SU1433416A3 - Способ получени S-аденозилметиониновых (САМ) солей - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  гетероциклических веществ, в частности получени  S-аденозилметиониновых солей минеральных сильных кислот с (количество молей последних 4, или 5, или 6), обладающих защитным и рассасывающим действием при гепатическом стеатозе. Цель - создание нового способа синтеза новых солей указанного класса. Процесс ведут из концентрированного водного раствора технической S-аденозилметиониновой соли, рН которого довод т до 6-7, затем очищают пропусканием через слабокисдоткую ионообменную смолу, злюируют разбавленным раствором (0,1 Н.) сильной минеральной кислоты с последующим титрованием до строго стехиометри- ческого количества к присутствующей S-адекозилметиониновой соли концентрированной неорганической кислоты. В другом случае титрование ведут сильно основной ионообменной смолой в ОН-форме с последующими упариванием злюата до достижени  концентрации целевой соли 50-100 г/л и лиофилмзи- рованием преимущественно в присутствии инертного вещества (лучше маннита или порошкообразной кремниевой кислоты ) . Новые соли обладают лучшей активностью , чем соответствующий дисуль- фат ди-пара-толуолсульфонат S-адено- зилметионина, и нар ду с гепатозащит- ным действием оказывает еще антидеп- рессантную и противоревматоидную ак- тивность. 1 з.п. ф-лы, 8 табл. i 1 &9 С«д

Description

Ы

Изобретение относитс  к способу получени  S-аденозилметиониновых (САМ)

М)

1Д334162

солей общей формулы

Ш12

кЛтгцГл

N

CH-CH-CH-CH-CH2-S-CH2- СН2-СН-СОО пНХ

1Н2

I

он он

Q

где X - кислотный эквивалент сильной минеральной кислоты с рН меньше 2,55. п равно 4, 5 или 6, обладающих защитным и рассасывающим действием при ге- патическом стеатозе.

Цель изобретени  - разработка способа синтеза новых солей S-адено- зштметионина, обладающих большей стабильностью при 45°С по сравнению со структурными аналогами - известными сол ми САМ ПХ, где X - кислотный эквивалент сильной кислоты, а п 1, 2 и 3, а также большей активностью в отношении защиты печени по сравнению с ближайшим структурным аналогом ди- сульфатом-ди-п-толуолсульфонатом S-аденознлметионина.

Пример 1. 110л этилацетата и 110 л воды добавл ют при температуре окружающей среды к 900 кг дрожжей, обогащенных САМ (6,88 г/кг) в соответствии с методом Шлейка.

После энергичного перемешивани  в течение 0,5 ч добавл ют 500 л ) 0,35 н, серной кислоты и продолжают перемешивание в течение 1,5 ч.

Смесь -фильтруют и остаток промывают водой, получа  14QO л раствора, содержащего 4,40 г/л САМ, что соответствует 99,5% от присутствующего в исходном материале.

При перемешивании добавл ют 23 кг пикрслоновой кислоты. Реакционную массу оставл ют на ночь и затем осадок отдел ют центрифугированием и промы- вают .водой.

Осадок при перемешивании раствор ют при окружающей температуре в 62 л 1 н. раствора серной кислоты в метаноле . Затем после отфильтровывани  следов нерастворенного вещества к раствору добавл ют 500 л ацетона, ,

После полной седиментации осадка декантируют всплывший раствор, и неснрастворимьй осадок промывают малым количеством ацетона. Осадок раствор ю в 800 л дистил.пированной воды, добавл ют 2 кг обесцвеченного древесного- угл  и смесь фильтруют.

Готов т колонку с 200 л Амберлита IRC 50 в Н форме и тщательно промывают дистиллированной водой.

К ранее полученному водному раствору добавл ют 4,8 кг лед ной уксусной кислоты при перемешивании и затем добавл ют 2 н. едкий натр вплоть до получени  рН 6,5.

Раствор пропускают через колонку со смолой со скоростью 400 л/ч, которую поддерживают посто нной в течение всего процесса. Затем через Колонку пропускают последовательно 200 л дистиллированной воды, 1600 л 0,1 М уксусной кислоты и затем 200 л дистиллированной воды.

