ES2327301T3 - Polipeptidos relacionados con el copolimero 1 para su uso como marcadores de pesos moleculares y para uso terapeutico. - Google Patents
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Abstract
Uso de una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para establecer una relación entre el tiempo de retención en una columna cromatográfica y el peso molecular para determinar el peso molecular medio de una mezcla de polipéptidos, cada uno de cuyos polipéptidos consta de alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina, en el que en la mezcla de polipéptidos la fracción molar de alanina es de 0,38 a 0,5, la de ácido glutámico es de 0,13 a 0,15, la de tirosina es de 0,08 a 0,10, y la de lisina es de 0,3 a 0,4, y en el que cada uno de los marcadores de pesos moleculares es un polipéptido que consta de alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina y que tiene una secuencia de aminoácidos predeterminada y un peso molecular definido.
Description
Polipéptidos relacionados con el copolímero 1
para su uso como marcadores de pesos moleculares y para uso
terapéutico.
La presente solicitud reivindica los beneficios
de la solicitud provisional 60/101.825, presentada el 25 de
septiembre de 1998, que se incorpora en el presente documento por
referencia.
La presente invención proporciona marcadores de
pesos moleculares para la determinación precisa del peso molecular
del acetato de glatirámero, de terpolímeros y otros copolímeros. Los
marcadores de pesos moleculares son polipéptidos que tienen pesos
moleculares identificados entre 2.000 Daltons aproximadamente y
40.000 Daltons aproximadamente, y una composición de aminoácidos
que se corresponde con el acetato de glatirámero o con un copolímero
relacionado. Los pesos moleculares identificados se proporcionan
mediante polipéptidos que tienen secuencias definidas. Los
marcadores de pesos moleculares que se corresponden con el acetato
de glatirámero comprenden los aminoácidos alanina, ácido glutámico,
tirosina y lisina en relaciones molares específicas. Los marcadores
de pesos moleculares correspondientes a terpolímeros relacionados
comprenden tres de los cuatro aminoácidos. En una forma de
realización preferida, el polipéptido tiene alanina en el extremo
N-terminal y tirosina en la cuarta posición desde el
extremo N-terminal. La presente invención
proporciona adicionalmente una pluralidad de marcadores de pesos
moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares de una composición copolimérica. La pluralidad de
marcadores de pesos moleculares idealmente presenta relaciones
lineales entre la elipticidad molar y el peso molecular, o entre el
tiempo de retención y el log del peso molecular.
Óptimamente, los polipéptidos presentan una
actividad biológica similar al copolímero del cual proceden. Los
polipéptidos que tienen pesos moleculares definidos y composiciones
de aminoácidos similares al acetato de glatirámero óptimamente
tienen utilidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades y
dolencias inmunitarias.
Las enfermedades autoinmunitarias se producen
cuando el sistema inmunitario de un organismo falla en reconocer
como "propios" algunos de los tejidos del organismo y los ataca
como "extraños".
Normalmente, se desarrolla autotolerancia
temprana mediante acontecimientos del desarrollo dentro del sistema
inmunitario que evitan que las propias células T y células B del
organismo reaccionen con los tejidos del propio organismo. Estas
respuestas inmunitarias tempranas están mediadas por la unión de
antígenos a moléculas del MHC y su presentación a los receptores de
las células T.
Este proceso de autotolerancia se rompe cuando
se desarrollan enfermedades autoinmunitarias y los tejidos y
proteínas del propio organismo son reconocidos como
"autoantígenos" y son atacados por el sistema inmunitario del
organismo. Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es una
enfermedad autoinmunitaria que se produce cuando el sistema
inmunitario ataca la vaina de mielina, cuya función es aislar y
proteger a los nervios. Es una enfermedad progresiva caracterizada
por la desmielinización, seguida por la pérdida de la función
neuronal y motora. También se cree que la artritis reumatoide
("AR") es una enfermedad autoinmunitaria que implica la
inflamación crónica de las articulaciones sinoviales y su
infiltración por células T, macrófagos y células plasmáticas
activadas, dando lugar a una destrucción progresiva del cartílago
articular. Es la forma más grave de enfermedad articular. La
naturaleza del autoantígeno(s) atacado(s) en la
artritis reumatoide apenas se comprende, aunque el colágeno de tipo
II es un candidato.
La tendencia a desarrollar esclerosis múltiple y
artritis reumatoide es hereditaria. Estas enfermedades se producen
más frecuentemente en individuos que portan uno o más alelos del MHC
de clase II característicos. Por ejemplo, la susceptibilidad
hereditaria para la artritis reumatoide está fuertemente asociada a
los alelos DRB1 *0401, DRB1 *0404, o DRB1 *0405 o DRB1 *0101 del
MHC de clase II. Los antígenos del locus de histocompatibilidad
(HLA) se encuentran en la superficie de las células y ayudan a
determinar la individualidad de los tejidos de diferentes personas.
Los genes para los antígenos del locus de histocompatibilidad están
localizados en la misma región del cromosoma 6 que el complejo
principal de histocompatibilidad (MHC). La región del MHC expresa
una serie de clases de moléculas distintivas en diversas células del
cuerpo, siendo los genes, en orden de secuencia a lo largo del
cromosoma, los genes del MHC de clase I, II, y III. Los genes de
clase I constan de genes del HLA, que están adicionalmente
subdivididos en subregiones A, B y C. Los genes de clase II están
subdivididos en las subregiones DR, DQ y DP. Las moléculas
MHC-DR son las mejor conocidas; éstas se encuentran
en la superficie de células presentadoras de antígenos tales como
los macrófagos, células dendríticas de tejido linfoide y células
epidérmicas. Los productos del MHC de clase III se expresan en
diversos componentes del sistema del complemento, así como en
algunas células no relacionadas con el sistema inmunitario.
Para tratar las enfermedades autoinmunitarias se
han desarrollado una serie de agentes terapéuticos, incluyendo
fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, por
ejemplo, metotrexato; diversos interferones; y ciertos inhibidores
de la síntesis de prostaglandinas. No obstante, estos agentes pueden
ser tóxicos cuando se usan más allá de cortos periodos de tiempo o
provocar efectos secundarios indeseables. Otros agentes terapéuticos
se unen a y/o inhiben la actividad inflamatoria del factor de
necrosis tumoral (TNF), por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos específicos anti-TNF, o una forma
soluble del receptor del TNF. Estos agentes están dirigidos contra
una proteína de la superficie de la célula T y generalmente
previenen la interacción con una célula presentadora de antígeno
(CPA). No obstante, las composiciones terapéuticas que contienen
proteínas plegadas naturales a menudo son difíciles de producir,
formular, almacenar, y liberar. Además, la heterogeneidad innata
del sistema inmunitario puede limitar la eficacia de fármacos y
complica el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias a largo
plazo.
El acetato de glatirámero (Copolímero 1; Cop 1;
en lo sucesivo copolímero GLAT) es una mezcla de polipéptidos
compuestos de alanina, ácido glutámico, lisina, y tirosina en una
relación molar de aproximadamente 4,6:1,5:3,6:1,0, respectivamente,
que se sintetiza polimerizando químicamente los cuatro aminoácidos,
formando productos con pesos moleculares medios que abarcan entre
4.000 aproximadamente y 13.000 Daltons aproximadamente. Las
fracciones molares correspondientes son de 0,427 para la alanina,
0,141 para el ácido glutámico, 0,337 para la lisina y 0,093 para la
tirosina, aproximadamente, y pueden variar en un \pm10%
aproximadamente. Los copolímeros relacionados son mezclas de
polipéptidos compuestos por tres (así, "terpolímeros") de los
cuatro aminoácidos anteriormente mencionados. El Copolímero 1 y los
terpolímeros se dirigen a la heterogeneidad innata del sistema
inmunitario de los mamíferos y de la población humana y son eficaces
para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y otras
dolencias inmunitarias. Los intervalos de pesos moleculares medios
preferidos y los procedimientos de preparación de terpolímeros se
describen en la patente de EE.UU. Nº 5.800.808. La invención también
contempla otros copolímeros compuestos de otras combinaciones de
tres, cuatro, o cinco o más aminoácidos.
