SU576922A3 - Способ получени двойных солей -аденозил- -метионина - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способу получени  новых стабильных солей 8-аденозил-и- метионина (SAM),  вл юидахс  основой дл  получени  ценных фармацевтических препаратов с широким спектром действи .

Известен способ получени  различных солей SAM, в частности галоидидов SAM, таких как бромид хлорид, йодид, основанный на том, что готов т раств с достаточно высокой концентрацией SAM, осаждают SAM, например, с помощью фосфорновопьфрамовой кислоты, выделенный осадок раствор ют в подход щем растворителе и подвергают взаимодействию с тетраэтиламмонийгапоидидом, полученную соль SAM выдел ют известными приемами, Однако известные соли SAM (галоидиды, сульфаты ) даже в сухом состо нии представл ют собой крайне нестойкие соединени  при окружающих температурах и тем более при температурах, превышающих окружающие. Кроме того, способы получени  зтих солей весьма трудоемки, пригодны дл  получени  лицп небольших количеств и не могут быть осуществлены в промышленном масштабе; выход целевого продукта достаточно низкий и обычно не превьгпгает 10%„

В шкерат фе отсутстпуют каКне-либо сведени  1 получешш солей SAM, стабильных при нормальньк услови х leivmepaiypbi и влажности. Такие соли ВАМ предстБВл ют значительный интерес дл  бнохи ж11 и фар1 «аколопв1.

Оп.чсыБаюг способ получени  новых двойных солей ЗАМ ч п - толуолсу:аьфокислотой и серной кислотой, обладаюишх высокой стабильностью во време-ш и при тe шepaтypax вплоть до 45°С, .

Способ заключаетс  в том, что а) готов т К05щентркрованньп1 раствор либо путем экстракции из природных веществ, которые содержат АМ, Л11бо путем знэиматкческого синтеза из аденозилтрифосфата (АТФ) к ьетионина; б) SAM, присутствуюшнй в водном растворе, осуждают .нрн помощи насыщенного водного раствора пикролоновой кислоты или растворами зтой кнслоты в органических растворител х, растворимых в воде, таких как л«тнловьш, зтиловый, пропиловый, ч-бутиловьш или иэобутиловый С1шрты, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, зтилацетат, тетрагндрофуран, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксан или диметилформамид; в) пикролонат SAM раствор ют в смеси, состо щей из равных объемз ьк частей водного раствора одинаковых

нормальностей li топуолсульфок tJ ii-nd кислоты и оргаш1ческого расгвор; ггл , 4acTii4,io смешивающегос  с водой, такого ме1клэти жетон , мепишзобутилкетон, н - бутиловый или изобугиловый сшзрт; г) сол1 SAPil осаждают из водного сло  растворителем, полностью растворимым в воде, таким как кетон. йгш спирт; д) соль, выгавшую в осадок, раствор ют в IO-205fc-HOM растворе п - толуолсульфокислоты в метаноле и получего1ьи1 раствор обесцвечршают древесным углем; е) двон1 у1о соль SAM с серной кислотой и п толуолсульфокислотой оса сдают органическим растворителем, таким как алифатический спирт с 1-5 атомами углерода, щ этиловый эфнр.хлорофорлили тетрагидрофуран.

Как уже было указано, стади  а) процесса может быть осуществлен ош наково эффективнс различными слособаь-вд.

Согласно изобретению, один вариант стаддш а) заключаетс  в том, что дрожжи ( Saccharomyces Cereoisial, Torulopsis utilis, Candida ut) j обогащешгые SAM путем прибавлени  метио1шна в соответствующих услови х, обрабатывают ,етатом и затем ,5 н. серной кислотой, предпочтительно 0,35 и., при KOMiiaTHofl темпера1уре, чтобы вь5звать лизис клеток и переход в раствор практтески 100% присутствующего SAM.

Количества воды и эп лацет га находлтс  в интервале 1:20-1:5 от веса влажных юшток и обработку проводит в течею е 15-45 мин, предпочтительно 30 мш.

Затем приб гвл ют сер11ую кислоту и  нзис провод т в Teueiaie 1-2 ч, предпочтит ;пыю 1,5 ч. Следует отметить, что лизис клеток дрожжей, проводилш1Й с использов;1)шем смеси органического растаорител  и разбавленной серной кислот  вл етс  значительно более удобным, чем обычгк проводил лй при помопда хлорной, муравьиной, уксусной киаюты и т. п., так как он не только протекает при окружающей температуре, что  вл етс  весьма благопри тным дл  стабильности SAM, но и ведетс  в таких услови х, что раствор может быть легко отфильтрован от Ю1еточного остатка и не содержит каки-Х-либо примесей, присутствующих обычно при использовагаш других средств дл  проведени  лизиса, которые трудно удалить при получении чистого SAM.

