CZ284472B6

CZ284472B6 - Nevodný prostředek na somatotropinové bázi

Info

Publication number: CZ284472B6
Application number: CS878156A
Authority: CZ
Inventors: James William Mitchell
Original assignee: Monsanto Company
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1985-10-03
Publication date: 1998-12-16
Also published as: ES547489A0; JPH0745409B2; KR890002631B1; CS274717B2; YU45281B; PL152711B1; DK449585D0; EP0177478B2; EP0177478B1; AU4823785A; GEP19960332B; PT81248B1; CN1044761A; JPS6191130A; IE852422L; BG47039A3; NO853909L; NO173975B; DK449585A; EP0177478A2

Abstract

Nevodný prostředek na somatotropinové bázi pro panterální podávání, popřípadě prodlouženě uvolňující biologicky účinný somatropin do oběhového systému zvířat po parenterálním podání, obsahující, vztaženo na prostředek jako celek, alespoň hmotnostně 10 % somatropinu a jakožto kontinuální fázi biokiompatibilní olej. Prostředek je vhodný například pro zvýšení poměru masa k tuku, ke zvýšení využitelnosti krmiv a zvýšení mléka v případě různých druhů savců, jako skotu, ovcí, koz a vepřů.ŕ

Description

Vynález se týká nevodného prostředku na somatotropinové bázi pro parenterální podívání, popřípadě prodlouženě uvolňujícího biologicky účinný somatotropin do oběhového systému zvířat po parenterálním podání.

Dosavadní stav techniky

Výrazem „somatotropin“ se zde vždy míní polypeptid, jehož biologická účinnost a chemická struktura jsou v podstatě podobné vlastnostem somatotropinu, produkovaného v hypofyze zvířat. Jsou tedy míněny přírodní samototropiny, produkované somatotropními buňkami hypofyzy a somatotropimy, expresované geneticky transformovanými mikroorganismy, jako jsou například E. coli, jiné bakterie nebo kvasinky. Aminokyselinové sekvence těchto alternativně produkovaných somatotropinů mohou být identické s přírodním somatotropinem, nebo mohou být analogy se změnami v sekvenci aminokyselin se zvýšenou biologickou účinností a s delšími přednostmi. Jakož polypeptidy, obzvláště vhodné podle vynálezu, se uvádějí hovězí a vepřové somatotropiny, například mikrobiálně expresované a jiné zvířecí prolaktiny, faktory uvolňující růstový hormon, placentové laktogeny a růstové faktory podobné inzulínu. Tyto polypeptidy popřípadě naN-konci obsahují methioninový zbytek, například mehionin z mikrobiální translace iniciačního signálu ATG v genu polypeptidu. V některých případech však může být žádoucí, aby takové methioninové zbytky v polypeptidu znamenaly nejvýše asi 20 % (s výhodou nejvýše asi 10 %) formyl-methioninu. Tím se zmenší tendence zvířete k obraně proti cizím částicím a tedy i degradace polypeptidu.

Ačkoliv prodloužení účinnosti některých biologicky účinných (bioaktivních) polypeptidů lze dosáhnout parenterálním podáváním jen velmi malých dávek, jiné biologicky aktivní polypeptidy jsou vyžadovány v dostatečných koncentracích v séru a/nebo mají tak krátký poločas v séru, že pro získání žádoucího biologického efektu po delší dobu, jako je například týden nebo déle, se musí podávat vysoká dávka (např. alespoň 100 mg). Příklady takových polypeptidů jsou právě uvedené somatotropiny (růstové hormony).

Aby se předešlo nežádoucímu rychlému uvolňování do krevního oběhu zvířete, podávaly se jisté polypeptidy v kapalných nosičích, které mohou popřípadě obsahovat hydratační retardanty (zpomalovače) (antihydratační činidla) nebo v asociaci s kovy nebo kovovými sloučeninami, které dále snižují jejich rozpustnost v tělesných kapalinách. Výhodné by bylo, kdyby koncentrace polypeptidu v takovém nosiči byla značná, protože by se tím odstranila potřeba nepřijatelně velkého množství takového nosiče. Ve vyšších koncentracích je však většina bioaktivních peptidů velmi viskózní. Z toho plynou těžkosti při injekčním nebo jiném podávání v těchto vysokých koncentracích. Navíc, mnoho obvykle používaných antihydratačních činidel dále zvyšuje viskozitu a snižuje tak vhodnost takových sloučenin pro injekční podávání. Z tohoto a dalších důvodů lze normálně velice obtížně dosáhnout správné kombinace: 1) dostatečně rychlého uvolňování tak, aby se dosáhlo žádaného biologického účinku na živočicha, 2) dostatečně pomalého uvolňování tak, aby se dostatečně prodloužila účinnost, 3) dávky, která je vhodná pro uvolňování žádanou rychlostí po prodlouženou dobu a 4) dostatečně malého objemu a dostatečně nízké viskozity pro vhodné podávání.

Jelikož je každý polypeptid jiný, např. svoji trojrozměrnou strukturou a interakcí sjinými sloučeninami, je nemožné teoreticky předpovědět nebo demonstrovat snadnost dosažení prodlouženého efektivního uvolňování vysoké dávky polypeptidu ve vhodném nosiči. Přesto

- 1 CZ 284472 B6 musí být v mnoha případech vyvinuty prostředky s prodlouženým uvolňováním, jestliže se má biologická účinnost polypeptidu využívat užitečným a ekonomickým způsobem.

Dlouhou dobu jsou vyhledávány způsoby získání prodlouženého uvolňování bioaktivních látek, čímž by se snížila frekvence léčení a/nebo minimalizovala poranění léčených zvířat. Prodlouženého uvolňování bylo dosaženo u mnoha látek různými způsoby. Jedním ze systémů je použití olejových roztoků, které se mohou podávat intramuskulámí, podkožní nebo jinou injekcí. V některých případech, kdy jsou látky voleji málo rozpustné, se podávají v olejových suspenzích. Například Welch v US patentu č. 2491537 popisuje uvolňování až po dobu 24 hodin penicilinu, který je suspendován v oleji (například v rostlinném oleji) ve formě gelu s pektinem, celulózovou sloučeninou nebo· proteinem, jako je například želatina. Welch navrhuje také prodloužené uvolňování inzulínu a steroidních hormonů. Buckwalter v US patentu 2507193 popisuje uvolňování u králíků až po dobu 11 dnů při použití 300 000 jednotek/ml prokainpenicilin suspendovaného v podzemnicovém oleji ve formě gelu s 5% monostearanem hlinitým (A1MS). Jacobson v US patentu 3016330 popisuje penicilín potažený A1MS, který je suspendován v sezamovém oleji. Chien v Journal of Parenteral Science and Technology 35(3). 109 (1981) diskutuje prodlouženou biodostupnost prokain-penicilinu G suspendovaného v jedlém oleji ve formě gelu s 2% A1MS. Konstatuje, že více než 2 % A1MS se zdají mít pouze omezený přínos pro prodloužení účinných hladin penicilinu a že suspenze, které obsahují více než 2 % A1 MS, jsou pro praktické použití příliš viskózní.

Olejové suspenze se používají také pro určité terapeutické látky o nízké molekulové hmotnosti (MW) jiné než má penicilín. Například Lachman a spol. v US patentu 3676557 popisuje dlouhopůsobící prostředky s až 50 % pamoátových solí normorfinonů v olejových suspenzích ve formě gelu s A1MS. Sieger a spol. v US patentu 4016273 popisují prostředky s prodlouženým uvolňováním s až 40% pamoátových solí oxazepinů volejích ve formě gelu se stearanem hlinitým.

