CN1541098A - 用于癌症治疗的联合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用蛋白酪氨酸激酶抑制剂结合环氧合酶抑制剂，尤其环氧合酶－2选择性抑制剂治疗或预防瘤形成病症的方法。

Description

用于癌症治疗的联合疗法
                      发明背景
发明领域
本发明涉及使用蛋白酪氨酸激酶抑制剂结合环氧合酶抑制剂，尤其环氧合酶-2选择性抑制剂治疗或预防瘤形成病症的方法。
现有技术状态
新生物或肿瘤是异常性失控性和紊乱性细胞生长增殖。如果新生物具有破坏性生长、侵入性和转移的特性，则是恶性的或癌性的。侵入性指新生物通过浸润或破坏周围组织局部扩散，典型地突破限定组织边界的基底层，因此常常进入机体的循环系统。转移典型地指肿瘤细胞通过淋巴管或血管扩散。转移还指肿瘤细胞通过直接扩散穿过浆膜腔或蛛网膜下腔或其他的腔隙的移植。通过转移过程，肿瘤细胞移植到身体其他部位，在远离原发部位的地方生长新生物。
在美国癌症现在位居导致死亡原因的第二位，并且在美国已经有超过8,000,000人诊断为癌症。1995年，癌症占美国总死亡的23.3％。(参见U.S.Dept.of Health and Human Services，National Centerfor Health Statistics，Health United States 1996-97 and InjuryChartbook 117(1997))。
在分子水平上癌症未完全了解。已知细胞与致癌物诸如某些病毒、某些化学物质或放射线接触导致“抑制”基因灭活或“癌基因”活化的DNA改变。抑制基因是生长调节基因，该基因突变可不再控制细胞生长。癌基因起初是正常基因(称为原癌基因)，通过突变或表达顺序(context)改变成为转化基因(transforming genes)。转化基因的产物引起不适当的细胞生长。超过20个不同的正常细胞基因可通过基因改变变成癌基因。转化细胞与正常细胞在很多方面不同，包括细胞形态学、细胞对细胞相互作用、膜内含物、细胞支架结构、蛋白质分泌、基因表达和死亡率(转化细胞可无限生长)。
现在癌症主要用一种或结合三种治疗方法治疗：手术、放射线和化学疗法。手术包括大量切除患病组织。当手术切除位于特定部位例如乳腺、结肠和皮肤的肿瘤有时有效的同时，其不能用于治疗位于其他区域诸如脊椎的肿瘤，也不能用于治疗散布的瘤疾病诸如白血病。
化学疗法包括破坏细胞复制或细胞代谢。它最常用于治疗乳腺、肺和睾丸的癌症。
在治疗肿瘤疾病中使用的系统化疗的副作用是经历癌症治疗的患者最害怕的。在这些副作用中恶心和呕吐是最常见和最严重的副作用。其他副作用包括在接受伴骨髓援救的大剂量化疗或放射治疗的患者中的血细胞减少、感染、恶病质、粘膜炎；脱发(头发减少)；皮肤并发症(参见M.D.Abeloff，et al：Alopecia and CutaneousComplications.P.755-56.In Abeloff，M.D.Armitage，J.O.，Lichter，A.S.，and Niederhuber，J.E.(eds)Clinical Oncology.Churchill Livingston，New York，1992，for cutaneous reactionsto chemotherapy agents)，诸如瘙痒症(pruritis)、荨麻疹、血管神经性水肿；神经系统并发症；在接受放疗或化疗患者中的肺和心脏并发症；和生殖和内分泌并发症。
化疗引起的副作用明显影响患者的生活质量并可显著影响患者治疗的依从性。
另外，化疗药相关的副作用通常是在施用这些药物中的主要的剂量限制性毒性(DLT)。例如，粘膜炎是数种抗癌药包括抗代谢细胞毒药物5-FU、甲氨蝶呤和抗肿瘤抗生素诸如阿霉素的主要剂量限制性毒性之一。许多这些化疗引起的副作用如果严重，可导致住院治疗或要求止痛剂治疗疼痛。
化疗药和放射治疗引起的副作用对癌症患者临床管理已经非常重要。
当前，科学家们正在寻求通过使用抗血管生成药治疗癌症。据信血管生成是肿瘤获得所需营养以生长并转移到身体其他部位经由的机制。抗血管生成药干预这些过程并破坏或控制肿瘤。
例如，第5,854,205号美国专利描述了为内皮细胞增殖和血管生成抑制剂的独立endostatin蛋白；第5,843,925号美国专利描述了用7-[取代的氨基]-9-[取代的甘氨酰基酰胺基(glycyloamido)]-6-去甲基-6-脱氧四环素抑制血管生成和内皮细胞增殖的方法；第5,861,372号美国专利描述了聚集内皮抑制剂angiostatin的用途，且其用于抑制血管生成；PCT/GB97/00650描述了用于产生抗血管生成的和/或血管渗透性减少的作用的噌啉衍生物的用途；Tai-Ping，D.描述了潜在的抗血管生成疗法，参见Trends Pharmacol.Sci.16，No.2，57-66，1995；Lode，H.et al.描述了在抗血管生成整合素αv拮抗剂和抗体-细胞因子融合(fusion)蛋白之间的协同作用根除自发的肿瘤转移，参见Proc.Nat.Acad.Sci.USA.，96(4)，1591-1596，1999；Giannis，A.等描述了整合素拮抗剂和其他低分子量化合物如血管生成抑制剂，参见New drugs in cancer therapy.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.36(6)，588-590，1997；WO 97/41,844描述了联合应用angiostatic化合物预防和/或治疗人类患者新血管形成的方法；WO98/22,101描述了使用[pyrozol-1-基]苯磺酰胺作为抗血管生成剂的方法；和美国5,792,783号专利描述了用于治疗多种癌症作为蛋白激酶抑制剂和抗血管生成剂的3-杂芳基-2-吲哚满酮。
近来据报道以环氧合酶-2选择性抑制剂特别是Celecoxib_，与ART-2抑制剂特别是Herceptin_结合治疗结肠直肠癌比单独应用其中一种制剂时更有效。因此，有需要发现当一起应用时比单独应用时更有效的化疗药的新联合。本发明满足这种需要。
                      发明概述
一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用与环氧合酶抑制剂结合的治疗有效量的式(I)的蛋白激酶抑制剂：
Figure A0281591200321
其中：
R选自氢、哌嗪-1-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基甲基、哌啶-1-基甲基、2-羟甲基吡咯烷-1-基甲基、2-羧基吡咯烷-1-基甲基和吡咯烷-1-基甲基组成的组；
R1选自氢、卤、烷基、取代的烷基环烷基、取代的环烷基(cyclkoalkyl)、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、-C(O)NR8R9、-NR13R14、-(CO)R15和-(CH2)rR16组成的组；
R2选自氢、卤、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR13R14、-NR13C(O)R14、-C(O)R15、芳基、杂芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、芳基、杂芳基、-NR13R14、-NR13S(O)2R14、-S(O)2NR13R14、-NR13C(O)R14、-NR13C(O)OR14、-(CO)R15和-SO2R19组成的组；
R4选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基和-NR13R14组成的组；
R5选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R6选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R7选自氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R17和-C(O)R10组成的组，条件是当R是氢那么至少R5、R6和R7之一是-C(O)R10；或R6和R7可结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-和-(CH2)6-组成的组中的基团；
R8和R9独立地选自氢、烷基、取代的烷基和芳基组成的组；
R10选自羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R11)(亚烷基)nR12组成的组，其中亚烷基是以羟基和-NR13R14任选取代的；
R11选自氢、烷基和取代的烷基组成的组；
R12选自-NR13R14、羟基、-C(O)R15、芳基、杂芳基、-N+(O-)R13R14、-N(OH)R13和-NHC(O)R18组成的组(其中R18是烷基、取代的烷基、卤烷基或芳烷基)；
R13和R14独立地选自氢、烷基、取代的烷基、以羟基烷基氨基取代的低级烷基、氰基烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或
R13和R14可结合形成杂环基；
R15选自氢、羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；
R16选自羟基、-NR13R14、-C(O)R15和-C(O)NR13R14组成的组；
R17选自烷基、取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；
R19选自烷基、取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基组成的组；且
n和r独立地是1、2、3或4。或其可药用盐。
优选地，式(I)的蛋白激酶抑制剂用于与选自下列组的选择性环氧合酶-2抑制剂或其可药用盐结合：
(i)式(II)的化合物：
其中：
G选自O、S和-NRa-组成的组，其中Ra是氢或烷基；
R10a选自氢和芳基组成的组；
R11a选自羧基、烷基、芳烷基、氨基羰基、烷基磺酰氨基羰基和烷氧基羰基组成的组；
R12a选自卤烷基、烷基、芳烷基、环烷基和以一种或多种选自烷基硫基、硝基和烷基磺酰基的基团任选取代的芳基组成的组；和
R13a是独立地选自氢、卤、烷基、芳烷基、烷氧基、杂芳氧基、芳烷基氧基、杂芳烷基氧基、卤烷基、卤烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、硝基、氨基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基、杂芳烷基氨基磺酰基、杂环磺酰基、烷基磺酰基、羟基芳基羰基、硝基芳基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、芳基羰基、氨基羰基和烷基羰基的一种或多种基团；
或R13a与E环一起形成萘环；或
(ii)式(III)的化合物：
其中：
A选自部分未饱和的或未饱和的杂环基和部分未饱和的或未饱和的碳环；
R1b选自杂环基、环烷基、环烯基和芳基组成的组，其中R1b在可取代的位置是以独立地选自烷基、卤烷基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羟基、羟基烷基、卤烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、硝基、烷氧基烷基、烷基亚硫酰基、卤、烷氧基和烷基硫基的一种或多种基团任选取代的；
R2b选自甲基和氨基组成的组；且
R3b选自由选自氢、卤、烷基、链烯基、炔基、氧、氰基、羧基、氰基烷基、杂环基氧基(heterocyclyloxy)、烷基氧基、烷基硫基、烷基羰基、环烷基、芳基、卤烷基、杂环基、环链烯基、芳烷基、杂环基烷基、酰基、烷基硫基烷基、羟基烷基、烷氧基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、芳链烯基、烷氧基烷基、芳基硫基烷基、芳氧基烷基、芳烷基硫基烷基、芳烷氧基烷基、烷氧基芳烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、氨基羰基烷基、烷基氨基羰基、N-芳基氨基羰基、N-烷基-N-芳基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、羧基烷基、烷基氨基、N-芳基氨基、N-芳烷基氨基、N-烷基-N-芳烷基氨基、N-烷基-N-芳基氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、N-芳基氨基烷基、N-芳烷基氨基烷基、N-烷基-N-芳烷基氨基烷基、N-烷基-N-芳基氨基烷基、芳氧基、芳烷氧基(aralkoxy)、芳基硫基、芳烷基硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、N-芳基氨基磺酰基、芳基磺酰基和N-烷基-N-芳基氨基磺酰基的基团组成的组。
优选地，将上述化合物作为含一种或多种上述化合物和可药用赋形剂的药物组合物施用。特别地，可将本发明的治疗剂制备成同时或不同时给予的分离的组合物，或者该治疗剂可作为单一组合物给予。
本发明的方法可用于治疗或预防瘤形成病症，包括肢端着色斑性黑素瘤、光化性角化病(actinic keratoses)、腺癌、囊性腺样癌(adenoid cycstic carcinoma)、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、前庭大腺癌(bartholin gland carcinoma)、基细胞癌、支气管腺癌、毛细管的(capillary)、类癌、癌、癌肉瘤、空洞的(cavernous)、胆管癌、软骨肉瘤(chondosarcoma)、脉络丛(choriod plexus)乳头状瘤/癌、清细胞癌、囊腺瘤、内胚层窦肿瘤(endodermal sinustumor)、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma)、室管膜的、上皮样的(epitheloid)、Ewing氏肉瘤、纤维层的、灶性结节性增生、胃泌素瘤、生殖细胞瘤、成胶质细胞瘤、高血糖素瘤、成血管细胞瘤(hemangiblastoma)、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛瘤、上皮内(intaepithelial)瘤、上皮间(interepithelial)鳞状细胞瘤、侵袭性鳞状细胞癌、大细胞癌、平滑肌肉瘤、恶性小痣、恶性黑素瘤、恶性间皮瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、脑(脊)膜的、间皮的、转移的癌、粘液性表皮样癌、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质的(oligodendroglial)、骨肉瘤、胰多肽、乳头状浆液腺癌(papillary serous adenocarcinoma)、松果体细胞、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺胚细胞瘤、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、间皮下的(submesothelial)、表面伸展的黑素瘤、未分化的癌、色素层黑素瘤、疣状癌、血管活性肠多肽瘤、高分化癌(well differentiated carcinoma)和Wilm’s瘤。
本发明的方法提供一种或多种好处。好处之一是将本发明的组合物、制剂和治疗在低剂量结合施用，即，比每个个体成分独自施用的临床情况中常规使用剂量低。
降低对哺乳动物施用本发明的化合物、组合物、制剂和治疗的剂量的好处包括减少与高剂量相关的副作用的发生率。例如，当与高剂量组所观察到的相比，通过降低化疗药诸如甲氨蝶呤的剂量，将导致恶心和呕吐的频率及严重性减少。当本发明的蛋白激酶抑制剂与环氧合酶抑制剂，特别是环氧合酶-2选择性抑制剂结合后预期有类似好处。
通过降低副作用的发生率，注意到经历癌症治疗的患者的生活质量的改善。降低副作用的发生率的其他好处包括改善患者依从性，减少需要治疗副作用的住院人数，减少治疗与副作用相关疼痛所需的止痛剂的施用。
所预期的另一个好处是当蛋白激酶抑制剂与环氧合酶抑制剂，优选环氧合酶-2选择性抑制剂结合施用比其中任何一种单独施用时的肿瘤抑制作用高。
本发明进一步包括含COX-2抑制剂和式(I)蛋白激酶抑制剂的试剂盒。
                    发明的详细描述
                        定义
除非另外注明，用在详述和权利要求书中的下列术语具有下述含义：
“烷基“指饱和脂肪族烃基包括有1-20个碳原子的直链和支链基团(无论什么时候，当本文中出现数字范围，例如“1-20”，意味着该基团，在此例中烷基可包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，一直到并且包括20个碳原子)。将包含1-4个碳原子的烷基称为低级烷基。当所述低级烷基缺少取代基，将它们称为低级烷基。更优选地，烷基是具有1-10个碳原子的中等大小的烷基例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最优选地，它是具有1-4个碳原子的低级烷基例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。
“取代的烷基”含义是以一种或多种，更优选地一种到三种，更加优选地一种或两种取代基取代如上述定义的烷基，所述取代基独立地选自卤；羟基；低级烷氧基；以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳基；以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳氧基；在环上有1-3个氮原子的6元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代环上的碳原子；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮原子；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元或6元杂脂环基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮(如果存在)原子；巯基(mercapto)；(低级烷基)硫基；以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳基硫基；氰基；酰基；硫代酰基；O-氨基甲酰；N-氨基甲酰；O-硫代氨基甲酰；N-硫代氨基甲酰；C-酰氨基；N-酰氨基；硝基；N-亚磺酰氨基；S-亚磺酰氨基；R18S(O)-；R18S(O)2-；-C(O)OR18；R18C(O)O-和-NR18R19，其中R18和R19独立地选自以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基任选取代的氢、低级烷基、三卤甲基、(C3-C6)环烷基、低级链烯基、低级炔基和芳基组成的组。
优选地，以一种或两种取代基取代烷基，所述取代基独立地选自下列组：羟基；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元或6元杂脂环基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮(如果存在)原子；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮原子；在环上有1-3个氮原子的6元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种、两种或三种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代环上的碳原子；或-NR18R19，其中R18和R19独立地选自氢、低级烷基。更加优选以一种或两种彼此独立的羟基、二甲基氨基、乙氨基、二乙氨基、二丙基氨基、吡咯烷子基、哌啶子基(piperidino)、吗啉代、哌嗪子基、4-低级烷基哌嗪子基、苯基、咪唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、噁唑基、三嗪基等取代基取代烷基。