Согласно второму варианту стади  а) получе}ш  SAM осуществл етс  под дейс1вием зшима АТФ-метао1шшденозилтрансс{зеразы на инкубационную смесь, содер:кащую АТФ и метионин. Основным условием дл  промышленного осуществле ш  этого метода  вл етс  то обсто тельство , что энзим должен быть чистым и находитьс  в такой форме, в которой его легко выделить как из начальной И п убационной смеси, так и из полученного SAM.

Очистку энзима осуществл ют хроматографически перкол п.ии раствора, содержащего энзим, например сырого экстракта дрожжей Escherichia coti через колонку с твердым сор

Зчнтом, с которым коьалешпо св зана группа, ведуща  себ , как конкурирушащий ингибитор дл  самого энзима. В качестве сорбента дл  такой очистительной колонны по изобретегг. используют активированный гель по;шсахар. ,..м ., i.. которым ковалентно св зан L - Ш1зин.

Степень сродства энзима к остатку лизина, св занному с твердой матридей, вызывает задержку в элкмровании энзима из колонки и благодар  этому можно достигнуть ра;зделение его и других белков и энзим в весьма чистой форме.

Однако выд,елеш1е энзима из содержащего его элюата дл.ч использовани  его на следующей стадии

энзиматического синтеза нецелесообразно, так Как после такого выделени  стабильность энзима низка, кроме того энзим после однократного его использовани  при синтезе БАМ разруоиетс  при последующ1 х бпераци х выделеьш  SAM. Поэтому дл 

получений наилучщих результатов элюат, содержащий спещ1фический энзим, ввод т в колонку, заполненную твердым сорбентом, нредставл щим собой по:шсахарид, акт1шированньш реагентом, способным св зывать безжи с твердым сорбентом,

таким, как дианистьш бром. Затем в этой колонне, содер ащей спеплфическш энзим на описанном твердом сорбенте, провод т каталитическую реак1ЩЮ между метиоршном и АТФ, ведущую к обра3O3atfifm SAM. Обьгшо через колонку пропускают

раствор АТФ и метионина в соответствующем буферном растеоре, получа  элюат, содержащий SAM. Осажде1ше SAM в кислой среде с номощью водного раствора гикролоновой кислоты шш растворов ее в органических растворител х, проводимое на стадии б), отличаетс  простотой и м гкими услови ми, и, кроме того, позвол ет получатьSAM Высокой чистс-ты, что практически неосуществимо при применении других известнь х агентов осаждени , таких как пикринова  кислота, соль

Рейнеке или борна  кислота.

На стадии в) используют растворь;, содержащие п - толу олсульфо кислоту и серную кислоту 0,05-0,2 н., предпочтительно 0,1 и., с применением органического растворител , хорощо сменшвающегос  с водой, такого как йетилэтилкетон или н-бутаиол. Применение органического растворител  дает возможность употребл ть си.чьно разбавленпь е водные растворы и практгетески служит дл  удалени  всей пикролоновой кислотьь

На стадии г) процесса пре,шючгительно используют 4-8 об. (по отнощению к объему водного раствора) растворител , такого как ацетон, метиловый , этиловый или пропиловый спирт.

Большой интерес представл ет тот факт, что в том случае, если на стадии /i) используют минимальное количество метанола, требующегос  дл  растворител  осадка, образовавшегос  на стадии г), то на следующей стадии е) осаждени  выдел ют двойную соль .SAM HSO4 . fijSOa

2СН2С5Н480зН„Однако н гом случае,есл11 на

дни д) используют ь«тано:т Е ко.шшестве, по мере здвоа пре ыитющем необходимое, то на следующей стадии е) осаждешш выдел ю; даойн 1о сольБАМ HSO7 Н28О4СНзС5Н48ОзН. Использовагше промежуточного колггчества метанола ведут к оразойзнию смеси двух солей.

Конечное осэдсдение, стади  е), образовавшейс  двойной соли SAM требует кримешнл  оргаюческого растворител , такого как метанол, шэтиловый эфир, хлороформ, к - пропанол, и::опрспанол , н-бутанол, изоб)Танол, бгор-буталсвый ширт, изоамиловый спирт и/ш тетрагидроф раи.