САМ элюируют 400 л 0,1 н. серной кислоты. Таким образом полученный элю ат содержит примерно 4 кг САМ и его концентрируют в вакууме до 60 л.

Добавл ют 0,5 кг древесного угл , и смесь фильтруют. Раствор титруют.

Добавл ют концентрированной серной кислоты до получени  мол рного отношени  серной кислоты к САМ, равного 2,5:1. Раствор затем лиофили- зируют.

Получают 6,5 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 61%; . 37,5%j H,j,0 1,5%.

Соль имеет кристаллический вид и растворима в воде в количестве, большем 20%, дава  при этом бесцветный раствор. Однако соль нерастворима в обычных органических растворител х.

Методом тонкослойной хроматографии установлено, что продукт не содержит каких-либо примесей.

314

В табл. 1 приведены данные анали- за, которые согласуютс  с элементным составом дл  соединени  формулы

C,,,.

Новое соединение также идентифицировано энзиматическим методом, основанным на энзиматическом метилирова- НИИ никотинамида и гуанидинуксусной кислоты с помощью САМ.

При повторении процесса аналогичным образом, но с добавлением перед лио илизацией такого количества сер- ной кислоты, чтобы подн ть мол рное . отношение к САН до 3:1, получают САМ-ЗН БО OjTH O. Данные элементног анализа приведены в табл. 1.

Понижа  мол рное отношение /САМ перед лиофилизацией до 2:1, получают соль CAH- ZHjSO 0,4H,jO. Данны элементного анализа приведены в табл. 1.

Пример 2. Т 1,5 кг пикроло- новой кислоты, растворенной в 100 л изобутанола, добавл ют к 700 л раствора , полученного лизированием дрожжевых клеток, использу  те же исходные материал и способ, что и в приме ре 1.

После выдержки в течение ночи образующийс  осадок отдел ют центрифугированием . Осадок раствор ют при окружающей температуре при перемешивании в 31 л однонормального раствора серной кислоты в этаноле.

После отфильтровывани  малых количеств нерастворенного вещества к расвору добавл ют 250 л серного эфира. Смесь выдерживают, фильтруют, и твердый отфильтрованный остаток промывают малым количеством воды. Твердый остаток сушат в вакууме.

Твердое вещество раствор ют в 400 л воды, добавл ют 1 кг обесцвеченного древесного угл , и смесь фильтруют . Добавл ют лед ную уксусную кислоту, довод  рН до 6,5, и затем раство р пропускают через колонку с Амберлитом IRC 50 аналогично тому, как это осуществл ют в примере 1.

САМ элюируют из колонки 200 л 0,1 н. сол ной кислоты.- Элюат концентрируют в вакууме до 30 л. Добав- л ют 0,25 кг активированного древесного угл  и смесь фильтруют. Раствор титруют и добавл ют концентрирован- ной сол ной кислоты в количестве,

достаточном дл  получени  мол рного отношени  НС1/САМ равным 5:1. Раствор лиофилизируют.

Получают 2,8 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 67,6%; НС1 30,9%; 1,5%.

Соль имеет кристаллический вид, и растворима в воде в количестве большем 20%, дава  при этом бесцветный раствор. Соль слабо растворима в обыч- Hbjx органических растворител х.

Методом тонкослойной хроматографии показано, что соединение не содержит каких-либо примесей. Хроматографию провод т способом, аналогичньм примеру 1.

Данные элементного анализа приведены в табл. 1 и согласуютс  с продуктом формулы

С,у H Ng05S-5HCl.

Новое соединение также идентифи- фицировано энзиматическим методом, описанным в примере 1.

Осуществл   процесс как в примере 1, возможно получить продукт, имеющий различную величину солеобразова- ни , и в частности, следу)ощие соли: САМ 4НС1 0,4Н40; САМ-6НС1 0,.

Аналитические данные дл  солей приведены в табл. 1,

Пример 3, Повторен процесс, описанный в примере 1 с той разницей , что.перед лиофилизацией добавл ют к раствору 4,75 кг апирогенного маннита. Затем, раствор лиофилизируют обычным способом.

Добавление маннита позвол ет получить продукт с остаточным содержанием влаги 0,1%,

Полученный таким образом продукт пригоден дл  превращени  в инъектиру- емую фармацевтическую форму.

