KR20120112885A

KR20120112885A - 신경계 장애의 예방을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20120112885A
Application number: KR1020127024992A
Authority: KR
Inventors: 단 프렌켈; 루쓰 마론; 데이비드 버트; 하워드 엘 위너
Original assignee: 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.; 아이디 바이오메디컬 코포레이션 오브 퀘벡
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-27
Publication date: 2012-10-11
Also published as: NO20070460L; JP2008504299A; IL179933A; WO2006004749A2; CN101039691A; EP2332569A2; MA28975B1; SG153871A1; EP2332570A1; RU2010103240A; ES2432369T3; RU2007102698A; IL179933A0; JP2012041351A; AU2005259991B2; WO2006004749A3; KR20070048703A; MXPA06015096A; KR101347562B1; HK1101140A1

Abstract

유해한 단백질 응집, 비정상적 단백질 폴딩과 관련된 신경퇴행성 장애, 예를 들어, 뇌 아밀로겐 질환 및/또는 신경퇴행성 자가면역 장애를 포함하는 신경계 장애의 치료에 유용한 조성물이 기술된다. 상기 조성물의 사용방법도 또한 기술된다. 특히, 프로테오좀 및/또는 글라티라메르 아세테이트(여기서, GA는 서브마이크론 에멀젼 또는 나노에멀젼 중에 있다)를 사용하여 알쯔하이머병과 같은 신경퇴행성 장애 및 다발성 경화증과 같은 신경퇴행성 자가면역 장애를 치료하는 방법이 의도된다.

Description

신경계 장애의 예방을 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for prophylaxis of neurological disorders}

정부 지원 연구 및 개발하에 이루어진 발명의 권리에 관한 진술

본 발명은 보건복지부가 허가한 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 있어 특정 권리를 갖는다.

관련 출원에 관한 상호참조

본 출원은 2004년 6월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/582,999호[이는 충분히 설명된 것과 같이 전문이 본원에서 참조로 인용된다]를 우선권으로 주장한다.

유해한 단백질 응집, 비정상적 단백질 접힘(protein folding)과 관련된 신경퇴행성 장애 및/또는 신경퇴행성 자가면역 장애, 예를 들어, 뇌 아밀로겐 질환을 포함하는 신경계 장애의 치료에 유용한 조성물이 기술된다. 상기 조성물의 사용방법도 또한 기술된다.

신경계 질환은 일반적으로 중추신경계의 하나 이상의 영역의 뉴론 손실을 특징으로 한다. 신경계 질환의 예로는 알쯔하이머병, 신경섬유종증, 헌팅턴병, 우울증, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 졸중, 파킨슨병 및 다발경색 치매가 포함된다. 이들 질환은 기원 및 진행 측면 모두에서 복잡하며 치료가 가장 곤란한 질환 유형 중 일부인 것으로 입증되었다. 사실, 일부 신경계 질환에 있어 실질적 치료 이익을 제공하는 유효한 약물이 없다. 이들 질환이 피해자들에게 미치는 악질적 효과를 고려한다면 치료법 제공의 곤란함은 더욱 비극적이다.

알쯔하이머병(AD)은 임상적으로 기억, 인지, 추론, 판단 및 정서적 안정성의 진행성 손실을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 질환으로서, 심각한 정신적 황폐를 점차적으로 유도하고 결국에는 사망에 이르게 한다. AD는 노년층에서 진행성 정신 장애(치매)의 가장 통상적 원인이며 미국에서는 네번째로 가장 흔한 의학적 사망 원인인 것으로 사료되고 있다. AD는 전세계적으로 모든 인종 및 민족 그룹에서 관찰되었으며 현재와 미래의 주요한 공중 건강 문제로서 나타난다. 당해 질환은 현재 미국에서만 약 4백만명의 사람들이 앓는 것으로 추산된다. AD는 현재로서는 치유 불가능하다. 특정 치료제의 투여가 사람의 AD의 증상을 치료하는데 사용되어 왔다. 그러나, AD를 효과적으로 예방하거나 사람에서 이의 증상 또는 진행과정을 회복시키는 치료법은 현재 공지되어 있지 않다.

AD 환자의 뇌는 노인성 플라크로 지칭되는 특징적 병변 및 신경섬유원 농축제(neurofibrillary tangle)를 나타낸다. AD의 특징인 노인성 플라크는 세포외에 가장 빈번하게 국소화되는 반면, 신경섬유원 농축제는 세포내에 가장 빈번하게 국소화된다. 이들 병변의 대다수는 AD 환자에서 기억 및 인지 기능에 중요한 사람 뇌의 몇몇 영역에서 일반적으로 발견된다. 이들 병변의 보다 적은 수는 보다 제한된 해부학적 분포로 임상적 AD를 갖지 않는 노령층의 사람 뇌에서 때때로 발견된다. AD의 특징인 노인성 플라크 및 혈관 아밀로이드 침착물(아밀로이드 혈관병증)의 주된 화학적 구성성분은 아밀로이드-β 펩타이드(Aβ)로 지정된 단백질이며, 이는 βAP, AβP 또는 β/A4로도 지칭될 수 있다. Aβ를 함유하는 세포외 플라크는 조밀하거나 미만성일 수 있다. 조밀한 플라크는 흔히 섬유질 플라크로서 언급된다. Aβ는 문헌[참조: Glenner and Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:885-890]에서 최초로 정제되었으며 이의 부분적 아미노산 서열이 보고되어 있다. 분리 과정 및 처음 28개 아미노산에 대한 서열 데이타는 미국 특허 제4,666,829호에 기재되어 있다. 40개 초과의 아미노산을 갖는 Aβ 형태는 문헌[참조: Kang et al. (1987) Nature 325:733-736]에 의해 최초로 보고되었다.

신경병리학적으로, AD는 다양한 정도로 다음의 4가지 주요 병변을 특징으로 한다: a) 신경섬유원 농축제(NFT)의 뉴론내 세포질 침착, b) 신경염 플라크(neuritic plaque)으로 불리는 실질(parenchymal) 아밀로이드 침착물, c) 뇌혈관 Aβ 아밀로이드증(예: 아밀로이드 혈관병증) 및 d) 시냅스 및 뉴론 손실. AD의 주요 현상 중 하나는 세포외 신경염 플라크 및 대뇌 혈관벽 주변의 침착물을 야기하는 불용성 섬유질 덩어리로서의 아밀로이드(예: Aβ 펩타이드)의 침착(아밀로이드생성)이다. 신경염 플라크 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 주된 구성성분은 Aβ이지만, 이들 침착물은 글리코사미노글리칸 및 아포지단백질과 같은 다른 단백질을 함유할 수도 있다.

솔로몬 등[참조: Solomon, B. et al. (1997) PNAS 94(8) :4109-12]은 Aβ의 N-말단에 대한 모노클로날 항체가 선재하는 Aβ-펩타이드 집합체에 결합하여 이를 해체시키고/시키거나 시험관내 원섬유 응집을 방해하고 신경세포 배양물에 대한 독성을 방지할 수 있음을 제시하였다. 쉔크 등[참조: Schenk, D. et al., Nature 400(6740): 173-177 (1999)]은 아밀로이드-β 침착 및 알쯔하이머병-유사 신경병증에 대한 동물 모델로서 사용되는 PDAPP 유전자전이된(transgenic) 마우스에서 아밀로이드-β로의 면역화가 알쯔하이머병-유사 병리상태를 약화시켰음을 입증하였다. 이들은 알쯔하이머병-유사 신경병리상태의 발병 이전에 어린 동물의 면역화가 본질적으로 β-아밀로이드 플라크 형성, 신경염 위축 및 성상교세포증의 발생을 예방한 반면, 알쯔하이머병-유사 신경병리상태의 발병 후에 노령 동물의 치료는 이러한 신경병리상태의 정도 및 진행을 감소시킨 것으로 관찰되었음을 보고하였다. 말초로 투여된 Aβ에 대한 항체가 뇌의 실질 아밀로이드 부하량을 감소시킨 것으로 나타났기 때문에, 이러한 효과는 항체에 의해 매개된다[참조: Bard F. et al., (2000) Nat. Med. 6(8):916-9]. 또한, 갓 가용화된 Aβ1 내지 40으로의 비강내 면역화는 대뇌 아밀로이드 부하량을 감소시킨다[참조: Weiner, H.L. et al., (2000) Ann. Neuro. 48(4):567-79]. 동물 모델 시스템을 사용하여 모르간[참조: Morgan, D. et al., (2000) Nature 408(6815):982-5] 및 야뉴스[참조: Janus, C. et al., (2000) Nature 408(6815):979-82]에 의해 수행된 두 연구는 뇌 아밀로이드 침착물의 백신접종-유도된 감소가 인지력을 개선시켰음을 입증하였다. 문헌[참조: Dodart et al., (2002) Nat. Neuroscience 5(5):452-7 및 Kotilinek, L.A. et al., (2002) J. Neuroscience 22(15):6331-5]을 포함하여 추가의 연구는 동일한 논제의 각종 양상을 논의하였다. Aβ 백신접종이 AD의 동물 모델을 사용한 다양한 연구에서 몇몇 성공사례를 보여주었지만, 보조제(QS21) 중에 제형화된 Aβ 1-40/42 펩타이드로 면역화시키는 사람 임상 연구는 수막뇌염과 같은 부작용의 유해한 및/또는 허용되지 않는 높은 발생율 때문에 중단되었다. 따라서, AD 및 단백질 응집과 연관된 관련 신경퇴행성 장애에 대한 치료학적으로 허용되는 치료 및/또는 예방 방식이 요구된다.

자가면역 질환은 자체 또는 자가 조직에 대한 비정상적 면역반응을 특징으로 한다. 관련되는 면역반응(immune response 또는 immune reaction)의 유형에 근거하여, 포유동물의 자가면역 질환은 일반적으로 다음의 상이한 두 유형 중 하나로 분류될 수 있다: 세포 매개성(즉, T-세포 매개성) 또는 항체 매개성 질환. 다발성경화증(MS)은 T-세포 매개성 자가면역 질환이다[참조; Trapp et al. New Eng. J. Med. 338(5):278 (1998)]. 전세계적으로 1,000,000명을 넘는 30세 내지 40세의 청장년층이 MS를 앓고 있다. MS는 가장 흔한 중추신경계 질환이며 청장년층의 신경계 장애의 가장 흔한 원인이다. 병태생리학적으로, 순환성 자가반응 T 세포는 MS 환자에서 보여진 많은 중추신경계 파괴를 매개한다[참조: Rudick et al. New Eng. J. Med. 337:1604(1997)].

MS에서, T-세포는 중추신경계내 미엘린의 성분인 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 반응한다. MBP에 특이적인 활성화된 T-세포를 MS 환자로부터 분리할 수 있다는 증거는 MS는 T-세포가 자체 또는 자가 신경 조직을 파괴하는 자가면역질환이라는 주장을 뒷받침한다[참조: Allegretta et al. Science: 247: 778 (1990)].

MS는 통상적으로 특정 소염제 및 면역억제제로 치료되고 있으며, 이러한 제제로는 (i) 면역조절 효과 및 면역억제 효과를 둘다 갖는 코르티코스테로이드; (ii) 인터페론-β; (iii) 글라티라메르 아세테이트(glatiramer acetate; GA); (iv) 세포 매개성 및 체액성 면역 둘다를 약화시키는 푸린 유사체인 아자티오프린; (v) 정맥내 면역글로불린; (vi) 디하이드로폴레이트 리덕타제를 억제하고 세포 매개성 및 체액성 면역을 저하시키는 메토트렉세이트; (vii) 세포독성 효과 및 면역억제 효과를 갖는 알킬화제인 사이클로포스파미드; 및 (viii) T 세포 활성화를 억제함으로써 강력한 면역억제 효과를 갖는 사이클로스포린이 포함된다. 이러한 소염 약물 또는 면역억제 약물 치료에도 불구하고, 50%를 넘는 MS 환자들은 척수, 소뇌 및 대뇌 피질의 집중적 파괴의 결과로서 끊임없이 악화되고 있다.

MS를 치료하는데 통상적으로 사용되는 많은 약물들은 부분적으로는 현저한 세포독성 효과를 갖기 때문에 장기간 효능이 제한된다. 예를 들어, 연장된 사이클로포스파미드 치료는 탈모증, 메스꺼움, 구토, 출혈성 방광염, 백혈구감소증, 심근염, 불임증 및 폐 간질성 섬유증을 유발할 수 있다. 면역억제제 치료는 치료된 환자에서 "전체적(global)" 면역억제를 유도할 수 있으며, 이는 감염 위험을 상당히 증가시킨다. 장기간 전체적 면역억제된 환자는 악성종양, 신부전 및 당뇨병과 같은 치료에 의한 중증 의학 합병증이 발생할 위험이 증가된다.

MS 치료에 대한 대안적 접근법은 관련될 수 있는 T-세포 면역반응을 조절하기 위한 MBP의 정맥내 또는 경구 투여의 사용이다. MBP 또는 MBP의 면역우세 에피토프를 함유하는 이의 단편의 정맥내 투여는 클론 무력화(clonal anergy) 또는 T-세포 무반응을 유발하여 MBP에 특이적인 T-세포를 불활성화킴으로써 면역계를 억제한다. 최종 결과는 MBP-특이적 T 세포가 더이상 MBP에 반응하여 증식하지 못하는 것이다. T-세포의 증식 불능은 신경 조직의 T-세포 매개성 파괴를 감소시킨다.

MS를 치료하는데 사용되는 MBP의 면역화학 유사체는 글라티라메르 아세테이트(GA) 또는 공중합체-1(COP-1)[참조: 미국 특허 제3,849,550호; PCT 출원 제WO/95/31990호]이다. 시판 형태의 GA는 L-알라닌, L-글루탐산, L-라이신 및 L-티로신으로 6.0:1.9:4.7:1.0 몰비로 이루어진 랜덤 합성 폴리펩타이드의 혼합물이다. 이는 처음에 MBP의 면역화학 모사체로서 합성되었다. 예를 들어, GA에 대한 특정 모노클로날 항체는 MBP와 교차반응한다[참조: Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9258 (1991)]. 또한, GA는 MBP에 특이적인 T 억제인자 세포를 유도하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lando et al. J. Immunol. 123:2156 (1979)]. 마우스 실험은 GA가 또한, 실험 알레르기 뇌척수염(EAE)에서 중추신경계 조직의 파괴에 관여하는 MBP-특이적 T 세포를 특이적으로 억제함을 나타낸다[참조: Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. USA 85:9724 (1995)].

GA의 투여는: (i) NK 세포의 비율을 증가시킬 수 있고; (ii) 혈청 IL-2 수용체를 감소시킬 수 있으며; (iii) TNF-α를 억제할 수 있고; (iv) TGF-β 및 IL-4를 증가시킬 수 있다[참조: Ariel et al. Multiple Sclerosis 3(5), S053 (1997)].

MS 환자가 비경구 투여된 GA로 비교적 성공적으로 치료되었으나[참조: Bornstein et al. Transactions American Neurological Association, 348 (1987)], 현행 치료 요법 및 전반적 효과가 개선될 수 있다.

상기 문헌의 인용은 어떠한 상기 기술내용이라도 해당 선행 기술임을 인정하기 위함이 아니다. 날짜에 대한 모든 진술 또는 이들 문헌의 내용에 관한 설명은 본 출원인의 이용가능한 정보에 기초하며, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 관한 어떠한 허용도 구성하지 않는다.