Byly popsány také systémy s prodlouženým uvolňováním jistých bioaktivních polypeptidů. Například Anschel v USA patentu 2964448 popisuje suspenzi popisuje suspenzi relaxinu (asi 2%) v rostlinném oleji ve formě gelu sAlMS. Anschel ukazuje, že tato suspenze zajišťuje uvolňování srovnatelné s prostředkem voleji bez činidla tvořícího gel (např. 5 až 7 dnů) a popisuje delší účinek (až na 23 dnů) tím, že se na suspenzi, které obsahuje A1MS, nechá působit teplo. Geller v US patentu 3869549 popisuje injektovatelné prostředky s prodlouženým uvolňováním, které obsahují „extrémně malé dávky“, např. „miligramové frakce“ peptidů. I když jsou tam uváděny růstové hormony, specifickými příklady jsou prostředky s kortikotroinem (ve vodě rozpustné) (ACTH) účinné po dobu sedmi až osmi dnů. Gellner popisuje prostředky, které obsahují adiční soli ACTH analog s kyselinou suspendované v podzemnicovém oleji ve formě gelu s distearanem hlinitým (AIDS) nebo adsorbované na AIDS a pak suspendované v takovém oleji. V kterémkoliv z těchto příkladů jsou v Gellerových injektovatelných prostředcích analoga obsaženy v koncentracích pouhých 0,03 až 0,1 % s hmotnostními poměry peptidů k hlinité soli ne větší než 0,5.

Prostředky se zpožděným uvolňováním analog LH-RH hormonu byly popsány Nestorem a spol. v US patentu č. 4256737. Takové prostředky obsahují soli tohoto hormonu včetně vícemocných kovů (např. zinku) v rostlinném oleji ve formě gelu s hlinitými solemi mastných kyselin. LH-RH analoga se podávají v koncentracích 0,01 až 1 % jako injektovatelný prostředek.

Jiní autoři popisují vodné suspenze solí kovů nebo komplexy polypeptidů s prodlouženým parenterálním uvolňováním. Např. Domini v US patentu č. 3852422 popisuje dlouhoaktivní suspenze vysráženého produktu ve vodě rozpustných gonadotropinů a hydroxidu hlinitého nebo zinečnatého. Jelikož je zinek přirozeně přítomný v pankreatickém inzulínu, bylo studováno prodloužené uvolňování inzulínu z vodných suspenzí díky interakci mezi inzulínem a různými

-2 CZ 284472 B6 kovy (např. zinkem, niklem, kobaltem a kadmiem) (americký patentový spis číslo 2 143590, 2 174862, 2 882203, 2 920014 a 3 102077).

Podstata vynálezu

Nevýhodný prostředek na somatotropinové bázi pro parenterální podávání, popřípadě prodlouženě uvolňující biologicky účinný somatotropin do oběhového systému zvířat po parenterálním podání, podle vynálezu spočívá v tom, že vztaženo na prostředek jako celek, 10 obsahuje alespoň hmotnostně 10% somatotropinu a jakožto kontinuální fázi biokompatibilní olej.

Takový prostředek se připravuje tak, že se dispergují jemně re nleté částice somatotropinu v bioslučitelném oleji v poměrech, kdy olej vytváří kontinuální f výsledné disperze, přičemž 15 výsledná disperze obsahuje alespoň hmotnostně 10% somato..opinu, je podstatě bezvodá a střední průměr částic somatotropinu v prostředku se zmenší mletím prostředku na velikost do 15 mikrometrů, dispergování a mletí se provádí při teplotě 4 až 125 °C a prostředek se izoluje filtrací, s výhodou za vakua.

Bioslučitelným olejem, který vytváří kontinuální fázi ve prostředcích podle vynálezu, je olej, který nemá žádný nepřijatelný nepříznivý vliv na polypeptid, na zvíře (v případě zvířete, jehož produkty vstupují do potravinového řetězce) nebo na spotřebitele takových produktů. Tyto oleje jsou s výhodou málo kyselé a v podstatě nežluknou. Výrazem „olej“ se zde rozumí vždy mastný olej nebo tuk, který je za tělesné teploty zvířete kapalný. Takový olej taje nebo alespoň začíná tát 25 při teplotě pod asi 40 °C, s výhodou pod asi 35 °C. Oleje, které jsou kapalné při teplotě asi 25 °C, usnadňují injekční nebo jiné podávání prostředků podle vynálezu. V některých případech mohou být pro svoji větší bioslučitelnost se zvířetem nebo zjiného důvodu výhodné několikrát nenasycené (například částečně hydrogenované) oleje.

S výhodou sestává bioslučitelný olej v podstatě z triglyceridů, to je esterů glycerolu s mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem (obvykle s 8 až 24 atomy uhlíku, s výhodou s 12 až 18 atomy uhlíku), nebo ze směsí triglyceridů a těchto mastných kyselin (s výhodou v pouze minoritních podílech, např. méně než asi 10% volné mastné kyseliny). V některých případech se místo glycerolu mohou používat jiné trihydroxy- nebo polyhydroxysloučeniny. Mezi zvláště výhodné oleje patří rostlinné oleje, jako je například olivový olej, olej sezamových semen, podzemnicový olej, slunečnicový olej, sojový olej, olej z bavlníkových semen, kukuřičný olej, saflorový olej, palmový olej, řepkový olej a směsi těchto olejů. V mnoha případech jsou vysoce výhodné sezamový olej a podzemnicový olej. Lze používat také oleje živočišné, minerální nebo syntetické (včetně esterů glycerolu nebo propylenglykolu s mastnými kyselinami s dlouhým řetězcem) za předpokladu, že jsou dostatečně bioslučitelné.

V mnoha případech takový olej představuje převažující hmotnostní část těchto prostředků. Kontinuální fáze bioslučitelného oleje obsahuje ve většině případů jemné diskrétní částice polypeptidu, které jsou v něm stejnoměrně dispergované, např. v suspenzi. Horní mez množství 45 polypeptidu je dána tím, kdy olej přestane existovat v kontinuální fázi, protože již neexistuje dostatečné množství oleje pro plné obalení v podstatě veškerého polypeptidu v prostředku.

Při použití vysokých množství polypeptidu v těchto prostředcích, dokonce i tehdy, kdy viskozita je podstatně zvýšena, byly zjištěny překvapivé neočekávané výsledky. Navíc bylo při těchto 50 vysokých množstvích objeveno, že interakce mezi polypeptidem a olejem v mnoha případech příznivě ovlivňují prodloužení uvolňování polypeptidu z dlouhopřetrvávajících zásob (depot).

Prostředky připravené způsobem podle vynálezu tedy obsahují somatotropin (polypeptid) v žádoucích vysokých hladinách, například alespoň asi 10 %. Často jsou žádoucí a zvláště účinné

-3 CZ 284472 B6 dokonce vyšší hladiny polypeptidu, např. alespoň asi 15%, náplně o alespoň asi 20% nebo vyšší, např. alespoň 30 % nebo dokonce až asi 42 % nebo vyšší, se mohou s výhodou používat v parenterálních injektovatelných prostředcích obsahujících somatotropin (např. hovězí). Takové prostředky poskytují somatotropin s prodlouženým uvolňováním (měřeno v krevním toku dobytka nebo jiných zvířat) v období až 30 dnů nebo déle.

V podstatě nevodné prostředky, které obsahují tak vysoké hladiny somatotropinu jako je asi 10%, nebyly popsány podle znalostí autora tohoto vynálezu nikdy dříve v žádném odborné literatuře. V obdobné literatuře jsou olejové prostředky omezeny na prostředky s velmi nízkými náplněmi polypeptidů, tj. ne více než asi 2 % (viz US patenty 296448, 3869549 a 4256737).