“环烷基”指3-8元全碳单环、全碳5元/6元或6元/6元稠合双环或稠合多环(“稠合”环系统含义是系统中的每个环与系统中其他每个环共享相邻的一对碳原子)基，其中这些环中的一个或多个可包含一个或多个双键，但是这些环都不具有完全共轭的pi-电子系统。
环烷基的实例是但不限于环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、金刚烷、环庚烷、环庚三烯等。
“取代的环烷基”含义是以一种或多种，更优选一种或两种取代基取代如上述定义的环烷基，所述取代基独立地选自下列组：低级烷基；三卤烷基；卤；羟基；低级烷氧基；以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳基；以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳氧基；在环上有1-3个氮原子的6元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代环上的碳原子；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元杂芳基，以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮原子；具有选自氮、氧和硫组成的组中的1-3个杂原子的5元或6元杂脂环基，以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代该基团中的碳和氮(如果存在)原子；巯基；(低级烷基)硫基；以一种或多种基团，优选一种或两种彼此独立为卤、羟基、低级烷基或低级烷氧基的基团任选取代的芳基硫基；氰基；酰基；硫代酰基；O-氨基甲酰；N-氨基甲酰；O-硫代氨基甲酰；N-硫代氨基甲酰；C-酰氨基；N-酰氨基；硝基；N-亚磺酰氨基；S-亚磺酰氨基；R18S(O)-；R18S(O)2-；-C(O)OR18；R18C(O)O-和-NR18R19如上述定义。
“链烯基”指低级烷基，如本文所定义，由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成。典型的实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等。
“炔基”指低级烷基，如本文所定义，由至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成。典型的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。
“芳基”指含具有完全共轭的pi-电子系统的1-12个碳原子的全碳单环或稠合多环(即，共享相邻碳原子对的环)基。芳基的实例是但不限于苯基、萘基和蒽基。这些芳基可以是取代的或未取代的。当其是取代的，取代基优选为一种或多种，更优选一种、两种或三种，更加优选一种或两种，独立地选自下列组：低级烷基、三卤烷基、卤、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、R18S(O)-、R18S(O)2-、-C(O)OR18、R18C(O)O-和-NR18R19，R18和R19如上述定义。优选地，芳基是以独立地选自卤、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基、或N-亚磺酰氨基组成的组中的一种或两种取代基任选取代的。
“杂芳基”指具有5-12个环原子的单环或稠合环(即，共享相邻的原子对的环)基，所述环原子含一个、两个或三个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子为C，并且，另外具有完全共轭的pi-电子系统。未取代的杂芳基团的实例是，但不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤和咔唑。杂芳基可以是取代的或未取代的。当其是取代的，取代基优选为一种或多种，更优选一种、两种或三种，更加优选一种或两种，独立地选自下列组：低级烷基、三卤烷基、卤、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、R18S(O)-、R18S(O)2-、-C(O)OR18、R18C(O)O-和-NR18R19，R18和R19如上述定义。优选地，杂芳基是以独立地选自卤、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基、或N-亚磺酰氨基组成的组中的一种或两种取代基任选取代的。
“杂脂环”指在环中有5-9个环原子的单环或稠合环基，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n(这里n是0-2的整数)的杂原子，其余的环原子是C。这些环还可有一个或多个双键。然而，这些环不具有完全共轭的pi-电子系统。未取代的杂脂环基的实例是，但不限于吡咯烷子基、哌啶子基、哌嗪子基、吗啉代、硫代吗啉代、高哌嗪子基(homopiperazino)等。杂脂环可以是取代的或未取代的。当其是取代的，取代基优选为一种或多种，更优选一种、两种或三种，更加优选一种或两种，独立地选自下列组：低级烷基、三卤烷基、卤、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰、N-氨基甲酰、O-硫代氨基甲酰、N-硫代氨基甲酰、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、R18S(O)-、R18S(O)2-、-C(O)OR18、R18C(O)O-和-NR18R19，R18和R19如上述定义。优选地，杂脂环基是以独立地选自卤、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基、或N-亚磺酰氨基组成的组中的-种或两种取代基任选取代的。
优选地，杂脂环基是以独立地选自卤、低级烷基、三卤烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、单或二烷基氨基、羧基、或N-亚磺酰氨基组成的组中的一种或两种取代基任选取代的。
“杂环”指具有3-8个环原子的饱和的环基，其中一个或两个环原子是选自N、O或S(O)n(这里n是0-2的整数)的杂原子，其余的环原子是C，其中一个或两个C原子可用羰基任选置换。所述杂环是可独立地以选自任选取代的低级烷基(以1或2个独立地选自羧基或酯的取代基取代)、卤烷基、氰基烷基、卤、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基、杂芳烷基、-COR(其中R是烷基)或-COOR(其中R是氢或烷基)的一种、两种或三种取代基任选取代的。更具体地，术语杂环基包括但不限于四氢吡喃基、2，2-二甲基-1，3-二氧戊环、哌啶子基、N-甲基哌啶-3-基、哌嗪子基、N-甲基吡咯烷-3-基、3-吡咯烷子基、吗啉代、硫代吗啉代、硫代吗啉代-1-氧化物、硫代吗啉代-1，1-二氧化物、4-乙氧基羰基哌嗪子基、3-氧代哌嗪子基、2-咪唑烷酮、2-pyrrolidinone、2-氧代高哌嗪子基、四氢嘧啶-2-酮和它们的衍生物。优选地，杂环基是以一种或两种独立地选自卤、低级烷基、以羧基取代的低级烷基、酯羟基、单或二烷基氨基。
“羟基”指-OH基团。
“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(环烷基)基团。典型的实例包括但不限于，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基等。
“芳氧基”指-O-芳基和-O-杂芳基，如本文所定义。典型的实例包括但不限于苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基、噻吩基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基等及它们的衍生物。
“巯基”指-SH基。
“烷基硫基”指-S-烷基和-S-环烷基。典型的实例包括但不限于，例如甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、丁基硫基、环丙基硫基、环丁基硫基、环戊基硫基、环己基硫基等。
“芳基硫基”指-S-芳基和-S-杂芳基，如本文所定义。典型的实例包括但不限于苯基硫基、吡啶基硫基、呋喃基硫基、噻吩基硫基(thientylthio)、嘧啶基硫基等及它们的衍生物。
“酰基”指-C(O)-R”基团，其中R”选自下列组：氢；低级烷基；三卤甲基；环烷基；以一种或多种，优选一种、两种或三种选自低级烷基、三卤甲基、低级烷氧基、卤和-NR18R19基组成的组中的取代基任选取代的芳基；以一种或多种，优选一种、两种或三种选自低级烷基、三卤烷基、低级烷氧基、卤和-NR18R19基组成的组中的取代基任选取代的杂芳基(通过环中的碳结合)和以一种或多种，优选一种、两种或三种选自低级烷基、三卤烷基、低级烷氧基、卤和-NR18R19基组成的组中的取代基任选取代的杂脂环(通过环中的碳结合)。典型的酰基(acygroups)包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“醛”指其中R”是氢的酰基。
“硫代酰基”指-C(S)-R”基团，R”如本文所定义。
“酯”指-C(O)O-R”基团，R”除不能是氢之外如如本文所定义。
“乙酰基”指-C(O)CH3基团。
“卤”基指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。
“三卤甲基”指CX3基团，其中X为如本文定义的卤基。
“三卤甲基磺酰基”指X3CS(＝O)2-基团，X如本文定义。
“氰基”指-C≡N基团。
“亚甲二氧基”指-OCH2O-基团，其中两个氧原子与相邻的碳原子结合。
“亚乙二氧基”指-OCH2CH2O-基团，其中两个氧原子与相邻的碳原子结合。
“S-亚磺酰氨基”指-S(O)2NR18R19基团，R18和R19如本文所定义。
“N-亚磺酰氨基”指-NR18S(O)2R19基团，R18和R19如本文所定义。
“O-氨基甲酰”指-OC(O)NR18R19基团，R18和R19如本文所定义。
“N-氨基甲酰”指R18OC(O)NR19-基团，R18和R19如本文所定义。
“O-硫代氨基甲酰”指-OC(S)NR18R19基团，R18和R19如本文所定义。
“N-硫代氨基甲酰”指R18OC(S)NR19-基团，R18和R19如本文所定义。
“氨基”指-NR18R19基团，其中R18和R19都是氢。
“C-酰氨基”指-C(O)NR18R19基团，R18和R19如本文所定义。
“N-酰氨基”指R18C(O)NR19-基团，R18和R19如本文所定义。
“硝基”指-NO2基团。
“卤烷基”含义是以一个或多个相同或不同的卤原子取代的烷基，优选如上述定义的低级烷基，例如，-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“芳烷基”含义是以如上述定义的芳基取代的烷基，优选如上述定义的低级烷基，例如，-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等及其衍生物。
“杂芳烷基”含义是以杂芳基取代的烷基，优选如上述定义的低级烷基，例如，-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等及其衍生物。
“单烷基氨基”含义是-NHR基，其中R是未取代的如上述定义的烷基或环烷基，例如，甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、环己基氨基等。
“二烷基氨基”含义是-NRR基，其中每个R独立地是未取代的如上述定义的烷基或环烷基，例如，二甲基氨基、二乙基氨基、(1-甲基乙基)-乙基氨基、环己基甲基氨基、环戊基甲基氨基等。
“氰基烷基”含义是以1或2个氰基取代的烷基，优选如上述定义的低级烷基。
“任选的”或“任选地”含义是随后描述的事件或情形可以但不是必需发生，且该描述包括事件或情形发生的情况和未发生的情况。例如，“以烷基任选地取代的杂环基”含义是烷基可以但不是必需存在，并且该描述包括以烷基取代了杂环基的情形和烷基未取代杂环基的情形。
本文中可交替地使用的术语“2-吲哚满酮”、“二氢吲哚-2-酮”和“2-羟基吲哚”指具有下面化学式的分子：
Figure A0281591200441
术语“吡咯”指具有下面化学式的分子：
本文中可交替地使用的术语“吡咯取代的2-吲哚满酮”和“3-吡咯烷基(pyrrolidenyl)-2-吲哚满酮”指具有式(I)中显示的通用结构的化学化合物。
具有相同的分子式但在性质或它们的原子结合顺序或它们的原子空间排列方面不同的化合物叫做“同分异构体”。在原子空间排列方面不同的同分异构体叫做“立体异构体”。
相互不是镜像的立体异构体叫做“非对映立体异构体”，那些相互为非可叠加的镜像立体并构体叫做“对映异构体”。当化合物有不对称的中心，例如其结合4个不同的基团，一对对映异构体是可能的。对映异构体可以不对称的中心绝对构型为特征，并通过Cahn和Prelog的R-和S-排序规则或通过分子旋转偏光面的方式描述，并设计为右旋的或左旋的(即，相应为(+)或(-)-异构体)。手性化合物可存在为单独的对映异构体或存在为其混合物。含等比例对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
本发明化合物可拥有一个或多个不对称中心，因此可将这些化合物生产为(R)-或(S)-立体异构体或其混合物。例如，如果在式(I)化合物中的R6取代基是2-羟基乙基，那么羟基所结合的碳原子是不对称中心，因此式(I)化合物存在为(R)-或(S)-立体异构体。除非另外指出，在详述和权利要求中特定化合物的描述和命名意思是包括单独的对映异构体和其外消旋或其他混合物两者。用于立体化学测定和立体异构体分离的方法是本领域众所周知的(参见“AdvancedOrganic Chemistry”，4th edition J.March，John Wiley and Sons，New York，1992第四章中讨论)。
本发明化合物可显示互变异构和结构共分异构现象。例如，本文描述的式(I)化合物关于连接2-吲哚满酮部分与吡咯部分的双键可采用E或Z构型或者可以是E和Z的混合物。本发明包括任何拥有调节RTK、CTK和/或STK活性的能力的互变异构和结构共分异构的形式和其混合物，并且不限于任何一种互变异构和结构共分异构的形式。
“药物组合物”指一种或多种本文中描述的化合物或其生理/药物可接受盐或前药，与其他化学成分诸如生理/药物可接受载体和赋形剂的混合物。药物组合物的目的是方便对生物体施用化合物。
本发明的化合物还可充当前药。“前药”指在活体内转化成母药的药剂。在某些情况下，前药常常是有帮助的，因为它们可比母药更容易施用。例如，它们通过口服可以是可生物利用的，然而母药不是。前药还可具有超过母药的改善的药物组合物溶解度。前药的实例将是，但不限于本发明的化合物，将其作为酯(所述“前药”)施用以方便传输过水溶度对移动性不利的细胞膜，不过一旦进入水溶度是有帮助的细胞内，将其代谢水解为羧酸-活性本体。
前药的另外的实例可以是短的多肽，例如但不限于通过末端氨基与本发明化合物的羧基结合的2-10氨基酸多肽，其中将所述多肽在体内水解或代谢以释放活性分子。式(I)化合物的前药包含在本发明的范围内。
另外，预期式(I)化合物将在生物体诸如人类体内通过酶代谢产生能够调节蛋白激酶活性的代谢产物。这些代谢产物包含在本发明的范围内。
如本文所使用，“生理/药物可接受载体”指对生物体不引起明显刺激并且不消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
“药物可接受赋形剂”指加入药物组合物中更方便施用化合物的无活性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
如本文所使用，“药物可接受盐”指保留母化合物生物有效性和性质的盐类。这些盐包括：
(i)通过母化合物的游离基与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸(perhcloric acid)等，或与有机酸诸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或(L)苹果酸反应获得的加成盐，诸如5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺的L-苹果酸盐；或
(2)当存在于母化合物中的酸性的氢核为金属离子例如碱性金属离子、碱土离子所置换，或者与有机碱配位形成盐。典型的离子包括在它们通常化合价的铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。优选的有机碱包括质子化了的叔胺和季铵阳离子，部分地包括三甲胺、二乙胺、N，N’-二苄基亚乙基二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、亚乙基二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因。
“方法”指用于完成特定任务的方式、手段、技术和操作，包括但不限于对化学、药物、生物、生化和医学领域的专业人员或者是已知的，或者从已知的方式、手段、技术和操作容易改良的那些方式、手段、技术和操作。
“治疗”指任何过程、行动、应用、疗法等，其中哺乳动物包括人类接受医疗帮助，目的是直接或间接改善哺乳动物的状况。特别是关于癌症，术语“治疗”简单含义是受癌症影响的个体的预期寿命增加或一种或多种疾病症状得以改善。这可通过除了别的以外延迟原发或再发肿瘤的出现，减缓原发或再发肿瘤的发展，降低原发或再发肿瘤的发生，减缓或降低疾病严重继发作用，阻止肿瘤生长和肿瘤退化来监测。
术语“预防”包括在危险个体中预防全部临床明显的瘤形成的发生或者预防临床前明显期瘤形成的发生。此定义还用来包括预防恶性细胞的发生或阻止或逆转恶化前细胞进展为恶性细胞。这包括处于肿瘤发展危险期患者的预防治疗。
短语“治疗有效的”意思是限制将达到在肿瘤疾病严重性方面改善目标每种药剂的数量，和每种药剂单独治疗肿瘤疾病的次数，同时避免与其他疗法典型相关的副作用。
“治疗效应”或“治疗有效量”意思是限制缓解肿瘤病症的一种或多种症状到一定程度所要求的抗癌药的数量，包括但不限于：1)减少癌细胞数量；2)缩小肿瘤尺寸；3)抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)癌细胞浸润到外周器官；3)抑制(即，减缓至一定程度，优选停止)肿瘤转移；4)抑制，到一定程度，肿瘤生长；5)缓解或减少与病症相关的一种或多种症状到一定程度；和/或6)缓解或减少与施用抗癌药相关副作用。
短语“联合疗法”(或“联合治疗”)包含施用作为意图从这些治疗药的联合作用中提供有益作用的特定治疗计划一部分的蛋白激酶抑制剂和环氧合酶-2抑制剂。所述联合的有益作用包括但不限于从治疗药的联合导致的药物动力学的或药效的联合作用。典型地，将联合施用这些治疗药实施一段限定的时间(根据所选择的联合方案通常是分钟、小时、天或周)。“联合疗法”通常意思是不包含施用2种或多种这些治疗药作为分离的单一治疗计划的一部分，该计划偶然地和武断地导致本发明的联合。“联合疗法”意思是包含以连续的方式施用这些治疗药，即，将其中每个治疗药在不同的时间施用，以及以充分同时的方式施用这些治疗药，或这些治疗药的至少两种。充分同时的给药可例如通过对受试者施用具有每种治疗药确定比率的单一胶囊或以每种治疗药一粒胶囊的多粒胶囊来完成。每种治疗药的连续或充分同时施用可通过任何适当的途径包括但不限于口服途径、静脉途径、肌内途径和通过黏膜组织直接吸收来实现。治疗药可通过相同途径或不同途径来施用。例如，所选择联合疗法的第一种治疗药可通过静脉注射施用，同时可口服联合疗法的其他治疗药。另外，例如，两种治疗药都可口服或都可通过静脉注射施用。施用治疗药的顺序不是精细重要的。“联合疗法”还可包含上述治疗药进一步与其他生物活性成分(诸如但不限于第二种和不同种抗肿瘤药)和非药物疗法(诸如但不限于手术或放射治疗)联合施用。在联合疗法另外包括放射治疗情况下，可在任何合适的时间进行放射治疗以便于从治疗药与放射治疗联合的联合作用中获得有益效应。例如，在适当情况下，当从施用治疗药中暂时去除放射治疗时，也许数天甚或数周，仍获得有益效应。