Para certificar la preparación del Copolímero 1
o de un terpolímero para su uso en productos farmacéuticos, es
necesario determinar con precisión la distribución de pesos
moleculares de los polipéptidos en la preparación. Un procedimiento
para determinar el peso molecular es cromatografía en una columna de
Superosa 12. Los coeficientes de calibración de columnas para la
determinación del peso molecular del acetato de glatirámero se han
determinado usando lotes de acetato de glatirámero con pesos
moleculares medidos indirectamente. Las medidas indirectas han
incluido la viscosimetría y la velocidad de sedimentación por
ultracentrifugación. Más recientemente, se han preparado lotes de
marcadores de acetato de glatirámero, cuyos pesos moleculares se
determinaron por dispersión de luz láser en múltiples ángulos
(MALLS).
Así, existe una necesidad de marcadores de pesos
moleculares útiles como patrones para la determinación de la
distribución de pesos moleculares de composiciones copoliméricas
contempladas por la invención. Los marcadores de pesos moleculares
deseables tienen pesos moleculares y propiedades físicas definidos
que son análogos a las moléculas para las cuales se va a determinar
el peso molecular. Idealmente, hay una relación lineal entre los
pesos moleculares definidos (o el log de los pesos moleculares
definidos) de los marcadores y una propiedad física medible tal
como, por ejemplo, la elipticidad molar de los marcadores, o el
tiempo de retención de los marcadores en una columna de separación
por tamaño molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los marcadores de pesos moleculares de secuencia
definida que tienen características químicas y físicas similares al
copolímero GLAT proporcionan una calibración precisa y robusta
ajustada para determinaciones del peso molecular de lotes de
producción. La presente invención revela derivados del copolímero
GLAT útiles como marcadores de pesos moleculares para la
determinación de los intervalos de pesos moleculares de
preparaciones de copolímero GLAT y que óptimamente tienen utilidad
terapéutica para el tratamiento de dolencias inmunitarias. La
invención revela adicionalmente polipéptidos que tienen pesos
moleculares definidos que son derivados de otros copolímeros y que
son útiles para la determinación de intervalos de pesos moleculares
de preparaciones de aquellos copolímeros. Cuando aquellos
copolímeros sean terapéuticamente útiles, los polipéptidos derivados
óptimamente tendrán utilidad terapéutica. Para la determinación del
intervalo de pesos moleculares de una preparación de copolímero
GLAT, el derivado preferido es un polipéptido que tiene una
composición de aminoácidos que se corresponde aproximadamente con
el copolímero GLAT y un peso molecular identificado que está entre
2.000 Daltons aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente. El
polipéptido preferentemente tiene relaciones molares específicas de
los aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina.
Además, en una forma de realización preferida el polipéptido tiene
alanina en el extremo N-terminal y tirosina en la
cuarta posición desde el extremo N-terminal. Para
la determinación del peso molecular de un terpolímero, el derivado
preferido tendrá un peso molecular definido y una composición de
aminoácidos que se corresponde aproximadamente con aquélla del
terpolímero. Otros copolímeros también están contemplados por la
invención. Cuando se determina el peso molecular de un copolímero
contemplado por la invención, el derivado del polipéptido tendrá un
peso molecular definido y una composición de aminoácidos que se
corresponde aproximadamente con aquélla del copolímero.
La presente invención proporciona adicionalmente
una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para la
determinación del peso molecular del acetato de glatirámero o de un
terpolímero u otro copolímero en una columna de separación de pesos
moleculares. Los marcadores comprenden de dos a diez o más
polipéptidos, cada polipéptido con un peso molecular identificado.
Cuando se determina el intervalo de pesos moleculares del acetato de
glatirámero, una pluralidad preferida de marcadores de pesos
moleculares tendrán pesos moleculares definidos entre 2.000 Daltons
aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente, y una composición
de aminoácidos correspondiente al acetato de glatirámero o a un
terpolímero seleccionado. En formas de realización preferidas, hay
una relación lineal entre el log del peso molecular de los
marcadores de pesos moleculares polipeptídicos y el tiempo de
retención de los marcadores de pesos moleculares en la columna de
separación por tamaños o entre el peso molecular de los marcadores
de pesos moleculares y la elipticidad molar de los marcadores de
pesos moleculares.
La presente invención proporciona adicionalmente
composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido útil como marcador de
pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares del copolímero GLAT y que consta esencialmente de los
aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina en
fracciones molares de 0,38 aproximadamente a 0,50 de alanina
aproximadamente, de 0,13 aproximadamente a 0,15 de ácido glutámico
aproximadamente, de 0,08 aproximadamente a 0,10 de tirosina
aproximadamente, y de 0,3 aproximadamente a 0,4 de lisina
aproximadamente, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
aceptable.
La presente invención revela adicionalmente
composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido útil como marcador de
pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares de un terpolímero y que consta esencialmente de los
aminoácidos alanina, tirosina, y lisina en las fracciones molares
de 0,3 aproximadamente a 0,6 de alanina aproximadamente, de 0,005
aproximadamente a 0,25 de tirosina aproximadamente, y de 0,1
aproximadamente a 0,5 de lisina aproximadamente, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. El polipéptido está de manera
preferente sustancialmente exento de ácido glutámico.
La presente invención revela adicionalmente
composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido útil como marcador de
pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares de un terpolímero y que consta esencialmente de ácido
glutámico, tirosina y lisina en fracciones molares de 0,005
aproximadamente a 0,300 de ácido glutámico aproximadamente, de 0,005
aproximadamente a 0,250 de tirosina aproximadamente, y de 0,3
aproximadamente a 0,7 de lisina aproximadamente, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. El polipéptido está de manera
preferente sustancialmente exento de alanina.
La presente invención revela adicionalmente
composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido útil como marcador de
pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares de un terpolímero y que consta esencialmente de los
aminoácidos alanina, ácido glutámico y tirosina en fracciones
molares de 0,005 aproximadamente a 0,8 de alanina aproximadamente,
de 0,005 aproximadamente a 0,3 de ácido glutámico aproximadamente,
y de 0,005 aproximadamente a 0,25 de tirosina aproximadamente, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable. El polipéptido está de manera
preferente sustancialmente exento de
lisina.
lisina.
La presente invención también revela
composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido útil como marcador de
pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos
moleculares de un terpolímero y que consta esencialmente de alanina,
ácido glutámico y lisina, en fracciones molares de 0,005
aproximadamente a 0,6 de alanina aproximadamente, de 0,005
aproximadamente a 0,3 de ácido glutámico aproximadamente, y de 0,2
aproximadamente a 0,7 de lisina aproximadamente, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. El polipéptido está de manera
preferente sustancialmente exento de tirosina.
En general, las composiciones farmacéuticas de
la invención incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de un
polipéptido que es útil como marcador de pesos moleculares para la
determinación del intervalo de pesos moleculares de un copolímero
de cualquier número (por ejemplo, tres a cinco o más) de
aminoácidos. En forma de acetato de glatirámero, ese copolímero es
una población de secuencias de aminoácidos diversas. El polipéptido
útil como marcador de de pesos moleculares consta de aquellos
aminoácidos en fracciones molares que se corresponden
aproximadamente con el copolímero.
La presente invención revela adicionalmente el
uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un marcador de pesos
moleculares de la invención para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento y la prevención de una enfermedad
autoinmunitaria y mediada por el sistema inmunitario en un mamífero.
En otra forma de realización, el uso supone adicionalmente la
inhibición de la proliferación de las células T involucradas en el
ataque del sistema inmunitario. En otra forma de realización, el
uso supone la unión de un marcador de pesos moleculares de la
invención a una célula presentadora de antígenos. En otra forma de
realización más, el uso supone la unión de un marcador de pesos
moleculares de la invención a una proteína de clase II del complejo
principal de histocompatibilidad que está asociada a enfermedades
autoinmunitarias.
Las enfermedades autoinmunitarias contempladas
por la presente invención incluyen dolencias artríticas,
enfermedades desmielinizantes y enfermedades inflamatorias. Por
ejemplo, las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar
mediante las presentes composiciones incluyen esclerosis múltiple,
artritis reumatoide, osteoartritis, anemia hemolítica
autoinmunitaria, ooforitis autoinmunitaria, tiroiditis
autoinmunitaria, uveorretinitis autoinmunitaria, enfermedad de
Crohn, púrpura trombocitopénica inmunitaria crónica, colitis,
enfermedad de sensibilidad por contacto, diabetes mellitus,
enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre,
enfermedad de Hashimoto, mixedema idiopático, miastenia grave,
psoriasis, pénfigo vulgar, o lupus eritematoso sistémico.
