CN101039691B - 用于治疗神经疾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于治疗神经疾病的组合物，所述神经疾病包括与有害的蛋白质聚集，异常的蛋白质折叠有关的疾病，诸如脑的生成淀粉的疾病，和/或神经变性自身免疫疾病。还描述了使用所述组合物的方法。具体而言，意欲使用蛋白体和/或醋酸格拉替美来治疗神经变性疾病如阿尔茨海默病和神经变性自身免疫疾病如多发性硬化的方法，其中所述醋酸格拉替美是以亚微米乳剂或纳米乳剂的形式存在。

Description

用于治疗神经疾病的组合物和方法

关于在联邦政府赞助研究和发展下进行本发明的权利的声明

本发明在国家健康和人类服务部门(Department of Health and HumanServices)提供的基金下，由政府支持进行。政府对本发明享有确定的权利。

对相关申请的交叉参考

本申请要求提交于2004年6月25日的美国临时专利申请60/582,999的优先权的权益，将其全部内容原样特此并入本文作为参考。

发明领域

描述了用于治疗神经疾病的组合物，所述神经疾病包括与有害的蛋白质聚集，异常的蛋白质折迭有关的神经变性疾病和/或神经变性自身免疫疾病诸如脑生成淀粉病(brain amylogenic disease)。还描述了使用所述组合物的方法。

发明背景

神经疾病的特征通常在于中枢神经系统的一个或多个区域的神经元的损失。神经疾病的实例包括阿尔茨海默病、神经纤维瘤病、亨廷顿舞蹈病、抑郁症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、多发性硬化、中风、帕金森病、和多梗死性痴呆。它们在起源和进展上都是复杂的并且已被证实是一些最难于治疗的疾病类型。事实上，对于一些神经疾病而言，没有获得提供显着治疗益处的药物。在提供治疗中的难度是这些疾病对它们的受害者所具有的更加悲惨的破坏性影响。

阿尔茨海默病(AD)是神经变性脑部疾病，其临床上的特征在于进行性的记忆、认知、推理、判断和情绪稳定性的损失，其逐渐导致深刻的智力衰退和最终的死亡。AD是成年人中进行性精神病症(痴呆)的最常见原因，并且被认为代表在美国的第四最常见医学死亡原因。已经在世界上所有的人种和种族中观察到AD，并且其代表着主要的目前和未来的公众健康问题。目前估计所述疾病只在美国就影响约四百万个体。目前AD是不可治愈的。已经将某些疗法的施用用于治疗人中的AD的症状。然而，目前尚不知道在人中有效预防AD或逆转其症状或进程的治疗方法。

具有AD的个体的脑部显示被称为老年斑的特征性的病变，和神经原纤维缠结。AD的老年斑特征最频繁地细胞外定位，而神经原纤维缠结最频繁地细胞内定位。大量这些病变通常见于患有AD的患者中，在其人脑的对于记忆和认识功能是重要的一些区域中。在更局限解剖学分布中的更少数量的这些病变有时会在没有患有临床上的AD的老年人的脑中发现。AD的老年斑的主要化学组分和血管淀粉状蛋白沉积(淀粉样血管病)特征是被称为淀粉样-β肽(Aβ)的蛋白质，其也可以被称为βAP、AβP或β/A4。包含Aβ的细胞外斑块可以是密集的或分散的。密集的斑块通常被称为原纤维斑。Aβ首先被纯化，部分氨基酸序列报道于Glenner和Wong(1984)，Biochem.Biophys.Res.Commun.120：885-890中。对于前面28个氨基酸的分离方法和序列数据描述于美国专利号4,666,829中。具有超过40个数目的氨基酸的Aβ的形式首先由Kang et al.(1987)Nature 325：733-736报道。

在神经病理学上，AD在不同程度上被表征为四个主要的病变：a)神经元内，神经原纤维缠结(NFT)的细胞质沉积，b)被称为神经炎性斑块的实质淀粉状蛋白沉积，c)脑血管Aβ淀粉样变性病(例如淀粉样血管病)，和d)突触和神经元损失。AD的关键事件之一是作为不可溶的纤维块的淀粉状蛋白(例如Aβ肽)的沉积(淀粉样变性病发生)，其导致围绕脑血管壁的细胞外神经炎症斑块和沉积。神经炎症斑块和脑淀粉样血管病的主要成分是Aβ，尽管这些沉积还可以包含其它蛋白质诸如糖胺聚糖和载脂蛋白。

Solomon，B.et al.(1997)PNAS 94(8)：4109-12显示针对Aβ的N端的单克隆抗体可以结合于Aβ肽的预先存在的装配方式并使其解聚，和/或在体外预防原纤维聚集和预防对于神经元细胞培养物的毒性。Schenk，D.etal.，Nature 400(6740)：173-177(1999)证实用淀粉状蛋白-β的免疫在PDAPP转基因小鼠中减弱了阿尔茨海默病样病理，所述PDAPP转基因小鼠充当淀粉状蛋白-β沉积和阿尔茨海默病样神经病理学的动物模型。他们报道在阿尔茨海默病样类型的神经病理学发作前免疫幼小的动物有效地预防了β淀粉状蛋白斑块形成、神经炎性营养不良和astrogliosis的发展，而观察到在阿尔茨海默病类型的神经病理学发作后在老年动物中的治疗减少了这些神经病理学的程度和进展。这种效果由抗体介导，因为外周施用针对Aβ的抗体已经显示减少了脑实质淀粉状蛋白的负担(Bard F.et al.，(2000)Nat.Med.6(8)：916-9)。此外，用新鲜溶解的Aβ1-40进行鼻内免疫减少了脑淀粉状蛋白的负担(Weiner，H.L.et al.，(2000)Ann.Neuro.48(4)：567-79)。由Morgan，D.et al.，(2000)Nature 408(6815)：982-5；和Janus，C.et al.，(2000)Nature 408(6815)：979-82使用动物模型系统进行的研究证实了疫苗诱导的在脑淀粉状蛋白沉积中的减少导致了认知性改善。另外的研究已经解决了相同课题的各个方面，包括Dodart et al.，(2002)Nat.Neuroscience5(5)：452-7，和Kotilinek，L.A.et al.，(2002)J.Neuroscience 22(15)：6331-5。尽管Aβ疫苗已经在使用AD动物模型的各种研究中显示了一些成功，用被配制在佐剂(QS21)中的Aβ1-40/42肽免疫的人临床研究被终止，因为有害和/或不可接受的高发生的副作用诸如脑膜脑炎。因此，存在对于这样的治疗上可接受的治疗方法的需要，所述治疗方法用于治疗和/或预防AD和与蛋白质聚集相关的相关神经变性疾病。

自身免疫疾病的特征在于针对自身或自体组织的异常免疫应答。基于涉及的免疫应答(或免疫反应)的类型，哺乳动物中的自身免疫疾病通常可以分成两种不同类型之一：细胞介导的(即，T细胞介导的)或抗体介导的疾病。多发性硬化(MS)是T细胞介导的自身免疫疾病(Trapp et al.New Eng.J.Med.338(5)：278(1998))。世界上有超过1,000,000的介于30岁和40岁之间的年轻人具有MS。MS是年轻人中最常见的中枢神经系统疾病并且是神经失能的最常见原因。在病理生理学上，循环的自身反应性T细胞介导在MS患者中观察到的许多中枢神经系统的损坏(Rudick et al.New Eng.J.Med.337：1604(1997))。

在MS中，T细胞与髓磷脂碱性蛋白(MBP)反应，所述髓磷脂碱性蛋白是中枢神经系统中髓磷脂的成分。特异于MBP的激活的T细胞可以分离自MS患者的证明支持了这样的见解，所述见解是MS是自身免疫疾病，其中T细胞破坏了自身或自体神经组织(Allegretta et al.Science：247：778(1990))。

目前，用某些抗炎和免疫抑制药剂来治疗MS，这些药剂包括：(i)皮质类固醇，其具有免疫调节和免疫抑制两种效果；(ii)干扰素-β；(iii)醋酸格拉替美(glatiramer acetate)(GA)；(iv)咪唑硫嘌呤，抑制细胞介导的和体液免疫的嘌呤类似物；(v)静脉内免疫球蛋白；(vi)甲氨喋呤，其抑制二氢叶酸还原酶并抑制细胞介导的和体液免疫；(vii)环磷酰胺，具有细胞毒性和免疫抑制效果的烷化剂；和(viii)环孢菌素，其通过抑制T细胞激活而具有有效的免疫抑制效果。尽管用这些抗炎或免疫抑制药物进行治疗，超过50％的患有MS的患者因为脊髓、小脑和大脑皮层的病灶破坏而持续恶化。

目前，用于治疗MS的许多药物具有有限的长期功效，这部分是因为它们具有显着的细胞毒性效果。例如，用环磷酰胺进行的延长的治疗可以导致秃头症、恶心、呕吐、出血性膀胱炎、白细胞减少症、心肌炎、不育症和肺间质纤维化。用免疫抑制剂进行的治疗可以最终在待治疗的患者中诱导“全面的”免疫抑制，其大大增加了感染的风险。遭受延长的全面免疫抑制的患者具有从治疗发展重度医学并发症诸如恶性肿瘤、肾衰竭和糖尿病的增加的风险。

治疗MS的备选的方法是将静脉内或口服施用MBP应用于调节可能与其相关的T细胞免疫应答。静脉内施用MBP或包含MBP的免疫显性表位的其片段通过导致克隆无反应性，或使特异于MBP的T细胞失活的T细胞无应答性而抑制免疫系统。最终效果是MBP-特异性的T细胞不再响应于MBP而增殖。T细胞不能增殖导致了T细胞介导的对神经组织破坏的减少。

用在治疗MS中的MBP的免疫化学类似物是醋酸格拉替美(GA)，或共聚物-1(COP-I)(美国专利号3,849,550；PCT申请WO/95/31990)。以其商购形式存在的GA是随机合成多肽的混合物，其由L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸以6.0∶1.9∶4.7∶1.0的摩尔比率组成。其首先被合成为MBP的免疫化学模拟物。例如，针对GA的某些单克隆抗体与MBP交叉反应(Teitelbaum et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9258(1991))。此外，已经发现GA诱导特异于MBP的T抑制细胞(Lando et al.J.Immunol.123：2156(1979))。在小鼠中的实验显示GA还特异性地抑制MBP特异性T细胞，其在实验性变应性脑脊髓炎(EAE)中涉及中枢神经系统组织的破坏(Teitelbaum et al.Proc.Natl.Acad.USA 85：9724(1995))。

GA的施用可以：(i)增加NK细胞的百分比；(ii)减少血清IL-2受体；(iii)抑制TNF-α；和(iv)增加TGF-β和IL-4(Ariel et al.多发性硬化3(5)，S053(1997))。

尽管患有MS的患者已经相对成功地用肠胃外施用GA进行治疗(Bornstein et al.Transactions American Neurological Association，348(1987))，目前的治疗方案和全面效果可以有所改善。

上述文献的引用并不倾向于承认任何上述是相关现有技术。关于日期的所有声明或关于这些文献内容的表现形式基于申请人可获得的信息并且并不保证这些文献的日期或内容的正确性。

发明概述

本发明提供治疗需要这种治疗的哺乳动物中的神经疾病或病症的方法和组合物。所述神经疾病或病症可以与蛋白质或蛋白质性材料的全身性或局部沉积相关(例如，淀粉样变性病)，有害的蛋白质聚集(蛋白质错折叠)和/或神经变性自身免疫相关。特别关注的是在淀粉状蛋白形成疾病诸如阿尔茨海默病和/或其它脑中产生淀粉的疾病包括朊病毒相关疾病，亨廷顿舞蹈病，帕金森病和脑淀粉样血管病(CAA)中(Revesz，T.et al.(2003)J.Neuropathol.Exp.Neurol.62(9)：885-98)。所述淀粉状蛋白相关疾病的治疗可以包括预防新的淀粉状蛋白斑(沉积)形成，维持目前的淀粉状蛋白斑水平和/或减少存在的淀粉状蛋白斑或总的脑部淀粉状蛋白(包括可不沉积于斑中的Aβ)的量，如通过确定总的淀粉状蛋白负载或原纤维Aβ-淀粉状蛋白负载(可溶的和不可溶的Aβ)或原纤维Aβ淀粉状蛋白负载所测量。所述神经疾病或病症可以与细胞介导的自身免疫疾病诸如多发性硬化相关。所述自身免疫疾病的治疗可以包括预防自身反应性的T细胞的形成，维持现在的自身反应性T细胞的浓度，和/或减少自身反应性T细胞的浓度。

