3 kg kwasu pikrólonowego, w 25 litrach ketonu metylowoetylowego. Nastepnego dnia oddziela sie wytracony osad za pomoca odwiro¬ wania i przemywa go woda.Do otrzymanego' w ten sposób osadu dodaje sie, podczas mieszania, 0,1 n roztwór kwasu siarkowego i p-toluenosulfonowego oraz 18 litrów ketonu me¬ tylowoetylowego. Po odstaniu oddziela sie faze or¬ ganiczna, która kieruje sie do regeneracji kwasu pikrólonowego. Do warstwy wodnej dodaje sie nieco ketonu metylowoetylowego w celu usuniecia resztek pikrólonowego a nastepnie wegla aktyw¬ nego i saczy. 16,5 litra otrzymanego roztworu zawiera 33,8 g/litr SAM, co odpowiada 90% ilosci obecnej w droz¬ dzach. Chromatografia cienkowarstwowa, wykona¬ na wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28 (1971), wyka¬ zuje obecnosc tylko SAM bez sladów produktów rozkladu lub innych zasad organicznych. Powyzszy roztwór wlewa sie, podczas mieszania do 100 litrów acetonu. Po odstaniu roztwór dekantuje sie a otrzy¬ many osad rozpuszcza sie w 3,3 kg 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu. Do roz¬ tworu dodaje sie wegiel aktywny, saczy i wlewa do 25 litrów eteru etylowego.Otrzymuje sie 1184 g krystalicznego osadu, latwe¬ go do saczenia, malo higroskopijnego, i dobrze roz¬ puszczalnego w wodzie (ponad 20%), tworzacego bezbarwny roztwór. Sól jest slabo rozpuszczalna w metanolu i etanolu oraz nierozpuszczalna w ace¬ tonie, ketonie metylowoetylowym, chloroformie, wyzszych alkoholach i benzenie. Chromatografia cienkowarstwowa wedlug Anal. Biochem. 4, 16—28 (1971) wykazuje, ze produkt nie zawiera zadnych zanieczyszczen.Analiza elementarna: obliczono dla wzoru Cr9H42N6019S5 i ciezaru czasteczkowego 938,98: C — 37,09%, H — 4,51%, S — 17,07%, N — 8,95%, zna¬ leziono: C — 36,39%, H — 4,6%, N — 8,8%, S —. 16,7%. Kwas siarkowy: obliczono — 20,89%, zna¬ leziono — 20,5%, kwas p-toluenosulfonowy: obli¬ czono — 36,67%, znaleziono — 36,0%, S-adenozylo- -L-metionina: obliczono — 41,54%, znaleziono — 41,7%. Zawartosc wody oznaczana metoda Fischera wynosi 1,7—2%. W widmie w nadfiolecie wystepuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 260nm oraz Efcm = l82.Powyzsze dane odpowiadaja zwiazkowi o wzo¬ rze 2. Identycznosc nowego zwiazku potwierdzono równiez stosujac metody enzymatyczne oparte na enzymatycznym metylowaniu amidu kwasu nikoty¬ nowego lub octanu guanidyny S-adenozylo-Tj-me- tionina (G-L. Cantoni, J. Bil. Chern,, 189, 745 (1951) s oraz G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd i H.H. Richards, J. Amer. Chem. Soc., '81, 3975 (1959).Przyklad II. Roztwór zawierajacy 1,15 kg kwasu pikrólonowego w 10 litrach alkoholu buty- io lowego dodaje sie do 70 litrów roztworu pochodza¬ cego z lizy komórek drozdzy, otrzymanego przy za¬ stosowaniu takiego samego surowego materialu i takich samych metod, jak stosowane w przykla¬ dzie I. Po odstawieniu na okres nocy oddziela sie wytracony osad za pomoca odwirowania.Do osadu dodaje sie 9 litrów 0,1 n roztworu kwa¬ su siarkowego i kwasu p-toulenosulfonowego oraz 9 litrów ketonu metylowoizobutylowego. Po odsta¬ niu, oddziela sie warstwe organiczna, a wodna przemywa mala iloscia ketonu metylowoizobutylo¬ wego celem odmycia resztek kwasu pikrólonowego.Do warstwy wodnej dodaje sie wegiel