Пример 4. Повторена процедура примера 1, Перед лиофилизацией добавл ют 4 кг Аэросил  (пылевидной кремниевой кислоты) . Полученную коллоидальную суспензию лиофилизируют.

Добавление Аэросил  позвол ет получить продукт с остаточным содержа-) нием влаги 0,2%. Этот продукт пригоден дл  превращени  в таблетки дл  персрального применени  ,

Пример 5. Повторена процедура примера 2 с той разницей, что , САМ элюируют 0,1 М раствором фосфор51

ной кислоты, а не о,1 н. раствором сол ной кислоты, как в примере 2,

Лиофилиэации предшествовало добавление концентрированной фосфорной кислоты в количестве, достаточном дл  получени  мол рного отношени  кислоты к САМ, равным 5:1.

Получено 4,26 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 44,4%; Н5Р04 54,6%; 1%.

Данные элементного анализа -приведены в табл. 1 и согласуютс  с соединением , имеющим формулу:

C yHj2NgOgS 5H,P04-0,5H20.

Методом тонкослойной хроматогра- фии, аналогичной описанной в примере 1 , показано, что продукт не содер- жит каких-либо примесей.

Новое соединение также идентифицировано описанным в примере 1 энзима- тическим методом.

Повтор   операции примера 1, мож- но получить соединени , имеющие различные степени солеобразовани , и в частности соли САМ АН РО 0,, САМ 5Н Р04 0, данные элементного анализа дл  которых приведены в табл. 1.

Кислоты, которые используютс  дл  получени  новых солей по предлагаемому изобретению, имеют следующие значени  рН: НС1 - рК меньше 0,5; - рК меньше 0,5 (перва  стади ), рК 1,92 (втора  стади ); Н,Р04 - рК 2,12 (1 стади ).

Испытани  на стабильность проведены на сол х, полученных предлага- емым способом, выдерживанием продукта в термостатируемой печи при 45 С и определением процента остаточной соли в фиксированные моменты временив Дл  сравнени  эксперименты были повто рены с известными САМ-пНС1 сол ми, в которых п 1, 2иЗ, НС. CAM-nH SO, в которых п равно 0,5, 1 и 1,5.

Табл. 2-5 иллюстрируют процент разложени  соли в определенные моменты времени.

В табл. 2 привод тс  данные дл  соли CAM-nHCl.

В табл. 3 привод тс  данные дл  соли CAM-nH SO.

В -табл. 4 привод тс  данные дл  соли САМ 1,5HiS04-nHCl.

В табл. 5 привод тс  данные дл  соли САМ 2НС1-H SO .

166

Остаточный САМ-процент в указанные моменты времени определ ют способом, описанным ниже, и который обеспечивает максимальную точность измерений за счет того, что позвол ет полностью отделить САМ от всех возможных продуктов разложени .

В св зи с этим найдено, что используемый до насто щего времени способ, основанный на применении аналитической колонки ионообменной смолы Доуекс 50, не позвол ет добитьс  полного отделени  САМ от нзкоторьк продуктов разложени , и, в частности, от метилтиоаденозина, что приводит к ошибке в оценке стабильности САМ, котора  была предполагаемой.

Предлагаемьй способ определени  .. САМ основан на использовании жидкостной хроматографии высокого давлени  (ЖХВД). Использованы следующие услови : колонка Партисил 10SCX - 2,5 250 мм, элюирующий растворитель 0,1 М муравьинокисльш аммоний с рН 4, содержащий 20% метанола дл  ЖХВД, поток 1 мл/мин; врем  удерживани  САМ примерно 400 с.

Из данных табл. 2-5 следует, что САМ-соли обладают максимальной стабильностью в том случае, когда они содержат п ть кислотных эквивалентов. Соли с четырьм  и шестью эквивалентами обладают достаточно хорошей стабильностью , в то врем  как более низкое число кислотных эквивалентов не имеет практического значени  в силу значительной нестабильности получаемых солей.

Также очевидно, что стабильность имеет одинаковый характер независимо от примен емой кислоты, при условии, что это есть кислота с рК меньше 2,5.

Нельз  приготовить соли с кислотами , имеющими рК больше 2,5, содержащими 4-6 кислотных эквивалентов.

