NO139523B - Fremgangsmaate for fremstilling av doble salter av s-adenosil-l-methionin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av uhyre stabile doble salter av S-adenosil-L-methionin (SAM) ved hvilken disse kan fremstilles enkelt og økonomisk i industriell skala.

SAM er særlig et produkt av naturlig opprinnelse, som finnes i.alle levende organismer fra bakterier til planter, fra encellede organismer til høyerestående pattedyr innbefattet mennesket, hvis struktur har vært kjent i en tid og som illustreres av følgende formel:

hvor X er et ikke spesifikt anion.

I levende organismer dannes SAM ved innvirkning av enzymer (S-adenosilmethioninsynthetasis eller S-adenosiltransferasis) i det cytoplasmatiske område ut fra methionin som opptas, med nærings-midlene eller fra ATP som foreligger som energireserve i hver levende celle.

Det har også vært kjent i en viss tid at SAM er et produkt av fundamental betydning i et stort antall biologiske reaksjoner med enzymatisk transmethylering, hvorfor det alltid har vært betrak-tet som et meget viktig reagens innen biokjemien.

Det store problem med denne forbindelse har alltid vært dens store ustabilitet ved omgivende eller høyere temperaturer, og fremgangsmåte ved fremstilling av denne er arbeidskrevende og kan ikke lett utføres i industriell skala.

I de siste år har det vært forsket mye med henblikk på å stabilisere SAM i en slik grad at det er mulig å anvende denne innen biologisk forskning, og mot fremstilling av salter som er stabile under normal temperatur og fuktighet.

På denne måte har kloridet og sulfatet av SAM vært fremstilt, men disse kan bare anvendes som reagenser innen biokjemien i løpet av kort tid, på grunn av at deres stabilitet selv i tørr tilstand er begrenset ved lave temperaturer. Ennvidere er fremgangsmåten ved fremstilling av disse bare anvendbar ved fremstilling av små mengder,.men ikke for fremstilling i industriell skala.

Det er nå ganske uventet funnet nye salter av SAM som er uendelig stabile med tiden ved temperaturer opp til 45° C, og som kan fremstilles ved en ny fremgangsmåte som lett og økonomisk kan utføres i industriell målestokk med høye utbytter. Disse salter har vist seg. ganske overraskende å utvise.en sterk legende styrke i mange områder innen medisinen, ofte tilsynelatende uten forbin- else mellom disse. De nye salter ifølge foreliggende oppfinnelse er doble salter av SAM med p-toluensulfonsyre og svovelsyre, tilsvarende formelen SAM<+>.HS04~.H2S04.2CH3CgH4S03H, og SAM<+>.HS04~. H2S04.CH3C6H4S03H.

Det betydelige tekniske fremskritt som oppnås ved disse nye salter illustreres i den etterfølgende tabell som sammenligner stabiliteten med tiden ved 45 Ci tørr tilstand av de to mest stabile salter av SAM kjent opp til nå, dvs. kloridet og sulfatet, med det nye di-sulfat-di-p-toluensulfonat. Tallene angir prosenten av SAM-residuet etter de angitte tider:

De erholdte stabilitetsverdier med di-sulfat-mono-p-toluensulfonat er ekvivalent med de som ble oppnådd for di-sulfat-di-p-toluensulfonatet.

Oppfinnelsen angår følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av doble salter av S-adenosil-L-methionin (SAM) med strukturformel

hvor. n = X-eller; 2 og fremgangsmåten er særpreget ved at

a) der fremstilles en konsentrert oppløsning av SAM,

b) tilstedeværende SAM i oppløsningen utfelles ved surgjøring med en oppløsning av picrolinsyre i vann eller i et organisk

oppløsningsmiddel som er oppløselig i vann,

c) SAM-picrolonat oppløses i en blanding bestående av like volum-deler av et organisk oppløsningsmiddel som erJ delvis blandbart

med vann, og av en vandig oppløsning bestående av svovelsyre og p-toluensulfonsyre med like normaliteter på mellom 0,05 og

0,2,

d) SAM-saltet utfelles fra det vandige lag ved tilsetning av 4 8 volum, i forhold til den vandige oppløsning, av et organisk, oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av aceton, methylalkohol, ethylalkohol, propylalkohol, e) det utfelte salt oppløses i en 10-20%-ig oppløsning av p-toluensulfonsyre i methanol,

f) det doble salt av formelen SAM+.HSO ~.HoS0..2CH~C,H.SO..H

4 2 4 3643 utfelles med et organisk oppløsningsmiddel når den minimale nødvendige mengde methanol anvendes i trinn e), mens det doble salt av formelen SAM+.HS0/,~.HoS0/1 .CH-,C,H. SO-.H utfelles

4 z 4 3 6 4 3

når et stort overskudd av methanol anvendes i trinn e)

Trinn (a) i fremgangsmåten kan utføres på forskjellige måter som er like effektive for det formål å oppnå en konsentrert løsning av SAM.

Ifølge en alternativ utførelsesform behandles gjær

(Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis etc.)

anriket med SAM ved tilsetning av methionin under egnede betingelser (Schlenk,Enzymologia 29, 283 (1965)), med ethylacetat og deretter med svovelsyre med en normalitet mellom 0,1 og 0,5, fortrinnsvis 0,35 N, ved omgivende temperatur for således å bevirke lyse av cellene og overføring av praktisk talt 100 % av tilstedeværende SAM over i løsningen.

Fortrinnsvis anvendes mengder av vann og acetat mellom 1/20 og 1/5 av vekten av de fuktige celler, og behandlingen utføres i løpet av .15 - 45 minutter-, fortrinnsvis i løpet av 30 minutter.