Prostředky podle vynálezu mohou vedle bioslučitelného oleje obsahovat také „protihydratační činidlo“. Tento pojem zde znamená látku, která zabraňuje hydrataci daného prostředku podle vynálezu nebo somatotropinu a/nebo bioslučitelného oleje. Tím se snižuje a/nebo stabilizuje rychlost uvolňování polypeptidu z prostředku po podání zvířeti. Jsou známa mnohá různá netoxická protihydratační činidla. Příkladem jsou činidla „tvořící gel“, která po dispergování a v některých případech po zahřátí se rozpustí voleji. Tím se získá olej o větší viskoelasticitě (a tedy větší strukturní stabilitě) a tím se zpomaluje pronikání vodných (např. tělesných) kapalin do oleje.

Přesný mechanismus těchto činidel není úplně jasný. Tak bylo zjištěno, že některá známá činidla „tvořící gel“ vykazují žádoucí protihydratační účinek dokonce i tehdy, když olej obsahující toto činidlo nebyl zahřát tak, aby se zvýšil účinek tvorby gelu a nebo tehdy, když gel, který se už jednou vytvořil, byl v podstatě odstraněn (např. střihovými silami). Pro použití podle tohoto vynálezu jsou vhodná také různá protihydratační činidla, která v podstatě nemají schopnost tvořit s olejem gel. Příkladem je stearan hořečnatý.

Příklady protihydratačních činidel jsou různé soli organických kyselin, například mastných kyselin s asi 8 (s výhodou alespoň) asi 10) až asi 22 (výhodně až asi 20) atomy uhlíku, např. soli hlinité, zinečnaté, hořečnaté nebo vápenaté kyseliny laurové, palmitové, stearové nebo podobných kyselin. Takové soli mohou být mono- nebo disubstituované podle mocenství kovu a podle oxidačního stupně kovu kyselinou. Zvláště užitečné jsou hlinité soli těchto mastných kyselin. Zvláště výhodnými protihydratačními činidly jsou monostearan a distearan hlinitý. Mezi další užitečná protihydratační činidla patři tristearan hlinitý, mono- a distearan vápenatý, monoa distearan hořečnatý a odpovídající palmitany, laurany a podobné sloučeniny. V mnoha případech se koncentrace těchto protihydratačních činidel, vztaženo na součet hmotnosti oleje a tohoto činidla, s výhodou pohybuje mezi 1 % a asi 10 % (nejtypičtěji mezi asi 2 % a asi 5 %) i když v některých případech mohou být výhodné i jiné koncentrace.

Obecně jak somatotropin tak protihydratační činidla mají tendenci zvyšovat viskozitu prostředků podle vynálezu. U mnoha prostředků to znamená problém, který se však podařilo překonat relativně vysoký poměr hmotnosti přítomného polypeptidu k protihydratačnímu činidlu.

Somatotropiny jsou užitečné pro zvýšení poměru libového masa k tučnému, ke zvýšení účinnosti krmivá a produkce mléka u různých druhů savců včetně dobytka (tj. krav určených pro mléko), ovcí, koz a prasnic.

Zpozorování injekčních prostředků obsahujících somatotropin připravených způsobem podle vynálezu plyne, že v některých případech se podstatné množství přítomného polypeptidu uvolňuje již před injekcí. Tento jev se v angličtině označuje jako „burst“, v němž se předpokládá, že pochází z plochy povrchu při podání injekce nebo při jiném podání. V některých případech může být případný „burst“ žádoucí, např. pro aktivaci požadovaného biologického účinku.

Charakteristikou použitelnou pro formulaci prostředků podle tohoto vynálezu je vzájemný vztah hladiny původního „burstu“ stanovené změřením koncentrace v séru léčeného zvířete krátce po

-4CZ 284472 B6 podání k hladině prodlouženého uvolnění stanovené změřením koncentrace polypeptidu v séru zvířete později. Pro účely tohoto vynálezu hladina „burstu“ znamená koncentraci somatotropinu v séru 24 hodin po injekci, hladina prodlouženého uvolňování znamená pak koncentraci somatotropinu v séru 14 dnů po injekci. Tato koncentrace se používá k výpočtu poměru „burstu“ k prodlouženému uvolňování, který je obvykle považován za žádoucí mezi asi 1,2 a asi 6, přesněji mezi asi 1,5 a 3.

Další užitečnou vlastností při hodnocení a formulaci prostředků připravených způsobem podle vynálezu je „injektovatelnost“ - míra toho, jak dobře prostředek protéká hypodermickou injekční jehlou. Jestliže jsou částice somatotropinu příliš velké, nebo jestliže je prostředek příliš viskózní, může být pro protlačení prostředku injekční jehlou potřeba neobvyklý tlak. Pro účely tohoto vynálezu se „injektovatelnost“ stanovuje tím, že se změří čas projití jistého objemu prostředku hypodermickou jehlou (457,2 gm, 18 gauge) o vnitřním průměru 0,838 mm a délce 4 cm při tlaku 1193 Pa, který se působí na prostředek ve stříkačce s jehlou. Je žádoucí, aby „injektovatelnost“ prostředků podle tohoto vynálezu byla alespoň 0,03 mililitru za sekundu (ml/s). Výhodná injektovatelnost je vyšší, např. alespoň asi 0,1 ml/s nebo výhodněji alespoň asi 0,3 ml/s.

Prostředky podle předloženého vynálezu se mohou připravovat přidáním somatotropinu ksamotnému oleji nebo koleji s hydratačním činidlem suspendovaným nebo rozpuštěným v oleji. Často je výhodné rozpustit protihydratační činidlo za vzniku oleje ve formě gelu. Jestliže se prostředky podle vynálezu připravují postupem začínajícím tvorbou gelovaného oleje, koleji se přidá činidlo tvořící gel, jako je například hlinitá sůl mastné kyseliny, jako prášek. Mícháním se vytvoří suspenze tohoto prášku. Může být žádoucí, aby se míchaná suspenze zahřála na alespoň teplotu tání soli mastné kyseliny (např. alespoň 155 °C pro AI MS), při níž se sůl rozpustí voleji. Jestliže se činidlo tvořící gel nebo jiné protihydratační činidlo dostatečně rozpouští, lze použít nižších teplot. Rádné a neustálé míchání pomáhá tomu, že nedochází k aglomeraci soli mastné kyseliny a že se udržuje disperze. V zahřívání a míchání by se mělo pokračovat tak dlouho, dokud se suspendovaná sůl úplně nerozpustí. Často je žádoucí, aby se v míchání pokračovalo ještě po delší dobu, aby bylo zajištěno úplné rozpuštění. Olejový roztok soli mastné kyseliny se pak může ochladit např. na teplotu místnosti, při čemž se získá dosti stabilní gelová struktura. Gel by se měl uchovávat ve vakuu nebo nad sušidlem, aby se zabránilo kontaminaci vodou, která by mohla nepříznivě ovlivnit strukturu gelu.

