CZ292247B6

CZ292247B6 - Frakce kopolymeru-1, kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy obsahující tuto frakci a způsob výroby této frakce

Info

Publication number: CZ292247B6
Application number: CZ19963410A
Authority: CZ
Inventors: Eliezer Konfino; Michael Sela; Dvora Teitelbaum; Ruth Arnon
Original assignee: Yeda Research And Development Co., Ltd.
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-23
Publication date: 2003-08-13
Also published as: CN1626238A; HU223473B1; GEP20002205B; PT762888E; NO964976D0; EE03423B1; CZ341096A3; US6620847B2; CA2191088A1; US7199098B2; LU90987I2; CN1174753C; US6362161B1; US5800808A; FI964600A0; US20050171286A1; BR9507758A; HUT75672A; JP2003105000A; CN1152874A

Abstract

eÜen se t²k frakce kopolymeru-1, kter² zahrnuje m n ne 5 % druh kopolymeru-1 maj c ch molekulovou hmotnost vyÜÜ ne p°ibli n 40 kilodalton , a v ce ne 75 % mol rn frakce m rozsah mol rn ch hmotnost p°ibli n od 2 kilodalton do 20 kilodalton . eÜen se rovn t²k kompozice pro l bu roztrouÜen skler zy obsahuj c tuto frakci a zp sobu v²roby t to frakce.\

Description

Frakce kopolymeru-l, kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy obsahující tuto frakci a způsob výroby této frakce

Oblast techniky

Vynález se týká frakce kopolymeru-l, kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy obsahující tuto frakci a způsobu výroby této frakce.

Dosavadní stav techniky

Kopolymer-1 je syntetickým polypeptidovým analogem myelinového bazického proteinu (MBT), který je přirozenou složkou myelinové pochvy. Byl navržen jako potenciální terapeutické činidlo pro roztroušenou sklerózu (Eur. J. Immunol. [1971] 1:242; a J. Neurol. Sci. [1977] 31:433). Zájem o kopolymer-1 jako o imunoterapeutické činidlo pro kmeny roztroušené sklerózy se prvně objevil v 50. letech 20. století, kdy myelinové složky, jakými byly MBP, zabraňovaly nebo zastavily experimentální autoimunitní encefalimyalitidu (EAE). EAE je nemoc podobná roztroušené skleróze, která může být přenesena na zvířata náchylná k této chorobě.

Kopolymer-1 vyvinul tým tvořený Dr. Selaem, Dr. Amonem a jejich spolupracovníky ve Weizmannově Institutu (Rehovot, Izrael). Ukázalo se, že potlačuje EAE (Eur. J. Immunol. [1971] 1:242; patent US 3 849 550). V nedávné době se ukázalo, že kopolymer-1 se jeví jako úspěšný i u pacientů se stálou recidivou roztroušené sklerózy (N. Engl. J. Med. [1987] 317:408). Pacienti ošetřovaní denně injekcemi kopolymeru-l měli méně exacerbací, a co se týče jejich stavu, došlo u nich k menšímu nárůstu nezpůsobilosti než u kontrolních pacientů.

Kopolymer-1 je směsí polypeptidů tvořených alaninem, kyselinou glutamovou, lysinem a tyrosinem vmolámím poměru přibližně 6:2:5:1. Kopolymer-1 se získává chemickou polymeraci čtyř aminokyselin představujících produkty s průměrnými molekulárními hmotnostmi 23 000 daltonů (patent US 3 849 550).

Podstata vynálezu

Vynález se týká frakce kopolymeru-l, který zahrnuje méně než 5 % druhů kopolymeru-l majících molekulovou hmotnost vyšší než přibližně 40 kilodaltonů a více než 75 % molámí frakce má rozsah molámích hmotností přibližně od 2 kilodaltonů do 20 kilodaltonů.

Vynález se výhodně týká frakce kopolymeru-l, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost 4 kilodaltony až 8 kilodaltonů a ještě výhodněji 6,25 kilodaltonů až 8,4 kilodaltonů.