Двойные соли SAM могут хранитьс  неопределенно долгое врем  в сухом состо вии и пракшчески не измен ютс .

Предлагаелс.1Й способ отличаетс  простой, не требует сложной и дорогосто щей аппаратуры и таких методов, которые трудно осуществимы в промыишешюм масштабе; процесс осутдесТЕл етс  в кислойсреде и ни ш одной из стадий не требует применени  температур, превышающих окруохающую .

П р и м е о 1. К 90 га- дрожжей, обогащенньж SAM (6,88 г/кг),, нрибазл ют 11 л эгилацет гта к 11л во.ды при окрз- : аюшей температуре. После энергичного переме1Л1иванк  в течение 30 tffiu прибавл ют 50л 0,35 и, ирной кксг.о: -: меш вают euje в Т8чен1-:е ip ч. Иослг iJFiJbiposRH:: и промывки водой, лолучйют 14С р2с;-Кра с-дг:;жащего 4,4С г/л SAiVi, что ;оотиетс72у1; ::: всего SAiVi, присугстеуюдегс в исходном .«териале .

К получе ногиу pacibopy при перемзил кшприбавл ют рзстБОр 2,3 кг miKpoJ CHOEo: :-:;,; чспг в 25 л метлэтилкетона; после выдержк,- в .;екзг ночи осадок отдел ют путем центриф}тк:0;;анк  к промывают водой.

Полученное такиг-. образом ntpiotприбавл ют при nepeMeLuiuiaHHv ,, ifii г с г из 18 л 1,0 и. раствора сернойf itv,

сульфокислоты и 18л глетг - )- гвьщержки органическую фазу по систему рекуперации пикролоновоЕ кислоть, а водлую фазу обрабатывают кебольишм количеством метилэтилепкетона .от  удаленгг  следовых количеств пикролоповон киолоть, прибав.п ют обгсцвеч.иваюигий лревесШ)ТЙ уголь и затем фильтруют .

Этот раствор (16,5л) содержит 33,8 г/л САМ, что соответствует 90% соелипе ж , присутствующего в дрожжах.

Раствор вы; ивают в 100 ;i ацетона при перемешиваг;ии . После вылорлОчИ жидкость декантируют и твердое вещество растпор ют в 3,3 кг 157о-ното раствора н-то.уо;су.-тьфокислотй в ютаполс. После прибавлсит обс-сц:зеч;-:ваюшего древесного упи; смесь фильтруют и прибавл ют к 25 л ди:)ти.чового -лЬира.

При :}том :;;ч)схонит осаждение 1184 г крпстуллическо i;po,io hopN npoBaKHviii в виде крисгалл  co;ii. коюри  легко отфильтровываетс , К; ;ил;л fbho гй)роскопичиай, хорошо растпсрйетс-: j з. : ;..;еъ:1;1г iijvf) с образованием беетвеше о ,Jp„, С:,л1ь акшъ слегка раствор етс  в метг1гп;о ;; .т ..оле. и ж раствор етс  в апетоие. м гмлэгчv., х;:ороформе, выслшх спиртги; и &5нзолс, :;.,одуз;г из ;oдepж}iT каких либо

Пр;й;йГ5Й:

Кайдено,%: С 39,36; Н4,б; S 16,7; N 8,8.

Cjnl-LijNf.O.-oSe {(Молекул рньп вес 938,98)

Вьги леиоД: С 37, Н 4,51; N 8,95; S 17,07.

лШЙдеьо.Д:: г ... ЗС,. 20,5; ri толуолсулъфокислота 36.0; SAM-и,/,

Вычислено.%: H.jSO.j 20,89; п - толуолсульфокислота 36,57; ЗАМ л:,54Вл жкос1ь , спределлюУ а ск по eтoдy К. Фиитерй, -/Гг С/тектр поглощени  в ультрафиолетовой нозото соединени  максимум при 2сч} лмк, - 182.,

Эт15 подч-верждают. что соединение описываетс  фои -плсй

NHr.

Nil

,

-сН; Нз-сн- ;оок:

:T-v .,-.,:/ ггпентифчкш3 : ;:- , осрованным на

:v:: :Глпп ;- Т;:; Ч7-;КО пг;;л ЧШ ИЛИ V ;r-4 i;-ук лпч полюии SAM.

п -; г, 3 г, М: V i-rronarfOBOM 1шслоты рзtтБэ: f; ; 1 ;;io vTi-no io D спнрти и прибав: -: к- гг--и грс с р зчльтате

л . : - 0 ГОГП с КСПОЛЬ-i ; i - ;: гс. :Cr-rD-jij л:агер;:ала и того же

,--7сг- ----r.v-v :-,,- ,,:, -,,-.,, 3 . После j5M r:-:y-i-: п образовавшийс  осадок

ОТДе - :: V С.- : - ;х роВ1ШЯ.