“辅助疗法”包含以减少或避免与本发明联合疗法相关副作用的药物治疗受试者，包括但不限于那些药物，例如，减少抗癌药毒性作用的药物例如骨吸收抑制剂、心脏保护剂；预防或减少与化疗、放疗或手术相关的恶心和呕吐的发生率的药物；或减少与施用骨髓抑制性抗癌药相关的感染发生率的药物。
                   优选的实施方案
在本发明的概述中列出最广定义的同时，优选下面列出的式(I)、(II)和(III)的某些化合物实施本发明。
A. 蛋白酪氨酸激酶抑制剂-式(I)的化合物：
(1)式(I)化合物的优选基团是其中R1、R3和R4为氢的基团。
(2)式(I)化合物的另一个优选基团是其中R1、R2和R4为氢的基团。
(3)式(I)化合物的另一个优选基团是其中R1、R2和R3为氢的基团。
(4)式(I)化合物的另一个优选基团是其中R2、R3和R4为氢的基团。
(5)式(I)化合物的另一个优选基团是其中R1、R2、R3和R4为氢的基团。
(6)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5、R6或R7，优选R5或R6，更优选R6为-COR10的基团，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基，优选氢或甲基；
n是2、3或4，优选2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和R14是独立地烷基，更优选低级烷基，或R13和R14结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)2-O-(CH2)2-或-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-的基团，优选R13和R14独立地是氢、甲基、乙基或结合形成吗啉-4-基、吡咯烷-1-基、哌嗪-1-基或4-甲基哌嗪-1-基。
更优选地，在上面(6)中的R5或R6是N-(2-二甲基氨基乙基)氨羰基、N-(2-乙氨基乙基)-N-甲基氨羰基、N-(3-二甲基氨基丙基)-氨羰基、N-(2-二乙氨基乙基)氨羰基、N-(3-乙氨基丙基)氨羰基、N-(3-二乙氨基丙基)氨羰基、3-吡咯烷-1-基-丙基氨羰基、3-吗啉-4-基丙基-氨羰基、2-吡咯烷-1-基乙基-氨羰基、2-吗啉-4-基乙基氨羰基、2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基氨羰基、2-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基氨羰基、2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)乙基氨羰基或2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)丙基氨羰基，更加优选地N-(2-二乙氨基乙基)氨羰基或N-(2-乙氨基乙基)氨基-羰基。
(7)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5、R6或R7，优选R5或R6，更优选R6为-COR10的基团，其中R10为-NR13R14，其中R13是氢且R14是烷基，优选以羟基、芳基、杂芳基、杂脂环或羧基取代的低级烷基，更优选以羟基、芳基、杂脂环诸如哌啶、哌嗪、吗啉等、杂芳基或羧基取代的甲基、乙基、丙基或丁基。在(7)组的范围内更加优选地，R5或R6是2-乙氧基羰基甲基-氨羰基、羧基甲基氨羰基、3-羟基丙基-氨羰基、2-羟基乙基氨羰基、3-三嗪-1-基丙基氨基-羰基、三嗪-1-基乙基氨羰基、4-羟基-苯基乙基氨羰基、3-咪唑-1-基丙基-氨羰基、吡啶-4-基甲基氨羰基、2-吡啶-2-基乙基氨羰基或2-咪唑-1-基乙基氨羰基。
(8)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5、R6或R7，优选R5或R6，更优选R6为-COR10的基团，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基，优选氢或甲基；
n是2、3或4，优选2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和R14结合在一起形成杂环，优选含羰基和1或2个氮原子的5、6或7元杂环。优选地，R5或R6是2-(3-乙氧基羰基甲基哌嗪-1-基)乙基氨羰基、2-(3-氧代哌嗪-1-基)乙基氨羰基、2-(咪唑啉-1-基-2-酮)乙基氨羰基、2-(四氢嘧啶-1-基-2-酮)乙基氨羰基、2-(2-氧代吡咯烷-1-基)-乙基氨羰基、3-(4-甲基哌嗪-1-基)-丙基氨羰基、3-(3-乙氧基羰基甲基哌嗪-1-基)-丙基氨羰基、3-(3-氧代哌嗪-1-基)丙基-氨羰基、3-(咪唑啉-1-基-2-酮)丙基-氨羰基、3-(四氢嘧啶-1-基-2-酮)-丙基氨羰基、3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基-氨羰基、2-(2-氧代高哌啶-1-基)乙氨基-羰基或3-(2-氧代高哌啶-1-基)丙基氨羰基。
(9)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5、R6或R7，优选R5或R6，更优选R6为-COR10的基团，其中
(a)R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基，优选氢或甲基；
n是2、3或4，优选2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13是氢和R14是氰基烷基或-NHCORa，其中Ra是烷基；或
(b)R10是-NR13R14，其中R13和R14结合在一起形成在环中不含羰基的杂环。优选地，R5或R6是2-(2-氰基乙氨基)乙基氨羰基、2-(乙酰氨基)-乙基氨羰基、吗啉代羰基、哌啶-1-基-羰基、2-氰基甲基氨基乙基氨羰基或哌啶-1-基羰基。
(10)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5为-COR10的基团，其中R10为-NR13R14，其中R13是氢且R14是以羟基、以羟烷基氨基取代的低级烷基、羧基或-NR18R19取代的低级烷基，其中R18和R19独立地是氢或低级烷基，更优选地，R5是2-[(二乙氨基)-2-羟基乙基]氨羰基、2-(N-乙基-N-2-羟基乙氨基)乙基氨羰基、羧甲基氨基-羰基或2-(2-羟基乙氨基)乙氨基-羰基。
(11)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R6为-COR10的基团，其中R10为-NR13R14，其中R13是氢且R14是由羟基、以羟烷基氨基取代的低级烷基、羧基或-NR18R19取代的低级烷基，其中R18和R19独立地是氢或低级烷基；更优选地，R6是2-[(二乙氨基)-2-羟基]乙基氨羰基、2-(N-乙基-N-2-羟基乙氨基)乙基氨羰基、羧甲基氨羰基或2-(2-羟基乙氨基)乙氨基-羰基。
(12)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R5为-COR10的基团，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中R12是-N+(O-)NR13R14或-N(OH)R13，其中R13和R14独立地选自氢和低级烷基组成的组，优选地，R5是2-(N-羟基-N-乙氨基)-乙基氨羰基或2-[N+(O-)(C2H5)2]乙基-氨羰基。
(13)式(I)化合物的再一个优选基团是其中R6为-COR10的基团，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中R12是-N+(O-)NR13R14或-N(OH)R13，其中R13和R14独立地选自氢和低级烷基组成的组，优选地，R6是2-(N-羟基-N-乙氨基)乙基氨羰基或2-[N+(O-)(C2H5)2]乙基-氨羰基。
(14)在上述优选的(6)-(13)基团中，当R5为-COR10时，那么化合物的更优选的基团是下面的基团，其中：
R6选自氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；和
R7选自氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是氢、烷基或芳基，更优选氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，更加优选甲基、氢或苯基。
(15)在上述优选的(6)-(13)基团中，当R5为-COR10时，那么R6和R7结合形成-(CH2)4-。
(16)在上述优选的(6)-(13)基团中，当R6为-COR10时，那么化合物的更优选的基团是下面的基团，其中：
R5选自氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；和
R7选自氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是氢、烷基或芳基，更优选氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，更加优选甲基、氢或苯基。
(17)在上述优选的及更优选的(6)-(16)基团中，化合物的更加优选的基团是下面的基团，其中：
R1是氢、烷基、-C(O)NR8R9、环烷基或芳基，优选氢、苯基、3，4-二甲氧基苯基氨羰基、4-甲氧基-3-氯苯基-氨羰基，更优选氢或甲基，最优选氢；
R2是氰基、氢、卤、低级烷氧基、芳基或-S(O)2NR13R14，其中R13是氢和R14是氢、芳基或烷基，优选R2是氢、氯、溴、氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲氨基磺酰基、3-氯苯基-氨基磺酰基、羧基、甲氧基、氨基磺酰基、甲氨基磺酰基、苯基氨基磺酰基、吡啶-3-基-氨基磺酰基、二甲氨基磺酰基、异丙基氨基-磺酰基，更优选氢、氟或溴；
R3选自下列组：氢；低级烷氧基；-C(O)R15；-NR13C(O)R14；芳基优选以一种或两种选自低级烷基、卤或低级烷氧基组成的组中的取代基任选取代的芳基；和杂芳基，优选以一种或两种选自低级烷基、卤或低级烷氧基组成的组中的取代基任选取代的杂芳基，；优选氢、甲氧基、羧基、苯基、吡啶-3-基、3，4-二氯苯基、2-甲氧基-5-异丙基苯基、4-正-丁基苯基、3-异丙基苯基，更优选氢或苯基；和
R4是氢。
(18)另一个式(I)化合物更优选的基团是下面的基团，其中：
R1是氢、烷基、-C(O)NR8R9、环烷基或芳基，优选氢、3，4-二甲氧基-苯基-氨羰基、4-甲氧基-3-氯苯基氨羰基，更优选氢或甲基，特别是氢；
R2是氰基、氢、卤、低级烷氧基、芳基或-S(O)2NR13R14，其中R13是氢和R14是氢、芳基或烷基，优选R2是氢、氯、溴、氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲氨基磺酰基、3-氯苯基-氨基磺酰基、羧基、甲氧基、氨基磺酰基、甲氨基磺酰基、苯基氨基磺酰基、吡啶-3-基-氨基磺酰基、二甲氨基磺酰基、异丙基氨基-磺酰基，更优选氢、氟或溴；
R3选自下列组：氢；低级烷氧基；-C(O)R15；-NR13C(O)R14；芳基优选以一种或两种选自低级烷基、卤或低级烷氧基组成的组中的取代基任选取代的芳基；和杂芳基，优选以一种或两种选自低级烷基、卤或低级烷氧基组成的组中的取代基任选取代的杂芳基，；优选氢、甲氧基、羧基、苯基、吡啶-3-基、3，4-二氯苯基、2-甲氧基-5-异丙基苯基、4-正-丁基苯基、3-异丙基苯基，更优选氢或苯基；和
R4是氢。
在上述优选的(18)基团中化合物的更优选的基团是其中：
R5是-COR10，其中R10如在发明概述中所定义，优选如在发明概述中所定义的-NR11(CH2)nR12或-NR13R14。
R6选自氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；和
R7选自氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，更优选氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，更加优选甲基、氢或苯基。
在上述优选的(18)基团中另一个化合物的更优选的基团是下列基团，其中：
R6是-COR10，其中R10如在发明概述中所定义，优选如在发明概述中所定义的-NR11(CH2)nR12或-NR13R14。
R5选自氢和烷基组成的组，优选氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或正丁基，更优选氢或甲基；和
R7选自氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、烷基或芳基，更优选氢、甲基、乙基、异丙基、正、异或叔丁基、苯基、苯甲酰基、乙酰基或羧基，更加优选甲基、氢或苯基。
(19)式(I)化合物的另一个优选基团是下列基团，其中：
R1和R4是氢；
R2选自氢、卤、低级烷氧基、-C(O)R16和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、低级烷氧基、-C(O)R15和-S(O)2NR13R14、芳基和杂芳基组成的组；
R5是-C(O)R10；
R6选自氢和低级烷基组成的组；和
R7选自氢、低级烷基和-C(O)R17组成的组。
目前，本发明的另一个优选实施方案是在具有如(15)中描述的结构的化合物中：
R10选自羟基、低级烷氧基和-NR11(CH2)nR12组成的组，其中
n是2或3；
R11选自氢和低级烷基组成的组；和，
R12选自芳基和-NR13R14组成的组。
目前，本发明的再一个优选实施方案是在具有如前面两段落中所描述结构的化合物中，R13和R14独立地选自氢、低级烷基和结合的-(CH2)4-、-(CH2)5-、-CH2)2O(CH2)2-或-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-组成的组。
(20)目前本发明的另一个优选实施方案是如下化合物，其中：
R1选自氢、低级烷基、-(CH2)rR16和-C(O)NR8R9组成的组；
R2选自氢、卤素、芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基和-C(O)R15组成的组；
R4是氢；
R5选自氢和低级烷基组成的组；
R6是-C(O)R10；
R7选自氢、低级烷基和芳基组成的组；
R16选自羟基和-C(O)R15组成的组；且
r是2或3。
本发明目前优选实施方案是具有如刚刚在上面段落中所描述结构的化合物，其中R3是以一种或多种选自低级烷基、低级烷氧基和卤组成的组中的基团任选取代的芳基。
(21)同样地，本发明目前的一个优选实施方案是，在化合物中：
R1选自氢、低级烷基、-(CH2)rR16和-C(O)NR8R9组成的组；
R2选自氢、卤素、芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基和-C(O)R15组成的组；
R4是氢；
R5选自氢和低级烷基组成的组；
R6是-C(O)R10；
R7选自氢、低级烷基和芳基组成的组；
R16选自羟基和-C(O)R15组成的组；且
r是2或3。
R10选自羟基、低级烷氧基、-NR13R14和-NR11(CH2)nR12组成的组，其中n是1、2或3，R11是氢和R12选自羟基、低级烷氧基、-C(O)R15、杂芳基和-NR13R14组成的组。
(22)本发明的另外的优选实施方案是具有在前一段落中所描述的结构的化合物，其中R13和R14独立地选自氢、低级烷基、杂芳基和结合的-(CH2)4-、-(CH2)5-、-CH2)2O(CH2)2-或-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-组成的组。
(23)目前本发明的另外的优选实施方案是如下化合物，其中：
R1是-C(O)NR8R9，其中R8是氢和R9是以选自卤、羟基和低级烷氧基组成的组中一种或多种基团任选取代的芳基；
R2选自氢、卤素、芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、低级烷基、低级烷氧基、芳基、杂芳基和-C(O)R15组成的组；
R4是氢；
R5选自氢和低级烷基组成的组；
R6是-C(O)R10；
R7选自氢、低级烷基和芳基组成的组；
R16选自羟基和-C(O)R15组成的组；且
r是2或3。
(24)目前本发明的另外优选实施方案是如下化合物，其中：
R1选自氢和低级烷基组成的组；
R2选自氢、卤、低级烷氧基、芳基、-C(O)R15和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、卤、芳基、杂芳基和-C(O)R15组成的组；
R4是氢；
R5是-C(O)R10；和，
R6和R7结合形成-(CH2)4-基。
在具有前一段落中所描述结构的化合物中，本发明目前的优选实施方案是，其中R10选自羟基、烷氧基、-NR13R14和-NH(CH2)nNR13R14组成的组，其中n是2或3。
本发明目前的优选实施方案是，在具有前两个段落所描述结构的化合物中，R13和R14独立地选自氢、低级烷基和结合的-(CH2)4-、-(CH2)5-、-CH2)2O(CH2)2-或-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-组成的组。典型的式(I)化合物显示于下面表1中。
表1
Figure A0281591200571
Figure A0281591200581
Figure A0281591200621
Figure A0281591200631
Figure A0281591200651
Figure A0281591200661
Figure A0281591200671
Figure A0281591200691
Figure A0281591200731
Figure A0281591200741
Figure A0281591200751
Figure A0281591200791
Figure A0281591200821
化合物号码与在实施例部分中的实施例号码一致。即，在实施例1中描述表1中化合物1的合成。表1中所显示的化合物只是举例性的，并且不理解为以任何方式限制本发明的范围。另外的可用于本方法的蛋白激酶抑制剂包括3-(3，5-二甲基吡咯-2-基亚甲基)-2-吲哚满酮(su 5416)；3-[3，5-二甲基-4-(2-羧乙基)吡咯-2-基亚甲基]-2-吲哚满酮(su 6668)和3-[3-(2-羧乙基)-5-甲基吡咯-2-基亚甲基]-2-吲哚满酮。
B. 环氧合酶-2选择性抑制剂——式(II)和(III)的化合物
可用于本发明的COX-2抑制剂的非限制性实例在下面表II和表III中鉴别。
                                        表II
化合物 商标/研究名称 参考文献 剂量
1，5二苯基-3-取代的吡唑 WO 97/13755
radicicol WO 96/25928.Kwon et al(Cancer Res(1992)526296)
GB-02283745
TP-72 Cancer Res 1998 584717-723
1-(4-氯苯甲酰基)3-[4-(4-氟-苯基)噻唑-2-基甲基]-5-甲氧基-2-甲基吲哚 A-183827.0
GR-253035
4-(4-环己基-2-甲基噁唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺 JTE-522 JP 9052882
5-氯-3-(4-(甲磺
酰)-苯基)-2(甲基-5-吡啶基)-吡啶
2-(3，5-二氟-苯基)-3-4-(甲磺酰)-苯基)-2-环戊烯-1-酮
L-768277
L-783003
MK-966；VIOXX_ US 5968974 12.5-100mg po
吲哚美辛-衍生的吲哚链烷酸 WO 96/374679 200mg/千克/天
1-甲磺酰-4-[1，1-二甲基-4-(4-氟-苯基)环戊-2，4-二烯-3-基]苯 WO 95/30656.WO 95/30652.WO 96/38418.WO 96/38442.