本发明要求和使用任选地以亚微米乳剂，或纳米乳剂形式存在的基于蛋白体的组合物，和/或GA组合物，的各种制剂作为用于治疗哺乳动物中神经疾病或病症中的治疗方法，所述神经疾病或病症包括Aβ斑相关疾病或病症，和细胞介导的自身免疫疾病或病症。

附图简述

图1：皮下免疫对脑中总的Aβ水平的影响。

为了量化淀粉状蛋白负担，将右大脑半球于室温在5.0M的盐酸胍(pH8)中提取约3小时。将稀释物通过夹心式酶联免疫吸附测定(ELISA)，用于测量Aβ40和Aβ42的水平。

图2：鼻免疫对脑中总Aβ总水平的影响。

来自个体小鼠的Aβ40和Aβ42的总Aβ浓度水平在鼻治疗后，通过夹心式酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测量。

图3：在肠胃外和鼻处理的小鼠中，CD11b+细胞的激活导致Aβ原纤维的清除。(A)在皮下免疫后，用thioflavin-S对在海马区中的Aβ原纤维进行染色(放大10倍)或用抗Aβ抗体(R1288)和抗CD-11b(小胶质细胞/巨噬细胞)对总的Aβ进行共染色(放大40倍)。(B)在鼻免疫后，共染色抗Aβ抗体(R1288)和抗-CD 11b(小胶质细胞/巨噬细胞)(在海马区中，放大40倍)。

图4：在MOG皮下免疫和鼻接种醋酸格拉替美后，脑切片的免疫组化。使用抗CD11b，CD3，IFN-γ和TGF-β抗体对来自未处理的，或免疫后50天的免疫的小鼠的海马区的系列切片进行标记(放大20倍，插图，放大60倍)。

图5：在鼻施用GA+IVX-908后，星形胶质细胞增生的减少。使用GFAP染色，将充分限定的海马区(前卤-1.44mm)选择用于激活的星形胶质细胞的量化。将星形胶质细胞激活的水平表示为每mm²海马区的百分比；p＝0.039GA+IVX-908对比对照；p＝0.02对比EAE(MOG)。

图6：在MOG皮下免疫和鼻接种醋酸格拉替美后，脑切片的神经病理学。使用神经毒性的标记物：SMI32，TUNEL，和iNOS对来自未处理的，或免疫后50天的处理的小鼠的皮层的系列切片进行标记(最初放大20倍)。箭头指示用于研究的标记物的标记。在EAE动物中观察到神经毒性的标记物的标记，但是在GA-IVX-908处理的动物中没有观察到该标记。

图7：在MOG皮下免疫和鼻接种醋酸格拉替美后，在海马切片中的血脑屏障的完整性。使用血浆染色的标记物-纤维蛋白原对来自未处理的，或免疫后50天的处理的小鼠中的皮层的系列切片进行标记。在EAE动物中观察到纤维蛋白原的标记物的标记，但是在GA-IVX-908处理的动物中未观察到该标记(放大20倍，小图放大40倍)。

图8：在MOG皮下免疫和鼻接种醋酸格拉替美后，在嗅觉切片中的神经病理学。使用原纤维淀粉状蛋白的标记物：ThS、小胶质细胞激活CD11b，BBB完整性(integrity)，纤维蛋白原对来自未处理的，或免疫后50天处理的小鼠的皮层的系列切片进行标记(放大20倍)。

图9：在未处理的，MOG免疫的和GA+IVX-908处理的小鼠中，对在CNS中的CD68+细胞的染色。箭头指示CD68+细胞，其浸润在EAE中的CNS，但是仍旧位于GA+IVX-908处理的小鼠中的脉络丛。在未处理的小鼠中，没有观察到染色。切片取自小脑(放大20倍)。

进行本发明的方式

术语“神经疾病”指涉及神经系统的神经元细胞的疾病或病症。具体地包括：朊病毒病(例如，克罗伊茨费尔特-雅各布综合征)；发育的脑的病理学(例如，在氨基酸代谢中的先天缺陷，诸如，精氨基琥珀酸血症、脱硫醚尿、组氨酸血症、高胱氨酸尿、高氨血症、苯丙酮尿症、酪氨酸血症和脆性X综合征)；成熟的脑的病理学(例如，神经纤维瘤病、亨廷顿舞蹈病、抑郁症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、多发性硬化)；侵袭成年人的疾病(例如，阿尔茨海默病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、雷维小体病、帕金森病、皮克病)；和脑的其它病理学(例如，脑损坏，脑损伤，昏迷，由各种病原体引起的感染，饮食性缺陷，中风，多梗死性痴呆，和脑血管意外事故)。

本发明优选的疾病或病症是那些影响成熟的脑的疾病，诸如多发性硬化，和那些典型地侵袭成年人的疾病，诸如阿尔茨海默病。

术语“阿尔茨海默病”，在本文简称为“AD”指中枢神经系统的神经变性疾病。广泛地说，所述疾病分为两类：晚期发作，其发生于老年人(典型地超过65岁)和早期发作，其一般在老年期前，例如35到60岁发展。在两种类型疾病中，病理学是类似的，但是在更早年龄阶段开始的病例中异常性倾向于更严重和广泛。AD的特征在于细胞外定位的脑淀粉状蛋白(例如Aβ肽)的聚集，淀粉状蛋白斑(其可以进一步区分为密集的或分散的)，和在脑的某些易受发作的区域诸如海马和皮层中浓缩的细胞内定位的神经原纤维缠结。AD是导致老年性痴呆的进行性疾病。淀粉状蛋白斑是无组织的神经原纤维纤维区域，其可以与穿越在中心的细胞外淀粉状蛋白-beta(Aβ)沉积物多达150mm的嗜中性粒细胞相关，这可以通过脑组织的切片的显微镜分析进行观察。神经原纤维缠结是tau蛋白质(通常是高磷酸化的)的细胞内沉积物，其由彼此配对的两股纤维扭曲组成。AD与Aβ肽的异常聚集相关，其由对淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的改变的蛋白水解加工形成。Aβ的异常聚集与各种突变，诸如常染色体显性APP突变和在编码被称为早老蛋白1(PSl)和早老蛋白2(PS2)的蛋白质的基因中的突变相关，其随后影响γ(gamma)，或β(beta)分泌酶的蛋白水解活性，导致，例如Aβ1-42的增加的水平；而，α(alpha)分泌酶的蛋白水解活性可能与APP的正常加工有关。在AD中发现的各种类型的斑，包括，但不限于与异常的营养不良性轴突相关的神经炎性斑。所述疾病的另外的特征是在CNS中的炎性应答的存在，所述CNS包括激活的小胶质细胞和星形胶质细胞。认为与神经疾病相关的功能异常的蛋白质(例如Aβ和朊病毒蛋白)的聚集体的累积导致或有助于或在其它情况下影响某些神经疾病的发展(Ingelsson，M.和Hyman B.T.(2002)Annals of Med.34：259-271)。与有害蛋白质聚集相关的神经变性疾病包括，阿尔茨海默病，皮克病，帕金森病，朊病毒病，亨廷顿舞蹈病和运动神经元病症(Shastry，NeurochemistryInternational，2002，43：1-7)。

术语“淀粉状蛋白”指细胞外(例如，Aβ、朊病毒病和多发性骨髓瘤轻链病)或细胞内(例如在AD的tau蛋白的神经原纤维缠结和在帕金森病中的α-突触核蛋白)的蛋白质聚集体的沉积(Trojanowski J.Q.和Mathson M.P.(2003)Neuromolecular Medicine 4：1-5)。淀粉状蛋白沉积物可以发现于AD和唐氏综合征患者的脑中，以及在中枢神经系统的动脉、微动脉、毛细血管和静脉中。淀粉状蛋白沉积物可以通过结合染料诸如刚果红和thioflavin S，以及形成原纤维的能力，包括交叉的β折叠片确认来识别。

术语“淀粉样变性病”指大的不同种类病症的组，其特征在于通常可溶的蛋白质的异常不可溶解的沉积物，其可以是错折叠的蛋白质，包括蛋白质聚集体。

除了阿尔茨海默病(AD)，早期发作的阿尔茨海默病，晚期发作的阿尔茨海默病和症状发生前的阿尔茨海默病之外，其它特征是淀粉状蛋白质沉积物的疾病是，例如血清淀粉状蛋白A(SAA)淀粉样变性病，遗传性冰岛综合征，多发性骨髓瘤，朊病毒病等，或其它脑生成淀粉病(Revesz，T.et al.(2003)J.Neuropathol.Exp.Neurol.62(9)：885-98)，可以按照本文提出的组合物和方法进行治疗。在动物中最常见的朊病毒病是绵羊和山羊的瘙痒病和牛的牛海绵状脑病(BSE)(Wilesmith和Wells(1991)Curr.Top.Microbiol.Immunol.172：22-38)。已经在人中鉴定了四种朊病毒病：(i)库鲁病，(ii)克罗伊茨费尔特-雅格布综合征(CJD)，(iii)格-施-沙病(GSS)，和(iv)致死性家族性失眠症(FFI)(Gajdusek，D.C.(1977)Science 197(4307)：943-60和Medori，R.et al.，(1992)N.Engl.J.Med.326(7)：444-9)。

老年斑的主要成分是Aβ肽。Aβ肽是前体蛋白质APP的39-43个氨基酸的内部片段。在APP蛋白质中的一些突变与阿尔茨海默病的存在相关(见，例如.，Goate，A.et al.，(1991)Nature 349(6311)：704-6，Murrell，M.et al.，(1991)Science 254(5028)：97-9，Mullan，M.et al.，(1992)Nat.Genet.1(5)：345-7)。

用于本文时，术语“β-淀粉状蛋白前体蛋白质”(APP)定义为这样的多肽，所述多肽由定位在人的染色体21的长臂上的相同名称的基因所编码，并且在其羧基端(carboxyl third)包括Aβ。APP是在许多哺乳动物组织中在多种类型的细胞中表达的糖基化的，单跨膜蛋白。

认为APP突变通过增加的或改变的将APP蛋白水解加工为Aβ，特别是将APP加工为增加量的Aβ的长的形式(即Aβ1-42和Aβ1-43)来影响阿尔茨海默病的发展。认为在其它基因，诸如早老蛋白基因，PS1和PS2中的突变间接影响将APP蛋白水解处理以产生增加量的长的形式的Aβ(见Hardy，J.(1997)Trends Neurosci.20(4)：154-9)。这些观察指出Aβ，特别是其长的形式，是阿尔茨海默病的致病元件。

用于本文时，术语“APP片段”指除了只由Aβ或Aβ片段组成的那些之外的APP的片段。即，APP片段将包括除了形成完整Aβ或Aβ片段的那些之外的APP的氨基酸序列。

术语“beta-淀粉状蛋白肽”与“β-淀粉状蛋白肽”，“βAP”，“βA”和“Aβ”同义。所有这些术语指来自淀粉状蛋白前体蛋白质的片段的斑形成肽。

用于本文时，术语原纤维Aβ和总的Aβ的定义如下。原纤维Aβ是包含在细胞外淀粉状蛋白沉积物中的Aβ肽，所述淀粉状蛋白沉积物还可以被称为Aβ斑或痕(plagues)；在某些情形中，还可以将Aβ斑区分为分散的或密集的。“总的”淀粉状蛋白负载或总的Aβ负载是可溶性和不可溶的(例如，原纤维)Aβ肽的总和，其大部分被假定为细胞外的。认为在可溶性和不可溶的Aβ之间存在动力学关系，其中细胞外的非原纤维Aβ可以代表可形成原纤维淀粉状蛋白的Aβ的来源。