Vynález se dále týká kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy, která obsahuje farmaceuticky účinné množství frakce kopolymeru-l podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Kromě toho se vynález týká výroby kopolymeru-l majícího více než 75 % své molámí frakce v rozmezí molámích hmotností přibližně od 2 kilodaltonů do 20 kilodaltonů, který zahrnuje reakci chráněného kopolymeru-l s kyselinou bromovodíkovou za vzniku trifluoracetylu kopolymeru-l, uvedení získaného trifluoracetylu kopolymeru-l do reakce s vodným roztokem piperidinu za vzniku kopolymeru-l a purifikaci získaného kopolymeru-l za vzniku kopolymeru-l majícího více než 75 % své molámí frakce v rozmezí molámích hmotností od 2 kilodaltonů do 20 kilodaltonů.

-1 CZ 292247 B6 u

i

Vynález se konečně týká použití frakce kopolymeru-1 podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčbu roztroušené sklerózy.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje distribuci molekulárních hmotností tří dávek kopolymeru-1, ukazující zastoupení druhů s molekulovou hmotností vyšší než 40 kilodaltonů;

obr. 2 znázorňuje podobné údaje týkající se molámí frakce.

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká kompozice kopolymeru-1 v podstatě prostého druhů kopolymeru-1 majících molekulovou hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů (kDa). Výhodně tato kompozice obsahuje méně než 5 % druhů kopolymeru-1 majících molekulovou hmotnost 15 40 kilodaltonů a vyšší. Výhodněji kompozice obsahuje méně než 2,5 % druhů kopolymeru-1 majících molekulovou hmotnost 40 kilodaltonů nebo vyšší.

Vynález se dále týká kopolymeru-1 u kterého 75 % jeho molámí frakce má molekulární hmotnost přibližné v rozmezí od 2 kilodaltonů do 20 kilodaltonů.

Kromě toho se vynález týká kopolymeru-1 majícího průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 4 až 8,6 kilodaltonů Zejména se týká kopolymeru-1 majícího průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 4 až 8 kilodaltonů a kopolymeru-1 majícího průměrnou molekulovou hmotnost přibližně 6,25 až 8,4 kilodaltonů.

Kopolymer-1 podle vynálezu lze připravit vdaném oboru známými způsoby, například způsobem popsaným v patentu US 3 849 550, podle kterého se N-karboxyanhydridy tyrosinu, alaninu gama-benzylglutamátu a E-N-trifluoroacetyllysinu polymerují při pokojové teplotě vbezvodém dioxanu s diethylaminem jako iniciátorem. Bromovodík v ledové kyselině způsobí 30 odblokování gama-karboxylové skupiny kyseliny glutamové a po tomto odbourání následuje odstranění trifluoroacetylových skupin z lysinových zbytků 1M piperidinem. Pro účely přihlášky se pod výrazy „okolní teplota“ a „pokojová teplota“ rozumí teplota přibližně v rozmezí od 20 do 26 °C.

Kopolymer-1 s požadovaným profilem molekulových hmotností lze dosáhnout o sobě známými způsoby, mezi něž patří například chromatografie kopolymeru-1 obsahujícího druhy s vysokou molekulovou hmotností a shromáždění frakcí bez nežádoucích druhů, nebo parciální kyselinová nebo enzymatická hydrolýza pro odstranění druhů s vysokou molekulární hmotností a následné čištění pomocí dialýzy nebo ultrafiltrace. Další metodou pro získání kopolymeru-1 s požadova40 ným profilem molekulárních hmotností je příprava požadovaných druhů za současné ochrany aminokyselin a následného získáni správných druhů přímo po odstranění ochrany. Kompozice podle vynálezu lze formulovat konvenčními v daném oboru známými způsoby. Výhodně se uvedená kompozice lyofilizuje a formuje do vodného roztoku vhodného pro podkožní injektování.

Alternativně lze kopolymer-1 formulovat v libovolné v daném oboru známé formě pro přípravu orálních, nazálních, bukálních, nebo rektálních formulí peptidových léčiv.

Kopolymer-1 se zpravidla podává pacientům trpícím roztroušenou sklerózou denně v 20 mg dávce.

Vynález bude dále podrobněji objasněn pomocí následujících příkladů, které však mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, jenž je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

-2CZ 292247 B6 i

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Chromatografický způsob přípravy nízkotoxického kopolymeru-1

Dvě dávky kopolymeru-1 se připravily v daném oboru známým způsobem, například, způsobem popsaným v patentu US 3 849 550.