발명의 개요

본 발명은 신경계 질환 또는 장애의 치료가 필요한 포유동물에서 신경계 질환 또는 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 신경계 질환 또는 장애는 단백질 또는 단백질성 물질의 전신 또는 국소 침착(예: 아밀로이드증), 유해한 단백질 응집(단백질의 잘못접힘(misfolding)) 및/또는 신경퇴행성 자가면역과 관련될 수 있다. 아밀로이드형성 질환, 예를 들면, 알쯔하이머병, 및/또는 프리온 관련 질환, 헌팅턴병, 파킨슨병 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 포함하는 기타 뇌 아밀로겐 질환이 특히 관심대상이다[참조: Revesz, T. et al. (2003) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62(9):885-98]. 상기 아밀로이드 관련 질환의 치료는 새로운 아밀로이드 플라크(침착) 형성의 예방, 현재 아밀로이드 플라크 수준의 유지 및/또는 전체 아밀로이드 부하량(가용성 및 비-가용성 Aβ)을 측정하여 측정된 기존의 아밀로이드 플라크 또는 전체 뇌 아밀로이드 단백질(플라크로 침착되지 않을 수 있는 Aβ를 포함) 양 또는 원섬유 Aβ-아밀로이드 부하량의 감소를 포함할 수 있다. 이러한 신경계 질환 또는 장애는 다발성 경화증과 같은 세포 매개성 자가면역 질환과 관련될 수 있다. 이러한 자가면역 질환의 치료는 자가반응 T 세포 형성의 방지, 현재 자가반응 T 세포 농도의 유지 및/또는 자가반응 T 세포의 농도의 감소를 포함할 수 있다.

본 발명은 Aβ 플라크 관련 질환 또는 장애 및 세포 매개성 자가면역 질환 또는 장애를 포함하는 포유동물의 신경계 질환 또는 장애 치료용 치료제로서, 프로테오좀(proteosome)계 조성물 및/또는 임의로 서브마이크론 에멀젼 또는 나노에멀젼 중의 GA 조성물의 각종 제형을 청구하고 사용한다.

