HU229719B1 - Copolymer-1-delated polipeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use - Google Patents

Description

Kopolimer-1 -rokon polípeptidek alkalmazása molekulatömeg kalibráló standardként és gyógyászati anyagként

A találmány molekulatömeg kalibráló standardokat Ismertet a glatiramer-aeetst terpohmerek és más kopolimerek molekulatömegének pontos meghatározására. A molekulatömeg kalibráló standardok olyan polípeptidek, amelyeknek körülbelül 2000-40000 dalion közötti, meghatározott molekulatömegük ven és amlno'sav-összetételök megfelel agy glatiramer-acetátnak vagy ezzel rokon kopolimernek. Meghatározott molekulatömegekkel azok a polípeptidek rendelkeznek, amelyek szekvenciái meghatározottak. A glatlramer-acetátnsk megfelelő molekulatömeg kalibráló standardok alanln, glufsminsav, tirozin és ílzin nevű arninosavakai, specifikus mólarányban tartalmaznak. A rokon terpoltmereknek megfelelő molekulatömeg kalibráló standardok a fenti négy sminesavhói hármat tartalmaznak. Egy előnyös kiviteli alakban a polipeptid aianlnnal rendelkezik az N-láncvégen és tlrozinnal az N-láncvégtől szám flott negyedik pozícióban, A találmány több molekulatömeg kalibráló standardok sorozatára is vonatkozik egy kopolimer-kompoziciö moiekuiatőmeg- tartományának meghatározására., A molekulatömeg kalibráló standardok ideális esetben a moláris elíipticitás és a molekulatömeg vagy a retenciős idő és a molekulatömeg logaritmusa között lineáris kapcsolatot mutatnak.

Optimális esetben a polípeptidek olyan biológiai aktivitást mutatnak, amely hasonló azon kopoÍimeréhez, amelyből azokat származtatják. A meghatározott moiekulstömegekkai és a glatiramer-acetáthoz hasonló aminosav összetétellel rendelkező polípeptidek optimális esetben gyógyászatHag is hasznosíthatók immunbetegségek és -állapotok kezelésére.

ί κ <

« ♦

Autoimmun betegségek ekkor fordulnak elő, amikor a szervezet immunrendszere a szervezet egyes saját szöveteit nem ismeri fel sajátjaként” és azokat “idegenként megtámadja. Normális esetben a sajátanyag felismerés az Immunrendszeren belüli, azon fejlődés során, amely megakadályozza, hogy a szervezet saját T -sejtjei és 8-sejtjeí a szervezet saját szöveteivel reagáljanak, korán kifejlődik. Ezeket a korai immunválaszokat az antigének MHC-molekulákhoz való kötődése és a T-sejt receptorokEz a sajátanyag felismerési folyamat összeomlik, amikor autoimmun betegségek fejlődnek ki, és a szervezet saját szöveteit és proteinjeit a szervezet immunrendszere autoantigénekként” ismeri fel, és megtámadja. Például a sclerosis multiplexről azt gondolják, hogy egy autoimmun betegség, amely akkor fordul elő, amikor az immunrendszer megtámadja a mielin hüvelyt, amelynek funkciója az idegek elszigetelése és védelme. Ez egy kifejlődő betegség, amelyet demiellnezés, majd Idegi és mozgás funkciós károsodás jellemez. A rheumatoid arthritis (“RA) vélhetően szintén autoimmun betegség, amely a színovlálís ízületek gyulladásából és aktíváit T -sejtek, makrofágok és plazma sejtek beszűrődéséből ált és az izületi porc progresszív károsodására vezet. Ez az izületi betegség legsúlyosabb formája. A rheumatoid arthritis során megtámadott autoantigén(ek) természete kevéssé ismert, bár a Il-tipusú kollagén lehetséges felelős,

A sclerosis multiplex és a rheumatoid arthritis kifejlődésére való hajlam örökletes. A szóban forgó betegségek többszőr fordulnak elő azokban a személyekben, akik egy vagy több jellegzetes H-osztalyú MHC altéit (allelomorf gént) hordoznak. Például a rheumatoid artritisre való örökletes hajlam erős összefüggésben áll a lí-osztályú MHC CRBVÖ401, DRBVG4G4 vagy DRB 1*0405 vagy a DRB 1*0101 allélekkel. A hísztokompatibilitás génhely antigének (HLA) sejtek felületén találhatók és a szövetek egyedi

Λν χ Í, jellegének meghatározását segítik különböző személyekből, A hísztokompafibíl-tás génhely antigének génjei a S. számú kromoszóma ugyanazon régiójában helyezkednek el nagyméretű hisztokompatibilitás komplexként (MHC). Az MHC-régiő molekulák számos különböző osztályát expresszáíja a test különböző sejtjeiben, a. gének a kromoszóma mentén szekvencia sorrendben I-, II- és Hl-osztályú MHC-gének. Az l-osztályú gének HLA-génekbői állnak, amelyek tovább csoportosíthatók A, δ és C alrégiókra, A il-osztályú gének tovább csoportosíthatók a DR, DO és DP alrégiókra. Az MHC-.DR molekulákat ismerjük a legjobban; ezek az antigént bemutató sejtek, így például makrofágok, a nyirokszövet dendrites sejtjei és felhám-sejtek felületén fordulnak elő. A Hl-osztályú MHC-fermékek a komplement rendszer számos komponensében és egyes nem Immun-rokon sejtekben expresszálódnak.

Számos gyógyászati anyagot fejlesztettek ki autoimmun betegségek kezelésére, így szteroíd- és nem-szteroid gyulladáséilenes gyógyszereket, például metotrexátot; különböző Interferonokat; és a prosztaglandín szintézis számos gátlószerét, A szóban forgó szerek azonban mérgezoek lehetnek, ha rövid időtartamoknál hosszabb Ideig alkalmazzák, vagy nemkívánatos mellékhatásokat okozhatnak. Más terápiás szerek, például anti-TNF-speciflkus antitestek vagy antitest-fragmentumok, vagy a TNF-receptor oldható formái megkötik és/vagy gátolják a tumor nekrözís faktor (TNF) gyulladáskeltő hatását. Ezek a szerek T-sejt felületén egy proteint juttatnak célba és általában megakadályozzák az antigén bemutató sejttel (ARC) való kölcsönhatást. Azonban természetes bajlításű proteineket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása, kiszerelése, tárolása és célba juttatása gyakran bonyolult. Továbbá, az immunrendszer természetes heterogenitása a gyógyszerek hatásosságának határt szabhat és bonyolíthatja az autoimmun betegségek hosszú távú kezelését.

«X * *

A glatiramer-acetát (k.opoH.m.er-1_s Gop-1, a továbbiakban GLAT-kopolímer) alanin, glefamínsav, lizin és tirozln sorrendben körülbelül 4,6:1,5:3,6:1,0 mőlarányábói éllé polipeptid-elegy, amelyet a négy aminosav kémiai polimefizációjávaí állítanak elő, olyan termékeket képezve, amelyek átlagos molekulatömege köröibelöl a 40ÖÖ--130ÖG dalion tartományban van. A megfelelő móltörtek körülbelül aianlnra 0,427, glutaminssvra 0,141, iizínre 0,337 és firozínra 0,093 és azok körülbelül ±10 % mértékig változhatnak, A rokon kopollmerek az előbb említett négy aminosavbél háromból álló polípeptid-elegyek (ezért terpolímerek”). A kopolimer-1 és a terpoiimerek az emlős Immunrendszer és az emberi populáció természetes heterogenitását célozzák, és autoimmun betegségek és más immunáíiapotok kezelésére hatásosak. Előnyös átlagos molekulatömeg-tartományokat és terpollmer-előállítés! eljárásokat ismertet az 5 800 SOS számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely teljes tartalmára referenciaként hivatkozunk. A találmány szerinti kopolimer-1 a szakember által Ismert módon állítható elő, l. pl. az US 3 849 550 sz, szabadalom leírását. £ szerint a tirozln, alanin. γ-benzil-glutamát és az s-H-trifluor-acetil-lizin H-karboxi-anhldridjét szobahőmérsékleten absz. dloxénban díetii-amin mint íníoíátor jelenlétében polimerizálják. A glutaminsav γ-karboxíi-csoportjának felszabadítását jégecetben hldrogén-bromlddal végzik: ezt követi a ίηίΙηοί-βοβΡΙ-οοοροίΐοΚηοΚ a lizin maradékokból 1M plperidinnel végzett eltávolítása, A jelen leírásban a „szobahőmérséklet” kifejezés a kb. 20 - kb. 28°C hőmérséklet tartományra vonatkozik. A keresett molekulatömeg profillal rendelkező kopoiimer-l-et bármelyik ismert módszerrel előállíthatjuk. Ilyen módszer pl. a nagy molekulájú elemeket tartalmazó kopolimer-í kromatografálása és a nem-kívánt féleségeket nem tartalmazó frakciók összegyűjtése; a részleges savas vagy enzimes hidrolízis,, amely a nagy molekulájú elemek eltávolítására irányul, majd ezt követő tisztítás, diaitφφφφ **** „**» s* * * ♦ φ * φ * , φφ*» zisseí vagy ultraszűréssel, Egy további eljárás szerint a keresett molekulatömeg profillal rendelkező kopollmer-1 előállítására az aminocsoportokat védett alakban tartalmazó, keresett molekulatömeg profillal rendelkező kopöíímer~1~hol Indulunk ki és közvetlenül a védőosoportok eltávolításává! jutunk a megfelelő molekulatömeg féleséghez, A találmány szerinti készítmények a szakterületen ismert eljárásokkal készíthetők ki, A készítményt előnyösen llofiíízáijuk és vizes oldattá alakit]uk, amely s,c, injekció céljára alkalmas. Egy másik megoldás szerint a kopollmer-1 bármely, a szakember által pepiid hatóanyagok esetében ismert alakban - orális, nazális, bukkálls vagy rektális készítményként kikészíthető, A találmány más, három, négy vagy őt vagy több amínosav más kombinációiból álló kopoUmereket is Ismertet.

A kopolímer-1 vagy terpollmer preparátum gyógyászati készítményekben velő alkalmazásra történő tanúsításhoz szükséges a preparátumban lévő polipeptidek molekulatömeg-eloszlásának pontos meghatározása. A molekulatömeg meghatározásának egyik módja a kromatográfiás eljárás Superose-12 oszlopon, A Superose-12 keresztkötéses, agarőz alapú anyag, amelynek kizárási tartománya 2x1 ü⁶ Dalion, optimális szétválasztási tartománya 1000-3x10 ^b Dalion és a gyöngyök átmérője 20-40 um. A glatiramer-aeetáf molekulatömegének meghatározására szolgáló oszlopok kalibráló koefficienseit közvetetten mért molekulatömegekkel rendelkező glatiramer-acetát-adagok alkalmazásával határozták meg. A közvetett mérések közé tartozott a viszkozlmeiría és a sebesség szedimentácíős ultracentrlfugálás. Újabban a glatlramer-acetát kalibrációs standardok olyan adagjait állították elő, amelyek molekulatömegét sokszögű lézerfény szórási eljárással (MALIS) határozták meg.

Ennélfogva Igény van olyan molekulatömeg kalibráló standardokra, amelyek standardokén! alkalmasak a találmány sze«.# « « * ** * .6 rinfi kopolimer kompozíciók molekulatömeg-eloszlásának meghatározására. A kívánt molekulatömeg kalibráló standardok meghatározott, olyan molekulatömegekkel és fizikai tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek analógok azokkal a molekulákkal, amelyek molekulatömege meghatározandó. Ideális esetben lineáris kapcsolat van a kalibráló standardok meghatározott molekulatömegei (vagy a meghatározott molekulatömegek logaritmusa) és egy mérhető fizikai tulajdonság, így például a kalibráló standardok moláris ellíptícitása vagy molekula méret szerint elválasztó oszlopon mért retenclós ideje között.