Polypeptid se pak koleji může přidat za jakékoliv teploty (například za teploty místnosti), při které nedochází k nepřijatelně nepříznivým účinkům (např. k denaturaci). Například hovězí somatotropin se může k takovému oleji přidávat při teplotách od asi 4 °C do asi 125 °C, aniž by byla nepříznivě ovlivněna biologická účinnost. Toto přidání somatotropinu se s výhodou provádí ve vaku, čímž se zamezí kontaminaci vodou nebo bublinkami vzduchu. Přidání se s výhodou provádí tak, že se jemně rozemletý somatotropin přidává k oleji za intenzivního míchání velkým nůžkovým míchadlem. Dojde tak ke stejnoměrné disperzi částic polypeptidu. Často bývá důležité zmenšit velikost částic. To se dá provést například použitím kulového mlýna, v němž se suspenze somatotropinu smíchá s kuličkami z nerezavějící oceli, které mají průměr např. 0,3 až 0,6 cm. Tato úprava se s výhodou provádí současně s dispergováním v dolní části nádobky, v níž dochází k intenzivnímu míchání velkým nůžkovým míchadlem. Takový postup je zvláště výhodný u polypeptidů s velkým nábojem, u nichž se střední velikost částic obtížně zmenšuje na velikost ne větší než asi 15 mikrometrů, tj. 50 % částic má průměr ne větší než asi 15 μηι. Bylo zjištěno, že pro zvýšení injektovatelnosti prostředků podle vynálezu je žádoucí, aby se používaly polypeptidy o malé velikosti částic (např. částice o střední velikosti ne více než asi 10 gm v průměru, s výhodou o průměru ne větším než asi 5 mikrometrů). Použitím kulového mlýnu se částice polypeptidu mohou vhodně zmenšit až na částice o výhodném středním průměru ne větším než asi 5 gm. Prostředek podle tohoto vynálezu se pak z kulového mlýna izoluje filtrací (s výhodou ve vakuu).

-5CZ 284472 B6

V mnoha uspořádáních podle předloženého vynálezu se polypeptid podává v takové formě, že není chemicky vázán s jinou látkou. V mnoha jiných případech se polypeptid s výhodou používá v takové formě (např. chemicky vázaný s jinou látkou), v níž je podstatně méně rozpustný ve vodných (např. zvířecích tělesných) tekutinách než nevázaný polypeptid. Například polypeptid může být převážně (např. úplně) chemicky asociován s netoxickým kovem nebo v esterové, amidové či jiné formě (formách), které mají žádanou bioaktivitu a nemají nepřijatelné vedlejší účinky. Jestliže je s takovým kovem chemicky asociován, může být kov přítomen jako takový (např. v soli polypeptidu s kovem nebo komplexu s polypeptidem) nebo jako sůl či komplex kovu s jedním nebo s více jinými aionty.

I když se v některých prostředcích podle vynálezu s výhodou používají jednomocné kovy (například sodík nebo draslík), v mnoha jiných případech se s výhodou používají vícemocné kovy, mezi něž patří například zinek, železo, vápník, vismut, baryum, hořčík, mangan, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium a podobné kovy.

Jak bylo shora uvedeno, prostředky obsahující somatotropin podle předloženého vynálezu se výhodně používají při parenterálním podání, např. intraperitoneální injekcí, obvykle je více žádoucí podávání podkožní nebo vnitrosvalové. Trvání prodlouženého uvolňování je doba, během níž je polypeptid podáván rychlostí, která je potřebná pro biologický účinek. Tato rychlost se typicky udává koncentrací somatotropinu v krevním oběhu živočicha. Je žádoucí, aby doba uvolňování byla alespoň 7 dnů. V jiných případech může být alespoň asi 15 dnů, u mnoha aplikací je více žádoucí, aby tato doba byla alespoň asi 30 dnů nebo dokonce alespoň asi 60 dnů či déle. Bylo zjištěno, že prostředky obsahující hovězí somatotropin asociovaný se zinkem, přetrvávají v séru laktujících krav po injekční dávce 2,5 ml po dobu alespoň asi 7 dnů. Průměrná koncentrace hovězího somatotropinu je alespoň asi 12 h g/ml. Taková koncentrace je vysoce výhodná pro zvýšení produkce mléka a/nebo pro účinnost konverze krmivá na mléko u hovězího dobytka. Efektivní dávka hovězího somatotropinu pro krávy produkující mléko, např. pro zvýšení produkce mléka, je alespoň asi 300 mg somatotropinu asociovaného se zinkem, čímž se zvýší hladina aktivního hovězího somatotropinu v séru po dobu alespoň asi 15 dnů. Důležitým lákavým rysem tohoto vynálezu je to, že somatotropin asociovaný se zinkem je s výhodou přítomný v dostatečně vysoké koncentraci (např. alespoň asi 15%). To umožňuje používat výhodně malý objem prostředku (asi kolem 10 ml i méně) a tedy snažší podávání.

K prostředku se ovšem mohou přidávat i jiné materiály, za předpokladu, že takové materiály neinhibují nepřijatelně nežádoucí prodloužené uvolňování polypeptidu v účinných hladinách. Může být například žádoucí přidat k prostředku připravenému způsobem podle vynálezu protizánětlivá nebo jiná aditiva a tak snížit, předcházet nebo působit proti účinkům reakce (např. nealergické) na cizí těleso. Takovými aditivy mohou být steroidní a/nebo nesteroidní protizánětlivá činidla, která jsou v prostředku obsažena s výhodou v hladinách dostatečně nízkých tak, aby nedocházelo k systémovému účinku, ale postačujících pro to, aby byla účinná při potírání zánětu.

Podle čistoty použitého polypeptidu může být žádoucí depyrogenace a/nebo sterilizace. Pyrogeny (např. endotoxiny), pokud jsou přítomné, lze odstranit uvedením polypeptidu do kontaktu s iontoměničem. Většina pyrogenů se váže na pozitivně nabitá místa, např. na katex. Některé pyrogeny se mohou vázat na negativně nabitá místa. Pro zajištění dostatečného odstranění pyrogenů je pak užitečné použít směs iontoměničů. Polypeptidový roztok se může sterilizovat. Filtrací jemných filtrem např. filtrem o velikosti pórů 0,2 μιη, se odstraní nesterilní cizí tělesa, jako jsou například bakterie nebo příměsi z předcházejících postupů.

V dále uvedených příkladech jsou uváděné díly hmotnostní a teplota je uváděna ve °C pokud není uvedeno jinak.

-6CZ 284472 B6

Příklady slouží k bližšímu objasnění způsobu podle vynálezu a předložený vynález nijak neomezují.

Příklady provedení

Příklad 1

Příprava hovězího somatotropinu asociovaného se zinkem

Hovězí somatotropin s methioninem na N-konci (MBS) byl připraven postupem, který popisuje Seeburg a spol. v „Efficient Bacterial Expression of Bovine and Porcine Growth Hormone“ 2(1), DNA 37 až 45 (1983). Tato citace je zařazena v textu jako odkaz. Somatotropin se izoluje v použitelné formě lysí bakteriálních buněk, načež se samototropin oddělí od zbytků bakteriálních buněk.

Podle jednoho způsobu se MBS izoluje tak, že se bakterie působením 50% kyseliny sírové, která sníží pH fermentačního prostředí, zabíjí. Živný roztok se zneutralizuje působením hydroxidu sodného a odstředí. Získá se buněčná pasta, která se suspenduje v močovině, zhomogenizuje, ochladí asi na 4 °C (tato teplota se udržuje až do dále uvedené lyofilizace MBS), odstředí, třikrát promyje, rozpustí v hydrochloridu guanidinu (7M) a odstředěním se odstraní nerozpustný materiál. Roztok se zfiltruje, nechá projít kolonou se Sephadexem G 25, na níž se guanidin vymění za močovinu, opět se zfiltruje a nechá se projít kolonou iontoměniče DE52. Objem eluentu se ultrafiltrací dutými vlákny sníží asi 30x. Koncentrovaný roztok se nechá projít chromatografickou kolonou se Sephadexem G75, následuje další stupeň zmenšování objemu dutými vlákny, pak se dialýzou vymění močovina na roztok hydrogenuhličitanu sodného a nakonec se MBS vysráží destilovanou vodou. Sraženina se lyofilizuje. Zůstane bílá pevná látka (nepatrně rozpustná ve vodě) obsahující polypeptid (MBS) s aminokyselinovou sekvencí NH₂met-phe(l)-pro(2)-...leu(126)...phe(190)-COOH, která byla získaná extrasí ve shora uvedené publikaci Seeburga a spol.