도 1: 뇌 속의 전체 Aβ 수준에 대한 피하 면역화의 효과. 아밀로이드 부하량을 정량하기 위해, 우측 반구를 실온에서 3시간 동안 5.0 M 구아니디늄-클로라이드(pH 8)로 추출하였다. 희석액을 사용하여 샌드위치 효소면역 측정법(ELISA)으로 Aβ40 및 Aβ42의 수준을 측정하였다 .
도 2: 뇌 속의 전체 Aβ수준에 대한 비강 면역화의 효과. 샌드위치 효소면역 측정법(ELISA)으로 측정한, 비강 치료 후 개개 마우스로부터의 Aβ40과 Aβ42의 전체 Aβ 농도 수준.
도 3: CD11b+ 세포의 활성화는 비경구 및 비강 치료된 마우스에서 Aβ 원섬유의 제거를 유도하였다. (A) 피하 면역화 후, 티오플라빈-S로의 해마 영역내 Aβ 원섬유의 염색(배율 x10) 또는 항 Aβ 항체(R1288) 및 항-CD11b(미세아교세포/대식세포)과의 전체 Aβ의 공동 염색(배율 x40). (B) 비강 면역화 후 (해마 영역내)(배율 x40) 항 Aβ 항체(R1288) 및 항-CD11b(미세아교세포/대식세포)과의 공동염색.
도 4: MOG 피하 면역화 및 비강 글라티라메르 아세테이트 백신접종 후의 뇌 절편의 면역조직학. 미처리된 마우스 또는 면역화한지 50일 후의 면역화된 마우스로부터의 해마 영역의 일련의 절편을 항 CD11b, CD3, IFN-γ및 TGF-β항체를 사용하여 표지하였다(배율 x20, 삽입 도면 배율 x60).
도 5: GA+IVX-908 비강 투여 후 성상교세포증의 감소. 활성화된 성상교세포의 정량을 위해, GFAP 염색을 사용하여 잘 한정된 해마 영역(브레그마 -1.44mm)을 선별하였다. 성상교세포 활성화의 수준을 mm² 해마 영역당 백분율로서 표시하였다; p=0.039 GA+IVX-908 대 대조군; EAE(MOG) 대비 p=0.02 .
도 6: MOG 피하 면역화 및 비강 글라티라메르 아세테이트 백신접종 후의 뇌 절편의 신경병리상태. 미처리된 마우스 또는 면역화한지 50일 후의 처리된 마우스로부터의 피질 영역의 일련의 절편을 신경독성 마커를 사용하여 표지하였다: SMI32, TUNEL 및 iNOS(원 배율 x20). 화살표는 연구된 마커에 대한 표지화를 표시한 것이다. 신경독성 마커에 대한 표지화는 EAE 동물에서는 관찰되었지만, GA-IVX-908 처리된 동물에서는 관찰되지 않았다.
도 7: MOG 피하 면역화 및 비강 글라티라메르 아세테이트 백신접종 후의 해마 절편의 혈뇌 장벽 완전성. 미처리된 마우스 또는 면역화한지 50일 후의 처리된 마우스로부터의 피질 영역의 일련의 절편을 혈장 염색-피브리노겐 마커를 사용하여 표지하였다. 피브리노겐 마커에 대한 표지화는 EAE 동물에서는 관찰되었지만, GA-IVX-908 처리된 동물에서는 관찰되지 않았다(배율 x20, 작은 도면 배율 x40).
도 8: MOG 피하 면역화 및 비강 글라티라메르 아세테이트 백신접종 후의 후각망울 절편의 신경병리상태. 미처리된 마우스 또는 면역화한지 50일 후의 처리된 마우스로부터의 피질 영역의 일련의 절편을 원섬유 아밀로이드 마커를 사용하여 표지하였다: ThS, 미세아교세포 활성화 CD11b, BBB 완전성, 피브리노겐(배율 x20).
도 9: 미처리되고, MOG 면역화되고 GA+IVX-908 처리된 마우스의 CNS내 CD68+ 세포에 대한 염색. 화살표는 EAE에서는 CNS로 침윤되지만 GA+IVX-908 처리된 마우스에서는 맥락막총으로 국소화된 상태를 유지하는 CD68+ 세포를 표시한 것이다. 미처리된 마우스에서 염색은 관찰되지 않았다. 소뇌로부터 절편을 취하였다(배율 x20).
"신경계 질환"은 신경계의 신경 세포와 관련되는 질환 또는 장애를 지칭한다. 구체적으로는, 프리온 질환(예; 크레이츠펠트-야콥병); 발달중인 뇌의 병리상태(예: 아미노산 대사의 선천적 결함, 예를 들어, 아르기닌석신산뇨증, 시스타티오닌뇨증, 히스티딘뇨증, 호모시스틴뇨증, 고암모니아혈증, 페닐케톤뇨증, 티로신뇨증 및 유약 X 증후군); 성숙한 뇌의 병리상태(예: 신경섬유종증, 헌팅턴병, 우울증, 근위축성 측삭 경화증, 다발성경화증); 성인기에 발병하는 상태(예: 알쯔하이머병, 크레이츠펠트-야콥병, 루이 소체(Lewy body)병, 파킨슨병, 피크병); 및 뇌의 기타 병리상태(예: 뇌의 부상, 뇌 손상, 혼수, 각종 병원체에 의한 감염, 식이 결핍, 졸중, 다발경색치매 및 심혈관 사고)가 포함된다.
본 발명의 바람직한 질환 또는 장애는 성숙한 뇌에 걸리는 질환, 예를들어, 다발성 경화증 및 전형적으로 성인기에 발병하는 질환, 예를 들어, 알쯔하이머병이다.
본원에서 AD로 약칭되는 "알쯔하이머병"이란 용어는 중추신경계의 신경퇴행성 질환을 지칭한다. 대체로 말하면, 상기 질환은 다음 2가지 카테고리에 속한다: 고령(전형적으로 65세 이상)에서 발생하는 후기 발병 및 노년기 전, 예를 들면, 35세 내지 60세에 발생하는 조기 발병. 이들 두 질환 유형에서, 병리상태는 유사하지만, 이른 연령에서 시작된 경우에 장애는 더욱 중증이고 확산되는 경향이 있다. AD는 세포외에 국소화된 뇌 아밀로이드(예: Aβ 펩타이드), 아밀로이드 플라크(조밀 또는 미만성으로 추가 구별될 수 있음) 및 해마 및 피질과 같은 뇌의 특정한 취약 영역에 집중된, 세포내에 국소화된 신경섬유원 농축제를 특징으로 한다. AD는 노인성 치매를 야기하는 진행성 질환이다. 아밀로이드 플라크는 뇌 조직 단면의 현미경 분석으로 가시화될 수 있는 중심의 세포외 아밀로이드-베타(Aβ) 침착물과 최대 150mm 교차되는 호중구와 관련될 수 있다. 신경섬유원 농축제는 쌍을 이루어 서로 꼬여있는 2개의 필라멘트로 이루어진 tau 단백질(흔히 과인산화되어 있음)의 세포내 침착물이다. AD는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 변경된 단백분해성 프로세싱으로부터 초래되는 Aβ 펩타이드의 비정상적 축적과 관련된다. Aβ 펩타이드의 비정상적 축적은 상염색체 우성 APP 돌연변이 및 프레세닐린 1(PS1) 및 프레세닐린 2(PS2)로 언급되는 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이와 같은 다양한 돌연변이와 상관관계가 있으며, 이는 후속적으로 γ(감마) 또는 β(베타) 세크레타제의 단백분해 활성에 영향을 주어서 예를 들어 Aβ1-42의 수준을 증가시키며, 반면, α(알파) 세크레타제의 단백분해 활성은 아마 APP의 정상적 프로세싱과 관련될 것이다. 비정상적 위축성 신경돌기와 관련된 신경염 플라크를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 플라크 유형이 AD에서 발견된다. 또한, 당해 질환의 특징은 활성화된 미세아교세포 및 성상교세포를 포함하는 CNS에서의 염증 반응의 존재이다. 신경계 장애와 관련된 기능장애 단백질(예: Aβ 및 프리온 단백질)의 응집체의 축적은 특정 신경계 장애를 유발하거나 이의 발생에 기여하거나 또는 영향을 주는 것으로 사료된다[참조: Ingelsson, M. and Hyman B.T. (2002) Annals of Med. 34:259-271]. 유해 단백질 응집과 관련된 신경퇴행성 장애로는 알쯔하이머병, 피크병, 파킨슨병, 프리온병, 헌팅턴병 및 운동뉴론 장애가 포함된다[참조: Shastry, Neurochemistry International, 2002, 43: 1-7].
"아밀로이드"란 용어는 단백질 응집체의 세포외(예: Aβ, 프리온병 및 다발성 골수종 경쇄 질환) 또는 세포내(예: AD에서의 tau 단백질의 신경섬유원 농축제 및 파킨슨병에서의 알파-시뉴클레인) 침착을 지칭한다[참조: Trojanowski J.Q. and Mathson M.P. (2003) Neuromolecular Medicine 4:1-5]. 아밀로이드 침착은 AD 및 다운증후군 환자의 뇌 뿐만 아니라, 중추신경계의 동맥, 세동맥, 모세혈관 및 정맥에서 발견될 수 있다. 아밀로이드 침착물은 콩고 레드 및 티오플라빈 S와 같은 뇌 염료에 결합하여 가교 β-플리티드 쉬트(β-pleated sheet) 입체형태를 포함하는 원섬유를 형성하는 능력으로 식별할 수 있다.
"아밀로이드증"이란 용어는 단백질 응집체를 포함하여 잘못 폴딩된 단백질일 수 있는, 정상적으로는 가용성인 단백질의 이상 불용성 침착물을 특징으로 하는 장애의 큰 이종(異種) 그룹을 지칭한다.
알쯔하이머병(AD), 조기 발병 알쯔하이머병, 후기 발병 알쯔하이머병, 및 증상발현전 알쯔하이머병 이외에, 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 기타 질환, 예를 들어, 혈청 아밀로이드 A(SAA) 아밀로이드증, 유전성 아이슬랜드 증후군, 다발성 골수종, 프리온병 등 또는 기타 뇌 아밀로겐 질환[참조: Revesz, T. et al. (2003) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62(9):885-98]이 본원에서 제시하는 조성물에 따라서 치료될 수 있다. 동물에서 가장 흔한 프리온병은 양 및 염소의 스크래피 및 소의 해면상뇌증(BSE)이다[참조: Wilesmith and Wells(1991) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 172:22-38]. 사람에서는 4가지 프리온병이 확인되었다: (i) 쿠루병, (ii) 크레이츠펠트-야콥병(CJD), (iii) 게르츠만-스트러슬러-샤인커병(Gerstmann-Streussler-Sheinker)병(GSS) 및 (iv) 치명적 가족성 불면증(FFI)[참조: Gajdusek, D.C. (1977) Science 197(4307):943-60 and Medori, R. et al., (1992) N. Engl. J. Med. 326(7):444-9].
노인성 플라크의 주요 성분은 Aβ 펩타이드이다. Aβ 펩타이드는 전구체 단백질 APP의 39 내지 43개 아미노산의 내부 단편이다. APP 단백질 내의 몇가지 돌연변이는 알쯔하이머병의 존재와 상관관계가 있었다[참조: Goate, A. et al., (1991) Nature 349(6311):704-6, Murrell, M. et al., (1991) Science 254(5028):97-9, Mullan, M. et al., (1992) Nat. Genet. 1(5):345-7].
본원에서 사용되는 "β-아밀로이드 전구체 단백질"(APP)은 사람에서 21번 염색체의 긴 암(arm)상에 위치하는 동일한 명칭의 유전자에 의해 암호화되고 세번째 카복실내에 Aβ를 포함하는 폴리펩타이드로서 정의된다. APP는 많은 포유동물 조직내의 광범위한 세포에서 발현되는 글리코실화된 단일-막-스패닝(spanning) 단백질이다.
APP 돌연변이는 APP의 Aβ로의 단백분해성 프로세싱, 특히 APP의 증가된 양의 Aβ의 장형(즉, Aβ1-42 및 Aβ1-43)으로의 프로세싱이 증가되거나 변경됨으로써 알쯔하이머병의 발생에 영향을 주는 것으로 사료된다. 다른 유전자, 예를 들어, 프레세닐린 유전자 PS1 및 PS2의 돌연변이는 APP의 단백분해성 프로세싱에 영향을 주어 증가된 양의 장형 Aβ을 생성하는 것으로 사료된다[참조: Hardy, J. (1997) Trends Neurosci. 20(4): 154-9]. 이러한 관찰은 Aβ 및 특히 이의 장형이 알쯔하이머병의 원인 요소임을 가리킨다.
본원에서 사용되는 "APP 단편"이란 용어는 오직 Aβ 또는 Aβ 단편으로만 이루어진 APP 이외의 APP의 단편을 지칭한다. 즉, APP 단편은 온전한 Aβ 또는 Aβ의 단편을 형성하는 APP의 아미노산 서열 이외의 APP의 아미노산 서열을 포함할 것이다.
"베타-아밀로이드 펩타이드"는 "β-아밀로이드 펩타이드", "βAP", "βA" 및 "Aβ"와 동의어이다. 이들 용어는 모두 아밀로이드 전구체 단백질의 단편으로부터 유래된 플라크 형성 펩타이드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 원섬유 Aβ 및 전체 Aβ의 정의는 다음과 같다. "원섬유" Aβ는 Aβ 플라크 또는 플라그로서 지칭될 수도 있는 세포외 아밀로이드 침착물내에 함유된 Aβ 펩타이드이다; 일부 경우에, Aβ 플라크는 미만성 또는 조밀한 것으로 추가 구별될 수 있다. "전체" 아밀로이드 부하량 또는 전체 Aβ 부하량은 대부분이 세포외에 있는 것으로 추정되는 가용성 및 비-가용성(예: 원섬유) Aβ 펩타이드의 합계이다. 가용성 Aβ와 비-가용성 Aβ 사이에 역학적 관련성이 있을 것으로 이해되며, 여기서 세포외 비-원섬유 Aβ는 원섬유 아밀로이드가 될 수 있는 Aβ의 공급원을 대표할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 '실험 알레르기 뇌척수염(EAE)'은 MS에 대한 주요 동물 모델이다. EAE는 소형 포유동물에서 적절한 보조제 중의 MBP로의 면역화에 의해 또는 MBP-반응성 T-세포인 CD4+의 수동 전달에 의해 용이하게 유도할 수 있다[참조: Alvord Jr, E.C., et al. eds. in Experimental Allergic Encephalomyelitis a Useful Model for Multiple Sclerosis, A. R. Liss, N.Y., 1984; Makhtarian et al. Nature 309: 356 (1984); Ben-Nun et al. J. Immunol. 129:303 (1982)]. 마우스 및 랫트 둘다에서 EAE를 유도하는 T-세포는 제II형 주조직적합 복합체(MHC) 분자상의 항원-제시 세포에 의해 제시된 MBP의 면역우세 영역에 상응하는 펩타이드를 인식한다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 포유동물에서 신경계 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 측면의 방법은 치료학적 유효량의 GA 및 프로테오좀계 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여함으로써 효과적으로 실시될 수 있다. 본 발명의 추가의 측면에서 상기 신경계 질환 또는 장애는 아밀로이드 플라크-형성 질환 또는 장애이다. 본 발명의 한 측면에 따른 GA 및 프로테오좀계 조성물로 치료되는 가장 중요한 신경계 질환 또는 장애는 알쯔하이머병 및 다발성 경화증이다. 상기한 신경계 질환 또는 장애의 치료를 위한 프로테오좀과 배합된 GA의 치료학적 조성물 이외에, 추가의 양태는 치료를 위해 다음의 치료학적 조성물을 사용함을 포함하나 이에 제한되지 않는다: GA 조성물을 함유하지 않는 프로테오좀계 조성물, 서브마이크론 에멀젼 조성물 중의 GA 또는 나노에멀젼 조성물 중의 GA. 상기 양태는 임의의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 안정화제 또는 담체를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서 상기 신경계 질환 또는 장애의 치료는 포유동물에서 항체 비의존성 반응을 유도하는 치료학적 유효량의 GA 및 프로테오좀계 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 알쯔하이머병일 수 있는 아밀로이드 질환의 치료방법으로 이루어진다. 아밀로이드 질환의 치료는 예를 들어, 원섬유 아밀로이드 부하량의 증가를 방지하거나, 전체 아밀로이드 부하량의 증가를 방지하거나, 현재의 원섬유 및/또는 전체 아밀로이드 부하량을 유지하거나, 뇌내의 원섬유 및/또는 전체 아밀로이드 부하량을 감소시킴으로써 수행할 수 있다. 아밀로이드 단백질이 신체 전체에 존재할 수 있다는 것이 공지되어 있기 때문에, 본 발명의 양태는 뇌 아밀로이드로 제한되지 않는다. 추가로, 본 발명이 β-아밀로이드를 구체적으로 논의하지만, 혈청 아밀로이드 A(SAA), 프리온 질환, 유전성 아이슬랜드 증후군, 헌팅턴병, 파킨슨병, 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증과 같은 다른 아밀로이드 부류가 본 발명의 범주내에서 고려된다. 상기한 아밀로이드 질환에 따라서, 치료는 다음의 치료학적 조성물 중 하나를 투여함으로써 달성될 수 있다: 치료학적 유효량의 GA 및 프로테오좀계 조성물, GA 조성물을 함유하지 않는 프로테오좀계 조성물, 서브마이크론 에멀젼 중의 GA 및/또는 나노에멀젼 중의 GA. 상기 양태는 임의의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 안정화제 또는 담체를 또한 포함할 수 있다.
글라티라메르 아세테이트
다발성 경화증(MS)를 치료하는데 효과적인 MBP의 면역화학 유사체는 글라티라메르 아세테이트(GA) 또는 공중합체-1(Cop-1)이다[참조: 미국 특허 제3,849,550호; PCT 출원 제WO/95/31990호]. 시판 형태의 GA는 L-알라닌, L-글루탐산, L-라이신 및 L-티로신으로 6.0:1.9:4.7:1.0 몰비로 구성된 랜덤 합성 폴리펩타이드의 혼합물이다. 이는 처음에 MBP의 면역화학 모사체로서 합성되었다. 예를 들어, GA에 대한 특정 모노클로날 항체는 MBP와 교차반응한다[참조: Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9258 (1991)]. 또한, GA는 MBP에 특이적인 T 억제인자 세포를 유도하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lando et al. J. Immunol. 123:2156 (1979)]. 마우스 실험은 GA가 또한, EAE에서 중추신경계 조직의 파괴에 관여하는 MBP-특이적 T 세포를 특이적으로 억제함을 나타내고[참조: Teitelbaum et al. Proc. Natl. Acad. USA 85:9724 (1995); and Angelov, D.N. et al. PNAS 100(8):4790-4795 (2003)], GA를 사용하여 근위축성 측삭 경화증을 치료할 수 있음을 나타내고, 조절된 자가면역 반응의 유도는 GA의 투여에 의해 증진될 수 있는, 항-자가 T-세포 반응의 존재하에 생존에 영향을 주는 것으로 보인다.
GA는 본 발명에 따라서 당해 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, GA는 미국 특허 제3,849,550호에 개시된 방법으로 제조할 수 있으며, 이 방법에서는 티로신, 알라닌, γ-벤질 글루타메이트 및 ε-N-트리플루오로-아세틸라이신의 N-카복시무수물 주위 온도에서 무수 디옥산 중에서 디에틸아민을 억제제로서 시용하여 중합한다. 글루탐산의 γ-카복실 그룹의 탈차단은 빙초산 중에서 브롬화수소로 수행하고 이어서 1M 피페리딘에 의해 라이신 잔기로부터 트리플루오르아세틸 그룹을 제거한다. 수득된 폴리펩타이드의 혼합물은 필수적으로 알라닌, 글루탐산, 라이신 및 티로신으로 약 6:2:5:1의 몰비로 이루어진다.
GA는 또한 제조원[Teva Pharmaceuticals, Kfar-Saba, Israel]으로부터 시판되고 있다.
GA는 본 발명의 따른 용도를 위해 이의 치료학적 유용성을 유지하는 어떠한 형태로도 제조할 수 있다. 이러한 형태에는 각종 분자량 범위를 갖는 펩타이드들의 혼합물이 포함된다. 목적하는 분자량 범위를 갖는 GA는 당해 분야에 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 이러한 방법에는 WO 95/31990에 개시된 바와 같은, 고분자량 화학종을 제거하기 위한 겔 여과 고압 액체 크로마토그래피가 포함된다. 하나의 양태에서, GA는 약 2KDa 내지 약 20KDa의 분자량 범위 내의 이의 중합체 종의 약 75%를 갖는다. 다른 양태에서, GA는 평균 분자량이 약 4KDa 내지 9KDa이다. GA는 공지된 방법에 따른 통상의 GA와 상이한 길이의 또는 이로부터 변형된 중합체 화학종을 포함하도록 효소 분해되거나 또는 다르게 분해될 수 있는 것으로 이해되고 있다.
GA 및 프로테오좀
프로테오좀(예: IVX-908 또는 프로톨린(Protollin))과 함께 제형화된 GA는 예를 들어, 주사에 의해 또는 비강내로 투여될 수 있다. 주사에 의해 전달되는 경우, 이러한 전달은 1회 주사(조합된 동시 투여)일 수 있다. 또는, GA 조성물 및 프로테오좀계 조성물의 전달은, 다수 부위에서 동시에 일어날 수 있는 주사에 의해 또는 한 부위에 오직 GA 조성물(즉, 프로테오좀 비함유)만을 투여하고 두번째 부위에 오직 프로테오좀계 조성물(즉, GA 비함유)만을 투여하는 일시적으로 개별적인 횟수의 주사에 의해 달성할 수 있다. GA를 주사로 투여하면서, 이와 동시에 또는 상이한 시점에 프로테오좀계 조성물을 예를 들어 비강내로 투여할 수 있는 것도 의도된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양태에서, GA 조성물은 주사에 의해 전달되고, 별도로 프로테오좀계 조성물은 비강내로 투여된다.
본 발명의 GA 펩타이드는 또한 프로테오좀과의 비공유 결합을 증진시킬 것으로 예측되는 소수성 앵커(anchor) 서열 잔기를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구 투여용 또는 전신 및 점막 항체 반응을 유도하는 위장관 투여를 포함하는 점막 투여용으로 고안된 프로테오좀-양쪽성 결정인자 백신의 생산 및 제조는 미국 특허 제6,476,201호에 논의되어 있다. 양쪽성 결정인자는 프로테오좀과 적절히 제형화되는 경우에 프로테오좀과 연합하여 피험체에서 면역반응을 유도하는 복합체를 형성하는, 소수성 및 친수성 영역을 갖는 분자이다. 전형적 양쪽성 결정인자로는 당지질, 지질당류(해독된 지질다당류를 포함), 지질펩타이드, 트랜스막 도메인, 외피(envelope) 또는 변성독소화(toxoided) 단백질 또는 내재적 소수성 아미노산 앵커를 갖는 단백질 또는 펩타이드가 포함된다.
에멀젼 조성물
GA는 각각 미국 특허 제5,961,970호 또는 제5,716,637호에 기재된 서브마이크론 에멀젼 또는 나노에멀젼 중에서 투여되거나 이와 제형화될 수 있다. 당해 조성물은 약 0.5 내지 약 50%의 오일, 약 0.1 내지 약 10%의 유화제, 약 0.05 내지 약 5%의 비이온성 계면활성제 및 수성 연속 상으로서 약 0.00001 내지 약 1.0%의 GA를 함유한 수중유 서브마이크론 에멀젼을 포함한다. 서브마이크론 에멀젼의 평균 액적 크기는 약 0.03 내지 약 0.5㎛ 및 바람직하게는 0.05 내지 0.2㎛의 범위이다.
나노에멀젼 접근법은 하나 이상의 인지질 2층으로 둘러싸인 지질 코어를 갖는 입자의 나노에멀젼을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 입자의 평균 직경은 중량을 기준으로 측정된 바에 따라 약 10 내지 약 250nm이며, GA는 본질적으로 균질화 공정 전에 또는 비본질적으로 균질화 공정 후에 혼입된다. 입자는 전형적으로 수성 연속 상 중에 현탁되고 각각의 지질 입자는 지질이 약 25℃ 이상의 온도에서 대량의 고체 또는 액체 결정인 지질 코어를 포함한다. 일반적으로, 포획된 GA의 양은 약 0.001 내지 약 5%이다. 또는, GA는 프로테오좀과 제형화될 수 있고/있거나, 나노에멀젼은 생접착성 또는 점막접착성 거대분자를 추가로 포함할 수 있다.
제안된 기작
본 발명은 또한 예를 들어, 포유동물을 프로테오좀계 조성물과 제형화된 GA 또는 GA를 함유하지 않는 프로테오좀계 조성물로 면역화시킴을 포함하는, 아밀로이드-β 펩타이드(가용성 및/또는 비-가용성), 이의 단편 또는 유도체를 억제하거나 감소시키는 방법을 포함하며, 당해 방법에서 상기 펩타이드, 이의 단편 또는 유도체의 감소 또는 억제는, 항체 반응을 유도할 수 없는 B-세포 결핍(μMT) 마우스를 사용하여 본원에서 입증된 바와 같이, 항체를 생성시키지 않으면서 일어난다. 이론으로 국한시키고자 함은 아니나, 바람직하게는, 아밀로이드(예: Aβ 펩타이드)의 억제 또는 감소는 뇌 국소화된 미세아교세포 또는 뇌 또는 말초에서 발견될 수 있는 호중구 및/또는 대식세포와 같은 면역 세포의 활성화를 통해 일어나며, 여기서, 이들 세포의 활성화는 임의의 항체 또는 항원-특이적 기작과는 무관하다. 포유동물에서 실험 알레르기 뇌척수염(EAE)(수막뇌염을 포함)을 발생시키지 않으면서 감소 또는 활성화가 일어나는 것이 가장 바람직하다.
아밀로이드 부하량(예: 원섬유 플라크와 플라크로 침착되지 않을 수 있는 비-원섬유 Aβ를 포함하는 Aβ)의 감소는 아밀로이드 침착 및/또는 Aβ 플라크 형성의 감소 및 이에 따른 AD 및 관련 질환 또는 아밀로이드형성 질환 또는 장애의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 각종 양상이 임의의 특정 이론 또는 기작으로 제한되지 않아야 하나, 활성화된 미세아교세포는 아밀로이드 플라크와 공동국소화되고 미세아교세포의 활성화는 아밀로이드 침착의 존재에 의존하고, 이러한 침착은 활성화를 위해 내인성 미세아교세포를 사전자극시키는 것으로 사료된다. 따라서, 활성화된 미세아교세포는 아밀로이드(예: Aβ 플라크) 침착물을 제거하는데 참여한다. 가능한 AD 기작에 관한 추가의 정보는 문헌[참조: Schenk, D. (2002) Nature 3:824-828]에서 확인된다. Aβ의 침착 및 아밀로이드 플라크의 형성은 복합적 염증 및 신경독성 캐스케이드(cascade)와 동반되는 것으로 보인다. 따라서, 치료의 소염 기작이 유리할 수 있는 것으로 사료된다. 이러한 소염 과정은 흔히 소염성 IL-4/IL-10 (Th2) 및 TGF-β(Th3) 면역반응의 발현과 양립한다. 따라서, 프로테오좀이 염증촉진성(pro-inflammatory) 면역반응과 관련된 Th1형 면역(사이토킨) 반응의 자극과 보다 빈번하게 관련되고 Th2 면역반응과 동격일 수 있고 이와 별개라는 것이 이미 제안된 바 있기 때문에, 프로테오좀계 조성물 및 GA를 포함하는 당해 조성물이 Aβ-아밀로이드 함유 플라크의 감소를 유발하는 비-항체 매개성 면역반응을 자극한다는 것은 놀랍고도 예측하지 못한 발견이다. 그럼에도 불구하고, Th1형 사이토킨 INF-감마(75% 초과의 미처리)에 의한 미세아교세포 포식작용(phagocytosis)의 증대는 CNS에서 염증성 침윤물의 가속화된 제거에 대한 피드백 기작을 시사할 수도 있다[참조: Cha, A. et. al. (2001) GLIA 33(1):87- 1.0 95]. 게다가, INF-감마 자체가 베타-아밀로이드 전구체 단백질의 전사 억제를 유도할 수도 있다[참조: Ringheeim G. E. et al. Biochem Biophys Res Commun (1996) 224(1):246-51].
프로테오좀계 조성물
미국 특허 제6,476,201호 및 제5,961,970호의 목적은 다가 서브유닛 백신이 각각의 성분에 대한 최적의 면역반응을 자극하기 위해, 어떻게 적절한 성분들이 적절하게 연합되어야 하고, 면역계가 어떻게 각각의 성분들을 이용하여 이들 성분이 면역계에 의해 효과적으로 인식되고 프로세싱되는지를 기술하고 있다. 이러한 인식 및 프로세싱은 예를 들어, 비강 상피 내부에 위치한 막성 세포(M-세포)에 의한 흡수 및 숙주 면역계의 기저 세포로의 후속적 전달을 포함할 수 있다. 이러한 비공유 복합체화된 백신의 주요한 예로는, 펩타이드, 지질펩타이드, 트랜스막 또는 변성독소화 단백질, 다당류 또는 지질다당류(LPS)을 포함하는 광범위한 항원과 비공유적으로 복합체화된 나이세리아(Neisseria) 외막 단백질로 이루어질 수 있는 프로테오좀계 백신이다[추가의 검토를 위해 다음 문헌을 참조한다: 미국 특허 제5,726,292호, Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigella flexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in Animal Models; Infect. Immun. 61:2390; Mallett, C. P., T. L. Hale, R. Kaminski, T. Larsen, N. Orr, D. Cohen, and G. H. Lowell. (1995); Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigella lipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model of 30 shigellosis (Infect. Immun. 63:2382-2386; Lowell G H, Kaminski R W, Grate S et al. (1996)); Intranasal and intramuscular proteosome-staphylococcal enterotoxin B (SEB) toxoid vaccines: immunogenicity and efficacy against lethal SEB intoxication in mice (Infec. Immun. 64:1706-1713; Lowell, G. H. (1990)); Proteosomes, Hydrophobic Anchors, Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and Protein Vaccines, (in New Generation Vaccines: G. C. Woodrow and M. M. Levine, eds. (Marcel Dekker, NY) Chapter 12 (pp. 141-160)); and Proteosome-lipopeptide vaccines: enhancement of immunogenicity for malaria CS peptides; (Lowell, G. H., W. R. Ballou, L. F. Smith, R. A. Wirtz, W. D. Zollinger and W. T. Hockmeyer (1988) Science 240:800)].
본원에서 사용되는 프로테오좀계 조성물은 나이세리아 종과 같은 그램-음성 세균의 외막 단백질(OMP, 포린으로도 공지됨)[참조: Lowell et al., J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lowell et al., Science 240:800, 1988; Lynch et al., Biophys. J. 45:104, 1984; Lowell, in "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, pages 193, 1997; 미국 특허 제5,726,292호; 미국 특허 제4,707,543호]의 제제를 지칭하며, 이는 세균 또는 바이러스 항원과 같은 면역원에 대한 담체 또는 보조제로서 유용하다. 상기한 바와 같이 제조된 프로테오좀은 OMP 포린을 제조하는데 사용된 세균(예: 나이세리아 종)으로부터 기원하는 내인성 지질다당류(LPS)을 또한 함유한다. 하나 이상의 OMP의 다중-분자 구조 또는 용융 구형 OMP 조성물을 포함하는, 소포 또는 소포 유사 형태의 외막 단백질 성분을 생성시키는 임의의 제조방법이 프로테오좀의 정의내에 포함된다.
본원에서 사용되는 "지질당류"는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 또는 플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides)와 같은 그램-음성 세균 또는 기타 그램-음성 세균(알칼리게네스(Alcaligenes), 박테로이데스(Bacteroides), 보르데텔라(Bordetella), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 시트로박터(Citrobacter), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 에를리카(Ehrlicha), 엔테로박터(Enterobacter), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 푸소박테리움(Fusobacterium), 가드네렐라(Gardnerella), 헤모필루스(Hemophillus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 모락셀라(Moraxella), 모르가넬라(Morganella), 나이세리아, 파스퇴렐라(Pasteurella), 프로테우스(Proteus), 프로비덴시아(Providencia), 기타 플레시오모나스(Plesiomonas), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케치아(Rickettsia), 살로넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 기타 쉬겔라, 스필리룸(Spirillum), 베일로넬라(Veillonella), 비브리오(Vibrio) 또는 예르시니아(Yersinia) 종을 포함)으로부터 유래된 천연 또는 변형된 지질다당류 또는 지질올리고당류를 지칭한다. 본원에서 사용된 LPS는 해독되지 않거나 해독될 수 있음이 주지되어야 한다.
다른 양태에서, 프로테오좀이 제조되어진 동일한 또는 상이한 세균으로부터 분리된 내인성 LPS는 당해 프로테오좀과 혼합될 수 있고; 이러한 한가지 프로테오좀계 조성물은 본원에서 IVX-908(프로톨린으로 언급될 수도 있다)으로 지칭된다. 즉, IVX-908 유형의 프로테오좀은 한 종류 이상의 지질당류와 혼합되어 OMP-LPS 조성물(이는 면역자극성 조성물로서 작용할 수 있다)을 제공하는 OMP의 제제이다. 따라서, OMP-LPS(IVX-908) 보조제는 2개의 기본 성분, (1) 나이세리아 메닝기티데스(Neisseria meningitides)와 같은 그램-음성 세균으로부터 제조된 프로테오좀의 외막 단백질 제제 및 (2) 하나 이상의 지질당류의 제제로 이루어질 수 있다. 또한, IVX-908의 성분이 지질, 당지질, 당단백질, 소분자 등일 수 있거나 이러한 것들을 포함함이 의도된다.
본원에서 기술하는 프로테오좀계 조성물은, 적어도 부분적으로 숙주 면역계를 자극하는 능력을 지니는 보조제로서 작용하는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 이러한 프로테오좀 성분은 그램 네가티브 세균의 외막 단백질(OMP) 성분(융합 단백질 또는 이의 단편) 뿐만 아니라 동일하거나 상이한 그램 네가티브 세균의 지질다당류(LPS) 성분을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 성분들은 예를 들어, 백신 수용자의 하나 이상의 숙주 세포에 의해 생산되는 특정 수용체(예: Toll-유사 수용체)와 상호작용하여 숙주 면역 반응을 자극하는 리간드로서 작용할 수 있다.
이론으로 국한됨이 없이, 본원에서 기술하는 백신 제제의 하나 이상의 성분은 백신 수용자의 선천면역반응 및/또는 적응면역반응과 관련된 Toll-유사 수용체(TLR)와 상호작용할 수 있다. 10가지 이상의 TLR이 있다[참조: Takeda et. al., Annu Rev Immunology (2003) 21 :335-76]. TLR8 및 TLR1O을 제외한 특정 TLR과 상호작용하고 이어서 이를 활성화시키는 하나 이상의 리간드가 동정되었다. 나이세리아 메닝기티데스의 외막 단백질, 예를 들어, OMP 2(Por B로서도 지칭됨)는 TLR2와 상호작용하며, 대부분 그러나 전부는 아닌 그램 네가티브 세균의 LPS는 TLR4와 상호작용한다. 따라서, 본원에서 기술하는 백신 제제가 생물학적 효과에 기여할 수 있는 한가지 기작은 TLR2 및 TLR4 중 하나 또는 이들 둘다의 활성화를 포함한다. 그러나, 본 발명의 다른 측면에서, 다른 TLR(TLR2 및 TLR4이 아닌)이 유사한 작용을 하거나 발현된 사이토킨의 정성적 및/또는 정량적 프로파일을 보다 증진시킬 수 있고 숙주 Th1/Th2 면역반응과 관련될 수 있다는 것도 마찬가지로 가능하다.
하나 이상의 TLR의 정성적 및/또는 정량적 활성화는, 수반되는 체액성 항체 반응의 존재 또는 부재하에 Th1 및/또는 Th2 면역반응의 상대적 자극(균형 또는 불균형 상태)을 유도하거나 영향을 줄 것으로 예상된다.
TLR2 및 TLR4 이외의 TLR과 상호작용하는 리간드도 본원에서 기술하는 백신 조성물에서 사용할 수 있다. 이러한 백신 성분을 단독으로 또는 배합하여 사용함으로써, 본원에서 제시하는 아밀로겐 질환을 치료하거나 이로부터 보호하기에 충분한 숙주 면역반응의 발생을 일으킬 수 있다. 이러한 TLR 및 관련된 리간드에는 목록 1에 제시한 것들이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
목록 1