aktywny, saczy i przesacz wlewa do 70 litrów alkoholu me¬ tylowego. Po wytraceniu sie osadu dekantuje sie rozpuszczalnik, a osad rozpuszcza sie w 1,65 kg % roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w me¬ tanolu. Po odbarwieniu weglem aktywnym prze¬ sacz dodaje sie do 10 litrów chloroformu, otrzymu- jac latwy do saczenia, krystaliczny dwusiarczano- 3o -dwu-p-toluenosulfonian SAM, w ilosci 1110 g. Wy¬ niki analiz sa identyczne jak dla produktu otrzy¬ manego w przykladzie I.Przyklad III. 1,15 kg kwasu pikrólonowego rozpuszczonego w 12 litrach n-butanolu dodaje sie do 70 litrów roztworu pochodzacego z lizy komórek drozdzy i otrzymanego w sposób opisany w przy¬ kladzie I.Nastepnego dnia odwirowuje sie wytracony osad i dodaje do niego 9 litrów 0,1 n kwasu siarkowe- 40 go i p-toluenosulfonowego oraz 12 litrów n-buta¬ nolu. Warstwe organiczna oddziela sie a wodna przemywa mala iloscia n-butanolu w celu usunie¬ cia sladów kwasu pikrólonowego. Po odbarwieniu weglem aktywnym, przesacz wlewa sie do 65 li- 45 trów alkoholu n-propylowego.Wytracony osad oddziela sie od rozpuszczalni¬ ka przez dekantacje a nastepnie rozpuszcza w 1,65 kg 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowe¬ go w metanolu. Po odbarwieniu weglem aktyw- 50 nym przesacz wlewa sie do 14 litrów n-butanolu.Otrzymuje sie latwy do saczenia krystaliczny osad dwusiarczario-dwu-p-toluenosulfonianiu SAM, w ilosci 1155 g. Wyniki analiz sa identyczne jak dla produktu otrzymanego w przykladzie I. 55 Przyklad IV. Oczyszczanie specyficznego enzymu. 50 ml sefarozy (wielocukier produko¬ wany przez Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsa¬ la, Szwecja) zawiesza sie w wodzie i traktuje bro- mocyjanem, stosujac postepowanie znane w przy- 60 padkach osadzania substancji zawierajacych gru- pv aminowe na matrycach preparowanych z zelu wielocukru. Do tak przygotowanego zelu dodaje sie nadmiar L-lizyny, po czym przemywa kolejno destylowana woda, buforem o wartosci pH = 8,5 65 oraz buforem o wartosci pH = 4,5. Otrzymanym15 95 666 16 zelem zaladowuje sie kolumne o srednicy 1,5 cm i wysokosci 30 cm, przez która nastepnie prze¬ puszcza sie roztwór bufprowy o wartosci pH = 8,0 zawierajacy 0,05 mola trójetanoloaminy i 0,01 mo¬ la kwasu siarkowego az do jej calkowitego zrów¬ nowazenia. Na kolumne nanosi sie 2 ml wyciagu drozdzowego zawierajacego enzym, przygotowane¬ go na drodze dzialania ultradzwiekami lub homo¬ genizacji w suchym lodzie i ewentualnie wzboga¬ conego w specyficzny enzym.Do elucji stosuje roztwór buforowy, taki sam jaki uzywa sie do równowazenia kolumny a ko¬ lejne frakcje bialkowe oznacza sie stosujac po¬ miary absorpcji w nadfiolecie. Jednoczesnie oznacza sie w poszczególnych frakcjach eluatu aktywnosc enzymu, poslugujac sie metoda opisana przez J.A.Stekola w Methods in Enzymology, 6, 566 (1963).Frakcje wykazujace odpowiednia aktywnosc laczy sie otrzymujac roztwór o aktywnosci co najmniej dwudziestokrotnie wyzszej od wyjsciowego wycia¬ gu. Roztwór zawierajacy enzym mozna dalej zate- zac stosujac wytracanie za pomoca soli lub roz¬ puszczalników organicznych albo inne metody, sto¬ sowane do zatezenia roztworów zawierajacych substancje bialkowe.Wytwarzanie SAM. 30 ml napecznialego zelu Se- farozy