Svovelsyre tilsettes deretter og lysen utføres i løpet av 1-2 timer, fortrinnsvis i løpet av 1,5 timer. Det skal bemerkes at lysen av gjærceller utført med en blanding av organisk løsnings-middel og fortynnet svovelsyre er mer hensiktsmessig enn den som normalt utføres med perklorsyre ved omgivende temperatur, eller med maursyre eller eddiksyre ved 60° C og lignende, idet den ikke bare finner sted ved omgivende temperatur som er meget fordelaktig med hensyn til stabiliteten av SAM, men fordi den utføres under slike betingelser at løsningen kan lett filtreres fra celle-resten, og inneholder ikke noe av de forurensninger som foreligger når de andre lyseringsmidler anvendes, og som er vanskelig å fjerne med de kjente metoder for fremstilling av ren SAM.

Ifølge et annet alternativ utføres trinn (a) ved fremstilling av SAM ved enzymatisk syntese ved virkning av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferasis (E.C. 2.4.2.12) på en inkubasjonsblanding inneholdende adenosiltrifosfat (ATP) og methionin.

Den.vesentlige betingelse for industriell utførelse av denne metode er at enzymet er rent og foreligger i en form som lett kan isoleres både fra den opprinnelige inkubasjonsblanding og fra det dannede SAM.

Det er nå funnet en fremgangsmåte for rensing av enzymet ATP-methionin-adenosiltransferase ved affinitetskromatografi plus en kolonnereaksjonsmetode, hvilket gjør det mulig å oppnå de ovenfor angitte mål.

Affinitetskromatografi,av det spesifike enzym ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved percolering av en løsning inneholdende dette/f.eks. et råekstrakt av gjær eller "Escherichia coli" gjennom en kolonne fyllt med en fast bærer til hvilken en gruppe er kovalent bundet som virker som en konkurrerende inhibitor for enzymet. Det er ganske overraskende funnet at et utmerket fyllstoff for en slik rensekolonne består i en aktivert gel av polysacchari-der til hvilken L-lysin har vært kovalent bundet.

Affiniteten av det spesifike enzym til lysinresten bundet til den faste matrise bevirker en forsinkelse i eluering av enzymet fra kolonnen, og gjør det således mulig å oppnå en separasjon fra de andre proteiner i en meget ren tilstand.

Imidlertid har separasjonen av enzymet fra eluatet som inneholder dette, for bruk i det neste enzymatiske syntesetrinn, gitt fullstendig utilfredsstillende resultater fordi dets stabilitet etter at det er separert avtar med tiden, og etter å ha vært anvendt én gang ved syntesen av SAM, ble det i tillegg ødelagt i den etterfølgende rensing av SAM. Det er nå funnet at utmerkede resultater oppnås ved å absorbere eluatet inneholdende det spesifike enzym i en egnet fast bærer og ved å utføre den katalytiske reaksjon mellom methionin og ATP i kolonnen, hvilket fører til dannelse av

SAM.

En egnet fast bærer består i et polysaccharid aktivert med et reagens som er egnet til å binde proteiner til faste bærere, slik som cyanogenbromid.

Ved percolering av en løsning av ATP og méthohin i en egnet bufferløsning gjennom kolonnen erholdes det et eluat ved bun-nen av kolonnen inneholdende SAM.

Trinn (b) muliggjør en separering av SAM i meget ren tilstand. I sure, omgivelser vi? faktisk den eneste forbindelse-som utfelles av picroloninsyre væreSAM,scm vist, ved tynnskiktskroma-tografi ifølge Anal. Biochem. 4, 16 - 28 (1971). Picroloninsyre har således en overraskende selektiv virkning. De tidligere anvendte u tfellingsmidler slik som picrinsyre, Reinecke-salt eller borsyre gir meget urene bunnfall som alltid krever en etterfølgende rensing av SAM ved ionebyttekromatografi, en fremgangsmåte som er meget kostbar og vanskelig å utføre industrielt. Det er også vanskelig å oppnå produktet med den nødvendige renhet. Anvendelse av vandige løsninger av picroloninsyre eller løsninger av denne syre i de tidligere angitte organiike løsninger medfører ingen spesielle pro-blemer, og er en metode som utføres ved omgivende temperaturer.

Trinn (c) utføres med vandige løsninger inneholdende p-toluensulfonsyre og svovelsyre i konsentrasjoner begge på mellom 0,05 og 0,2 N, fortrinnsvis 0,1 N, og med et organisk løsningsmid-del som er delvis blandbart med vann slik som methylethylketon eller n^hutanol. Anvendelse av det organiske løsningsmiddel gjør det mulig å redusere den vandige syreløsning og praktisk talt eliminere alt av picroloninsyren.

Trinn (d) utføres ved anvendelse av mellom

4 og 8 volumer (i forhold til volumet av den vandige løsning) av et løsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av aceton, methylalkohol, ethylalkohol og propylalkohol.

Det er også ganske overraskende funnet at hvis det i trinn (e) anvendes den minimale mengde methanol som er nødvendig til å løse bunnfallet som stammer fra trinn (d), utskilles det doble salt SAM+.HS04".H2S04.2CH3C6H4SO:3H i det etterfølgende utfellings trinn (f) .

Hvis imidlertid det anvendes et volum av methanol som er tenkt dobbelt så stort som det nødvendige volum i trinn Xe), utfelles det doble salt SAM<+.>HS04~.H2S04.CH3<C>6<H>4S03H i det etterfølgende utfellingstrinn (f).

Anvendelse av mellomliggende mengder methanol fører til dannelse av blandinger av de to salter.

Den ytterligere utfelling av det ene eller det andre av de nye salter ifølge oppfinnelsen (trinn f) krever anvendelse av et organisk løsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av methanol, ether, kloroform, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sekundært butylalkohol, isoamylalkohol og tetrahydrofuran.