동정된 TLR(목록 1) 중 어느 하나 또는 이들의 배합물은 본원에서 의도하는 백신 제제의 TLR 리간드 성분 중 어느 하나 또는 배합물에 의해 활성화될 수 있다. TLR 중 어느 하나 또는 다수의 TLR의 자극은 투여 경로(예: 비강내, 주사 등)에 적합한 농도에서 TLR 리간드 중 어느 하나 또는 다수의 TLR을 사용하여 달성할 수 있음이 또한 이해된다.
따라서, 본 발명에 따라서, 백신 제제는 지질다당류 성분을 외부 첨가하거나 외부 첨가함 없이, 항원성 백신 성분과 배합된 리간드(융합 단백질 또는 이의 단편)을 포함하는 또는 임의로 CD14 수용체를 포함하는 임의의 하나 이상의 TLR 리간드(들)를 포함할 수 있음이 이해된다.
본 발명의 한 측면에서, 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 이용하여 임의의 하나 이상의 TLR 리간드의 TLR 결합 부분만이 분리될 수 있고, 이를 알쯔하이머병 또는 유사 질환 또는 장애의 치료학적 치료제 및/또는 예방학적 예방제로서 GA의 존재 또는 부재하에 제형화할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 하나 또는 다른 합성 공정에 의해 제조할 수도 있다. 이론으로 국한됨이 없이, 한가지 이러한 분리된 결합 도메인은 TLR2에 결합하는 것으로 추측되는 포린 B로서 지칭되는 나이세리아 메닝기티데스 외막 단백질의 부분으로부터 분리될 수 있다. 또한, TLR의 다른 폴리펩타이드 리간드 결합 도메인도 단독으로 또는 하나 또는 다른 배합물로서, 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 제제는 프로테오좀-GA 제제를 투여함을 필요로 하거나 필요로 함이 없이 사용될 수 있거나, 프로테오좀-GA 제제를 투여한 후에 사용할 수 있다. 또한, 이러한 TLR 리간드의 TLR 결합 부분의 변이체(예; 보존적 아미노산 치환)가 TLR에 결합하는(그리고 활성화시키는) 능력을 유지하는한 당해 변이체를 사용하여 TLR을 활성화시킬 수 있음이 인지된다. 본 발명의 추가의 측면에서, 이러한 TLR 리간드의 TLR 결합 부분을 재조합 DNA 기술을 사용하여 1회 이상 반복되게 하여, 이러한 결합 부분의 복사체 다수를 함유하는 폴리펩타이드 또는 심지어 동일한 또는 상이한 TLR 리간드의 결합 도메인을 다수 포함하는 다가(즉, 하이브리드) 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
특정한 프로테오좀계 조성물에서, 백신 제제의 하나 이상의 성분 부분은 비공유적으로 복합체화될 필요가 없고, 오히려 프로테오좀 조성물(예: IVX-908, 프로톨린)과 혼합될 수 있다. 프로쥬번트(Projuvant)로 지칭되는 프로테오좀계 조성물은 오직 소량의 LPS(또는 지질올리고당(LOS))만을 함유하며, IVX-908/프로톨린 프로테오좀계 조성물은 OMP 성분과 같이 동일하거나 상이한 그램 음성 세균 종으로부터 기원할 수 있거나 하나 이상의 그램 음성 세균 유래의 LPS의 혼합물일 수 있는 추가의 외인성 LPS를 함유한다.
하나의 양태에서, 전체 프로테오좀 단백질의 백분율로서의 최종 지질당류 함량(기준 중량)은 약 1% 내지 약 500%의 범위, 보다 바람직하게 약 20% 내지 약 200%의 범위, 약 30% 내지 약 150%의 범위 또는 약 10% 내지 약 100%의 범위이다. 본 발명의 바람직한 양태는 프로테오좀계 성분이 나이세리아 메닝기티데스로부터 제조되고 최종 지질당류 함량이 전체 프로테오좀 단백질의 50중량% 내지 150중량%인 면역자극성 조성물이다. 최종 LPS 함량은 내인성 LPS(예: LOS)와 외부에서 첨가된 LPS(또는 LOS)의 배합물을 나타낼 수 있다. 다른 양태에서, 프로테오좀계 조성물(예: 프로쥬번트)은 나이세리아로부터의 내인성 지질올리고당류(LOS) 함량이 전체 OMP의 약 0.5% 내지 약 5% 범위가 되도록 제조한다. 본 발명의 다른 양태는 전체 OMP의 약 12% 내지 약 25% 범위, 바람직한 양태에서는 약 15% 내지 약 20%의 내인성 지질당류를 함유한 프로테오좀을 제공한다. 본 발명은 또한 임의의 그램-음성 세균 종 유래의 지질당류를 함유한 조성물을 제공하며, 당해 지질당류는 프로테오좀의 공급원인 동일한 그램-음성 세균 종 또는 상이한 세균 종으로부터 유래할 수 있다.
미국 특허 제6,476,201호는 전신(혈청) 항체 반응 및 점막(호흡기 및 창자를 포함) 항체 반응 둘다를 유도하는 비경구 또는 점막 투여용으로 고안된 프로테오좀-양쪽성 결정인자 백신의 생산 및 제조에 관한 것이다. 점막 투여가 바람직하며, 여기에는 호흡기(예를 들어, 비강내, 인두내 및 폐내 포함), 위장관(예: 경구 또는 직장 포함) 또는 국소(예: 결막 또는 귀) 투여가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 양쪽성 결정인자는 프로테오좀과 적절히 제형화되는 경우에 프로테오좀과 연합하여 피험체에서 면역반응을 유도하는 복합체를 형성하는 소수성 및 친수성 영역을 갖는 분자이다. 전형적 양쪽성 결정인자로는 당지질, 지질당류(해독된 지질다당류를 포함), 지질펩타이드, 트랜스막 도메인, 외피 또는 변성독소화 단백질 또는 내재적 소수성 아미노산 앵커를 갖는 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 이러한 결정인자 물질에는 에스케리키아, 클렙시엘라, 슈도모나스, 헤모필루스(Hemophilus), 브루셀라, 쉬겔라 및 나이세리아를 포함하는 그램 음성 세균으로부터 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 수막염구균(Meningococci)의 외막 단백질 프로테오좀 제제(엔. 메닝기티데스 또는 엔. 고노레아 또는 기타 나이세리아 종의 임의의 균주로부터 제조됨)가 천연 또는 해독된 쉬겔라 또는 나이세리아 지질다당류 또는 지질올리고당류와 비공유적으로 복합체화되어 백신을 형성하는 프로테오좀 백신은 그램 음성 유기체에 의해 유발된 질환에 대해 보호하도록 고안된 것으로, 이는 수막염구균 또는 쉬겔라를 포함하는 복합체의 임의의 성분 부분을 함유한다. 보다 구체적으로, 상기 프로테오좀 백신은 쉬겔라 지질다당류의 유형-특이적 체세포 다당류 O-항원을 인식하는 항체 반응을 유도함으로써 이질(shigllosis)에 대한 동종 보호를 제공하는 LPS를 함유한다. 지질다당류는 프로테오좀에 복합체화되는 경우 항-쉬겔라 보호 면역반응을 유도한다. 프로테오좀 백신은, 에스. 플렉스네리 2a(또는 3a 등), 에스. 보이디(S. boydii), 에스. 소네이(S. sonnei) 등 등에 의해 유발된 이질에 대한 동종 면역을 부여하도록 동종 또는 항원성 교차반응성 유기체 유래의 LPS를 사용하여 쉬겔라 소네이 또는 플레시모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides)[쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 질환에 대한 면역을 위해] 및 쉬겔라 플렉스네리 2a[쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 2a 질환에 대한 면역을 위해] 등으로부터 제조하고 정제한다. 또한, 미국 특허 제6,476,201호에는 에스. 플렉스네리 2a(에스. 플렉스네리 2a 질환용) 및 피. 쉬겔로이데스 또는 에스. 소네이(에스. 소네이 질환용)로부터 유래된 쉬겔라 LPS를 사용하여 독립적으로 제조한 2개의 프로테오좀 백신을 함께 투여하여 두 유기체를 인식하는 항체를 유도함으로써 이들 두 종류의 질환에 대한 보호를 부여하는, 다가의 프로테오좀-쉬겔라 백신의 투여가 기재되어 있다. 추가로, 점막 호흡기 및/또는 위장관 경로에 의해 투여되는 백신을 제조하고 에스. 소네이의 체세포 O-항원 LPS를 인식하는 항체를 유도하기 위해 그룹 B 유형 2b 수막염구균으로부터의 프로테오좀을 중공 섬유 정용여과 기술을 사용하여 피. 쉬겔로이데스 LPS에 복합체화시킨 프로테오좀-쉬겔라 LPS 백신을 이질로부터 보호하는데 사용한다.
예시적이지만 비제한적인 본 발명의 프로테오좀계 조성물은 나이세리아 메닝기티데스 외막 단백질(프로테오좀) 및 외부에서 첨가된, 쉬겔라 플렉스네리로부터 제조된 LPS의 비공유적 제형인 프로테오좀계 점막 보조제 IVX-908(프로톨린)이다.
제형 및 투여
이하, "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"란 어구는 상호교환하여 사용될 수 있으며, 유기체에게 심각한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다.
본원에서 "부형제"란 용어는 활성 성분의 투여를 보다 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 부가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예로는 제한됨이 없이, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 전분 종류, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
약물의 제형 및 투여를 위한 기술은 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판]에서 찾아볼 수 있다.
적합한 투여 경로는 예를 들어, 근육내, 피하 및 수질내 주사 뿐만 아니라 뇌척수강내(intrathecal), 직접적 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안내 주사를 포함하여 경구, 직장, 경점막, 경비강, 장 또는 비경구 전달을 포함하지만, 프로테오좀에 바람직한 투여 경로는 비강내 투여이다.
프로테오좀계 조성물을 포함하거나 서브마이크론 에멀젼 또는 나노에멀젼 중의 GA 제형은 비경구, 경구, 비강내 또는 국소 투여되거나, 본원에서 나타낸 바와 같이 이들 경로를 임의로 조합하여 투여될 수 있다. 비록 특정 양태이기는 하나 GA 제형을 비경구 또는 점막 투여하는 것이 바람직하다.
본원에서 이중 또는 다중 투여 경로도 또한 포함된다. 이중 투여 경로는 예를 들면, 제조된 프로테오좀계 조성물을 GA와 별도로 비강내 투여하고, GA를 프로테오좀의 비강내 투여와 동시에 또는 상이한 시점에서 주사로 투여함을 포함할 수 있다. 프로테오좀(프로쥬번트) 또는 프로테오좀:LPS(즉, IVX-908) 조성물(GA 부재)은 또한 GA와 동시에 또는 상이한 시점에서 주사로 투여할 수 있다. 주사의 경우, 본 발명의 활성 성분은 생리학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액(예: 행크액, 링거액 또는 생리학적 염 완충액) 중에서 제형화될 수 있다. 경피 및 가능하게는 경점막 투여의 경우, 투과할 장벽에 적절한 침투제를 당해 제형에서 사용할 수 있다. 이러한 침투제는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여의 경우, 화합물은 활성 화합물을 당해 분야에 익히 공지된 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 즉시 제형화할 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 환자의 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽, 슬러리, 현탁제 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구용 약리학적 제제는 고체 부형제를 사용하고, 임의로, 생성된 혼합물을 분쇄시키고, 경우에 따라 정제 또는 당의정 코어를 수득하기 위해 적합한 보조제를 부가한 후 과립의 혼합물을 가공함으로써 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 충전제, 예를 들어, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈, 나트륨 카보메틸셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 제제; 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리학적으로 허용되는 중합체이다. 경우에 따라, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 이의 염(예: 나트륨 알기네이트)과 같은 붕해제를 부가할 수 있다.
비강 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성 성분은 예를 들어, 적합한 추진제(예: 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로-테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소)를 함께 사용한 가압된 팩 또는 분사기로부터 에어로졸 스프레이 제제의 형태로 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 밸브를 제공하여 용량 단위를 결정함으로써 계량된 양을 전달할 수 있다. 예를 들어, 분배기(dispenser)에서 사용하기 위한 젤라틴으로 이루어진 카트리지 및 캡슐을 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재와 당해 화합물의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
본원에서 기술하는 제제는 예를 들어, 일시 주사 또는 연속적 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 용량 형태로서, 예를 들어, 임의로 방부제가 첨가된 앰풀 또는 다용량 용기 중에 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제 또는 에멀젼일 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화보조제(formulatory agent)를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 피험체의 체내 어느 곳에라도 있지만 특히 뇌 속의 아밀로이드(예: Aβ)의 생산 및/또는 침착과 관련된 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 처치를 위해 투여될 수 있다. 치료학적 적용시, 당해 약제학적 조성물은 이미 이러한 질환을 앓고 있고 치료가 필요한 포유동물에게 투여된다. 약제학적 조성물은 플라크내로 Aβ의 추가 침착을 억제 또는 감소시키고/시키거나 이미 형성된 플라크를 제거하고/하거나 이미 존재하는 Aβ응집물의 제거를 자극하고/하거나 플라크에 함유되지 않을 수 있는 Aβ의 감소를 자극하기에 충분한 양으로 투여될 것이다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효 용량 또는 치료학적 유효량"으로 정의된다.
예방학적 적용을 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 아밀로이드 관련 질환(예: Aβ 관련된 알쯔하이머병)에 민감하지만, 이러한 질환을 앓고있지 않은 포유동물 피험체게 투여된다. 이러한 포유동물 피험체는 의학 문헌(예: Goate (1991) Nature 349:704-706)에 기술된 유전자 스크리닝 및 임상 분석으로 확인할 수 있다. 약제학적 조성물은 증상적 초기 단계에서 예를 들어, Aβ의 플라크로의 아밀로이드 침착을 억제, 예방 또는 감소시켜, 바람직하게는 심지어 β-아밀로이드 관련 질환의 초기 병기(病期)도 예방할 수 있다. 예방학적 유효량으로 지칭되는, 이러한 예방학적 처치를 위해 요구되는 화합물의 양은 반드시는 아니지만 일반적으로 상기 치료학적 처치에 관해 기술한 바와 동일할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위의 목적상, "환자", "피험체" 및 "수용자"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 예방학적, 실험적, 치료학적 처치의 대상이 되는 사람 및 기타 포유동물(예: 소 및 기타 소과 동물)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "치료하다"란 용어는 통계학적 유의적 방식으로, 질환의 진행을 실질적으로 억제, 둔화 또는 역전시키거나, 질환의 임상 징후를 실질적으로 경감시키거나, 질환의 임상 징후의 출현을 실질적으로 예방함을 포함한다.
치료되는 상태의 중증도 및 반응성에 따라서, 투여는 하나의 또는 다수의 부위에 하나의 또는 다수의 전달 수단으로 1회 또는 수회 투여일 수 있으며, 이때 치료 과정을 수일 내지 수주 동안 또는 치유가 성취되거나 질환 상태의 통계학적으로 유의적인 감소가 달성될 때까지 지속한다. 투여될 치료제의 양은 물론 치료될 피험체, 질환의 중증도, 투여 방식, 담당 주치의의 판단 등에 따라 좌우될 것이다. 통계학적 유의성의 계산방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
MS의 "치료"에는 다발성 경화증의 임의의 징후 개시, 이의 임상적 또는 준임상적(subclinical), 예를 들어, 조직학적 증상의 예방 또는 지연 뿐만 아니라, 자가면역 발생을 저하시키고 자가면역 조직 파괴를 방지 또는 둔화시킴에 의한 다발성 경화증의 징후 후의 증상의 치료학적 억제 또는 완화를 포함한다. 자가면역 발생 또는 반응의 "저하", "억제" 또는 "감소"는 발생 또는 반응의 하나 이상의 증상의 부분적 감소 또는 호전을 포함한다. "자가면역 반응"의 "실질적으로" 증가된 억제 효과(또는 저하 또는 감소)는 MS의 하나 이상의 마커 또는 조직학적 또는 임상적 지표의 실질적 감소를 의미한다. 비제한적 예로는 사지마비 스코어의 1단위 이상의 감소가 있다.
MS를 치료하기 위해 GA는 일반적으로 0.01mg 내지 1000 mg/일의 양으로 투여된다. 하나의 양태에서, 0.5 내지 50mg의 투여량 범위가 사용된다. 그러나, 본 발명의 하나의 측면에 따라서, 본원에서 제시하는 하나 이상의 보조제를 GA를 포함하는 조성물과 함께 제형화함으로써 GA의 보다 낮거나 높은 투여량 또는 투여 횟수가 허용될 수 있고, GA의 투여량이 그 자체로 유효량일 필요가 없음이 예측된다.
유효량 범위 뿐만 아니라 최적 양의 확립은 본 단락에 제공된 정보의 견지에서 당해 분야의 숙련가의 기술범위내에 있다. 예를 들면, 포유동물에 대한 투여량 및 사람에 대한 용량은, 특히 비교적 낮은 투여량의 GA(예: 1mg/일)로 시작하여 이를 점차 증가시키고(예를 들어, 대수적으로) 치료에 대한 생물학적 반응을 측정하여, 예를 들어, (i) 조절성 세포(CD4⁺및/또는 CD8⁺)[참조: Chen, Y. et al., Science, 255: 1237 (1994)]의 유도를 측정; (ii) 순환 T-세포상의 II형 표면 마커의 감소를 측정; (iii) TGF-β 발현 세포의 수 또는 검출가능한 TGF-β의 상대량을 측정; (iv) 혈중의 면역 공격 T-세포의 수 또는 활성화를 측정; 또는 (v) 당해 분야에 공지된 스코어화 방법에 따라 질환 중증도를 스코어화하여(예를 들어, 발생 횟수, 관절 종창, 악력, 강직성, 시력, 투약을 감소시키거나 중단하는 능력을 측정함으로써) 최적화시킨다. 유효량은 투여 연구 동안 이들 마커 중 하나의 적어도 통계학적으로 또는 임상적으로 유의적인 약화를 유발하는 임의의 양, 바람직하게는 MS의 특징적인 하나 이상의 증상을 약화시키는 양이다.
MS에서의 질환 중증도의 평가는 질환 유형에 따라 널리 공지된 방법에 따라서 달성할 수 있다. 이러한 방법에는 제한됨이 없이, 일정 기간 동안의 발작의 중증도 또는 발작 횟수; 장애의 진행성 축적(예를 들어, 종합장애상태척도(Expanded Disability Status Scale)로 측정할 수 있음); 뇌 속의 병변의 수 및 정도(예를 들어, 자기공명영상으로 확인된 바와 같은); 및 자가반응성 T-세포의 빈도가 포함된다.
앞서 본 발명을 일반적으로 설명했으며, 본 발명은 예시로서 제공되고 특별히 언급하지 않는 한 본 발명을 제한하기 위함이 아닌 하기 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것이다.