A meghatározott szekvenciáié molekulatömeg kalibráló standardok, amelyek kémiai és fizikai tulajdonságai hasonlóak a GLAT-kopohmerhez, pontos és megbízható kalibráló sorozatot biztosítanak a termék-adagok molekulatömegének meghatározásaihoz, A találmány olyan GLAT-kopoiimer származékokat Ismertet, amelyek alkalmasak molekulatömeg kalibráló standardokként GLAT-kopoiimer készítmények molekulatömeg tartományainak meghatározására és optimális esetben gyógyászatilag alkalmazhatok immunállapofok kezelésére, A találmány továbbá m e g h a t á r ο z o t í m o le k u I al ö m ege k k e 1 rendelkező polipeptid eket ismertet, amelyek más kopolimerek származékai és amelyek alkalmasak a. szóban forgó polimerek preparátumai molekulatömeg-tartományának meghatározására. Amikor a szóban forgó kopolimerek gyógyászatilag hasznosíthatók, akkor optimális esetben a származék-poíipeptldek is gyógyászatilag alkalmazhatók. A GLAT-kopohmer preparátum molekulatömeg tartományának meghatározására előnyös származék az olyan polipénfid, amely aminosav-összetétele közelítőleg megfelel a *»

GLAT-kopolímerének és olyan meghatározott mo rendelkezik, amely körülbelül 2QOO-4ÖOÖO dalion polípeptid előnyösen az aianin, a giutamínsav, eku la tömeggel között van, A a fírozin és a llzln nevű amínosavak specifikus móiarányalval rendelkezik. Továbbá egy előnyős kiviteli alakban a polípeptid az N-láncvégnél alaníint és az N-íáhcvégtől számított 4. pozícióban ürozínt tartalmaz. Egy terpohmer molekulatömegének meghatározására az előnyős származék meghatározott molekulatömeggel és olyan aminosav-összetéteiiel rendelkezik, amely körülbelül a szóban forgó terpoiimerének felel meg. A találmány más kopolimereket ís Ismertet. A találmány szerinti kopolimer molekulatömegének meghatározásakor a polipeptid-származék meghatározott molekulatömeggel és olyan aminosav-ősszetétellsl rendelkezik, amely közelítőleg megfelel a szóban forgó kopolímeréoek,

A találmány továbbá molekulatömeg kalibráló standardok sorozatát Ismerteti a glafíramer-acetát vagy egy terpohmer vagy más kopolimer molekulatömegének meghatározására molekulatömeg szerint elválasztó oszlopon, A kalibráló standardok 2-1 ö vagy több pohpeptióet tartalmaznak, minden egyes polípeptid meghatározott molekulatömeggel rendelkezik. A glatiramer-acetát molekulatömeg tartományának meghatározásakor előnyösen a molekulatömeg kalibráló standardok sorozata körülbelül 2000-40000 dalion, meghatározott molekulatömeggel és a giallFamer-aeafáfnak vagy a kiválasztott terpollmernék megfelelő amínosav-összetétehei rendelkeznek. Előnyös kiviteli alakokban lineáris kapcsolat van a molekulatömeg kalibráló standard polipeptíd molekulatömegének logaritmusa és akár a molekulatömeg kalibráló standardok retenciős ideje a méret-meghatározó ι, A ** « β * * molekulatömeg kalibráló standardok m-oiekulamolekulatömeg kalibráló standardok moláris oszlopon vagy a tömege és a ♦·<·.♦ »* «« «« ellipflcitása között.,

A találmány továbbá gyógyászati készítményt ismertet, amely GLAT-ko-poiímer molekulatömeg tartományának meghatározására molekulatömeg kalibráló standardként alkalmazható polipeptid gyógyászatílag hatásos mennyiségét tartalmazza és lényegében alanin, gtutammsav,, tirozín és lizin amiRo-savakból, (körülbelül 0,35-0,50 alanin, körülbelül 0,13-0,15 giutamínsav, körülbelül 0,08-0,10 tirozín és körülbelül 0,3-0,4 lizin möltörtekkel) és egy gyógyászatílag elfogadható hordozóból áll, A találmány továbbá gyógyászati készítményt ismertet, amely egy terpoíimer molskolatömeg-tartományának meghatározására molekulatömeg kalibráló standardként használható polipeptid gyógyászatílag hatásos mennyiségét tartalmazza, és lényegében alanin, tirozín és lizin aminosavakból (körülbelül

0,3-0,6 alanin, 0,1-0,5 lizin mö hordozóból ált körülbelül 0,005-0,25 tirozín és körülbelül törtekkel) és egy gyógyászatílag elfogadható

A polipeptid előnyösen lényegében giutamin s a v t ο I m e n t e s.

A találmány továbbá gyógyászati készítményt ismertet, amely egy terpofimer molekulatömeg tartományának meghatározására molekulatömeg kalibráló standardként alkalmas polipeptid gyógyászatílag hatásos mennyiségét tartalmazza., és lényegében giutamínsavból, tlfozmfoöl és Hzlnböi (körülbelül 0,05-0,300 giutamínsav, körülbelül· 0,05-0,250 tirozín és körülbelül 0,3-0,7 lizin mőltörtekken és egy gyógyászatiiag elfogad# «

Φ »

X « ΐ» * *

« 5 .·» φ φ >9

Φ* *·

Φ * ható hordozóbői áh alanintó! mentes.

Á pun peptid előnyösen lenyegeben

A találmány továbbá gyógyászati készítményt ismertet, amely egy terpohmer molekulatömeg tartományának meghatározására molekulatömeg kalibráló standardként alkalmas polipeptid gyógyászatilag hatásos mennyiségét tartalmazza és lényegében aianínbói, gluíaminsavból és tírozinbóí (körülbelül 0,005-0,8 al-anin, 0,005-0,3 glutaminsav, körülbelül 0,005-0,25 il.zm móltortekkeí) és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból álí. A polipeptid előnyösen lényegében hzintöl mentes.

A találmány továbbá gyógyászati készítményt ismertet, amely egy terpohmer molekulatömeg tartományának meghatározására molekulatömeg kalibráló standardként alkalmas polipeptid gyógyászafiiag hatásos mennyiségét tartalmazza és lényegében aianínbói, gluíaminsavból és lizinböl (körülbelül 0,005-0,6 alanln, körülbelül 0,005-0,3 glutaminsav és körülbelül 0,2-0,7 lizín móítortekkel} és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóból áll. A polipeptid előnyösen lényegében tirozintól mentes.

Általában a találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely számú (például 2-5, vagy több) aminosavból álló kopohmer molekulatömeg tartományának meghatározására, molekulatömeg kalibráló standardként alkalmas polipeptid gyógyászatíisg hatásos mennyiségét tartalmazzák, A giatiramer-acetát esetében az ilyen kopolímer az aminosav szekvenciák különböző csoportja. A molekulatömeg kalibráló standardokként alkalmas polipeptid az aminosavak olyan móltörtjeíből ált amely közelítőleg megfelel a kopoíimemek.

Tö ♦ * * .

< * ' s < * Ια ,$ 44 *** >*

A * ♦ *

Jt * «« «* ♦

« χ*«»

A találmány továbbá eljárást ismertet immun-közvetített és autoimmun betegségek kezelésére és megelőzésére emlősökben, amely szerint a találmány szerinti molekuíatőmég kalibráló standard gyógyászatilag hatásos mennyiségét adagoljuk. Más kiviteli alakban az Immun-közvetített és autoimmun betegségek kezelésére Irányuló eljárás emlősökben magában foglalja továbbá az immun támadással érintett T-sejtek szaporodásának gátlását. Más kiviteli alakban az immun-közvetített és autoimmun betegségek kezelési eljárásában emlősökben a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardot egy antigén bemutató sejthez kötjük. További másik kiviteli alakban az emlősök immun-közvetített és autoimmun betegségei kezelési eljárása során a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardot egy olyan H-osztályü nagyméretű hisztokompatibllítás komplex proteinhez kötjük, amely az. autoimmun betegséggel van kapcsolatban,

A. találmány szerinti autoimmun betegségek közé tartoznak az arthritiséé állapotok, a demielinezesi betegségek és gyulladásos betegségek. Például a találmány szerinti készítményekkel kezelhető autoimmun betegségek közé tartozik a sclerosis mn tlplex, a rheumatoid arthritis, a csont-ízületi gyulladás, az autoimmun haemolitíkus vérszegénység, az autoimmun petefészek gyulladás, az autoimmun pajzsmingy gyulladás, az autoimmun uveoretlnitis, a Crohn-féle betegség, a krónikus Immun trombocitopeníkus vörheny, a vastagbélgyulladás, az érintés érzékenységi betegség, a dlabetes meliitus, a Graves-féíe betegség, a Guillaln-Barre-féie tünetcsoport, a Hashimoto-féle betegség, az ídiopatbiás mixödéma, a myastbenia gravis (Izom-

gyengeség), a pikkelysömör, a ípemphigus vulgáris) vagy az általános

Az immun-közvetített betegségek

1.1 *<· ·»( 1 óörhölyagosodas erythematosus. az immunrendszer különösen idegen antigénekre való nemkívánatos érzékenységéből származik. Ezekre példák a gazda-beüitetett-szövet-típusú beteg* ség chvgd) és a beültetett szövet-gaztía-típusú betegség igvhdi és számos késleltetett-típusú hiperszenzitívitás íöTHh

A találmány szerinti készítmények a szóban forgó betegségek közül egy vagy több kezelésére alkalmazhatók.

Az ábrák rövid

Az 13-1, la-2, ia-3 ábrák az 1.

n Ismertetett molekula kalíPrálóstandardokban rrv-kallbrácrős standardok) az aianln megoszlását ismertetik. Az aminosav pozíciót az x-tengelyen jelöljük, Az aianln jelenlétét a jelzett aminosav pozícióban függőleges csík ielzi.

Az Ib-1, i ö-2, lb-3 ábrák az 1. táblázatban ismertetett TV-kalibrációs standardokban a lizin megoszlását ismertetik. Az aminosav pozíciót az x-tengelyen jelöljük, A lizin egység jelenlétét a jelzett aminosav pozícióban függőleges sáv jelzi

Az 1C-1, ie-2, 1c-3 ábrák az 1. táblázatban ismertetett TV-kaiíbráclős standardokban a glutamínsav megoszlását ismertetik. Az aminosav pozíciót az x-tengelyen jelöljük. A glutamínsav egység jelenlétét a jelzett aminosav pozícióban függőleges sáv jelzi.

Az ld-1, ití-2, id-3 ábrák az 1. táblázatban ismertetett tv-kalibráciős standardokban a tírozin megoszlását ismertetik. Az aminosav pozíciót az X-tengelyen jelöljük, A tírozin egység jelenlétét a jelzett aminosav pozícióban függőleges sáv jelzi.

A 2. ábra a találmány szerinti TV-kalíbrációs standardok moláris eiliptícítása és molekulatömege ábrázolásával képzett pontsort ismerteti ismert glatiramer-acetát kalibráló standardokkal összehasonlítva. A moláris eliipticitást W^s deg cm'² dmoP-ben, a molekulatömeget daítonban adjuk meg. A körök a TV-kalibrációs standardokat,, a négyzetek a glatiramer-acetát kalibráló standar-

Φ φ ·»:

♦ « * ♦ » φ » κ « φ Φ » Φ Φ dókat jelentik. Amint az látható, a TV-kalibrációs standardok lineáris kapcsolatot biztosítanak a moláris ehipticitás és a molekulatömeg között

A 3a. ábra a találmány szerinti TV-kalíbrádős standardok relatív retenciós ideje íRRT) és a szóban forgó kalibráló standardok molekulatömegének logaritmusa ábrázolásával felvett pontsort mutatja az RRT -alapú algoritmus alkalmazásával,

A 3b. ábra a TV-kalibrációs standardok molekulatömegének logaritmusa és a szóban forgó kalibráló standardok retenciós ideje (RT) ábrázolásával felvett pontsort mutatja a Millennium-alapú algoritmus alkalmazásával

A Aa. ábra a találmány szerinti ív-kailöráelős standardok relatív retenciós ideje (RRT) és a szóban forgó kalibráló standardok molekulatömege ábrázolásával képzett több kalibrációt összegző pontsort ismerteti., RRT-alapú algoritmus alkalmazásával Az adatokat 16 oszlopról gyűjtöttük. Mind a 16 kalibráció átlagos értékelt ismertetjük.

A 4b. ábra a találmány szerinti TV-katibráclós standardok relatív retenciós ideje (RRT) és a szóban forgó kalibráló standardok molekulatömege ábrázolásával képzett több kalibrációt összegző pontsort ismerteti Millennium-alapú algoritmus alkalmazásával. Az adatokat. 76 oszlopról gyűjtöttük. Mind a is kalibráció átlagos értékelt ismertetjük.

Az 5, ábra '’mono-cop-r elisa felvétele a Cop-i kötésének anti-Cop-1 polikiőn antitestekhez négy TV-kalibrációs standard és Cop-i (03494) általi gátlását mutatja. Az abszorbancia aránya növekvő inhibitor koncentrációval mert aöszorbanciát jelzi a kötő inhibitor hiányában mért abszorbanclához viszonyítva,

A szekvencialista kötetlen szövegének ismertetése;

szekvencia azonosítási szám <213> mesterséges szekvencia <223> szintetikus peptid ♦ ♦♦

Λ«ς5 *«·* ♦.♦·» ·

χ » » * « » « χ «** »♦ ** ♦ < 213 > m esterséges szekve η cí a < 223> szintetikus peptíd < 213 > mesterséges szekvencia <223> szintetikus peptíd < 213 > mesterséges szekvencia < 223 > szintetikus peptíd < 213 > mesterséges szekvencia < 223> szintetikus peptíd < 213 > mesterséges szekvencia <223> szintetikus peptíd <213> mesterséges szekvencia < 223 > szintetikus pepiid

A találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok (például TV-kallbrácíos standardok) közé olyan polipeptidek tartoznak, amelyek aminosav összetétele közelítőleg megfelel a glatiramer-acetáténak vagy a rokon terpoíímereknek és meghatározott molekulatömeggel rendelkeznek, amely körülbelül 200040000 dalton között van és alkalmasak a GLA T -kopolimer és a rokon terpolimerek molekulatömegének pontos meghatározására. A meghatározott molekulatömeg követelményéből következik, hogy a τν-kaKöráctös standardnak diszkrét molekulatömeggel kell rendelkezni és nem molekulatömegek tartományával Ennek megfelelően a τν-kallpráciős standardokat előre meghatározott aminosav szekvencia szerint állítjuk elő, amely összetételében megfelel annak a kopoHmernek, amelyre a molekulatömeg tartomány meghatározandó. Optimális esetben a w-katibraciós standardoknak a megfelelő kopoHmeréhez hasonló gyógyászati hatása van. A szóban forgó kalibráló standardok alkalmazhatók bármely molekula méret megkülönböztető rendszerben bármely megfelelő molekulatömeg meghatározási eljárás vagy készülék alkalmazásával. Például a találmány szerinti kalibráló standardok alkalmazhatok polipeptidek vagy proteinek molekulatömeg meghatározására alkalmazott bármely Scromatog« «β· Φ

ΙΑ ϊφ ϊ >

ráfiás eljárás vagy készülék kalibrálására. Az ilyen kromatográfiás készülék lehet molekulatömeg szerint elválasztó oszlop, amely a polípeptideket molekula, méretük alapján különíti el.· A molekulatömeg szerint elválasztó oszlopokra példák a TSK-oszlopok, a Sephadex-oszlopok, a Sepharose-oszlopok és a Superose-oszlopök. Diszkrét mérettel és összetétellel rendelkező molekulatömeg kalibráló standardok biztosítása érdekében a találmány szerinti molekulatömeg, kalibráló standardokat a szakember számára ismert eljárásokkal előre meghatározott szekvenciák szerint állíthatjuk elő.