Jedna dávka se podrobila výše popsané chromatografícké separaci.

Kolona pro gelovou filtraci, Fractogel TSK HW55 (600 x 26 mm) se připravila podle instrukcí výrobce v kazetě Superformance 26 Měrek. Kolona se uvedla pomocí vody do rovnovážného stavu a s cílem stanovit celkový objem se do takto připravené kolony vstříknul acetonový roztok. Kolona se vyvážila pufrem na bázi octanu amonného pH 5,0. Kolona se naplnila 30ml kopolymerovými vzorky (20mg/ml, v 0,2M octanu amonném pH 5,0) a každých 10 minut se odebraly frakce. Frakce mající průměrnou molekulovou hmotnost 7 až 8 kilodaltonů se izolovala mezi 120. a 130. minutou (dávka A).

Analýza molekulové hmotnosti

Stanovila se UV absorbance při 275 nm ve spektrofotometru UVIKON 810. Vzorky se naředily tak, aby se získala UV absorbance nižší než 1 absorpční jednotka. Molekulová distribuce 2 dávek se určila na kalibrované gelové filtrační koloně (Superose 12).

Zjistilo se, že dávka A kopolymeru-1 má průměrnou molekulovou hmotnost 7 až 8 kilodaltonů 2,5 % této dávky mělo molekulovou hmotnost vyšší než 32 kilodaltonů, přičemž uvedená dávka neobsahovala žádné druhy kopolymeru-1, které by měly molekulární hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů.

Druhá dávka kopolymeru-1, která nebyla podrobena chromatografií měla průměrnou molekulovou hmotnost 12 kilodaltonů. 2,5 % této dávky mělo molekulovou hmotnost vyšší než 42 kilodaltonů a 5 % všech druhů kopolymeru-1 v této dávce mělo molekulovou hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů.

Příklad 2

Analýza toxicity

A: In Vivo

Tři dávky kopolymerem-1 mající průměrnou molekulovou hmotnost 7,3 a 8,4 kilodaltonů (méně než 2,5 % druhů kopolymeru-1 mělo molekulovou hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů) a 22 kilodaltonů (méně než 5 % druhů kopolymeru-1 mělo molekulovou hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů byly podrobeny níže popsanému testu toxicity. V každém případě bylo použito v každé experimentální skupině 5 myší.

Způsob

Kopolymer-1 se rozpustil v destilované vodě, čímž se získal roztok 2mg/ml účinné složky. Každé myši se vstříklo 0,5 ml testovaného roztoku do laterální ocasní žíly. U myši se sledovala úmrtnost a relevantní klinické symptomy v průběhu 48 hodin. Pozorování se zaznamenala v 10. minutě, 24. hodině a 48. hodině po vstříknutí testovaného roztoku. Pokud po uplynutí 48 hodin byla všechna pokusná zvířata naživu a nebyly u nich pozorovány žádné nežádoucí

-3CZ 292247 B6 příznaky, potom byla dávka označena za „netoxickou“. Avšak pokud jedna nebo několik myší uhynulo, nebo vykazovalo nežádoucí příznaky, potom byla dávka označena za „toxickou“.

Dávky s průměrnou molekulovou hmotností 7,3 a 8,4 kilodaltonů byly označeny za netoxické, přičemž u dávky s průměrnou molekulovou hmotností 22 kilodaltonů z 5 myší na konci 48 hodinového pozorování uhynuly a v důsledku tohoto pozorování byla tato dávka označena za toxickou.