; -г;7 ;5i;- ,n л трпгл обэабатывают 9 д V. н r -Fo н П - толуолсульбоь ..тл ;. 9 ;т ivfemrKjoevTiinKeTOHa. После выдержк, опгсллггескую фазу отдел ют, освобохсдают BojiKyyo фазу от следов гыкролоновой К1;слсты гг, npoNibiBBWiH ее п5етиштзобутилкетоком . Прибавл ют обесгэечивающкй древесный утоль, cf.ecb сЬпльтрЮ и фильтрат вьиливают в 70 л л г о rocie выд.ер) образовавшеес  твердое ветдесгзо отдел.чют декантшшей от растворител , и р;стБОр ют в 15%-ном растворе п толуодсуль;;;пчпсг.с:;- в : геталоле (1,65 кг). Мосле обес11ве-п;з ,ч:-; -ц/ глесмым углем фильтрат прибавл ют к 10 л члопофоркг дл  получени  легко отфильтровьгвающегос  кристаллического осадка SAM в форме дисульгратдаитаратолуолсульфонатв.

Полугенньгй лродут т (П IО г) лает при анализе результаты, идеитк- -;Ы : тем, которые дает lipjAyKT, зписанньш в пример I. П р и м е р 3. Очистка шецифического энзима. 50 мл сефа|)озы (полисахарид, вьшускаемый фирмой Фармади  Фаин Кемикалз АВ-Упсала, Швеци ) спеченного и суспендированного в воде, обрабатьшают бромистым цианом в соответствии с хорошо известными методами св зьтани  веществ, содержащих аминогруппы с матрицами, состо щими из полисахаридного гел . К приготовленному таким способом гелю прибавл ют избыток L пизина . Материал после реакции последовательно промывают дисти:шировакной водой, буферным раствором с рН 8,5 и буферным раствором с рН 4,5. Затем этот гель используетс  дл  набивки колонки, диаметр которой составл ет 1,5 высота 30 см. Через колонку до достижени  полностью равновеского состо ни  пропускают буферный раствор с рН 8,0, 0,05 М по триэтаноламину и 0,01 М по серной кислоте. Затем в колонку внос т 2 мл зкстракта дрожжей, содержащего специфический энзим, полученного обработкой ультразвуком или гемогенизацией с твердой углекислотой и, i возможно после обогащени  специфическим энзимом. Затем колонку элюируют той же буферной смесью, кака  примен лась дл  создани  равновесного состо ни , после чегу распределение белков, присутствующих в элюате, контролируют проведением измерений в ультрафиолетовой области спектра. Одновременно определ ют активность синтетазиса дл  различных фракций по методу Дж. А. Стекола 1. Те фракщш, которые про вл ют одинаковую активность синтетазиса , объедин ют и полученный раствор показьтает удельную активность по меньщей мере в 20 раз больщую, чем у сырого экстракта. Энзим может быть после зтого дополнительно концентрирован в данном растворе путем осаждени  сол ми, органическими растворител ми или в соответствии с другими известными методами концентрировани  растворов белков. Получение SAM 30 мл спеченлой сефарозы, представл ющей собой гель, активируют бромистым цианом или любым другим известным методом св зьюани  белков с матрицами из полисахаридного гел . 4 мл раствора специфического энзима, очищенного, как это было описано выше и содержащего примерно 100 мг белка, внос т в активированный гель. Суспензию активированного гел  и раствора энзима перемещивают при 4° С в течение 18ч. Смолу промывают водой. Эта промывна  жидкость содержит -Примерно 70% общей энзиматической активности, первоначально присутствовавцюй в растворе специфического энзима. Путем инкубировани  сефарозы, приготовленной, как зто описано выше, с применением ранее описа1шого метода, служащего дл  определени  активности етнтетазиса, устанавливают, что 20% общей активности св зано с полисахаридом. Сефароза, приготовленна , как это описано выше, служит дл  набивки колонки, имеющей диаметр 1,5 см и высоту 20см. Через колонку со скоростью 5 мл/ч при 25-27° С пропускают раствор 0,675 М по триэтаноламину, 0,150 М по сульфату магни , 0,05 М по АТФ, 0,05 М по L-метионину , и 0,01 М по хлористому калию). После анализа элюата из колонки на содержание SAM обнаруживают, что степень превращени  составила 30%. SAM с серной и Получение двойных солей паротолуолсульфокислотой. 103 мл элюата, содержащего 6 г/л SAM подкисл ют серной кислотой до достижени  величины рН, равной 3, и к этой жидкости прибавл ют при перемещивании раствор 2,3 г пикролоновой кислоты в 25 мл метилэтилкетона. После выдержки в течение ночи, осадок отфильтровьтают и промывают водой. Осадок снова раствор ют в 18 мл 0,1 и. раствора серной кислоты и п-толуолсульфокислоты ч в 18 мл метилэтилкетона. После перемещивани  и вйдержки, органический слой отдел ют и водный слой обрабатывают небольшим количеством метилэтилкетона дл  удалени  последних следов пикролоновой кислоты. После отделени  водного сло  прибавл ют обесцвечивающий древесный уголь и смесь фильтруют . При этом получают 16,5 мл водного бесцветного раствора, содержащего 33,8 г/л SAM, что эквивалентно 90% SAM, присутствовавшего в исходном растворе. Методом тонкослойной хроматографии устанавливают, что раствор содержит только SAM. 16,5 МП раствора выливают в 100 мл ацетона. После перемещивани  и выдержки жидкость декантируют. Твердое вещество раствор ют в 6,6 г 15%-ного раствора п -толуолсульфокислоты в метаноле. После прибавлени  обесцвечивающего древесного угл  и фильтровани  раствор выливают в 25 мл диэтилового эфира. После выдержки ere фильтруют и получают хорошо сформированные кристаллы соли, вес щие 0,967 г и имеющие сле|дующий состав: HSG; H2S04.CH3C6H4S03H. Найдено,%: С 33,68; Н 4,65; N S 16,5; ,5, HI О 2,1; HZ S04 25,3, и-толуолсульфокислота 21,7. C2jH340i6NeS4 Вычислено,%: С 34,46; Н4,47; N10,96; S 16,72. Спектр поглощени  в ультрафиолетовой области имеет максимум при 260 ммк, Ej см 179. Пр повторении опыта идентичным образом, но с использованием 3,3 г 15%-ного раствора и - толуолсульфокислоты в метаноле, на последующей стадии осаждени  с применением 25 мл диэтилового эфира, получают 1,18 г соли, ВАМ HjSO4 CH3C6H4SO3H, характеристики которой идентич ны характеристикам, установленным дл  продукта из примера 1.