用于本文时，术语实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是MS的主要的动物模型。EAE可以容易地在小的哺乳动物中，通过用在适合的佐剂中的MBP进行免疫或通过CD4，MBP-反应性T细胞的被动转移来诱导(Alvord Jr，E.C，et al.eds.in Experimental Allergic Encephalomyelitis a Useful Model forMultiple Sclerosis，A.R.Liss，N.Y.，1984；Makhtarian et al.Nature 309：356(1984)；Ben-Nun et al.J.Immunol.129：303(1982))。在小鼠和大鼠中诱导EAE的T细胞识别对应于由抗原呈递细胞对于II型主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的MBP的免疫显性区域的肽。

根据本发明的一个方面，提供了治疗哺乳动物中神经疾病或病症的方法。可以通过将治疗上有效量的GA和基于蛋白体的组合物给药于需要其的受试者而使得本发明这方面的方法有效。本发明的另一方面是这样的，其中所述神经疾病或病症是淀粉状蛋白斑形成疾病或病症。用GA或根据本发明的一方面的基于蛋白体的组合物治疗的最突出的神经疾病或病症是阿尔茨海默病和多发性硬化。除了组合以蛋白体的GA的治疗性组合物来治疗前述神经疾病或病症之外，其它实施方案包括，但不限于，使用下列治疗性组合物进行治疗：无GA组合物的基于蛋白体的组合物，亚微米乳剂组合物中的GA，或纳米乳剂组合物中的GA。前面的实施方案也将包括任何药用的稀释剂，赋形剂，稳定剂或载体。

本发明的又一方面是这样的，其中哺乳动物中的所述神经疾病或病症的治疗包括施用治疗上有效量的GA和基于蛋白体的组合物，其引发所述哺乳动物中的抗体不依赖反应。

本发明的另一实施方案由治疗淀粉状蛋白性疾病(amyloidal disease)的方法组成，所述淀粉状蛋白性疾病可以是阿尔茨海默病。淀粉状蛋白性疾病的治疗可以通过，例如，预防原纤维淀粉状蛋白负载的增加，预防总的淀粉状蛋白负载升高，保持当前的原纤维和/或总的淀粉状蛋白负载，或减少在脑中原纤维和/或总的淀粉状蛋白负载而实施。由于已知淀粉状蛋白可以在整个躯体中驻留，本发明的实施方案并不限于脑淀粉状蛋白。另外，尽管本发明具体讨论了β-淀粉状蛋白，其它淀粉状蛋白类别如血清淀粉状蛋白A(SAA)，朊病毒病，遗传性冰岛综合征，亨廷顿舞蹈病，帕金森病，唐氏综合征和脑淀粉状蛋白血管病被考虑在本发明中。根据前述的淀粉状蛋白性疾病，可以通过施用一种下列治疗性组合物来完成治疗：治疗上有效量的GA和基于蛋白体的组合物，无GA组合物的基于蛋白体的组合物，亚微米乳剂中的GA，和/或纳米乳剂的GA。先前的实施方案还将包括任何药用的稀释剂，赋形剂，稳定剂或载体。

醋酸格拉替美

对于治疗多发性硬化(MS)有效的MBP的免疫化学类似物是醋酸格拉替美(GA)，或共聚物-1(Cop-1)(美国专利号3,849,550；PCT申请WO/95/31990)。以其商购形式存在的GA是由摩尔比为6.0∶1.9∶4.7∶1.0的L-丙氨酸，L-谷氨酸，L-赖氨酸和L-酪氨酸组成的随机合成多肽的混合物。它首先合成为MBP的免疫化学模拟物。例如，针对GA的某些单克隆抗体与MBP交叉反应(Teitelbaum et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9258(1991))。另外，已经发现GA诱导对于MBP特异性的T抑制细胞(Lando etal.J.Immunol.123：2156(1979))。在小鼠中的实验显示GA还特异性地抑制涉及EAE中中枢神经系统组织破坏的MBP-特异性T细胞(Teitelbaum et al.Proc.Natl.Acad.USA 85：9724(1995)；和Angelov，D.N.et al.PNAS100(8)：4790-4795(2003))，显示GA可以用来治疗肌萎缩性侧索硬化，在所述肌萎缩性侧索硬化中诱导充分调控的自身免疫反应似乎影响在抗自身T细胞应答存在时的存活，所述抗自身T细胞反应可以通过施用GA而得以提高。

根据本发明，GA可以通过本领域已知的方法进行制备。例如，GA可以通过在美国专利号3,849,550中公开的方法制备，其中酪氨酸，丙氨酸，[γ]-苄基谷氨酸盐和ε-N-三氟-乙酰基赖氨酸的N-羧基酸酐在环境温度下于无水二噁烷中进行聚合，以二乙胺作为抑制剂。用冰醋酸中的溴化氢实施谷氨酸的γ-羧基的去封闭，接下来用1M哌啶从赖氨酸残基上去除三氟乙酰基。得到的多肽混合物基本上由摩尔比为大约6∶2∶5∶1的丙氨酸，谷氨酸，赖氨酸，和酪氨酸组成。

GA还可由Teva Pharmaceuticals，Kfar-Saba，Israel商购。

可以制备保留其治疗性用途的任意形式的GA进行根据本发明的使用。这些包括具有各种分子量范围的肽的混合物。具有所需分子量范围的GA可以通过本领域已知的方法获得。这些方法包括如WO 95/31990中公开的GA的凝胶过滤高压液相色谱以去除高分子量种类。在一个实施方案中，GA具有大约75％的在大约2KDa到大约20KDa的分子量范围内的其聚合物种类。在另一个实施方案中，GA具有从大约4KDa到9KDa的平均分子量。据理解GA可以进行酶学或其它降解以便包含与根据已知方法的常规GA不同长度，或者在其它情况下进行修饰的聚合物种类。

GA和蛋白体

以蛋白体配制的GA(例如，IVX-908或Protollin)可以通过，例如，注射或鼻内进行给药。当通过注射递送时，这种递送可以作为一种注射剂(组合的同时给药)。或者，GA组合物和基于蛋白体的组合物的递送可以分别进行递送，通过在多个位点注射来完成，其可以同时或在暂时的不同时间进行，并且其中一个位点仅仅给予GA组合物(即，无蛋白体)，而在第二个位点上仅仅施用基于蛋白体的组合物(即，无GA)。还意欲GA可以通过注射给药，而同时或不同时例如，通过鼻内给药基于蛋白体的组合物。因而，在本发明的一个实施方案中，通过注射递送GA组合物并且单独地，通过鼻内递送基于蛋白体的组合物。

还可以制备本发明的GA肽以包含疏水性锚定序列部分，其将预期增强与蛋白体的非共价缔合。在美国专利号6,476,201中讨论了生产和制造蛋白体-两亲性决定簇疫苗，其设计用于胃肠外或特别是用于粘膜给药，包括胃肠给药以诱导全身性和粘膜的抗体反应。两亲性决定簇是具有疏水性和亲水性区域的分子，其当与蛋白体进行适当配制时，与蛋白体组合(align)以形成引发受试者体内免疫应答的复合物。典型的两亲性决定簇包括糖脂，脂糖(包括解毒的脂多糖)，脂肽，跨膜结构域，包膜或类毒素蛋白，或具有内在疏水性氨基酸锚定物的蛋白质或肽。

乳剂组合物

GA可以分别如在美国专利5,961,970或5,716,637中所述在亚微米乳剂或纳米乳剂中给药或与亚微米乳剂或纳米乳剂一起进行配制。所述组合物包含水包油亚微米乳剂，其具有大约0.5到大约50％的油，大约0.1到大约10％的乳化剂，大约0.05到大约5％的非离子性表面活性剂，和大约0.00001到大约1.0％的GA作为水性持续相。亚微米乳剂具有在大约0.03和大约0.5μm之间范围内，优选在0.05和0.2μm之间的平均小滴大小。

纳米乳剂法提供了包含颗粒的纳米乳剂的疫苗组合物，所述颗粒具有脂质核心，其由至少一个磷脂双分子层围绕。如在重量基础上所测定的，所述颗粒具有在大约10到大约250nm范围内的平均直径，并且GA在匀化过程之前内在地或在其后外在地并入其中。典型地将颗粒悬浮于水性持续相中并且每个脂质颗粒都包含脂质核心，其中所述脂质在大约25℃或更高的温度下是固体或液体大块结晶。通常包埋的GA的量为大约0.001到大约5％。或者，GA可以与蛋白体一起配制和/或纳米乳剂还可以包含生物粘附性或粘附性大分子。

建议的机制

本发明还包括，例如，抑制或减弱淀粉状蛋白-β肽(可溶的和/或不可溶的)，其片段或衍生物的水平的方法，所述方法包括用与基于蛋白体的组合物一起配制的GA，或无GA的基于蛋白体的组合物免疫哺乳动物，其中所述肽，其片段或衍生物的减弱或抑制发生而无抗体产生，如本文使用不能引发抗体反应的B细胞缺陷(μMT)小鼠所证实的。尽管不希望被任何理论所束缚，优选地，淀粉状蛋白(例如，Aβ肽)的抑制或减少是通过免疫细胞如脑定位小胶质细胞，或可以在大脑或外周发现的嗜中性粒细胞和/或巨噬细胞的激活进行的，其中这些细胞的激活独立于任何抗体或抗原特异性机制。最优选的是减少或抑制发生而不在哺乳动物中引起实验性变应性脑脊髓炎(EAE)(包括脑膜脑炎)。

淀粉状蛋白负载(例如，包含原纤维斑的Aβ加上可能不沉积到斑上的非原纤维Aβ)的减少涉及淀粉状蛋白沉积的减少和/或Aβ斑形成以及由此治疗AD和相关疾病或促淀粉状变疾病或病症。尽管本发明的各方面不应当受限于任何特定理论或机制，认为激活的小胶质细胞与淀粉状蛋白斑一起共定位并且小胶质细胞的激活依赖于淀粉状蛋白沉积的存在，所述沉淀引发内源小胶质细胞的激活。因而，激活的小胶质细胞参与清除淀粉状蛋白(例如，Aβ斑)沉积物。关于AD的可能机制的其它信息见于Schenk，D.(2002)Nature 3：824-828。Aβ的沉积和淀粉状蛋白斑的形成似乎伴随着复杂的炎性和神经毒性级联。所以，认为治疗的抗炎性机制可能是有益的。这些抗炎方法通常与抗炎性IL-4/IL-10(Th2)和TGF-β(Th3)免疫反应的表现相一致。因此令人吃惊和意外地发现，包含基于蛋白体的组合物和GA的该制剂刺激引发包含Aβ-淀粉状蛋白的斑减少的非抗体介导的免疫应答，因为先前有人提出蛋白体更加经常与Th1型免疫(细胞因子)反应的刺激相关联，并且将与Th2免疫反应并列和不同，所述Th1型免疫反应与促炎性免疫反应相关联。然而，由Th1-型细胞因子INF-γ(75％以上未处理)增强小胶质细胞的吞噬作用，也可能提示了加速清除在CNS中的炎性渗液的反馈机制(Cha，A.et.al.(2001)GLIA 33(1)：87-95)。另外，INF-γ本身也能够导致β-淀粉状蛋白前体蛋白的转录抑制(Ringheeim G.E.et al.Biochem Biophys Res Commun(1996)224(1)：246-51)。