Аналогичным способом также определена стабильность дл  солей, которые .получают в присутствии лиофили- зирующего агента, указанного в примерах 3 и 4. Результаты приведены в табл. 6 и 7 (дл  солей САМ ЗНС и САМ 2, 5Н2;S04 ) . Отмечаетс  резкое снижение содержани  влаги при проведении лиофилизации в присутствии лио- филизирующего агента и соответствующее повьш1ение стабильности соли, получаемой таким путем.

Испытани  фармакологических свойс солей САМ ЗНС и САМ-2,54,504 показали высокую активность и их токсичность , не завис щую от аниона, св - занного с САМ. Установлено, что активность новых солей существенно зависит от способности САМ иона, выдел емого в организме, действующего как донор метильных групп, как при- родное вещество с большим числом трансметилазовых ферментов, которые катализируют важнейшие реакции белькового , жирового и глюцидного обмена

Важность новых солей обуславлива- етс  тем, что они делают З-аденозил- метионин абсолютно стабильным при температуре вплоть до , тем самым позвол   Yloлнocтью использовать его трансметилирующую активность в человеческом организме без опасности образовани  токсичных продуктов разложени , которые отрицательно вли ют на биологические процессы, активированные САМ.

Токсичность.

Острую токсичность определ ли на мышах. Дл  обеих солей получены значени  TOjo при пероральном приеме . больше 3 г/кг, при внутривенном вве- дении -1,1 г/кг.

Переносимость и хроническую токсичность определ ли на крысах породы Вистар и Спрагью-Доули, дава  им в течение 12 мес. в день по 20 иг/кг продукта. После прекращени  эксперимента не было обнаружено патологических изменений в различных органах и системах.

На кроликах проведены тератогенны эксперименты. Не обнаружено никакого тератогенного действи  или врожденных уродств у эмбрианов или утробного плода конечной стадии при введени солей формулы (I) в дозах, в дес ть раз превьш1ающих максимальные терапевтические дозы.

Внутривенное введение доз вплоть до 200 мг/кг не вызывало у кроликов никакого пирогенного про влени . Внутривенное введение 40 мг/кг у кроликов и крыс не приводило к изменени давлени  в сонной артерии, частоты сокращени  сердца или дыхани , ни к изменени м электрокардиограммы,

Местна  переносимость в случае внутримышечных инъекций, даже после повторени  введени  в течение 30- 60 дн, ив случае внутр ивенных инъекций в маргинальную вену внешнего уха кролика была очень хорошей.

Фармакологические свойства.

Проведенна  на крысах полна  сери  испытаний показала, что новые соли формулы (I) оказывают очень значительное защитное и рассасывающее действие при гепаткческом стеатозе, вызванном гиперлипидной-гиперпротеино- вой диетой по Гандлеру, и стеатозе, вызванном острой алкогольной интоксикацией и другими токсическими веществами даже в том случае, когда вво дитсд доза 10 мг/кг САН.

При экспериментальной гиперлипе- мии у крыс, например, вызванной Тритоном S, новые соли демонстрируют очень значительную гиполипемическую активность, котора  при используемьк дозировках (т.е. 10 мг/кг, выраженных IB САМ) была намного вьш1е, чем в случае других лекарственных препаратов, обладающих гиполипемической активностью .

У цыпл т, у которых вызван атеросклероз с помощью диеты, богатой холестерином и фруктозой, парентеральное введение продуктов формулы (I) в дозах 10 мг/кг уменьшает холестаро- лемию и благопри тно измен ет поражени , которые обнаруживаютс  у контрольных птиц в отношении грудной и брюшной аорт и малых сосудов основани  мозга.

Что касаетс  фосфолипидного обмена , то было экспериментально установлено , что у крыс имеет место увеличение в ткан х печени количества фос- фатидилхолина при некомпенсированном стеатозе. Был определен полный прирост фосфатидилхолина при расходе альфа протеинов крови при экспериментальшВГ нарушени х, вызванных соотношением бета к альфа-липопротеинов.

Все эти эксперименты отчетливо свидетельствуют о лечебном эффекте новых солей формулы (I) при нарушени  жирового обмена.