4，4-二甲基-2-苯基-3-[4-(甲磺酰)苯基]环丁烯酮
2-(4-甲氧基苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺酰苯基)-吡咯 EP 799823
N-[5-(4-氟)苯氧基]噻吩-2-甲氨磺酰 RWJ-63556
5(E)-(3，5-二-叔-丁基-4-羟基)苯亚甲基-2-乙基 S-2474 EP 595546
-1，2-异噻唑烷-1，1-二氧化物
3-甲酰氨基-7-甲基磺酰氨基-6-苯氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 T-614 DE 38/34204
苯磺酰氨，4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)- celecoxib US 5466823
CS 502 (Sankvo)
2-[(2-氯-6-氟苯基)氨基]-5-甲基苯乙酸 lumiracoxib(Cox-189) WO 99/11605
5-氯-6’-甲基-3-[4-(甲基磺酰)苯基]-2，3’-二吡啶 etoricoxib(MK 663) WO 98/03484
BMS 34070 US 6180651
meloxicam US 4233299 15-30mg/天
nimesulide US 3840597
                                  表III
 WO 99/30721  WO 99/30729  US 5760068  WO 98/15528
 WO 99/25695  WO 99/24404  WO 99/23087  FR 27/71005
 EP 921119  FR 27/70131  WO 99/18960  WO 99/15505
 WO 99/15503  WO 99/14205  WO 99/14195  WO 99/14194
 WO 99/13799  GB 23/30833  US 5859036  WO 99/12930
 WO 99/11605  WO 99/10332  WO 99/10331  WO 99/09988
 US 5869524  WO 99/05104  US 5859257  WO 98/47890
 WO 98/47871  US 5830911  US 5824699  WO 98/45294
 WO 98/43966  WO 98/41511  WO 98/41864  WO 98/41516
 WO 98/37235  EP 86/3134  JP 10/175861  US 5776967
 WO 98/29382  WO 98/25896  ZA 97/04806  EP 84/6,689
 WO 98/21195  GB 23/19772  WO 98/11080  WO 98/06715
 WO 98/06708  WO 98/07425  WO 98/04527  WO 98/03484
 FR 27/51966  WO 97/38986  WO 97/46524  WO 97/44027
 WO 97/34882  US 5681842  WO 97/37984  US 5686460
 WO 97/36863  WO 97/40012  WO 97/36497  WO 97/29776
 WO 97/29775  WO 97/29774  WO 97/28121  WO 97/28120
 WO 97/27181  WO 95/11883  WO 97/14691  WO 97/13755
 WO 97/13755  CA 21/80624  WO 97/11701  WO 96/41645
 WO 96/41626  WO 96/41625  WO 96/38418  WO 96/37467
 WO 96/37469  WO 96/36623  WO 96/36617  WO 96/31509
 WO 96/25405  WO 96/24584  WO 96/23786  WO 96/19469
 WO 96/16934  WO 96/13483  WO 96/03385  US 5510368
 WO 96/09304  WO 96/06840  WO 96/06840  WO 96/03387
 WO 95/21817  GB 22/83745  WO 94/27980  WO 94/26731
 WO 94/20480  WO 94/13635  FR 27/70,131  US 5859036
 WO 99/01131  WO 99/01455  WO 99/01452  WO 99/01130
 WO 98/57966  WO 98/53814  WO 98/53818  WO 98/53817
 WO 98/47890  US 5830911  US 5776967  WO 98/22101
 DE 19/753463  WO 98/21195  WO 98/16227  US 5733909
 WO 98/05639  WO 97/44028  WO 97/44027  WO 97/40012
 WO 97/38986  US 5677318  WO 97/34882  WO 97/16435
 WO 97/03678  WO 97/03667  WO 96/36623  WO 96/31509
 WO 96/25928  WO 96/06840  WO 96/21667  WO 96/19469
 US 5510368  WO 96/09304  GB 22/83745  WO 96/03392
 WO 94/25431  WO 94/20480  WO 94/13635  JP 09052882
 GB 22/94879  WO 95/15316  WO 95/15315  WO 96/03388
 WO 96/24585  US 5344991  WO 95/00501  US 5968974
 US 5945539  US 5994381  US 6180651
可通过WO 95/15316中描述的方法制备吡唑。另外可通过WO95/15315中描述的方法制备吡唑。还可通过WO 96/03385中描述的方法制备吡唑。可通过WO 95/00501中描述的方法制备噻吩类似物。在WO 94/15932也描述了噻吩类似物的制备。可通过WO 95/00501中描述的方法制备噁唑。在WO 94/27980也描述了噁唑的制备。可通过WO96/25405中描述的方法制备异噁唑。可通过WO 96/03388中描述的方法制备咪唑。在WO 96/03387也描述了咪唑的制备。可通过美国5,344,991号专利所描述的方法制备环戊烯环氧合酶-2抑制剂。在WO95/00501中也描述了环戊烯环氧合酶-2抑制剂的制备。可通过WO96/16934中描述的方法制备三联苯化合物。可通过WO 96/03,392中描述的方法制备噻唑。可通过WO 96/03392中描述的方法制备吡啶化合物。在WO 96/24585中也描述了吡啶化合物的制备。
可通过美国5,466,823号专利建立的方法制备用于本发明联合治疗的celecoxib。
可通过美国5,633,272号专利建立的方法制备用于本发明联合治疗的valdecoxib。
可通过美国5,932,598号专利建立的方法制备用于本发明联合治疗的parecoxib。
可通过美国5,968,974号专利建立的方法制备用于本发明联合治疗的rofecoxib。
可通过JP 90/52,882中建立的方法制备用于本发明联合治疗的Japan Tobacco JTE-522。
可通过WO 99/11605中建立的方法制备用于本发明联合治疗的lumiracoxib(Cox-189)。
可通过WO 98/03484中建立的方法制备用于本发明联合治疗的etoricoxib(MK 663)。
可通过美国6,180,651号专利建立的方法制备用于本发明联合治疗的Bristol Meyers Squibb’s BMS 34070。
列于上面表II和表III中的上述参考文献描述了本文中描述的适合用于本发明的多种COX-2抑制剂，因此它们的制造方法是通过文献个别表现的。
可用于本发明的优选COX-2抑制剂包括但不限于：
JTE-522，4-(4-环己基-2-甲基噁唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺；C2)
5-氯-3-(4-(甲磺酰)苯基)-2-(甲基-5-吡啶基)吡啶；
C3)
2-(3，5-二氟苯基)-3-4-(甲磺酰)苯基)-2-环戊烯-1-酮；
4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]-苯磺酰氨；
Figure A0281591200892
rofecoxib，4-(4-(甲基磺酰)苯基]-3-苯基-2(5H)-呋喃酮；
4-(5-甲基-3-苯基异噁唑-4-基)苯磺酰氨；C7)
N-[[4-(5-甲基-3-苯基异噁唑-4基)苯基]磺酰]丙酰胺；
4-[5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200911
6-[[5-(4-氯苯甲酰基)-1，4-二甲基-1H-吡咯-2-基]甲基]-3(2H)-哒嗪酮；
N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺酰氨；
3-(3，4-二氟苯氧基)-5，5-二甲基-4-[4-(甲基磺酰)苯基]-2(5H)-呋喃酮；
N-[6-[(2，4-二氟苯基)硫代]-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-5-基]甲基磺酰氨；
Figure A0281591200922
3-(4-氯苯基)-4-[4-(甲基磺酰)苯基]-2(3H)-噁唑酮；
4-[3-(4-氟苯基)-2，3-二氢-2-氧代-4-噁唑基]苯磺酰氨；
3-[4-(甲基磺酰)苯基]-2-苯基-2-环戊烯-1-酮；
Figure A0281591200932
4-(2-甲基-4-苯基-5-噁唑基)苯磺酰氨；
Figure A0281591200933
3-(4-氟苯基)-4-[4-(甲基磺酰)苯基]-2(3H)-噁唑酮；
5-(4-氟苯基)-1-[4-(甲基磺酰)苯基]-3-(三氟甲基)-1H-吡唑；
Figure A0281591200941
4-[5-苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰氨；
Figure A0281591200942
4-[1-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200943
4-[5-(4-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰氨；
N-[2-(环己氧基)-4-硝基苯基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200951
N-[6-(2，4-二氟苯氧基)-2，3-二氢-1-氧代-1H-茚-5-基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200952
3-(4-氯苯氧基)-4-[(甲基磺酰)氨基]苯磺酰氨；
3-(4-氟苯氧基)-4-[(甲基磺酰)氨基]苯磺酰氨；
3-[(1-甲基-1H-咪唑-2-基)硫基]-4-[(甲基磺酰)氨基]苯磺酰氨；
5，5-二甲基-4-[4-(甲基磺酰)苯基]-3-苯氧基-2(5H)-呋喃酮；
Figure A0281591200962
N-[6-[(4-乙基-2-噻唑基)硫基]-1，3-二氢-1-氧代-5-异苯并呋喃基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200963
3-[(2，4-二氯苯基)硫基]-4-[(甲基磺酰)氨基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200971
1-氟-4-[2-[4-(甲基磺酰)苯基]环戊烯-1-基]苯；
4-[5-(4-氯苯基)-3-(二氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200973
3-[1-[4-(甲基磺酰)苯基]-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]吡啶；
Figure A0281591200981
4-[2-(3-吡啶基)-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-1-基]苯磺酰氨；
4-[5-(羟基甲基)-3-苯基异噁唑-4-基]苯磺酰氨；
4-[3-(4-氯苯基)-2，3-二氢-2-氧代-4-噁唑基]苯磺酰氨；
Figure A0281591200984
4-[5-(二氟甲基)-3-苯基异噁唑-4-基]苯磺酰氨；
[1，1’：2’，1”-三联苯]-4-氨磺酰；
Figure A0281591200992
4-(甲基磺酰)-1，1’，2]，1”-三联苯；
4-(2-苯基-3-吡啶基)苯磺酰氨；
Figure A0281591200994
N-(2，3-二氢-1，1-二氧化物代-6-苯氧基-1，2-苯并异噻唑-5-基)甲基氨磺酰；和
Figure A0281591201001
N-[3-(甲酰氨基)-4-氧代-6-苯氧基-4H-1-苯并吡喃-7-基]甲基氨磺酰；
和
C49)lumiracoxib(COX-189)
Figure A0281591201012
2-[(2-氯-6-氟苯基)氨基]-5-甲基苯乙酸
C50)etoricoxib(MK 663)
Figure A0281591201013
5-氯-6’-甲基-3-[4-(甲基磺酰)苯基]-2，3’-二吡啶
C51)BMS 34070
Figure A0281591201014
可用于本发明的更优选的COX-2抑制剂选自下列组：
Figure A0281591201021
JTE-522，4-(4-环己基-2-甲基噁唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺；
II)
5-氯-3-(4-(甲磺酰)苯基)-2(甲基-5-吡啶基)吡啶；
III)
2-(3，5-二氟苯基)-3-4-(甲磺酰)苯基)-2-环戊烯-1-酮；
4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]-苯磺酰氨；
Figure A0281591201031
rofecoxib，4-(4-(甲基磺酰)苯基]-3-苯基-2(5H)-呋喃酮；
Figure A0281591201032
4-(5-甲基-3-苯基异噁唑-4-基)苯磺酰氨；
VII)
N-[[4-(5-甲基-3-苯基异噁唑-4基)苯基]磺酰]丙酰胺；
4-[5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰氨；和
IX)lumiracoxib(COX-189)
Figure A0281591201041
2-[(2-氯-6-氟苯基)氨基]-5-甲基苯乙酸
更加优选地，可用于本发明的COX-2抑制剂包括但不限于celecoxib、valdecoxib、parecoxib、rofecoxib、lumiracoxib和Japan Tobacco JTE-522。
还包括在本发明的联合中的是所述化合物的异构形式、前药和互变异构体及其药物可接受盐。起说明作用的药物可接受盐是从甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸(glycolic acid)、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、糖醛酸、马来酸、延胡索酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸(mesylicacid)、硬脂酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、embonic酸(pamoic酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、藻酸(algenic acid)、b-羟基丁酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸制备的。