Las enfermedades mediadas por el sistema
inmunitario resultan de una sensibilidad indeseada del sistema
inmunitario a antígenos exógenos particulares. Los ejemplos son
enfermedad de hospedador contra injerto (HVGD) y enfermedad de
injerto contra hospedador (GVHD) y numerosos tipos de
hipersensibilidad de tipo retardada (HTR).
Las presentes composiciones se pueden usar para
tratar una o más de estas enfermedades.
\newpage
La Figura 1a proporciona la distribución de la
alanina en los marcadores moleculares (marcadores TV) descritos en
la Tabla 1. La posición del aminoácido está definida por el eje X.
La presencia de una alanina está indicada por una barra vertical en
la posición del aminoácido indicado.
La Figura 1b proporciona la distribución de la
lisina en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La posición
del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de un
residuo de lisina está indicada por una barra vertical en la
posición del aminoácido indicado.
La Figura 1c proporciona la distribución del
ácido glutámico en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La
posición del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de
un residuo de ácido glutámico está indicada por una barra vertical
en la posición del aminoácido indicado.
La Figura 1d proporciona la distribución de la
tirosina en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La posición
del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de un
residuo de tirosina está indicada por una barra vertical en la
posición del aminoácido indicado.
La Figura 2 proporciona una gráfica de la
elipticidad molar frente al peso molecular de los presentes
marcadores TV comparados con marcadores de acetato de glatirámero
conocidos. La elipticidad molar se proporciona en 10^{-5} grad
cm^{-2} dmol^{-1} y el peso molecular está en Daltons. Los
círculos indican marcadores TV y los cuadrados representan
marcadores de acetato de glatirámero. Como se muestra, los
marcadores TV proporcionan una relación lineal entre la elipticidad
molar y el peso molecular.
La Figura 3a proporciona una gráfica del tiempo
de retención relativo (TRR) de los presentes marcadores TV frente
al log del peso molecular de esos marcadores, usando un algoritmo
basado en el TRR.
La Figura 3b proporciona una gráfica del log del
peso molecular de los marcadores TV frente al tiempo de retención
(TR) de esos marcadores, usando un algoritmo basado en
Millennium.
La Figura 4a proporciona una gráfica que resume
diversas calibraciones del tiempo de retención relativo (TRR) de
los marcadores TV frente al peso molecular de esos marcadores,
usando un algoritmo basado en el TRR. Los datos se obtuvieron de 16
columnas. Se representan los valores promedio para cada una de las
16 calibraciones.
La Figura 4b proporciona una gráfica que resume
diversas calibraciones del peso molecular de los marcadores TV
presentes frente al tiempo de retención relativo (TRR) de esos
marcadores, usando un algoritmo basado en Millennium. Los datos se
obtuvieron de 16 columnas. Se representan los valores promedio para
cada una de las 16 calibraciones.
La Figura 5 representa la inhibición de la unión
del Cop 1 a anticuerpos policlonales anti-Cop 1
mediante cuatro marcadores TV y Cop 1 (03494). Las relaciones de
absorbancia indican la absorbancia medida con una concentración de
inhibidor creciente en relación a la absorbancia en ausencia de
inhibición de la unión.
Los marcadores de pesos moleculares de la
invención (por ejemplo, marcadores TV), incluyen polipéptidos que
tienen una composición de aminoácidos que se corresponde
aproximadamente con el acetato de glatirámero o con terpolímeros
relacionados, y un peso molecular identificado que está entre 2.000
Daltons aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente y son
útiles para la determinación con precisión del peso molecular del
copolímero GLAT y de terpolímeros relacionados. Se deduce de los
requerimientos para un peso molecular identificado que un marcador
TV debe tener un peso molecular discreto y no un intervalo de pesos
moleculares. Por consiguiente, los marcadores TV se sintetizan
según una secuencia de aminoácidos predeterminada que se corresponde
en composición con el copolímero para el que se debe determinar el
intervalo de pesos moleculares. Óptimamente, los marcadores TV
tienen una actividad terapéutica que es similar al copolímero
correspondiente. Estos marcadores se pueden usar en cualquier
sistema de discriminación de tamaños moleculares usando cualquier
procedimiento o aparato de determinación de pesos moleculares
disponible. Por ejemplo, los presentes marcadores se pueden usar
para la calibración de cualquier procedimiento o aparato
cromatográfico que se use para las determinaciones de pesos
moleculares de polipéptidos o proteínas. Ese aparato cromatográfico
puede ser una columna de separación de pesos moleculares que separa
polipéptidos en base a su tamaño molecular. Ejemplos de columnas de
separación de pesos moleculares incluyen columnas TSK, columnas de
Sephadex, columnas de Sepharosa, y columnas de Superosa. Para
proporcionar marcadores de pesos moleculares de tamaño y composición
discretas, los marcadores de pesos moleculares de la invención se
pueden sintetizar según secuencias predeterminadas mediante
procedimientos que son muy conocidos por aquellos expertos en la
materia.
Los aminoácidos de la presente invención
incluyen, pero no están limitados a los 20 aminoácidos que se
encuentran comúnmente. También se incluyen derivados de origen
natural y sintético, por ejemplo, la selenocisteína. Los
aminoácidos incluyen adicionalmente análogos de aminoácidos. Un
"análogo" de un aminoácido es una forma del aminoácido
químicamente relacionada que tiene una configuración diferente, por
ejemplo, un isómero, o una configuración D en lugar de una
configuración L, o una molécula orgánica con el tamaño y la forma
aproximada del aminoácido, o un aminoácido con una modificación de
los átomos que están involucrados en el enlace peptídico, de manera
que es resistente a las proteasas cuando se polimeriza en un péptido
o en un polipéptido.
\newpage
Las frases "aminoácido" y "secuencia de
aminoácidos" como se definen en el presente documento y en las
reivindicaciones pueden incluir uno o más componentes que son
derivados de aminoácidos y/o análogos de aminoácidos que comprenden
parte o la totalidad de los residuos para uno cualquiera o más de
los 20 aminoácidos de origen natural indicados por esa secuencia.
Por ejemplo, en una secuencia de aminoácidos que tiene uno o más
residuos de tirosina, una porción de uno o más de esos residuos se
puede sustituir por homotirosina. Además, una secuencia de
aminoácidos que tiene uno o más enlaces no peptídicos o
peptidomiméticos entre dos residuos adyacentes, está incluida
dentro de esta definición.
Los códigos de aminoácidos de una letra y de
tres letras (y el aminoácido que representa cada uno) son los
siguientes: A significa ala (alanina); C significa cys (cisteína); D
significa asp (ácido aspártico); E significa glu (ácido glutámico);
F significa phe (fenilalanina); G significa gly (glicina); H
significa his (histidina); I significa ile (isoleucina); K
significa lys (lisina); L significa leu (leucina); M significa met
(metionina); N significa asn (asparagina); P significa pro
(prolina); Q significa gln (glutamina); R significa arg (arginina);
S significa ser (serina); T significa thr (treonina); V significa
val (valina); W significa trp (triptófano); e Y significa tyr
(tirosina).
El término aminoácido "hidrófobo" está
definido en el presente documento y en las reivindicaciones como
incluyendo a los aminoácidos alifáticos alanina (A, o ala), glicina
(G, o gly), isoleucina (I, o ile), leucina (L, o leu), prolina (P,
o pro), y valina (V, o val), siendo los términos entre paréntesis
las abreviaturas estándar del código de una letra y de tres letras
para cada aminoácido, y a los aminoácidos aromáticos triptófano (W,
o trp), fenilalanina (F, o phe) y tirosina (Y, o tyr). Los
aminoácidos confieren hidrofobicidad en función de la longitud de
las cadenas laterales alifáticas y del tamaño de las aromáticas,
cuando se encuentran como residuos dentro de una proteína.