Tento MBS se rozpustí ve 4,5M močovině, 0,09M roztoku TRIS, tak, aby koncentrace byla 21,5 mg MBS na mililitr při 4 °C a pH 9,5. Roztok MBS se depyrogenuje smícháním s 0,2 g směsi kuliček anexu a katexu (Biorad AG-501X8) s každým mililitrem sterilního roztoku MBS. Směs se míchá asi 10 minut při 4 °C. Pak se zfiltruje 1 pm nylonovým filtrem, aby se odstranily perličky obsahující adsorbované pyrogeny.

Depyrogenovaný MBS se steriluje tím, že se roztok nechá projít radiačně sterilovaným skládaným filtrem s otvory 0,2 pm. Tím se odstraní nesterilní cizí tělesa, jako jsou například bakterie nebo nečistoty z předcházejících procesů.

Přidáním 1M chloridu zinečnatého za míchání k depyrogenovanému roztoku MS se převede MBS na zinečnatou sůl (ZnMBS). Vysrážená sůl ZnMBS obsahuje přibližně 1 % zinku. Roztok, který obsahuje částice ZnMBS se pak zředí sterilní depyrogenovanou vodou tak, aby koncentrace močoviny byla 1M.

ZnMBS se izoluje centrifugaci roztoku při 10 000 G po dobu 30 minut, přičemž se teplota roztoku udržuje na 4 °C. ZnMBS se suspenduje ve sterilní depyrogenované vodě v množství 50 mg ZnMBS/ml za použití velkého nůžkového míchadla. ZnMBS se opět izoluje centrifugaci při 10 000 G po dobu 30 minut, resuspenduje ve sterilní depyrogenované vodě sterilní

-7CZ 284472 B6 v množství 50 mg ZnMBS/ml opět za použití velkého nůžkového míchadla, načež se produkt lyofilizuje. Získá se bílý prachovitý prášek sterilního ZnMBS.

Příklad IA

Alternativní příprava ZnMBS.

Depyrogenovaný a sterilovaný roztok 21 mg MBS na mililitr ve 4,5M močovině a 0,05M TRIS se při 10°C a pH 8,8 nechá recirkulovat působením objemového čerpadla v zásobní nádrži. Do sací části čerpadla purmy se přidává 1M chlorid zinečnatý dokud roztok není 0,01M na chlorid zinečnatý, což má za důsledek vysrážení ZnMBS. Roztok se zředí vodou tak, aby obsahoval MBS v koncentraci 10 mg/ml, což vede k dalšímu srážení ZnMBS. Výsledná suspenze ZnMBS se pak recirkuluje při 25 °C diafiltrační membránou z dutých vláken s takovými póry, kterými projdou molekuly až do molekulové hmotnosti 100 000. Recirkulace se nechá probíhat dokud nedosáhne koncentrace MBS 40 mg/ml. Potom se přidá tolik vody, kolik odchází membránového filtrátu, a to tak dlouho, dokud se v podstatě všechen zinek, močovina a TRIS neodstraní ze suspenze. Přidávání vody se zastaví při koncentraci MBS asi 80 mg/ml. Koncentrovaná suspenze se pak lyofilizuje. Získá se suchý, bílý prášek ZnMBS s částicemi o velikosti v rozmezí od 0,5 do 11 pm.

Příklad IB

Příprava hovězího somatotropinu asociovaného se sodíkem

Depyrogenovaný a sterilovaný roztok 21,5 mg MBS na ml ve 4,5M močovině a 0,05M TRIS se při 4 1C a pH 9,5 dialyzuje. Nejdříve se vymění močovina za roztok hydrogenuhličitanu sodného, potom za destilovanou vodu. Výměna vody se zastaví, jakmile se MBS začne srážet. Roztok se pak zfiltruje 0,2 pm filtrátem. Získá se vysrážený MBS, který lyofilizací poskytne sodnou sůl (NaMBS). Tuto sůl lze použít v prostředcích podle vynálezu.

Příklad 2

Příprava prostředku obsahujícího samototropin asociovaný se zinkem

Do trojhrdlé baňky s kulatým dnem se dá sezamový olej (Fischer NF Grade). Koleji se přidá protihydratační činidlo (A1MS) do koncentrace 5% a sezamový olej. Baňka se přemístí do olejové lázně o teplotě 155 °C. Směs se míchá tak, aby se A1MS dispergoval co nejrychleji.

V míchání se pokračuje dvacet minut. Během této doby se A1MS v oleji úplně rozpustí. Baňka se z lázně odstraní, udržuje se pod vakuem a ochladí se na 25 °C. Ochlazením se z roztoku stane hustý gel. Hustý gel se přenese do kulového mlýna s velkým nůžkovým míchadlem a s kuličkami z nerezavějící oceli o průměrech 0,32, 0,48, 0,64 cm. Mlýn se připojí na vakům. Šroubovým podavačem se pomalu přidává prášek ZnMBS (který se připraví postupem podle příkladu 1) dokud prostředek neobsahuje 40% ZnMBS (hmotnostní poměr ZnMBS kAlMS je 13,3).

V míchání se pokračuje 6 hodin. Během této doby se průměr částic ZnMBS zmenší z 20 pm na 5 pm. Výsledná, v podstatě nevodná olejová emulze ZnMBS ve formě gelu se odfiltruje od nerez kuliček.

-8CZ 284472 B6

Příklad 3

Tento příklad ilustruje účinné použití prostředku připraveného způsobem podle vynálezu s prodlouženým uvolňováním polypeptidů, tj. hovězího somatotropinu, kterým se dosahuje zvýšení produkce mléka u taktujících krav chovaných na mléko.

Rozpuštěním 5 % A1MS v sezamovém oleji zahřátí na 155 °C se připraví v podstatě nevodný prostředek prakticky stejným způsobem jako v příkladu 2. Ochlazením oleje se vytvoří gel. ZnMBS se voleji disperguje a mele tak dlouho, pokud prostředek neobsahuje 32% ZnMBS v kontinuální fázi oleje (hmotnostní poměr ZnMBS k A1MS je 9,4). Injekční stříkačka s jehlou (457,2 pm, 18 gauge) dlouhou 3,8 cm se naplní 2,54 gramu (2,5 ml) prostředku, což je dávka, která obsahuje 805 mg ZnMBS. Prostředek má injektovatelnost 0,36 ml/s. Vedle toho se připraví slepý prostředek (tj. prostředek bez účinné látky) sestávající z 5 % A1MS v sezamovém oleji bez polypeptidů. Dávkou 2,4 g tohoto prostředku se naplní stejná injekční stříkačka.

Prostředky byly injekčně podány 23 kravám pěstovaným pro mléko (Holstein) v druhém nebo třetím trimestru jejich druhé (nebo následující laktace). Dobytek byl náhodně seskupen do 4 skupin po 5 nebo 6 kusech. Dvěma skupinám byly injekce podány intramuskulárně do hýžďové (gluteální) oblasti, jedné skupině byl podán prostředek obsahující ZnMBS a další (kontrolní) skupině byl podán slepý prostředek. Podobně bylo dvěma jiným skupinám podkožní injekcí (SQ) do oblasti nad lopatkou (supraskapulárně) podán prostředek, který obsahoval ZnMBS nebo slepý prostředek.

Souhrnné výsledky (metodou nejmenších čtverců) průměrné produkce mléka (upravené vzhledem k rozdílům v produkci mléka před podáním prostředku) jsou uvedeny v tabulce 1. Produkce mléka je vyjádřena v kg mléka za den. Jak je uvedeno v tabulce 1, jediná intramuskulární nebo podkožní injekce vhodně podaného prostředku připraveného způsobem podle vynálezu způsobí rychlé a prodloužené zlepšení produkce mléka při velmi vysokých hladinách statistického významu.