아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 유전자전이된 마우스를 완전 프로인트 보조제(CFA) 중의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 펩타이드(아미노산 35-55)로 면역화시킨 후에 백일해 독소(PT)를 투여(주사)하여, 이의 비-유전자전이된 동복자(同腹仔) 마우스와 비교하여 실험 알레르기 뇌척수염(EAE)에 대한 이의 감수성을 측정하였다. 대조군으로서, 동물을 소 혈청 알부민(BSA) 또는 사람 β-아밀로이드 펩타이드(Aβ 아미노산 1-40)로 면역화시켰다. EAE는 APP 유전자전이된 동물[참조: Mucke et al., Ann NY Acad Sci (777) 82- 88 (1996)] 및 이의 비-유전자전이된 동복자 마우스에서 동일한 정도로 발생하였으며, Aβ1-40 또는 BSA로 면역화된 동물에서는 EAE가 관찰되지 않았다. 그러나, 뇌를 신경병리학적으로 검사하였을 때, EAE가 발생한 동물에서는 Aβ에 대해 덜 염색되었다. 티오플라빈 S를 사용하여 해마내 Aβ 원섬유에 대한 염색량을 정량함으로써, MOG-면역화된 마우스는, 대조군에 비해 92% 감소한 것으로 확인되었으며(p=0.001) Aβ 1-40으로 면역화된 마우스에 비해 73% 감소한 것으로 확인되었다(p=0.03)(표 1 및 도 1 참조). ELISA로 전체 뇌 Aβ함량을 정량함으로써, MOG-면역화된 동물의 Aβ는, 대조군과 비교하여 94% 감소한 것으로 측정되었고(p<O.001), Aβ 1-40 면역화된 마우스와 비교하여 86% 감소한 것으로 측정되었다(p=0.03)(표 1 및 도 1 참조).

이러한 효과가 MOG-유도된 EAE 고유의 것인지를 결정하기 위해, CFA 중의 단백지질 단백질(PLP) 펩타이드(아미노산 139-151)로 EAE를 유도하였다. PLP 유도된 EAE를 갖는 동물에서 Aβ 원섬유에 대한 염색의 76% 감소 및 Aβ 수준의 70% 감소가 확인되었다(p<0.02)(표 2 및 도 3A 참조). PLP로 EAE를 유도하기 위해, 문헌[참조: Hsiao, K. et al, Science 274 (5284):99-102 (1996)]에 기재된 바와 같은 Tg2576 마우스를 B6/SJL 배경상에서 사용하였다. MOG-EAE를 유도하기 위한 Tg2576 마우스 및 문헌[참조: Mucke et al., Ann NY Acad Sci (777) 82-88 (1996)]에 기재된 J20 면역화된 마우스의 경우에 유사한 결과가 확인되었다(표 1). 이러한 결과들은 당해 관찰이 EAE 유도를 위해 사용된 항원 또는 AD 연구된 동물 모델과 관련되지 않고, 동물의 유전적 배경 뿐만 아니라 성별(50% 수컷/암컷)과도 관련되지 않았음을 입증한다. CFA 중의 BSA로 면역화된 동물에서는 변화가 관찰되지 않았다. 주목할만하게도, 16개월 초과의 Tg2576 마우스와 비교하였을 때 13개월 초과의 J20 마우스에서 전체 Aβ(아밀로이드) 부하량에 차이가 없었다.

동물을 CFA 중에서 제형화된 Aβ 펩타이드로 면역화시킨, AD의 마우스 모델의 치료를 위한 이전의 면역 접근법 연구에서, 항-응집성 β 아밀로이드 항체는 시험관내[참조: Solomon, B. et al, Proc Natl Acad Sci 94:4109-12 (1997)] 및 생체내[참조; Weiner, H. L. et al., Ann Neurol 48, 567-79 (2000), 및 Schenk, D. et al., Nature 400, 173-7 (1999)] 둘다에서 아밀로이드 부하량을 감소시키는 역할을 하는 것으로 것으로 제시되었으며, 이의 능력은 Aβ의 N-말단 영역내의 특정 에피토프와 연관되었다[참조: Frenkel, D. et al., Neuroimmunol 88, 85-90 (1998), and Frenkel, D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 11455-9 (2000)]. MOG 또는 PLP로 면역화된 동물에서 Aβ와의 교차반응성이 있었는지를 결정하기 위해 Aβ에 대한 항체 수준을 측정하였고, Aβ로 면역화된 동물로부터의 Aβ항체 역가와 비교하여 Aβ항체 역가를 측정하였다. 표 1 및 2에 제시된 바와 같이, MOG 또는 PLP로 면역화된 동물에서 항-Aβ 항체는 검출되지 않았다. 항체가 관여하지 않았음을 명확히 정립하기 위해, μMT B-세포 결핍 마우스와 교배된 16개월령 J20 마우스를 CFA 중의 MOG 35-55로 면역화시킨 후, 백일해 독소를 투여하였다. 표 1 및 도 1에 제시된 바와 같이, μMT B-세포 결핍 APP+ 마우스에서는 ThS 염색(p<O.001) 또는 전체 뇌 아밀로이드에 대한 ELISA(p<0.001)로 측정한 바에 따르면 대조군과 비교해 아밀로이드가 90% 감소하였다. 이러한 결과는 MOG 면역화 후에 Aβ의 감소가 항체 비의존성 기작에 의해 일어났음을 나타낸다.