A találmány szerinti aminosavak közé tartozik a 20 általában előforduló aminosav, nem korlátozódik azonban a találmány ezekre. A találmány körébe tartoznak a természetben előforduló és szintetikus származékok, például a szelenociszteín is. Az aminosavak közé tartoznak továbbá az aminosav analógok. Az aminosav analóg” sz aminosav kémiailag rokon vegyülete, amely eltérő konfigurációval rendelkezik, például egy izomer vagy egy D-konfigurációjú vegyület L-konfígurácIö helyett; vagy egy az aminosavhoz közeli méretű és alakú szerves molekula vagy olyan aminosav, amelyen a peptid kötésben résztvevő atomok módosítva vannak annak érdekében, hogy proíeáz-ellenállók legyenek, amikor pepiidben vagy polipeptidben polimerizáljuk.

Az ''aminosav’' és aminosav szekvencia kifejezések a jelen leírásban és az igénypontokban alkalmazva egy vagy több aminosav-származék és/vagy amínosav-analóg összetevőt jelenthetnek, amelyek egy része vagy egésze a szekvencia által jelzett, természetben előforduló 20 aminosav közül egy vagy több :15' , ♦ * ♦♦ » ♦· > ♦ * η κ·χ egységet tartalmaznak. Például egy egy vagy több tirozin egységgel rendelkező aminosav szekvenciában a szóban forgó egységek közül egy vagy több részlete homoíírozinnei helyettesíthetö. Továbbá, ebbe a definícióba értendő egy olyan aminosav szekvencia, amely egy vagy több oem-peptid vagy peptidutánzó kötéssel rendelkezik két szomszédos egység között.

Az egybefös· vagy hárombetűs aminosav rövidítések (és az aminosav, amelyet a rövidítés jelöl) a következők: A jelentése aia (aianin); C jelentése cys (oíszteín}; D jelentése asp (aszpartámsav); E jelentése glo (glutaminsav}; F jelentése phe (fenilalanin); G jelentése gly (gllcin): H jelentése his (hisztiéin): I jelentése lle (ízoleucin): K jelentése lys (hzín); L jelentése Ieu (leucin); M jelentése met (metionin); N jelentése asn (aszparagín): P jelentése pro (prolin); Q jelentése gin (glutamin); R. jelentése arg (arglnin); S jelentése ser (szerin); T jelentése thr (treonin); V jelentése val (valin); W jelentése trp (trlptofán); és Y jelentése tyr (tirozin).

A hidrofób” aminosav kifejezés a jelen leírásban és az igénypontokban alkalmazva az aianín (A vagy aia), a gllcin (G vagy gly), az ízoleucin (I vagy iie), a leucín (L vagy Ieu), a prolin (P vagy pro), és a valin (V vagy val) alifás aminosavakat - a zárójelben levő kifejezések az aminosavak egybetűs vagy hárombetűs általános rövidítései - és a trlptofán (W vagy trp), a íeníiaíanm (F vagy phe), és a tirozin (Y vagy tyr) aromás aminosavakat foglalja magában. Az aminosavak hidrofobicifást mutatnak az alifás rész hossza és az aromás oidaiíáncok mérete függvényében, amikor azok a proteinen belül egységként találhatók.

«« *

Az töltéssel rendelkező aminosav kifejezés a jelen' leírásban ás az Igénypontokban alkalmazva az aszparagms3V.(D veg-y asp}, a glutamlnsav (E vagy glu),· a hlsztidín (H vagy hisz), az arginin (R vagy arg) ás a Uzm (X vagy lys) aminosavakat foglalja magában, amely aminosavak pozitív (his, lys és arg) vagy negatív (asp és giy) töltést adnak a szóban forgó egységeket tartalmazó proteineknek vizes oldatokban a pH élettani értékel mellett.

A találmány szerinti polipeptid kompozíció. A találmány szerint meghatározott molekulatömeggel rendelkező és a tirozin, a gluíaminsav, az alanln és a lízin nevű: aminosavak közöl hármat vagy mind a négyet tartalmazó· pollpeptidek előnyösek a találmány szerinti kalibráló standardokként. Azonban a szakember könnyen helyettesítheti a szerkezetileg rokon aminosavakat a találmány értelmétől velő eltérés nélkül. Ennélfogva a találmány tárgyát képezik továbbá e találmány szerinti poiipeptidekben a tirozin, a gluíaminsav, az alanln és a iizin hagyományos aminosav-helyettesítései. Az Ilyen szerkezetileg rokon aminosavak közé tartoznak.azok az aminosavak, amelyek körülbelül azonos töltéssel, hidrofőb jelleggel és mérettel rendelkeznek, mint a tirozin, a glutamlnsav, az alanln vagy a llzin. Például a iizin szerkezetileg rokon az argmínneí és a híszíiöinneí; a glutaminsav szerkezetileg rokon azsfszparaglnsswal; a tirozin szerkezetileg rokon a' szennnei, a freonióoah a tíiptofánnal és a fenlielaninoal: és az alsóin szerkezetileg rokon a vallanak a leuoinnal és az izoteuclnnel,

Továbbá a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló stsn dardok állhatnak L- vagy D-amlnosavakbót Amint az a szakem♦ Jí ♦ Φ *

X XX * » » < * < <« ««««

♦ * » * η + * ** ♦

Per számára ismert, a legtöbb természetes proteinben L-ammosavak fordulnak elő. Azonban a ö-amlnosavak kereskedelmi. forgalomban beszerezhetők és a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok előállítására alkalmazott egyes vagy összes - amínosavat helyettesíthetik. A találmány tárgyát képezik a D- és L-ammosavak elegyeíből képzett molekulatömeg kalibráló standardok es lényegében vagy L- vagy D-arninosavakból álló molekulatömeg kalibráló standardok is.

A találmány szerinti polipeptidekben lévő amínosavak átlagos molekulatömege és átlagos móltörtje változhat. Azonban a molekulatömeg a körülbelül 2ÖÖ0-4OÖÖÖ tartományban van,, és a savas pohpeptidekkel szemben inkább a bázikus pohpeptldek előnyösek.

Egy kiviteli alakban a találmány firoztnt, alantot, glutamlnsavat és lizlnt meghatározott mói'arányokban tartalpia-zó

polípeptid kalfbr	élő standardokat ismertet.. Egy előnyösebb ki-
vitel! alakban a	találmány szerinti polipeptidekben lévő sminc-
savak mölarány	a azonos a GLAT-kopolímerben taláíítal. A
mólarányok közö	tli ilyen összefüggés biztosítja a legjobb mole-
kulatömeg kallót	álö standardokat, mert a szóban, forgó kalibráló

standardok töltése és molekula-alakja hasonló a GLAT-kopolimeréhez. Amikor szerkezetileg különböző kalibráló· standardokat alkalmazunk, a kalibráló standardok a GLAT-kopolimer preparátumoktól eltérőhöz vándorolhatnak vagy eltérőnél elválhatnak annak ellenére, hogy a szóban forgó preparátumok a kalibráló standardokkal azonos molekulatömegűek.

Továbbá egy előnyös kiviteli alakban az alanin az N-láncvégen és a tirozín az N-láncvégfÖl számitott 4. pozícióban » χ»«*# ’ κ» *·*.

β » « « χ « * χ β ♦ X ♦♦ * » 9 4 4 * # “♦«-** V« ’»♦ »** '·*'*: ** *♦** van.. Különböző glatiramer-acetát egységeken végzett Edman-lehontási analízisek nagy mennyiségű alanínt mutattak ki az N-iáncvégen és tirozlnt az N-láncvégtől számított 4. pozícióban. Ezért bizonyos előnyös kiviteli alakokban a GLAT-kopolimer molekulatömeg kalibráló standardok alaninnai rendelkeznek az N-láncvégen es tirozínnal az N-láncvégtől számított 4. pozícióban. A GLAT-kopolimer előállítására alkalmazott poiimerizációs reakciók tanulmányozása kimutatta, hogy az alanín és a giutaminsav gyorsabban polimerizálödik, mint a lizin. Ennek eredményeként a GLAT-kopolimer C-íáncvégi részlete gyakran gazdagabb alaninban és glotamlnsavban, míg az IM-láncvégi részlet ovakran o« ílzinben. Előnyős kiviteli alakokban a GLAT-kopolimer molekulatömeg kalibráló standardokban ez aminosav egységek megoszlása ezt az eltolódást tükrözi.

A GLAT-kopolimer molekulatömeg-tartományának meghatározásakor az előnyös molekulatömeg kalibráló standard lénye? gében alanín,. giutaminsav, tirozin és lizin aminosavakböl áll alap-inra körülbelül 0,38-0,50, gíutammsavra körülbelül 0,13-0,15, tirozinra körülbelül 0,00-0,10 és íízinre körülbelül 0,3-0,4 móitörtekkel.

Más kiviteli alakokban a találmány az alanín, a giutaminsav.. a tirozin és a lizin nevű négy aminosav közül hármat meghatározott arányban tartalmazó molekulatömeg kalibráló standardokat ismertet. Előnyös kiviteli alakokban a molekulatömeg kalibráló standardokban jelenlévő aminosavak mólförtjei azoknak a mőltörteknek telelnek meg, amelyeket a megfelelő terpolímerben találó nk.

* »:· *'* ·* * »» _Μ » 0 » X * * » * * * 4 Λ ♦ ♦ * **** *♦ «3 $ ♦ ~ w * ♦ » ♦ * * »«.» »< »♦ 0XX ♦* ** ***·

Amikor a molekulatömeg kalibráló standard aíanlní, glutamtnsavat és firoziht tartalmaz, az alanin körülbelül 0,005-0,800, a gí utam insav körülbelül 0,005-0,300, és a tirozin körülbelül 0,005-0,250 mőOörttel lehet jelen. A molekulatömeg körülbelül 2000-40000 dslton. és előnyösen körülbelül: 3000-12000 dslton.

Amikor a molekulatömeg kalibráló standard alanin!, glutaminsavat és Ilzint tartalmaz, az alantn. körülbelül 0,005-0,600, a glutamlnsav körülbelül 0,005-0,300 és a lizln körülbelül 0,2-0,7 móltöTttel lehet jelen. A molekulatömeg körülbelül 2000-40000 dalion és előnyösen körülbelül 3000-12000 dalion.

Amikor a molekulatömeg kailbrálő standard alaníní, tlrozint és lizinl tartalmaz, az alanin körülbelül 0,3-0,8, a tirozin körülbelül 0,005-0,250 és a ílzin körülbelül 0,1-0,5 móltörtfel lehet jelen. A molekulatömeg körülbelül 2000-40000 dalion és előnyösen körülbelül 3000-1 2000 dalion.

Amikor a molekulatömeg kalibráló standard glutamínsavat, tlrozint és ilzint tartalmaz, a glutamlnsav körülbelül 0,005-0,300, a tirozin 0,005-0,250 és a lizln körülbelül 0,3-0,7 rnóltörttel lehet jelen. A molekulatömeg körülbelül 2000-40000 dalfon közötti érték, és előnyösen körülbelül 3000-12000 dalfon.

A találmány szerinti pclipepfidek a találmány körébe tartozó más kopolimerek molekulatömeg tartományának meghatározására alkalmazhatók. A találmány szerinti kopolimerek három, négy vagy öt vágy több aminosav kombinációjából állhatnak. Általában a találmány szerinti kopolimer molekulatömeg tartományának meghatározásé ra a polípeptid molekulatömeg kalibráló standard meghatározott molekulatömeggel, és olyan aminosav összetétellel rendelkezik.,, amely a szóban forgó kopolimerének

ΧΦΦΦ ΦΧΧΦ

ΦΦ< ΧΦΦΦ ΦΧΧΦ *- * «»

-» 20« *.,· ’ ’ ’ Χ»Φ ΦΦ * * *·*♦ *· *«φ Φ· φφ** közelítőleg megfelel. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a kopobmerben az amínosavak eloszlásában bármely eltolódás meghatározható a fentebb a GLAT-kopoiímernél ismertetett módon. Például- egy ferpobmer csoport minden egyes pozíciójában levő amínosavak relatív mennyiségei megkaphatok egy Edman-íebontás minden egyes lépéseiből származó termékek elemzésével. Más megoldásként egy terpolimer csoportban lévő arnínosavak arányai a szintézis során követhetők. Ahol az alkalmazható, molekulatömeg kalibráló standardok szintetizálhatok az eltolódás tükrében. Továbbá bizonyos előnyös terpolimer molekulatömeg kalibráló standardok alantot vagy tirozinf tartalmaznak a 4. pozícióban.

Az előnyős polipeptid molekulatömeg kalibráló standard szekvenciákra példákat az 1. táblázat tartalmaz (szekvencia azonosító számok: 1-7} a hagyományos egybetüs aminosav jelzés alkalmazásával., az H-iáncvégfőI a C-iáncvég felé olvasva. A hét jelzett szekvencia polipeptidek egyedi preparátumsí, amelyek a. glatiramer-acetátnak megfelelő aminosav összetétellel rendelkeznek. Általában egy molekulatömeg kalibráló standard molekulában lévő aminosavak túlnyomó többségben egy koníiguráclójúak (D~ vagy L.-konfiguráció}. Előnyős kiviteli alakokban a molekulatömeg kalibráló standard molekula teljes mértékben azonos konfigurációjú aminosavakból áll. Azonban kevert konfigurációjú amlnosavakat tartalmazó molekulatömeg kalibráló standard molekulák előnyösek lehetnek bizonyos kiviteli alakokban, ahol a molekulatömeget olyan glatíramer-acefáf preparátumra határozzuk meg, amely kevert konfigurációjú amlnosavakat tartalmaz.

(* χ

Kiválasztott TV-kalibrácios standardok aminosav szekvenciái

TV·#	Szekvencia asoöösítss; sa&m	Szekvencia. j
TV-3S	1	AKKYAKKEKAAKKAYKKEAKAKAAEAAAKBAAYEA |
TV-45	2	AAYEA í
i TV-56	3	ΑΚ&ΥΑΚΚΒΚ&ΥΑΚ&ΆΕΚΑΑΚΚΑΕΑ^ 1
	KAEAAKAAAKEAAYEA 1
TV-66	4	AKKYAKKEKAYAKAJKKAEAKAAKKAKAEAKKYAKAAKAEK- j
		KEYA MEAOKAEAAKAMKEAAYEA |
TV-77	5	AKEYAKKEKAYAKKÁEKAAKKAEAKAY’KAAEAKKKAKAEA- Í
		KKYAKAAKAEKKEYAAAEAEYKAEAAKMAKEAAYEA )
I TV-86	6	AKKYAKKEEAYAKKAEKAAKKAEAKAYKAAEÁKKKAKAEA- j EAAYEA !
1 TV-109 }	í	. . . ............................... ............... 1 KAKAEAKKYAKEAAKAKKEAYKAEAitEYAKAAKAEKKEYA- i
	| AAEÁKKAEAAKAYEAEAAKÁAAKEAAYEA

A találmány egy más kiviteli alakjában molekulatömeg kalibráló standardok sorozatát ismerteti glatiramer-acetát vagy egy terpolimer molekulatömegének meghatározására molekulatömeg szerinti elválasztó oszlopon. A molekulatömeg kalibráló standardok sorozata polipeptidekből áll A kalibráló standardok állhatnak 2~töl körülbelül 10 vagy több kalibráló standardboL Egy előnyös kiviteli alakban a kalibráló standardok száma

40000 halton molekulatömeggel és meghatározott aminosav jft_X 4b • W -·,*'-*· * ♦ * * 9 9 « « » « * ·* * * * * * » *·') o « « ♦ » * *# *

A * v * « ♦ * * * *

Vitt «4 fc* ♦ *» **· 4* összetétellel rendelkezik, amely közelítőleg megfelel a giatiramer-aeetát vagy a terpollmer összetételének.

Amikor ilyen molekulatömeg kalibráló standardok sorozatát alkalmazzuk a glatiramer-acetát vagy a terpoismer · molekulatömegének meghatározására standardként, közelítőleg lineáris kapcsolat van a molekulatömeg kalibráló .standardok retenclós ideje a kromatográfiás oszlopon és a molekulatömeg logaritmusa között. Annyi kalibrációs standardot alkalmazunk, amely elegendő a közelítőleg lineáris kapcsolat biztosításához, bár ennél több alkalmazható. A 3. ábra a közelítőleg lineáris kapcsolatot mutatja a relatív retenclós idő és a molekulatömeg logaritmusa között a találmány szerinti TV-kaíibrációs standardok esetében.

Más kiviteli alakban közelítőleg lineáris kapcsolat van a molekulatömeg kalibráló standardok moláris ellíptícitása és a kalibráló standardok molekulatömege között. Amikor a glatiramer~acetát preparátum molekulatömegét moláris ehipticitássai határozzuk meg, annyi kalibráló standardot alkalmazunk, amely elegendő a közelítőleg lineáris kapcsolat biztosításához, bár ennél több alkalmazható. A. glalíramer-aeetát vsgy terpollmer preparátumra a lineáris kapcsolaton alapuló molekulatömeget kapunk. A 2. ábra a találmány szerinti TV-kaíibrációs standardokra a moláris elíípticiíás és a molekulatömeg közötti közelítőleg lineáris kapcsolatot mutatja.

A találmány szerinti gyógyászati készítmények. A GLAT-kopolimernek összetételében megfelelő, találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok optimális esetben biológiai hatással rendelkeznek és a GLAT-kopollmerrel azonos módon alkalmazhatók betegségek kezelésére. A biológiai hatás23 sál rendelkező TV-kaíibrációs standardokra váltakozva gyógyászati kalibráló standardként hivatkozunk. Például a GLAT-kopollmer alkalmas emberekben sclerosls multiplex (MS) kezelésére és egerekben kísérleti allergiás encephaiomyelitis (EAE) blokkolására. A GLAT-kopolimornek megfelelő, találmány szerinti, meghatározott molekulatömeggel és amínosav összetétellel rendelkező polípebtldekröl ezúton kimutatjuk, hoov hatásosak aoér modellben és a GLAT-kopollmeréhez hasonló immunológiai tulajdonságokat mutatnak. Azok a monoklón antitestek, amelyek GLAT-kopollmerhez kötődnek, TV-kalibráoiós standardokhoz ís kötődnek. Továbbá bizonyos T-sejteket, amelyeket a GLAT-kopolímer serkent, a találmány szerinti molekulatömeg, kalibráló standardok is serkentik.

Hasonlóan a megbatározott molekulatömeggel rendelkező és a gyógyászatilag alkalmazható terpoltmernek megfelelő aminosav összetételiéi rendelkező polipeptid optimális esetében gyógyászatilag alkalmazható. Általában egy biológiailag aktív kopolimernek összetételében megfelelő polipeptid molekulatömeg kalibráló standardok optimális esetben hasonló biológia; hatással rendelkeznek,

A találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekké szerelhetők ki. A jelen leírásban alkalmazva a ''gyógyászatilag elfogadható hordozó¹¹ jelentése magában foglalja az összes oldószert, diszperziós közeget, bevonatot, baktériumellenes és gombaölő szert, Izofon és felszívódást késleltető szert, édesítőszert és más ezekhez hasonlókat. A gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok sokféle anyagból eiőállithatök, ideértve az illatsnyagokat, édesítőszereket és egyéb anyagokat, igy például puffereket és abszorbenseket, amelyek szükségesek lehetnek meghatározott gyógyászati készítmény eiöáiliiásához, az anyagok köre nem korlátozódik azonban ezekre. Az ilyen közegek es szerek alkalmazása a gyogyászatliag hatásos anyagokkal a szakterületen ismeretes. Kivéve, ha bármely hagyományos közeg vagy szer összeférhetetlen a hatóanyaggal, annak alkalmazása a gyógyászati készítményekben nem tartozik a találmány körébe. Kiegészítő hatóanyagok szintén a készítményekbe foglalhatók. A találmány szerinti készítmények kiszerelhetek injektálható oldatként vagy szus2'pen.z^:ióként, spray-oldalként vagy szuszpenzíőként.

A gyógyászati készítmények a találmány szerinti egy vagy több molekulatömeg kalibráló standard egy mennyiségét tartalmazzák. Előnyösen a molekulatömeg kalibráló standardok lényegében a. tirozin, az alanin, a glutamlnsav és a hzln nevű aminosavak közöl mind a négyből vagy három aminosavból állnak meghatározott móltörttel. Az aminosavak móltörtjei a fentiek szerintiek.

Egy kiviteli alakban a gyógyászati készítmény moiekuíatömeg kalibráló standardjai képesek egy ll-osztályú MHCproteinhez való kötődésre, amely előnyösen egy autoimmun, betegséggel függ össze. A. ll-osztályú MHC-proteín körülbelül egyenlő mérető a és β alegységekből áh, amelyek közül mindkettő transzmembrán protein. Egy peptid kötözseb képződik az. a és a β alegységek amino-végi részel által. Ennél a peptid kötozsebnél történik az antigén bemutatása a T-sejteknek. Legalább bárom típusú ll-osztályú MHC molekula van; a HLA-DR, a • κ««« »»»« ♦* «♦ ** * Μ » * * * ♦ « Λ < * ♦ « ♦ ♦

HLA-DQ és a HLA-DP molekulák. Számos alléi Is van, amely ezen HLA-molekulák minden típusait kódolja. A ll-oszlályű MHC molekulák túlnyomó; többségben B-iimfocíták és antigén bemutató sejtek, Így például roakrofágok felületen expresszálódnak. Bármely megfelelő eljárás alkalmazható annak megállapítására, hogy a molekulatömeg kalibráló standard egy vagy több li-osztályú MHC-protelnhez kötodrk-s. Például a polipeptid radioaktív jelzéssel látható el vagy bioiíoilezhető, keverhető nyers vagy tiszta ll-oszfáiyú MHC-protein preparátummal és a kötés detektálható a jelző (reporter) molekulának a II-osztályú MHC-protefnhez való tapadása által a nem kötött polipeptid eltávolítása után.

Egy másik kiviteli alakban a molekulatömeg kalibráló standardok képesek a sclerosis multiplex-szel összefüggő H-osztályú MHC-protelnhez való kötődésre. A szóban forgó kiviteli alak szerinti polipeptid a sclerosis multiplex-szel összefüggő II-osztályú MKC-protein antigén kötőhelyéhez azonos vagy nagyobb affinitással rendelkezhet, mint a kopolimer-1. Ezáltal a találmány szerinti polipeptid gátolhatja a megkötést vagy leszoríthatja a mielin autó-antigének kötését a ll-osztályú MHC-proteinröl, A sclerosis multiplex-szel összefüggő egy li-osztályú MiHC-protein a HLA-0R4 (DRBV1501

Más kiviteli alakban a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok képesek arthritised állapottal, például rheumatoid artrí ti sszel vagy csont-izületi gyulladással összefüggő ll-osztályú MHC-proleinhez való kötődésre. Ennek megfelelően a szóban forgó kiviteli alak szerinti polipeptid az autoimmun betegséggel összefüggő ll-osztályú MHC-protein antigén t«* ♦♦♦» ♦* ♦♦ »* ** 'kötőhelyéhez nagyobb affinitással rendelkezhet, mint a H-tlpusü kollagén 261-273 pepiid. Ezáltal a találmány szerinti polípeptid a il-típusü kollagén 261-273 pepiid kötését gátolhatja,, vagy a szóban forgó pepiidet leszoríthatja a ll-osztályu MHC-protein m kötőhely érői.

A találmány szerinti gyógyászati eljárások. A találmány továbbá eljárásokat ismertet immunbetegségek kezelésére és megelőzésére emlősökben, amelyek szerint a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardot tartalmazó készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségét adagoljuk.

A találmány szerinti autoimmun betegségek közé tartoznak mind sejt-szabályozott betegségek (például 7-sejt), mind antitest-szabályozott (például B-sejt) rendellenességek. Ilyen rendellenességek lehetnek többek között arthritiséé állapotok, demiehnezési betegségek és gyulladásos betegségek. Például a találmány szerinti pollpeptidekkei kezelhető autoimmun betegségek közé tartozik a solerosis multiplex (MS), a rheumatoid arthritis (RA), a csont-izületi gyulladás, az autoimmun haemoiiíikus vérszegénység, az autoimmun petefészek gyulladás, az autoimmun palzsmirigy-gyuhadás, az autoimmun uveoretinifis. a Crohn-féle betegség, a krónikus Immun trombooltopenikus vőrheny, a vestagbélgyulladás, az érintés érzékenységi betegség, a dlabetes mellhús, a Graves-féle betegség, a GulUaln-Barre-féle tünetcsoport, a Hashimoío-féle betegség, sz idiopathiás mixöóéma, a myesíherna gravls (izomgyengeség), a pikkelysömör, a közönséges bőrhöiyagosodás (pemphigus vulgáris) vagy az általános lupus erythematosus. A találmány szerinti készítmények * X ♦ Φ ««»’( A * * ♦ ** « ♦ ♦ ♦ «6 *' ♦ * > χ * * * *» _ν χ « Φ » * '♦ * X ¢4 φφ *ΦΦ ♦♦ *♦ '7 alkalmazhatók a szóban forgó betegségek közül egy vagy több kezelésére.

Az arthritises állapot kifejezés jelentése a jelen leírásban alkalmazva olyan állapot, ahol a rheumatoid arthritis legalább egy tünete tapasztalható egy emlős legalább egy ízületében, például váííban, térdben, csípőben, hátcsontban vagy az emlős egy ujlán, Az arthritises állapotok közé tartozik a poliartbriősö amely olyan arthritises állapot, amely több mint egy ízületet érint, a serdülőkori (jővénHis)· arthritis, emberek arthritises állapota 21. életév alatt, a Felly~féle tünetcsoport, amely magában foglalhatja a neutropénía, a spienomegália (lép nagyot bőd ás), a fogyás, .a vérszegénység, a nyirokcsomó duzzanat (lympbadenopáthia) és a bőrön pigment foltok tüneteit.

A jelen találmány szerinti immun-közvetített betegségek egy vagy több antigénre valö nemkívánatos immun hiperérzékenységgei jellemezhetők, és ezek közé tartoznak a gazda-béülfetett-szovet-fípusú betegségek (HVGDj és a beülteieft-szövetgazda-típusú betegségek (GVHDj, amelyekre példa sorrendben a gazda immunrendszere által a beültetett szövet kilökése és a donor-T sejtek gazda elleni támadása, Ezek a betegségek jelentős akadályt képeznek az átültetési (transzplantációs) rendszerekhez, igy például szervátültetésekhez és csontvelő újraképzéshez. Más találmány szerinti Immun-közvetített betegségek közé tartoznak a késleltetett típusú hiperérzékenység (DTK)·, amely kontakt antigénekkel, így például szömörcével és mérges szömörcével (Rhus-íoxlcodendron), számos kémiai anyaggal és tüdővésszel (tuberkulózis), leprával, leishmaniasis-szal, mély gombafertőzéssel stb. függ össze.

ΦΦ

- 28 Egy kiviteli alakban bármely autoimmun betegség kezelhető a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardokkal, amennyiben a szóban forgó kalibráló standard olyan il-osztáiyú MHC-proteinhez kötődik, amely az autoimmun betegséggel őszszeíügg, A szóban forgó kiviteli alak egy formája eljárást ismertet, amely szerint kiválasztunk egy olyan molekulatömeg kalibráló standardot_: amely gátolja egy antigén pepiid H-osztályú MHC-proteinhez való kötődését (például olyan eljárást, amely szerint olyan molekulatömeg kalibráló standardot választunk továbbá, amely gátolja a II-osztályú specifikus T-sejt válaszokat ii-osztályú MHC-protein-pepiití-komplexhez) és eljárást, ahol az antigén peptid az autoimmun betegséggel összefügg; a találmány más kiviteli alakjában eljárást ismertet, ahol a H-osztáiyú MKC-protein egy atuolmmun betegséggel függ össze.

Egy más kiviteli alakban egy emlősben autoimmun betegség kezelésére Irányuló eljárás során gátoljuk azon T-sejtek szaporodását vagy működését, amelyek felelősek az antigénért. Az RA egy T sejt-közvetített autoimmun betegség, amely a találmány szerinti polipeptidekkel kezelhető. Az autoimmun betegségek kóros folyamatait és az immun kilökést T-sejtek szabályozzák. Az antigénhez kötődés után és annak felismerését kővetően a T-sejtek szaporodnak, citokmeket választanak ki és további gyulladásos és citotoxikus sejteket gyűjtenek a helyre. A találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok megakadályozzák a T-sejtek szaporodását és a T-sejtek olyan funkcióit, mint a citokín kiválasztás és a gyulladásos és citotoxikus sejtek az adott helyre való gyűjtése. Amikor az autoimmun betegség arthritise» állapot, az autoantlgén lehet kollagén és a találmány « *

Φ *' ♦ * ♦ * ♦ X »X X ♦

Φ * «χ <6 ♦ *

X « « x »y» ** szerinti molekulatömeg kalibráló standardok gátolhatják a kollagénre reagáló T-sejtek szaporodását és működését.

kiviteli alakban emlős autoimmun betegségek kezeiésere szolgáló eljárás szerint a molekulatömeg kalibráló: standardot egy antigén bemutató sejthez, Így például m.akrofághoz, .dendrites sejthez vagy limíoid szövethez vagy hámsejthez kötjük. A T-sejtek szaporodása és működése aktiválódik, amikor egy megfelelő antigént mutatnak be azoknak. Az antigén bemutató sejthez való kötéssel a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok gátolhatják vagy egyébként befolyásolhatják a T-sejt aktiválódást.

Egy másik kiviteli alakban az emlős autoimmun betegsége kezelésére szolgáló eljárás szerint a molekulatömeg kalibráló standardot egy olyan il-osztályú protein., nagyméretű hisztokompatlbllitás komplexhez kötjük, amely az autoimmun betegség Összefügg. A il-osztályú MHC-proteinek túlnyomó részben a B-limfocíták és az antigén bemutató sejtek, így például makrofágok felületén expresszálódnak. Ezek a Il-osztályú MHCproteinek peptid-kőtő zsebbel rendelkeznek, amely az a hely, ahol az antigén peptideket a ϊ-sejteknek bemutatják. Amikor a találmány szerinti pohpeptidek egy Il-osztályú nagyméretű hísztokompafíbiliiás proteinhez kötődnek, a szóban forgó poíipepfídek blokkolhatják vagy egyébként befolyásolhatják az antigén bemutatást és/vagy a T-sejt aktiválást.

Egy másik kiviteli alakban egy emlősben autoimmun betegség kezelésére szolgáló· eljárás szerint a molekulatömeg kalibráló standardot kopollmer-1 -reaktív B-sejt antitestekhez és/vagy kopoiimer-1 -reaktív T-sejtekhez kötjük. A kopolimer-1 -reaktív <· >««« ν* φ * «« *y > φ Λ χ φ « » ♦ ♦ ♦ » > > φ φ· φ ♦ φ* « ο φ * > φ ♦ * · * * * »4 «φ *« **:♦ »* ♦♦ ·*♦♦

Τ«.2/3 T-sejtek a kopoilmer-1^: gyógyászati hatását fokozzák. A k-opohme-f-l-reaktív T-sejtek megkötésekor a találmány -szerinti moiekulatömeg kalibráló standardok serkentik a szóban forgó T-sejtsk szaporodását, gyulladásellenes citoklnek kiválasztását és növelik a találmány szerinti eljárások által megvalósított kezelés gyógyászati előnyeit. A találmány szerint a molekulatömeg' kalibráló standardok aütoantigén-reaktlv antitestekhez is kötődnek, amely blokkolhatja az antitestet a oéiszovet megtámadásában, ezáltal segítve az autoimmun betegség kifejlődésének megakadályozását.

A találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardokat adagolhatjuk bármely megfelelő módón. Egy kiviteli alakban a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardokat adagolhatjuk injekcióval az autoimmun betegséggel érintett szövetekhez való eljuttatás elősegítése érdekében. Ezáltal a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok lehetnek például injekciós adagolásnak, a tápcsatornából felszívódok, belégzéses vagy helyi alkalmazásiak. A találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standardok kiszereíhetök krém, oldat vagy szuszpenzíó formájában helyi adagolásra. A molekulatömeg kalibráló -standardok előnyösen orális, helyi vagy adjuvans hozzáadása nélküli, injekciós adagolásnak.

A találmány szerint alkalmazható készlet (kit). A találmány egy kiviteli alakjában egy készletet ismertetünk egy analizálandó anyagnak agy MHC-proteinhez való kötésének vizsgálatára, a szóban forgó készlet vizoldékony MHC-profelnt, például egy nem emlős sejtben rekombínáns módon előállított MHC-protemt és az MHC-proíemen kötött analizálandó anvaq detektálására φ* * * * φ φ * <t > * ♦ *φ eszközt, valamint használati utasítást tartalmaz. A készletben alkalmazott MHC-protein egy H-osztályú MHC-protein, amely tehet H-oszíályü MHC HLA-0R1. protein, 11 -osztályú MHC HLA-DR2 protein vagy li-osztályú MHC HLA-DR4- protein. A készlet tartalmazhat továbbá egy autoantigén peptidet. A találmány szerinti készlet alkalmazható például a találmány szerinti molekulatömeg kalibráló standard li~osztáiyú MHC-proteinhez való kötődésének vizsgálatára vagy egy autoantigén peptid MHC-kötésének gátlására.

Egy előnyös kiviteli alakban a ll~oszíályú MHG-proteint egy gerinctelen állatban vagy egy mikroba sejtben állítjuk elő, így például egy rovarsejtben vagy élesztőseitben, ezért az mentes az antigén kötözseben kötött pepiidtől. Az analizálandó anyagnak az MHC-proieinhez való kötődésének detektálására szolgáló eszköz lehet a szakterületen Ismert bármely radioaktív, fluorímetriás, kemfiumineszeenciás, enzimatikus vagy kolorímetrrás eszköz. Egy előnyös kiviteli alakban az MHC-proíein lí-osziályű HLA-DR1 vagy HLA-DR4 protein. Az előnyös autoantigén pepiidre példák a kollagén-li-peptid, mielín alapú proteinből származó peptid, mseim oiigodendrit protein vagy más. egy autoimmun betegségben lévő proteinből származó pepiid.

A kővetkező k a találmányt részletesen ismertetik, bemutatva, annak bizonyos specifikus, jellegzetes kiviteli alakjai hogyan állíthatok elő; az anyagok, a készülék és az eljárási lépések kizárólag szemléltető példákként értendők. Közelebbről, a találmány nem értelmezendő az itt ismertetett eljárá< ν ★ φ φ « * φ sokra, anyagokra,, körülményekre, eljárási paraméterekre, készülékre és más ezekhez hasonloakra korlátozva.

A jelen szabadalmi bejelentésben különböző publikációkra, szabadalmakra és szabadalmi bejelentésekre hivatkozunk. A találmányhoz tartozó technika állása teljesebb ismertetése érdekében a szóban forgó publikációk, szabadalmak és szabadalmi bejelentések tartalmára teljes egészében referenciaként hivatkozunk a jelen szabadalmi bejelentésben.

Nyilvánvaló és elvárható·, hogy az itt ismertetett találmány élelmétől való eltérések a szakember által megvalósíthatók. Az ilyen módosítások a találmány körébe tartozónak tekintendők.

A következő példák a találmányt tovább szemléltetik.

1.

A TV-kahbrációs

Szilárdfázisú szintézis

Prof, M. Frldkln (Weízmann Institute of Science) laboratóriumában hét, körülbelül 3700-12000 dalion moiekulatömegü molekulatömeg kalibráló standardot állítunk eló 12. táblázat). Ezeket a kalibráló standardokat TV-kabbráeiös standardoknak nevezzük. Az egyes peptldeket TV-## néven nevezzük, ahol a á# jelentése az aminosav egységek száma (például a TV-35 jelentése 35 egységből álló kalibráló standard). A szóban forgó kalibráló standardok aminosav összetétele megfelelő a gl.atiram.er~ acetát leírásoknak (2 táblázat).

♦ # > Jf ♦ £♦♦ * #» »* ♦♦ *κ * > * * « xx *»

2, táblázat

TV-66 - 7040 Dalion molekulatömegű ©estid

egysegex szama

Mbítört

TV-77 - 3259 Dalion molekulatömegű pepiid

1	Alá ,	Giu i	Tyr	: ! Lys |
{ * ;Az egységek	száma		5 33 1	11 j	•7 i	26 |
| Móltöri			0,429 1 C	),143 !	0,09.1	ΰ.338 Ι
TV -86 - 9220	Dalion molek	jlatör	neoü pepL	ő
			Alá j	Giu J	Tyr	> Lys j
ÍAz egységek	száma		Z7 1 ..........9,3.......ü ...	12 f:	3	} I 29 |
1 Móltört			0,430 ) í	>,140 |	0,093	0,337 J

ψ #fc«« ««»* 9® á* ** *♦ * * * X * * ♦ «fc* » * * * fc * * Nft·* * »♦··♦< X * * * * ♦ * frfcfc fc-x «» ♦*> ** *♦ ♦♦··**

	j Ala ί	Glu	i Tyr	Lys
Az egységek száma	! 46 |	-s n	I 1 -ι n	< CÜ O:
Mól tört	í............ r i 0,422 1	0,138	I 0,09,2	n *' * r· : v f <3 b

Az la., 1b.., 1c. és 1d. ábrák sorrendben az alanin, a llzin, a glutamínsav és a tirozín megoszlását mutatják a 2. táblázatban ismertetett TV-kehőráciős standardokban. Az aminosav pozíciót az X-tengelyen jelöljük úgy, hogy az. első aminosav a C-lán.cvégt helyzetnek felel meg. Az aminosav jelenlétét a jelzett aminosav pozícióban függőleges sáv jelzi.

Á tömeg és a szekvencia hitelesítése

Polípeptid mintákét elemzőnk közvetlenül azok előállítása után, elektron spray ionforrással felszerelt VG-platform tömegspektrofotométer alkalmazásával. Néhány hónappal később az analízist TEVA-nál megismételjük elektron spray ionforrással felszerelt PE-Sclex API300 tömegspektrofotométer alkalmazásával (3. táblázat,, első preparátum). Ezek az eredmények jelzik, hogy minden egyes polípeptid TV-kallbráciös standard· egy, cél szerinti molekulatömeggel rendelkező fő komponenssel rendelkezik.

♦ X ΦΦ χ φ φ * * * * ♦ Φ φ ΦΦ * * « X ♦ Φ *

ΦΧ ·'· φ X* ΦΦΧ* ♦ »<» ΧΦΦ* φ» » φ

3, táblázat

Meghatározott szskvenciájú polipeptidek tömegspektro&zkópiás elemzése

Polipeptid j Szándékolt j molekulatömeg 1 {dalion) 1	Meghatározott molekulatömeg - 1, preparátum (dalion)	Meghatározott 1 molekulatömeg - 2. preparátum (dalion)
TV-3 5	| 3757	3757	3757
TV-45	i j 4 790	479 0	4790 í
TV-5S	i 6008	6008	6008 |
TV-66	1 i 7040	7041	7040 I
TV-77	i 8259	8259	8259
TV-8 6	| 3220	9220	9220
TV-10 8 *	j 11727	11728	11727

* A	108 egységből álló poii	pepiidet fordított fá	zisú osziopo-n
való	frakcionaii'zálással tövéi	3b· tisztítjuk. Három	frakciót gyöj-
tünk,	és a 2. számú frakch	ót kalibráló célokra	kijelöljük, és
TV-1	08 jelzéssel látjuk el.