基于蛋白体的组合物

美国专利6,476,201和5,961,970的主题描述了关于多价亚基疫苗来说，怎样按序刺激针对每种组分的优化的免疫反应，适合的组分应当适当地关联并且每一种都在免疫系统中存在从而使得它们可以被有效地识别并且被免疫系统的细胞所加工。这种识别和加工可以包括被位于其中的膜细胞(M-细胞)，例如，鼻上皮细胞所吸收和随后递送到宿主免疫系统的基础(underlying)细胞中。这些非共价复合疫苗的主要实例包括基于蛋白体的疫苗，其可以由非共价复合到广泛抗原包括肽，脂肽，跨膜或类毒素蛋白，多糖或脂多糖(LPS)的奈瑟氏球菌(Neisserial)外膜蛋白组成(其它综述见下列参考文献；美国专利5,726,292，Immunogenicity and Efficacy of Oral orIntranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonneiProteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models；Infect.Immun.61：2390；Mallett，C.P.，T.L.Hale，R.Kaminski，T.Larsen，N.Orr，D.Cohen，和G.H.Lowell.(1995))；Intranasal for intragastric immunization withproteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against lethalpneumonia in a murine model of shigellosis(Infect.Immun.63：2382-2386；Lowell G H，Kaminski R W，Grate S et al.(1996))；Intranasal andintramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B(SEB)toxoid vaccines：immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice(Infec.Immun.64：1706-1713；Lowell，G.H.(1990))；Proteosomes，HydrophobicAnchors，Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide andProtein Vaccines，(in New Generation Vaccines：G.C.Woodrow and M.M.Levine，eds.(Marcel Dekker，NY)第12章(pp.141-160))；和proteosome-lipopeptide vaccines：enhancement of imrnunogenicity for malariaCS peptides；(Lowell，G.H.，W.R.Ballou，L.F.Smith，R.A.Wirtz，W.D.Zollinger和W.T.Hockmeyer(1988)Science 240：800))。

本文所用的基于蛋白体的组合物指来自革兰氏阴性细菌，如奈瑟氏球菌物种的外膜蛋白(OMPs，也称为孔蛋白)的制剂(见，例如，Lowell et al.，J.Exp.Med.167：658，1988；Lowell et al.，Science 240：800，1988；Lynch et al.，Biophys.J.45：104，1984；Lowell，in″New Generation Vaccines″2nd ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basil，Hong Kong，193页，1997；美国专利号5,726,292；美国专利号4,707,543)，其可以用作免疫原，如细菌或病毒抗原的载体或佐剂。如上所述制备的蛋白体还包含内源性脂多糖(LPS)，其起源自用于产生OMP孔蛋白的细菌(例如，奈瑟氏细菌物种)。任何形成小泡或小泡样形式的外膜蛋白成分，包括多分子膜结构或一种或多种OMPs的熔球样OMP组合物的制备方法，都包括在蛋白质体的定义中。

本文所用的″脂糖″指天然或经修饰的脂多糖或脂寡糖(也总称为″LPS″)，其源自革兰氏阴性细菌如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)或类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)，或其它革兰氏阴性细菌(包括产碱菌属(Alcaligenes)，拟杆菌属(Bacteroides)，鲍特氏菌属(Bordetella)，布鲁氏菌属(Brucella)，弯曲杆菌属(Campylobacter)，衣原体属(Chlamydia)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，爱德华氏菌属(Edwardsiella)，Ehrlicha，肠杆菌属(Enterobacter)，埃希氏菌属(Escherichia)，弗朗西丝氏菌属(Francisella)，梭杆菌属(Fusobacterium)，加德纳氏菌属(Gardnerella)，Hemophillus，螺杆菌属(Helicobacter)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，军团菌属(Legionella)，莫拉氏菌属(Moraxella)，摩根氏菌属(Morganella)，Neiserria，巴斯德氏菌属(Pasteurella)，变形菌属(Proteus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，其它邻单胞菌属(Plesiomonas)，卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，普雷沃氏菌属(Prevotella)，假单胞菌属(Pseudomonas)，立克次氏体属(Rickettsia)，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，其它志贺氏菌属(Shigella)，螺菌属(Spirillum)，韦荣氏球菌属(Veillonella)，弧菌属(Vibrio)，或耶尔森氏菌属(Yersinia)物种)。应当注意本文所用的LPS可以是未脱毒或脱毒的。

在其它实施方案中，可以将由制备蛋白体的相同或不同细菌分离的外源LPS与其混合；本文将一种这样的基于蛋白体的组合物称作IVX-908(也可称作Protollin)。换句话说，IVX-908型的蛋白体是OMPs混合以至少一种脂糖的制剂以提供OMP-LPS组合物(其可以充当免疫刺激组合物)。因而，OMP-LPS(IVX-908)佐剂可以包含两种基本组分(1)由革兰氏阴性细菌，如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)制备的蛋白体的外膜蛋白制剂，和(2)一种或多种脂糖的制剂。还意欲IVX-908的组分可以是或包括脂质，糖脂，糖蛋白，小分子，等。

如本文公开的基于蛋白体的组合物可以包括一种或多种组分，其至少部分地，充当具有刺激宿主免疫系统能力的佐剂。要理解的是这些蛋白体组分可以包括革兰氏阴性细菌的外膜蛋白(OMP)组分(融合蛋白或其片段)以及相同或不同革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)组分。这些组分可以充当例如，配体，其通过与由一种或多种疫苗接受者的宿主细胞产生的某些受体(例如，Toll样受体)相互作用刺激宿主免疫应答。

不希望被理论所束缚，本文公开的一种或多种疫苗制剂的组分可以与Toll样受体(TLRs)相互作用，所述Toll样受体与疫苗接受者的固有的和/或适应性免疫反应相关联。有至少10种TLRs(见Takeda et.al.，Annu RevImmunology(2003)21：335-76)。已经鉴定了与某些TLRs相互作用并且随后激活它们的一种或多种配体，除了TLR8和TLR10。脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白，例如OMP 2(也称作Por B)，与TLR2相互作用，而大多数但并非全部革兰氏阴性细菌的LPS与TLR4相互作用。因此，本文所述的疫苗制剂可以促成生物学影响的一种机制包括TLR2和TLR4其中一种或两种的激活。不过，在本发明的其它方面，同样可能的是其它TLRs(除了TLR2和TLR4之外其它的)的激活可以发挥类似的功能或进一步增强所表达细胞因子的质和/或量的模式，并且其可能与宿主Th1/Th2免疫应答相关联。

预期一种或多种TLRs的质和/或量的激活引发或影响Th1和/或Th2免疫应答的相关刺激(平衡的或不平衡的)，有或无伴随性体液抗体反应。

与除了TLR2和TLR4之外其它的TLRs相互作用的配体也可以用于本文所述的疫苗组合物中。这些疫苗组分可以单独地，或组合地用来影响足以治疗或保护免受本文给出的生淀粉(amylogenic)疾病的宿主免疫应答的发展。这些TLRs和关联的配体包括，但不限于，列表1中给出的那些。

列表1

TLR家族	配体(可能来源的实例)
		TLR1	可溶性因子(脑膜炎奈瑟氏球菌)三酰基脂肽(细菌，分支杆菌)
TLR2	脂蛋白和脂肽孔蛋白(奈瑟氏球菌属)

	非典型LPS(问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans))非典型LPS(牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis))肽聚糖(革兰氏阳性细菌)脂磷壁酸质(革兰氏阳性细菌)HSP70(宿主)糖脂(嗜麦芽密螺旋体(Treponemamaltophilum))
		TLR3	双链RNA(例如，病毒的)
TLR4	LPS(革兰氏阴性细菌)紫杉醇(植物)HSP60(宿主)HSP70(宿主)HSP60(肺炎衣原体(Chlamydiapnemoniae))纤维蛋白原(宿主)
		TLR5	鞭毛蛋白(细菌)
TLR6	二-酰基脂肽(支原体)
		TLR7	咪唑喹啉(合成化合物)洛索立宾(合成化合物)溴匹立明(合成化合物)
TLR8	尚待鉴定的配体
		TLR9	CpG DNA(细菌)
TLR10	尚待鉴定的配体

任何一种经鉴定的TLRs或其组合(列表1)都可以由任一种本文所意欲的疫苗制剂的TLR配体组分或其组合来激活。要进一步理解的是任何一种或多种TLRs的刺激都可以使用任一种或多种TLR配体以适于给药途径(例如，鼻内，注射等)的浓度来实现。

所以，根据本发明，要理解的是疫苗制剂可以包括任何一种或多种TLR配体，包括重组配体(融合蛋白或其片段)组合以抗原性疫苗组分，或任选地包括CD14受体，有或无外源添加的脂多糖组分。

在本发明的一个方面任一种或多种TLR配体只有TLR结合部分可以通过，例如重组DNA技术，进行分离，并在有或无GA时进行配制作为阿尔茨海默病或类似疾病或病症的治疗性治疗和/或预防性预防。这种多肽还可以通过一种或另一种本领域技术人员公知的合成方法进行制备。不希望被理论所束缚，一个这种分离的结合结构域可以分离自称作孔蛋白B的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白的部分，所述孔蛋白B被疑为结合TLR2。TLRs的其它这些多肽配体结合结构域也可以以类似的方式单独或以一种或另一种组合的方式使用。可以使用这种制剂，有或无必要施用蛋白体-GA制剂，或可以在施用蛋白体-GA制剂之后使用。此外，要理解的是TLR配体的这种TLR结合部分的变体(例如，保守性氨基酸置换)可以用于激活TLR，只要该变体保留结合(和激活)TLR的能力。在本发明的又一方面，可以使用重组DNA技术将TLR配体的这种TLR结合部分重复一次或多次以制备包含多拷贝这种结合部分的多肽，或甚至是包含相同或不同TLR配体的多个结合结构域的多价(即，杂合的)多肽。

在某些基于蛋白体的组合物中，疫苗制剂的一种或多种组成部分不需要非共价地复合而是可能与蛋白体组合物(例如，IVX-908，Protollin)混合。称作Projuvant的基于蛋白体的组合物只包含小量的外源性LPS(或脂寡糖(LOS))而基于IVX-908/Protollin蛋白体的组合物包含其它的外源性LPS，其可以来自与OMP组分相同或不同的革兰氏阴性细菌物种或者可以是源自一种以上革兰氏阴性细菌的LPS的混合物。

在一个实施方案中，作为总蛋白体蛋白的重量百分比的最终脂糖含量可以在大约1％到大约500％范围，更优选大约20％到大约200％范围，或大约30％到大约150％范围，或大约10％到大约100％范围中。本发明的优选实施方案是免疫刺激组合物，其中基于蛋白体的组分制备自脑膜炎奈瑟氏球菌而最终脂糖含量在50％到150％的总蛋白体蛋白重量之间。最终LPS含量可以代表内源性LPS(例如，LOS)加外源性添加的LPS(或LOS)的组合。在另一个实施方案中，基于蛋白体的组合物(例如，Projuvant)用来自Neiserria的内源性脂寡糖(LOS)组分制备，其为从大约0.5％到高达大约5％的总OMP。本发明的另一个实施方案提供了具有内源性脂糖的蛋白体，其在总OMP的从大约12％到大约25％范围中，在优选的实施方案中在大约15％和大约20％的范围内。本发明还提供了包含来自革兰氏阴性细菌物种的脂糖的组合物，其可以来自相同的革兰氏阴性细菌物种或来自不同的细菌物种，所述革兰氏阴性细菌物种是蛋白体的来源。