aktywuje sie bromocyjanem albo w inny sposób stosowany w procesach osadzania bialek na zelach wielocukrów. Do aktywowanego zelu do¬ daje sie 4 ml roztworu specyficznego enzymu za¬ wierajacego okolo 100 mg bialka, przygotowanego w sposób opisany powyzej. Zawiesine aktywowa¬ nego zelu i roztworu enzymu miesza sie w ciagu 18 godzin, w temperaturze 4°C a nastepnie prze¬ mywa woda. W wodzie po przemyciu znajduje sie okolo 70% calkowitej aktywnosci enzymatycznej.Natomiast okolo 20% enzymu zostaje zwiazane z wielocukrem, co stwierdza sie inkubujac Sefa- roze w sposób opisany uprzednio dla oznaczania aktywnosci enzymu. Tak przygotowana Sefaroze zaladowuje sie do kolumny o srednicy 1,5 cm i wy¬ sokosci 20 cm a nastepnie przez kolumne prze¬ puszcza sie roztwór zawierajacy 0,675 m trójeta¬ noloaminy, 0,150 m siarczanu magnezu, 0,05 m ATP, 0,05 m L-metioniny oraz 0,01 m chlorku po¬ tasu, z szybkoscia 5 ml/godz. w temperaturze 25— 27°C. Analiza eluatów z kolumny wykazuje, ze SAM otrzymuje sie z 30% wydajnoscia.Wytwarzanie podwójnych soli SAM z kwasem siarkowym i kwasem p-toluenosulfonowym. 103 ml eluatu zawierajacego 6 g/litr SAM za¬ kwasza sie kwasem siarkowym do wartosci pH = = 3 a nastepnie dodaje sie, podczas mieszania, roz¬ twór 2,3 g kwasu pikrolonowego w 25 ml ketonu metylowoetylowego. Nastepnego dnia odsacza sie osad i przemywa go woda, po czym rozpuszcza w 18 ml 0,1 n roztworu kwasu siarkowego i p-to- luenosulfonowego w 18 ml ketonu metylowoetylo¬ wego. Calosc miesza sie i oddziela faze organiczna.Warstwe wodna przemywa sie mala iloscia ketonu metylowoetylowego w celu usuniecia resztek kwa- su pikrolonowego. Po odbarwieniu weglem aktyw¬ nym otrzymuje sie 16,5 ml bezbarwnego roztworu wodnego, zawierajacego 33,8 g/litr SAM, co odpo¬ wiada 90% ilosci zawartej w wyjsciowym eluacie.Chromatografia cienkowarstwowa wykazuje, ze roztwór zawiera tylko S-adenozy-10-L-metionine. 16,5 ml powyzszego roztworu wlewa sie do 100 ml acetonu, miesza i po odstaniu dekantuje rozpusz¬ czalnik. Osad rozpuszcza sie w 6,6 g 15% roztworu kwasu p-toluenosulfonowego w metanolu. Roztwór odbarwia sie weglem aktywnym, saczy i przesacz wlewa do 25 ml eteru etylowego. Po odsaczeniu otrzymuje sie 0,967 g krystalicznej soli o wzorze SAM+.HS04-.H2S04.CH3C6H4S03H. Analiza elemen¬ tarna: obliczono dla wzoru C22H84016N6S4; C — 34,46%, H — 4,47%, N — 10,96%, S — 16,72%, zna¬ leziono: C — 33,68%, H — 4,65%, N — 10,8%, S — 16,5%.Zawartosc SAM+ — 50,5%, wody — 2,1%, kwasu siarkowego — 25,3%, kwasu p-toluenosulfonowe¬ go — 21,7%.W widmie w nadfiolecie wystepuje maksimum absorpcji przy dlugosci fali 260 nm oraz EJ0/£m = 179.Powtarzajac opisane powyzej postepowanie ale stosujac 3,3 g 15% roztworu kwasu p-toluenosul¬ fonowego w metanolu i 25 ml eteru etylowego do wytracania, otrzymuje sie 1,18 g soli o wzorze SAM+.H2iS04.2CH3C6H4S03H identycznej z otrzy¬ mana w przykladzie I.