B: In Vitro

RBL - Degranulační test

1. Úvod

Uvolnění histaminu (nebo serotoninu) z bazofílu je in vitro modelem pro bezprostřední přecitlivělost. Byla vyvinuta krysí bazofílní leukemiová buněčná linie (RBL-2H₃), která byla charakterizována jako vysoce citlivá, uniformní, snadno udržitelná v kultuře a reprodukce schopném systému (E. L. Basumian, C. Isersky, M.G. Petřino a R. P. Siragenian. Eur. J. Immunol. 11,317 (1981)). Fyziologický stimul pro uvolnění histaminu zahrnuje navázání antigenu na membránovou vazbu IgE molekul, což vede k zesíťování těchto molekul a následnému vyvolání komplikované biochemické kaskády. Kromě těchto fyziologických imunoglobulinem zprostředkovaných spuštění, lze degranulaci indukovat různými IgE nestimulovanými podněty. Mezi ně patří různé peptidy a syntetické polymery, například polylysin (R.P. Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432 (1983)). RBL degranulační test se proto používá k odfiltrování těch dávek kopolymeru-1, které vyvolávají větší degranulaci a mohou tak vyvolat nežádoucí místní nebo celkové vedlejší účinky.

Π. Princip testovací metody

Krysí bazofílní leukemické buňky (RBL-2H₃) se zatížily [³H]-serotoninem a následně inkubovaly 100 mikrogramy kopolymeru-1, který měl být testován. Dávky kopolymeru-1, který vyvolá nespecifickou degradaci, uvolní [³H]-serotonin do média. Radioaktivita v médiu se vypočte scintilačním čítačem a veškerý serotonin značený radioaktivním izotopem zabudovaný do buněk se určí v peletovaných buňkách. Procentní degranulace se vypočte jako procento uvolněného serotoninu z celkového množství zabudovaného serotoninu.

ΙΠ. Výsledky

U čtyř dávek kopolymeru-1 s průměrnou molekulovou hmotností mezi 6250 a 14 500 se analyzovala obě procentní zastoupení druhů s molekulovou hmotností přesahujících 40 kilodaltonů a degradace RBL's. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Průměrná mol. hm. (dalton)	% druhů s mol. hm. vyšší než 40 kilodaltonů	% uvolněného serotoninu
6250	<2,5	12,4
7300	<2,5	21,0
13000	>5	66,9
14500	>5	67,8

Jak je patrné výše uvedených výsledků, pokud je % druhů s vysokou molekulovou hmotností nižší (<2,5), potom je % uvolněného serotoninu, které indikuje toxicitu, nižší a naopak.

-4CZ 292247 B6

Příklad 3

Příprava trifluoroacetyl-kopolymeru-1

Chráněný kopolymer-1 se připraví způsobem popsaným Teitelbaumem a kol. v Eur. J. Immun. svazek 1 str. 242 (1971) z N-karboxyanhydridu tyrosinu (18 g), alaninu (50 g), gama-benzylglutamátu (35 g) a trifluoroacetyllysinu (83 g) rozpuštěných v 3,5 litrech dioxanu.

Polymerační proces je iniciován přidáním 0,01 až 0,02 % diethylaminu. Reakční směs se míchala při pokojové teplotě po dobu 24 hodin a následně přilila do 10 litrů vody. Produkt (chráněný kopolymer-1) se přefiltroval, promyl vodou a vysušil. Odstranění gama-benzylových blokačních skupin z glutamátového zbytku se provedlo tak, že se chráněný kopolymer-1 ošetřoval 33% kyselinou bromovodíkovou v bezvodé octové kyselině při pokojové teplotě podobu 6 až 12 hodin za stálého míchání. Získaný produkt se vlil do přebytku vody, přefiltroval, promyl a vysušil, čímž se získal trifluoroacetyl-kopolymer-1.

Příklad 4

Příprava trifluoroacetyl-kopolymeru-1

Polymerační proces je iniciován přidáním 0,01 až 0,02 % diethylaminu. Reakční směs se míchala při pokojové teplotě po dobu 24 hodin a následně přilila do 10 litrů vody. Produkt (chráněný kopolymer-1) se přefiltroval, promyl vodou a vysušil.