El término aminoácido "cargado" está
definido en el presente documento y en las reivindicaciones como
incluyendo a los aminoácidos ácido aspártico (D, o asp), ácido
glutámico (E, o glu), histidina (H, o his), arginina (R, o arg) y
lisina (K, o lys), que confieren una carga positiva (his, lys y arg)
o negativa (asp y gly) a valores fisiológicos de pH en disoluciones
acuosas a proteínas que contienen estos residuos.
Composiciones de polipéptidos contempladas
por la invención. Según la presente invención, para los
presentes marcadores se prefieren los polipéptidos que tienen pesos
moleculares definidos y que comprenden tres o los cuatro de los
aminoácidos tirosina, ácido glutámico, alanina y lisina. No
obstante, alguien con conocimientos en la materia puede sustituir
fácilmente aminoácidos estructuralmente relacionados sin desviarse
del espíritu de la invención. Así, la presente invención contempla
adicionalmente sustituciones conservativas de aminoácidos para la
tirosina, ácido glutámico, alanina y lisina en los presentes
polipéptidos. Tales aminoácidos estructuralmente relacionados
incluyen aquellos aminoácidos que tienen aproximadamente la misma
carga, hidrofobicidad y tamaño que la tirosina, el ácido glutámico,
la alanina o la lisina. Por ejemplo, la lisina está estructuralmente
relacionada con la arginina y la histidina; el ácido glutámico está
estructuralmente relacionado con el ácido aspártico; la tirosina
está estructuralmente relacionada con la serina, treonina,
triptófano y fenilalanina; y la alanina está estructuralmente
relacionada con la valina, leucina e isoleucina.
Además, los marcadores de pesos moleculares de
la invención pueden estar compuestos de aminoácidos L o D. Como es
sabido por alguien experto en la materia, los aminoácidos L se
encuentran en la mayoría de proteínas naturales. No obstante,
comercialmente están disponibles aminoácidos D y se pueden sustituir
por alguno o todos los aminoácidos usados para preparar los
marcadores de pesos moleculares de la invención. La presente
invención contempla marcadores de pesos moleculares formados de
mezclas de aminoácidos D y L, así como marcadores de pesos
moleculares constituidos esencialmente por cualquiera de los
aminoácidos L o D.
El peso molecular medio y la fracción molar
media de los aminoácidos de los presentes polipéptidos pueden
variar. No obstante, se contempla un intervalo de pesos moleculares
de 2.000 aproximadamente a 40.000 aproximadamente, y se prefieren
polipéptidos básicos, en lugar de polipéptidos ácidos.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona marcadores polipeptídicos que contienen
tirosina, alanina, ácido glutámico y lisina en relaciones molares
definidas. En una forma de realización más preferida, la relación
molar de aminoácidos de los presentes polipéptidos es aquella
encontrada en el copolímero GLAT. Esa correspondencia en las
relaciones molares proporciona los mejores marcadores de pesos
moleculares debido a que esos marcadores tendrán una carga y una
forma molecular que es similar a aquella del copolímero GLAT.
Cuando se usan marcadores estructuralmente diferentes, los
marcadores pueden migrar o eluir de forma algo diferente de las
preparacio-
nes del copolímero GLAT, incluso de aquellas preparaciones que tienen el mismo peso molecular que los marcadores.
nes del copolímero GLAT, incluso de aquellas preparaciones que tienen el mismo peso molecular que los marcadores.
Además, en una forma de realización preferida,
la alanina está en el extremo N-terminal y la
tirosina está en la posición cuatro desde el extremo
N-terminal. Los análisis de degradación de Edman
realizados sobre diversos lotes de acetato de glatirámero revelaron
una mayor abundancia de alanina en el extremo
N-terminal y de tirosina en la posición cuatro
desde el extremo N-terminal. Por tanto, en ciertas
formas de realización preferidas, los marcadores de pesos
moleculares del copolímero GLAT tienen alanina en el extremo
N-terminal y tirosina en la posición cuatro desde
el extremo N-terminal. Los estudios de la reacción
de polimerización usada para sintetizar el copolímero GLAT han
indicado que la alanina y el ácido glutámico polimerizan más rápido
que la lisina. Como resultado, la porción
C-terminal del copolímero GLAT tiende a ser más rica
en alanina y en ácido glutámico, mientras que la porción
N-terminal tiende a ser más rica en lisina. En
formas de realización preferidas, la distribución de residuos
aminoácidos en los marcadores de pesos moleculares del copolímero
GLAT refleja esta predisposición.
Cuando se determina el intervalo de pesos
moleculares del copolímero GLAT, un marcador de pesos moleculares
preferido consta esencialmente de los aminoácidos alanina, ácido
glutámico, tirosina y lisina en fracciones molares de 0,38
aproximadamente a 0,50 de alanina aproximadamente, de 0,13
aproximadamente a 0,15 de ácido glutámico aproximadamente, de 0,08
aproximadamente a 0,10 de tirosina aproximadamente, y de 0,3
aproximadamente a 0,4 de lisina aproximadamente.
En otras formas de realización, la presente
invención revela marcadores de pesos moleculares que contienen tres
de los cuatro aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina, y
lisina en relaciones definidas. En formas de realización
preferidas, las fracciones molares de los aminoácidos presentes en
los marcadores de pesos moleculares se corresponden con aquellas
encontradas en el terpolímero correspondiente.
Cuando el marcador de pesos moleculares contiene
alanina, ácido glutámico y tirosina, la alanina puede estar
presente en una fracción molar de 0,005 aproximadamente a 0,800
aproximadamente, el ácido glutámico puede estar presente en una
fracción molar de 0,005 aproximadamente a 0,300 aproximadamente, y
la tirosina puede estar presente en una fracción molar de 0,005
aproximadamente a 0,250 aproximadamente. El peso molecular está
entre 2.000 aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente, y
preferentemente entre 3.000 aproximadamente y 12.000 Daltons
aproximadamente.
Cuando el marcador de pesos moleculares contiene
alanina, ácido glutámico y lisina, la alanina puede estar presente
en una fracción molar de 0,005 aproximadamente a 0,600
aproximadamente, el ácido glutámico puede estar presente en una
fracción molar de 0,005 aproximadamente a 0,300 aproximadamente, y
la lisina puede estar presente en una fracción molar de 0,2
aproximadamente a 0,7 aproximadamente. El peso molecular está entre
2.000 aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente, y
preferentemente entre 3.000 aproximadamente y 12.000 Daltons
aproximadamente.
Cuando el marcador de pesos moleculares contiene
alanina, tirosina y lisina, la alanina puede estar presente en una
fracción molar de 0,3 aproximadamente a 0,6 aproximadamente, la
tirosina puede estar presente en una fracción molar de 0,005
aproximadamente a 0,250 aproximadamente, y la lisina puede estar
presente en una fracción molar de 0,1 aproximadamente a 0,5
aproximadamente. El peso molecular está entre 2.000 aproximadamente
y 40.000 Daltons aproximadamente, y preferentemente entre 3.000
aproximadamente y 12.000 Daltons aproximadamente.
Cuando el marcador de pesos moleculares contiene
ácido glutámico, tirosina y lisina, el ácido glutámico puede estar
presente en una fracción molar de 0,005 aproximadamente a 0,300
aproximadamente, la tirosina puede estar presente en una fracción
molar de 0,005 aproximadamente a 0,250 aproximadamente, y la lisina
puede estar presente en una fracción molar de 0,3 aproximadamente a
0,7 aproximadamente. El peso molecular está entre 2.000
aproximadamente y 40.000 Daltons aproximadamente, y preferentemente
entre 3.000 aproximadamente y 12.000 Daltons aproximadamente.
Los polipéptidos de la invención se pueden usar
para determinaciones de intervalos de pesos moleculares de otros
copolímeros contemplados por la invención. Los copolímeros
contemplados pueden consistir en combinaciones de tres, cuatro, o
cinco o más aminoácidos. En general, para determinar el intervalo de
pesos moleculares de un copolímero contemplado por la invención, el
marcador de pesos moleculares polipeptídico tendrá un peso
molecular y una composición de aminoácidos definidos que se
corresponde aproximadamente con aquella del copolímero. Será
evidente para alguien experto en la materia que cualquier tendencia
en la distribución de los aminoácidos en un copolímero se puede
determinar como se ha descrito anteriormente para el copolímero
GLAT. Por ejemplo, se pueden obtener las cantidades relativas de
aminoácidos incorporados en cada posición de una población de
terpolímeros analizando los productos de cada etapa de una
degradación de Edman. Alternativamente, se pueden controlar las
proporciones de aminoácidos incorporados en una población de
terpolímeros durante la síntesis. Donde sea aplicable, se pueden
sintetizar marcadores de pesos moleculares que reflejan la
tendencia. Además, ciertos marcadores de pesos moleculares de
terpolímeros preferidos tendrán alanina o tirosina en posición
cuatro.