De doble salter av SAM erholdt ifølge foreliggende oppfinnelse kan lagres uendelig i tørr tilstand praktisk,talt uforand-ret.

De etterfølgende eksempler illustrerer fremgangsmåten ved fremstilling av de nye salter ifølge oppfinnelsen. Den nye fremgangsmåte krever ikke temperaturer høyere enn omgivende temperatur i noen av trinnene, pg utføres i surt miljø. Dette er meget viktig for å forhindre spaltning av SAM. Ennvidere kreves ikke kom-plisert og arbeidskrevende trinn slik som kromatografi over kolonner eller ionebytterharpikser eller carbon, hvilket ville være vanskelig å utføre industrielt.

Eksempel 1

Til 90 kg gjær anriket med SAM (6,88 g/kg) ifølge Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965) ble tilsatt 11 liter e.thylacetat og 11 liter vann ved omgivende temperatur. Etter kraftig omrøring i 30 minutter ble 50 liter 0,35N svovelsyre tilsatt idet omrøringen ble fortsatt ytterligere i 1,5 timer. Etter filtrering og vasking med vann, ble det erholdt 140 liter av en løsning inneholdende 4,4 0 g/ liter SAM, tilsvarende 99,5 % av det tilstedeværende i utgangsmate-rialet.

En løsning av 2,3 kg picroloninsyre i 25 liter methylethylketon ble tilsatt til løsningen under omrøring. Etter henstand over natten ble bunnfallet fraskilt ved sentrifugerihg og vasket med vann.

Det således erholdte faste stoff ble tilsatt under omrøring til en blanding av 18 liter av en 0,IN løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og 18 liter methylethylketon. Etter henstand ut-skiltes den organiske fase som ble ført til et gjenvinningssystem for picroloninsyre, og den vandige fase ble behandlet med en liten mengde methylethylketon for å fjerne spor av picroloninsyre, og avfargende benkull ble tilsatt hvoretter løsningen ble filtrert.

Qen^e løsning (16,5 liter) inneholdt 33,8 g/liter SAM, tilsvarende 90 % av det foreliggende i gjæren. Når denne ble analysert tynnskiktskromatografisk ifølge Anal. Biochem. 4, 16 - 28

(1971) viste den seg å inneholde bare SAM uten spor av dets spalt-ningsprodukter eller andre organiske baser. Den ovenfor angitte løsning ble heldt over i 100 liter aceton under omrøring. Etter henstand ble løsningsmidlet dekantert fra og det faste materiale ble løst i, 3 ,3. kg ,av. en .15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol. Etter tilsetning av avfargende benkull ble blandingen filtrert og tilsatt til 25 liter ethylether. 1184 g av et krystal linsk salt utfeltes som var lett filtrerbart, ikke meget hygrbsko-pisk og meget løselig i vann (mere enn 20 %) under dannelse av en

fargeløs løsning. Saltet er bare svakt løselig i methanol og etha-nol og uløselig i aceton, methylethylketon, kloroform, .høyere

alkoholer og benzen. Ved tynnskiktkromatografi ifølge Anal.Biochem. 4, 16 - 28.(1971) viste produktet seg å være fritt for enhver for-urensning .

Elementæranalyse av saltet ga følgende resultater:

-C = 36,39 %, H =4,6 %, S = 16,7 %, N = 8,8 %

De beregnede-verdier for C29H42N6^19S5 ^M,w-938»98) er:

