FI120236B - Kopolymeeri-1 parannuksia kopolymeerien seoksiin - Google Patents

Description

KOPOLYMEERI-1 PARANNUKSIA KOPOLYMEERIEN SEOKSIIN

Tämä patenttihakemus on 23. marraskuuta 1994 kirjatun julkaisun U.S.S.N 08/344,248 jatko-osa, joka on 24. huhtikuuta 1994 kirjatun julkaisun U.S.S.N 5 08/248,037 jatkoa.

Kopolymeeri-1 on myeliiniperusproteiinin (MBP, myelin basic protein), joka on myeliinisuojatu-pen luonnollinen ainesosa, synteettinen polypeptidia-nalogi. Sitä on ehdotettu mahdolliseksi lääkeaineeksi 10 multippeli skleroosia ajatellen (Eur. J. Immunol.

(1971) 1:242; ja J. Neurol. Sei. (1977) 31:433). Kaikki mainitut viitteet sisällytetään kokonaisuudessaan tähän hakemukseen tällä viittauksella. Kiinnostus ko-polymeeriä-1 kohtaan immuunihoitona multippeli skle-15 roosia ajatellen juontaa ensimmäisinä 1950-luvulla tehtyihin havaintoihin, että myeliinin ainesosat, kuten MBP, estävät tai jarruttavat kokeellista autoimmuunia aivoselkäydintulehdusta (EAE, experimental autoimmune encephtalomyelitis). EAE on multippeli skle-20 roosia muistuttava tauti, joka voidaan aiheuttaa herkille eläimille.

Kopolymeerin-1 kehittivät lääkärit Sela, Arnon ja heidän kollegansa Weizman-instituutissa *···1 (Rehovor, Israel) . Sen osoitettiin vaimentavan EAE:ta • · · 25 (Eur. J. Immunol. (1971) 1:242; patentti U.S.

*.·.ϊ 3,849, 550). Viime aikoihin asti kopolymeerin-1 osoi- ·:· tettiin olevan hyödyllinen potilaille, joilla on mul- ; tippeli skleroosin paheneva-lievenevä muoto (N. Engl.

• · · J. Med. (1987) 317:408). Kopolymeerin-1 päivittäisillä 30 ruiskeilla hoidetuilla potilailla oli vähemmän taudin . pahenemisia ja vähemmän kasvua heidän työkyvyttömyys- • · · *”·1 tilassaan kuin vertailupotilailla.

• · · * Kopolymeeri-1 on alaniinista, glutamiiniha- :1·.· posta, lysiinistä ja tyrosiinista koostuvien polypep- t · 35 tidien seos keskinäisessä moolisuhteessa n. 6:2:5:1.

• · ,1. Sitä syntetisoidaan polymeroimalla kemiallisesti näitä • · · • · · • · · · · · • · • · • · · 2 neljää aminohappoa muodostaen tuotteita, joiden keskimääräiset molekyylipainot ovat 23,000 daltonia (Da)(patentti U.S. 3,849,550).

Keksinnön tarkoitus on tuottaa parannettu ko-5 pylymeeri-1 seos.

Keksintö koskee pääosin kopolymeeri-1:n muodoista, joiden molekyylipaino on yli 40 kilodaltonia (kDA), vapaata kopolymeeri-l-seosta.

Keksintö koskee lisäksi kolopymeeria-1, jonka 10 mooliosuudesta yli 75 % on molekyylipainoalueella 2-20 kDa.

Lisäksi keksintö koskee kopolymeeria-1, jonka keskimääräinen molekyylipaino on n. 4-8,6 kDa.

Sen lisäksi keksintö koskee lääkeseosta ja 15 menetelmää multippeli skleroosin hoitamiseksi käyttäen edellä mainittua kopolymeeria-1.

Keksintöä kuvataan seuraavassa lyhyesti viitaten liitteenä oleviin piirroksiin, joissa kuva 1 esittää kolmen kopolymeeri-l-panoksen 20 molekyylipainojakautumaa osoittaen muotojen suhteen molekyylipainoon 40 kDa:n yläpuolella ja kuva 2 esittää vastaavia tietoja koskien moo-liosuutta.