美国专利6,476,201涉及蛋白体-两亲性决定簇疫苗的生产和制造，其设计用于胃肠外或粘膜给药，以诱导全身性(血清)和粘膜(包括呼吸器官和肠的)的抗体反应。粘膜给药是优选的，并包括，但不限于，呼吸器官的(例如包括鼻内，咽内和肺内)，胃肠(例如包括口或直肠)或局部的(例如结膜或耳的)给药。两亲决定簇是具有疏水性和亲水性区域的分子，其当与蛋白体进行适当配制时，与蛋白体组合以形成引发受试者体内免疫应答的复合物。典型的两亲性决定簇包括糖脂，脂糖(包括解毒的脂多糖)，脂肽，跨膜、包膜或类毒素蛋白，或具有内在疏水性氨基酸锚定物的蛋白质或肽。这些决定簇材料可以获自革兰氏阴性细菌包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属，假单胞菌属，Hemophilus，布鲁氏菌属，志贺氏菌属和奈瑟氏球菌属。更具体地，设计蛋白体疫苗来保护免受由革兰氏阴性生物引发的疾病，在所述蛋白体疫苗中脑膜炎球菌外膜蛋白蛋白体制剂(制备自脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)或其它奈瑟氏球菌属物种的任意菌株)非共价地复合到天然或脱毒的志贺氏菌属或奈瑟氏球菌属脂多糖或脂寡糖上以形成疫苗，所述革兰氏阴性生物包含复合物的组成部分中的任一种，包括脑膜炎球菌或志贺氏菌。更具体地，所述蛋白体疫苗包含LPS，其诱导识别志贺氏菌属脂多糖的类型特异性体细胞多糖O-抗原的抗体反应，由此赋予针对志贺氏菌病(shigellosis)的类似保护。当复合到蛋白体上时，脂多糖诱导抗志贺氏菌属保护性免疫应答。由宋内氏志贺氏球菌(Shigella sonnei)或类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)制备和纯化蛋白体疫苗来获得针对宋内氏志贺氏球菌的免疫性，由弗氏志贺氏菌2a(Shigella flexneri 2a)制备和纯化以获得对于弗氏志贺菌2a病的免疫性，使用源自同源性或抗原性交叉反应生物的LPS来赋予针对由弗氏志贺氏菌2a(或3a等)，鲍氏志贺氏菌(S.boydii)，宋内氏志贺氏菌等引发的志贺菌病的同源免疫性。另外，美国专利6,476,201描述了多价蛋白体志贺氏菌属疫苗的给药，其中将两种使用源自弗氏志贺氏菌2a(针对弗氏志贺氏菌2a病)和类志贺邻单胞菌或宋内氏志贺氏菌(针对宋内氏志贺氏菌病)的志贺菌属LPS抗原独立制备的蛋白体疫苗一起施用，由此诱导识别两种生物的抗体并且由此赋予针对两种类型疾病的保护。另外，由此将蛋白体志贺氏菌属LPS疫苗用于保护免受志贺氏菌病，在所述疫苗中使用中空纤维渗滤技术将来自B组2b型脑膜炎球菌的蛋白体复合到类志贺邻单胞菌LPS上以产生通过粘膜呼吸器官和/或胃肠途径施用的疫苗并诱导识别宋内氏志贺氏菌的体细胞O抗原LPS的抗体。

本发明的示例性但非限制性的基于蛋白体的组合物是基于蛋白体的粘膜佐剂IVX-908(Protollin)，其是脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(蛋白体)的非共价制剂并外源加入制备自弗氏志贺氏菌的LPS。

制剂和给药

在下文中，可以互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药用的载体”指载体或稀释剂，其并不引发针对生物的显著刺激并且不消除被施用化合物的活性和性质。

在本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步有利于活性成分的给药的惰性物质。非限制性的赋形剂的实例包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖和各种类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油和聚乙二醇。

药物配制和给药的技术可以见于″Remington′s PharmaceuticalSciences，″Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，最近版。

合适的给药途径可以，例如，包括口服，直肠，经粘膜，经鼻，肠或肠胃外递送，包括肌内，皮下和髓内注射以及鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内或眼内注射，但蛋白体的优选给药途径是鼻内。

包含基于蛋白体的组合物，或在亚微米乳剂或纳米乳剂中的GA制剂可以通过肠胃外，口服，鼻内，或局部，或如本文所示，以其任意组合进行给药。尽管在某些实施方案中优选通过胃肠外或粘膜施用它们。

本文还包括双或多途径给药。双途径给药可以包括，例如，制备基于蛋白体的制剂于鼻内进行给药但与GA分开，所述GA可以与蛋白体的鼻内给药同时或不同时通过注射进行给药。蛋白体(Projuvant)或蛋白体：LPS(即，IVX-908)组合物(在缺少GA时)也可以与GA同时或不同时通过注射进行给药。对于注射来说，本发明的活性成分可以配制在生理上可以接受的载体中，优选在生理上相容的缓冲液如Hank′s溶液，林格氏溶液，或生理盐水缓冲液中。对于经皮和可能的经粘膜给药来说，可以在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这些渗透剂一般是本领域已知的。

对于口服给药来说，化合物可以通过将活性化合物与本领域公知的药用载体一起组合容易地进行配制。这些载体能够使得本发明的化合物配制成患者口服摄入的片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆，混悬液，等。可以使用固体赋形剂，任选地研磨得到的混合物，并加工颗粒混合物，在如果需要加入合适的助剂后，以获得片剂或糖衣核之后制得口服用的药物制剂。合适的赋形剂为，特别地，填充剂如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纤维素制剂如，例如，玉米淀粉，小麦淀粉，水稻淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或海藻酸或其盐如海藻酸钠。

对于鼻施用来说，用于按照本发明应用的活性成分可以方便地以，例如，气溶胶喷雾剂的形式进行递送，所述气溶胶喷雾剂由使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯-四氟乙烷或二氧化碳的加压包装或喷雾器产生。对于加压气溶胶来说，可以通过提供阀来测定剂量单位以递送经计数的量。可以对用在分样器中的例如由明胶制成的胶囊和药筒进行配制以包含化合物与合适粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

可以对本文所述的制剂进行配制以进行肠胃外给药，例如，通过大丸剂注射或持续输注。可以以单位剂型例如，在具有任选地添加的防腐剂的安瓿或在多剂量容器中给出注射用制剂。所述组合物可以是混悬液，溶液或在油性或水性赋性剂中的乳状液，并且可以包含配剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

本发明的药物组合物可以给药用于与受试者体内任何地方，但特别是在脑中以进行与淀粉状蛋白(例如，Aβ)的产生和/或沉积相关的疾病的预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将所述药物组合物给药于已经患有疾病和需要治疗的哺乳动物。将以足够抑制或减少Aβ进一步沉积成斑和/或清除已经形成的斑和/或刺激已经存在的Aβ团聚体的去除，和/或刺激可能不包含在斑中的Aβ的减少的量来给药所述药物组合物。将足以实现此的量定义为“治疗上有效的剂量或量”。

对于预防性应用来说，将本发明的药物组合物给药于易患淀粉状蛋白相关疾病(例如，Aβ相关的阿尔茨海默病)，但尚未患这种疾病的哺乳类受试者。这些哺乳类受试者可以通过遗传筛选和临床分析进行鉴定，如在医学文献中所述的(例如Goate(1991)Nature 349：704-706)。所述药物组合物将能够在症状的早期阶段，预防或减少例如，Aβ的淀粉状蛋白沉积成斑，优选地甚至预防β-淀粉状蛋白相关疾病的起始期。被称作预防上有效的剂量的对于这种预防性治疗所需的化合物的量，可以，但并非必需地，一般与上面对于治疗性治疗所述的量相同。

为了本说明书和后附的权利要求书的目的，术语“患者”、“受试者”和“接受者”可以交互使用。它们包括人和其它哺乳动物(例如，母牛和其它牛)，其是预防性，实验性，或治疗性治疗的目标。

本文所用的术语“治疗”包括以统计学上显著的方式，基本上抑制，延缓或逆转疾病的进程，基本上改善疾病的临床症状或基本上预防疾病临床症状的出现。

根据待治疗疾病的严重性和反应性，给药可以是在一种或多种位点或以一种或多种递送方式进行的单一或多次施用，治疗过程从几天延续到几周或直到实现治愈或实现统计学上显著的疾病状态的减弱。当然，要施用的治疗量将依赖受治疗的受试者，病痛的严重性，给药方式，处方医师的判断等。用于计算统计学显著性的方法是相关领域已知的。

MS的“治疗”意欲包括预防或延迟多发性硬化的表现形式，临床的或亚临床的，例如，其组织学症状的出现的治疗，以及在它们的临床表现后通过消除自身免疫攻击和预防或延缓自身免疫组织破坏而实现的症状的治疗性抑制或改善。“消除”、“抑制”或“减弱”自身免疫攻击或反应包括所述攻击或反应的一种或多种症状的部分减弱或改善。“自身免疫反应”的“基本上”提高的抑制效应(或消除或减弱)意味着MS的一种或多种标志物或组织学或临床指征的显著降低。非限制性的实例是四肢麻痹评分中减少至少一个单位。

一般以0.01mg到1000mg/天的剂量来施用GA以治疗MS。在一个实施方案中采用0.5-50mg范围的剂量。不过，根据本发明的一方面，预期使用本文给出的一种或多种佐剂(或其组合)可以与包含GA的组合物一起进行配制，由此可以允许GA给药的较低或较高剂量或频率，并且GA的剂量本身不必是有效的。

根据本节中给出的信息本领域技术人员完全能够确立有效的剂量范围以及优化量。例如，通过开始用相对低剂量的GA(例如，1mg/天)，逐渐提高它(例如，对数性地)并测定对于治疗的生物学反应来优化对于哺乳动物的剂量，特别是人的剂量；例如，(i)测量调节细胞(CD4⁺和/或CD8⁺)的诱导(Chen，Y.et al.，Science，255：1237(1994))；(ii)测量循环T细胞上的II类表面标志物的减少；(iii)测量TGF-β表达细胞的数目或可检测的TGF-β的相对量；(iv)评估血液中免疫攻击T细胞的数目和激活(例如，通过有限稀释分析和增殖的能力)；或者，(v)根据众所周知的评分方法(例如，通过测量发作的次数，关节肿胀，握力，硬度，视敏度，减少或停止药物治疗的能力)，通过对疾病严重性打分。有效剂量是引发这些标志物的其中一种至少统计学上或临床上显著衰减的任何剂量，并且优选是在给药研究期间减弱MS的至少一种症状特征的剂量。

根据公知的方法取决于疾病类型可以实现MS疾病严重性的评估。这些方法包括但不限于：在一定时期上发作的严重性和次数；失能的进行性累积(其可以在扩展的失能状态等级(Expanded Disability Status Scale)上进行测量)；脑中病灶的数目和程度(例如，通过磁共振成像所揭示的)；和自体反应性的T细胞的频率。

现在已经一般性地描述了本发明，通过参考下列实施例将会更容易理解它，除非指定，所述实施例是通过例证的方式提供的，并不意欲限制本发明。

实施例

用完全弗氏佐剂(CFA)中的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽(氨基酸35-55)免疫淀粉状蛋白前体蛋白(APP)转基因小鼠并随后施用(注射)百日咳毒素(PT)以测定，与它们的非转基因同窝出生仔畜相比它们对于实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的易感性。作为对照，用牛血清白蛋白(BSA)或人β-淀粉状蛋白肽(Aβ氨基酸1-40)免疫动物。EAE在APP转基因动物和它们的非转基因同窝出生仔畜中发展到相同的程度(Muckeet al.，Ann NY Acad Sci(777)82-88(1996))，并且在用Aβ1-40或用BSA免疫的动物中没有观察到EAE。不过，当对脑进行神经病理学检查时，在发展EAE的动物中有较少的Aβ染色。通过使用thioflavin S量化在海马中的Aβ原纤维染色量，发现对比对照在MOG免疫的小鼠中有92％的减弱(p＝0.001)而与用Aβ1-40免疫的小鼠相比有73％的减弱(p＝0.03)(见表1，图1)。通过由ELISA量化总的脑Aβ含量，与对照组相比在MOG免疫的动物中测定Aβ减少94％(p＜0.001)而当与Aβ1-40免疫的小鼠相比时有86％的减少(p＝0.03)(见表1，图1)。

为了确定所述作用是否对于MOG诱导的EAE是独特的，用CFA中的蛋白脂质蛋白(PLP)肽(氨基酸139-151)诱导EAE。在具有PLP诱导的EAE的动物中发现Aβ原纤维染色减少76％而Aβ水平减少70％(p＜0.02)(见表2，图3A)。为了用PLP诱导EAE，使用由Hsiao，K.et al，Science 274(5284)：99-102(1996)所述的Tg2576小鼠，其是基于B6/SJL背景的。用Tg2576小鼠和由Mucke et al.，Ann NY Acad Sci(777)82-88(1996)描述的J20免疫的小鼠发现诱导MOG-EAE的相似的结果(见表1)。这些结果证明观察结果与用来诱导EAE的抗原或研究的AD动物模型无关，也与动物的遗传背景无关，也与性别无关(50％雄性/雌性)。在用CFA中的BSA免疫的动物中没有观察到变化。注意，当与大于16月龄的Tg2576小鼠相比时，大于13月龄的J20小鼠中的总Aβ(淀粉状蛋白)负载没有差异。