C — 37,09 %, H = 4,51 %, N = 8,9 %, S = 17,07 %

Fuktighet bestemt ifølge K. Fischer: 1,7 - 2 % U^V...spektrum av den nye forbindelse viser et absorpsjonsmaksimum ved 260 nm, E* = 182. ;1 cm ;Disse data stemmer overens med en forbindelse av formelen: ; ; Den nye forbindelse ble ennvidere identifisert ved den ensymatiske metode basert på den enzymatiske methylering av nicotin-amid eller guanidineddiksyre med SAM (G.L. Cantoni. J. Biol. Chem., 189, 745 (1951), G. De La Hoba, B.A. Jamieson, S.H. Mudd and H.H. Richards, J. Amer. Chem. Soc. 81, 3975 (1959). ;Eksempel 2 ;,.. ,1,15 kg picroloninsyre løst i 10: liter isobutylalkohol ;ble tilsatt til 70 liter av en løsning som stammet fra lysen av gjærceller, erholdt ved anvendelse av samme råmateriale og samme metode som i eksempel 1. Etter hensatnd over natten ble det dannede bunnfall fraskilt ved sentrifugering. ;Det fraskilte faste stoff ble behandlet med 9 liter av en 0,1N løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og med 9 liter methylisobutylketon. Etter henstand separerte den organiske fase, mens den vandige fase ble befridd for spor av picrolonsyre ved vasking med en liten mengde methylisobutylketon. Avfarvende benkull ble tilsatt og blandingen ble filtrert, filtratet ble heldt ..over i 70 liter methylalkohol. Etter henstand ble det dannede faste materiale dekantert fra løsningsmidlet og ble løst i en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol (1,65 kg). Etter avfarving med benkull ble filtratet tilsatt til 10 liter kloroform under dannelse av et lett filtrerbart krystallinsk bunnfall av SAM-disulfat-di-p-toluensulfonat. Det erholdte produkt (1110 g) ga de samme analyse-resultater som produktet ifølge eksempel 1. ;Eksempel 3 ;1,15 kg picroloninsyre løst i 12 liter n-butanol ble tilsatt til 70 liter av en løsning som stammet fra lysen av gjærceller, erholdt ved den samme lysemetode og med det samme råmateriale som i eksempel 1. Etter henstand over natten ble bunnfallet ;fraskilt ved sentrifugering. Det erholdte faste materiale ble delt mellom 9 liter av en 0,1 N løsning av svovelsyre og p-toluensulfonsyre og 12 liter n-butanol. Etter henstand separerte den organiske fase mens den vandige fase ble befridd for spor av picroloninsyre ved vasking med en liten mengde n-butanol. Avfarvende benkull ble deretter tilsatt og blandingen ble filtrert, filtratet ble heldt over i 65 liter n-propylalkohol. Etter henstand ble det faste materiale dekantert fra løsningsmidlet og løst i en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol (1,65 kg). Etter afravning med benkull ble filtratet heldt over i 14 liter n-butanol under dannelse av et lett filtrerbart krystallinsk bunnfall av SAM-disulfat-di-p-toluensulfonat. Sluttproduktet (1155 g) ga de samme analyseresul-tater som produktet ifølge eksempel 1. ;Eksempel 4 ;Rensing av det spesifike enzym ;50 ml Sepharose (polysaccharid fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, sverige) sammenklumpet og suspendert i vann, ble behandlet med cyanogenbromid ifølge kjente metoder for å binde substanser inneholdende amingrupper til matriser bestående av polysaecharidgel. Et overskudd av L-lysin ble tilsatt til den således fremstilte gel. Den ble deretter vasket med henholdsvis destillert vann, en pufferblanding med pH 8,5 og en bufferblanding med pH 4,5. Gelen ble deretter anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 30 cm. En bufferblanding bestående av 0,05 M triethanolamin og 0,01 M H2S04med pH 8,0 ble ført gjennom kolonnen inntil det ble erholdt fullstendig likevekt. 2 ml gjærekstrakt inneholdende det spesifike enzym ble fyllt på kolonnen, erholdt ved sonifikering eller homogenisering med tørr is og eventuelt etter anrikning med det spesifike enzym. Kolonnen ble deretter eluert med den samme bufferblanding som ble anvendt for likevekt-behandling, og fordelingen av proteinene i eluatet ble fulgt ved ultrafiolett spektrofotometriske målinger. Samtidig ble syntetaseaktiviteten målt i -forskjellige fraksjoner ifølge J.A.Stakol, Methodes in Enzymology, vol. 6, s. 566 (1963). De fraksjoner som utviste en relevant syntetaseaktivitet ble slått sammen og den således erholdte løsning utviste en spesifik aktivitet på minst 20 ganger større enn råekstraktet. Enzymet kan ytterligere konsentreres i denne løsning ved utfelling med salter, med organiske løsningsmidler eller etter andre kjente metoder for konsentrering av proteinløsninger. ;F remstilling av SAM ;30 ml sammenklumpet Sepharose-gel ble aktivert med cyanogenbromid eller etter en annen kjent metode for å binde proteiner til polysaccharid-gelmatriser. 4 ml av en løsning av det spesifike enzym renset som ovenfor angitt og inneholdende ca. 100 mg protein ble tilsatt den aktiverte gel. Suspensjonen av aktivert gel og enzymløsningen ble omrørt ved 4° C i 18 timer. Harpiksen ble vasket med vann. Vaskevæsken inneholdt ca. 70 % av den totale enzymatiske aktivitet som opprinnelig forelå i løsningen av det spesifike enzym. Ved inkubering av Sepharose fremstilt som ovenfor angitt med den ;ovenfor angitte metode for bestemmelse av syntetaseaktiviteten, ble det observert at ca. 20 % av den totale aktivitet er bundet til polysaccharidet. ;Sepharose fremstilt som ovenfor angitt ble anvendt for å pakke en kolonne med en diameter på 1,5 cm og en høyde på 20 cm. En løsning inneholdende 0,675 M triethanolamin, 0,150 M magnesium- sulfat, 0,05 M ATP, 0,05 M M-methionin og 0,01 M KC1 ble ført gjennom kolonnen med en hastighet på 5 ml pr. time ved en temperatur på 25 - 27° C. ;Eluatet fra kolonnen ble analysert med hensyn på SAM-innhold og viste at omdannelsen var 30 %. ;Fremstilling av doble salter av SAM med svovelsyre og p-toluen-sulf onsyre ;103 ml eluat inneholdende 6 g/liter SAM ble surgjort med I^SO^til pH 3, og til denne løsning ble tilsatt under omrøring en løsning av 2,3 g picroloninsyre i 25 ml methyletylketon. Etter henstand over natten ble bunnfallet filtrert fra og vasket med vann. Bunnfallet ble på nytt oppløst i 18 ml 0,1 N løsning av H2S04og p-toluensulfonsyre, og i 18 ml methylethylketon. ;Etter omrøring og henstand separerte det organiske lag, ;og det vandige lag ble behandlet med en liten mengde methylethylketon for å fjerne de siste spor av picrolonsyre. Etter separering av vannlaget, ble avfarvende benkull tilsatt og blandingen ble filtrert. 