                       效用
本发明化合物是蛋白激酶(PKs)和环氧合酶，特别是环氧合酶-2的抑制剂，因此可用于治疗癌症。
由本发明式(I)化合物调节其催化活性的PKs包括蛋白酪氨酸激酶诸如受体酪氨酸激酶(RTKs)、细胞酪氨酸激酶(CTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。RTK介导的信号转导通过与特定的生长因子(配体)在细胞外相互作用开始，接着受体二聚、短暂刺激内部蛋白酪氨酸激酶活性和磷酸化。细胞内信号转导分子的结合位点因此产生，并导致与一系列方便适当细胞应答(例如，细胞分裂、对细胞外环境的新陈代谢等)的胞浆信号分子形成复合物。参见，Schlessinger andUllrich，1992， Neuron 9：303-391。
已表明，在生长因子受体上的酪氨酸磷酸化位点功能为对信号分子SH2(src同源性)区的高-亲和力结合位点。Fantl et al.，1992，Cell 69：413-423，Songyang et al.，1994， Mol.Cell.Biol.14：2777-2785)，Songyang et al.，1993， Cell 72：767-778，和Kochet al.，1991， Science 252：668-678。已经识别数个与RTKs相关的细胞内基质蛋白。可将它们分为两个主要类别：(1)具有催化区的基质，和(2)缺乏这种区但充当接合器并与催化活性分子相的基质。Songyang et al.，1993， Cell 72：767-778。受体与它们基质的SH2区之间相互作用的特异性立即通过围绕磷酸化的酪氨酸残基的氨基酸残基测定。SH2区与围绕磷酪氨酸残基氨基酸序列间对特定受体的结合亲和力的差别与在它们的基质磷酸化外型中观察到的差别相一致。Songyang et al.，1993， Cell 72：767-778。这些观察提示每个RTK的功能不仅由其表达模式和可获得的配体所决定，还由分析通过特定受体激活的下游信号转导途径所决定。因而，磷酸化提供了通过决定特定生长因子受体充实的选择性发信号途径的重要调节步骤，以及分化因子受体。
常常作为对PTK活动的下级反应的作为最初细胞溶质的STKs影响细胞内的生物化学。已将STKs包含于启动DNA合成和导致细胞增殖的随后的有丝分裂的发信号过程中。
因此，PK信号转导导致，在其他反应中，细胞增殖、分化、生长和新陈代谢。异常的细胞增殖可导致一大批病症和疾病，包括瘤形成的发展诸如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤和血管瘤，病症诸如白血病、牛皮癣、动脉硬化、关节炎和糖尿病性视网膜病及涉及失控性血管生成和/或血管发生的其他病症。
为实行本发明不要求精确理解本发明抑制PKs经由的机制。然而，当因此不受限于任何特定的机制或理论时，相信式(I)化合物与氨基酸在PKs催化区相互作用。在氨基酸保存于PKs之间的区域，PKs典型地加工二叶结构，其中ATP结合于两个叶间的裂隙。相信PKs抑制剂通过非共价相互作用诸如氢键结合、范德瓦尔斯力和离子相互作用结合在前述ATP结合于PKs的相同部位。更具体地，考虑式(I)化合物的2-吲哚满酮成分结合于一般常常为ATP腺嘌呤环所占据的空间。然后，作为在2-吲哚满酮核上的多种取代基与对特定PKs特异的氨基酸之间的另外相互作用的结果，对特定PKs的特定分子的特异性可以产生。因此，不同的吲哚满酮取代基可有助于对特定PKs的优先结合。选择在不同ATP(或其他核苷酸)结合位点有效的化合物的能力使式(I)化合物可用于以这样的位点靶定位任何蛋白。本文公开的式(I)化合物因此具有在体外分析这些蛋白质的效用以及通过与这些蛋白质相互作用显示在体内的治疗作用。
另外，式(I)化合物提供了对任何种类实体瘤治疗的一种治疗途径，包括但不限于癌、肉瘤包括Kaposi’s肉瘤、成红细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑(脊)膜瘤、星形细胞瘤、黑素瘤和成肌细胞瘤。非实体瘤性癌症诸如白血病的治疗或预防也是本发明的预期。适应症包括但不限于脑癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。
本发明可用于预防、治疗和研究的涉及不适当的PK活性的病症类型的其他实例是，但不限于细胞增生性病症、纤维变性的病症和代谢性病症。
可以通过本发明预防、治疗或进一步研究的细胞增生性病症包括癌症、血管增生性病症和肾小球系膜细胞增生性病症。
血管增生性病症指与异常血管发生(血管形成)和血管生成(血管展开)。当血管发生和血管生成在多种正常生理过程诸如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生中扮演重要角色的同时，它们还在导致保持肿瘤存活所需要的新生毛细血管形成的肿瘤发展中扮演关键角色。血管增生性病症的其他实例包括新生毛细血管侵犯关节和破坏软骨的关节炎和眼的疾病，如视网膜的新生毛细血管侵犯玻璃体、出血和引起失明的糖尿病性视网膜病。
已经确定两种结构相关的RTKs高亲和力结合VEGF：fms-like酪氨酸1(fit-1)受体(Shibuya et al.，1990， Oncogene，5：519-524；De Vries et al.，1992， Science，255：989-991)和KDR/FLK-1受体，也称为VEGF-R2。据报道血管内皮生长因子(VEGF)是伴随在体外的内皮细胞生长促进活性的血管内皮细胞特异性有丝分裂原。Ferrara & Henzel，1989， Biochein.Biophys.Res.Comm.，161：851-858；Vaisman et al.，1990， J.Biol.Chem.，265：19641-19566。在美国申请Ser.Nos.08/193,829，08/038,596和07/975,750中提出的信息强烈建议VEGF不仅是内皮细胞增生的原因，而且是正常性和病理性血管生成的主要调节剂。一般地参见Klagsburn & Soker，1993， Current Biology，3(10)699-702；Houck，et al.，1992， J.Biol.Chem.，267：26031-26037。
正常的血管发生和血管生成在多种生理过程诸如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和女性生殖过程诸如排卵期和妊娠后胎盘生长期黄体中卵泡发育之中扮演重要角色。Folkman & Shing，1992，J.Biological Chem.，267(16)：10931-34。失控性血管发生和/或血管生成与疾病诸如糖尿病有关，还与依赖血管形成以生长的恶性实体瘤有关。Klagsburn & Soker，1993， Current Biology，3(10)699-702；Folkham，1991， J.Natl Cancer Inst.，82：4-6；Weidner，et al.，1991， New Engl.J.Med.，324：1-5。
推测VEGF在血管生成和血管发生期间在内皮细胞增殖和迁移方面的作用说明了在这些过程中对KDR/FLK-1受体的重要作用。疾病诸如糖尿病(Folkman，198，in  XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis(Verstraeta，et al.，eds.)，pp.583-596，LeuvenUniversity Press，Leuven)和关节炎，以及恶性实体瘤生长可导致失控性血管生成。参见例如，Folkman，1971， N.Engl.J.Med.，285：1182-1186。VEGF特异性结合的受体对调节和调整血管发生和/或血管生成和包括由这些过程所引起的异常细胞生长的多种严重疾病是重要的和有力的治疗靶点。Plowman，et al.，1994， DN&P，7(6)：334-339。更具体地，在新血管形成中KDR/FLK-1受体的高特异性作用使其成为对治疗癌症和包括失控性血管形成的其他疾病的治疗方法的精选靶点。
因此，本发明提供了能够调节和/或调整酪氨酸激酶信号转导包括KDR/FLK-1受体信号转导的化合物以便抑制或促进血管生成和/或血管发生，即，当由配体如VEGF激活的时候抑制、预防或干预通过KDR/FLK-1转导的信号的化合物。尽管已相信本发明的化合物作用于受体或酪氨酸激酶信号转导途径中其他组分，但是它们还可直接作用于从失控性血管生成导致的肿瘤细胞。
尽管人和鼠基因“flk-I”受体配对物的命名法不同，但它们在很多方面是可互换的。鼠受体Flk-1和人的配对物KDR在细胞内区共享93.4％的同源性。同样地，鼠FLK-1结合人VEGF伴有与鼠VEGF相同的亲和力，因此可由源于任一物种的配体激活。Millauer et al.，1993， Cell，72：835-846；Quinn et al.，1993， Proc.Natl.Acad. Sci.USA，90：7533-7537。当共表达于293细胞(人胚肾成纤维细胞)中的时候，FLK-1还联合并随后酪氨酸磷酸化人RTK基质(例如PLC-γ或p85)。
依赖FLK-1受体的模型因此直接应用于了解KDR受体。例如，在鉴别调节鼠信号转导途径的化合物的方法中，鼠FLK-1受体的用途是直接用于鉴别可用于调节人信号转导途径的化合物，即，调节KDR相关的活性的化合物。因而，可以在合适的体内模型中确认在体外确定为KDR/FLK-1抑制剂的化学化合物。已经证明小鼠和大鼠两者的体内模型都对检测作用于KDR/FLK-1诱导的信号转导途径的制剂的临床潜力具有极好价值。
因此，本发明提供了通过影响KDR/FLK-1受体的酶促活性和干预KDR/FLK-1转导的信号调节、调整和/或抑制血管发生和/或血管生成的化合物。因而本发明提供了治疗很多种实体瘤包括但不限于成胶质细胞瘤、黑素瘤和Kaposi’s肉瘤，和卵巢癌、肺癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和表皮样癌的治疗方法。另外，数据提示施用抑制KDR/FLK-1介导的信号转导途径的化合物还可用于治疗血管瘤、restenois和糖尿病性视网膜病。
此外，本发明涉及通过其他受体介导途径，包括含flt-1的途径抑制血管发生和血管生成。
受体酪氨酸激酶介导的信号转导通过与特定的生长因子(配体)在细胞外相互作用开始，接着受体二聚、短暂刺激内部蛋白酪氨酸激酶活性和自磷酸化。细胞内信号转导分子的结合位点因此产生，并导致与一系列方便适当细胞应答例如，细胞分裂和对细胞外环境的新陈代谢的胞浆信号分子形成复合物。参见，Schlessinger and Ullrich，1992， Neuron 9：1-20。
KDR/FLK-1细胞内区与PDGF-β受体的(50.3％同源)和/或相关的flt-1受体的细胞内区的近同源性暗示了重叠信号转导途径的诱导。例如，对于PDGF-β受体，已显示src家族成员(Twamley et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7696-7700)、磷脂酰肌醇-3’-激酶(Hu et al.，1992， Mol.Cell.Biol.，12：981-990)、磷脂酶cγ(Kashishian & Cooper，1993， Mol.Cell.Biol.，4：49-51)、ras-GTP酶-活化蛋白(Kashi shian et al.，1992， EMBO J.，11：1373-1382)、PTP-ID/syp(Kazlauskas et al.，1993， Proc.Natl. Acad.Sci.USA，10 90：6939-6943)、Grb2(Advidsson et al.，1994，Mol.Cell.Biol.，14：6715-6726)和接合体分子Shc和Nck(Nishimura et al.，1993， Mol.Cell.Biol.，13：6889-6896)结合于包含不同自磷酸化位点的区域。一般地参见，Claesson-Welsh，1994， Prog.Growth Factor Res.，5：37-54。  因而，很可能由KDR/FLK-1激活的信号转导途径包括ras途径(Rozakis et al.，1992，Nature，360：689-692)、PI-3’-激酶、src介导和plcγ介导的途径。这些途径都可在内皮细胞中KDR/FLK-1的血管生成和/或血管发生效应中起重要作用。因此本发明的另一方面涉及本文中描述的按照由这些途径控制的过程调节血管生成和血管发生的有机化合物的用途。
相反，本发明的方法还包含并可治疗和预防血管的皱缩、收缩或关闭的病症诸如心瓣手术后的再狭窄。
纤维变性的病症指细胞外基质的异常形成。纤维变性的病症的实例包括肝硬化和肾小球系膜细胞增生病症。肝硬化以细胞外基质成分增加导致形成肝脏瘢痕为特征。导致肝脏瘢痕的增高的细胞外基质还可由病毒感染诸如肝炎引起。储脂细胞出现在肝硬化中起主要作用。其他涉及的纤维变性的病症包括动脉硬化。
肾小球系膜细胞增生病症指由小球系膜细胞异常增生引起的病症。肾小球系膜细胞增生病症包括人类肾疾病诸如肾小球性肾炎、糖尿病肾病和恶性肾硬化以及这些病症如血栓形成性微血管综合征、移植排斥和肾小球病。已将RTK PDGFR包含在肾小球系膜细胞增生的维持中。Floege et al.，1993， Kidney International 43：47S-54S。
很多癌症是细胞增生性病症，且如前所述，PKs与细胞增生性病症相关。因此，并不奇怪PKs诸如，例如RTK家族成员与癌症的发展相关。这些受体的一部分，象EGFR(Tuzi et al.，1991， Br.J.Cancer63：227-233，Torp et al.，1992， APMIS 100：713-719)、HER2/neu(Slamon et al.，1989， Science 244：707-712)和PDGF-R(Kumabeet al.，1992， Oncogene，7：627-633)在很多肿瘤中过表达和/或由自分泌环持续活化。事实上，在最常见和严重的癌症中这些受体过表达(Akbasak and Suner-Akbasak et al.，1992， J.Neurol.Sci.，111：119-133，Dickson et al.，1992， Cancer Treatment Res.61：249-273，Korc et al.，1992，J.Clin.Invest.90：1352-1360)且已证实了自分泌环(Lee and Donoghue，1992， J.Cell.Biol.，118：1057-1070，Korc et al.， supra，Akbasak and Suner-Akbasaket al.， supra)。例如，EGFR与鳞细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、肺癌和膀胱癌有关。HER2与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、胰腺癌和膀胱癌有关。PDGFR与成胶质细胞瘤和黑素瘤以及肺、卵巢和前列腺癌有关。RTK c-met也与恶性肿瘤形成有关。例如，c-met与，在其他癌症之中，结肠直肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、胃癌和肝细胞癌及淋巴瘤有关。另外，c-met还与白血病有联系。在Hodgkins病和Burkitts病患者中也已经检测到c-met基因的过表达。