Tabulka 1

Souhrnně upravená průměrná denní produkce mléka (kg/den)

dávka	způsob podání	7 dnů	14 dnů	21 dnů	30 dnů
MP	%ctrl^{* (a)}	MP	%ctrl	MP	%ctrl	MP	%ctrl
Kontrola	IM	23,3		22,4		22,0		21,1
ZnMBS	IM	26,6	16,2	26,0	17,1	24,9	13,9	22,9	9,6
kontrola	SQ	22,5		21,1	-	21,8	-	20,6	-
ZnMBS	SQ	25,1	9,6	24,8	11,8	24,0	9,6	22,1	5,7

současně IM a SQ:

(1) kontrola	22,9	22,2	21,9	20,9	-
(2) ZnMBS	25,9 13,1	25,4	14,4 24,4	11,4 22,6	8,1

Významnost (2) proti (1):

0,001 0,0001 0,0004 0,0187 (a) %ctrl znamená procento zlepšení vzhledem k průměrné kontrolní odpovědi.

-9CZ 284472 B6

Vzorek krve byly analyzovány na hovězí somatotropin, který se bez podání podle tohoto vynálezu normálně vyskytuje v oběhových systémech hovězího dobytka. Reprezentativní analýzy radioimunotestem („RIA“) jsou uvedeny v tabulce 2. Koncentrace hovězího somatotropinu v krevním seru je uvedena v nanogramech v jednom mililitru.

Tabulka 2

Průměrná koncentrace hovězího somatotropinu v plazmě (ng/ml) dnů po __________intramuskulárně_______________________podkožně

injekci	kontrola	ZnMBS	kontrola	ZnMBS
0	6,7	5,9	5,1	5,7
1	6,5	8,4	4,6	8,7
2	7,8	9,0	4,3	H,1
3	7,1	9,1	4,0	10,1
4	7,5	10,1	4,5	9,8
5	8,1	12,0	3,1	H,2
6	8,1	18,2	3,9	H,9
7	8,0	21,2	3,6	12,9
9	7,9	21,3	6,6	16,5
11	6,8	18,2	5,2	16,6
13	7,6	16,7	5,2	17,5
15	7,0	16,2	5,4	15,7
17	5,6	12,9	4,1	11,7
19	5,4	13,8	4,4	12,0
21	6,0	11,2	4,3	10,0
23	5,7	10,6	5,3	9,5
25	5,6	9,8	4,4	9,0
27	5,8	8,4	4,9	8,5
29	3,5	6,8	1,1	7,4
30	3,8	5,9	2,5	67

Příklad 4

Tento příklad ilustruje účinnost prostředků připravených způsobem podle vynálezu na prodloužení uvolňování polypeptidů (MBS) u živočichů v závislosti na typu látek v prostředku.

V tomto příkladu byly prostředky se ZnMBS formulovány v podstatě tak, jak je popsáno v příkladu 3 kombinací následujících složek:

bioslučitelný olej: sezamové semeno nebo podzemnice olejná protihydratační činidlo: 3% nebo 5% A1MS v oleji náplň polypeptidů: 20 %, 30 % nebo 40 % ZnMBS z celkového prostředku.

A1MS se disperguje v oleji. Disperze se zahřeje na 155 °C a udržuje se na této teplotě 15 minut. Po ochlazení na 25 °C vznikne olej ve formě gelu. Přidá se ZnMBS a směs se disperguje mixerem s velkým nůžkovým míchadlem (Polytron Homogenizer), který vytvoří suspenzi ZnMBS s olejem ve formě gelu. Suspenzí se naplní tuberkulinové injekční stříkačky a hypodermickou jehlou (457,2 pm 18 gauge).

- 10CZ 284472 B6

Prostředky, které jsou uvedeny v tabulce 3, se podávají podkožní injekcí na dorsální (hřbetní) supraskapulární oblasti 16 skupinám 8 imunosuprimovaných krysích samiček Spraue - Dawley (IFS-D).

Tabulka 3 objem skupina dávky __________________injekční prostředky______________________________________ (μΐ) olej %AlMS^(a) % ZnMBS ZnMBS:AlMS (hmot, poměr)

1	200	sezamový	3	0	-
2	200	sezamový	3	20	8,3
3	130	sezamový	3	30	1,3
4	100	sezamový	3	40	22,2
5	200	sezamový	5	0	-
6	200	sezamový	5	20	5,0
7	130	sezamový	5	30	8,6
8	100	sezamový	5	40	13,3
9	200	podzemnicový	3	0	-
10	200	podzemnicový	3	20	8,3
11	130	podzemnicový	3	30	14,3
12	100	podzemnicový	3	40	22,2
13	200	podzemnicový	5	0	-
14	200	podzemnicový	5	20	5,0
15	130	podzemnicový	5	30	8,6
16	100	podzemnicový	5	40	13,3

^a) Vztaženo na hmotnost oleje plus AI MS.

Vzorky krve se analyzují RIA metodou na hovězí samototroin, údaje analýzy v tabulce 4 znamenají ng/ml krevní plasmy. Hladiny v plasmě vzorků krve, které jsou uvedeny v tabulce 4 znamenají hladiny před injekcí v den 0 (tj. v den podání injekce). Některá základní měření u krys v případech 4 až 7 jsou vyšší než některá základní měření a měření uvolňovaného polypeptidu u krav v přikladu 3. To je dáno zčásti mezidruhovými rozdíly v normálních hladinách somatotropinu a zčásti tím, že RIA metoda v příkladu 3 je přesnější.

- 11 CZ 284472 B6

Tabulka 4

Průměrné koncentrace hovězího somatotropinu v plasmě (ng/ml) skupina _______________________________počet dnů po injekci

	0	1	3	7	11	14	21	28	35
2	9	765	440	304	138	83	21	18	22
3	10	494	309	337	141	113	60	31	15
4	6	381	245	239	169	136	49	35	65
6	11	255	91	146 ·	119	86	49	40	48
7	6	338	194	181	203	141	83	44	53
8	6	468	258	151	134	149	103	48	35
10	6	735	470	255	152	94	32	25	10
11	6	582	391	221	166	134	47	30	32
12	11	753	361	224	171	146	72	41	52
14	7	383	178	143	95	77	41	34	29
15	8	479	246	183	197	215	106	67	70
16	7	413	281	146	142	135	66	39	49

(Průměrná zjištěná koncentrace pro kontrolní skupiny 1, 5, 9 a 13 se pohybovala od 5 do 12 ng/ml pro každý z výše uvedených dnů). _;

Příklad 5

Tento příklad ilustruje účinnost prostředků připravených způsobem podle vynálezu na prodloužení uvolňování polypeptidů (MBS) za použití hlinitých solí mastných kyselin jako protihydratačních činidel. Jako protihydratační činidlo se v těchto prostředcích používají monolauran hlinitý (A1ML) a monopalmitan hlinitý (A1MP) spolu se sezamovým a podzemnicovým olejem.

Oleje ve formě gelu, obsahující 3% A1ML nebo A1MP, se v tomto příkladu připravují v podstatě stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 4. ZnMBS se suspenduje v olejích ve formě gelu na koncentraci 30% z celkového prostředku (hmotnostní poměr ZnMBS kAIML nebo A1MP je 14,3). Prostředek se podává injekčně skupině 8 krys 1FS-D v dávkách uvedených v tabulce 5.