16,5 ml vandig farveløs løsning ble erholdt, hvilken inneholdt 33,8 g/liter SAM, hvilket tilsvarte 90 % av det SAM som forelå å i den opprinnelige løsning. Ved tynnskiktskromatografisk analyse viste løsningen særlig å inneholde bare SAM. 16,5 ml av løsningen ble heldt over i 100 ml aceton. Etter omrøring og henstand ble væsken fraskilt ved dekantering. Det faste materiale ble oppløst i 6,6 g av en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol. Etter tilsetning av avfarvende benkull og filtrering, ble løsningen heldt over i 25 ml ethylether. Løsningen ble filtrert etter henstand og det krystallinske salt veide 0,967 g og hadde sammensetningen: ;SAM<+>.HS04~.H2S04.CH3<C>gH4S03H. ;Analyse: Beregnet for C22<H>3<4>^16<N>6^4;C 34,46 %, H 4,47 %, N 10,96 %, S 16,72 % ;Funnet : C 33,68 %, H 4,65 %, N 10,8 S 16,5 % ;SAM<+>50,5 %, H20 2,1 %, H2S04 25,3 % p-toluensulfonsyre 21,7 % ;Det ultrafiolette spektrum viste et maksimum ved 260 nm, E^ 1%cm<=><1>79. Ved hjelp av fremgangsmåten men ved å anvende 3,3 g av en 15 %-ig løsning av p-toluensulfonsyre i methanol i det etterfølgende utfellings trinn og anvende. 25 ml ethylether , ble det erholdt.1,18 gav saltet SAM+.H2S04.2CH3CgH4S03H med de samme karakteristika som produktet ifølge eksempel 1. ;I noen år har det fra biokjemisk forskning vært kjent at SAM er den eneste spesifike donator av methylgrupper i levende organismer for de biokjemiske reaksjoner for overføring av CH3-gruppen, hvilke er fundamentale reaksjoner i den lipide, proteide og glucide metabolisme. ;I det etterfølgende er angitt enkelte av de mest viktige SAM-avhengige transmethyleringsreaksjoner: a'l N-transmethylering: adenin, carnitin, carnosin, creatin, 2,6-diaminopyrin, adrenalin, guanin, hordenin, N'-nicotinamid, fosfatidilcolin, ricinin, •■- bl O-transmethylering: N-acetylserotonin, dopamin, epinin, d- adrenalin, 1-adrenalin, ergosterol, 1-noradrenalin, pectin, ublikinon, c) S-transmethylering: 2,3-dimercaptopropanol, H2S, methionin, methylmercaptan, S-mercaptopropionsyre, S-mercaptoethanol, ;thiopyrimidin, thiouracyl, ;dl C-transmethylering: cytosin, thymin. ;Med hensyn til den menneskelige organisme betyr dette at SAM virker i de følgende metabole prosesser: biosyntese av cholin, biosyntese av fosfatidylcolin, aktivitet av enzymer krever SH-grupper, metabolisme av catecholaminer, metabolisme av biogene sentroencefaline aminer, metabolisme av serotonin, metabolisme av histamin, metabolisme av vitamin B12 og folinsyre, metabolisme av creatin, metabolisme av myosin, metabolisme av his-toner, metabolisme av RNA, metabolisme av DNA, metabolisme av protein substanser, metabolisme av enkelte hormoner av cyclopentan-perhydrofenantrenkjerner- den viktigste av disse er østrogener - metabolisme av triglycerider. ;Det har også vært kjent en tid at SAM, når denne dernethy-leres av methyltransferase-enzymer, overføres til S-adenosilhomo-cystein (SAO) som er en indirekte donator av hydrosulfidgrupper og således spiller en viktig rolle i metabolisme av alle forbindelser som krever SH-grupper for å kunne utføre den biologiske aktivitet. Spesielt viktig blandt disse er enkelte thioenzymer og sulfurerte aminosyrer. ;SAO decarboxyleres i sin tur i organismen, og det dekar-boxylerte produkt er den prinsipale donator av aminopropylgruppen, hvilken ifølge den ferskeste biokjemiske lære, er uunnværlig for biosyntesen av polyaminer. Prosessen katalyseres av flere enzymer ;.blandt hvilke en spesifik er aminopropyl-transferase. ;Man kan konkludere med at det er kjent at SAM i den.menneskelige organisme er nært sammenkoblet med alle biokjemiske reaksjoner av: A - transmethylering (spesifik giver av CH^-gruppen) B - transsulfurering (spesifik giver av SH-gruppen) ;C - transaminopropylering (spesifik giver av aminopropylgruppen) ;Denne kunnskap kunne føre til den konklusjon at SAM ville kunne ha en terapeutisk virkning ved behandling av patologiske tilstander forbundet med mangeltilstander i organismen med hensyn til de enkelte av de mange produkter som er angitt ovenfor. ;Imidlertid har den store ustabilitet av SAM og mangel på fremgangsmåte for å gjøre den stabil i tilstrekkelig tid under normale omgivende betingelser, forhindret at dette produkt er blitt farmakologisk eller klinisk testet og således forhindret at det er funnet praktisk anvendelse for dette innen den menneskelige terapi. Bare etter fremstilling av de nye SAM-salter ifølge foreliggende oppfinnelse, salter som i praksis er uendelig stabile ved omgivende temperatur, har vært mulig å utføre en systematisk farmakologisk og klinisk undersøkelse som har ført til gjenoppdagelse av de nye salter har terapeutiske egenskaper som er fullstendig overraskende med hensyn til kvalitet og intensitet. ;Fra den store mengde farmakologiske og kliniske data som er oppsamlet for dette nye produkt, vil det her bare bli gitt enkelte eksempler tilstrekkelig til klart å angi de essentielle karakteristika til det nye produkt og dets hovedanvendelse i den menneskelige terapi. ;I de farmakologiske og kliniske data er det for enkel-hets skyld angitt forkortelsen SAM for saltet SAM<+>.HS04~.H2S04. 2CH3CgH4S03H. ;De administrerte mengder er også alltid av SAM.HS04 .H2S04.2C<H>3<C>g<H>4S03H. Imidlertid gjelder de angitte data også det andre doble salt. ;Toksisitet - Samsaltet ifølge oppfinnelsen har vist seg å være absolutt fri for akutt toksisitet, kronisk toksisitet, lokal into-leranse og bivirkninger. DL501 mus er større enn 6 g/kg/os og 2,5 g/kg/i.p. ;Tester over toleranser og toksisitet ble utført på rotter av Wlstar- og Sprague-Dowley-stammen administrert med 10 - 20 mg/kg . pr. dag i 12 måneder, og etter endt behandling viste de forskjellige organer og systemer ingen patologiske forandringer. ;Teratogenese-tester ble utført på kaniner og rotter: ;selv med administrering av massive doser av SAM, ca. 10 ganger den maksimale terapeutiske dose, ble det ikke observert noen teratogene virkninger eller noen misdannelser i fosteret eller i det ferdige utviklede foster. ;Tilsetning av doser opp til 0,1 - 0,2 mg/ml av produktet i levende kulturer av human lymfocytes eller leverceller fra mus bevirker ingen forandringer i sprengningsindekset (blasticising index) for de cellulære elementer. Intravenøs administrering i doser opp til 40 kg/kg fremkalte ingen pyrogene utslag i kaninene. ;Venøs administrering i kaniner og katter på 4 0 mg/kg bevirket ingen forandring i card trykk, hjerte- og respirasjonsfrekvens eller EKG-kurven. ;Den