Chráněný kopolymer-1 se ošetřil 33% HBr v bezvodé kyselině octové, čímž se odstraní omegabenzylová ochranná skupina z 5-karboxylátu glutamátového zbytku a rozštěpí polymer na menší polypeptidy. Čas potřebný pro získání kopolymeru-1 s molekulovou hmotností 7000 ± 2000 kilodaltonů závisí na reakční teplotě a velikosti chráněného kopolymeru-1. Při teplotách v rozmezí od 20 do 28 °C probíhala testovací reakce na jednotlivých dávkách různě dlouho, například v rozpětí 10 až 50 hodin. Výsledky týkající se molekulových hmotností těchto reakcí prováděných v malém měřítku se vypočetly a na základě těchto měření se vynesla křivka vývoje molekulové hmotnosti v závislosti na čase. Z takto vynesené křivky se vypočetl čas potřebný pro získání molekulové hmotnosti 7000 + 2000 kilodaltonů a reakce se provedla ve větším měřítku. Průměrné reakce probíhala při teplotě 26 °C 17 hodin. Produkt se vlil do přebytku vody, přefiltroval, promyl a vysušil, čímž se získal trifluoroacetylkopolymer-1.

Příprava nízkotoxického kopolymeru-1 g trifluoroacetyl-kopolymeru-1 se dispergovalo v 1 litru vody, do které se přidalo 100 g piperidinu. Tato směs se míchala při pokojové teplotě po dobu 24 hodin a přefiltrovala. Roztok surového kopolymeru-1 se distribuoval do dialyzačních vaků a dialyzoval při teplotě 10 až 20 °C proti vodě až do dosažení pH hodnoty rovné 8. Následovalo dialyzování proti přibližné 0,3% kyselině octové a opět proti vodě do dosažení pH 5,5 až 6,0. Tento roztok se následně zahustil a lyofilizoval do sucha.

Claims

í

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Frakce kopolymeru-1, který zahrnuje méně než 5 % druhů kopolymeru-1 majících 5 molekulovou hmotnost vyšší než 40 kilodaltonů a více než 75 % molární frakce má rozsah molámích hmotností 2 až 20 kilodaltonů.
2. Frakce kopolymeru-1 podle nároku 1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost 4 kilodaltony až 8 kilodaltonů.
3. Frakce kopolymeru-1 podle nároku 1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost 6,25 kilodaltonů až 8,4 kilodaltonů.
4. Kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy, vyznačená tím, že obsahuje 15 farmaceuticky účinné množství frakce kopolymeru-1 podle některého z předcházejících nároků.
5. Kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy podle nároku 4, vyznačená tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství frakce kopolymeru-1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost 4 kilodaltony až 8 kilodaltonů, a farmaceuticky přijatelný

20 nosič.
6. Kompozice pro léčbu roztroušené sklerózy podle nároku 4, vyznačená tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství frakce kopolymeru-1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost 6,25 kilodaltonů až 8,4 kilodaltonů a farmaceuticky přijatelný

25 nosič.
7. Způsob výroby kopolymeru-1 majícího více než 75 % své molární frakce v rozmezí molámích hmotností 2kilodaltonů až 20kilodaltonů, vyznačený tím, že zahrnuje reakci chráněného kopolymeru-1 s kyselinou bromovodíkovou za vzniku trifluoracetylu

30 kopolymeru-1, uvedení získaného trifluoracetylu kopolymeru-1 do reakce s vodným roztokem piperidinu za vzniku kopolymeru-1 a čištění získaného kopolymeru-1 za vzniku kopolymeru-1 majícího více než 75 % své molární frakce v rozmezí molámích hmotností 2 kilodaltony až 20 kilodaltonů.

35
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že se chráněný kopolymer-1 uvede do reakce s kyselinou bromovodíkovou na dobu 10 h až 50 h při teplotě 20 °C až 28 °C.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se chráněný kopolymer-1 uvede do reakce s kyselinou bromovodíkovou na dobu 17 h při teplotě 26 °C.
10. Způsob podle nároku 7, vyznačený tím, že čistý kopolymer-1 má molekulovou hmotnost 5 kilodaltonů až 9 kilodaltonů.
11. Použiti frakce kopolymeru-1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost

45 4 kilodaltony až 8 kilodaltonů pro výrobu léčiva pro léčení roztroušené sklerózy.
12. Použiti frakce kopolymeru-1, ve které má kopolymer-1 průměrnou molekulovou hmotnost

6,25 kilodaltonů až 8,4 kilodaltonů pro výrobu léčiva pro léčení roztroušené sklerózy.

2 výkresy

-6CZ 292247 B6

Průměrná molekulová hmotnost (tóiodaiton)