除包含于营养支持和II型糖尿病中之外，IGF-IR还与数种类型的癌有关。例如，暗示IGF-I作为对数种肿瘤类型例如人乳腺癌细胞(Arteaga et al.，1989， J.Clin.Invest.84：1418-1423)和小肺肿瘤(Macauley et al.，1990， Cancer Res.，50：2511-2517)细胞自分泌生长刺激因子。另外，当完整包含于神经系统的正常生长和分化的同时，IGF-I还表现为人神经胶质瘤的自分泌刺激因子。Sandberg-Nordqvist et al.，1993， Cancer Res.53：2475-2478。IGF-IR和其配体在细胞增生中的重要性通过很多培养中由IGF-I刺激生长的细胞类型(成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T-淋巴细胞、骨髓细胞、软骨细胞和成骨细胞(骨髓干细胞))的事实来进一步支持。Goldring and Goldring，1991， Eukaryotic Gene Expression，1：301-326。Baserga和Coppola提出IGF-IR在转化机制中起到中心作用，并且同样地可以是对广泛的人恶性肿瘤优选的治疗干预靶点。Baserga，1995， Cancer Res.，55：249-252，Baserga，1994， Cell79：927-930，Coppola et al.，1994， Mol.Cell.Biol.，14：4588-4595。
STKs已经涉及很多类型的癌症包括，尤其是乳腺癌(Cance，etal.， Int.J.Cancer，54：571-77(1993))。
异常PK活性和疾病间的联合并不限于癌症。例如，RTKs与疾病诸如牛皮癣、糖尿病、子宫内膜异位、血管生成、动脉粥样化斑发展、Alzheimer’s病、再狭窄、von Hippel-Lindau病、表皮高增生、神经变性疾病、老年斑变性和血管瘤。例如，在角膜和真皮愈合中已经指出了EGFR。在II型糖尿病中显示胰岛素R和IGF-1R的缺损。在Plowman et al.，1994， DN&P 7：334-339中阐明了特异性RTKs与它们的治疗适应症之间的更全面的联系。
如前所示，不仅RTKs而且CTKs包括但不限于src、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr和yrk(由Bolen等综述，1992，FASEBJ.，6：3403-3409)涉及增生和代谢信号转导途径，并因此可期望，且已表明，包含多种本发明涉及的PTK-介导的病症。例如，在鸡中已显示变异的src(v-src)是瘤蛋白(pp60v-src)。而且，其细胞同系物pp60c-src，原癌基因传输很多受体的癌基因信号。EGFR或HER2/neu在肿瘤中的过表达导致pp60c-src的持续活化，它所独有的特征为恶性细胞但缺少正常细胞。另一方面，c-src表达缺陷的小鼠显示osteopetrotic表现型，提示c-src主要参与破骨细胞功能并可能包含在相关病症中。
类似地，Zap 70已包含在可能与自身免疫病相关的T细胞发信号中。
STKs与炎症(inflamation)、自身免疫病、免疫应答和高增生性病症诸如再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎和类风湿性关节炎有关。
PKs还包含于胚胎植入中。因而，本发明化合物可提供预防这种胚胎植入的有效方法并因此可用作计划生育药。可使用本发明化合物治疗或预防的其他病症是免疫性病症诸如自身免疫病、AIDS和心血管病症诸如动脉硬化。
最后，目前怀疑RTKs和CRKs都涉及超免疫病症。
一些本发明举例的化合物对数种PTKs的作用的实例显示于下面表2中。所示化合物和数据不以任何的方式对本发明的范围进行限制。B.环氧合酶-2抑制剂或COX-2抑制剂或环氧合酶-2抑制剂包括特异性抑制系列酶，环氧合酶-2，伴较少明显抑制环氧合酶-1的药剂。优选地，包括具有环氧合酶-2IC50少于约0.2μM，且还具有对环氧合酶-2比对环氧合酶-1的选择性抑制比率超过至少50的化合物，更优选至少100的化合物。更加优选地，化合物具有大于约1μM的环氧合酶-1 IC50，更优选大于10μM。
研究指出由环氧合酶合成的前列腺素在癌症的发生和发展中起重要作用。而且，COX-2在结肠、乳腺、肺、前列腺、食管、胰腺、子宫颈、卵巢、膀胱和头颈部肿瘤性损害中过表达。在数种体外和动物模型中，COX-2抑制剂抑制肿瘤生长和转移。
除癌症本身之外，COX-2还表达于邻近和在增生性和肿瘤性损害中生成血管的脉管系统，表明COX-2在血管生成中起作用。在小鼠和大鼠中，COX-2抑制剂都明显抑制bFGF-诱导的新血管形成。在文献(Koki et al.，Potential utility of COX-2 inhibitors inchemoprevention and chemotherapy.Exp.Opin.Invest.Drugs(1999)8(10)pp.1623-1638，因此将文献合并)中描述了COX-2抑制剂作为化学预防、抗血管生成和化学治疗剂的应用。HER-2/nue(ErbB2)的扩增和/或过表达发生于20-30％的人乳腺和卵巢癌以及5-15％的胃和食管癌，且与预后差有关。另外，近来已在体外发现在过表达HER-2/neu癌基因细胞中COX-2表达上调。(Subbaramaiah et al.，Increased expression of cyclooxygenase-2 in HER-2/neuoverexpressing breast cancer.Cancer Research(submitted 1999)，hereby incorporated by reference)。在这项研究中，HER-2/neu转化的乳腺上皮细胞与非转化的对照细胞系相比检测到明显升高的PGE2生产、COX-2蛋白和mRNA的水平。COX-2活性产物，即前列腺素，刺激增生，增加恶性细胞侵袭性并提高促进血管生成的血管内皮生长因子的生产。另外，HER-2/neu诱导血管生成因子诸如血管内皮生长因子的生产。
因此，预期将COX-2抑制剂与抗HER-2/neu抗体诸如trastuzumab(Herceptin_)和其他直接抑制HER-2/neu的疗法联合施用以便于治疗其中HER-2/neu过表达的癌症。
还预期随着其他癌基因包括但不限于c-myc、N-myc、L-myc、K-ras、H-ras、N-ras的扩增和/或过表达，COX-2水平升高。COX-2活性产物刺激细胞增生，抑制免疫监视，增加恶性细胞侵袭性并促进血管生成。因此，蛋白激酶抑制剂与本发明COX-2抑制剂联合施用可用于预防或治疗其中癌基因过表达的癌症。
特异性COX-2抑制剂可用于治疗癌症(WO 98/16227)且在数种动物模型中降低由多种生长因子(WO 98/22101)推进的血管生成。在以bFGF、血管内皮生长因子(VEGF)或众所周知的血管生成性质的蛋白carrageenan植入的大鼠中以COX-2抑制剂获得了抗血管生成。(Masferrer，et al.，89th Annual Meeting of the AmericanAssociation for Cancer Research，March 1998)。
                  药物组合物和施用
本发明化合物或其可药用盐可同样施用于人类患者，或者可在其中前述物质与合适的载体或赋形剂混合的组合物中施用。药物制备和施用的技术可见于“Remington’s Pharmacological Sciences”Mack Publishing Co.，Easton，PA.的最新版本。
如本文所用，“给予”和“施用”指为了预防或治疗PK相关病症的目的，将本发明式(I)化合物或其可药用盐或将含有式(I)化合物或其可药用盐的药物组合物提供给生物体。
合适的施用途径包括但不限于口、直肠、局部、跨黏膜或肠内施用或肌内、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内(intravitreal)、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选的施用途径是口服和胃肠外途径。
另外，可以以局部而不是系统方式施用化合物，例如，通过将常常在存储剂或缓释剂中的化合物直接注射入实体瘤中。
而且，可以在靶药转送系统中施用药物，例如，在以肿瘤特异性抗体涂敷的脂质体中。该脂质体目标将是肿瘤并将被肿瘤选择性吸收。
本发明药物组合物可通过本领域熟知的方法制造，例如通过常规的混合、溶解、粒化、包糖衣、磨细、乳化、装入胶囊、包埋或冻干方法。
依照本发明使用的药物组合物可在常规方式下使用一种或多种生理可接受载体，包括方便将活性化合物加工成可药用制剂的赋形剂和辅剂来制备。适当的制剂依赖于所选择的用药途径。
为了注射可将本发明化合物制备为水溶液，优选生理相容的缓冲液诸如Hank’s液、Ringer’s液或生理盐水。为了跨黏膜给药，在制剂中使用对所要透入的屏障合适的渗透剂。这些渗透剂通常是本领域中所知道的。
为了口服给药，化合物可通过将活性化合物与本领域熟知的可药用载体联合来制备。为了患者口服摄入，这些载体使本发明化合物能制备为片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、悬浮剂等。口服应用的药物制剂可使用固体赋形剂制造，任选磨碎最终的混合物，并在加入其他如果需要的合适的辅剂之后加工颗粒混合物以便获得片剂或糖衣剂的核。具体地，可用的赋形剂是填料诸如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂诸如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉和马铃薯淀粉以及其他物质诸如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸。还可使用盐诸如藻酸钠。
为糖衣剂的核提供合适的涂层。为这一目的，可使用浓缩的糖溶液，其可任选地含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣加入染料或色素，用于辨认或描述活性化合物剂量的不同的联合特征。
可用于口服的药物组合物包括明胶制成的推入配合胶囊，以及明胶和增塑剂诸如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可含与填料诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体，诸如油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。也可将稳定剂加入到这些制剂中。
可将胶囊包入棕色玻璃或塑料瓶以避光保护活性化合物。装有活性化合物胶囊制剂的容器必须在控制的室温(15-30℃)下保存。
为吸入给药，根据本发明使用的化合物可用气溶胶罐包装或喷雾器和合适的推进物，例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四-氟乙烷或二氧化碳，以气溶胶喷雾剂的形式便利地提供。就加压气雾剂来说，剂量单位可通过提供传送计量的阀来控制。胶囊和例如明胶的用在吸入器或吹药器的筒可制备成含所述化合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
该化合物还可制备用于胃肠外给药，例如，通过集合药团注射或连续的输注。注射制剂可呈现在单位剂量形式例如安瓿中或在伴有附加保存剂的多剂量容器中。所述组合物可采用这样的形式如悬浮液、溶液或在油或水载体中的乳状液，且可包含配方物质诸如悬浮、稳定和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药用组合物包括活性化合物的可溶解于水形式诸如但不限于盐的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可在亲脂性载体中制备。合适的亲脂性载体包括脂肪油诸如芝麻油、合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯和甘油三酯、或诸如脂质体的物质。水注射悬浮液可含增加悬浮液粘滞度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含合适的稳定剂和/或增加化合物溶解度以允许制备高浓度溶液的制剂。
此外，活性成分可以是粉末形式，在使用前与合适的载体例如消毒的不含致热原的水配制。
所述化合物还可使用，例如常规栓剂基质诸如可可油或其他甘油酯制备成直肠用组合物诸如栓剂或保留灌肠剂。
除前面描述的制剂之外，所述化合物还可制备成存储剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射给药。为了这种途径给药，本发明化合物可与合适的聚合或疏水物质(例如在有可药用油的乳状液中)用离子交换树脂制备，或制备为微溶的衍生物诸如但不限于微溶的盐。
用于本发明的疏水化合物的药物载体的非限制性实例是含苯甲醇、无极性的表面活性剂、水-可混溶的有机聚合物和水相的助溶剂系统，诸如VPD助溶剂系统。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v无极性的表面活性剂聚山梨醇酯80、和65％w/v聚乙二醇300的溶液，在纯乙醇中补足体积。VPD助溶剂系统(VPD：D5W)由在水溶液中与5％葡萄糖1∶1稀释的VPD组成。这种助溶剂系统充分溶解疏水化合物，且其本身对全身给药产生低毒性。自然地，如果没有破坏其溶解度和毒性特征这种助溶剂系统的比例可相当大地改变。此外，助溶剂成分本身可以变化：例如，其他低毒性无极性的表面活性剂可用来代替聚山梨醇酯80，聚乙二醇部分的大小可以变化，其他可生物相容的聚合物可取代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，并且其他糖或多糖可取代葡萄糖。
另外，可以使用其他疏水性药物组合物传送系统。脂质体和乳化剂是疏水药物传送载体的众所周知的实例。另外，还可使用某些有机溶剂诸如二甲亚砜，尽管常常以更高的毒性为代价。
此外，可使用缓释系统诸如含治疗药的固体疏水聚合物半透性基质来传送化合物。多种缓释材料已经建立并为本领域技术人员所熟知。根据它们的化学性质，缓释胶囊可释放化合物几周直到超过100天。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可使用其他用于蛋白稳定性的计划。
本文的药物组合物还可包括合适的固体或明胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇的聚合物。
本发明的许多PK调节化合物可提供为生理可接受盐，其中所述化合物可形成带负电的或带正电的种类。其中化合物形成带正电一部分的盐的实例包括但不限于季铵(本文他处所定义)；诸如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐的盐，其中季铵基团的氮原子是与适当的酸反应的本发明选择的化合物的氮。其中本发明化合物形成带负电种类的盐包括但不限于通过化合物中的羧酸基团与适当的碱反应形成的钠、钾、钙和镁盐(例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)2)等)。
适合用在本发明中的药物组合物包括以足以达到预期目的，例如调节PK活性或治疗或预防PK相关的病症的数量将活性成分包含在其中的组合物。
更具体地，治疗有效量含义是有效预防、减轻或改善疾病症状或者延长接受治疗的受试者的生存期的化合物量。
本领域技术人员有充分能力确定治疗有效量，尤其是在本文提供的详细公开的启示下。
对于用在本发明方法中任何化合物，治疗有效数量或剂量最初可从细胞培养方法估计。然后，该剂量可规划用在动物模型中以便获得包括象细胞培养中的IC50(即，达到PK活性的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环浓度范围。然后这些信息可用于更准确的确定人可用的剂量。
本文中描述的化合物毒性和治疗效应可通过标准药理学方法在细胞培养或实验动物来确定，例如通过对主体化合物测定IC50和LD50(这两者都在本文其他地方讨论)。从这些细胞培养方法和动物研究所获数据可用在规划对人使用的剂量范围。剂量可根据所用剂型和所应用的给药途径变化。正确的规划、给药途径和剂量可由负责医师根据患者的情况选择(参见，例如Fingl，et al.，1975，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”中第一章第一页)。
可单独调整剂量和间隔以提供足以维持激酶调节效应的活性种类的血浆水平。将这些血浆水平归类为最小有效浓度(MECs)。对每个化合物来说MEC可以变化，但是可从体外数据估计，例如，达到激酶50-90％抑制必需的浓度可使用本文中描述的方法确定。达到MEC必需的剂量将依靠个体的特征和给药的途径。可使用HPLC分析或生物分析来确定血浆浓度。