이전의 연구는 활성화된 미세아교세포가 생체내에서 Aβ를 제거하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 제시한 바 있다[참조: Schenk, D. et al., Nature 400, 173-7 (1999), Rogers, J. et al., Glia 40, 260-9 (2002), Mitrasinovic, O.M. et al., Neurobiol Aging 24, 807-15 (2003), Webster, S.D. et al., Exp Neurol 161, 127-38 (2000), Bacskai, BJ. et al., J Neurosci 22, 7873-8 (2002), Nicoll, J.A. et al., Nat Med 9, 448-52 (2003), Akiyama, H. & McGeer, P.L., Nat Med 10, 117-8; author reply 118-9 (2004)]. 활성화된 미세아교세포(또는 미세아교세포-유사 세포)는 뇌로부터 유래했는지 또는 뇌 밖으로부터, 즉, 호중구 및 대식세포와 같이 말초로부터 기원하는지에 따라 추가로 구별될 수 있다. 말초 호중구 및 대식세포로부터 뇌 유래의 미세아교세포를 구별하는 과정은 당해 분야에 공지되어 있다. Aβ 제거에 있어 미세아교세포 활성화의 잠재적 역할을 조사하기 위해, MOG/CFA로 (발바닥 주사 또는 비강내 투여에 의해) 면역화된 APP tg 마우스의 뇌를 활성화된 미세아교 세포의 마커인 CD11b로 염색시켰다. 도 3A 및 4 및 표 4에 도시된 바와 같이, APP tg MOG-면역화된 마우스의 해마를 면역염색한 결과, 아밀로이드 플라크와 공동 국소화된 활성화된 미세아교세포(349±34.3 세포/해마 영역) 수가 증가된 것으로 나타났다(표 4). BSA/CFA로 면역화된 대조군 마우스에서는 오직 최소의 염색(76±17 세포/해마 영역)만이 관찰되었다(표 4). Aβ/CFA로 면역화된 동물에서는 중간 수준의 미세아교세포 활성화(106±27 세포/해마 영역)가 관찰되었다. 또한, 증가된 미세아교세포 활성화 수준은 μMT B-세포 결핍 마우스(p<O.OO1) 및 PLP로 면역화된 동물(p<O.OO1)에서 관찰되었다(도 3A, 표 4).

앞서 기술한 첫번째 실험 시리즈에 따르면, MOG/PLP와 CFA의 투여(이어서 백일해 독소를 투여함)는 Aβ의 감소와 관련되었지만, 원치않는 EAE가 동반되었다. 당해 실험에서 백일해 독소는 CFA 제형화된 화합물의 뇌로의 전달을 위해 혈뇌 장벽을 개방하는데 사용된다. 따라서, Aβ의 감소가 EAE의 유도와 직접적으로 연관되었는지를 평가하기 위해 그리고 MOG, PLP 및 GA가 MS 관련 EAE와 관련하여 연구되었기 때문에, EAE의 억제에 효과적이고 재발성 형태의 MS용으로 승인되고 널리 사용되는 치료제인 알라닌, 라이신, 글루탐산 및 티로신의 랜덤 아미노산 공중합체인 글라티라메르 아세테이트(GA)에 의한 APP 마우스의 면역화의 효과를 평가하였다[참조: Teitelbaum, D. et al., J. Neural Transm Suppl 49, 85-91 (1997)].

초기 수행된 바와 같다해도, 본원에 제공된 특정 항원/보조제 혼합물을 투여한 다음 백일해 독소를 투여(주사)한다; 본원에서 기술하는 특정한 다른 조성물을 백일해 독소의 투여없이 투여할 수 있음이 충분히 이해된다. 실제로, GA를 함유하거나 함유하지 않는 IVX-908과 같은 프로테오좀계 조성물은 백일해 독소의 투여 없이 투여한다. 사실, 백일해 독소는 본원에서 기술하는 임의의 프로테오좀계 조성물의 비강 전달 중의 어느 시점에서도 사용되지 않았다.

마우스를 CFA 중의 100㎍ GA로 (발바닥 주사에 의해) 면역화시킨 직후 및 48시간째에 백일해 독소 150ng을 복강내 주사하였다. 면역화한지 50일 후에, 마우스를 희생시켰다. 글라티라메르 아세테이트 면역화는 미처리된 대조군에 비해서 해마 영역내 아밀로이드 원섬유를 92% 감소시켰으며(p<0.01) 전체 아밀로이드 부하량을 70% 감소시켰다(p<0.01)(표 1 및 도 1 참조). GA/CFA와 백일해 독소로 면역화된 동물에서 임상적 EAE는 없었다.

CFA는 사람 피험체에게 투여될 수 없기 때문에, CFA 이외의 보조제가 포함된, AD의 마우스 모델에서의 글라티라메르 아세테이트의 비강 백신접종의 효과를 조사하였다; 동물을 글라티라메르 아세테이트를 단독으로 또는 점막 보조제와 함께 비강내 투여하여 처리하였다. 나이세리아 메닝기티데스 외막 단백질(프로테오좀) 및 쉬겔라 플렉스네리의 LPS(둘다 사람[참조: Fries, L.F., et al., Infect Immun 69:4545-53 (2001)] 및 마우스[참조: Plante, M. et al., Vaccine 20, 218-25 (2001)]에서 사용된 바 있다)의 비-공유성 제형으로 이루어진 프로테오좀계 점막 보조제 IVX-908(Protollin)을 제조하였다. 첫주에 마우스를 프로테오좀 보조제의 치료제로 복합적으로 처리하고 이어서 다음 5주 동안 1주일 간격으로 부스트(boost)시키고, 뒤이어 신경병리학적 분석을 수행하였다. 대조군으로서 동물을 IVX-908+BSA, 단독의 IVX-908 또는 단독의 GA로 비강 처리하였다. 예상치않게, IVX-908와 제형화된 GA의 비강 투여는 해마내 티오플라빈-양성 원섬유 아밀로이드의 84% 감소(대조군 대비 p<O.OO1) 및 단독의 IVX-908과 비교하여 70%의 감소(p<O.Ol)를 야기하였다(표 3). 전체 뇌 Aβ 수준의 측면에서, IVX-908중의 글라티라메르 아세테이트의 비강 투여 후에 73% 감소가 관찰되었으며(대조군 대비 p<0.001) 단독의 IVX-908을 사용한 경우에 45% 감소가 관찰되었다(p<0.002)(표 3, 도 2). 또한, 처리된 동물의 아밀로이드 플라크 주변에서 활성화된 미세아교세포가 검출되었다. 뇌 속의 전체 Aβ 수준이 약간 감소되었지만(대조군에 대해 p=0.044) 단독의 GA의 비강 투여는 Aβ 원섬유에 영향을 주지 못하였다. BSA+IVX-908 또는 단독의 IVX-908의 비강 투여는 원섬유 Aβ염색에는 영향이 없었지만 전체 아밀로이드 부하량(대조군 대비 p=0.02)를 50% 감소시켰다. CFA와의 주사와 대조적으로, 단독의 또는 GA 또는 BSA와의 제형으로서의 IVX-908의 비강 투여는 당해 실험에서 어떠한 동물에서도 EAE를 유도하지 않았다.

APP 비-유전자전이된 마우스에서는 다음 면역화 프로토콜 중 어느 것에서도 미세아교세포 활성화가 발견되지 않았다: CFA/PT와 GA의 비경구 투여, IVX-908과 GA의 비강 투여(도 3B 참조) 또는 단독의 IVX-908와의 비강 투여. 이러한 결과들은 IVX-908와 제형화된 GA 또는 단독의 IVX-908의 투여(면역화) 후의 미세아교세포 활성화가 활성화를 위해 내인성 미세아교세포를 사전자극하는 작용을 할 수 있는 아밀로이드 침착의 존재에 의존할 수 있음을 시사한다.

GA와 Aβ 간에 공지된 교차반응성이 없고 본 발명자들도 GA 처리된 또는 EAE 동물에서 항-Aβ 항체를 관찰하지 않았지만, GA+IVX-908로의 면역화가 Aβ반응성 T 세포의 자극을 야기할 수 있을 가능성이 있다. 본 발명자들은 7주 동안 GA+IVX-908로 매주 처리한 후에(이때 당해 실험을 종결하였다) T 세포 증식반응 및 사이토킨 생산(IL-2, IFN-γ, IL-6)을 비장의 T 세포를 Aβ(1-40)로 자극함으로써 측정하였다. 본 발명자들은 증식으로 측정한 바에 따라 Aβ 반응성 T 세포의 사전자극이 없음을 발견하였다: 미처리 그룹의 경우 Aβ에 대한 분당 계수 = 3315 ± 1682 cpm; GA+IVX-908의 경우 Aβ에 대한 분당 계수 = 4516 ± 1412 cpm(배경 계수는 100 내지 300이었다). 자극 지수(GA+IVX-908/미처리) = 1.37; 2.5 초과의 최소 자극 지수를 양성으로 간주한다. 또한, 본 발명자들은 당해 배양물들에서 배경값 이상의 IL-2, IFN-γ, IL-6의 분비를 발견하지 못하였다. 이와 같은 Aβ에 대한 T 세포 반응의 결여는 항-Aβ 항체가 검출되지 않은 본 발명자들의 결과와 부합하는데, 이는 항체의 생산을 위해서 T 세포 도움이 요구되기 때문이다. 마찬가지로, 본 발명자들은 EAE 동물에서 Aβ에 대한 사전자극을 발견하지 못하였다.

해마 이외의 다른 뇌 부위에 대한 GA+IVX-908 처리의 효과를 검사하기 위해, 본 발명자들을 후각망울(olfactory bulb) 및 소뇌를 조사하였다. 본 발명자들은 Aβ, CD11b 및 피브리노겐에 대해 후각망울을 염색시켜 해마에서 관찰된 바와 유사한 결과를 수득하였다(도 8). GA+IVX-908의 비강 투여 후에 본 발명자들은 대조군과 비교하여 증가된 수의 활성화된 미세아교세포를 발견하였다. 활성화는 EAE를 갖는 동물에서도 일어났지만, 피브리노겐에 대한 염색으로 측정된 바에 따르면 혈뇌 장벽(BBB)에서의 누출을 동반하였다.

본 발명자들이 소뇌를 검사한 경우, 본 발명자들은 GA+IVX-908 처리된 동물에서 미세아교세포 염색의 증가된 활성화를 발견하지 못하였는데, 이는 증가된 활성화가 Aβ가 침착된 영역으로 제한됨을 시사한다. 게다가, 미세아교세포의 활성화는 GA+IVX-908 후에 비-유전자전이된 동복자의 뇌 어느곳에서도 관찰되지 않았는데, 이는 증가된 활성화가 Aβ가 침착된 영역으로 제한됨을 입증한다(도 3b 참조).

본 발명자들이 관찰한 제거 기작을 보다 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 CD68 발현에 대해 염색하였으며, CD68은 뇌 미세아교세포와 대조적으로 말초 유래의 활성화된 대식세포에서 고도로 발현된다. 도 9에 도시한 바와 같이, 본 발명자들은 GA+IVX-908로 처리된 동물과 비교해서 EAE를 갖는 동물에서 CD68에 대한 보다 많은 염색을 수득하였다. 이러한 염색 패턴은 대식세포가 맥락막총(choroids plexus)으로부터 소뇌 및 피질을 포함하는 주변 뇌 실질로 이동하였음을 보여준다. GA+IVX-908 처리시, 주로 맥락막총 공간에서 CD68의 발현이 증가된다. 이는 EAE를 갖는 동물에서는 Aβ의 제거를 책임지는 CD11b+ 세포가 말초로부터 CNS로 이동하고 이 세포가 신경독성과 관련되는 반면에, GA+IVX-908 처리된 동물에서의 CD11b+ 세포는 주로 내인성 미세아교세포이고 직접적 독성의 증거 없이 Aβ의 제거와 관련됨을 시사한다. 이러한 해석에 대한 추가의 증거로서, 본 발명자들은 EAE를 갖는 동물의 소뇌에서 CD68+ 세포의 발현이 증가되지만 GA+IVX-908 처리된 또는 미처리된 동물에서는 그렇지 않음을 발견하였다(도시하지 않음). 또한, GA+IVX-908 처리 후에 활성화된 CD11b+ 세포는 오직 아밀로이드가 축적된 영역에서만 발견되었다.

표 4 및 도 4에 도시한 바와 같이, 해마내 Aβ 원섬유의 감소는 CD11b 염색으로 나타난 바와 같이 두 활성화된 미세아교세포 모두의 증가된 수와 강한 상관관계가 있었다(Aβ 원섬유 대비 r= -0.7 CD11b), 및 IFN-γ 대 Aβ 원섬유). CD11b 세포와 IFN-γ 세포 간에는 강한 상관관계가 있기 때문에 본 발명자들이 처리된 동물에서 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체(M-CSFR)에 대해 면역반응성인 미세아교세포의 수가 대조군과 비교하여 증가되었음을 관찰하였다(p<0.02)(표 4). 본 발명자들은 TGF-β의 감소 및 해마 영역내 Aβ 원섬유 비율을 관찰하였다(r=0.91). 대조군과 GA+IVX-908 처리된 동물 간에 IL-10 반응성 세포에서의 유의적 변화는 관찰되지 않았지만, EAE를 갖는 동물은 대조군에 비해서 IL-10이 적었다.

GA와 IVX-908로의 처리가 신경 세포 독성 또는 기타 잠재적 음성 효과를 유도하는지를 평가하기 위해, 다음의 실험들을 실시하였다: i) 신경 세포 손상과 부합되는 성상교세포증(독성)의 척도인 GFAP를 측정한다; ii) 신경미세섬유의 인산화에 대한 마커이며 신경세포 손상과 함께 증가되는 것으로 공지된 SMI32의 발현 수준을 측정한다; iii) 아폽토시스(apoptosis) 세포사멸의 측정 수단으로서 TUNEL 검정을 실시한다; 및 iv) 신경세포 스트레스의 조건하에 상향 조절되는 것으로 나타난 효소인 iNOS의 수준을 측정한다.

GFAP 검정의 결과는 성상교세포증이 대조군인 미처리된 동물(GFAP+ 세포로 측정한 바와 같은 해마내 활성화된 성상교세포의 면적)에서 일어났음을 보여준다(도 5). 성상교세포증은 GA+IVX-908이 비강 투여된 동물에서 감소되었다(3.1%; 대조군 대비 p=0.039). 대조적으로, EAE 동물에서 성상교세포증의 감소는 없었다. 이러한 결과는, EAE가 Aβ 침착의 감소와도 관련된다 해도, GA+IVX-908 처리 결과로서 Aβ의 제거가 EAE를 갖는 동물에서 관찰된 것보다 덜 독성(보다 적은 성상교세포증과 관련됨)임을 가리킨다.