Ejemplos de secuencias de marcadores de pesos
moleculares polipeptídicos preferidos se dan en la Tabla 1 (SEQ ID
NOS: 1-7) usando el código convencional de una letra
de los aminoácidos y leyendo desde el extremo
N-terminal al extremo C-terminal.
Las siete secuencias indicadas son preparaciones individuales de
polipéptidos que tienen una composición de aminoácidos que se
corresponde con el acetato de glatirámero. Normalmente, los
aminoácidos que comprenden una molécula marcadora de pesos
moleculares son predominantemente de una de las configuraciones
(configuración D o L). En formas de realización preferidas, una
molécula marcadora de pesos moleculares está compuesta en su
totalidad de aminoácidos de la misma configuración. No obstante, en
ciertas formas de realización se pueden preferir moléculas
marcadoras de pesos moleculares que comprenden aminoácidos de
configuración mixta, cuando el peso molecular se determina para una
preparación de acetato de glatirámero que comprende aminoácidos de
configuración mixta.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona una pluralidad de marcadores de pesos
moleculares para la determinación del peso molecular de acetato de
glatirámero o de un terpolímero en una columna de separación de
pesos moleculares. La pluralidad de marcadores de pesos moleculares
son polipéptidos. La pluralidad de marcadores puede ser de dos a
diez aproximadamente o más. En una forma de realización más
preferida, la pluralidad de marcadores es de siete aproximadamente.
Cada polipéptido tiene un peso molecular identificado que está
entre 2.000 Daltons aproximadamente y 40.000 Daltons
aproximadamente, y una composición de aminoácidos que se
corresponde aproximadamente con aquella del acetato de glatirámero o
de un terpolímero.
Cuando esa pluralidad de marcadores de pesos
moleculares se usa como patrón para la determinación del peso
molecular del acetato de glatirámero o de un terpolímero, existe una
relación que es aproximadamente lineal entre el tiempo de retención
de los marcadores de pesos moleculares en una columna cromatográfica
y el log del peso molecular. Se usa una pluralidad de marcadores
que es suficiente para establecer la relación aproximadamente
lineal, aunque se pueden emplear más. La Fig. 3 muestra la relación
aproximadamente lineal entre el tiempo de retención relativo y el
log de pesos moleculares para los marcadores TV de la invención.
En otra forma de realización, existe una
relación aproximadamente lineal entre la elipticidad molar de los
marcadores de pesos moleculares y el peso molecular de los
marcadores. Cuando se determina el peso molecular de una
preparación de acetato de glatirámero mediante elipticidad molar, se
usa una pluralidad de marcadores que es suficiente para establecer
la relación aproximadamente lineal, aunque se pueden emplear más. A
continuación se obtiene un peso molecular para la preparación de
acetato de glatirámero o de terpolímero basándose en la relación
lineal. La Fig. 2 muestra la relación aproximadamente lineal entre
la elipticidad molar y el peso molecular para marcadores TV de la
invención.
Composiciones farmacéuticas contempladas por
la invención. Los marcadores de pesos moleculares de la
invención que se corresponden en composición con el copolímero GLAT
óptimamente tienen actividad biológica, y se pueden usar para el
tratamiento de enfermedades de la misma manera que el copolímero
GLAT. Los marcadores TV que tienen actividad biológica se denominan
alternativamente marcadores terapéuticos. Por ejemplo, el copolímero
GLAT es útil para el tratamiento de la EM en humanos así como para
bloquear la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en
ratones. Los polipéptidos de la invención que tienen pesos
moleculares y composiciones de aminoácidos identificados que se
corresponden con el copolímero GLAT han demostrado también ser
activos aquí en el modelo de ratón y han demostrado características
inmunológicas que son similares a aquellas del copolímero GLAT. Los
anticuerpos monoclonales que se unen al copolímero GLAT también se
unen a los marcadores TV. Adicionalmente, ciertas células T que son
estimuladas por el copolímero GLAT también son estimuladas por los
marcadores de pesos moleculares de la invención.
De manera similar, un polipéptido que tenga un
peso molecular definido y que se corresponda en la composición de
aminoácidos con un terpolímero con utilidad terapéutica óptimamente
tendrá utilidad terapéutica. En general, los marcadores de pesos
moleculares polipeptídicos que se corresponden en composición con un
copolímero biológicamente activo óptimamente tendrán una actividad
biológica similar.
Los presentes marcadores de pesos moleculares se
pueden formular en composiciones farmacéuticas que contienen un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente
documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye
todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión,
recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y retardantes de la absorción, edulcorantes y similares.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a
partir de un amplio rango de materiales que incluyen, pero no están
limitados a, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes y
materiales diversos tales como tampones y absorbentes que pueden
ser necesarios para preparar una composición terapéutica particular.
El uso de tales medios y agentes con sustancias farmacéuticamente
activas es muy conocido en la materia. Excepto en la medida en que
cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el
principio activo, está contemplado su uso en las composiciones
terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones
principios activos suplementarios. Las presentes composiciones se
pueden formular en forma de disolución o suspensión inyectable, de
disolución para pulverizador o de una
suspensión.
suspensión.
Las composiciones farmacéuticas comprenden una
cantidad de uno o más marcadores de pesos moleculares de la
invención. Preferentemente, los marcadores de pesos moleculares
constan esencialmente de tres o los cuatro aminoácidos tirosina,
alanina, ácido glutámico y lisina en las fracciones molares
definidas. Las fracciones molares de los aminoácidos serán como se
ha establecido anteriormente.
En una forma de realización, los marcadores de
pesos moleculares de la composición farmacéutica son capaces de
unirse a una proteína de clase II del MHC que, preferentemente, está
asociada a una enfermedad autoinmunitaria. La proteína del MHC de
clase II consta de subunidades \alpha y \beta de un tamaño
aproximadamente igual, siendo ambas proteínas transmembrana. Se
forma una hendidura de unión del péptido por partes del extremo
amino de ambas subunidades \alpha y \beta. Esta hendidura de
unión del péptido es el sitio de presentación del antígeno a las
células T. Hay al menos tres tipos de moléculas del MHC de clase II:
moléculas HLA-DR, HLA-DQ, y
HLA-DP. También hay numerosos alelos que codifican
cada tipo de estas moléculas HLA. Las moléculas del MHC de clase II
se expresan predominantemente sobre la superficie de los linfocitos
B y de células presentadoras de antígenos tales como los
macrófagos. Se puede usar cualquier procedimiento disponible para
averiguar si el marcador de pesos moleculares se une a una o más
proteínas de clase II del MHC. Por ejemplo, el polipéptido se puede
radiomarcar o biotinilar, mezclar con una preparación en crudo o
pura de proteína de clase II del MHC y la unión se puede detectar
por la adherencia de la molécula indicadora a la proteína de clase
II del MHC después de la retirada del polipéptido sin
unir.
unir.
En otra forma de realización, los marcadores de
pesos moleculares son capaces de unirse a una proteína de clase II
del MHC asociada a la esclerosis múltiple. Un polipéptido de esta
forma de realización puede tener una afinidad por la hendidura de
unión del antígeno de una proteína de clase II del MHC asociada a la
esclerosis múltiple similar o superior a la que tiene el Copolímero
1. Por tanto, el polipéptido contemplado puede inhibir la unión o
desplazar la unión de autoantígenos de mielina de la proteína de
clase II del MHC. Una proteína de clase II del MHC asociada a la
esclerosis múltiple es la HLA-DR4 (DRB1*1501).