给药间隔还可用MEC值确定。化合物应该用保持血浆水平高于10-90％MEC的时间方案给药，优选在30-90％之间且最优选在50-90％之间。
目前，式(I)化合物的治疗有效量范围可从约0.25mg/m2到1500mg/m2每天；优选约3mg/m2/天。更加优选50mg/qm qd至400mg/qd。
对于治疗上述疾病，环氧合酶抑制剂的治疗有效量从约0.1mg到约10,000mg，优选约1.0mg到约1,000mg水平。
可与其他抗癌药联合以产生单一剂型的活性成分的数量将根据所治疗的主体和给药的特殊方式变化。
如果局部给药或选择性摄取，药物的有效局部浓度可不涉及血浆浓度和在本领域已知的可用于测定正确的剂量和间隔的其他步骤。
当然，所给化合物的数量要根据受治疗的主体、痛苦的严重程度、给药方式、主治医生的判断等。
如果需要的话，该组合物可呈现在包装或分散装置中，诸如FDA认可的试剂盒，其可包括一种或多种和活性成分的单位剂型。所述包装可以例如包括金属或塑料箔，诸如硬质泡沫塑料衬垫包装。包装和分散器还可附有与由控制生产、使用和销售的政府机构所规定的形式的容器有关的通知，该通知是由政府批准的深思熟虑的化合物或者人或兽给药的形式。这些通知，例如，对处方药物来说可具有由美国食品和药品管理局批准的标志或具有已批准的产品嵌入。含在可相容的药物载体中制备的本发明化合物的组合物还可制备，放置在适当的容器内，并标明治疗适应症。在标签上标明的合适的病症可包括治疗肿瘤、抑制血管生成、治疗纤维变性、糖尿病等。
本发明的另一个方面是本文所述化合物，或其盐或前药，可能与用于治疗上面讨论的疾病和病症的其他化疗药联合。例如，本发明的化合物、盐或前药可与烷化剂诸如氟尿嘧啶(5-FU)单独联合或进一步与下列药物联合：leukovorin；或其他烷化剂诸如但不限于，其他嘧啶类似物诸如UFT、capecitabine、gemcitabine和阿糖胞苷，烷基磺酸盐例如白消安(用于治疗慢性粒细胞性白血病)、improsulfan和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、carboquone、美妥替派和乌瑞替派；吖丙啶(ethyleneimine)和甲基蜜胺(methylmelamine)，例如六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺；和氮芥，例如苯丁酸氮芥(用于治疗慢性淋巴细胞性白血病、原发性巨球蛋白血症和非Hodgkin’s淋巴瘤)、环磷酰胺(用于治疗Hodgkin’s病、多发骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、Wilm’s瘤和横纹肌肉瘤)、雌氮芥、异环磷酰胺、novembrichin、泼尼莫司汀和尿嘧啶芥(用于治疗原发性血小板增多症、非Hodgkin’s淋巴瘤、Hodgkin’s病和卵巢癌)；和三嗪，例如氮烯咪唑胺(用于治疗软组织肉瘤)。
本发明的化合物、盐或前药还可用在与其他抗代谢化疗药联合，所述抗代谢化疗药诸如但不限于：叶酸类似物例如甲氨喋呤(用于治疗急性淋巴细胞性白血病、绒膜癌、蕈样霉菌病、乳癌、头颈癌和骨肉瘤)和蝶罗呤；和嘌呤类似物诸如治疗巯(基)嘌呤和发现用于急性粒细胞性、急性淋巴细胞性和慢性粒细胞性白血病的硫鸟嘌呤。
预期本发明的化合物、盐或前药还可用在与天然产物的化疗药联合，所述化疗药诸如但不限于：长春花属生物碱例如长春碱(用于治疗乳癌和睾丸癌)、长春新碱和长春地辛；epipodophylotoxin例如鬼臼乙叉苷、替尼泊甙，两者都用于治疗睾丸癌和Kaposi’s肉瘤；抗生素化疗药例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、丝裂霉素(用于治疗胃癌、子宫颈癌、结肠癌、乳癌、膀胱癌和胰腺癌)、放线菌素D、temozolomide、普卡霉素、博莱霉素(用于治疗皮肤、食管和泌尿生殖道癌症)；和酶促化疗药诸如L-天冬酰胺酶。
除上述之外，本发明的化合物、盐或前药还能用于与下列药物联合：铂配位复合物(顺铂等)；取代的脲诸如羟基脲；甲基肼(methylhydrazine)衍生物例如甲基苄肼；肾上腺皮质抑制药例如米托坦、氨基苯乙哌啶酮；和激素和激素拮抗剂诸如肾上腺皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮己酸酯)；雌激素(例如己烯雌酚(diethylstilbesterol))；抗雌激素药诸如三苯氧胺；雄激素例如丙酸睾酮；和芳香酶抑制剂诸如anastrozole。
其他本领域已知的抗肿瘤药可随同本发明的联合治疗一起使用。这些抗肿瘤药和其他的实例发表于优先权日为1998年12月23日的美国专利申请号60/113,786的申请文件和PCT申请出版号WO 00/38716，其公开通过文献在这里合成一体。
最后，也预期本发明化合物的联合将与米托蒽醌或紫杉醇联合用于有效治疗实体瘤癌症或白血病诸如但不限于急性骨髓性(非淋巴细胞性)白血病。
                       实施例
                     合成实施例
下面所给出的制备和实施例是为了使本领域技术人员更容易理解并实施本发明。它们不应该被认为是限制本发明的范围，而只是作为它们的说明和代表。
合成本发明的蛋白激酶抑制剂——式(I)化合物
一般合成程序
可使用下面一般方法学制备本发明的化合物：
将适当取代的2-羟吲哚(1当量)、适当取代的醛(1.2当量)和碱(0.1当量)在溶剂(1-2ml/mmol 2-羟吲哚)中混合，然后将所得混合物加热从约2到约12小时。冷却后，将形成的沉淀过滤，用冷乙醇或乙醚洗涤并真空干燥获得，固体产物。如果没有沉淀形成，将反应混合物浓缩，并将残余物与二氯甲烷/乙醚粉碎，过滤收集所得固体，然后干燥。任选地，可通过色谱法进一步纯化所获产物。
碱可以是有机碱和无机碱。如果使用有机碱，优选其为氮碱。有机氮碱的实例包括但不限于二异丙胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、1，8-二氮杂双环[5.4.1]十一-7-烯、吡咯烷和哌啶。
无机碱的实例包括但不限于氨、碱金属或碱土氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐和酰胺。碱金属包括锂、钠和钾，同时碱土包括钙、镁和钡。
在本发明目前的优选实施方案中，当溶剂是质子溶剂诸如水或乙醇的时候，所述碱是碱金属或碱土无机碱，优选碱金属或碱土氢氧化物。
在已知的有机合成一般原则和本文的公开——对预期反应来说碱是最适当的——的基础上，这对本领域技术人员来说将是清楚的。
反应在其中进行的溶剂可以是质子溶剂或非质子溶剂，优选它是质子溶剂。“质子溶剂”是具有共价结合于氧或氮原子的氢原子的溶剂，其将氢原子呈递给适当地酸性的溶质并因此能够通过氢键与其“共有”。质子溶剂的实例包括但不限于水和醇。
“质子溶剂”可以是极性的或无极性的但，无论如何，不含酸性氢，因此不能具有与溶质结合的氢。无极性质子溶剂的实例是但不限于戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯甲烷和四氯化碳。极性质子溶剂的实例是氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。
在本发明目前优选的实施方案中，溶剂是质子溶剂，优选水或醇诸如乙醇。
将反应在高于室温的温度进行。一般温度从约30℃到约150℃，优选约80℃到约100℃，最优选约为乙醇沸点的约75℃到约85℃。用“约”意思是温度范围优选在所示温度的摄氏10度范围内，更优选在所示温度的摄氏5度范围内，且最在所示温度的摄氏2度范围内。因此，例如，用“约75℃”意思是75℃±10℃，优选75℃±5℃且最优选75℃±2℃。
可以容易地用化学领域所熟知的技术合成2-羟吲哚和醛。本领域技术人员会懂得可有形成本发明化合物的其他合成方法，且本领域技术人员会懂得下面所述是为了举例而不是限制。
方法A：甲酰化吡咯
于-10℃向二甲基甲酰胺(3当量)逐滴加入POCl3(1.1当量)，其后加溶解在二甲基甲酰胺中的适当的吡咯。在搅拌2小时后，将反应混合物用H2O稀释并以10N KOH碱化到pH11。将形成的沉淀通过过滤收集，用H2O洗涤并在真空干燥箱中干燥，得到所需要的醛。
方法B：皂化吡咯羧酸酯
将吡咯羧酸酯和KOH(2-4当量)在EtOH中的混合物回流直到由薄层色谱(TLC)指示反应完成为止。将冷却的反应混合物用1N HCl酸化至pH3。将形成的沉淀通过过滤收集，用H2O洗涤并在真空干燥箱中干燥，得到所需要的吡咯羧酸。
方法C：酰胺化
向溶解在二甲基甲酰胺(0.3M)中的吡咯羧酸的搅拌溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(1.2当量)、1-羟基苯并三唑(1.2当量)和三乙胺(2当量)。加入适当的胺(1当量)并搅拌直到由TLC指示的反应完成为止。然后向反应混合物中加入乙酸乙酯，将所得溶液用饱和的NaHCO3和盐水(用过量的盐)洗涤，在无水MgSO4上干燥，浓缩获得所需要的酰胺。
方法D：醛与含羧酸取代基羟吲哚的缩合
在90-100℃将羟吲哚(1当量)、1当量的醛和1-3当量哌啶(或吡咯烷)在乙醇(0.4M)中的混合物搅拌直到由TLC指示的反应完成为止。然后将该混合物浓缩并将残余物用2N HCl酸化。将形成的沉淀用H2O和EtOH洗涤，然后在真空干燥箱中干燥得到产物。
方法E：醛与不含羧酸取代基羟吲哚的缩合
在90-100℃将羟吲哚(1当量)、1当量的醛和1-3当量哌啶(或吡咯烷)在乙醇(0.4M)中的混合物搅拌直到由TLC指示的反应完成为止。将该混合物冷却至室温，形成的固体通过真空过滤收集，用乙醇洗涤并干燥获得产物。如果冷却反应混合物没有形成沉淀，将该混合物浓缩并通过柱色谱法纯化。
C.羟吲哚合成的实施例
无论如何，合成代表性羟吲哚的下列实施例不以任何方式用于限制本发明的范围。在下面的公开基础上，其他合成羟吲哚的途径以及其他所用的羟吲哚对本领域技术人员是显而易见的。这些合成和羟吲哚是在本发明的范围和精神范围内的。
5-氨基-2-羟吲哚
在超过10％披钯碳上在甲醇中将5-硝基-2-羟吲哚(6.3g)氢化，获得3.0g(60％产率)标题化合物，为白色固体。
5-溴-2-羟吲哚
将在20mL乙腈中2-羟吲哚(1.3g)冷却到-10℃，且将2.0g N-溴琥珀酰亚胺缓慢搅拌加入。将该反应物在-10℃搅拌1小时且在0℃搅拌2小时。将沉淀收集，用水洗涤，干燥获得1.9g(90％产率)标题化合物。
4-甲基-2-羟吲哚
向19g悬浮在50mL干醚中的乙醇钾搅拌加入在20mL干醚中的草酸二乙酯(30mL)。将该混合物在冰浴中冷却，缓慢加入在20mL干醚中的20mL 3-硝基-氧基烯(3-nitro-o-xylene)。将浓暗红色混合物加热回流0.5小时，浓缩至暗红色固体，用10％氢氧化钠处理直到几乎全部固体溶解。将该暗红色混合物用30％过氧化氢处理直到红色变成黄色。将所得混合物另以10％氢氧化钠和30％过氧化氢处理直到暗红色不在存在。将固体过滤，并用6N盐酸将滤液酸化。将所得沉淀用真空过滤收集，用水洗涤，真空干燥得到9.8g(45％产率)2-甲基-6-硝基苯基乙酸，为近纯白色固体。在甲醇中在10％钯/碳上氢化，得到9.04g白色固体化合物。
7-溴-5-氯-2-羟吲哚
将5-氯-2-羟吲哚(16.8g)和19.6g N-溴琥珀酰亚胺悬浮在140mL乙腈中，并回流3小时。在回流2小时薄层色谱(二氧化硅，乙酸乙酯)显示5-氯-2-羟吲哚或N-溴琥珀酰亚胺(Rf0.8)、产物(Rf0.85)和二级产物(Rf0.9)，其比率在回流另1小时后不改变。将混合物冷却到10℃，将沉淀通过真空过滤收集，用25mL乙醇洗涤并在漏斗中吸干20分钟，获得14.1g湿的产物(56％产率)。将该固体悬浮在200mL性质改变的乙醇并通过搅拌和回流浆洗10分钟。将所得混合物在冰浴中冷却到10℃。将固体产物通过真空过滤收集，用25mL乙醇洗涤并在40℃真空干燥，获得12.7g(51％产率)7-溴-5-氯-2-羟吲哚。
5-氟-2-羟吲哚
将5-氟靛红(8.2g)溶解在50mL水合肼中并回流1.0小时。然后将反应混合物倾到入冰水中。然后将沉淀过滤，用水洗涤并在真空干燥箱中干燥，获得标题化合物。
5-硝基-2-羟吲哚
将2-羟吲哚(6.5g)溶解在25mL浓硫酸中，并将该混合物保持在-10到-15℃，同时逐滴加2.1mL发烟硝酸。加硝酸后，将反应混合物在0℃搅拌0.5小时并倾倒入冰水中。将沉淀通过过滤收集，用水洗涤并从50％乙酸结晶。然后将结晶产物过滤，用水洗涤并真空下干燥，获得6.3g(70％)5-硝基-2-羟吲哚。
5-氨基磺酰基-2-羟吲哚
向装有27mL氯磺酸的100mL烧瓶缓慢加入13.3g 2-羟吲哚。在添加过程中维持反应温度低于30℃。添加后，将反应混合物在室温搅拌1.5小时，加热到68℃1小时，冷却，并倾倒入水中。将沉淀用水洗涤并在真空干燥箱中干燥，获得11.0g 5-氯磺酰-2-羟吲哚(50％产率)，将其未进一步纯化使用。
将5-氯磺酰-2-羟吲哚(2.1g)加到在10mL乙醇中的10mL氢氧化铵中，并在室温搅拌过夜。将混合物浓缩，并通过真空过滤收集固体，获得0.4g(20％产率)标题化合物，为近纯白色固体。
5-异丙基氨基磺酰基-2-羟吲哚
向装有27mL氯磺酸的100mL烧瓶缓慢加入13.3g 2-羟吲哚。在添加过程中维持反应温度低于30℃。将反应混合物在室温搅拌1.5小时，加热到68℃ 1小时，冷却，并倾倒入水中。将形成的沉淀过滤，用水洗涤并在真空干燥箱中干燥，获得11.0g 5-氯磺酰-2-羟吲哚(50％)，将其未进一步纯化使用。
将3g 5-氯磺酰-2-羟吲哚、1.15g异丙基胺和1.2mL吡啶在50mL二氯甲烷中的悬浮液在室温搅拌4小时，期间白色固体形成。将固体通过真空过滤收集，用热乙醇浆洗，冷却，通过过滤收集并在40℃真空干燥过夜，获得1.5g(45％产率)5-异丙基氨基磺酰基-2-羟吲哚。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.69(s，br，1H，NH)，7.63(dd，J＝2 and 8Hz，1H)，7.59(d，J＝2Hz，1H)，7.32(d，J＝7Hz，1H，NH-SO2-)，6.93(d，J＝8Hz，1H)，3.57(s，2H)，3.14-3.23(m，1H，CH-(CH3)2)，0.94(d，J＝7Hz，6H，2xCH3).
5-苯基氨基磺酰基-2-羟吲哚
将5-氯磺酰-2-羟吲哚(1.62g，7mmol)、苯胺(0.782mL，8.4mmol)和吡啶(1mL)在二氯甲烷(20mL)中的悬浮液在室温搅拌4小时。将反应混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释，并以1N盐酸(16mL)酸化。将有机层用碳酸氢钠和盐水洗涤，干燥并浓缩。将残余物用乙醇(3mL)洗涤，然后在硅胶上进行色谱分析，以甲醇/二氯甲烷1∶9洗脱，得到5-苯基氨基磺酰基-2-羟吲哚。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.71(s，br，1H，NH)，10.10(s，br，1H，NH)，7.57-7.61(m，2H)，717-7.22(m，2H)，7.06-7.09(m，2H)，6.97-7.0(m，1H)，6.88(d，J＝8.4Hz，1H)，3.52(s，2H).
2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸吡啶-3-基酰胺
将5-氯磺酰-2-羟吲哚(3g)和3-氨基吡啶(1.46g)在吡啶(15mL)溶液在室温搅拌4小时，期间棕色固体出现。将固体过滤，用乙醇洗涤，并真空干燥，获得1.4g(38％产率)2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸吡啶-3-基酰胺。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.74(s，1H，NH)，10.39(s，1H，SO2NH)，8.27-8.28(d，1H)，8.21-8.23(m，1H)，7.59-7.62(m，2H)，7.44-7.68(m，1H)，7.24-7.28(m，1H)，6.69-6.71(d，1H)，3.54(s，2H).