Claims (4)

1. Способ получени  двойных солей S - аденозил - L -Метионина (SAM) - метионина (SAM) с серной кислотой и и - толуол су ль фокислотой, отличающийс  тем, что готов т концентрированный раствор SAM с помощью лизиса клеток дрожжей обработкой этилацетатом и серной кислотой или путем энзиматического синтеза действием специфического энзима АТФ-метионинаденозилтрансферазы высокой степени чистоты на смесь аденозилтрифосфата (АТФ) и метионина, SAM, присутствующий в растворе, осаждают подкислеиием раствором пикролоновой кислоты, полученный пикролонат SAM раствор ют в смеси, состо щей из равных объемных частей водного раствора одинаковых нормальностей и - толуолсульфокислоты и серной кислоты и органического растворител , частично смешивающегос  с водой, соль SAM осаждают из водного сло  растворителем, полностью растворимым в воде, таким каккетонили спирт, использу  4-8 об. органического растворител  по отнощению к объему водного раствора, выделенную соль раствор ют в 10-20%-ном растворе п толуолсульфокислоты в метаноле и образо вавщуюс  двойную соль SAM осаждают подход ц{им органическим растворителем.

10

2.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что энзиматкческий синтез SAM из АТФ и метионина осуществл ют путем пропускани  раствора, содержащего два реагента, через колонку активированного пописахаридного гел , с которым св зан знзим высокой степени щстоты.

3.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что получение двойной соли SAM обработкой метанольным раствором п - толуолсульфокислоты прювод т с использованием минимального количества метанола, требующегос  дл  растворени  соли и 1Три дальнейшей обработке органическим растворителем осаждают двойную соль HSO-H, SO 2CH3C6H4S03H;

4.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что получение двойной соли SAM обработке метанольным раствором и - толуолсульфокислоты провод т с использованием больщого избытка Mttzнола и при дальнейшей обработке органическим растворителем выдел ют двойную соль SAMv «HS04 H2S04 CH3C sH4S03H

Приоритет по пунктам:

27.06.73по пп. 1 и 2

24.05.74по пп. 3 и 4