.* Keksintö koskee pääosin kopolymeerin-1 muo- • · · .***· 25 doista, joiden molekyylipaino on yli 40 kDa, vapaata • · · . .·. kopolymeeri-1 seosta. Seos sisältää edullisesti alle 5 • * · % kopolymeeri-1:n muotoja, joiden molekyylipaino on 40 ***! kDa tai enemmän. Edullisemmin seos sisältää alle 2,5 % • · · • · * l” kopolymeeri-1:n muotoja, joiden molekyylipaino on 40 • · · '·* * 30 kDa tai enemmän.

Keksintö koskee edelleen kolopymeeria-1, jon-ka mooliosuudesta yli 75 % on molekyylipainoalueella • · · 2—20 kDa.

: Lisäksi keksintö koskee kopolymeeria-1, jonka • · · ! 35 keskimääräinen molekyylipaino on n. 4-8,6 kDa. Erityi sesti keksintö koskee kopolymeeria-1, jonka keskimääri I räinen molekyylipaino on n. 4-8 kDa ja kopolymeeria-1, *«» • · • t • · · 3 jonka keskimääräinen molekyylipaino on n. 6,25-8,4 kDa.

Keksinnön mukainen kopolymeeri-1 voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esim. paten-5 tissa U.S. 3,849,550 julkaistulla prosessilla, jossa tyrosiinin, alaniinin, γ-bentsyyliglutamaatin ja E-N-trifluoriasetyylilysiinin N-karboksianhydridejä poly-meroidaan huoneenlämpötilassa vedettömässä dioksaanis-sa dietyyliamiinin toimiessa initiaattorina. Glutamii-10 nihapon γ-karboksyyliryhmän suojauksen poisto suoritetaan bromivedyllä jääetikassa ja sitä seuraa trifluo-riasetyyliryhmien poisto lysiinisaostumista IM piperi-diinin avulla. Patenttihakemuksen tarkoituksiin termien ympäristön lämpötila ja huoneenlämpötila pitäisi 15 ymmärtää tarkoittavan lämpötilaa, joka on alueella n. 20-26°C.

Tarvittavan molekyylipainojakautuman omaava kopolymeeri-1 voidaan saada aikaan jommalla kummalla sinänsä tunnetulla menetelmällä. Näihin menetelmiin 20 kuuluvat kopolymeerin-1 kromatografinen erottelu, joka sisältää korkean molekyylipainon muotoja ja kerää talteen jakeet ilman ei haluttuja muotoja, tai osittaisen happo- tai entsyymihydrolyysin avulla poistaen korkean .* molekyylipainon muodot puhdistamalla jälkikäteen dia- ··· .***. 25 lyysin tai ultrasuodatuksen avulla. Lisämenetelmä ha- • * • · · , .·. lutun molekyylipaino jakautuman omaavan kopolymeerin-1 « * · *'J, aikaansaamiseksi on valmistaa haluttuja muotoja amino- **"! happojen ollessa vielä suojattuja ja saada sitten oi- • · ♦ ’·”* keitä muotoja suoraan suojauksen poistamisen jälkeen.

% · ♦ *** * 30 Keksinnön seoksia voidaan formuloida tavanomaisilla alalla tunnetuilla menetelmillä. Seos tehdään edulli-sesti lyofiiliseksi ja muodostetaan ihonalaiseen ruis-kutukseen sopivaksi vesiliuokseksi. Vaihtoehtoisesti ; kopolymeeria-1 voidaan formuloida kaikissa alalla tun- • · · * I 35 netuissa muodoissa suun, nenän, posken tai peräsuolen kautta annettavien peptidilääkeformulaatioiden valmis- : tamiseksi.

• · · · ·*· • · • · • · · r

Tyypillisesti kopolymeeria-1 annetaan päivittäin 20 mg:n annoksina potilaille, jotka kärsivät multippeli skleroosista.

Keksintöä kuvataan esimerkkien avulla, mutta 5 ei ehdottomasti rajoiteta seuraaviin esimerkkeihin.

Esimerkki 1

Alhaisen myrkyllisyyden omaavan kopolymeerin-1 kromatografinen valmistusmenetelmä 10 Kaksi kopolymeeri-l-panosta valmistettiin alalla tunnettujen menetelmien, esim. patentin U.S. 3,849,550, mukaisesti.

Toinen panos altistettiin sitten alla olevassa kuvattuun kromatografiseen erotteluun.

15 Geelisuodatuskolonni, FRACTOGEL TSK HW55 (600x26 mm), valmisteltiin Superformance 26 Merck- panokseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolonni tasapainotettiin vedellä ja asetoniliuosta ruiskutettiin kokonaistilavuuden määrittämiseksi. Kolonni tasapaino-20 tettiin 0,2M ammoniumasetaattipuskurilla, jonka pH oli 5,0. Kopolymeeri-l-näytteitä (20 mg/ml, 0,2M ammoniu-masetaatissa, pH = 5,0) syötettiin kolonniin 30 ml ja jakeita kerättiin talteen 10 minuutin välein. Jae, • · . jonka keskimääräinen molekyylipaino on 7-8 kDa, eris- 25 tettiin välillä 120-130 minuuttia (panos A) .

• · · • · · • · · ···

Molekyylipainoanalyysi «

UV-absorbanssi 275 nm: 11a määritettiin UVIKON

• · · • · ♦ I" 810- spektrofotometrilla. Näytteitä laimennettiin alle to · · *·* * 30 1 absorbtioyksikön UV-absorbanssin aikaansaamiseksi.

Näiden kahden panoksen molekyylijakautuma määritettiin :.i.: kalibroidulla geelisuodatuskolonnilla (Superose 12) .

··· V · Kopolymeeri-l-panoksen A keskimääräisen mole- .·) : kyylipainon havaittiin olevan 7-8 kDa. Tästä panokses- • ·· 35 ta 2,5 % oli molekyylipainoltaan 32 kDa:n yläpuolella, • · . mutta molekyylipainoltaan yli 40 kDa:n kopolymeeri-1- • · ·,· · muotoja ei ollut mukana tässä panoksessa.

• · · • · • · ··· 5

Toisen kopolymeeri-l-panoksen, jota ei käsitelty kromatografiän avulla, molekyylipaino oli 12 kDa. Panoksesta 2,5 % oli molekyylipainoltaan yli 42 kDa ja 5 % kaikista kopolymeeri-l-muodoista tässä pa-5 noksessa oli molekyylipainoltaan yli 40 kDa.

Esimerkki 2

Myrkyllisyysanalyysi A: Elimistössä tapahtuva 10 Kolme kopolymeeri-l-panosta, joiden molekyy- lipainot ovat 7,3 ja 8,4 kDÄ (alle 2,5 % kopolymeeri-1 muotoja yli 40 kDa) ja 22 kDa (yli 5 % kopolymeeri-1 muotoja yli 40 kDa) altistettiin alla olevassa kuvattuun myrkyllisyyskokeeseen. Kaikissa tapauksissa käy-15 tettiin viittä hiirtä kussakin koeryhmässä.

Menetelmä

Kopolymeeria-1 liuotettiin tislattuun veteen aktiivisen ainesosan 2 mg/ml:ssa olevan liuoksen saamiseksi. Kuhunkin hiireen ruiskutettiin 0,5 ml koeliu-20 osta ulompaan häntälaskimoon. Hiiristä havainnoitiin kuolleisuus ja asiaan kuuluvat sairausoireet 48 tunnin aikana. Havaintoja tehtiin 10 minuuttia, 24 tuntia ja . . 48 tuntia ruiskutuksen jälkeen. Mikäli kaikki eläimet *;··’ olivat elossa 48 tunnin päättyessä, eikä negatiivisia • · '··.1 2 3 25 oireita havaittu, silloin panos määriteltiin myrkyttö- mäksi. Jos kuitenkin yksi tai useampi hiiri oli kuol- ..1·1 lut tai osoittanut negatiivisia oireita, silloin panos ; määriteltiin myrkylliseksi.

• ·· ·1·1: Panokset, joiden molekyylipainot olivat 7,3 30 ja 8,4 kDa, määriteltiin molemmat myrkyttömiksi, kun taas panoksessa, jonka molekyylipaino oli 22 kDa, koi- • · · lii me viidestä hiirestä oli kuollut 48 tunnin päättyessä • · · \1 ja se määriteltiin näin ollen myrkylliseksi.

• ♦ • · · • · · • · *:1·: 35 B: Elimistön ulkopuolella tapahtuva .1. RBL - solunjyvästen häviämiskoe • · · ··· · · · • · 2 • · 3 6 I. Johdanto

Histamiinin (tai serotoniinin) vapautuminen basofiilisesta aineesta on elimistön ulkopuolella tapahtuva malli suorasta yliherkkyydestä. Rotan basofii-5 linen leukemia solusukupolvi (RBL-2H3) kehitettiin ja tunnistettiin erittäin herkäksi, yhtenäiseksi, helpoksi säilyttää viljelmässä ja toistettavaksi järjestelmäksi (E. L. Basumian, C. Isersky, M. G. Petrino ja R.

P. Siraganian, Eur. J. Immunol. 11, 317 (1981)). Fy- 10 siologinen ärsyke histamiinin vapautumista ajatellen käsittää vasta-aineen synnyttäjän sitomisen kalvoon sidottuihin IgE-molekyyleihin, mikä johtaa viimemainitun silloittumiseen ja myöhempään monimutkaisen biokemiallisen ketjureaktion laukeamiseen. Näiden fysiolo-15 gisten immunoglobuliinivälitteisten ketjureaktion ai kaansaavien aineiden lisäksi solunjyvästen häviämisen voivat aiheuttaa erilaiset ei-IgE-välitteiset ärsykkeet. Näiden joukossa ovat erilaiset peptidit ja synteettiset polymeerit, esim. polylysiini (R. P. Siraga-20 nian, Trends in Pharmacological Sciences, lokakuu 432 (1983)). RBL-solunjyvästen häviämiskoetta käytetään sen vuoksi niiden kopolymeeri-l-panosten seulomiseksi eroon, jotka herättävät merkittävää solunjyvästen hä- • · ·...· viämistä ja saattaisivat siten tuoda esiin ei- • ·· 25 toivottuja paikallisia ja/tai sisäisiä sivuvaikutuk- : siä.

• · · f • · · ··«· . .·. II. Koemenetelmän periaate • · ·

Rotan basofiilisia leukemia soluja (RBL-2H3) *** * 3 30 ladataan [ H]-serotoniinilla, sen jälkeen inkuboidaan 100 pg:lla testattavaa kopolymeeria-1. Kopolymeeri-1- • · · *·Σ·* panokset, jotka aiheuttavat ei-ominaista solunjyvien ♦ ♦ · V * häviämistä, vapauttavat [3H]-serotoniinia väliainee- : seen. Väliaineessa oleva radioaktiivisuus lasketaan • ♦♦ « · 35 tuikelaskimella ja säteilymerkitty soluihin liittynyt « · • kokonaisserotiini määritetään rakeisissa soluissa.

• ♦ : Prosentuaalinen solunjyvien häviäminen lasketaan lii- «·· • · • ♦ ·· · 7 tetystä kokonaismäärästä vapautuneen serotoniinin prosenttiosuutena .

III. Tulokset 5 Neljä kopolymeeria-l-panosta, joiden keski määräinen molekyylipaino on välillä 6,250-14,500, analysoitiin sekä molekyylipainon 40 kDa ylittävien muotojen prosenttiosuuden että RBL:n solunjyvien häviämisen osalta. Tulokset on esitetty yhteenvetona seuraa-10 vassa taulukossa.

Taulukko

Keskimääräinen Molekyylipainoltaan Vapautuneen sero-molekyylipaino yli 40 kDa:n muoto- toniinin %-osuus (Da) jen %-osuus 6,250 < 2,5 Ϊ2~4 7,300 < 2,5 21,0 13,000 > 5 6679 14,500 Γ~5 67,8 15 Kuten voidaan nähdä, suurimolekyylipainoisten muotojen prosenttiosuuden ollessa alhainen (< 2,5 %) serotoniinin vapautumisprosentti, joka ilmaisee myr- • · ·,..ί kyllisyyden, on pieni ja päin vastoin.

• ·· • · • · • · · i 20 Esimerkki 3 • · ·

Trifluoriasetyylikopolymeerin-l valmistus • » · · .·. Suojattu kopolymeeri-1 valmistetaan, kuten

I · I

V.'. Teitelbaum et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Eur. J.

i : : • Immun. osa 1 s. 242 (1971), tyrosiinin (18 g), alanii-25 nin (50 g), γ-bentsyyliglutamaatin (35 g) ja trifluo- • · · ’.i.* riasetyylilysiinin (83 g) N-karboksianhydrideista, • · a V · jotka on liuotettu 3,5 litraan dioksaania.

a : Polymerointiprosessia initioidaan lisäämällä 0,01-0,02 % dietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitetaan • · . 30 huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan ja kaadetaan sitten • · i.: : 10 litraan vettä. Tuote (suojattu kopolymeeri-1) suo- • · · • · • · »·* 8 datetaan, pestään vedellä ja kuivataan. Gammabentsyyliä suojäävien ryhmien poisto glutamaattisaostumasta suoritetaan käsittelemällä suojattua polymeeria-1 bromi vetyhapolla (33 %) jääetikassa sekoittaen huoneen-5 lämpötilassa 6-12 tunnin ajan. Tuote kaadetaan puhtaaseen veteen, suodatetaan, pestään ja kuivataan antaen saannoksi trifluoriasetyylikopolymeeria-1.