SMI32를 측정한 실험의 결과(도 6)는 비정상적 난형 형태를 갖는 SMI32 양성 세포가 미처리된 대조군 동물에서 신경염 플라크와 관련됨을 보여준다. EAE를 갖는 동물은 (신경염 플라크가 관찰되지 않았으나) 소뇌를 포함하여 뇌 전반에 걸쳐 비정상적 난형 형태를 갖는 SMI32 양성 세포(염증과 관련됨) 수의 증가를 나타낸다. 대조적으로, GA+IVX-908로 처리된 동물은 신경염 플라크와 관련된 SMI32 양성 세포(비정상적 난형 형태를 가짐) 수의 감소를 나타낸다. 이들 실험은 GA+IVX-908 처리가 SMI32로 측정한 바에 따르면 독성과 관련되지 않음을 시사한다.

표준 TUNEL 검정을 사용하여 아폽토시스 세포사멸을 측정한 실험 결과(도 6)는 대조군 동물에서 TUNEL 염색이 없었으며, EAE 동물의 피질에서 TUNEL 염색이 증가되었음을 보여준다. GA+IVX-908 처리된 동물에서는 TUNEL 염색이 관찰되지 않았다. 또한, iNOS를 측정한 검정은 iNOS가 EAE를 갖는 마우스에서는 상향 조절되지만, GA+IVX-908로 처리된 동물에서는 그렇지 않음을 나타낸다. GA-IVX-908 처리된 동물과 EAE 동물 어느 쪽에서도 혈관 구조의 손상은 검출되지 않았다.

종합하면, 이들 데이타는, EAE를 갖는 동물뿐만 아니라 GA+IVX-908로 처리된 동물에서 Aβ가 제거되었다 해도, GA+IVX-908로 처리된 동물은 신경세포 독성과 관련되지 않았음을 나타낸다(표 4 및 도 6).

그러나, 단독의 IVX-908로 면역화 후의 미세아교세포의 활성화가 Aβ 침착물의 존재를 필요로 하지만, 이러한 면역화는 (활성화된 미세아교세포에 의한) 이러한 Aβ 침착의 제거를 야기하지 않았고 오히려 전체 아밀로이드 부하량의 우선적 감소가 있었다. 상기 결과는 활성화될 수 있는 2가지 미세아교세포 집단이 있다는 가능성, 또는 미세아교세포가 상이한 정도로, 부분적으로 또는 완전히 활성화될 수 있다는 대안적인 가능성(완전히 활성화된 미세아교세포는 선재하는 Aβ 플라크를 제거할 수 있고 부분적으로 활성화된 미세아교세포는 가용성 Aβ 펩타이드의 제거에 참여한다)을 시사할 수 있다. 가용성 Aβ가 불용성 Aβ 플라크내로 응집된다는 개념을 고려하면, 이러한 단독의 IVX-908로의 처리는 Aβ 플라크의 지속적 형성을 둔화 또는 방지하여 질환을 앓는 피험체에게 유익할 수 있다.

표 4 및 도 3B는 해마내 Aβ 원섬유의 감소가 활성화된 미세아교세포(CD11b+ 면역조직학 염색으로 나타난 바와 같은) 및 IFN-γ 분비 세포 둘다의 수 증가와 상관관계가 있었음을 입증한다. 또한, 대식세포 콜로니-자극 인자 수용체(M-CSFR) 양성 미세아교세포의 수가 증가되었다. 마우스 및 사람 미세아교세포상의 M-CSFR의 증가된 발현은 대식세포 스캐빈저 수용체를 통해서 그리고 미세아교세포상의 FcR 감마 수용체 발현을 증가시킴으로써 응집된 아밀로이드의 포식작용을 가속화시킨다는 것이 보고되었다[참조: Mitrasinovic, O.M. & Murphy, G.M., Jr., Neurobiol Aging 24, 807-15 (2003)]. 그러나, μMT B-세포 결핍 마우스에서의 아밀로이드 제거시에 M-CSFR에 대한 염색도 또한 증가되었으며, 따라서 관찰된 효과는 비-Fc-매개성 기작을 통한다[참조: Bacskai, BJ. et al, J Neurosci 22, 7873-8 (2002)]. IFN-γ의 증가와 관련하여, TGF-β발현의 감소가 관찰되었으며, 이는 TGF-β가 플라크로 응집하는 가용성 Aβ의 능력을 다소 조절함을 시사하고, 또한, TGF-β가 증가된 아밀로이드 침착과 관련되는 것으로 사료된다[참조: Wyss-Coray, T. et al., Nature 389, 603-6 (1997)]. TGF-β의 감소도 또한 아밀로이드 제거를 촉진할 수 있다. IL-10 발현에서의 유의적 변화는 관찰되지 않았다. T 세포의 수와 IFN-γ 분비 세포의 수 사이에 상관관계가 있었기 때문에, 미세아교세포의 활성화는 미세아교세포의 활성화를 촉진하는 역할을 할 수 있는 T 세포의 증가된 수와 관련될 수 있다.

당해 실험에서 검출된 CD11b+ 세포가 활성화된 대식세포 또는 미세아교세포였으며 호중구가 아님을 확인하기 위해, 샘플을, 세포 표면 구조가 활성화된 대식세포 및 미세아교세포의 표면에서는 검출될 수 있지만 호중구(다형핵 백혈구)의 표면에서는 검출되지 않는, F4/80을 인식하는 모노클로날 항체와 함께 항온처리하였다. F4/80의 발현은 대식세포와 미세아교세포가 성숙함에 따라 증가한다. 당해 실험의 결과는 당해 실험에서 검출된 모든 CD11b+ 세포가 F4/80에 대해 양성으로 염색되었음을 나타내며(도시하지 않음), 이는 이들 CD11b+ 세포가 활성화된 대식세포 또는 미세아교세포이며 호중구가 아니었음을 나타낸다. 또한, H&E 염색(도 4)에 의해 Aβ 플라크와 공동 국소화한 CD11b+ 세포는 단핵구 형태를 지녔으며 호중구의 특징인 다형핵 형태를 지니지 않았다.

다른 실험 시리즈에서, GA + IVX-908의 비강 투여 후에 미세아교세포 활성화는 CD3 염색으로 측정된 바에 따른 T 세포의 수 증가와 상관관계가 있었음이 나타났다. 검출된 T 세포의 수와 IFN-γ 분비 세포의 수 간에 상관관계가 있었기 때문에(r=0.88)(표 4), 이러한 결과들은 미세아교세포 활성화를 촉진하는데 있어 T 세포의 가능한 역할을 시사한다. 게다가, TGF-β는 APP tg-마우스에서 APP 원섬유 형성을 증가시키거나 감소시킬 수 있음이 보고되었다[참조: Wyss-Coray, T. et al Nature 389, 603-6 (1997); Wyss-Coray et al. Nat. Med. 7:612- 8 (2001)]. 본원에서 보고한 실험에서, TGF-β 발현의 감소는 대조군과 비교하여 MOG(p<O.OO1) 및 GA+IVX-908(p<O.OO1) 처리된 마우스에서 관찰되었다(표 4); TGF-β의 감소와 해마 영역내 Aβ 원섬유 비율 간에 강한 상관관계가 있었다(r=0.95). IL-10-면역반응성 세포에서 유의적 변화는 관찰되지 않았다(도시하지 않음).

단독의 IVX-908을 비강 투여한 경우에 전체 뇌 Aβ수준의 감소가 관찰되었지만(표 3)(미처리 동물 대비 p=0.02), GA와 제형화된 IVX-908와 달리 단독의 IVX-908은 티오플라빈 양성 Aβ 원섬유의 제거에 대해 효과가 없었다. IVX-908은 엔. 메닝기티데스 외막 단백질(OMP)과 외부에서 첨가된 지질다당류(LPS)로 이루어진 프로테오좀계 보조제이다. 나이세리아 메닝기티데스 OMP 2(포린 B) 및 LPS/LOS는 선천면역계 및/또는 적응면역계와 관련된 특정 세포 유형의 표면에 표시된 TLR과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 상호작용은 적어도 부분적으로는, 본원에서 제시한 바와 같은 IVX-908 및/또는 IVX-908과 제형화된 GA의 관찰된 활성을 위해 필요할 수 있다. IVX-908로 관찰된 효과는, 해마내로의 LPS의 직접 주사가 비-원섬유 Aβ 부하량을 감소를 야기할 수 있지만, 원섬유 Aβ 침착물은 감소를 야기할 수 없다는 보고와 관련될 수 있다[참조: DiCarlo, G. et al., Neurobiol Aging 22, 1007-12 (2001)]. 그러나, 이들 실험들의 투여 경로, 즉 뇌로의 직접 주사가 본원에서 기술하는 프로테오좀계 제형의 전달을 위한 비강 투여와 매우 다르다는 것이 주지되어야 한다. 대조적으로, 다른 보고서는 복강내로 투여된 LPS(염증)가 미세아교세포의 활성화를 자극할 수 있고, 전체 아밀로이드의 증가도 또한 관찰되었으며, LPS-유도된 신경염증이 아밀로이드 전구체 단백질 및 Aβ 펩타이드의 세포내 축적을 증가시킴을 나타낸다[참조: Sheng et al., Neurobiology of Disease 14:133-145 (2003), 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌]. 게다가, LPS의 직접 주사는 독성인 것으로 예측됨이 인지된다.

상기 논의한 실험에서, CD11b+ 세포는 F4/80 시그날의 부재로 인해서 활성화된 미세아교세포 또는 대식세포이지만 호중구는 아닌 것으로 나타났다. 그러나, 이들 CD11b+ 세포가 활성화된 대식세포가 아니라 활성화된 미세아교세포로서 추가 구별될 수 있는지를 결정하기 위해, 샘플을 말초의 활성화된 대식세포에서 고도로 발현되지만 뇌로부터 기원하는 미세아교세포의 표면에서는 고도로 발현되지 않는 세포 마커인 CD68의 존재에 대해 평가하였다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 GA+IVX-908로 처리된 동물로부터 유래된 샘플과 비교하여 EAE 동물에서 CD68에 대한 보다 많은 염색을 수득하였으며(대식세포는 CD11b+ 및 CD68+이다), 이는 이들 CD11b+ 및 CD68+ 세포가 말초(지주막하강(subarachnoid space))로부터 소뇌 및 피질을 포함하는 뇌 실질로 이동하는 대식세포임을 가리킨다. 대조적으로, GA-IVX-908 처리 후에 CD68 발현 대식세포가 증가되지만, 이들 세포는 주로 지주막하강으로 국소화된 상태를 유지한다. 당해 실험의 결과는, EAE 동물에서 Aβ의 제거에 관여하는 CD11b+ 세포는 말초로부터 CNS로 이동하고 신경 독성과 관련되는 반면에, GA-IVX-908 처리 후에 검출된 CD11b+ 세포는 주로 내인성 미세아교세포이며 직접적 독성의 증거없이 Aβ의 제거에 관련됨을 시사한다. 이러한 해석을 보다 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 EAE 동물의 소뇌에서 CD68+ 세포의 발현이 증가되지만, GA-IVX-908 처리된 동물 또는 미처리된 동물에서는 그렇지 않음을 발견하였다(데이타는 제시하지 않음). 게다가, GA-IVX-908 처리 후의 활성화된 CD11b+ 세포는 오직 아밀로이드가 축적된 영역에서만 발견되었다.

또한, 본 발명자들은 미처리된 동물과 비교하여 GA-IVX-908이 투여된 동물의 혈청중 Aβ의 수준이 증가되었음을 발견하였으며, 이는 GA-IVX-908이 뇌 영역으로부터 Aβ의 제거를 유도하며 이후에 이 Aβ가 말초에서 발견될 수 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 Aβ의 재분포는 상기 기술한 바와 같이 활성화된 CD11b+ 세포의 공급원과 관련될 수 있는 EAE를 갖는 동물에서는 관찰되지 않았다. 또한, 뇌 모세혈관 및 맥락막총의 내층에 있는 CD11b+ CD68+ 활성화된 대식세포의 수가 미처리된 동물과 비교하여 GA-IVX-908 투여된 동물에서 증가되었다(도 9). 이러한 발견들은 GA-IVX-908 처리된 동물에서 수득된 혈청 샘플중에서 검출된 상승된 Aβ 수준 및 CD11b+ 세포와 연관된 GA-IVX-908 처리된 동물에서의 아밀로이드 혈관병증의 부수적 감소와 부합한다(도 8).

예상치않게도, 아밀로이드(예: Aβ 플라크) 제거의 최종적 공통 경로는 활성화된 미세아교세포를 통한 경로일 수 있는 것으로 보인다. EAE에서, IFN-γ Th1 유형 미엘린 반응성 T 세포는 MOG 또는 PLP와 CFA로의 면역화에 의해 말초에서 명백히 활성화되며, 이들 T 세포는 뇌로 이동하여 여기서 IFN-γ(Th1 사이토킨)을 방출하고 미세아교세포를 활성화시킨다. 그 결과, 미엘린과 내재적 액손의 손상에 의해 동물의 뇌척수염 및 마비가 유발된다. BSA 특이적 Th1 유형 세포는 뇌내에 축적되지 않기 때문에 말초에서 BSA/CFA로의 면역화는 Aβ 제거를 유도하지 않는다. CFA 중의 글라티라메르 아세테이트로의 말초 면역화는 GA와 MBP와의 교차 반응성으로 인해 뇌에 축적되는 GA 특이적 T 세포를 유도한다. 상기 T 세포는 IFN-γ를 분비하여 미세아교세포를 활성화시킬 수 있지만, MBP에 대한 친화성 변경 및 소염성 사이토킨의 부수적 분비 때문에 EAE를 유발할 수는 없다.

본 발명자들은 미세아교세포 활성화와 관련된 Aβ의 제거를 입증하였다. 미세아교세포 활성화가 양성 효과와 음성 효과를 모두 가질 수 있음이 주지되어야 한다[참조: Monsonego, A., and Weiner, H.L., Immunotherapeutic approaches to 알쯔하이머병, Science 302:834-838 (2003)]. 미세아교세포는 단백질이 응집되고 파편들이 뇌로부터 제거될 수 있도록 하는 천연 기작을 나타내며, Aβ 면역화 또는 졸중 후의 미세아교세포 활성화가 Aβ 제거를 유도할 수 있음이 보고되어 있다[참조: Nicoll, J.A., et al., Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-beta peptide: a case report, Nat Med., 9:448-452 (2003); Akiyama, H., and McGeer, P.L., Specificity of mechanisms for plaque removal after A beta immunotherapy for Alzheimer Disease, Nat Med., 10:117-118; author reply 118-119 (2004); and Wyss-Coray, T., et al., Prominent neurodegeneration and increased plaque formation in complement-inhibited Alzheimer's mice., Proc Natl Acad ScL, 99:10837-10842 (2002)]. 동물 연구에서 와이스-코레이(Wyss-Coray) 및 동료들은, 미세아교세포가 동일한 연령의 야생형 AD 마우스에 비해 현저하게 덜 활성화된 보체-억제된 AD 마우스 모델에서 현저한 신경 퇴행 및 증가된 플라크 형성이 있음을 입증하였다. 이는 활성화된 미세아교세포가 AD 마우스 모델에서 주된 신경독성 없이 아밀로이드 부하량을 감소시키는데 있어 유익한 역할을 한다는 개념을 뒷받침한다.