¦ CHj-S -CH2-CH2-CH -COOH X" Wzór 1 CH3 NH9 CH-CH-CH-CH-CH-S-CH2CH2-CH-COOH.H2S04.2CH3C6H4S03H j ÓH ÓH I I n—I HSO/.Wzór PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania podwójnych soli S-adeno- zylo-L-metioniny (SAM) z kwasem siarkowym i kwasem p-toluenosulfonowym o wzorze SAM+. .HS04~.H2S04.XCH3C6H4S03H, w którym X ozna¬ cza liczbe 1 lub 2] znamienny tym, ze stezony roz¬ twór SAM o wzorze 1 zakwasza sie roztworem kwasu pikrolonowego w wodzie lub w organicz¬ nym rozpuszczalniku rozpuszczalnym w wodzie, a nastepnie rozpuszcza stracony pikrolonian SAM w mieszaninie zawierajacej równe objetosciowo wodne roztwory kwasu siarkowego i kwasu p-to¬ luenosulfonowego o tej samej normalnosci wyno¬ szacej 0,05—0,2, po czym straca z warstwy wodnej podwójna sól SAM z kwasem siarkowym i kwasem p- toluenosulfonowym za pomoca ketonu lub niz¬ szego alkoholu calkowicie rozpuszczalnego w wo¬ dzie, rozpuszcza stracona podwójna sól w 10—20% roztworze kwasu p-toluenosulfonowego w metano¬ lu i straca podwójna sól SAM z kwasem siarko¬ wym i kwasem p-toluenosulfonowym przez doda¬ nie rozpuszczalnika organicznego. 15 20 25 30 35 40 45 50 *95 666 CH-CH-CH-CH- I OH I ' ' I OH OH I O ' NH N*~Ti—N CH- I ó NU, i * PL
PL17223674A 1973-06-27 1974-06-27 Sposob wytwarzania nowych podwojnych soli s-adenozylo-alfa-metioniny PL95666B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2589473A IT1022016B (it) 1973-06-27 1973-06-27 Sale enzimatico e processo per la sua preparazione

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL95666B1 true PL95666B1 (pl) 1977-11-30

Family

ID=11218051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL17223674A PL95666B1 (pl) 1973-06-27 1974-06-27 Sposob wytwarzania nowych podwojnych soli s-adenozylo-alfa-metioniny

Country Status (2)

Country Link
IT (1) IT1022016B (pl)
PL (1) PL95666B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
IT1022016B (it) 1978-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3954726A (en) Double salts of S-adenosil-L-methionine
US4057686A (en) Sulphonic acid salts of S-adenosilmethionine
US3893999A (en) Salt of S-adenosil-L-methionine and process of preparation
US5658889A (en) Method and compounds for aica riboside delivery and for lowering blood glucose
JP3474073B2 (ja) ウリジンまたはシチジンのアシル誘導体を含有する医薬組成物
Roberts et al. Some metabolic studies of γ-aminobutyric acid.
US5470838A (en) Method of delivering exogenous uridine or cytidine using acylated uridine or cytidine
EP0427799B1 (en) Method and compounds for aica riboside delivery and for lowering blood glucose
US4465672A (en) Stable S-adenosylmethionine salts, the process for their preparation, and therapeutic compositions which contain them as active principle
JPH07507540A (ja) 多発性硬化症の治療のための置換アデニン誘導体を含む薬学的組成物
US4028183A (en) Process of preparing double salts of S-adenosyl-L-methionine
US4543408A (en) Stable S-adenosylmethionine salts, the process for their preparation, and therapeutic compositions which contain them as active principle
PL95666B1 (pl) Sposob wytwarzania nowych podwojnych soli s-adenozylo-alfa-metioniny
WO2019096113A1 (zh) 一种氘代的含硼的化合物及药物组合物和用途
JPH05506842A (ja) 神経変性状態の処置方法
NZ532171A (en) Antidiabetic 2-Substituted-5'-O- (1-boranotriphosphate) adenosine derivatives
SU1433416A3 (ru) Способ получени S-аденозилметиониновых (САМ) солей
NO139523B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av doble salter av s-adenosil-l-methionin
WO2020140730A1 (zh) 硫鸟嘌呤在制备治疗adsl缺陷症药物中应用
Mann The interrelationship between niacin in large doses and vitamin B6 status as reflected by an altered methionine metabolism in rats