A kalibráló standardok egy második adagját állítjuk elő. A tömegspektroszkópía. Igazol polipeptidek azonosak az e

a. hooy a. második előállítás szerinti sö előállítás szerinti poiipepfidekkei (3. táblázat, m lóságot Superc Minden egyes ásodik előállítás). A két előállítás közötti hason>se~12 kromatográfiás eljárással Is megerősítjük, kalibráló standard különböző rétén dós időpontokban éles csúccsal eluál, tekintet nélkül az elemzett adagra *♦ ♦♦ ** > · * > φ * * ♦ * *

χ. < * Φ tr Λτ» *

«. ♦ X ♦ * * » ♦ * ♦ «« ♦» *♦» ** *Χ ****

Ennélfogva a találmány szerinti TV-kaiibrácsós standardok reprodukálható tömegben állíthatók elő.

Edman lebontás

A pohpepíidek szándékolt szekvenciáját az első előállítás Edman-lebontásl elemzésével erősítjük meq.

dikroízmus

A molekulatömeg kalibráló standardok ás a glatiramer-acélát között? szerkezei? hasonlóság előfeltétele a molekula méret szerinti elválasztó oszlop megfelelő kalibrációjának. A polipeptid szerkezetben lévő különbségek különböző hidrodinamikai méretet és ebből következően a kromatográfiás rendszerben módosult retenclős Időt eredményezhetnek. A cirkuláris dikroizmussa! meghatározott eüiptieítss a polipeptid másodlagos szerkezeiének méréséül szolgál. Amikor a molekulatömeg kalibráló standardok és a gíatiramer-aeeíát eHipíícííása hasonló, a két vegyűlet szerkezete hasonló.

A posspeptidek moláris eííipíícstésát Jofoin-Yvon CD spektrofotométerrel határozzuk meg. A 2. ábra és a 4. táblázat megmutatja, hogy a moláris ellíptlcitás kiterjedése a polipeptid molekulatömegével összefügg, A_: legrövidebb pepiid a legalacsonyabb ellíptíeitás értéket mutatja. Az új kalibráló standardok moláris eiiípticilása azonos nagyságrendű a jelenleg alkalmazott gíatiramer-aeeíát molekulatömeg kalibráló standardokéval, Megjegyezzük, hogy mig a TV-kalsbrációs standardok pontos molekulatömegét pontsorral ábrázoljuk, a glatlramer-acetát szám szerint? átlagos molekulatömegét a pontsorban alkalmazzuk.

♦ X **

Χι ♦ φ X » * ♦♦ ' * ♦ * ♦

X X«0«* *·»>> ** »4 χ

* »·

Ezáltal az új kalibráló standardok és a glatlramer-acetát hasonló szerkezettel rendelkezik és ennélfogva a kalibráló standardok alkalmasak molekulatömeg kalibráló standardokként a glatiramer-acetát új preparátumaihoz.

4. táblázat

Molekuláris elL’ptieitás

Molekulatömeg ka-	Molekulatömeg	Molekuláris
llforálő standard	{dalion)	elliptseltás (210 nm)
TV-kalibrálö standardok
TV-3-5	3757	-1,5367
TV-4 5	47 90	-2,1651
TV-δ 6	8008	-3,9658
TV-88	7040	•3,5172
TV-77	8259	-4,8365
TV-88	9220	-6,4546
TV-10 9	11727	-8,818
giat íra mer- acetát
SD 743	3 7 GO	-2,0186
BD 714	5600	-4,41 82
SD 681	6600	-5,2019
BD 677	7000	-6,0153
588 95	8000	-6,9062
909 95	8500	-9,1736
BD 655	8900	-3,8576

«*' * * ♦ A X * »**♦ *·» φ Ϋ «, φ « « » *

Λ Λ ♦ ♦ * ♦♦ >** κ« «* ♦ *»*

Ezek az analitikai adatok jelzik, hogy a szintetizált TVkalibrációs standard polipeptidek jelentős fokú hasonlóságot mutatnak a jelenleg alkalmazott glatiramer-ace-tát molekulatömeg kalibráló standardokhoz. Az aminosav-tartaiom a glatiramer-acetátén belül van. Az új polipeptidek és a giatiramer-acetát molekulatömeg kalibráló standardok hasonló, moláris eillpticltásként kifejezett másodlagos szerkezettel rendelkeznek. Ennélfogva a TV-kalibrációs standardoknak olyan módon kell vándorolni vagy eioálnl gélpermeáclós kromatográfiás (GPC) rendszerben, Így például Superose-12 rendszerben, mint a glatiramer-acetéi preparátum..

Superose-12 oszlop kalibráció TV-kaSIferációs standardokkal

A TV-kalibrációs standardoknak és a giatiramer-acetát preparátumnak a relatív retenciós idő (RRT) és a molekulatömeg logaritmusa között hasonló összefüggést kell mutatniuk. A TVkalibrációs standardokat több Superose-12 oszlopon kromatografáljuk. A csúcs retenciós Időt minden egyes pohpeptídre rögzítjük, A molekulatömeg logaritmusa (MW) és a relatív retenciós idő (RRT) közötti lineáris összefüggést a következők szerint számítjuk:

RRT ~ BI + 82 x logMW (lásd; 3a. ábra és 5. táblázat)

A most bevezetett Miiienium-alapú adatszerzési rendszer (Waters Corp.,, Míiford, MA) GPC-oszlopokra integrált kalibrációt biztosit. A kalibráció az algoritmusra a retenciós időn alapul, és a következő egyenlettel adható meg:

Χ-Μ

Φ φφΧ* **<» * * - ΦΦ ν Φ «· » β » ♦ * * * φ φ χ ♦ φ Φ ♦♦ φ

X χ. φ Φ φ * ♦ ♦ * * ·

ΦΦ^ Φφ »** ΦΦ «* ·**♦

LogMW - Α ·* Β χ RT vagy :MW = 1.0^{Α * ^SxRT·⁵ ahol MW jelentése a molekulatömeg, RT jelentése a retenciös Idő, A és 8 jelentése sorrendben a számított regressziós függvény tengelymetszete és meredeksége (3b. ábra, 5. táblázat:).

Ezzel az algoritmussal kapott eredmények gyakorlatilag azonosak azokkal, amelyeket az. RRT-n alapuló, jelenleg alkalmazott algoritmussal kapunk. Az eljárások automatizálása érdekében a Mfilenium-alapú adatszerzési rendszert alkalmazzuk a TV-kailbráolós standardok felhasználásával a kalibráció végrehajtására. .Az. elemzési eljárásokat ennek megfelelően korszerűsítjük.

A. lóg MW és RRT között jó korrelációt (Ή > ö.SS) kapunk, bár a pontok nem egyenletesen oszlanak meg a regressziós vonal kórul. Ez az eloszlás megfelel a különböző kalibráló standardok elhpticitásában tapasztalható különbségeknek, amint az a gialirarner-acetátra is tapasztalható. A bizonyos unearitástöl eltérő alacsony molekulatömeg kalibráló standard nem zárható ki, mert a regressziónak lefelé 2500 daltonlg magában keli foglalnia értékeket az első standard deviáció (+ ISO) disztribúciós paraméterhez. Ez egy általános jellemzője minden rövidebb pepiidnek - ezek kevésbé spirálisak, és Inkább lineárisak.

A glatlramer-acetát molekulatömeg kalibráló standardokon alapuló kalibrációhoz a tengelymetszet (81) és a meredekség (82) sorrendben 1,7415 és -0,2784. Ez kedvezően viszonyul a TV-kalibrációs standardokra kapott kalibráló értékekhez (81 = 1,6998; 82 ~ -0,2705). A két kalibráló sorozatot alkalmazva kapott molekulatömegek a specifikációs tartományban tipikusan nem több, mint 20 %-kal térnek el az alacsony molekulatömeg « ♦ *.«# #» -* ** ^*** 94 „ * * * * « Λ « * * * ** » 4 Φ Λ « * * * * Φ ♦** *# *♦ ΦΦ» Φ* ** tartományban és nem több, mint 12 %-kai a csúcs RRT-specifikácíős tartományában (átlagos molekulatömeg). Ezen viszonylag kis különbség: -következtében teljesül az igény,, hogy ezek a kalibráló' standardok helyettesíthessék a jelenleg alkalmazott glaílramer-acetát molekulatömeg kalibráló standardokat a molekulatömeg értékekben való jelentős változás nélkül.

Sa. táblázat

Glatiramer-acetát molekulatömeg kalibráló standardok általi kalibráció

Γ i .........	Molekula- tömeg logaritmusa	j Csúcs re | tendós id	- | RRT* i ö i | |
j Kalibrációs | standard	Molekula- ·: ί -
l TV-35	I 375?		3,575	i 28.9?	| 0,728 |
! TV-45	: 4790		3,88	1 27,96	i 0,703 ί
| TV-55	6003		3,779	i 27,12	—5-5 1 0,682 |
I 7V-88	7040	3,84 8	r j 28.32	1 0,662 1
i ’T'V 77	8259		3,917	”i-------- 1 25,56	1 0,843 ί
| TV-S6	9220	j	3,965	1 24,93	1 ! ΐ 0,627
| TV-109	11727		4,059	1 23,57	ί j í 0.593 1
S Tengely-	“ A	b	,2516	! H* BI 1,(	$996 j
1 metszet				I I .........................	|
I Meredekség	8	-0,0918	) 82 -0	2705 |
r2		0	0 097 v <	I Oh	$923 i

' RRT - RT/RT-aceton ** a Millennium-egyenlet szerint számítva; Iog MW = A+BxRT *** a következő egyenlet szerint számítva; RRT ~ B? * β₂ χ iog MW ♦ 9 ·»*φ« «C*** ί» $ ν χ «I ί ♦ «

Φ * » 9· ·>.• « ♦» . ♦*.. 9 ♦ « Κ · » ♦ 4 «9 » # ,* * φ * •φφ »« φ*ίί»

I V-kahhraeiös standardokon alapúid kalibrációt glaiiramer-acetát molekulatömeg: kalibráló standardokon alapuló kalibrációhoz hasonlítjuk (5b. táblázat). A két kalibrációt minden egyes kapó ráció sorozatra a 0,5-0 RRT tartományban a molekulatömeg számításával hasonlítjuk össze. A. TV-kalibráló standard kalibráló sorozat magában foglalja a TV-1Ö9 frakciót, amelyet az oszlop kalibráció előtt fordított fázisú kromatográfiás eljárással tisztítunk.

5b. táblázat

Oszlop kalibráció TV-kallbráciős standardokkal

RRT	RT* (perc) - !:	Glaíiramer- -acélát (molekula- tömeg <1)	TV (0,1) (molekula- temeg.rn)	Különbség (molekulatömeg, m- -molekulatömeg. 1 j ; ' í
	..	(Dalton)	(Dalton)	(Dalton) 1 %
η κ Ví V?	19,89	23300	26700	-2100 1 -7,3%
0.51	20,23	26500	i ! 24500 í -2000 j -7,5%
; 1 0,52 I 20,68 1 24400	7 9 £ λ n κ*» a»- v^ V» v	1 i -1800 j -7,4%

* * - * « « φ * « * «Φ ♦«* ♦ * <

»»

Φ #*

RRT	RT* (perc)	Glatkamer- -a cetét (mölekuSa- tömeg.1)	TV (0,1) (molekula- tömeg, m)	Különbség (molekula tömeg, m- -mcüekulatömeg.1) H
		(Dal tonj	(Dalion)	(Dal tón)	%
: 0,61	24,26	11800	1 0600	-1000	-8,7%
0,62	24,68	10700	9700	-1000	-9,3%
0,63	25,06	9800	9000	-800	-8,2%
0,64	25,45	9000	8200	-800	-8,9%
0,85	25,85	8300	7600	-700	-8,4%
0,85	26,25	7700	7000	-7 00	-9,1%
0,67	28,65	7100	6400	-700	-9,9%
0,68	27/04	8800	6900	-600	-9,2%
0,89	27,44	8000	5400	-600	-10,0%
0,70	27,84	5500	5000	-500	-9,1 %
0,71	28,24	5100	4600	-500	-9/8%
0,72	28,83	4700	4200	-500	-10,8% |
0,73	29.03	4300	3900	-400	-9,3% I
0,74	29,43	4 000	3600	-400	-10,0%
0,7 5	29,83	3800	3300	-300	! -8,3%
0,78	30.23	3400	3000	-400	-11.8% i
0,77	30.,82	3100	2 SOÖ	-300	-9,7%
0/78	31,02	2800	2500	-300	Í -10,7%:
0,.79	31,42	2800	2300	-300	[ -11,5%
0,80	31,82	2400	2100	-300	-12,5% i

» »»«» ««»♦ _e*«_{s #} ,♦», ,»♦,

Σ A $ * ·♦ » ·*♦ * » a ♦ * > * 9 > * · * „ _

g.^8 $x ΛΛ ·♦* ** >♦*«

A TV-kalibrációs standardok th A kalibráló standardok közöl hármat (TV-66, TV-?? és TV-36} fordított fázisú kromatográfiás eljárással tovább tisztítunk. Három_: frakciót: kapunk minden egyes kalibráló standardra.. A csúcs nagyobb részét tartalmazó középső frakciót Superose-12 rendszerben a frakclonálatian kalibráló standardokkal összehasonlítva kromatografáljuk (6. táblázat). TV-kalibrációs standardokat mérei-kromatografálunk tisztítás nélkül (szabályos) és fordított fázisú kromatográfiás tisztítás után (tisztított). A csúcs refenciős időket meghatározzuk és a különbségeket számítjuk. A csúcs refenciős Idő a tisztítás fokától független marad. Ezért a szintézis végterméke alkalmas pontos kalibrációra és különös tisztítás nem szükséoes.