Tabulka 5

skupina	objem dávky (dl)	iniekčně Dodávané prostředky
olei	protihvdratační činidlo
17	130	sezamový	A1ML
18	130	sezamový	A1MP
19	130	podzemnicový	A1ML
20	130	podzemnicový	A1MP

Analýzou vzorků krve krys uvedený den po injekci se získají koncentrace hovězího somatotropinu, které jsou uvedeny v tabulce 6. Za základ pro analýzu je vzata hodnota v den nula.

- 12 CZ 284472 B6

Tabulka 6

Průměrné koncentrace hovězího somatotropinu v plasmě (ng/ml) skupina __________________počet dnů po podání injekce

	0	1	3	7	14	21
17	9	431	143	172	49	30
18	10	632	229	277	58	33
19	11	421	162	198	32	28
20	9	492	164	210	17	35

Příklad 6

Tento příklad ilustruje účinnost prostředků připravených způsobem podle vynálezu na prodloužení uvolňování polypeptidu (MBS) za použití olivového nebo kukuřičného oleje.

V tomto příkladu se oleje ve formě gelu připravují v podstatě stejným způsobem jako v příkladu 4 s použitím A1MS (vztaženo na součet A1MS plus olej). Dvěma skupinám 8 krys IFS-D se v dávkách které jsou uvedeny v tabulce 7, injekčně podávají 30% nebo 40% suspenze ZnMBS.

Tabulka Ί

skupina	objem dávky (μΐ)	injekčně podávané prostředky
olej	%ZnMBS	hmot, poměr ZnMBS:AlMS
21	100	olivový	40	22,2
22	130	kukuřičný	30	14,3

Analýzou vzorků krve krys uvedený den po podání injekce se získají koncentrace hovězího somatotropinu, které jsou uvedeny v tabulce 8. Za základ pro analýzu je vzata hodnota v den 0.

Tabulka 8

Průměr koncentrace hovězího Somatotropinu v plazmě (v ng/ml) ______________________počet dnů po podání injekce__________________________ skupina ______________0____________1____________4__________Π_________14________25

7 996 314 174 98 36

7 1314 444 158 98 35

Příklad 7

Tento příklad ilustruje prostředky, které obsahují asi 10% polypeptidu MBS a ZnMBS v podzemnicovém oleji. Tento příklad dále ilustruje, že prodloužený účinek polypeptidu lze zvýšit použitím polypeptidu asociovaného s kovem a použitím protihydratačního činidla. Prostředky v tabulce 9 pro injekční podávání se připravují v podstatě tak, jak je popsáno v příkladu 4.

- 13 CZ 284472 B6

Tabulka 9

Injekčně podávané prostředky

skupina	polypeptid	dávka polypeptidu (%)	olei	% AlMS^(a)
30	MBS	10	podzemnicový	-
31	ZnMBS	10	podzemnicový	-
32	MBS	10	podzemnicový	1
33	ZnMBS	10	podzemnicový	1

^(a) Vztaženo na součet hmotnosti oleje s A1MS.

Každý prostředek se podává podkožně skupinám 8 krys IFS-D v dávce 300 mikrolitrů. Analýzou vzorků krve krys uvedený den po injekci se získají koncentrace hovězího somatotropinu, které jsou uvedeny v tabulce 10. Za základ pro analýzu je vzata hodnota v den 0.

Tabulka 10

Průměrné koncentrace hovězího somatotropinu v plasmě (ng/ml) počet dnů po injekčním podání skupina

	0	1	3	5	7	11	14
30	14	1350	375	145	75	50	20
31	15	1800	310	240	200	40	20
32	12	1200	250	123	64	35	21
33	18	620	350	330	280	175	125

Ze srovnání výsledků pro skupinu 30 s výsledky skupiny 31 plyne, že použitím asociovaného vícemocného kovu se zvýší prodloužené uvolňování MBS alespoň o 7 dnů. Ze srovnání výsledků skupiny 32 se skupinou 33 plyne, že použitím protihydratačního činidla spolu s MBS s asociovaným vícemocným kovem dojde ke zvýšení prodloužení uvolňování MBS.

Příklad 8

Tento příklad ilustruje prostředky, které obsahují 10% hovězího somatotropinu bez protihydratačního činidla v následujících olejích: v sezamovém, podzemnicovém, kukuřičném, olivovém, saflorovém, voleji ze semen bavlníku, v palmovém, řepkovém a sojovém. Oleje se udržují na některé z následujících teplot 4 °C, 25 °C, 50 °C, 75 °C, 100 °C a 125 °C. ZnMBS se disperguje a mele jako v příkladu 2 dokud jeho koncentrace nedosáhne 10%. V mletí se pokračuje, dokud střední průměr částic somatotropinu není ne větší než 15 pm. Injektovatelnost každého ze zde připravených prostředků je větší než 0,1 ml/s.

Příklad 9

V tomto příkladu je ilustrována prostředky, které se připravují jako v příkladu 8 s tím, že se před přidáním somatotropinu A1MS disperguje v oleji na 5% koncentraci (vzhledem k součtu olej + A1MS). Injektovatelnost těchto prostředků je větší než 0,1 ml/s.

- 14CZ 284472 B6

Příklad 10

Tento příklad ilustruje prostředky, které se připravují jako v příkladu 8 stou výjimkou, že v přidávání somatotropinu se pokračuje tak dlouho, dokud prostředek neobsahuje 40 % hovězího somatotropinu. V dispergování a mletí se pokračuje dokud střední velikost průměru částic somatotropinu není větší než 15 pm. Injektovatelnost těchto prostředků je větší než 0,03 ml/s.

Příklad 11

V tomto příkladu jsou ilustrovány prostředky, které se připravují jako v příkladu 10 stím, že před předáním somatotropinu se AI MS disperguje v oleji na 5% koncentraci (vzhledem k součtu olej + A1MS). Injektovatelnost těchto prostředků je větší než 0,03 ml/s.

Příklad 12

Tento příklad ilustruje prostředky, které obsahují 10 % hovězího somatotropinu v následujících olejích: v sezamovém, kukuřičném, olivovém, saflorovém, voleji ze semen bavlníku, v palmovém, řepkovém a sojovém. Olej se zahřeje na 160 °C. Rozpouštění A1MS se usnadní mícháním. Po rozpuštění 1 % AI MS se olej ochladí na 25 °C. ZnMBS se disperguje a mele v ochlazeném oleji jako v příkladu 2, dokud koncentrace ZnMBS nedosáhne 10% a dokud střední průměr částic není menší než 15 pm; injektovatelnost těchto prostředků je větší než 0,1 ml/s.

Příklad 13

Tento příklad ilustruje prostředky, které se připravují jako v příkladu 12 stím, že v přidávání somatotropinu se pokračuje, dokud prostředek neobsahuje 40 % somatotropinu. Prostředky se melou jako v příkladu 2, dokud střední průměr částic není nejvýše 15 pm. Injektovatelnost prostředků podle tohoto příkladu je větší než 0,03 ml/s.

Příklad 14

Tento příklad ilustruje prostředky, které obsahují 10% hovězího somatotropinu v následujících olejích, v nichž je rozpuštěn A1MS na 5% koncentraci (vztaženo na součet oleje a A1MS): v sezamovém, sojovém, kukuřičném, saflorovém, v oleji ze semen bavlníku, v palmovém, řepkovém a podzemnicovém. Oleje se zahřívají na 160 °C. Rozpouštění A1MS se usnadní mícháním. Po rozpuštění AI MS se oleje ochladí na 25 °C. ZnMBS se pak disperguje a mele v ochlazeném oleji jako v příkladu 2, dokud koncentrace ZnMBS nedosáhne 10 % a dokud se střední průměr částic nezmenší na maximálně 15 pm. Injektovatelnost těchto prostředků je větší než 0,1 ml/s.

Příklad 15

Prostředky obsahující 42% hovězího somatotropinu se v tomto příkladu připravují tak, že se somatotropin nepřetržitě přidává k prostředkům podle příkladu 14, dokud prostředek neobsahuje 42 % somatotropinu. Somatotropin se disperguje a mele jako v příkladu 2 dokud střední průměr částic není maximálně 15 pm. Injektovatelnost každého prostředkuje větší než 0,03 ml/s.

- 15 CZ 284472 B6

Příklad 16

Tento příklad ilustruje prostředky, které obsahují 20% hovězího somatotropinu volejích podobně jako v příkladu 9 stím rozdílem, že A1MS je substituován jedním z následujících protihydratačních činidelidistearanem nebo tristearanem hlinitým, monopalmitanem, dipalmitanem, tripalmitanem nebo lauranem hlinitým, monostearanem, distearanem, lauranem nebo palmitanem hořečnatým a monostearanem, distearanem, lauranem nebo palmitanem vápenatým. Pře přidáním somatotropinu koleji se koleji přidá proti hydratační činidlo ZnMBS se přidává jako v příkladu 2, dokud jeho koncentrace není 20 %. V dispergování a mletí se pokračuje dokud střední průměr částic somatotropinu není maximálně 15 pm. Injektovatelnost každého prostředku je větší než 0,03 ml/s.

Příklad 17

Tento příklad ilustruje prostředek obsahující jiné koncentrace hovězího somatotropinu v olejích podobně jako v příkladu 20, kde se používají oleje jako v příkladu 16 stou výjimkou, že v přidávání somatotropinu se pokračuje tak dlouho, dokud jeho koncentrace nedosáhne 25 %, 30 % nebo 35 %. V dispergování a mletí se pokračuje dokud střední průměr částic somatotropinu není maximálně 15 pm. Injektovatelnost každého prostředkuje větší než 0,03 ml/s.

Příklad 18

Jestliže se hovězí somatotropin používá buď jako chemické individuum, neboje asociován se sodnými či draselnými ionty, získané výsledky jsou v podstatě stejné jako v příkladech 8 až 17.

Příklad 19

Jestliže se používají jiné hovězí somatotropiny, např. somatotropiny s následujícími aminokyselinovými sekvencemi:

NH₂-met-phe( 1 )-pro(2)....val( 126).....phe( 190)-COOH,

NH₂-ala-phe( 1 )-pro(2) val( 126) phe( 190)-COOH,

NH₂-ala-phe( 1 )-pro(2) Ieu( 126) phe( 190)-COOH,

NH₂-phe( 1 }-pro(2) Ieu( 126) phe (190)-COOH,

NH₂-phe( 1 )-pro(2).....val( 126).....phe (190)-COOH,

NH₂-met-asp-glu-phe( 1 )-pro(2).....leu( 126).....phe( 190)-COOH,

NH₂-met-asp-glu-phe( 1 )-pro(2).....val( 126).....phe( 190)-COOH,

NH₂-met(4) leu( 126) phe( 190}-COOH, nebo

NH₂-met(4) val(126) phe(190)-COOH, získají se výsledky stejné jako v příkladech 8 až 18.

Příklad 20 až 30

Jestliže se místo hovězího somatotropinu v postupech podle příkladu 8 až 18 používá vepřový somatotropin, získají se v podstatě shodné výsledky díky podobnosti hovězího a vepřového somatotropinu.

- 16CZ 284472 B6

I když jsou zde popsány specifické příklady podle tohoto vynálezu, pracovníkům v oboru je zřejmé, že lze vytvořit jejich různé modifikace v rámci rozsahu vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Nevodný prostředek na somatotropinové bázi pro parenterální podávání, popřípadě prodlouženě uvolňující biologicky účinný somatotropin do oběhového systému zvířat po parenterálním podání, který je vhodný například pro zvýšení poměru libového masa k tučnému masu, ke zvýšení využitelnosti krmiv a zvýšení mléka v případě různých druhů savců včetně dobytka jako skotu, ovcí, koz a vepřů.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Nevodný prostředek na somatotropinové bázi pro parenterální podávání, popřípadě prodlouženě uvolňující biologicky účinný somatotropin do oběhového systému zvířat po parenterálním podávání, vyznačující se tím, že vztaženo na prostředek jako celek, obsahuje alespoň hmotnostně 10% somatotropinu a jakožto kontinuální fázi biokompatibilní olej.

2, Nevodný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jakožto somatotropin obsahuje hovězí somatotropin.

3. Nevodný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jakožto somatotropin obsahuje vepřový somatotropin.

4. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že vztaženo na prostředek jako celek, obsahuje alespoň hmotnostně 15 % somatotropinu.

5. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 4, vyznačující se t í m , že vztaženo na prostředek jako celek, obsahuje hmotnostně 15 až 42 % somatotropinu.

6. Nevodný prostředek podle nároků laž5, vyznačující se tím, že vztaženo na prostředek jako celek, obsahuje hmotnostně alespoň 20 % somatotropinu.

7. Nevodný prostředek podle nároků laž6, vyznačující se tím, že vztaženo na prostředek jako celek obsahuje hmotnostně alespoň 1 % antihydratačního činidla.

8. Nevodný prostředek podle nároků 7, vyznačující se tím, že jako antihydratační činidlo obsahuje hlinitou vápenatou nebo horečnatou sůl mastné kyseliny s 8 až 22 atomy uhlíku.

9. Nevodný prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje sůl mastné kyseliny, volené ze souboru zahrnujícího kyselinu stearovou, palmitovou, laurovou a jejich směsi.

10. Nevodný prostředek podle nároků 7, 8 nebo 9, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr somatotropinu k antihydratačnímu činidlu je alespoň 1.

- 17CZ 284472 B6

11. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že somatotropin je asociován s netoxickým kovovým iontem.

12. Nevodný prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že kov je volen ze souboru zahrnujícího zinek, sodík, draslík, železo, vápník, bismut, baryum, hořčík, mangan, hliník, měď, kobalt, nikl a kadmium.

13. Nevodný prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že kovem je zinek.

14. Nevodný prostředek podle nároku 12, vyznačující se tím, že kovem je sodík nebo draslík.

15. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že má vstřikovatelnost alespoň 0,03 ml/s, přičemž vstřikovatelností se rozumí objem prostředku v ml, procházející hypodermickou jehlou o vnitřním průměru 0,838 mm a o délce 4 cm za sekundu za tlaku 1193 kPa na prostředek v jehle.

16. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že somatotropin má průměr částic nejvýše 15 mikrometrů.

17. Nevodný prostředek podle nároků lažló, vyznačující se tím, že samototropin má průměr částic nejvýše 10 mikrometrů.

18. Nevodný prostředek podle nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že olej je volen ze souboru zahrnujícího olej kukuřičný, podzemnicový, sesamový, olivový, světlicový, sojový, bavlníkových semen, řepkový a jejich směsi.

19. Nevodný prostředek na somatotropinové bázi pro parenterální podávání, vyznačující se tím, že vztaženo na prostředek jako celek, obsahuje hmotnostně 15 až 42% hovězího somatotropinu o průměru částic nejvýše 10 mikrometrů, 2 až 5 % monostearátu nebo distearátu hlinitého a jako kontinuální fázi biokompatibilní rostlinný olej za hmotnostního poměru somatotropinu ke stearátu alespoň 3.

20. Nevodný prostředek podle nároku 19, vyznačující se tím, že somatotropin je chemicky asociován se zinkem.

21. Nevodný prostředek podle nároků 19 a 20, vyznačující se tím, že má střední průměr částic nejvýše 5 mikrometrů.