CN105218646B - 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 - Google Patents
一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105218646B CN105218646B CN201410290469.3A CN201410290469A CN105218646B CN 105218646 B CN105218646 B CN 105218646B CN 201410290469 A CN201410290469 A CN 201410290469A CN 105218646 B CN105218646 B CN 105218646B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- internal standard
- sample
- standard peptide
- methods
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供一组与醋酸格拉替雷(共聚物‑1)结构相似的内标肽作为共聚物‑1分子量测定用内标以及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用方法能够在高分辨的UPLC分离技术下，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测醋酸格拉替雷样本的超高效液相色谱色谱(UltraPerformance Liquid Chromatography，UPLC)方法及与其配套使用的内标肽组。
背景技术
自身免疫类疾病(autoimmune diseases)是指，生物机体的免疫系统将一些机体本身的组织当作“外来物”进行攻击的现象。通常这种疾病可以通过阻碍生物机体T细胞和B细胞对机体自身组织的反应，得到缓解。这些早期的免疫反应是通过抗原结合到MHC分子上促进的，并通过T细胞表达出来。自身免疫类疾病就是机体本身的组织和蛋白质被当作“自抗原”，被机体免疫系统攻击。例如：多发性硬化症，就是免疫系统对隔离和保护神经的髓鞘进行攻击而导致的疾病，这种疾病发展到失去髓鞘，就会带来神经元和运动神经功能丧失；其他例如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、自免疫性溶血性贫血等，也属于此类疾病。
很多药物开发出来用于治疗自身免疫类疾病，包括多发性硬化症。醋酸格拉替雷(又叫共聚物-1)是由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸通过聚合产生的不同分子量聚合物的混合物。它的四种氨基酸摩尔比大约是0.392～0.462:0.129～0.153:0.300～0.374:0.086～0.100(Ala：Glu：Lys：Tyr)，混合物中的共聚物的平均分子量大约5000～9000道尔顿。
为了能够确保得到的共聚物-1具有药效，就必须准确的知道多氨基酸混合物在合成过程中的平均分子量分布和变化，例如用Superose12色谱柱进行分析确定分子量，但是，由于对于不确定含量及分子量的聚合物混合物而言，由于没有标准对照物，因此，进行分子量检测时，多使用内标法进行评价，此时，质量合乎标准的内标物质对于检测结果的准确性至关重要。
对于共聚物-1的内标物，上世纪末，US6514938记载了使用合成的多肽作为内标物调整色谱柱的校正系数，能够较为准确测量共聚物-1平均分子量。但是，随着分离技术的不断发展，尤其是如高分辨的UPLC色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，超高效液相色谱)技术的不断成熟，该方法专属性不强的缺点就被暴露出来，在如UPLC的相对严格的条件下，需要对该方法进行修正，从而更准确的检测目标聚合物的分子量及分子量分布，以便为相关的药物质量控制提供更为准确的参考。
发明内容
本发明提供一组与目标化合物(共聚物-1)结构相似的内标肽作为共聚物-1分子量测定用内标以及与其配套使用的UPLC检测及分离参数，使用该内标能够在高分辨的UPLC分离技术时，更准确的测定目标聚合物的分子量及分子量分布。为相关研究提供更为真实的数据支持。
本发明首先涉及一种用来检测共聚物-1的UPLC方法，该方法使用BEH125SEC色谱柱与BEH200SEC两根色谱柱任意串联的UPLC系统，柱参数为1.7um，4.6×150mm；使用pH值3.0-5.0(优选为3.5)、浓度0.1-0.5mol/l(优选为0.25)的甲酸铵或乙酸铵作为缓冲液；将所述缓冲液与乙腈按照缓冲液：乙腈＝1:9配制流动相；所述流动相通过过滤法除菌除杂。
本发明所述的UPLC方法中，绘制内标肽校准曲线和检测目标共聚物-1时的方法参数还包括，本发明所述的串联色谱柱系统的进样和检测样本时，柱温控制在30-60℃，优选为50℃；根据所述的串联系统，制备标准曲线时内标肽组的进样量为1-20ul，样品浓度0.01～0.1mg/ml，优选为0.05mg/ml；根据所述的串联系统，检测目标共聚物-1时，样品的浓度为0.1-10mg/ml，优选为4mg/ml。
本发明所述的UPLC方法中，所使用的内标肽组合共包含7条内标肽，所述的内标肽序列见表1
表1.内标肽组合的序列结构及分子量
附图说明
图1、本发明所述的内标肽组不同条件下的色谱图：图1a.使用本发明所述UPLC方法配合内标肽组进行UPLC色谱校正时的色谱图；图1b.使用普通HPLC方法混合进样标定本发明所述的内标肽组时的HPLC图谱；图1c.使用普通HPLC方法分别进样标定本发明所述的内标肽组时的HPLC拟合图谱。
图2、本发明所述的内标肽组的校正曲线：图2a.使用本发明所述UPLC方法配合内标肽组进行UPLC色谱校正时的校正曲线；图2b.使用普通HPLC方法和本发明所述的内标肽组校正时的校正曲线。