Дополнительной серией экспериментов на крысах было показано, что введение доз 1 мг/кг вызывает накопление запаса гликогена в крови и мышцах, что демонстрируетс  как гистохимическими методами, так и количественными оп ределени ми. При экспериментальном диабете, вызванном аллоксаном, количество инсулина, которое требуетс  ввести дл  возвращени  к норме вели

чины гликемии, значительно уменьшает е  путем введени  0,5 мг/кг САМ .

Эти серии экспериментов отчетливо иллюстрируют положительное действие йовых соединений формулы (I) на глю- 1(идный обмен,

I Крыс, у которых экспериментально вызвана гиподиспротеинеми , обрабатывали количествами 10 мг/кг САМ Установлено, что указанный продукт озвращает все показатели протеинеми до нормальных значений в основном пу ем увеличени  содержани  альбумина и таким образом иллюстриру  значител иую протеиновую анаболическую активность .

Соединени  формулы (I) про вл ют особенную активность в части защиты 1ечени. Защитна  активность была оп- ; еделена при внутримьшечном введении лри дозе 20 мг/кг соли САМ за 5 мнн до внутрибрюшинной инъекции 710 мг/к , 1цетаминофена мыши.

Полученные результаты приведены в табл. 8.

Результаты показьгаают сущеетвен- 1ое увеличение защиты по сравнению с ; Двойными сол ми дисульфат-ди-п-толу- эл сульфонатов.

I NH2

N

V

К

н сн

сн-CH-CH-CH-CH2-S-CH , СНг-СН-СОО пНХ

II ф I

он онNH.

где X - кислотный эквивалент сильной минеральной кислоты с рН меньше 2,5; п 4, 5 или 6,

отличающийс  тем, что концентрированный водный раствор технической 8-аденозш1метиониновой соли , полученной путем лизиса дрожжевых клеток, обогащенных S-аденозил- метиониновой солью по методу Шленка, очищгаот, после доведени  рН раствора до 6-7 пропусканием через слабо кислотную ионообменную смолу, элюируют разбавленным раствором кислоты НХ, например 0,1 н. раствором кислоты, титруют элюат и довод т количество

Эти и другие аналогичные эксперименты иллюстрируют лечебное действие новых продуктов формулы (I) при нарушени х протеиодного обмена.

Суммиру  сказанное, можно утверждать , что на основе описанных фармакологических экспериментов и многих других данных,которые показывают актив ность новых соединений формулы (1),изученных на всех уровн х организма человека , активность новых продуктов клинически установлена в гепатологии в острой и хронической гепати- ческой интоксикации, в нейрологии в .качестве антидепрессантов и в остеологии в случае ревматоидных артритов.

Новые соли формулы (I) могут вводитьс  перорально или путем внутримышечных инъекций, или путем внутривенных инъекций. Другими приемлемыми формами применени   вл ютс  свечи, жидкости дл  глазных введений, аэрозоли или формы дл  местного употреблени .

Claims (2)

1. Спо соб получени  S-аденозилме- тиониновых (САМ) солей формулы

кислоты до строго стехиометрической. пропорции по отношению к присутствую- щей S-аденозилметиониновой соли прибавлением промышленного концентриро- ванного раствора данной кислоты или титрованием этого раствора сильно основной ионообменной смолой в ОН-фор- ме, упаривают элюат до достижени  концентрации S-аденозилметиониновой соли формулы I 50-100 г/л и лиофили- зируют его.

2. Способ поп, 1, отличающийс  тем, что лиофилизацию провод т в присутствии инертного вещества , предпочтительно маннита или порошкообразной кремневой кислоты.

in

СП

т

03

13

.11

21,5

32

1433416.

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

14

3

14

1720

4,55

1720

15

Без лиофилнзирующего агента

С маннитом (ЮОгСАМ + 120 г маннита)

С Аэросилем

(100 г САМ% 120 гАэросил )

Табл

Процесс лиофилизации

Без лиофилизирующего агента

,4-.С маннитом (100 г САМ + + 120 г маннита)

С Аэросилем (100 г

+ 100 г Аэросил ) 0,2

Таблица 5

16

Разложение при 45°С спуст  360 дней.

1.5

,4-. +

0,1

17

1433416 Таблица 8

Соль дл  защиты

САМ-Дисульфат ди-п-толуол сульфЬнат (структурный

аналог)

Контрольна  группа

18

Смертность животных , %