8. táblázat

A tisztítás retencíós időre gyakorolt hatása

A mért értékek Összefüggései (kereszt-megerősítés)

Hat adag, 1893-ban és 1:994-ben gyártott giatiramer-acetátot TV-kalibrációs standardokkal kalibrált GPC alkalmazásával újra elemzőnk, Ezek átlagos molekulatömegét és molekulatömeg-eloszlását a kibocsátásukkor mért értékkel összeha1

ΦίΧί ♦ » « -«» » * «· * * *♦ #» «« « » ♦ * ♦ « « « * > χ « ♦ * ΧΜ * Ή s? ♦ ♦ ·· '* * * · *·*# £{4.44 *» *«« *♦ φφ soniitunk. Α 7. táblázat a molekulatömeg adatok összehasonlítását mutatja az elemzés eredet; tanúsítványával és TVkalibráelös standardokkal kalibrált Superose~12 oszlop alkalmazásával kapott molekulatömeg adatokkal. A mért értékekben lévő különbségek tipikusan kisebbek, mint 10 %.

7. táblázat

Molekulatömeg mégha iá rozásek ossz eh a se η 1I iá s a

i Cep.-I Pre-	i Molekula-	Molekula-	%-os i
1 parátum i s i		tömeg Millennium	tömeg CoA	eltérés i
I..........	átlag	10250	9900	-3,5 % Í
1 00193	- 1 SO	20950	<9100	-9,7 % j
l	+ 1 SD	51000 ...	4800	-6,3 % |
I }	átlag	670 Q	6550	-2,3 %
í 00594	- 1 SD	15700	151 öö	-4,0 % S
í	+ 1 SD	3600	340Ö	„a α 5/. VX > V
	átlag	9200	8600 j -7,0 %
00893	-1 SD	18500	17350 j -6,9 %
	+ 1 SD	4700	44 00	-6,8 %
	átlag	6100	8150	0,8 %
04194	- 1 SD	12600	12500	-0,8 %
	•í 1 SD	3200	3200	0,0 %
	átlag	8800	8300	-8,0 %
01793	·· 1 SD	isi 00	17300	-4,6 %
	+ 1 SD	5200	4750	-9,5 %
.........	átlag	8100	6300	2,4 %
05494	- 1 SD	1 7800	17450	-2,0 %
	+ 1 SD .............	4100	4100	0,0 %

Az „SD jelentése: átlagos eltérés

A kalibráló standardok stabilitása oldatban A TV-kalibrációs standardokat 24 óra alatt négy alkalommal krcmeíografáljuk. Minden kalibráló standardot szobahőmérsékleten oldatban tartunk, és 8 órás időközönként elemezzük. A 3. táblázat a 4 időpontban a TV-kallbrációs standardokra mért csúcs retenciós időt mutatja. 0,1 mg/ml koncentrációban a TVkalibrációs standardok oldatban legalább 24 óráig stabilak szobahőmérsékleten.

8. táblázat

A TV-kalibrációs standardok stabilitása oldatban szobahőmérsékleten

f I i	Csúcs retenciós idő (perc)	A«ag	t Eltérés 1 (RSD) j
TV-35	I 29.683	29,883	29.000	29,950	29,904	0,106 % |
TV-4 5	28,933	28,917	28,917	28,933	28,925 ;	0,032 %
-- TV-5 8	2 8.2 50	28.217	23,283	28.250	28,250	0,095 %
TV-86	27,400	27,350	27,433	27,4 33	27,404	0,143 % |
TV-7 7	26,750	26,700	26.750	26,783	26,746	0,128 %
' TV-86	26,117	26,100	26,150	26,150	26,129	0,095 %
TV- -lOSFr 11	24,763 |	24,850	24,683	24,850	24,642	0,189 %

A kalibráló standardok oldatait ezen kívül különböző tárolási körülmények között (2-8 X, -10-20 ’C azidda! vagy anélkül) legfeljebb 3,5 hónapig tároljuk. A TV-kallbrációs standardok fa* Λ Φ φ. ·φ· 9 « « ».·♦ φ *

Η » » Φ ♦ » Φ X Φ φ ♦ Φ Φ » ♦ φ

X _ΛΦ X Φ Φ Φ « χ Φ « > -^^5' Κ» *** ** ** ·»♦» gyászt ott oldat formájában legalább 3 hónapig tárolás-stabilak (9. táblázat). Óvatosságból a fagyasztott oldatokat 2 hónapig engedjük tárolni.

A iiöíHizált TV-katlbrácIós standardok legalább 2 évig stabilak a rendelkezésre álló stabilitási adatok szerint.

A TV-kalibrácIós sta biütása sékleten

- -20 ^CC hőmér-

A TV-kalibrácíós standardokat összesen 53 alkalommal, két laboratóriumban: elemeztük. Az adatok összegzését a 4. ábra és a 10. táblázat mutatja. Az egyes sorozatok között tapasztalható **· 42* » * » *««« «««φ.

» » * » ♦ -X » :· «β Φ * * ♦ χ· » « * « » » » χ « különbségek (4. ábra) inkább az oszlopok közötti különbségeket, mint a résztvevő la bóra-tőrt um..ok közötti különbségeket tükrözik. Ezt jelzi a 4. ábrán az egyes kísérletekre eltérő jelek alkalmazása.. A 10.. táblázatban a kalibráló állandókat 16 oszlopra Injektált 53 kalibráló sorozatból kapott adatokra a Millennium-egyenlet alkalmazásával számítjuk.

10. táblázat

A Plantex és az Ablc laboratóriumokban kapott kalibráló állandók

	Rsfencjős idő		Kstenciós idő
I Ksiife- ( ráió stsrs| dsrd Ϊ	Vc-isku- faíömeg	Középérték	Szórás (SD)	%-os eltérés	Perc	Vax.	Átlag - SD	Átlag* SD
j I I $ V-35	3757	2§,6S	0,463	1,6 %	28,85	30,35	23,30 :	31,08 j
TV-45	4 730	**·> <> Áö, ' d.	0,481	1,7 %:	2 7 SS	29.49 ί	27,28	30,16
7V-56 :	5096	27 99	0.52-6	1,9%.	27,08	28,7?	2646	29,55
TV-88	7Q40	27,19	0.526	1,3 %	26.26	27,96	25,61	28,77
TV-77	8259	26,49'	0,550	2,1 %	25,51	27,33	24,84	28,14
w-se	92.20	25,8-9·	0,556	2.1 %	24,89	26,72	; 24,22	27,56
TV-109	'1172? ί	24,SS	0,557	T* ‘2 Öó /0	23,5.3	25,41	22.3S	26.23
Teoqslymetszet (A;;	6,4706	0,1229	1,8%	6,2581	8,6500	6,1046	6,8366
Meredekség Γ3)	-9,0969	0,0032	-3,,3 %	-0,1014 ;	-9,0319	-0,1064	-0,0873
r	0,9901	0,0022	0,2 %	0,3368	0,9323	0,9335	0,9967

Az „SD jelentése; átlagos eltérés *

φ V Φ φ χ φ

Φ Φ Φ Φ Φ

X φ « » Φ «β ΦΦ «φφφ

Egy glatiramer-acetát preparátum molekulatömeg-eloszlása

Egy adag glatíramer-acefátra meghatározzuk a molekulatömeget (8N 90995), A 11. táblázat TV-kalrbráló standard-kallbráit oszlopon, 16 meghatározásból kapott adatokat összegzi.

11a, táblázat

A gSatíramer-acetát retenciós Idői (SN 90995)

11b. táblázat

A glatiramer-acetát RRT-értéke (BN9099S)

	Átlag	(SD)	I %-os eltérés i [ (RSD) |
I Csúcs	0,654	0,014	| 2,09 |
I -2SD (2,5 %)	0,503	0,016	I j f 3,09 f
-ISO (16 %)	0,572	0,015	t : I 2,54 |
| +1SD (34 %)	0,7 33	0,011	| 1,53

Az „SD Jelentése; szórás « * φ V X * φ · φ

*« φ

X ΦΦ φ * **

Φ X Φ « φφ φφ

11c. táblázat Á giatlramer-acefát molekulatöme<

j Átlag |	(SD)	i %-os eltérés | (RSD)
Csúcs i	7459 |	146	I I 1.95
-ISO (16%) f	16622 |	466	~Ί :- | 2.60
+ 1SD (84 %) j	4089 I	77	1 .......................... I 1,39

Az „SD” jelentése: szórás

A molekulatömeg- és •szekvencía-meghatá.rozott kalibráló standardok sorozatának alkalmazása a Saperose-12 oszlop 'kalibrálására számos előnnyel jár a jelenleg alkalmazott glatiramer-acetát molekulatömeg kalibráló standardokkal szemElőszőr a szilárdíázisú szintézis biztosítja minden egyes különböző preparátuméinak állandóságát. Tömegspektroszkópiás eredmények (3. táblázat) megerősítették a szintézis reprodukálhatóságát. Az állandóság biztosítja a molekulatömeg meghatározások megnövekede11 pontosságát..

Másodszor, a jelenlegi kalibráció minden egyes glatiramer-acetát molekulatömeg kalibráló: standard görbe alatti területének 50 %-ánál az RRT meghatározásán alapul. Az űj kalibráló standardok éles csúcsokként elválnak. Azok alkalmazása a kalibrációban pontosabb, mint egy széles csúcs alatti terület 50 %-ánál a számított retenciós idő.

Harmadszor, előre meghatározott szekvencia által definiált molekulatömeggel rendelkező kalibráló standardok alkalmazása előre kizár minden bizonytalanságot, amely a fizikai tulajdonsá&

Λ.

» «Φ«» »» y v ν» * X «« ♦ « ·* -« Μ · . * · ♦ Φ Φ *

Κ· χ < Φ X φ. φ φ φ.

♦ ♦«, ,4» * ♦ * Φ * » * * ^,Φ * *>:<)· * Χ * * ♦ ♦♦ > » *»·*·♦ gok pontatlan mérésvet meghatározott molekulatömegö kalibráló standardok alkalmazását kísérheti..

no rma h kül az gyedszer a kalibráló eljárás megkönnyíti az oszlopok Izálásáf molekulatömeg meghatározásokhoz., tekintet nél.oszlop-töltések időpontja, kor vagy műszerezettség közötti kisebb változásokra.

A TV-kalSbrációs standardok biológiai aktivitása

A TV-kahferáoiós standardok reaktivitása monokión antitestekkel Cep~1~hez

A 12. táblázat anti-Cop-1 monoklón antitestek TVkalibrációs standardokhoz valő kötődését mutatja, A TVkaííbráctós standardokat és referencia Glat-elcáliitási adagokat tesztelünk. Mrkrotitrálő egységeket 2 pg/ml antigénnel vonunk be. Az értékek a monoklőn antitestekhez kötőit ^Ufei-jelzett kecske anti-egér IgG percenkénti beütéseinek számával (cpm) vannak megadva. Minden egyes TV-kalibrálo standardhoz az antitest: kötődést a Cop-1 referencia standardhoz való antitest kötő déssei hasonlítunk össze.

# *»»X ♦ ♦♦X ·» v V* «« ««

9 » Φ « X ♦ X 9 9 >

* » 9 9 * # *« χ.

« X.. ♦ » « Φ > « X ‘ · **♦ ^*1 *** ♦** ** ** **♦*

12. táblázat

TV-kalibrációs standardok és Cop~1 reaktivitása mÁbk-ke íevono antiqe

Az mAfe kötődése cpm (%-es Cop-1 kötődés;

ΐ antí-Cop-1 j antí-Cop-1 s antl-Cop-*

Foszíátpuffer oldat

384 (5-7-2)

121

034 94 (giatiramer-acetát)	| 14860	20587 | } }	10513 |
55296	1 13705 (91)	17189 (33) |	8683 (62) |
(giatiramer-acetát)
55396	j 134 SS (90)	17564 (85) :	9142 (88) |
(giatiramer-acetát)	5
	t......... ι
TV-3 5	| 1176(0) ΐ	34 3 (0)	657 (1) 1

fTV-ka 1 ibráló standard) _£

TV-56 | 1614 (2) I 1581 (6) (TV-kaiibráló standard)

9584 (91) I

TV-77 ( 2265 (6) J 2152(9) (TV-kaIibrélő standard) )j

V~8í

1625 (2) 1506 (6)

4259 (3 ί) |

8140 Í75) (TV-kabbráIő standard) |

Cop-1-specifíkus T-sejtekkel való reaktivitás GLAT-kopoiimsrrel serkenthető T-sejtvo-nalakat alkalmazunk

TV-kaíibrácíős standardok serkentés! aktivitásának vizsgálatára szokásos GLAT-kopoiimer előállítási adagokkal összehasonlÍrva & »'*· ·Κ

X φ Φ V * Φφ·Μχ XV * «φ φφ *♦ « « ♦ ♦ » Φ « Φ « Κ * ♦ φ Φ * » ** *

-’·δ2⁴¹ £.*' ΦΧΧ *.♦. >Φ »»φ» (13, táblázat). Mint fent, a TV-kalibrációs standardok aktivitását in vitro vizsgáljuk. Számos egér- és emberi T-seltvonai szaporodását határozzuk meg tenyészetben pepbdekre való reakcióként. A sejtvonalak a következők: BALB/c-Ts-Cop-1, Sslb/e-egerekbői származó hőmérséklet-érzékeny vonal; L.-22-1; F1 egerekből származó hőmérséklet-érzékeny klón; SC-103 és SC-14: emberi Cop-1 specifikus T-sejt klánok. A szaporodást 10 pg GLAT-kopolímerrel vagy TV-kaiibrálő standarddal tenyésztett T-seltvonaiak ''H-tlmidin felvételének mérésével határozzuk meg.