在对于治疗AD的小鼠模型的免疫方法的先前研究中，其中用在CFA中配制的Aβ肽免疫动物，Solomon，B.et al，Proc Natl Acad Sci 94：4109-12(1997)已经显示抗积聚性β淀粉状蛋白抗体在体外，和Weiner，H.L.et al.，Ann Neurol 48，567-79(2000)，和Schenk，D.et al.，Nature 400，173-7(1999)已经显示其在体内，在减少淀粉状蛋白负载中具有作用，并且它们的活性与Aβ的N末端区域中的特异性表位相关(Frenkel，D.et al.，Neuroimmunol88，85-90(1998)，和Frenkel，D.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 97，11455-9(2000))。针对在用MOG或PLP免疫的动物中的Aβ测量抗体水平以确定与Aβ是否有交叉活性，以及与来自用Aβ免疫的动物的那些相比，Aβ抗体的效价。如在表1和2中所示，未检测在用MOG或PLP免疫的动物中的抗Aβ抗体。为了确定性地证实抗体未发挥作用，将培育为μMT B细胞缺陷小鼠的16月龄J20小鼠用CFA中的MOG 35-55进行免疫，随后施用百日咳毒素。如表1和图1中所示，μMT B细胞缺陷APP+小鼠，与对照相比有90％的淀粉状蛋白减少，如通过ThS染色(p＜0.001)或通过ELISA对于总脑淀粉状蛋白(p＜0.001)所测量的。这些结果显示在MOG免疫之后Aβ通过抗体非依赖型机制减少。

先前的研究已经提示激活的小胶质细胞可能在体内清除Aβ中发挥重要作用(Schenk，D.et al.，Nature 400，173-7(1999)，Rogers，J.et al.，Glia 40，260-9(2002)，Mitrasinovic，O.M.et al.，Neurobiol Aging 24，807-15(2003)，Webster，S.D.et al.，Exp Neurol 161，127-38(2000)，Bacskai，BJ.et al.，JNeurosci 22，7873-8(2002)，Nicoll，J.A.et al.，Nat Med 9，448-52(2003)，Akiyama，H.& McGeer，P.L，Nat Med 10，117-8；author reply 118-9(2004))。激活的小胶质细胞(或小胶质细胞样细胞)还可以基于脑源的或起源自脑外，即，外周地如嗜中性粒细胞和巨噬细胞而进一步区别。将脑源的小胶质细胞与外周嗜中性粒细胞和巨噬细胞区别开来的方法是本领域已知的。为了研究小胶质细胞激活在Aβ清除中的潜在作用，将用MOG/CFA免疫(通过足垫注射或鼻内)的APP tg小鼠的脑用激活的小胶质细胞的标记CD11b进行染色。如图3A和4和表4所示，对APP tg MOG-免疫小鼠的海马的免疫染色揭示激活的小胶质细胞数目增多(349±34.3细胞/海马区)，所述激活的小胶质细胞与淀粉状蛋白斑共定位(表4)。在用BSA/CFA免疫的对照动物中只观察到最少的染色(76±17细胞/海马区)(表4)。在用Aβ/CFA免疫的对照动物中观察到中间水平的小胶质细胞激活(106±27细胞/海马区)。另外，在μMT B细胞缺陷小鼠中(p＜0.001)，和用PLP免疫的动物中(p＜0.001)也观察到提高水平的小胶质细胞激活(图3A，表4)。

根据紧上面所述的第一系列的实验，MOG/PLP加CFA的施用(随后施用百日咳毒素)与Aβ的减少相关，但与有害的EAE一致。在这些实验中将百日咳毒素用于打开血脑屏障来递送CFA配制的化合物到脑中。所以，为了评估Aβ的减少是否与EAE的诱导直接相关并且由于MOG，PLP和GA已经关于MS相关EAE进行过研究，对用醋酸格拉替美(GA)免疫APP小鼠的效应进行了评估，所述醋酸格拉替美是丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸的随机氨基酸共聚物，其有效抑制EAE并且是已经批准的和广泛使用的MS复发形式的治疗方法(Teitelbaum，D.et al.，J.NeuralTransm Suppl 49，85-91(1997))。

尽管如一开始所实施的，在给药本文提供的某些抗原/佐剂混合物之后给药(注射)百日咳毒素；完全理解的是可以给药本文所述的某些其它组合物，而无需给药百日咳毒素。其实，基于蛋白体的组合物如有或无GA的IVX-908在无需给药百日咳毒素的情况下进行给药。事实上，在任何时候，对于鼻递送本文所述的任何基于蛋白体的组合物都未使用百日咳毒素。

由此用在CFA中的100μgGA免疫(通过足垫注射)小鼠并在其后立即以及在48小时接受150ng百日咳毒素的腹膜内注射。免疫后50天，处死小鼠。与未处理的对照相比，醋酸格拉替美免疫导致海马区中淀粉状蛋白原纤维减少92％(p＜0.01)而总的淀粉状蛋白负载减少70％(p＜0.01)(见表1，图1)。在用GA/CFA加百日咳毒素免疫的动物中没有临床EAE。

由于CFA不能施用给人受试者，对用除了CFA之外的佐剂以醋酸格拉替美鼻疫苗接种AD的小鼠模型的效果进行了研究；以单独鼻施用醋酸格拉替美单独或与粘膜佐剂一起处理动物。制备基于蛋白体的粘膜佐剂IVX-908(Protollin)，其包括脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(蛋白体)的非共价制剂和来自弗氏志贺氏菌的LPS，其已经用于人(Fries，L.F.，et al.，InfectImmun 69：4545-53(2001))和小鼠(Plante，M.et al.，Vaccine 20，218-25(2001))中。第一周小鼠接受多次蛋白体佐剂的处理并且在接下来的五周每周加强一次，其后进行神经病理学分析。作为对照，用IVX-908+BSA，IVX-908单独或GA单独对动物进行鼻部处理。意想不到的是，与IVX-908一起配制的GA的鼻部给药导致海马中thioflavin阳性原纤维淀粉状蛋白减少84％(与对照相比p＜0.001)，而与单独的IVX-908相比减少70％(p＜0.01)(表3)。至于总的脑Aβ水平，在鼻部施用IVX-908中的醋酸格拉替美之后观察到73％的减少(与对照相比p＜0.001)而单独使用IVX-908减少45％(p＜0.002)(表3，图2)。此外，在处理的动物中检测淀粉状蛋白斑周围的激活的小胶质细胞。单独鼻施用GA并不影响Aβ原纤维，尽管在脑中总的Aβ水平有轻微的减少(与对照相比p＝0.044)。鼻施用BSA+IVX-908或单独施用IVX-908导致总的淀粉状蛋白负载减少50％(与对照相比p＝0.02)，尽管对于原纤维Aβ染色没有影响。与用CFA注射相反，在这些实验中鼻部单独施用IVX-908或作为具有GA或BSA的制剂并不诱导任何动物中的EAE。

在下列任一种免疫方案中都没有发现APP非转基因小鼠中小胶质细胞的激活：用CFA/PT加GA肠胃外免疫，用IVX-908加GA鼻免疫(见图3B)，或单独用IVX-908鼻免疫。这些结果提示在用与IVX-908一起配剂的GA或IVX-908单独施用(免疫)后小胶质细胞的激活可能依赖于淀粉状蛋白沉积的存在，其可以作用来引发内源性小胶质细胞进行激活。

尽管在GA和Aβ之间没有已知的交叉反应性，并且我们在GA处理的或EAE动物中都未观察到抗Aβ抗体，有可能用GA+IVX-908免疫能够导致Aβ反应性T细胞的引发。我们通过用Aβ(1-40)刺激脾T细胞在用GA+IVX-908每周处理的七周后(此时终止实验)测量T细胞增殖反应和细胞因子(IL-2，IFN-γ，IL-6)产生。如通过增殖所测量的，我们没有发现Aβ反应性T细胞的引发：对于未处理的Aβ计数/分钟＝3315±1682cpm；对于GA+IVX-908＝4516±1412cpm(背景计数为100-300)。刺激指数(GA+IVX-908/未处理的)＝1.37；大于2.5的最小刺激指数被认为是阳性的。另外，在这些培养物中我们未发现IL-2，IFN-γ，IL-6在背景之上的分泌。对于Aβ的T细胞反应的这种缺乏与我们未检测到抗Aβ抗体是相一致的，因为对于抗体的产生来说T细胞的辅助是必需的。类似地，在EAE动物中我们未发现对于Aβ的引发。

为了检查GA+IVX-908处理对于除了海马之外的其它脑位点的影响，我们研究了嗅球和小脑。我们关于Aβ、CD11b和纤维蛋白原对嗅球进行了染色，并获得了与在海马中观察到的那些相似的结果(图8)。在鼻部给药GA+IVX-908后，我们发现与对照相比，激活的小胶质细胞数目增多。所述激活还发生在患有EAE的动物中，但与血脑屏障(BBB)的渗漏有关联，如通过对纤维蛋白原染色所测定。

当我们检查小脑时，我们在GA+IVX-908处理的动物中未发现染色的小胶质细胞的激活增多，提示增强的激活局限于具有Aβ沉积的区域。另外，在GA+IVX-908处理后，在非转基因同窝出生仔畜的脑中任何地方都观察不到小胶质细胞的激活，这进一步证明增强的激活局限于具有Aβ沉积的区域(见图3b)。

为了更好地理解我们观察到的清除机制，我们对于CD68表达染色，与脑小胶质细胞相反，其在来自外周的激活巨噬细胞上高度表达。如在图9中所示，与用GA+IVX-908处理的那些相比，我们在具有EAE的动物中获得了更高的CD68染色。这种染色模式显示巨噬细胞从脉络膜神经丛到周围脑实质包括小脑和皮层的迁移。在GA+IVX-908处理中，主要在脉络膜神经丛空间中有增强的CD68的表达。这提示负责清除具有EAE的动物中Aβ的CD11b+细胞从外周迁移到CNS并且与神经毒性相关联，而在GA+IVX-908处理的动物中CD11b+细胞是基本内源性的小胶质神经细胞并且与Aβ的清除有关，没有直接毒性的证据。作为对于这种解释的进一步支持，我们发现在具有EAE的动物的小脑中有增强表达的CD68+细胞，但在GA+IVX-908或未处理的动物中则没有(未显示)。另外，在GA+IVX-908处理后激活的CD11b+细胞只在有淀粉状蛋白积聚的区域中发现。

如在表4和图4中所示，在海马中Aβ原纤维的减少与两种激活的小胶质细胞的增加的数量都强烈相关，如通过CD11b染色所示，(r＝-0.7CD11b对Aβ原纤维)，和IFN-γ对Aβ原纤维)。在CD11b细胞和IFN-γ细胞之间有强烈的相关性，与对照相比，在处理的动物中我们观察到增多数量的小胶质细胞，其对于巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)具有免疫反应性(p＜0.02)(表4)。我们观察到在海马区域中TGF-β和Aβ原纤维的百分比的减少(r＝0.91)。我们在对照和GA+IVX-908处理的动物之间没有观察到在IL-10免疫反应性细胞中的显著变化，尽管具有EAE的动物比对照具有更少的IL-10。

实施下列实验以便评估用GA加IVX-908处理是否诱导神经细胞毒性或其它潜在的副作用：i)测定GFAP的水平，与神经元细胞损伤一致的星形细胞增生(毒性)测量；ii)测量SMI32，一种神经微丝磷酸化作用的标记的表达水平，并且已知其随着神经元细胞损伤而增加；iii)进行TUNEL测定，作为测量凋亡细胞死亡的手段；iv)和测定iNOS，一种在神经元细胞胁迫条件下显示上调的酶的水平。

来自GFAP测定的结果显示星形细胞增生发生在对照未处理的动物中(如通过GFAP+细胞所测量的，在海马中的激活的星形细胞的区域)(图5)。在鼻给药GA+IVX-908中，星形细胞增生减少(3.1％；与对照相比，p＝0.039)。与此相反，在EAE动物中没有星形细胞增生的减少。这些结果显示，与在患有EAE，即使是在还与Aβ沉积减少相关的EAE的动物中观察到的相比，作为用GA+IVX-908治疗的结果的Aβ的清除具有更少的毒性(与更少的星形细胞增生相关)。