단독의 IVX-908의 비강 투여는, 부가적으로 T 세포를 활성화시킬 수 있는 GA와 함께 제형화된 IVX-908 조성물만큼 효과적이지는 않더라도 미세아교세포를 활성화시킬 수 있기 때문에 아밀로이드의 감소를 유도한다. 비-유전자전이된 동물에서는 CFA와 함께 말초 투여되거나 IVX-908과 함께 비강내로 투여된 GA의 경우 미세아교세포 활성화가 관찰되지 않았다. Aβ 침착이 Aβ 플라크 주변의 미세아교세포의 미약한 활성화를 유도한다는 것이 보고된 바 있으며, 이러한 활성화는 미세아교세포가 IVX-908과 GA에 의해 추가 활성화되기 위해 요구되는 것으로 보인다. 미세아교세포의 미약한 활성화는 추가 활성화를 위해 미세아교세포를 사전자극하는 IFN-γ 또는 toll-유사 수용체의 발현과 관련될 가능성이 있다[참조: Sasaki, A. et al., Virchows Arch., 441(4):358-67 (2002)].

상기 발견들은 Th1 유형 보조제(QS21) 중의 Aβ1-42로 면역화된 후에 사람에서 관찰된 플라크 제거에 대한 잠재적 기작과 관련되며, 문헌[참조: Nicoll, J.A. et al., Nat Med 9, 448-52 (2003)]에는 보조제 QS21와 함께 Aβ1-42를 비경구 투여하여 백신접종한 AD 환자로부터, 널리 확산된 수막뇌염, 대식세포에 의한 뇌의 침윤 및 신피질내 아밀로이드 침착물의 감소를 야기하였다는 부검 결과가 보고되어 있다. 아키야마(Akiyama) 및 맥기어(McGeer)는, AD의 사례에서 불완전 허혈 상태인 피질 영역내 노인성 플라크의 유사한 감소를 보고하였으며 이들의 발견과 니콜(Nicoll) 등에 의해 보고된 발견들이 매우 반응성인 미세아교세포에 의한 포식작용에 항체 의존적 방식으로 관련될 수 있음을 제시하고 있다. 게다가, TUNEL 염색(아폽토시스 세포에 대한 마커) 또는 NeUN 면역염색(뉴론의 생존성에 대한 마커)를 사용한 경우, 미처리된 마우스와 비교하여 GA와 IVX-908 면역화 또는 단독의 IVX-908 면역화시에 독성 증거는 관찰되지 않았다.

본원에서는 항체 비의존성이고 활성화된 미세아교세포에 의해 매개되는, 알쯔하이머병 치료를 위한 신규한 면역 치료학적 접근법이 제공된다. 다발성 경화증을 치료하는데 사용되는 약물을 비강 보조제(IVX-908)와 배합함으로써; 사람에서 독성 없이 다른 증상에 대해 이전에 사용된 바 있는 2가지 조성물(GA 및 프로테오좀계 보조제)을 사용한 경우, 미세아교세포는 활성화되어 Aβ-원섬유 플라크를 제거하고 전체 아밀로이드 부하량을 감소시키는 것으로 보인다. 동물에서의 연구가 Aβ 플라크의 감소가 인지 개선과 관련됨을 입증하였기 때문에, GA와 제형화된 IVX-908를 비강으로 백신접종하는 것이 알쯔하이머병 환자를 위한 효과적 치료법이다.

* 결과는 1:500 IgG의 역가에서 OD 수준으로서 나타낸다.

** 미처리된 동물(n=5) 및 BSA/CFA 처리된 동물(n=3) 간에 차이가 없었기 때문에, 대조군은 이들 두 그룹을 포함한 것이다. 전체 뇌 Aβ에 대해; 미처리된 그룹= 126.7±19.5; BSA/CFA 처리 그룹 123.7±33.2. 티오플라빈 양성 Aβ플라크의 면적%에 대해; 미처리된 그룹= 2.8±0.5; BSA/CFA 처리 그룹 2.2±0.9.

^a 대조군 대비 p<0.05

^b 대조군 대비 p<0.001; Aβ 대비 p<0.05

^c 대조군 대비 p<0.01

^d 대조군 대비 p<0.01; Aβ 대비 p<0.05

* 결과는 1:500 IgG의 역가에서 OD 450 수준으로서 나타낸다.

^a 대조군(미처리된 마우스) 대비 p<0.02

^b 대조군 대비 p<0.002

각주

* 결과는 1:50 IgG의 역가에서 OD 450 수준으로서 나타낸다.

^a 대조군 대비 p<0.02, GA 대비 p<0.02

^b 대조군 및 GA 대비 p<0.001; IVX-908 대비 p<0.04

^c 대조군 대비 p<0.001, GA 대비 p<0.002, IVX-908 대비 p<0.002

표 4의 각주

* 데이타는 각 처리에 대한 3개의 절편 및 대조군에 대한 6개의 절편(표 1과 같이 3개 미처리된 절편 + 3개의 BSA/CFA 처리된 절편)의 정량을 나타낸다.

^a r = -0.7 CD11b 대 Aβ 원섬유의 면적%

^b r = -0.65 CD3 대 Aβ 원섬유의 면적%; r= 0.74 CD3 대 CD11b

^c r = -0.7 M-CSFR 대 Aβ 원섬유의 면적%; r= 0.92 M-CSFR 대 CD11b.

^d r = -0.8 IFN-γ 대 Aβ 원섬유의 면적%; r= 0.9 IFN-γ 대. CD11b; r= 0.85 IFN-γ 대 CD3.

^e r = 0.91 TGF-β 대 Aβ 원섬유의 면적%; r= -0.77 TGF-β 대 CD11b; r= -0.6 TGF-β 대 CD3.

^f r= 0.67 IL-10 대 Aβ 원섬유의 면적%; r= -0.4 IL-10 대 CD11b.

^g p=0.0007 CD11b 대 GA; p<0.05 IFN-γ대 GA; p=0.0011 TGF-β 대 GA.

ⁱ 대조군 대비 p<0.05

ⁱⁱ 대조군 대비 p<0.02

ⁱⁱⁱ 대조군 대비 p<0.001

^iv 대조군 대비 p<O.OOl

재료 및 방법

마우스. (B6XD2)F1(평균 연령 14개월) 또는 (B6XSJL)F1 APP+(WT 또는 μMT) (평균 16개월) APP 유전자전이된 마우스를 모든 해당 지침에 따라서 브리검앤드우먼즈하스피탈(Brigham and Woman's Hospital)의 무균 시설에서 사육하고 사용하였다.

재료. IVX-908(프로톨린)은 나이세리아 메닝기티데스 외막 단백질(프로테오좀)과 쉬겔라 플렉스네리 LPS의 비-공유적 제형으로서 사람에서 안전하게 시험되었고 아이디 바이오메디칼(ID Biomedical, 캐나다 몬트리올 소재)로부터 입수하였다. 글라티라메르 아세테이트(Copaxone^R)는 알라닌, 라이신, 글루탐산 및 티로신의 랜덤 아미노산 공중합체이고 재발성 형태의 MS용으로 승인되고 널리 사용되며, 브리검앤드우먼즈하스피탈 약국으로부터 입수하였다. MOG(35-55) 및 PLP (139-151)는 브리검앤드우먼즈하스피탈의 신경계질환 센터에서 합성되었다.

APP+ 마우스에서 EAE의 유도 및 임상적 평가. (B6D2)F1 또는 (B6XSJL)F1 APP+(WT 또는 B-세포 결핍 μMT) 및 비-tg 동복자를 CFA 중의 100㎍ MOG(35-55), PLP 139-151 또는 100㎍ β-아밀로이드 펩타이드(1-40)로 뒷발바닥에서 면역화시켰다. 이렇게 한 직후 및 다시 48시간 후에 마우스에게 0.2ml PBS 중의 백일해 독소 150ng를 함유하는 주사제를 복강내 투여하였다. 동물을 면역화한지 7일 후부터 시작하여 EAE의 증상에 대해 모니터하고 다음과 같이 스코어화하였다: 0, 질환 없음; 1, 꼬리 마비; 2, 뒷다리 쇠약; 3, 뒷다리 마비; 4, 뒷다리와 앞다리 마비; 및 5, 빈사상태.

비강 백신접종. 글라티라메르 아세테이트: 25㎍를 첫주에 1일, 2일, 4일 및 5일째에 투여한 다음, 6주 동안 1주일 간격으로 부스트시켰다. IVX-908: 1㎍/마우스를 첫주에 1일 및 5일째에 투여한 다음, 6주 동안 1주일 간격으로 부스트시켰다. BSA+IVX-908: BSA 25㎍와 IVX-908 1㎍을 첫주에 1일 및 5일째에 투여하고, 단독의 BSA 25㎍을 2일째 및 4일째에 투여한 다음, BSA+IVX-908의 배합물로 6주 동안 1일주일 간격으로 부스트시켰다. GA+IVX-908: GA 25㎍와 IVX-908 1㎍을 첫주에 1일째 및 5일째에 투여하고, 단독의 GA 25㎍을 2일째 및 4일째에 투여한 다음, GA+IVX-908의 배합물로 6주 동안 1주일 간격으로 부스트시켰다.

아밀로이드 정량. 아밀로이드 부하량을 정량하기 위해, 우측 반구를 실온에서 3시간 동안 5.0M 구아니디늄-클로라이드(pH 8)에서 추출하였다. 희석액을 사용하여 샌드위치 효소면역 측정법(ELISA)에 의해 불용성(아밀로이드-관련) Aβ40 및 Aβ42의 수준을 측정하였다. Aβ 원섬유를 측정하기 위해, 좌측 반구를 4% 뇌 O/N 속에 고정시킨 다음, 4시간 동안 4.5% 슈크로즈 속에 고정시키고 이어서 4℃에서 O/N을 위해 20% 슈크로즈 속에 고정시켰다. 뇌를 OCT 파라포름알데히드의 존재하에 동결시키고, 14-㎛ 종방향 절편으로 절단하여 면역조직학 염색 및 아밀로이드 원섬유 정량을 위해 사용하였다. 플라크내 아밀로이드 원섬유의 양을 정량하기 위해 티오플라빈-S 염색을 사용하여 잘 한정된 해마 영역(브레그마 -1.34)을 선별하였다. 이들 절편의 영상(배율 x20)을 3CCD 컬러 비디오 카메라로부터 수집하고 적절한 소프트웨어(NIH; Imaging Research)로 분석하였다. 아밀로이드 원섬유의 양은 소프트웨어로 측정된 mm² 해마 영역당 백분율로서 표시하였다.

면역조직학. 다음 마커들을 사용하여 염색을 실시하였다: T-세포(CD3; BD Biosciences:553057), 미세아교세포/대식세포(CD11b; Serotec:MCA74G), (C-MFR; Cymbus Biotech:21080096), IFN-γ(Pharmingen: 559065), IL-10(Pharmingen:559063) 및 TGF-β(RD:AB-20-PB). 항-아밀로이드 항체(R1282)는 데니스 셀록(Dennis Seloke)에 의해 제공되었다. 뇌 절편을 추가로 헤마톡실린 염색하였다. 절편들을 맹검(blinded) 방식으로 평가하고, 대조군에는 이전에 기술한 동종형 일치된(isotype-matched) mAb의 사용을 포함시켰다. 각 처리마다 3개의 상이한 뇌 절편의 해마 영역으로부터 정량하였다(동일한 영역, 브레그마-1.34, 이는 ThS 염색을 위해 사용하였다). 결과는 각 마커에 대한 표지된 세포의 평균으로서 표시하였다.

신경병리학. 신경독성을 검사하기 위해 좌측 반구를 4% 파라포름알데히드 속에 밤새 고정시킨 다음, 4시간 동안 4.5% 슈크로즈 속에 고정시키고 이어서 4℃에서 밤새 20% 슈크로즈 속에 고정시켰다. 뇌를 OCT 파라포름알데히드의 존재하에 동결시키고, 14-㎛ 종방향 절편으로 절단하여 면역조직학 염색을 위해 사용하였다. 본 발명자들은 신경 스트레스 및 혈뇌 장벽 완전성(integrity)을 위해 사용되는 다음의 4개의 마커에 대해 염색하였다: GFAP (Sigma;G9269), SMI32 (Serotec), TUNEL (Roche 1 684 817), iNOS (CHEMICON:AB5382) 및 피브리노겐(Dako: A0080). 성상교세포증은 성상교세포로 둘러싸인 해마 영역 mm²당 백분율로서 표시한다. iNOS, SMI32 및 피브리노겐에 대한 염색을 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(29). 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개성 dUTP 닉-말단 표지화(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling; TUNEL)을 제조업자(Roche 1 684 817) 권장사항에 따라 수행하였다. H&E 염색을 수행하여 계수된 세포의 형태를 동정하였다. 염색을 비편향 입체해석 접근법(unbiased stereological approach)으로 NIH의 영상화 조사 소프트웨어를 사용하여 맹검 방식으로 그룹당 동물 4마리씩, 동물당 2개의 연속적 절편에 대해 수행하였다. 일차 운동 피질(브레그마 바깥쪽 1.44mm)로부터의 그룹당 염색은 도 6에 도시한다.

데이타 분석. 모든 연속적 및 순차적 데이타는 평균±sem으로 표시한다. 데이타 비교는, 두 그룹을 비교하는 경우에 스튜던트 t-검정(Student's t-test)을 사용하여 수행하였고, 3개 이상의 그룹을 분석한 경우에 일원 분산분석(one-ANOVA analysis)을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되며, r 값은 엑셀 통계 프로그램을 사용하여 계산하였다.

특허, 특허원 및 간행물을 포함하는 본원에서 언급된 모든 참조문헌은 이전에 구체적으로 인용되었는지에 관계없이 전문이 본원에서 참조로 인용된다.

앞서 본 발명을 충분히 설명했으며, 당업자라면 본 발명을 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 광범위한 등가 매개변수, 농도 및 조건 내에서 실시할 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명은 이의 구체적 양태와 관련하여 설명하였지만, 추가로 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 본 출원은 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 또는 통상적인 실시의 범위내에 있으며 상기 제시한 필수적 특성에 적용될 수 있는, 본원의 개시내용으로부터의 변경을 포함하여 일반적으로 본 발명의 원리에 따라 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 변용을 포함하고자 한다.

Claims

(i) 나이세리아(Neisseria) 종 기원의 프로테오좀(proteosome) 및 (ii) 쉬겔라(Shigella) 종으로부터 수득되는 외인성 지질다당류를 포함하는 프로테오좀계 보조제를 포함하는 프로테오좀계 조성물을 포함하는, 포유동물에서 베타-아밀로이드 질환인 신경계 질환 또는 장애를 예방하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로테오좀계 조성물과 동일한 제형 또는 별도의 제형으로 글라티라메르 아세테이트(glatiramer acetate)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 베타-아밀로이드 질환이 조기 발병 알쯔하이머병, 후기 발병 알쯔하이머병 및 증상발현전 알쯔하이머병으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로테오좀이 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터 유래되고, 지질다당류가 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)로부터 유래되는, 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 안정화제 또는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 비의존성 반응을 유도하는 약제학적 조성물.
(a) 생리학적으로 허용되는 담체, 및 (i) 나이세리아(Neisseria) 종 기원의 프로테오좀 및 (ii) 쉬겔라(Shigella) 종으로부터 수득되는 외인성 지질다당류를 포함하는 프로테오좀계 보조제를 포함하는 프로테오좀계 조성물; 및
(b) 글라티라메르 아세테이트와 생리학적으로 허용되는 담체
를 포함하는, 항체 비의존성 면역반응을 유도할 수 있고 가용성 또는 불용성 아밀로이드 베타 펩타이드를 감소시킬 수 있는 제제.
제7항에 있어서, 상기 프로테오좀이 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터 유래되고, 지질다당류가 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)로부터 유래되는, 제제.