图3、聚合物-1的典型UPLC色谱图：图3a.使用本发明所述UPLC方法获得的典型共聚物-1的色谱图；图3b.使用普通HPLC方法获得典型共聚物-1的色谱图。
图4、4a、4b、4c本发明所述的内标肽组的UPLC分离图谱
具体实施方式
实施例1.内标肽组的合成及性质
分子量从5400-17000道尔顿的七条内标肽由本公司自行合成。这些内标肽编号为TV-##，其中##为氨基酸残基数目(例如：TV-35就是含有35个氨基酸残基的肽链)。氨基酸的组成与共聚物-1的特征值相符(表2)。
表2.内标肽组的各内标肽氨基酸组成
实施例2.以本发明UPLC-SEC超高压液相色谱方法，使用内标肽组校正色谱柱并测量共聚物-1的分子量及分子量分布
用Waters ACQUITY UPLC BEH125SEC色谱柱与Waters ACQUITY UPLC BEH200SEC两根色谱柱进行串联(注：两根色谱柱均为1.7um，4.6×150mm)，以0.25mol/l的甲酸铵(用甲酸调pH3.5)与乙腈按9：1的比例混合，过0.2um滤膜后作为流动相，检测波长为275nm，流速为0.2ml/min，柱温：50℃。对这七个内标肽的进行校正，内标组的每一个内标肽的进样浓度为0.05mg/ml，进样10μl，七个样本一起进样，获得的UPLC分离图谱见图1a，可见，采用该方法，能够很好的将内标肽进行分离。同时，这组内标肽与共聚物-1的保留时间与其对应分子量的对数呈一定的相关性，对这七个内标肽的进行校正，其公式为：logMw＝A+B×RT，校正曲线采用的数据如下表3，由此得出的校正曲线见图2a，对共聚物-1的典型样本进行检测，色变图见图3a。
表3.使用本发明所述UPLC方法配合内标肽组绘制校正曲线时采用的数据
随后，以同样的UPLC参数，对不同来源的共聚物-1进行检测，进样量为4mg/ml进样10μl。所得出的聚合物-1对比分子量及分子量分布情况的分析结果见表4
表4.使用本发明所述UPLC方法检测不同来源的共聚物-1的对比分子量及分子量分布结果
实施例3.内标肽组的UPLC分离
用Waters ACQUITY UPLC BEH125SEC色谱柱与Waters ACQUITY UPLC BEH200SEC两根色谱柱进行串联(注：两根色谱柱均为1.7um，4.6×150mm)，以0.25mol/l的甲酸铵(用甲酸调pH5.0)与乙腈按9：1的比例混合，过0.2um滤膜后作为流动相，检测波长为275nm，流速为0.2ml/min，柱温：30℃。对这七个内标肽的进行校正，内标组的每一个内标肽的进样浓度为0.05mg/ml，进样10μl，七个样本一起进样，获得的UPLC分离图谱见图4a，可见，采用该方法，能够很好的将内标肽进行分离。
实施例4.内标肽组的UPLC分离
用Waters ACQUITY UPLC BEH125SEC色谱柱与Waters ACQUITY UPLC BEH200SEC两根色谱柱进行串联(注：两根色谱柱均为1.7um，4.6×150mm)，以0.25mol/l的甲酸铵(用甲酸调pH3.5)与乙腈按7：3的比例混合，过0.2um滤膜后作为流动相，检测波长为275nm，流速为0.4ml/min，柱温：50℃。对这七个内标肽的进行校正，内标组的每一个内标肽的进样浓度为0.015mg/ml，进样10μl，七个样本一起进样，获得的UPLC分离图谱见图4b，可见，采用该方法，能够很好的将内标肽进行分离。
实施例5.内标肽组的UPLC分离
用Waters ACQUITY UPLC BEH125SEC色谱柱与Waters ACQUITY UPLC BEH200SEC两根色谱柱进行串联(注：两根色谱柱均为1.7um，4.6×150mm)，以0.10mol/l的甲酸铵(用甲酸调pH3.5)与乙腈按85：15的比例混合，过0.2um滤膜后作为流动相，检测波长为275nm，流速为0.1ml/min，柱温：60℃。对这七个内标肽的进行校正，内标组的每一个内标肽的进样浓度为0.10mg/ml，进样10μl，七个样本一起进样，获得的UPLC分离图谱见图4c，可见，采用该方法，能够很好的将内标肽进行分离。
实施例6.以普通的HPLC-SEC液相色谱方法，使用内标肽组校正色谱柱并测量共聚物-1的分子量及分子量分布
用GE healthcare Superose1210×300mm，10um色谱柱，以0.2mol/l的醋酸铵(用醋酸调pH5.0)，过0.2um滤膜后作为流动相，检测波长为275nm，流速为0.5ml/min，柱温：30℃。对这七个内标肽组进行校正。由于该色谱条件无法一次性将这七个内标肽的混合样品分离开来(混合进样后的HPLC图谱见图1b，可见，使用该HPLC条件时，本发明所述的内标肽组不能采用单次混合进样法校正)，采用每个单标逐一进样，各分子量内标的分离拟合图谱见图1c，最后再进行拟合校正，其公式为：logMw＝A+B×RT，校正曲线采用的数据如下表5，由此得出的校正曲线见图2b，对共聚物-1的典型样本进行检测，色变图见图3b。
表5.使用普通HPLC方法配合本发明内标肽组绘制校正曲线时采用的数据
随后，以同样的HPLC参数，对不同来源的共聚物-1进行检测，进样量为4mg/ml进样10μl。所得出的聚合物-1对比分子量及分子量分布情况的分析结果见表6。
表6.使用HPLC方法检测不同来源的共聚物-1的对比分子量及分子量分布结果
通过上述实施例2和实施例3的实验结果的对比，本发明所述的配套内标肽组和UPLC方法，相比于传统的HPLC方法，能够获得更为精确的相关性(本发明所述方法获得的内标肽校准结果的相关性值R2＝0.9978明显好于普通的HPLC方法的结果R2＝0.9907)，而应用于共聚物-1的检测和标定时，更为准确的分子量及分子量分布数据即意味着更好的产品精度和更为节约的评价成本。
最后需要说明的是，上述实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，并不用于限定本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一组用于检测醋酸格拉替雷分子量和分子量分布的内标肽组，其特征在于，所述的内标肽组中共有7条内标肽，其氨基酸序列依次为SEQ ID No.1～SEQ ID No.7所示。