Esimerkki 4 10 Trifluoriasetyylikopolymeerin-1 valmistus

Suojattua kopolymeeria-1 valmistetaan, kuten Teitelbaum et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Eur. J. Immun. osa 1 s. 242 (1971), tyrosiinin (18 g), alanii-nin (50 g) , ω-bentsyyliglutamaatin (35 g) ja trifluo- 15 riasetyylilysiinin (83 g) N-karboksianhydrideista, jotka liuotetaan 3,5 litraan dioksaania.

Polymerointiprosessia initioidaan lisäämällä 0,01-0,02 % dietyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan ja kaadetaan sitten 20 10 litraan vettä. Tuote (suojattu kopolymeeri-1) suo datetaan, pestään vedellä ja kuivataan.

Suojattua kopolymeeria-1 käsitellään HBrrlla (33 %) jääetikassa, joka poistaa omegabentsyyliä suo-*...* j aavan ryhmän glutamaattisaostuman 5-karboksylaatista f ·« 25 ja pilkkoo polymeerin pienemmiksi polypeptideiksi. Mo- ::: lekyylipainoltaan 7,000±2,000 Da olevan kopolymeerin-1 »·· aikaansaamiseen tarvittava aika riippuu reaktiolämpö- *·«· . tilasta ja suojatun kopolymeerin-1 koosta. Lämpöti- «·· ,*··, loissa välillä 20-28°C koereaktio toteutetaan kullekin « · i 30 panokselle eri aikajaksojen kuluessa, esim. 10-50 tun- . nin kuluessa.

i * · *··* Näiden laboratoriomittakaavaisten reaktioiden ·«» « * * *»* * molekyylipainoja koskevat tulokset lasketaan ja piir- * :\j retään molekyylipainokäyrä ajan funktiona. Molekyyli- » · 35 painon 7,000±2,000 Da saamiseen tarvittava aika laske taan käyrästä ja toteutetaan suurempimittakaavainen • · · : reaktio. Keskiarvona työskenneltäessä 26°C:ssa aika- m*· t * Λ · «· · 9 jakso on 17 tuntia. Tuote kaadetaan puhtaaseen veteen, suodatetaan, pestään ja kuivataan antaen saannoksi trifluoriasetyylikopolymeeria-1.

5 Alhaisen myrkyllisyyden omaavan kopolymeerin- 1 valmistus 20 g trifluoriasetyylikopolymeeria-1 disper-goidaan 1 litraan vettä, johon lisätään 100 g piperi-diiniä. Seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 24 tun-10 nin ajan ja suodatetaan. Raaka kopolymeeri-l-liuos jaetaan dialyysipusseihin ja dialysoidaan 10-20°C:ssa vettä vastaan, kunnes saavutetaan pH-arvo 8. Sitten sitä dialysoidaan etikkahappoa (n. 0,3 %) vastaan ja uudelleen vettä vastaan, kunnes saadaan pH-arvo 5,5-15 6,0. Sitten tämä liuos väkevöidään ja lyofilisoidaan kuivaksi.

• » m • «

»•I

• M

• · • · » · · • « · «»· *·· • # · • · · *·· • 9 · » · » m » · • · · 99· ··· 11« • · · «

Claims (17)

1. Seos, johon kuuluu polypeptidejä ryhmästä glutamiinihappo, lysiini, alaniini ja tyrasiini, tunnettu siitä, että seoksella on keskimääräi- 5 nen molekyylipaino, noin 4-9 kDa, ja siitä että poly-peptidien seos ei ole yhdenmukainen mitä tulee mole-kyylipainoon ja molekyylirakenteeseen.

2. Vaatimuksen 1 mukainen seos, tunnet -t u siitä, että alle 5 % polypeptideistä on yli 40 10 kDa:n painoisia.

3. Jonkin aiemman vaatimuksen mukainen seos, tunnettu siitä, että yli 75 % polypeptideistä on molekyylipainoalueella 2-20 kDa.