来自测量SMI32的实验的结果(图6)显示在未处理的对照动物中，具有异常卵圆形态的SMI32阳性细胞与神经炎性斑块相关。患有EAE的动物显示在整个脑部(与炎症相关)包括小脑(尽管没有观察到神经炎性斑块)中，具有异常卵圆形态的SMI32阳性细胞数量的增加。与此相反，用GA+IVX-908处理的动物显示与神经炎性斑块相关的SMI32阳性细胞(具有异常卵圆形态)的数量的减少。这些实验显示GA+IVX-908处理与通过SMI32测量的毒性不相关。

来自使用标准TUNEL测定测量的调亡细胞死亡的实验的结果(图6)显示在对照动物中没有TUNEL染色，而在EAE动物的皮层中具有增加的TUNEL染色。在GA+IVX-908处理的动物中没有观察到TUNEL染色。此外，测量iNOS的测定显示iNOS在患有EAE的小鼠中被上调，而在用GA+IVX-908处理的动物中则没有。在GA-IVX-908处理的或EAE动物中都没有检测到对血管结构的损伤。

综上所述，这些数据显示即使是在患有EAE的动物以及在用GA+IVX-908处理的动物中具有Aβ的清除，后者与神经元细胞毒性不相关(表4和图6)。

然而，尽管在单独用IVX-908免疫后，小胶质细胞的激活似乎需要Aβ沉积的存在，这种免疫并未导致这种Aβ沉积的去除(通过激活的小胶质细胞)，而在总的淀粉状蛋白负担的量中具有优先减少。这些结果可以显示存在可以被激活的两群小胶质细胞的可能性，或显示小胶质细胞可以被激活到不同的程度，部分地或完全地，的另一种可能性，其中完全被激活的小胶质细胞能够去除预先促在的Aβ斑，而部分激活的小胶质细胞参与可溶的Aβ肽的螯合。考虑到可溶的Aβ聚集形成不可溶的Aβ斑块，单独用IVX-908进行的这种治疗可能延缓或阻止Aβ斑块的持续形成，对于患病的受试者具有益处。

表4和图3B，证实在海马中的Aβ原纤维的减少与激活的小胶质细胞(如通过CD11b+免疫组化染色所显示的)和IFN-γ分泌细胞两者的数量增加相关，此外，存在增加数量的巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)阳性小胶质细胞。已经报道了在小鼠和人小胶质细胞上的M-CSFR的增加的表达通过巨噬细胞清除受体和通过增加小胶质细胞的FcRγ受体的表达加速聚集的淀粉状蛋白的吞噬作用(Mitrasinovic，O.M.&Murphy，G.M.，Jr.，Neurobiol Aging 24，807-15(2003))。然而，在μMT B-细胞缺陷型小鼠中淀粉状蛋白的清除还具有增加的对于M-CSFR的增加的染色，因此观察到的效果是通过非Fc-介导的机制进行的(Bacskai，BJ.et al，J Neurosci 22，7873-8(2002))。与IFN-γ的增加相关，观察到在TGF-β表达中的减少，提示TGF-β以某种方式调节可溶性Aβ聚集成斑块的能力，并且还认为TGF-β与增加的淀粉状蛋白沉积相关(Wyss-Coray，T.et al.，Nature 389，603-6(1997))。在TGF-β中的减少还促进淀粉状蛋白的清除。在IL-10表达中没有观察到显著的变化。小胶质细胞激活可能与增加数量的T细胞相关，其可能在促进小胶质细胞激活中具有作用，因为在T细胞的数量和IFN-γ分泌细胞的数量之间具有相关性。

为了证实在这些实验中检测到的CD11b+细胞是激活的巨噬细胞或小胶质细胞，而不是嗜中性粒细胞，将样品与识别F4/80的单克隆抗体一起温育，在激活的巨噬细胞和小胶质细胞的表面上可以检测到细胞表面结构，但是在嗜中性粒细胞(多形核白细胞)上没有检测到细胞表面结构。F4/80的表达随巨噬细胞和小胶质细胞的成熟而增加。这些实验的结果显示在这些实验中检测的所有的CD11b+细胞还对于F4/80染色为阳性(未显示)，由此显示这些CD11b+细胞是激活的巨噬细胞或小胶质细胞，而不是嗜中性粒细胞。此外，通过H&E染色(图4)与Aβ斑块共定位的CD11b+细胞具有单核形态，而不具有嗜中性粒细胞的多形核形态特征。

在另一系列的实验中，显示在鼻施用GA+IVX-908后，小胶质细胞激活与T细胞数量的增加相关，如通过CD3染色所确定。这些结果显示T细胞在促进小胶质细胞激活中的可能的作用，因为在检测到的T细胞的数量和IFN-γ分泌细胞的数量之间的相关性r＝0.88(表4)。此外，报道TGF-β可能在APP tg-小鼠中增加或减少Aβ原纤维形成，Wyss-Coray，T.et alNature 389，603-6(1997)；Wyss-Coray et al.Nat.Med.7：612-8(2001)。在本文报道的实验中，与对照相比，在MOG(p＜0.001)和GA+IVX-908(p＜0.001)处理的小鼠中观察到TGF-β表达的减少(表4)；在海马区中，在TGF-β的减少和Aβ原纤维的百分比之间具有强烈的相关性(r＝0.95)。在IL-10-免疫反应性细胞中没有观察到显著的变化(未显示)。

当通过鼻给药单独的IVX-908时，发现总的脑部Aβ水平的减少(表3)(p＝0.02，对比未处理的)，但是不象与GA一起配制的IVX-908，单独的IVX-908对于清除thioflavin阳性的Aβ原纤维没有作用。IVX-908是由脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(OMPs)和外源添加的脂多糖(LPS)组成的基于蛋白体的佐剂。已知脑膜炎奈瑟氏球菌OMP 2(孔蛋白B)和LPS/LOS与在某些细胞类型的表面上展示的TLRs相互作用，所述细胞类型与固有的和/或过继性免疫系统相关。可能的是，对于本文提出的IVX-908和/或与IVX-908一起配制的GA的观察到的活性，这些相互作用至少是部分需要的。关于IVX-908观察到的效果可能与这样的报道相关，所述报道是将LPS定向注射到海马中可以导致非原纤维Aβ负载，而不是原纤维Aβ沉积的减少(DiCarlo，G.et al.，Neurobiol Aging 22，1007-12(2001))。然而，必需注意到，在这些实验中施用的路径，定向注射到脑中，与递送本文所述的基于蛋白体的制剂的鼻施用路径非常不同。与此相反，其它的报道指出，尽管腹膜内给药LPS(炎症)可能刺激小胶质细胞的激活，还观察到总的淀粉状蛋白的增加，LPS-诱导的神经炎症增加淀粉状蛋白前体或蛋白质和Aβ肽的细胞内积累(Sheng et al.，Neurobiology of Disease 14：133-145(2003)，及其引用的参考)。另外，要理解的是预期定向注射LPS是具有毒性的。

在上述讨论的实验中，通过缺乏F4/80信号显示CD11b+细胞是激活的小胶质细胞或巨噬细胞，但是不是嗜中性粒细胞。然而，为了确定这些CD11b+细胞是否能够进一步被区分为激活的小胶质细胞，还是激活的巨噬细胞，将样品关于CD68的存在进行评估，所述CD68是一种细胞标志物，其在来自外周的激活的巨噬细胞上高表达，而在来自脑部的小胶质细胞的表面则无高表达。如在图8和9中所显示，与来自用GA+IVX-908处理的动物的样品相比，在EAE动物中，我们获得了对于CD68的更高染色(巨噬细胞是CD11b+和CD68+)；显示这些CD11b+CD68+细胞是已经从外周(蛛网膜下空间)迁移到包括小脑和皮层的脑实质中的巨噬细胞。与此相反，在GA-IVX-908处理后，在CD68表达的巨噬细胞中有增加，但是这些细胞仍旧主要保持定位在蛛网膜下空间。来自这些实验的结果显示所述CD11b+细胞涉及在EAE动物中，从外周将Aβ清除到CNS中，并且与神经元毒性相关；而在GA-IVX-908处理后检测到的CD11b+细胞主要是内源性的小胶质细胞，并且与Aβ的清除相关，但是无直接的毒性的迹象。为了进一步支持这种解释，我们发现在EAE动物的小脑中具有增加的CD68+细胞的表达，但是在GA-IVX-908处理的或未处理的动物(数据未显示)则没有增加的CD68+细胞的表达。而且，在GA-IVX-908处理后的激活的CD11b+细胞仅在其中积累淀粉状蛋白的区域中有发现。

与未处理的动物相比，我们还在施用GA+IVX-908的动物的血清中发现增加的Aβ的水平，提示GA+IVX-908导致Aβ从脑区域清除，并且该Aβ接着可以在外周中发现。然而，在具有EAE的动物中没有观察到这种Aβ的再次分布，其，如上所述，可能与激活的CD11b+细胞的来源相关。此外，与未处理的动物相比，在施用了GA-IVX-908的动物中，排列在脑毛细血管和脉络膜神经丛的CD11b+CD68+激活的巨噬细胞增加(图9)。这些发现与在获自GA-IVX-908处理的动物的血清样品中检测到的升高的水平的Aβ和伴随的与CD11b+细胞相关的在GA-IVX-908处理的动物中的淀粉状蛋白血管病的减少相一致(图8)。

意外地，似乎淀粉状蛋白(例如，Aβ斑)清除的最终常见途径可以通过激活的小胶质细胞进行。在EAE中，IFN-γTh1型的髓磷脂反应性T细胞通过用MOG或PLP加CFA免疫明显地在外周中得到激活，并且这些T细胞迁移到脑部，其中它们释放IFN-γ(Th1细胞因子)并且激活小胶质细胞。结果，动物的脑脊髓炎和麻痹由对髓鞘酯和下面的轴突起的损伤导致。在外周中用BSA/CFA进行的免疫没有导致Aβ的清除，因为BSA特异性Th1型细胞没有在脑中积累。用在CFA中的醋酸格拉替美进行的外周免疫诱导GA特异性T细胞，其由于GA与MBP的交叉反应性而在脑中积累。所述细胞能够分泌IFN-γ并且因此激活小胶质细胞，但是因为改变的对于MBP的亲和性和伴随的抗炎细胞因子的分泌而不会导致EAE。

我们已经证实Aβ的清除与小胶质细胞激活相关。应该指出的是，小胶质细胞的激活可能具有阳性和阴性结果(Monsonego，A.，和Weiner，H.L.，Immunotherapeutic approaches to Alzheimer’s disease，Science302：834-838(2003))。小胶质细胞代表蛋白质团聚体和碎片可以从脑中去除的天然机制，并且存在关于在Aβ免疫或中风后小胶质细胞的激活可导致Aβ的清除的报道(见Nicoll，J.A.，et al.，Neuropathology of humanAlzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide：a case report，Nat Med.，9：448-452(2003)；Akiyama，H.，and McGeer，P.L.，Specificity ofmechanisms for plaque removal after A beta immunotherapy for AlzheimerDisease，Nat Med.，10：117-118；author reply 118-119(2004)；and Wyss-Coray，T.，et al.，Prominent neurodegeneration and increased plaque formation incomplement-inhibited Alzheimer′s mice.，Proc Natl Acad Sci，99：10837-10842(2002))。在动物研究中，Wyss-Coray和同事证实在补体抑制的AD小鼠模型中，存在明显的神经变性和增加的斑块形成，其中与相同年龄的野生型AD小鼠相比，小胶质细胞的明显更少地被激活。这支持了这种观念，即激活的小胶质细胞在减少淀粉状蛋白负载中具有有益的作用，而在AD小鼠模型中没有主要的神经毒性。

因为其能够激活小胶质细胞，鼻施用单独的IVX-908导致了淀粉状蛋白的减少，尽管没有与GA一起配制的IVX-908组合物一样有效，所述组合物此外可以激活T细胞。在非转基因动物中，与CFA一起外周给药GA或通过鼻内给药IVX-908没有观察到小胶质细胞的激活。已经报道Aβ沉积物导致围绕Aβ斑的小胶质细胞的轻微激活，并且似乎这种激活是通过IVX-908加GA进一步激活小胶质细胞所需要的。可能的是，小胶质细胞的轻微激活与IFN-γ的表达或引发小胶质细胞进一步激活的toll-样受体的表达相关(Sasaki，A.et al.，Virchows Arch.，441(4)：358-67(2002))。

这些发现与用在Th1型佐剂(QS21)中的Aβ1-42免疫后，在人中观察到的斑块去除的可能机制相关，Nicoll，J.A.et al.，Nat Med 9，448-52(2003)报道来自用与佐剂QS21一起肠胃外给药Aβ1-42接种疫苗的AD患者的尸体解剖发现，其导致广泛的脑膜脑炎，巨噬细胞对脑的渗透，和在新皮层中的淀粉状蛋白沉积物的减少。Akiyama和McGeer报道在AD的情形中，在受不完全的局部缺血影响的皮层区域中的老年斑的相似的减少并且显示他们的发现和由Nicoll，et al报道的那些可能与高反应性小胶质细胞以抗体依赖型方式对淀粉状蛋白的吞噬作用相关。另外，通过使用TUNEL染色(调亡细胞的标记)或NeUN免疫染色(神经元生存力的标记)，与未处理的小鼠相比，在GA加IVX-908或单独的IVX-908中没有观察到毒性的迹象。

本文提供治疗阿尔茨海默病的新的免疫治疗方法，其是抗体不依赖性的并且由激活的小胶质细胞所介导。通过组合用于治疗多发性硬化的药物和鼻佐剂(IVX-908)；使用以前用在人中针对其它适应证的不具有毒性的两种组合物(GA和基于蛋白体的佐剂)，小胶质细胞似乎被激活以清除Aβ-原纤维斑并减少总的淀粉状蛋白负担。考虑到在动物中的研究已经证实Aβ斑块的减少与认知改善相关，用与GA一起配制的IVX-908进行的鼻疫苗接种对于具有阿尔茨海默病的患者而言是有效的疗法。

表1.在J20APP转基因小鼠的脑中，皮下免疫对总的和原纤维Aβ的影响

^*结果表示为在1∶500 IgG的效价上OD的水平

^**对照组合未处理的(n＝5)和BSA/CFA处理的(n＝3)的动物，因为在这些组中没有不同。对于总的脑部Aβ：未处理的＝126.7±19.5；BSA/CFA 123.7±33.2。对于％thioflavin阳性的Aβ斑块：未处理的：2.8±0.5；BSA/CFA＝2.2±0.9。

^a与对照相比，p＜0.05.

^b与对照相比，p＜0.001；与Aβ相比，p＜0.05.

^c与对照相比，p＜0.01.

^d与对照相比，p＜0.01；与Aβ相比，p＝0.05.

表2.在Tg2576 APP转基因小鼠的脑中，PLP免疫对总的和原纤维Aβ的影响

^*结果表示为在1∶500 IgG的效价上OD450的水平.

^a与对照(未处理的小鼠)相比，p＜0.02.

^b与对照相比，p＜0.002.

表3.在J20APP转基因小鼠的脑中，鼻免疫对总的和原纤维Aβ的影响

脚注

^*结果表示为在1∶50 IgG的效价上OD450的水平.

^a与对照相比，p＜0.02，与GA相比，p＜0.02.

^b与对照和GA相比，p＜0.001，与IVX-908相比，p＜0.04.

^c与对照相比，p＜0.001，与GA相比，p＜0.002，与IVX-908相比，p＜0.002.

表4在免疫的动物中的海马的免疫组化^*

表4脚注：

^*数据表示对每种治疗的三个切片和对于对照的6个切片的量化(3个未处理+如表1的3个BSA/CFA处理)

^ar＝-0.7 CD11b对比％Aβ原纤维的区域.

^br＝-0.65 CD3对比％Aβ原纤维的区域；r＝0.74 CD3对比CD11b.

^cr＝-0.7 M-CSFR对比％Aβ原纤维的区域；r＝0.92 M-CSFR对比CD11b.

^dr＝-0.8 IFN-γ对比％Aβ原纤维的区域；r＝0.9 IFN-γ对比CD11b；r＝0.85IFN-γ对比CD3.

^er＝-0.91 TGF-β对比％Aβ原纤维的区域；r＝-0.77 TGF-β对比CD11b；

r＝-0.6 TGF-β对比CD3.

^fr＝0.67 IL-10对比％Aβ原纤维的区域；r＝-0.4 IL-10对比CD11b.

^gp＝0.0007 CD11b对比GA；p＜0.05 IFN-γ对比GA；p＝0.0011 TGF-β对比GA.

ⁱp＜0.05对比对照

ⁱⁱp＜0.02对比对照

ⁱⁱⁱp＜0.001对比对照

^ivp＜0.001对比对照

材料和方法

小鼠.(B6XD2)F1(平均年龄14个月)或(B6XSJL)F1 APP+(WT或μMT)(平均年龄16个月)按照所有可应用的指导，在Brigham and Woman′s医院将APP转基因小鼠饲养于并用在无病原体的设施中。

材料.IVX-908(Protollin)是已经在人中进行安全测试的脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白(蛋白体)和来自弗氏志贺氏菌的LPS的非共价制剂，并且获自ID Biomedical，Montreal，加拿大。醋酸格拉替美(Copaxone

)是丙氨酸，赖氨酸，谷氨酸和酪氨酸的随机氨基酸共聚物，其被批准并被广泛用在MS的复发形式的治疗中，所述醋酸格拉替美获自Brigham and Women′s医院药房。MOG(35-55)和PLP(139-151)在Brigham and Women′s医院，神经疾病中心合成。

在APP+小鼠中的EAE的诱导和临床评估.用在CFA中的100μgMOG(35-55)，PLP 139-151或100μg的β-淀粉状蛋白肽(1-40)，在后脚垫中免疫(B6D2)F1或(B6XSJL)F1 APP+(WT或B-细胞缺陷型μMT)和非tg的同窝出生的仔畜。紧接其后和在48小时后，小鼠接受包含在0.2ml PBS中的150ng百日咳毒素的i.p.注射。在免疫后7天开始监测动物的EAE症状，并如下进行评分：0，无疾病；1，尾部麻痹；2，后肢虚弱；3，后肢麻痹；4，后肢加前肢麻痹；和5，垂死。

鼻疫苗接种.醋酸格拉替美：在第一周的第1，2，4和5天给药25μg，随后每周一次激发达6周。IVX-908：在第一周的第1和第5天给药1μg/小鼠，随后每周一次激发达6周。BSA+IVX-908：在第一周的第1和第5天给药25μg的BSA加1μg的IVX-908，并在第2和第4天单独给药25μg的BSA，随后进行BSA+IVX-908组合的6次每周一次的激发。GA+IVX-908：在第一周的第1和第5天给药25μg的GA加1μg的IVX-908，在第2和第4天单独给药25μg的GA，随后进行GA+IVX-908的组合的6次的每周一次的激发。

淀粉状蛋白量化.为了量化淀粉状蛋白负担，于室温，在5.0M的盐酸胍(pH 8)中抽提右大脑半球达3小时。通过夹心式酶联免疫吸附测定法(ELISA)，将稀释物用于测量不可溶的(淀粉状蛋白-相关的)Aβ40和Aβ42的水平。为了测量Aβ原纤维，于4℃在4％的Brain O/N中固定左大脑半球，随后在4.5％蔗糖中固定4小时，接着在用于O/N的20％蔗糖中固定。在存在OCT低聚甲醛的情况下冷冻脑，将其切成14μm的纵向切片进行免疫组织学染色和淀粉状蛋白原纤维量化。选择充分限定的海马区(Bregma-1.34)，使用thioflavin-S染色，进行斑块中的淀粉状蛋白原纤维的量的量化。以3CCD彩色视频照相机收集来自这些切片的图像(放大20倍)并用适合的软件(NIH；Imaging Research)进行分析。将淀粉状蛋白原纤维的量表示为如通过软件测量的每mm²海马区的百分比。

免疫组织学.使用下列标志物来进行染色：T细胞(CD3；BDBiosciences：553057)，小胶质细胞/巨噬细胞(CD11b；Serotec：MCA74G)，(C-MFR；Cymbus Biotech：21080096)，IFN-γ(Pharmingen：559065)，IL-10(Pharmingen：559063)和TGF-β(RD：AB-20-PB)。抗-淀粉状蛋白抗体(R1282)是Dennis Seloke的赠品。脑切片进一步进行苏木精染色。以盲方式来评估切片，对照包括使用如前所述的同种型匹配的mAbs。对于每种处理，进行三个不同脑切片的海马区的量化(相同的区域，Bregma-1.34，其用于ThS染色)。将结果表示为对于每种标志物的标记的细胞的平均值。

神经病理学.为了检查神经毒性，于4℃，将左大脑半球固定在4％的低聚甲醛种过夜，随后固定在4.5％的蔗糖中达4小时，接着在20％的蔗糖中固定过夜。在存在OCT低聚甲醛的情况下，冷冻所述脑，将其切成14μm的纵向切片并进行免疫组织学染色。我们关于4种用于神经元胁迫和血脑屏障完整性的标志物进行染色：GFAP(Sigma；G9269)，SMI32(Serotec)，TUNEL(Roche 1 684 817)，iNOS(CHEMICON：AB5382)，和纤维蛋白原(Dako：A0080)。将星形细胞增生表示为由星形胶质细胞覆盖的每mm²的海马区的百分比。如前所述进行关于iNOS，SMI32和纤维蛋白原的染色(29)。按照生产商(Roche 1 684 817)的推荐进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)的染色。进行H&E染色来鉴定计数的细胞的形态。以无偏性的立体测量学方法，使用来自NIH的图像研究软件，以盲方式进行每个动物的两个连续切片，每组4只动物的染色。将来自主要皮层运动区的每组的染色(Bregma侧面的1.44mm)显示在图6中。

数据分析.将所有的连续和顺序数据表示为平均值±sem。当两组进行比较时，使用斯氏t检验进行数据比较，或当分析三组或更多组时，进行单向ANOVA分析。将少于0.05的p值考虑为统计学上显著的；使用Excel统计学程序来计算r值。

将本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物的全部内容，特此并入本文作为参考，不管以前是否具体并入。

现在，在已经充分描述了本发明后，对于本领域那些技术人员而言要理解的是，可以在不背离本发明的精神和范围的前提下，在等价的参数、浓度和条件的广泛范围内进行本发明，而无需过度实验。

尽管已经结合其具体的实施方案描述了本发明，将理解的是其能够进一步地改进。本申请意欲包括本发明的任何变化，应用和改进，其通常遵循本发明的原则并包括来自本说明书的这样的方案(departures)，所述方案来自本发明所涉及的领域的已知或常规实践并可应用于上文提出的基本特征。

Claims (6)

1.基于蛋白体的组合物在制备用于治疗哺乳动物中阿尔茨海默病的药物中的应用，其中所述基于蛋白体的组合物是包含外源脂多糖的基于蛋白体的佐剂，其中所述基于蛋白体的佐剂是由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)制备的外膜蛋白制剂，并且其中所述外源脂多糖获自志贺氏菌属(Shigella)物种。

2.基于蛋白体的组合物和醋酸格拉替美组合物在制备用于治疗哺乳动物中阿尔茨海默病的组合制剂中的应用，其中所述基于蛋白体的组合物是包含外源脂多糖的基于蛋白体的佐剂，其中所述基于蛋白体的佐剂是由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)制备的外膜蛋白制剂，并且其中所述外源脂多糖获自志贺氏菌属物种。

3.权利要求1或2的应用，其中所述阿尔茨海默病是早期发作的阿尔茨海默病，晚期发作的阿尔茨海默病或症状发生前的阿尔茨海默病。

4.权利要求1或2的应用，其中所述基于蛋白体的佐剂来自脑膜炎奈瑟氏球菌，并且所述外源脂多糖来自弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)。

5.权利要求1或2的应用，其中所述基于蛋白体的组合物还包括药用稀释剂，赋形剂或稳定剂。

6.权利要求1或2的应用，其中所述基于蛋白体的组合物还包括药用载体。

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