2.与权利要求1所述的内标肽组配套使用的超高效液相色谱方法，其特征在于，使用BEH125SEC色谱柱与BEH200SEC两根色谱柱任意串联的超高效液相色谱系统，柱参数为1.7μm，4.6×150mm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述系统的流动相中缓冲液与乙腈的体积比为9:1,7:3或85:15，所述的缓冲液为pH值3.0-5.0、浓度0.1-0.5mol/l的甲酸铵或乙酸铵缓冲液。
4.根据权利要求2所述的方法，其所用色谱条件所用的流速为0.1-0.4ml/min。
5.根据权利要求2所述的方法，其所用色谱条件所用的流速为0.2ml/min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液的pH值为3.5、浓度为0.25mol/l。
7.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，检测样本时，柱温控制在30-60℃。
8.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，检测样本时，柱温控制在50℃。
9.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，检测内标肽组时，进样量为1-20μl；内标肽浓度为0.01～0.1mg/ml。
10.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，检测内标肽组时，内标肽浓度为0.05mg/ml。
11.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，检测目标醋酸格拉替雷样本时，样品的浓度为0.1-10mg/ml。
12.根据权利要求2-6任一所述的方法，其特征在于，检测目标醋酸格拉替雷样本时，样品的浓度为4mg/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410290469.3A CN105218646B (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410290469.3A CN105218646B (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105218646A CN105218646A (zh) | 2016-01-06 |
| CN105218646B true CN105218646B (zh) | 2018-09-21 |
Family
ID=54987974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410290469.3A Active CN105218646B (zh) | 2014-06-24 | 2014-06-24 | 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105218646B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6514938B1 (en) * | 1998-09-25 | 2003-02-04 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use |
| WO2006029411A2 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, and uses thereof |
| CN101479607A (zh) * | 2006-04-28 | 2009-07-08 | 莫门塔制药股份有限公司 | 评估肽混合物的方法 |
| EP2239269B1 (en) * | 1998-09-25 | 2013-01-16 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Use of peptides derived from copolymer-1 as molecular weight markers |
-
2014
- 2014-06-24 CN CN201410290469.3A patent/CN105218646B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6514938B1 (en) * | 1998-09-25 | 2003-02-04 | Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science | Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use |
| EP2239269B1 (en) * | 1998-09-25 | 2013-01-16 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Use of peptides derived from copolymer-1 as molecular weight markers |
| WO2006029411A2 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, and uses thereof |
| CN101479607A (zh) * | 2006-04-28 | 2009-07-08 | 莫门塔制药股份有限公司 | 评估肽混合物的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Antigen-specific therapy for autoimmune disease;Leonard C Harrison等;《Current Opinion in Immunology》;20001201;第12卷(第6期);第704-711页 * |