En otra forma de realización, los marcadores de
pesos moleculares de la invención son capaces de unirse a una
proteína de clase II del MHC asociada a una dolencia artrítica, por
ejemplo, artritis reumatoide o osteoartritis. Por consiguiente, un
polipéptido de esta forma de realización puede tener una mayor
afinidad por la hendidura de unión del antígeno de una proteína de
clase II del MHC asociada a la enfermedad autoinmunitaria de la que
tiene un péptido 261-273 de colágeno de tipo II. Por
tanto, el polipéptido contemplado puede inhibir la unión de o
desplazar al péptido 261-273 de colágeno de tipo II
de la hendidura de unión del antígeno de una proteína de clase II
del MHC.
Procedimientos terapéuticos contemplados por
la invención. La presente invención revela adicionalmente el
uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que
comprende un marcador de pesos moleculares de la invención para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y la prevención de
enfermedades inmunitarias en un mamífero.
Las enfermedades autoinmunitarias contempladas
por la presente invención incluyen tanto enfermedades mediadas por
células (por ejemplo, células T) como trastornos mediados por
anticuerpos (por ejemplo, células B). Tales trastornos pueden ser,
entre otros, dolencias artríticas, enfermedades desmielinizantes y
enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, las enfermedades
autoinmunitarias que se pueden tratar mediante los presentes
polipéptidos incluyen esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide
(AR), osteoartritis, anemia hemolítica autoinmunitaria, ooforitis
autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, uveorretinitis
autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, púrpura trombocitopénica
inmunitaria crónica, colitis, enfermedad de sensibilidad por
contacto, diabetes mellitus, enfermedad de Graves, síndrome de
Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, mixedema
idiopático, miastenia grave, psoriasis, pénfigo vulgar, o lupus
eritematoso sistémico. Las presentes composiciones se pueden usar
para tratar una o más de estas
enfermedades.
enfermedades.
\newpage
El término "dolencia artrítica" como se usa
en el presente documento es una dolencia en la que se observa al
menos un síntoma de la artritis reumatoide en al menos una
articulación de un mamífero, por ejemplo, hombro, rodilla, cadera,
columna o dedo de un mamífero. Ejemplos de dolencias artríticas
incluyen "poliartritis", que es una dolencia artrítica que
afecta a más de una única articulación; "artritis juvenil", una
dolencia artrítica en humanos menores de 21 años; y síndrome de
Felty, que puede incluir los síntomas de neutropenia,
esplenomegalia, pérdida de peso, anemia, linfadenopatía, y manchas
de pigmento en la piel.
Las enfermedades mediadas por el sistema
inmunitario contempladas por la presente invención se caracterizan
por una hipersensibilidad inmunitaria indeseable a uno o más
antígenos e incluyen enfermedad de hospedador contra injerto (HVGD)
y enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), que se
ejemplifican, respectivamente, por el rechazo del injerto por parte
del sistema inmunitario del hospedador y por el ataque contra el
hospedador por parte de las células T del donante. Estas
enfermedades son una barrera significativa para los sistemas de
trasplantes tales como los trasplantes de órganos y las
reconstituciones de médula ósea. Otras enfermedades mediadas por el
sistema inmunitario contempladas incluyen la hipersensibilidad de
tipo retardado (HTR) que está asociada a antígenos de contacto
tales como hiedra venenosa y roble venenoso y diversos productos
químicos, así como a tuberculosis, lepra, leishmaniasis,
infecciones fúngicas intensas, etc.
En una forma de realización, cualquier
enfermedad autoinmunitaria se puede tratar mediante los presentes
marcadores de pesos moleculares siempre que el marcador contemplado
se una a una proteína de clase II del MHC que está asociada a la
enfermedad autoinmunitaria. Un aspecto de esta forma de realización
revela un procedimiento que incluye la selección de un marcador de
pesos moleculares que inhibe la unión de un péptido antigénico a
una proteína de clase II del MHC, por ejemplo, un procedimiento que
comprende adicionalmente la selección del marcador de pesos
moleculares que inhibe las respuestas de las células T específicas
de clase II a un complejo péptido-proteína de clase
II del MHC, y un procedimiento en el que el péptido antigénico está
asociado a una enfermedad autoinmunitaria; en otra forma de
realización de la invención, se revela un procedimiento en el que
la proteína de clase II del MHC está asociada a una enfermedad
autoinmunitaria.
En otra forma de realización, el procedimiento
para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un
mamífero supone adicionalmente la inhibición de la proliferación o
de la función de las células T que son sensibles a un autoantígeno.
La AR es una enfermedad autoinmunitaria mediada por las células T
que se puede tratar con los presentes polipéptidos. El proceso
patológico de enfermedades autoinmunitarias y del rechazo
inmunitario está mediado por células T. Tras la unión y el
reconocimiento de un antígeno, las células T proliferan, secretan
citoquinas y reclutan células inflamatorias y citotóxicas
adicionales en el sitio. Los presentes marcadores de pesos
moleculares evitan la proliferación de las células T y las funciones
de las células T tales como la secreción de citoquinas y el
reclutamiento de células inflamatorias y citotóxicas en el sitio.
Cuando la enfermedad autoinmunitaria es una dolencia artrítica, el
autoantígeno puede ser colágeno, y los presentes marcadores de
pesos moleculares pueden inhibir la proliferación y función de las
células T sensibles al colágeno.
En otra forma de realización, el procedimiento
para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un
mamífero supone la unión del marcador de pesos moleculares a una
célula presentadora de antígenos tal como un macrófago, una célula
dentrítica del tejido linfoide o una célula epidérmica. La
proliferación y las funciones de una célula T se activan cuando le
presentan un antígeno apropiado. Uniéndose a células presentadoras
de antígenos, los presentes marcadores de pesos moleculares pueden
bloquear o interferir de otra forma con la activación de las
células
T.
T.
En otra forma de realización más, el
procedimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria
en un mamífero supone la unión del marcador de pesos moleculares a
una proteína de clase II del complejo principal de
histocompatibilidad que está asociada a una enfermedad
autoinmunitaria. Las proteínas de clase II del MHC se expresan
predominantemente en la superficie de linfocitos B y de células
presentadoras de antígenos tales como los macrófagos. Estas
proteínas de clase II del MHC tienen una hendidura de unión del
péptido que es el lugar en el que se presentan los péptidos
antigénicos a las células T. Cuando los presentes polipéptidos se
unen a una proteína de clase II del complejo principal de
histocompatibilidad, estos polipéptidos pueden bloquear o
interferir de otra forma con la presentación de antígenos y/o la
activación de las células T.
En otra forma de realización, el procedimiento
para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un
mamífero supone la unión del marcador de pesos moleculares a
anticuerpos de células B reactivas al Copolímero 1, y/o células T
reactivas al Copolímero 1. Las células T T_{H} 2/3 reactivas al
Copolímero 1 facilitan los efectos terapéuticos del Copolímero 1.
Cuando se unen a las células T reactivas al Copolímero 1, los
presentes marcadores de pesos moleculares estimulan a esas células
T a proliferar, secretar citoquinas antiinflamatorias y aumentar
los beneficios terapéuticos del tratamiento mediante los presentes
procedimientos. Según la presente invención, los presentes
marcadores de pesos moleculares también se unen a anticuerpos
reactivos a autoantígenos que pueden bloquear el ataque del
anticuerpo al tejido diana, ayudando así a prevenir el progreso de
la enfermedad autoinmunitaria.
Los presentes marcadores de pesos moleculares se
pueden administrar mediante cualquier vía conveniente. En una forma
de realización los presentes marcadores de pesos moleculares se
pueden administrar mediante inyección para facilitar la liberación
en los tejidos afectados por la enfermedad autoinmunitaria. Así, los
presentes marcadores de pesos moleculares se pueden, por ejemplo,
inyectar, ingerir, inhalar, o aplicar tópicamente. Los marcadores
de pesos moleculares objeto se pueden incorporar en una crema,
disolución o suspensión para la administración por vía tópica. Los
presentes marcadores de pesos moleculares se administran
preferentemente oralmente, tópicamente o mediante inyección sin la
adición de un adyuvante.