lokale toleranse ved intramuskulær injeksjon, selv etter administreringer gjentatt over 180 dager, og ved intravenøs injeksjon i randvev av den auriculære pavilion i kaniner, er utmerket. ;I unge friske mennesker av begge kjønn som ble underkastet administrering ved den hurtige intravenøse metode eller ved phleboclysis av doser av SAM 10 - 300 mg/kg (midlere vekt 70 kg), ble det ved samtidig undersøkelse av det minimale og maksimale trykk av puls og respirasjonsfrekvens ved 1, 5, 15, 20, 30, 60 minutter og ved 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 timer fra endt administrering ikke observert noen variasjon fra normale verdier. ;EKG-kurven viste en variasjon i PQ-intervallet, ST-seksjonen, eller ikke nærvær av ekstrasistol eller andre forandringer ved 30sek, 1, 2, 3, 5, 10 og 20 minutter fra administrering. ;I det hemopoetiske system og i lever- og nyrevirksomhet ble det ikke-observert noen variasjoner som var statistisk signifikant fra det normale. ;Farmakologi ;Det skal gjentas at når det i den etterfølgende beskrivel-se tales om administrering av SAM, menes det at følgende er blitt administrert: SAM<+>.HS<0>4~.H2S04.2CH3C6H4S03H og/eller SAM<+.>HS04'.H2S04.CH3C6H4S03H. ;For å bestemme indikativt hvordan SAM fordeles i vevene, ble det fremstilt S-adenosilmethionin (methyl C"^) . Fordelingen av ' dette produkt i rotter ble undersøkt ved administrering av en dose på 10 mg/kg/e.v lik 24 jjci av radioaktivt produkt. Den spesifike aktivitet til produktet var 58 mCi/m mol. Parallelt med dette ble det foretatt en autoradiografisk undersøkelse på mus. Resultatene av disse to forsøk viser at SAM fordeles meget hurtig til alt vev. ;I den etterfølgende tabell er oppført data for hver av de berørte organer: ;Fordeling av SAM i rottevev. ;Verdiene er uttrykt i yg/g. ; ; Det ble følgelig fastslått at de nye salter ifølge foreliggende oppfinnelse avgir CH3~gruppen til alt vev som er utstyrt med methyltransferase-aktivitet. Med andre ord er de nye forbindelser ifølge oppfinnelsen istand til valgfritt å lokalisere seg selv i alle organer utstyrt med methyltransferase-systemer. Dette ble fastslått ved suksessive farmakologiske tester. En serie av tester utført på rotter er vist ved at de nye forbindelser utviser en betydelig beskyttende og legende virkning av leversteatosis ved hyperlipid-hyperproteindiet ifølge Handler, i steatosis ved akutt alkoholintoksicasjon og ved andre toksiske midler (carbontetra-klorid, brombenzen etc.) ved administrering av bare 15 mg/kg/ip, både morfohistokjemisk og analytisk, idet SAM betydelig reduserer akkumulering av lipider ved det hepatocide nivå mens det begunsti-ger gjenoppbygning av normale nivåer av fosfolipider redusert etter intoksikasjon med CC14- ;Hepatisk fosfolipider i rotter etter intoksikasjon med CCI4og behandling med SAM. ; Verdiene er de gjennomsnittlige + E.S. av 10 verdier for ;hver gruppe. Ved undersøkelse av den hepatoprotektive beskyttende aktivitet ble det anvendt en eksperimentell anordning som fremkaller i rottene de såkalte hepatisk cholesteroldegenerering (Ridout and Coll., Biochem. J.52, 99, 1952). I denne metode oppnås ved hjelp av en egnet diet en gjenkallende økning i det totale hepatiske fett og hepatisk cholesterol i dyrene. Forbindelser som virker i den lipide metabolisme reduserer eller opphever denne økning. ;Dyrene ble delt i seks grupper. Den første gruppe ble administrert med en diet som ble variert etter behag. Den annen gruppe ble administrert med Ridout basisdiet (20 g pr. rotte pr. dag), de andre grupper ble administrert med samme diet i samme dose men anriket med cholesterol i en mengde av 0,2 g/rotte/dag. Behandlingen varte i 3 uker. ;Gruppene 4, 5-og 6 ble administrert med SAM i de følgende doser: 1, 2, 5 mg/kg/i.p. pr. dag ;Etter 3 uker ble alle dyrene avlivet, leveren ble fjernet og totalt fett (Best and Coll., Biochem. J.40, 368, 1966) og cholesterol (Sperry and Brand, J. Biol. Chem. 150, 315, 1943) ble bestemt. ;Resultatene viste at de grupper som ble underkastet behandling med SAM i doser på 1 - 2 mg/kg/i.p. ble bare svakt beskyttet, mens gruppen som ble behandlet med 5 mg/kg/i.p. ble fullstendig beskyttet. ;Hepatisk cholesterol og totalt fett etter endt forsøk (gjennomsnittlig pr., gruppe) : ; Andre farmakologiske virkeområder var den anti-inflamma-toriske effekt og analgesiske effekt som ble utvist av SAM. ;Av de forskjellige tester skal nevnes de mest klassiske, nemlig ødem fremkalt av carragenine og av eggehvite som en test for akutt inflammasjon, og granuloma fremkalt fra bomullspellets og arthritis som en test for kronisk inflammasjon. I alle tilfeller var SAM aktiv både når den ble administrert oralt (dose mellom 20 og 100 mg/kg) og parenteralt (doser mellom 10 og 20 mg/kg) i sammenligning med andre kjente farmasøytiske produkter (Ibuprofen - indometacina). De analgesiske tester var varmplatetesten og strekktesten fremkalt-av eddiksyre, og Randal- og Selitto-testen utført på rotter. Det nye produkt viste seg å være aktivt i disse tester i sammenligning med kjente farmasøytiske produkter. ;Et ytterligere farmakologisk virkeområde var den mulige virkning av SAM på søvn-tiden fremkalt av barbiturater. For dette formål ble det utført ét forsøk hvor grupper av mus mottok hexobarbital i en dose på 80 mg/kg/i.p. ifølge metoden beskrevet av Holten og Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346), en gruppe var kontrollgruppen og den andre gruppe mottok SAM i en dose på 10 mg/kg/i.p. ; Som det fremgår av de ovenfor angitte data utviser SAM en aktivitet med hensyn til å forlenge søvn-tiden som fremkalles av hexobarbital. ;Kliniske tester ;Hvor det i det etterfølgende, er angitt administrering av SAM, angir dette administrering av SAM<+.