| Synthetic Peptides that Inhibit Binding of the Collagen Type II 261–273 Epitope to Rheumatoid Arthritis-Associated HLA-DR1 and -DR4 Molecules and Collagen-Specific T-Cell Responses;Masha Fridkis-Hareli等;《Human Immunology》;20000731;第61卷(第7期);第640-650页 * |
| 内标对比标准曲线法与标准加入对比法的误差分析;孙国祥等;《沈阳药科大学学报》;20031130;第20卷(第6期);第435-438页 * |
| 高效液相色谱内标法测定人血头抱克罗浓度;李菊香等;《江西医学院学报》;20010228;第41卷(第1期);第31-33页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105218646A (zh) | 2016-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107531750B (zh) | 多肽混合物高效液相色谱分析方法 | |
| CN102590413B (zh) | 一种牛α-乳白蛋白的定量检测方法 | |
| CN110938130A (zh) | 一种生物活性多肽rvfqplphenkpltl及其制备方法和应用 | |
| CN101613408B (zh) | 乳清蛋白的分离和测定方法 | |
| HU229720B1 (en) | Copolymer 1 related polypeptides for us as molecular weight markers and for therapeutic use | |
| CN109142598B (zh) | 一组驴源性特征肽和一种鉴定阿胶或阿胶制品的方法 | |
| Pierri et al. | Analysis of bovine milk caseins on organic monolithic columns: an integrated capillary liquid chromatography–high resolution mass spectrometry approach for the study of time-dependent casein degradation | |
| CN114778731B (zh) | 鸡内金、炒鸡内金、醋鸡内金饮片及其标汤、颗粒剂的uplc特征图谱构建方法及应用 | |
| CN106749600A (zh) | 一种酪蛋白磷酸肽的标签肽及其应用 | |
| CN105218646B (zh) | 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法 | |
| CN105241973A (zh) | 蛋白制剂的高效液相色谱检测方法 | |
| CN109369783A (zh) | 一种多肽rdp1及其提纯方法与应用 | |
| CN101782549A (zh) | 检测牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法 | |
| Christodoulou et al. | Development of an HPLC multi‐residue method for the determination of ten quinolones in bovine liver and porcine kidney according to the European Union Decision 2002/657/EC | |
| CN107831259A (zh) | 一种脾氨肽内游离氨基酸的测定方法 | |
| CN104897832B (zh) | 转移因子溶液及其制剂中游离氨基酸含量的高效液相色谱检测方法 | |
| CN108982738B (zh) | 贞芪扶正颗粒的中间体特征图谱或贞芪扶正颗粒指纹图谱的构建方法及检测方法 | |
| CN104098655B (zh) | 用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽 | |
| CN109239219A (zh) | 一种转移因子胶囊中多肽的定量检测方法 | |
| WO2007095378A2 (en) | Mass tagging for quantitative analysis of biomolecules using 13c labeled phenylisocyanate | |
| CN106404946A (zh) | 一种合成抗原的分子量检测方法及应用 | |
| Cervantes et al. | Development and validation of an LC/MS method of glatiramer and its sequential amino acids, at pharmaceutical product | |
| CN110759964A (zh) | 一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法 | |
| EP3901166A1 (en) | Polypeptide having effect of inhibiting proliferation of leukemia cells | |
| CN115248277B (zh) | 刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |