JPH10500955A - コポリマー１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、40キロダルトンを超える分子量を有する種類が実質的にないコポリマー１を含むコポリマー１の改良された組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 コポリマー１ コポリマーの組成物における改良 本願は、1994年３月24日に出願されたU.S.S.N.08／248,037の継続である1994 年11月23日に出願されたU.S.S.N.08／344,248の一部継続である。 発明の背景 コポリマー１（Copolymer-1）はミエリン鞘の天然の構成物であるミエリン塩 基性蛋白質（MBP）の合成ポリペプチドアナログである。多発性硬化症のため潜 在的な治療剤として示唆されている（Eur．J．Immunol．（1971）１：242；及び Neurol．Sci．（1977）31：433）。本明細書に言及される全ての引用は、その全 体において引用により本明細書に組み込まれている。多発性硬化症のための免疫 療法としてのコポリマー１における関心は、MBPのようなミエリン構成物が実験 的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を防ぐ又は抑えるという1950年代に最初に示され た観察結果から生じている。EAEは感受性のある動物において誘導され得る多発 性硬化症に似た病気である。 コポリマー１は、Weizmann Institute（Rehovot，Israel）においてDrs．Sela ．Arnon、及び彼らの共同研究者らにより開発された。それはEAEを抑制すること が示されている（Eur．J．Immunol．（1971）１：242；米国特許第3,849,550号 ）。更に最近に、コポリマー１は多発性硬化症の憎悪−軽減形態における患者に 有益であることが示されている（N．Engl．J．Med．（1987）317：408）。コポ リマー１の毎日の注入で治療された患者はほとんど悪化せず、対照患 者よりその廃疾状態が少し増加した。 コポリマー１は各々約６：２：５：１のモル比におけるアラニン、グルタミン 酸、リシン及びチロシンからなるペプチドの混合物である。それは、23,000ダル トンの平均分子量を有する産物を形成する４つのアミノ酸を化学的に重合するこ とにより合成される（米国特許第3,849,550号）。 本発明の目的はコポリマー１の改良された組成物を提供することである。 発明の概略 本発明は、40キロダルトン（KDa）を超える分子量を有するコポリマー１の種 類が実質的にないコポリマー１の組成物に関する。 本発明は更に、約２KDa〜約20KDaの範囲の分子量におけるコポリマー１の分子 フラクションの75％超を有するコポリマー１に関する。 更に、本発明は、約４〜約8.6KDaの平均分子量を有するコポリマー１に関する 。 更に本発明は、先に記載されるコポリマー１を用いる多発性硬化症の治療のた めの医薬組成物及び方法に関する。 図面の簡単な説明 図１はコポリマー１の３つのバッチの分子量分布を示し、40KDaを超える分子 量を有する種類の割合を示す。 図２はその分子のフラクションに関する同様のデータを示す。 発明の詳細な記載 本発明は40キロダルトン（KDa）を超える分子量を有するコポリマ ー１の種類が実質的にないコポリマー１の組成物に関する。好ましくは、組成物 は40KDa以上の分子量を有するコポリマーの種類の５％未満を含む。更に好まし くは、この組成物は、40KDa以上の分子量を有するコポリマー１の種類の2.5％未 満を含む。 本発明は更に、約２KDa〜約20KDaの範囲の分子量におけるコポリマー１の分子 のフラクションの75％超を有するコポリマー１に関する。 更に、本発明は、約４〜約8.6KDaの平均分子量を有するコポリマー１に関する 。特に、本発明は約４〜約8KDaの平均分子量を有するコポリマー１及び約6.25〜 約8.4KDaの平均分子量を有するコポリマー１に関する。 本発明に従うコポリマー１は、当該技術において周知である方法、例えばチロ シン、アラニン、ｙ−ベンジルグルタメート及びＥ−Ｎ−トリフルオロ−アセチ ルリシンがイニシェーターとしてジエチルアミンを用いて無水ジオキサン中にお いて周囲の温度において合成される米国特許第3,849,550号において開示される 方法により調整され得る。グルタミン酸のｙ−カルボキシル基のデブロッキング (debloking)は氷酢酸中の臭化水素により行われ、次に１Ｍビペリジンによりリ シン残基からトリフルオロアセチル基が除去される。適用の目的のために、“周 囲温度”及び“室温”という言葉は約20〜約26℃の範囲の温度を意味すると理解 されるべきである。 必要とされる分子量プロファイルを有するコポリマー１はそれ自体周知である 方法によりいずれにおいても得られうる。このような方法は高分子量の種類を含 むコポリマー１のクロマトグラフィー及び不必要な種類を含まないフラクション の収集、又は部分酸又は酵素加水分解により高分子量種類を除去して次に透析も しくは限外ろ過による精製を含む。必要な分子量プロファイルを有するコポリマ ー１を得るための更なる方法は、アミノ酸がなお保護されてその後保護を除去す ることに直接よる正確な種類を得る必要な種類を調製することによる。本発明の 組成物は当該技術において周知である慣用的方法により製剤される。好ましくは 、組成物は凍結乾燥され、皮下注入に適した水溶液内に形成される。あるいは、 コポリマー１はペプチド薬剤の経口、鼻、頬、又は直腸製剤を調製するための当 該技術において周知である形態のいずれかにおいて調剤され得る。 典型的には、コポリマー１は20mgの投与量において多発性硬化症を患う患者に 毎日投与される。 本発明は以下の実施例により例証されるであろうが必要に限定されない。 実施例１ 低毒性コポリマー１の調製のクロマトグラフィー法 コポリマー１の２つのバッチを当該技術において周知である方法、例えば米国 特許第3,849,550号に従って調製した。 その後１つのバッチに以下に記載のようにクロマトグラフィー分離を行った。 ゲルろ過のためのカラム、FRACTOGEL TSK HW 55（600×26mm）を製造元の説明 書に従ってSuperformance 26 Merckカートリッジ中に調製した。カラムを水で平 衡化してアセトン溶液を全容量決定のために注入した。このカラムを0.2Ｍ酢酸 アンモニウム緩衝液pH5.0で平衡化した。30mlのコポリマー１サンプル（20mg／m l，0.2Ｍ酢酸アンモニウムpH5.0中）をカラム上に流して10分毎にフラクション を収集した。７〜８KDaの平均分子量を有するフラクションを120〜130分の間に おいて単離した（バッチＡ） 分子量分析 UVIKON 810分光光度計において275nmにおけるUV吸収を測定した。サンプルを １吸収単位より低いUV吸収を得るために希釈した。２つのバッチの分子の分布を 検定用ゲルろ過カラム（Superose 12）上で測定した。 コポリマー１バッチＡが７〜８KDaの平均分子量を有することを見い出した。 このバッチの2.5％は32KDaを超える分子量を有していたが、40KDaを超える分子 量を有するこのバッチ中に存在するコポリマー１種類はなかった。 クロマトグラフィーを行っていないコポリマー１の他のバッチは12KDaの平均 分子量を有していた。このバッチの2.5％は42KDaを超える分子量を有し、このバ ッチ中の全コポリマー１種類の５％は40KDaを超える分子量を有していた。 実施例２ 毒性分析 Ａ：生体内 7.3及び8.4KDa（40KDaを超えるコポリマー１種類2.5％未満）並びに22KDa（40 KDaを超えるコポリマー１種類５％超）の平均分子量を有するコポリマー１の３ つのバッチに以下に記載の毒性テストを行った。各々の場合において、各々の実 験群において５のマウスを用いた。 方 法 コポリマー１を蒸留水中に溶解して２mg／mlの活性成分の溶液を作り出した。 各々のマウスに外側尾部静脈に0.5mlのテスト溶液を注入した。マウスを死及び 関連する臨床的症状について48時間にわたり観察した。観察結果を注入後10分、 24時間及び48時間に記録した。48時間の最後において全ての動物が生きており、 不利な症状が観察されないのであれば、その後バッチを“非毒性”とした。しか しながら１以上のマウスが死ぬか又は不利な症状を示したならば、その後バッチ を“毒性”とした。 7.3及び8.4KDaの平均分子量を有するバッチは両方とも“非毒性”であり、一 方22KDaの平均分子量を有するバッチにおいては、５のマウスの３以外が48時間 の終りにおいて死んでおり、それは結果として“毒性”であった。 Ｂ：試験管内 RBL−顆粒消失テスト Ｉ．導 入 好塩基球から遊離したヒスタミン（又はセロトニン）は迅速な過敏症のための 試験管内モデルである。ラット好塩基性白血病（Rat Basophilic Leukemia）細 胞系統（RBL-2H₃）を発達させ、高感受性の、均一な、培養において維持するの が容易な、及び繁殖可能な系として特徴づけた（E.L．Basumian，C．Isersky，M .G．Petrino and R.P．Siraganian．Eur．J．Immunol．11，317（1981））。ヒ スタミン遊離のための生理学的剌激は抗原のメンブラン結合IgE分子への結合に 関連し、これは後者の複雑な生化学的カスケードを誘発する。これらの生理学的 免疫グロブリン媒体誘発の他に、異なる非IgE媒体刺激により顆粒消失が誘導さ れ得る。これらの間は種々のペプチド及び合成ポリマー、例えばポリリシンであ る（R.P．Siraganian．Trends in Pharmacological Sciences，October 432（19 83））。それゆえ、RBL顆粒消失テストは、実質的な顆粒消失を引きおこし、こ れにより不必要な局所的及び／又は全身的副作用を引きおこすコポリマー１のこ れらのバッチを選択排除するために用いられる。 II．テスト方法の原理 ラット好塩基性白血病細胞（RBL-2H₃）に〔³H〕−セロトニンを入れ、次にテ ストされるべきコポリマー１ 100μｇと共にインキュベ ートした。非特異的顆粒消失を誘導するコポリマー１のバッチは培地内に〔³H〕 −セロトニンを遊離する。培地中の放射能をシンチレーションカウンターにより 計数して細胞内に組み込まれた全放射能標識セロトニンをペレット状の細胞にお いて測定する。顆粒消失の割合を全部の組み込まれたものから遊離したセロトニ ンの割合として計算する。 III．結 果 6,250〜14,500の間の平均分子量を有するコポリマー１の４つのバッチを40KDa を超える分子量を有する種類の及びRBLの顆粒消失のための両方の割合（％）に ついて分析した。結果を次の表に要約する。 見られ得るように、高分子量の種類の割合（％）が低い場合（2.5未満）、毒 性を示すセロトニンの遊離割合（％）は低く、逆もまた同じである。 実施例３ トリフルオロアセチル−コポリマー１の調製 Teitelbaum et al．Eur．J．Immun．Vol．1p．242（1971）により記載される ように3.5リッターのジオキサン中に溶解されたチロシンのＮ−カルボキシ無水 物（18ｇ）、アラニン（50ｇ）、ｙ−ベンジルグルタメート（35ｇ）及びトリフ ルオロアセチルリシン（83ｇ ）から保護されたコポリマー１を調製する。 0.01〜0.02％ジエチルアミンを加えることにより重合過程を開始する。この反 応混合物を室温で24時間、撹拌して、その後10リッターの水中に注ぐ。この産物 （保護されたコポリマー１）をろ過して水で洗浄し、乾燥する。撹拌と共に６〜 12時間、室温において氷酢酸中33％の臭化水素酸で保護されたコポリマー１を処 理することによりグルタミン酸残基からγ−ベンジルブロッキング基の除去を行 う。この産物を過剰な水中に注ぎ、ろ過して洗浄し、乾燥させてトリフルオロア セチル−コポリマー１を製造する。 実施例４ トリフルオロアセチル−コポリマー１の調製 Teitelbaum et al．Eur．J．Immun．Vol．1p．242（1971）により記載される ように3.5リッターのジオキサン中に溶解されたチロシンのＮ−カルボキシ無水 物（18ｇ）、アラニン（50ｇ）、γ−ベンジルグルタメート（35ｇ）及びトリフ ルオロアセチルリシン（83ｇ）から保護されたコポリマー１を調製する。 0.01〜0.02％ジエチルアミンを加えることにより重合過程を開始する。この反 応混合物を室温で24時間撹拌して、その後10リッターの水中に注ぐ。この産物（ 保護されたコポリマー１）をろ過して水で洗浄し、乾燥させる。 グルタミン酸残基の５−カルボキシレートからω−ベンジル保護基を除去して ポリマーをより小さなポリペプチドに切断する酢酸中33％のHBrで、保護された コポリマー１を処理する。分子量7,000±2,000Daのコポリマー１を得るために必 要な時間は反応温度及び保護されたコポリマー１の大きさによる。20〜28℃の間 の温度において、異なる時間、例えば10〜50時間、それぞれのバッチにおいてテ スト反応を行う。 これらの小さなスケールの反応の分子量に関する結果を計算して、時間に対す る分子量の曲線を描く。分子量7,000±2,000Daを得るために必要とされる時間を この曲線から計算してより大きなスケールの反応を行う。平均に基づくと、26℃ での反応において時間は17時間である。この産物を過剰な水中に注いで、ろ過し て、洗浄し、そして乾燥させて、トリフルオロアセチル−コポリマー１を製造す る。 低毒性コポリマー１の調製 20ｇのトリフルオロアセチル−コポリマー１を100ｇのピペリジンが添加され た１リッターの水内に分散させる。この混合物を室温で24時間撹拌してろ過する 。粗コポリマー１の溶液を透析バッグ内に分注して、pH＝８に達するまで水に対 して10°〜20℃において透析する。その後約0.3％の酢酸に対して透析して、pH ＝5.5〜6.0となるまで再び氷で透析する。その後この溶液を濃縮して凍結乾燥し て乾燥状態にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 テイテルバウム，ドゥボラ イスラエル国，76209 レホボット，シュ コルニク ストリート ５ (72)発明者 アーノン，ルース イスラエル国，76110 レホボット，ウェ イツマン インスティテュート オブ サ イエンス，メオノット シャイン ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．40キロダルトンを超える分子量を有するコポリマー１（Copolymer-1）の 種類が実質的にないコポリマー１フラクション。 ２．前記フラクションが40キロダルトンを超える分子量を有するコポリマー１ の種類の５％未満を含むことを特徴とするコポリマー１フラクション。 ３．前記フラクションが40キロダルトンを超える分子量を有するコポリマー１ の種類の2.5％未満を含むことを特徴とする請求項２に記載のコポリマー１フラ クション。 ４．前記フラクションの75％超が約２キロダルトン〜約20キロダルトンの範囲 の分子量の範囲内であることを特徴とする請求項２に記載のコポリマー１フラク ション。 ５．前記コポリマー１が約４〜約８キロダルトンの平均分子量を有することを 特徴とするコポリマー１フラクション。 ６．前記コポリマー１が約6.25〜約8.4キロダルトンの平均分子量を有するこ とを特徴とするコポリマー１フラクション。 ７．多発性硬化症の治療のための組成物であって、 医薬として有効な量のコポリマー１フラクションであって、該フラクションが 、40キロダルトンを超える分子量を有するコポリマー１の種類の５％未満を含む フラクションと、 医薬として許容される担体と、 を含むことを特徴とする組成物。 ８．前記コポリマー１フラクションが、40キロダルトンを超える分子量を有す るコポリマー１の種類の2.5％未満を含むことを特徴とする請求項７に記載の組 成物。 ９．前記フラクションにおける前記コポリマー１の75％超が約２ キロダルトン〜約20キロダルトンの範囲の分子量の範囲内であることを特徴とす る請求項７に記載の組成物。 10．多発性硬化症の治療のための組成物であって、 医薬として有効な量のコポリマー１フラクションであって、該フラクションに おける前記コポリマーが、約４〜約８キロダルトンの平均分子量を有するフラク ションと、 医薬として許容される担体と、 を含むことを特徴とする組成物。 11．多発性硬化症の治療のための組成物であって、 医薬として有効な量のコポリマー１フラクションであって、該フラクションに おける前記コポリマーが、約6.25〜約8.4キロダルトンの平均分子量を有するフ ラクションと、 医薬として許容される担体と、 を含むことを特徴とする組成物。