4. Vaatimuksen 3 mukainen seos, tunnet-15 t u siitä, että seoksen keskimääräinen molekyylipaino on välillä 6,25-8,4 kDa.

5. Vaatimuksen 1 mukainen seos, tunnet-t u siitä, että seoksen keskimääräinen molekyylipaino on välillä 4-8,6 kDa.

6. Vaatimuksen 1 mukainen seos, tunnet - t u siitä, että seoksen keskimääräinen molekyylipaino on välillä 5-9 kDa.

.···. 7. Vaatimuksen 1 mukainen seos, tunnet- • · t u siitä, että alle 2,5 % polypeptideistä on yli 40 • · '** 25 kDa:n painoisia.

• · · *·*·* 8. Vaatimuksen 7 mukainen seos, tunnet- • · · ··.: t u siitä, että yli 75 % polypeptideistä on molekyy- ·.·.· lipainoalueella 2-20 kDa. • · φ V

· 9. Vaatimuksen 8 mukainen seos, tunnet- 30. u siitä, että seoksen keskimääräinen molekyylipaino :*·*: on välillä 6,25-8,4 kDa.

.**·. 10. Vaatimuksen 1 mukainen seos, t u n - • · • · · # ·# n e t t u siitä, että seoksen molekyylipaino jakauma • · · ί·! ' vastaa pääosin kuvassa 1 tai kuvassa 2 esitettyä käy- • · · *...· 35 rää, ja jossa keskimääräinen molekyylipaino on noin .·*.*. 7,7 kDa. • · · • · • ·

11. Farmaseuttinen seos multippeliskleroosin hoitamiseen, tunnettu siitä, että se sisältää jossakin vaatimuksista 1-10 kuvattua seosta.

12. Vaatimuksen 11 mukainen farmaseuttinen 5 seos multippeliskleroosin hoitamiseen, tunnettu siitä, että se sisältää farmaseuttisesti tehokkaan määrän jonkin vaatimuksista 1-10 määriteltyä seosta ja farmaseuttisen kantajan.

13. Vaatimuksen 11 mukainen farmaseuttinen 10 seos multippeliskleroosin hoitamiseen, tunnettu siitä, että seos on valmistettu seuraavilla vaiheilla: reagoimalla suojattu kopolymeeri-1 bromivetyhapon kanssa muodostaen trifluoroasetyylikopolymeeri-1, jolla on yli 75 % moolifraktiosta molekyylipaino- 15 alueella 2-20 kDa, ja joka reaktioaika ja lämpötila on määritetty testireaktiolla, ja käsittelemällä trifluoroasetyylikopolymeeriä-1, jolla on yli 75 % moolifraktiosta molekyylipaino- alueella 2-20 kDa, piperidiinivesiliuoksella kopo- 20 lymeeri-1 muodostamiseksi, jolla on yli 75 % mooli- fraktiosta molekyylipainoalueella 2-20 kDa.

... 14. Jonkin vaatimuksista 1-10 mukaisen seok- • · *···* sen käyttö lääkeaineen valmistamiseksi multippeliskle- • · · • · roosin hoitamiseen.

15. Menetelmä jonkin vaatimusten 1-10 seok- ·” sesta valmistamiseksi, tunnettu siitä, että • · · · : ·*; - reagoidaan suojattu kopolymeeri-1 bromivetyhapolla • · · muodostaen trif luoroasetyylikopolymeeri-1 käsitellään sanottua trifluoroasetyylikopolymeeri- ... 30 l:tä piperidiinivesiliuoksella raakakopolymeeri-1 • · · *.. muodostamiseksi • · *”·* - puhdistetaan sanottu raakakopolymeeri-1 halutun puhtaan kopolymeeri-1 :n saamiseksi, jolla on yli 75 % moolif raktiosta molekyylipainoalueella 2-20 kDa. • · · ,1. 35

16. Vaatimuksen 15 mukainen menetelmä, • · · *·* [ tunnettu siitä, että suojattu kopolymeeri-1 • · reagoidaan bromivetyhapon kanssa 10-50 tuntia lämpötilassa 20-28°C.

17. Vaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojattu kopolymeeri-1 5 reagoidaan bromivetyhapon kanssa 17 tuntia lämpötilassa 2 6°C. ««· • · • · • · · »·· • · • · • · · • · · • · · • · · • · · ···· • · « • · · • · 1 • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · • « · • · • · · • · · • · • · · • « • · • · · • · ·· • · 1 • · »