Kits útiles de la invención. En una forma
de realización de la invención, se revela un kit para someter a
ensayo la unión de un analito a una proteína del MHC, que incluye
una proteína del MHC soluble en agua, por ejemplo, que se ha
producido de manera recombinante en una célula que no pertenece a un
mamífero, y un medio para la detección del analito unido a la
proteína del MHC, e instrucciones para su uso. La proteína del MHC
usada en el kit es una proteína de clase II del MHC seleccionada del
grupo constituido por una proteína HLA-DR1 de clase
II del MHC, una proteína HLA-DR2 de clase II del MHC
y una proteína HLA-DR4 de clase II del MHC. El kit
puede comprender adicionalmente un péptido autoantigénico. Se puede
usar un kit de la invención, por ejemplo, para probar la unión de
un marcador de pesos moleculares de la invención a un péptido de
clase II del MHC o la inhibición de la unión del MHC de un péptido
autoantigénico.
En una forma de realización preferida, la
proteína de clase II del MHC se produce en una célula de
invertebrado o de un microbio, tal como una célula de insecto o una
célula de levadura y que por tanto está desprovista de péptido
unido en la hendidura del antígeno. Los medios para la detección de
la unión del analito a la proteína del MHC puede ser cualquier
medio radiactivo, fluorimétrico, quimioluminiscente, enzimático o
colorimétrico conocido por alguien con conocimientos ordinarios en
la materia. En una forma de realización preferida, la proteína del
MHC es una proteína HLA-DR1 o
HLA-DR4 de clase II. Ejemplos de péptidos
autoantigénicos preferidos que se pueden incluir son un péptido de
colágeno II, un péptido derivado de una proteína básica de mielina,
proteína de oligodendrita de mielina, o un péptido de otra proteína
implicada en una enfermedad autoinmunitaria.
Los ejemplos que siguen describen la invención
con detalle mostrando cómo se pueden realizar ciertas formas de
realización específicas representativas, los materiales, aparatos y
etapas del procedimiento que se entienden como ejemplos que están
previstos sólo con fines ilustrativos. En particular, no se pretende
que la invención esté limitada a los procedimientos, materiales,
condiciones, parámetros del proceso, aparatos y similares citados
específicamente en el presente documento.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención en
profundidad.
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Se prepararon siete marcadores de pesos
moleculares con pesos moleculares comprendidos entre
3700-12000 Daltons aproximadamente en el
laboratorio del Prof. M. Fridkin (Weizmann Institute of Science)
(Tabla 2). Estos marcadores se denominan marcadores TV. A los
péptidos individuales se les asignó un nombre
TV-\alm{2} donde \alm{2} es el número de
residuos de aminoácidos (por ejemplo, TV-35 es el
marcador 35-mero). La composición de aminoácidos de
estos marcadores cumple las especificaciones del acetato de
glatirámero (Tabla 2).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las figuras 1a, 1b, 1c y 1d proporcionan la
distribución de alanina, lisina, ácido glutámico y tirosina,
respectivamente, en los marcadores TV descritos en la Tabla 2. La
posición del aminoácido está definida por el eje X, con el primer
aminoácido que corresponde a la posición C-terminal.
La presencia de un aminoácido está indicada por una barra vertical
en la posición del aminoácido indicada.
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Espectroscopia de masas. Las muestras de
polipéptidos se analizaron inmediatamente después de su síntesis
usando un espectrofotómetro de masas de plataforma VG equipado con
una fuente de ionización por electropulverización. Varios meses más
tarde el análisis se repitió en TEVA usando un espectrofotómetro de
masas PE-Sciex AP1300 equipado con una fuente de
ionización por electropulverización (Tabla 3, primera preparación).
Estos resultados indican que cada marcador TV polipeptídico tiene
un único componente principal con la masa molecular prevista.
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Se preparó un segundo lote de marcadores. La
espectroscopia de masas confirmó que los polipéptidos de la segunda
preparación eran idénticos a los polipéptidos de la primera
preparación (Tabla 3, segunda preparación). La similitud entre las
dos preparaciones también se confirmó por cromatografía en Superosa
12. Cada uno de los marcadores eluyó con un pico agudo a un tiempo
de retención distinto, independientemente del lote analizado. Por
tanto, los marcadores TV de la presente invención se pueden
sintetizar con una masa reproducible.
Degradación de Edman. La secuencia
prevista de los polipéptidos se confirmó mediante análisis de
degradación de Edman de la primera preparación.
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Dicroísmo circular. La similitud
estructural entre los marcadores de pesos moleculares y el acetato
de glatirámero es un requisito previo para una calibración adecuada
de una columna de separación por tamaños moleculares. Las
diferencias en la estructura del polipéptido pueden dar como
resultado diferentes tamaños hidrodinámicos y en consecuencia un
tiempo de retención alterado en el sistema cromatográfico. La
elipticidad, determinada mediante dicroísmo circular, sirve como
medida de la estructura secundaria de un polipéptido. Cuando la
elipticidad de los marcadores de pesos moleculares y el acetato de
glatirámero es similar, las estructuras de los dos serán
similares.
La elipticidad molar de los polipéptidos se
determinó en un espectrofotómetro Jobin-Yvon CD. La
Figura 2 y la Tabla 4 muestran que el grado de elipticidad molar
correlacionó con el peso molecular del polipéptido. El péptido más
corto presentaba el valor de elipticidad más bajo. La elipticidad
molar de los nuevos marcadores era del mismo orden de magnitud que
aquéllas de los marcadores de pesos moleculares de acetato de
glatirámero usados actualmente. Nótese que aunque se representa el
peso molecular exacto para los marcadores TV, en la gráfica se usó
el peso molecular medio en número para el acetato de
glatirámero.
Así, los nuevos marcadores y el acetato de
glatirámero poseen estructuras similares y son, por tanto, adecuados
para su uso como marcadores de pesos moleculares para nuevas
preparaciones de acetato de glatirámero.
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Estos datos analíticos indican que los
polipéptidos marcadores TV sintetizados presentan un grado
sustancial de similitud a los marcadores de pesos moleculares de
acetato de glatirámero usados actualmente. El contenido en
aminoácidos está dentro de las especificaciones del acetato de
glatirámero. Los nuevos polipéptidos y los marcadores de pesos
moleculares de acetato de glatirámero tienen una estructura
secundaria similar, expresada como elipticidad molar. En
consecuencia, se espera que los marcadores TV migren o eluyan en un
sistema cromatográfico de permeación en gel (CPG), tal como
Superosa 12, igual que una preparación de acetato de
glatirámero.
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Se espera que los marcadores TV y una
preparación de acetato de glatirámero muestren una correlación
similar entre el tiempo de retención relativo (TRR) y el log del
peso molecular. Los marcadores TV se sometieron a cromatografía en
varias columnas de Superosa 12. Se registró el pico del tiempo de
retención para cada uno de los polipéptidos. La correlación lineal
entre el Log del Peso Molecular (PM) y el Tiempo de Retención
Relativo (TRR) se calculó de la manera siguiente: TRR = B1 + B2 x
LogPM (véase Fig. 3a y Tabla 5).
El sistema de adquisición de datos basado en
Millennium introducido recientemente (Waters Corp., Mildford, Ma)
proporciona una calibración integrada de columnas CPG. El algoritmo
para la calibración se basa en el tiempo de retención y viene dado
por la ecuación:
LogPM = A + B x
TR o PM =
10^{(A+BxTR)}
en la que PM es el peso molecular,
TR es el tiempo de retención, A y B, respectivamente, son la
ordenada en el origen y la pendiente de la función de regresión
calculada (Fig. 3b, Tabla
5).
Los resultados obtenidos mediante este algoritmo
son prácticamente idénticos a aquellos obtenidos con el algoritmo
aplicado actualmente, basado en el TRR. En el intento de automatizar
los procedimientos, se empleó el sistema de adquisición de datos
basado en Millennium para llevar a cabo la calibración usando los
marcadores TV. Los procedimientos analíticos se actualizaron en
consecuencia.
Se obtuvo una buena correlación
(r^{2}>0,98) entre el log PM y el TRR, aunque los puntos no se
distribuyen uniformemente en torno a la línea de regresión. Esta
distribución es debida a las diferencias en la elipticidad de los
diversos marcadores, como también se observó para el acetato de
glatirámero. El marcador de pesos moleculares bajos que se desvía
algo de la linealidad no se puede excluir debido a que la regresión
debe cubrir valores por debajo de los 2500 Daltons para el primer
parámetro de distribución de la desviación estándar (+1DS). Este es
un rasgo general de todos los péptidos cortos - son menos
helicoidales y más lineales.