>HS04~.2CH3CgH4S03H og/eller SAM+.HS04".H2S04CH3CgH4S03H. ;Etter de indikasjoner man fikk fra de farmakologiske tester, ble de kliniske tester rettet mot syklige tilstander hvor følgende syntes primært eller sekundært å være forandret: ;1 - metabolisme av lipider ;2 - metabolisme av protider og glucider ;3 - metabolisme av catecholaminer og biogene aminer. ;1. Fra tester utført klinisk på flere hundre pasienter ved ;bruk av doser av SAM varierende over et vidt område, ble det funnet at den nye forbindelse fremkalte et hurtig fall i leverlipidene ved hepatosteatosis av varierende patogenese,, hvilket kunne identifiseres ved biopsi undersøkelse endt behandlingssyklus, selv etter 60 dager fra endt behandling. ;Administrering av produktet bevirket også et markert fall i de høye verdier av total chalesterolemia, av hypertriglyceridemia og en normalisering av forandrede 3/a-lipoproteinforhold i pasienter med hyperdialipidemia i ukompensert tilstand. Denne hypo ;Denne hypocholesterol-nedsettende og hypolipid-nedsettende virkning ble også fastslått selv i doser på 20 - 30 mg administrert 2-3 ganger pr. dag, og er proporsjonal med dosen. ;I ren arteriosclerose med kliniske manifestasjoner av det psyko-påvirkelige område, ved turbemnesis og sekundær centroence-phalics (svekkelse ved arteriosclerotisk encephalopathia) og tegn på cerebral hypoxia, har administrering av SAM intramuskulært eller i alvorligere tilfeller, ved intravenøs injeksjon eller ved sakte phleboclysis, i doser mellom 20 og 40 mg 3 til 4 ganger pr. dag, vist en meget fordelaktig modifisering av symtomatologien. ;Særlig i rene hypoxydotiske tilstander har mange gjenvun-net livsfunksjoner meget hurtig og statistisk signifikant. ;I post-apoplektiske syndromer ble det funnet en hurtigere gjenoppbygning av det kliniske system. ;2. Det ble foretatt en klinisk behandling med flere hundre pasienter som var angrepet av: sekundær hypoprotidemia og disproti-demias, vedvarende eller aggressive hepatopathias, precyrrotisk eller cyrrotiske tilstander, malabsorpsjonsyndromer, protid-splittende syndromer. Administreringen av doser varierende mellom 20 og 200 mg SAM pr. dag intramuskulært eller intravenøst eller ;oralt, alt etter sykdommens tilstand, bevirker en statistisk betydelig (økning i den totale protidemia,. en økning i albuminkvoten og en ;tendens til å normalisere de endrede prosentuelle forhold mellom de elektroforetiske fraksjoner, i serumet. Denne proteinoppbyggende aktivitet har ofte vært fulgt av en meget betydelig forbedring i den subjektive symtomologi og de. generelle objektive tilstander. ;,3. Spesielt overraskende resultater ble oppnådd ved klinisk anvendelse av det nye enzymatiske salt ifølge oppfinnelsen, hvor det forelå svekkede systemer som klart har forbindelse med modifikasjoner i utveksling av biogene aminer, f.eks.: ;a) patologiske systemer med neuropsykiatrisk relevans, ;b) Parkinsons sykdom og Parkinsonisme av varierende eziopathoge-nese, c) Antifologistisk og analgetisk virkning i behandling av osteo-arthritis, og antalgetisk aktivitet i visse neurologiske manifestasjoner, ;d) forstyrrelser av søvn-rytmen. ;Med hensyn til punkt a) har en omfattende kasustri utført ;ved undersøkelse av den kliniske adferd og Hamilton og Wittenberg-tester, klart vist at administrering av doser varierende mellom 20 og 50 mg SAM 3-4 ganger pr. dag i løpet av 5 - 15 dager, uten noen annen form for terapi, fremkaller en betydelig remissjon av de hovedparametere som taes i betraktning ved diagnosen av depressive former. ;Med hensyn til punkt b) vedrørende behandling av Parkinsons sykdom og Parkinsonisme, er det funnet at: Administrering av SAM i doser på 10 - 40 mg pr. dag intramuskulært eller intravenøst, eller oralt, alt avhengig av sykdommens tilstand, sammen med den vanlige terapi medLevodopa, gor opphav til en statistisk mer betydelig forbedring i akinesia og stivhet i.forhold til hva som oppnås hos pasienter behandlet bare med Levodopa. Gunstige modifikasjoner ble også funnet ved Parkinsons tremor, hvilket ikke kan modifiseres med Levodopa alene. ;Administrering av SAM forbedrer betydelig den Levodopa-avhengige psykiske ubalanse, særlig med hensyn til depressive tilstander og psykiske manifestasjoner av irritativ type. ;Administrering av SAM i de ovenfor angitte doser blokkerer betydelig bivirkninger av Levodopa i forskjellige organer og systemer, særlig med hensyn til nausea, vomit, nedsatt appetit, hypo-tensjon, asthenia, cephalea, hypersudorasjon. og insomnia. ;Med hensyn til punkt c) har farmakologiske resultater vist at SAM har en betydelig antiflogistisk og analgesisk aktivitet, og har vist seg å være aktiv i alle osteoarthritiske former behandlet med en dose på 30 mg.to ganger pr. dag intramuskulært eller intravenøst og 30 - 50 mg oralt 4 ganger pr. dag. ;Etter bare 7 dagers behandling ble de muskulære spasmer, ;bevegelsesbegrensning, lokalisert smerte og stivhet influert betydelig for å placebo. Intet tilfelle av gastrisk pyrosis ble observert i de 90 tilfelle som ble behandlet. Undersøkelse over skjult blod i feces viste ingen modifikasjon under behandlingen. ;Sammenlignet med et ikke-steroid antiflogistisk legemiddel som van-ligvis anvendes i en dobbelblind-undersøkelse, utviste SAM en terapeutisk effektivitet lik indomethacin. ;Den analgetiske aktivitet av SAM ble også undersøkt i forskjellige pasienter med forskjellige neurologiske tilstander: neuritis, polyneuritis, anthralgia, sciatica, radiocolitis, torti-collis. ;Den terapeutiske effekt ble oppnådd fra den første dag med administrering av en dose av 15 mg to ganger pr. dag intramuskulært eller 30 - 50 mg 3 - 4 ganger pr. dag oralt. ;Analoge resultater ble erholdt i pasienter med tilbake-vendende og resistent cephalalgia med administreringen av legemid-let oralt i tyggbare tabletter. ;Med hensyn til punkt c), dvs. forstyrrelser av søvn-våken-rytmen, spesielt med hensyn til insomnia, er det nye produkt ifølge oppfinnelsen istand til med en dose på 10 - 30 mg oralt betydelig å forbedre de forandrede søvn-våken-forhold ved å fremkalle fysiolo-gisk søvn uten å måtte anvende bruk av barbiturater eller andre forbindelser med cortical og centroencefali depressiv virkning. ;Som det fremgår fra det ovenfor angitte åpnes det nye og vide perspektiver innen den menneskelige terapi. De anvendelsesområder som allerede er kartlagt er: behandling av hepatopiase, ;hyperdislipidemia, utbredt eller lokal arteriosclerose, psykiatriske manifestasjoner av depressiv og neurologisk type, degenerativ arthropathies, neurologiske smerte-manifestasjoner og forstyrrelser av søvn-våken-rytmen, mens mange andre anvendelsesområder fremdeles må undersøkes og kartlegges. ;De nye SAM-salter administreres fortrinnsvis intramuskulært eller intravenøst, eller i orale eller sublingale tabletter, ;eller i kapsler. ;Den terapeutiske dose av SAM ligger mellom 5 og 3 00 mg pr. dag, avhengig av den spesielle type og sykdommens tilstand. ;Større doser kan anvendes om nødvendig på grunn av at sal-tene ifølge oppfinnelsen er absolutt fri for toksisitet. *