A glatiramer-acetát adagok serkentőek. A TV-kallbrációs standardokat négy T-sejtvonalből kettő esetében szintén serkentőnek találtuk, bár nem olyan erősen. A TV-kaiíbráclős standardokat mind az egér, mind az emberi gtatiramer-acetátra specifikus T-sejtek felismerik. Ez megerősíti, hogy aminosav szekvencia és T-sejt epitóp hasonlóság van a glatiramer-acetát és a TV-kallbrációs standardok között.

13. táblázat

A glatiramer-acetát és TV-kallbrációs standardok reaktivitása glatiramer-acetát specifikus T-sejtvonalakkai

Antigén	3H-timidin beépítés i cpm (% Cop-1) [
	8ALB/C- Ts-Cep-1	L-22-1	SC-103 | t	SC-14 |
Foszfátpuffer oldat	538	2ö7	342 |	760
03494 (glatiramer-acetát)	32343	1 δ 395	8702 i i	3091 I

Λ >

«*♦ *§Α »««:» * XX «« * » X ♦ * X * X ♦ « X W * > * * « β β ♦ β · * «*. «X «X Χ*«Φ

55296 (g I a 11 ra m e r - a c e t á t)	35820 (110)	17315 (106)	7148 (81)	2973 (95)
55396 (gletiramer-acetát)	34281 (105)	17211 (105)	7013 (80)	3253 (107)
TV-3 5 (TV-kallhrálő standard)	9485 (28)	225 (0)	438 (0) i	884 (0).
TV-56 (TV-kahbráló standard)	19545 (59)	232 (0)	237 iö)	3495 (117)
TV-77 (TV-kahbráló standard)	17387 (52)	300 (1)	327 (0)	2791 (83)
TV-88 (TV-kallbrálő standard)	14694 (44)	418 (1)	298 (Ό)	2284 (65)

Kísérleti allergiás encepbalomyéiitís blokkolása A TV-kaiibrációs standardok fiziológiai aktivitásának vizsgálata érdekében kísérleti allergiás encephallomyelitis-töl (£A£) való védelmet vizsgálunk egerekben. Teljes Ereund-féle adjuvánsban lévő kopolimer-1: és az encephalltogén injekciója lényegében képes blokkolni az EAE-t, amint 'azt Aharonl és munkatársai a 17 Eur. J. Immunoi.,. 23, (1993) szakirodalmi helyen ismertetik. Más kutatók úgy találtak, hogy a. kopolimer-1 gyógyászati hatása sclerosis multiplexben szenvedő betegek esetében szintén a T_H2-sejtek indukciójával függ össze. Lásd: Lahat és munkatársai, 244 d. Neuron 129 (19S7) szakirodalmi helyen. Ebben a példában a találmány szerinti különböző polipepíidekkeí blokkoljuk az EAE-t.

>Χ«Χ <X«Jf * «Χ«Χ <<«Κ * ♦♦ ♦*

XX « » « X » « X 4 X » * X X ♦ » X ♦ « X * 4~· Λ X « * * * 4 ί * *** *^£± «*» «« ** ♦

Az EAE indukciója

2-3 hónapos nőnemű (SJL/jxBALB/c)FI egérnek mind a négy lábába 1:1 arányban teljes Freund-féle adjuvánssal (CFA) emulgeált, 4 mg/ml mikobaktérium tuberkulózis H37Ra-val kiegészített egér gerincvelő homogenátot (3,5 mg/egér) injektálunk. Pertüss is toxint (0,.2.5 ml, 250 ng, Sigma) injektálunk z p»n»r?

intravénásán közvetlenül utána és 48 órával később. Az két naponta vizsgáljuk az indukció- utáni 10. naptól kezdve az EAE klinikai jeleire nézve, amelyeket 0-5. skálán rögzítünk, amint azt Lando és munkatársai a 123 j. immunoi. 2156 (197 9) szakirodalmi helyen ismertették.

Az EAE blokkolása teljes adjuvánssal való injektálással Minden tesztelt antigént enc-ephalitogén oltóanyagba foglalunk. A 14. táblázat az EAE előfordulását mutatja olyan állatokban, amelyek TV-kallbrélő standarddal vagy giatiramer-acetáttal kiegészített encephaliíogé-n oltóanyagot kaptak és olyan állatokban, amelyek csak az encephaliiogén oltóanyagot kapták. Az EAE átlagos kezdetét is mutatja a táblázat azokban az állatokban, amelyeket nem védtünk. A betegség Intenzitását naponta rögzítjük az egerekben 0-5 közötti skálán (ö jelentése: egészséges, 5 jelentése; elpusztult). A kezdetet úgy határozzuk meg, mint azt a napot, amelyen az állat a betegségnek a szóban forgó skála szerinti legalább 1. sOlyosságú tünetét mutatja.

Ά *' λ

ΦΦ φ

»♦44 *

* ’ $ ♦fc

Φ * Φ :φ X φ χ r « Φ

X « *

ΦΦΦ κ«

XX

X *Φ:

Φ

ΦΦ

14. táblázat

EAE-tol való védelem TV-kaÜbráciés standardok segítségével

ι ” I antigén ΐ	Előfor- dulás	i Átlagos i érték	kezdet (nap)	%-os Blokkolás
Kontroll (-) i	10/10	I 4,9	11,3
I TV-45 I	0/10	I o		100
| Τ' ! TV-66 i	6/10	I 2,8	117	40
[ TV-77 |	1/9	| 0,2	14.0	89
j TV-3 6 i	3/10	I 0,7	12 0	70
! TV-109 i	0/10	I o		100
1 03494 |	0/10	0		1 OQ __
I 55396 j	0/10	I o	-	100

Szekvencialista

HSOADÁSALAHÁUL szolgáló változat < X10 > Ai s,, Dóra

Gad, Alexander <12.0 > Gisfemer-sceíát roctekuiatömeg kalibrációs standardok <130 2662/4840Í < 14 S> ezúton bejelentett <14i> 1SSS—05-24 <150 CS 60/102,693 <151> !SSS~GS-25 <1SG>

<X?Q> WordPerfect 8.0 fór Windows <210 1 <2.12 > 35 <212> PRT <213> Mesterséges szekvencia _:.

<220>

<220 Szintetikus peptid <400 1

Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Glu Lys Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Lys 1 5 lö 15

Lys. Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gla Ala Ala Ala Lys Glu. Ala Ala

25 30

Tyr Glu Ala 35 <220 2 <2H> 45 <212> pRT <213 > Mesterséges szekvencia <220 <223> Szintetikus pepiid <4 00 2

Ala· Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Ala Lys Ala Glu Lys Ala Lys Lys Ala ***♦ «φ

X Φ χ * ♦ » Φ « '*'·♦ *Φφ

Tyr Lys Alá Als da- 20	Als Lys	Lys Alá 25	Alá	Lys	Tyr	Gly	Lys 30	.Ara	&i3
Als Glu Lys Als Als	Ars Lys	Gly Als	Alá	Tyr	Glu	Alá
35		10				45
<220> -í
<21.1 > 5S
<212> PPT
<2X3> Mesterséges szel»	Aeneis
<22Ö>
<22 3> Szintetikus pepiid
<400> 3
Alá Lys Lys Tyr Als	Lys Lys	íaZxi -LyS	Ars	Tyr	Als	_-VS	Lys:	Alá
1 5			10					15
Lys Alá Alá Lys Lys	Alá Glu	A1.& íz/s	Als	Tyr	Lys	Als	Als	Gla
20		25					30
Lys rys Lys Ars Alii	Als Lys	Tyr Lys	Als	Gla	Alá	Als	Lys	Als	Als
35		40				45

Als r-ys ΆΧϊτ Al.s Ars Tyr Gla Ar,

5Ü

ÍS 56 <21 Ö> 4 <211> 6δ <212> PÉT <213> Mesterséges szekvencia <220>

<22 3> Szintetikus psptici <4Ö0> 4

Alá Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Glu Lys- Alá Tyr Alá Lys Alá Lys Lys 1 5 10 15

Al s SiB Als Lys Als Als r<ys uys Α1» Lys Ars t»iu Als Lys Tv:

* * * « 4> X « «« φ

Aia Lys Alá Aia .Lys Alá. Glu Lys Lys Glu ’eyz AIs Alá Aia Glu 35 40 '45

Lvs Tvr Lvs Aia Glu Alá Alá. Lys Alá Alá Alá Lys Glu Alá Alá Tyr

5ü

5:

su

Glu Aia <2IG> 5 <211> 77 <212> FRT <213> Mesterséges szekvends » <22ö>

<22 3> Szintetikus peptid <4G0> 5

Alá Lys Lys Tyr Alá Lys Lys Glu Lys Aia 1 5 lö

Alá Lys Lys Alá Glu

Lys Alá AIs Lyr Lys Aia Glu Alá r,ys λλλ Tyr uys

Alá Aia Glu Alá 30

Lys Lvs Lys Alá Lys Alá Glu Alá Lys Lys Tyr Aia Lys Aia Alá Lys

Alá Glu Lys Lys Glu Tyr Alá Alá Aia Siu Aia Lys Tyr Lys Aia Glu

Sö

Alá Ara Lys Alá .Als

TO

Slu Aia Aia Tyr Glu Alá

	<210>	δ
	<2I1>	8 δ
	<2I2>	P.RT
		r
		íViSSiSFSt
Λ	<22Q>
	<223>	Szinted:
	S' A Λ ?·\ v.	<3

* # »«· β » * ·♦ ' ** ««««

Als Lys Lys Tyr .Alá Lys Lys Giu Lys Alá Tyr Alá Lys Lys Alá Glu

Lys Als Ara rys Lys Alá íalu Air sys Ara Tyr Lys Als Alá de Alá ?5

Lys Lys Lys Aia Lys Alá Giu Aia Lys Lys Tyr 35 40:

Lys Alá Aia Lys

Aia Giu Lys Lys Gin Tyr Aia Aia Aia Giu Aia Lys Tyr Lys Alá Giu

Alá Aia Lys Lys Aia ryr Lys Aia Gitt Aia Ars Lys Ais Aia Aia Lys

S5	70
Gru Ar	.a Alá Tyr Giu Aia
	85 86
<210>	7
<211>	.209
<22 2>	ART
<213>	AVitíS lS’CSSQSS’ SZe&vencle
<220>
<22 3>	Szintetikus pepiid
<4Qö>
Aia Lys Lys Tyr Aia Lys Lys
1

,ys Alá Alá Lys ulu Z,ys « Aia Tyr Aia rys Lys sia

Lys Ais

Tyr Lys Aia Alá Giu Aia Lys Lys Lvs Aia Lys Alá Giu Alá Lys Lys

Tyr Aia C(~!

-d

Giu Aia Aia Lys Aia Lys Lys Giu Aia Tyr Lys Aia Giu

Aia Lys Lys Tyr Aia Lys Aia Alá Lys Aia Giu Lys Lys Glu Tyr Al;

o>

SX / U

-j-c

SO «X * *

Ai S Α1 £ϊ	Glu Alá	i.<ys Ays A-X& Siti 85	Als Als Lys . 00	Alá	Tyr	Lys Als Glu 05
Ma	Alá	Lys Ála	Alá Ála	Lys	Siti	Alá Alá Tyr	Gin	Alá
		100				105		109

V* * κ ***♦

Claims (6)

1. Molekulatömeg markerek sokaságának alkalmazása egy kromatográfiás oszlopon kapott retenciös idő és a molekulatömeg közötti összefüggés megállapítására egy polipeptid keverék átlagos molekulatömegének meghatározásához, amely polipeptidek mindegyike alanint, glutaminsavat, tírozint és lizint tartalmaz, ahol a polipeptid keverékben az alanin móltörtje 0,38-0,5, a glutaminsavé 0,13-0,15, a tiroziné 0,08-0,1 és a liziné 0,3-0.4, és ahol minden molekulatömeg marker alanint, glutaminsavat, tírozint és lizint tartalmazó polipeptid előre meghatározott amínosav szekvenciával és meghatározott molekulatömeggel.

2. Az 1. igénypont, szerinti alkalmazás, ahol a polipeptid keverékben az alanin mőltörtje 0,427, a glutaminsavé 0,141, a liziné 0,337 és a tiroziné 0,093.

3. Az Ι» vagy 2» igénypont szerinti alkalmazás, ahol a molekulatömeg markelekben az alanin móltörtje 0,38-0,5, a glutaminsavé 0,13-0,15, a tiroziné 0,03-0,1 és a liziné 0,3-0,4.

4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a molekulatömeg markerekben az alanin mőltörtje 0,422-0,444, a glutaminsavé 0,133-0,143, a tiroziné 0,086-0,093 és a liziné 0,3330,349..

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kromatografálő oszlop egy gélszűrő ígélpermeácíós) kromatográfiás oszlop.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a polipeptid keverék glatiramer-aeetát.