Para la calibración basada en los marcadores de
pesos moleculares del acetato de glatirámero, la ordenada en el
origen (B1) y la pendiente (B2) fueron, respectivamente, 1,7415 y
-0,2784. Esto se compara favorablemente con los valores de
calibración obtenidos con los marcadores TV (B1 = 1,6996; B2 =
-0,2705). Los pesos moleculares obtenidos usando los dos grupos de
calibración dentro del intervalo de especificación difirieron,
normalmente, en no más del 20% en el intervalo de pesos moleculares
bajos y no más del 12% en el intervalo de especificación del TRR
del pico (peso molecular medio). Esta diferencia relativamente
pequeña sostiene la afirmación de que estos marcadores pueden
sustituir a los marcadores de pesos moleculares de acetato de
glatirámero usados actualmente sin un cambio significativo en los
valores de pesos moleculares obtenidos.
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La calibración basada en los marcadores TV se
comparó con la calibración basada en los marcadores de pesos
moleculares del acetato de glatirámero (Tabla 5b). Las dos
calibraciones se compararon calculando los valores de pesos
moleculares para cada grupo de calibración en el intervalo TRR de
0,5 a 0,8. El grupo de calibración del marcador TV incluía una
fracción de TV-109 que se purificó mediante
cromatografía de fase inversa antes de su uso para la calibración
de la columna.
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Pureza de los marcadores TV. Tres de los
marcadores (TV-66, TV-77 y
TV-86) se purificaron posteriormente mediante
cromatografía de fase inversa. Se obtuvieron tres fracciones para
cada marcador. La fracción media que contiene la porción principal
del pico se sometió a cromatografía en el sistema Superosa 12 en
comparación con los marcadores sin fraccionar (Tabla 6). Los
marcadores TV se sometieron a cromatografía de separación por tamaño
sin purificación (Normal) y después de purificación mediante
cromatografía de fase inversa (Purificado). Se determinaron los
tiempos de retención del pico y se calcularon las diferencias. El
tiempo de retención del pico permaneció inalterado por el grado de
pureza. Por tanto, el producto final de la síntesis es útil para
una calibración precisa y no es necesaria una purificación
adicional.
Consistencia en los valores reportados
(Validación cruzada). Seis lotes de acetato de glatirámero,
fabricados en 1993 y 1994, se volvieron a analizar mediante CPG
calibrada con los marcadores TV. Sus pesos moleculares medios y la
distribución de pesos moleculares se comparó con los valores
reportados en el momento de su liberación. La Tabla 7 muestra una
comparación de los datos de los pesos moleculares del certificado de
análisis original y los datos de los pesos moleculares obtenidos
usando una columna de Superosa 12 calibrada con marcadores TV. Las
diferencias en los valores reportados normalmente son inferiores al
10%.
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Estabilidad de los marcadores en
disolución. Los marcadores TV se sometieron cuatro veces a
cromatografía en un periodo de 24 horas. Todos los marcadores se
mantuvieron en disolución a temperatura ambiente y se analizaron a
intervalos de 8 horas. La Tabla 8 muestra el tiempo de retención del
pico medido para los marcadores TV en cada uno de los cuatro puntos
temporales. A una concentración de 0,1 mg/ml, los marcadores TV
fueron estables en disolución durante al menos 24 horas a
temperatura ambiente.
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Además, las disoluciones de los marcadores se
almacenaron durante hasta tres meses y medio bajo diversas
condiciones de almacenamiento (2-8ºC, -10 a -20ºC,
con/sin azida). Los marcadores TV son estables durante al menos 3
meses cuando se almacenan en forma de disoluciones congeladas
(Tabla 9). Como precaución se decidió permitir el almacenamiento de
disoluciones congeladas durante dos meses.
Los marcadores TV liofilizados son estables
durante al menos dos años según los datos de estabilidad
acumulados.
\vskip1.000000\baselineskip
Resumen de los datos de calibración. En
total, los marcadores TV se analizaron 53 veces en dos laboratorios.
En la Fig. 4 y en la Tabla 10 se presenta un resumen de los datos.
Las diferencias observadas entre las carreras individuales (Fig. 4)
reflejan variaciones entre las columnas más que diferencias entre
los laboratorios participantes. Esto está indicado en la Fig. 4
mediante el uso de símbolos diferentes para algunas de las carreras.
Las constantes de calibración en la Tabla 10 se calcularon usando
la ecuación de Millennium para los datos obtenidos para 53 grupos
de calibración inyectados en 16 columnas.
Distribución de pesos moleculares de una
preparación de acetato de glatirámero. Se determinó el peso
molecular para un lote de acetato de glatirámero (BN 90995). La
Tabla 11 resume los datos obtenidos de 16 determinaciones en
columnas calibradas con marcador TV.
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\vskip1.000000\baselineskip
La aplicación de un peso molecular y un grupo de
marcadores de secuencia definida para la calibración de la columna
de Superosa 12 tiene varias ventajas sobre los marcadores de pesos
moleculares de acetato de glatirámero usados actualmente.
Primero, el uso de síntesis en fase sólida
asegura la consistencia entre las diversas preparaciones de cada
lote. Los resultados de la espectroscopia de masas (Tabla 3)
confirmaron la reproducibilidad de la síntesis. Esta consistencia
proporciona una precisión mejorada en las determinaciones de los
pesos moleculares.
Segundo, la calibración actual está basada en la
determinación del TRR al 50% del área del pico para cada uno de los
marcadores de pesos moleculares de acetato de glatirámero. Los
nuevos marcadores eluyen en forma de picos agudos. Su uso en
calibración es más preciso que el tiempo de retención calculado al
50% del área de un pico ancho.
Tercero, el uso de marcadores con pesos
moleculares definidos mediante secuencias predeterminadas excluye
cualquier incertidumbre que pueda acompañar al uso de los marcadores
cuyo peso molecular está determinado por una medida inexacta de las
propiedades físicas.
Cuarto, el procedimiento de calibración facilita
la normalización de columnas para las determinaciones de los pesos
moleculares, independientemente de cambios menores entre lotes, edad
o instrumentación de las columnas.
Claims (7)
1. Uso de una pluralidad de marcadores de pesos
moleculares para establecer una relación entre el tiempo de
retención en una columna cromatográfica y el peso molecular para
determinar el peso molecular medio de una mezcla de polipéptidos,
cada uno de cuyos polipéptidos consta de alanina, ácido glutámico,
tirosina y lisina, en el que en la mezcla de polipéptidos la
fracción molar de alanina es de 0,38 a 0,5, la de ácido glutámico
es de 0,13 a 0,15, la de tirosina es de 0,08 a 0,10, y la de lisina
es de 0,3 a 0,4, y en el que cada uno de los marcadores de pesos
moleculares es un polipéptido que consta de alanina, ácido
glutámico, tirosina y lisina y que tiene una secuencia de
aminoácidos predeterminada y un peso molecular definido.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que en
la mezcla de polipéptidos la fracción molar de alanina es 0,427, la
de ácido glutámico es 0,141, la de lisina es 0,337 y la de tirosina
es 0,093.
3. El uso de las reivindicaciones
1-2, en el que en los marcadores de pesos
moleculares la fracción molar de alanina es de 0,38 a 0,5, la de
ácido glutámico es de 0,13 a 0,15, la de tirosina es de 0,08 a 0,10,
y la de lisina es de 0,3 a 0,4.
4. El uso de las reivindicaciones
1-2, en el que en los marcadores de pesos
moleculares la fracción molar de alanina es de 0,422 a 0,444, la de
ácido glutámico es de 0,133 a 0,143, la de tirosina es de 0,086 a
0,093 y la de lisina es de 0,333 a 0,349.
5. El uso de las reivindicaciones
1-2, en el que en la mezcla la fracción molar de
alanina es 0,427, la de ácido glutámico es 0,141, la de lisina es
0,337 y la de tirosina es 0,093.
6. El uso de las reivindicaciones
1-5, en el que la columna cromatográfica es una
columna de cromatografía de permeación en gel.
7. El uso de las reivindicaciones
1-6, en el que la mezcla de polipéptidos es acetato
de glatirámero.
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