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av doble salter av S-adenosil-L-methionin (SAM) med strukturformel

   hvor n = 1 eller 2karakterisert vedat a) der fremstilles en konsentrert oppløsning av SAM, b) tilstedeværende SAM i oppløsningen utfelles ved surgjøring med en oppløsning av picrolinsyre i vann eller i et organisk oppløsningsmiddel som er oppløselig i vann, c) SAM-picrolonat oppløses i en blanding bestående av like volum-deler av et organisk oppløsningsmiddel som er delvis blandbart med vann, og av en vandig oppløsning bestående av svovelsyre — og p-toluensulfonsyre med like normaliteter på mellom 0,05 og 0.2, d) SAM-saltet utfelles fra det vandige lag ved tilsetning av 4 - 8 volum, i forhold til den vandige oppløsning, av et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av aceton, methylalkohol, ethylalkohol, propylalkohol, e) det utfeldte salt oppløses i en 10 - 20 %'s oppløsning av p-toluensulfonsyre i methanol, f) det doble salt av formelen SAM<+.>HS04".H2S04.2CH3C6H4S03H utfelles med et organisk oppløsningsmiddel når den minimale ' nødvendige mengde methanol anvendes i trinn e), mens det doble salt av formelen SAM<+>.HS04~.H2S04.CH3CgH4S03H utfelles når et stort overskudd av methanol anvendes i trinn e).