MS m/z(APCI+)290.2.
5-苯基羟吲哚
搅拌和稍微加热下将5-溴-2-羟吲哚(5g，23.5mmol)溶解在110mL甲苯和110mL乙醇中。加四(三苯膦)钯(O)(1.9g，1.6mmol)后加入40mL(80mmol)2M碳酸钠水溶液。向此混合物加苯硼酸(benzeneboronic acid)(3.7g，30.6mmol)，并将所得混合物在100℃油浴中加热12小时。冷却反应，用乙酸乙酯(500mL)稀释，用饱和碳酸氢钠(200mL)、水(200mL)、1N HCl(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机层在硫酸镁上干燥，浓缩获得棕色固体。用二氯甲烷研制得到3.8g(77％)5-苯基-2-羟吲哚，为褐色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.4(br s，1H，NH)，7.57(dd，J＝1.8 and 7.2Hz，1H)，7.5 to 7.35(m，5H)，7.29(m，1H)，6.89(d，J＝8.2Hz，1H)，3.51(s，2H，CH2CO).
MS m/z 209[M+].
按类似方式可制备下列羟吲哚：
6-(3，5-二氯苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.46(br，1H，NH)，7.64(d，J＝1.8Hz，2H)，7.57(m，1H)，7.27(m，2H)，7.05(d，J＝1.1Hz，1H)，3.5(s，2H).
MS-EI m/z 277/279[M]+.
6-(4-丁基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.39(s，1H，NH)，7.49(d，J＝8.0Hz，2H)，7.25(d，J＝8Hz，3H)，7.17(dd，J＝1.5 and 7.8Hz，1H)，6.99(d，J＝1.5Hz，1H)，3.48(s，2H，CH2CO)，2.60(t，J＝7.5Hz，2Hz，CH2CH3)，1.57(m，2H，CH2)，1.32(m，2H，CH2)，0.9(t，J＝7.5Hz，3H，CH3).
6-(5-异丙基-2-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.29(br s，1H，NH)，7.16-.21(m，2H)，7.08(d，J＝2.4Hz，1H)，6.97-7.01(m，2H)，6.89(d，J＝0.8Hz，1H)，3.71(s，3H，OCH3)，3.47(s，2H，CH2CO)，2.86(m，1H，CH(CH3)2)，1.19(d，J＝6.8Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 281[M]+.
6-(4-乙基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.39(br s，1H，NH)，7.50(d，J＝8.2Hz，2H)，7.28(d，J＝8.2Hz，2H)，7.25(d，J＝7.5Hz，1H)，7.17(dd，J＝1.6 & 7.5Hz，1H)，6.99(d，J＝1.6Hz，1H)，3.48(s，2H，CH2CO)，2.63(q，J＝7.6Hz，2H，CH2CH3)，1.20(t，J＝7.6Hz，3H，CH2CH3).
MS-EI m/z 237[M]+.
6-(3-异丙基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.37(br s，1H，NH)，7.43(m，1H)，7.35-7.39(m，1H)，7.17-7.27(m，3H)，7.01(d，J＝1.8Hz，1H)，3.49(s，2H，CH2CO)，2.95(m，1H，CH(CH3)2)，1.24(d，J＝6.8Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 251[M]+.
6-(2，4-二甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.28(br s，1H，NH)，7.17(m，2H)，6.93(dd，J＝1.6& 7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝1.6Hz，1H)，6.63(d，J＝2.4Hz，1H)，6.58(dd，J＝2.4 & 8.5Hz，1H)，3.79(s，3H，OCH3)，3.74(s，3H，OCH3)，3.45(s，2H，CH2CO).
MS-EI m/z 269[M]+.
6-吡啶-3-基-1，3-二氢吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.51(s，1H，NH)，8.81(d，J＝2.5Hz，1H)，8.55(dd，J＝1.8 and 5.7Hz，1H)，8(m，1H)，7.45(dd，J＝5.7 and 9.3Hz，1H)，7.3(m，2H)，7.05(s，1H)，3.51(s，2H，CH2CO).
MS m/z 210[M]+.
2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-4-羧酸(3-氯-4-乙氧基苯基)-酰胺
向4-羧基-2-羟吲哚(200mg，1.13mmol)和3-氯-4-甲氧基苯胺(178mg，1.13mmol)在二甲基甲酰胺(15mL)中的溶液在室温加入苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP试剂，997mg，2.26mmol)，之后加4-二甲基氨基吡啶(206mg，1.69mmol)。将该混合物在室温搅拌72小时。然后用乙酸乙酯(300mL)将其稀释，用饱和碳酸氢钠(100mL)、水、2N盐酸(100mL)、水(3×200mL)和盐水洗涤。然后在硫酸镁上将其干燥，浓缩。将残余物用乙酸乙酯研磨，获得，为桃红色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.50(s，br，1H，NH)，10.12(s，br，1H，NH)，7.9(s，J＝2.5Hz，1H)，7.62(dd，J＝2.5 & 9Hz，1H)，7.38(d，J＝7.6Hz，1H)，7.32(t，J＝7.6Hz，1H)，7.13(d，J＝9Hz，1H)，6.98(d，J＝7.6Hz，1H)，3.83(s，3H，OCH3)，3.69(s，2H，CH2).
MS-EI m/z 316[M]+.
4-羧基-2-羟吲哚
在室温将三甲代甲硅烷基二重氮甲烷在己烷(2M)中的溶液逐滴加入到2.01g 2-氯-3-羧基-硝基苯在20mL甲醇中的溶液中，直到没有进一步气体放出发生。然后加入乙酸压制过量的三甲代甲硅烷基二重氮甲烷。将反应混合物真空下蒸发，并将残余物在干燥箱中干燥过夜。所获2-氯-3-甲氧基羰基硝基苯对下面的反应来水是足够纯的。
向2.1g氢化钠在15mL DMSO的冰冷悬浮液中加入丙二酸二甲酯(6.0mL)。将反应混合物在100℃搅拌1小时，然后冷却到室温。将2-氯-3-甲氧基羰基硝基苯(2.15g)加入到一份中，将加热到100℃1.5小时。然后将反应混合物冷却到室温，倾倒入冰水中，酸化至pH5并以乙酸乙酯提取。将有机层用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，并浓缩获得3.0g二甲基-2-甲氧基羰基-6-硝基苯基-丙二酸酯。
将二甲基-2-甲氧基羰基-6-硝基苯基-丙二酸酯(3.0g)在50mL 6N盐酸中回流过夜。将该混合物浓缩至干，加入20mL和1.1g锡(II)氯化物，将所得混合物回流2小时。将该混合物通过塞里塑料(Celite)过滤，浓缩并在硅胶上用乙酸乙酯∶己烷∶乙酸作为洗脱液进行色谱分析，获得0.65g(37％)4-羧基-2-羟吲哚，为白色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.96(s，br，1H，COOH)，10.74(s，br，1H，NH)，7.53(d，J＝8Hz，1H)，7.39(t，J＝8Hz，1H)，7.12(d，J＝8Hz，1H)，3.67(s，2H).
D.吡咯取代的2-吲哚满酮的合成
实施例1
4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸
用方法A甲酰化4-甲基-2-吡咯羧酸乙酯(市购)，获得(73％)5-甲酰基-4-甲基-2-吡咯羧酸乙酯。然后将其用方法B水解得到5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(58％)。
使用方法D将羟吲哚(133mg，1mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(153mg)缩合，得到268mg(100％)标题化合物，为橙红色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.84(s，br，1H，NH)，12.84(s，br，1H，COOH)，10.98(s，br，1H， NH)，7.82(d，J＝7.5Hz，1H)，7.67(s，1H，H-vinyl)，7.18(t，J＝7.5Hz，1H)，7.01(t，J＝7.5Hz，1H)，6.88(d，J＝7.5Hz，1H)，6.71(d，J＝2.2Hz，1H)，2.32(s，3H，CH3).
MS(negative mode)266.8[M-1]+.
实施例2
4-甲基-5-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2- 羧酸
使用方法D将1-甲基-1，3-二氢吲哚-2-酮(147mg，1mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(153mg)缩合，得到250mg(86％)标题化合物。
(插入p100-2)
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.82(s，br，1H，NH)，12.88(s，br，1H，7.83(d，J＝7.5Hz，1H)，7.65(s，1H，H-vinyl)，7.26(t，J＝7.5Hz，1H)，7.02-7.09(m，2H)，6.70(d，J＝2.2Hz，1H)，2.32(s，3H，CH3).
MS m/z 283.0[M+1]+.
实施例3
4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲 酯
使用方法E将羟吲哚(105mg，0.79mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(110mg，0.67mmol)缩合，得到153.2mg(81％)标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.98(s，br，1H，NH)，10.97(s，br，1H，NH)，7.82(d，J＝7.6Hz，1H)，7.67(s，1H，H-vinyl)，7.2(dt，J＝1.2 & 7.7Hz，1H)，7.01(dt，J＝1.2，7.7Hz，1H)，6.90(d，J＝7.6Hz，1H)，6.77(d，J＝2Hz，1H).
MS(ES)m/z 283[M++1].
实施例4
5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-2-羧 酸乙酯
使用方法E将5-氯-1，3-二氢吲哚-2-酮(2.22g，13.2mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯(2.43g)缩合，得到4.1g(94％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.95(s，br，1H，NH)，7.98(d，J＝2.2Hz，1H，H-4)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.18(dd，J＝2.2 & 8.3Hz，1H，H-6)，6.87(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，7.34(d，J＝1.8Hz，1H，H-3’)，4.27(q，J＝7.2Hz，2H，OCH2CH3)，2.33(s，3H，CH3)，1.29(t，J＝7.2Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 330[M+].
实施例5
5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-2-羧 酸
将5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯(1.3g，4mmol)和氢氧化钾在甲醇(25mL)和乙醇(25mL)中的混合物加热回流过夜。通过过滤将不溶解的物质除去，并以6N盐酸将该混合物中和，获得0.876g(70％)标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.80(s，br，1H，NH)，12.90(s，br，1H，COOH)，11.06(s，br，1H，NH)，8.02(d，J＝1.8Hz，1H，H-4)，7.81(s，1H，H-vinyl)，7.20(dd，J＝1.8 &8.3Hz，1H，H-6)，6.89(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，6.72(d，J＝1.8Hz，1H，H-3’)，2.35(s，3H，CH3).
MS-EI m/z 302[M+].
实施例6
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-2-羧 酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.16g，0.76mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺(0.2g，通过方法C制备)缩合，得到60mg(17％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，11.02(s，br，1H，NH)，8.42(t，J＝5.8Hz，1H，CONHCH2)，8.12(d，J＝1.8Hz，1H，H-4)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.30(dd，J＝1.8 & 8.4Hz，1H，H-6)，6.82(d，J＝8.4Hz，1H，H-7)，6.77(d，J＝2.4Hz，1H，H-3’)，3.22-3.31(m，2H，CH2)，2.38-2.43(m，6H，3xCH2)，2.35(s，3H，CH3)，1.62-1.71(m，6H，3xCH2).
MS-EI m/z 456 and 458[M+-1 and M++2].
实施例7
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-2-羧 酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.16g，0.75mmol)与5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(0.2g，通过方法C制备)缩合，得到30mg(8％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，11.02(s，br，1H，NH)，8.40(m，1H，CONHCH2)，8.12(d，J＝1.5Hz，1H，H-4)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.30(dd，J＝1.5 &8.2Hz，1H，H-6)，6.82(d，J＝8.2Hz，1H，H-7)，6.78(d，J＝2.4Hz，1H，H-3’)，3.23(m，2H，CH2)，2.38-2.45(m，6H，CH2 & N(CH2CH3)2)，2.35(s，3H，CH3)，1.61(m，2H，CH2)，0.93(t，J＝7.1Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 458 and 460[M+-1 and M++2].
实施例8
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(2-二 乙氨基乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(212mg，1mmol)与5-甲酰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(通过方法A、B和然后C从乙基吡咯-2-羧酸酯制备)缩合，得到162mg(38％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.53(s，br，1H，NH)，11.06(s，br，1H，NH)，8.37(t，1H，CONHCH2)，7.89(m，2H)，7.32(dd，J＝2.0Hz，1H)，6.96(s，1H)，6.80-6.84(m，2H)，3.3(m，2H，CH2)，2.45-2.55(m，6H，N(CH2CH3)2 & CH2)，0.95(t，J＝7.2Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 430 and 432[M+-1 and M++1].
实施例9
5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(2- 二乙氨基乙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(209mg，1mmol)与5-甲酰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺缩合，得到182mg(42％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.56(s，br，1H，NH)，11.06(s，br，1H，NH)，8.36(t，1H，CONHCH2)，7.77(s，1H，H-vinyl)，7.73(d，J＝7.8Hz，1H)，7.64(d，J＝7.2Hz，2H)，7.46(m，2H)，7.32(m，2H)，7.11(s，1H)，6.96(m，1H)，6.80(m，1H)，3.31-3.32(m，2H，CH2)，2.46-2.53(m，6H，N(CH2CH3)2 & CH2)，0.96(t，J＝6.9Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 428[M+].
实施例10
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(2-二 乙氨基乙基)-甲基-酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(212mg，1mmol)与5-甲酰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-二乙氨基乙基)甲基酰胺缩合，得到246mg(55％)标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.54(s，br，1H，NH)，11.06(s，br，1H，NH)，7.90(m，2H)，7.33(dd，J＝1.8 & 8.4Hz，1H)，6.82-6.85(m，3H)，3.55(s，br，2H，CH2)，3.25(s，br，3H，NCH3)，2.57(t，J＝6.5Hz，2H，CH2)，2.45(m，4H，N(CH2CH3)2)，0.91(m，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 444 and 446[M+-1 and M++1].
实施例11
5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(2- 二乙氨基乙基)甲基酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(209mg，1mmol)与5-甲酰基-1H-吡咯-2-羧酸(2-二乙氨基乙基)甲基酰胺缩合，得到277mg(63％)标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.58(s，br，1H，NH)，11.04(s，br，1H，NH)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.73(d，J＝7.8Hz，1H)，7.64(d，J＝7.5Hz，2H)，7.46(m，2H)，7.33-7 36(m，2H)，7.11(s，1H)，6.84(m，1H)，6.78(m，1H)，3.55(s，br，2H，CH2)，3.25(s，br，3H，NCH3)，2.58(t，2H，CH2)，2.44(m，4H，N(CH2CH3)2)，0.92(m，6H，N(CH2CH3)2).
实施例12
3-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(3- 二乙氨基丙基)酰胺
将羟吲哚(66.5mg，0.5mol)与5-甲酰基-3甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(通过B然后C从3-甲酰基-3甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯)缩合，得到39mg(21％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.34(s，br，1H，NH)，10.88(s，br，1H，NH)，7.62-7.67(m，3H)，7.17(m，1H)，6.99(m，1H)，6.87(d，J＝7.6Hz，1H)，6.63(d，J＝1Hz，1H)，3.26-3.32(m，2H，CH2)，2.41-2.48(m，6H，CH2 & N(CH2CH3)2)，2.29(s，3H，CH3)，1.63(m，2H，CH2)，0.93(t，J＝7.2Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 380[M+].
实施例13
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H-吡咯-2-羧 酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(106mg，0.5mmol)与5-甲酰基3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基乙基)酰胺缩合，得到35mg(15％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.35(s，br，1H，NH)，11.00(s，br，1H，NH)，7.89(d，J＝1.9Hz，1H，H-4)，7.80(s，1H，H-vinyl)，7.74(t，J＝5.3Hz，1H，CONHCH2)，7.31(dd，J＝1.9 & 8.4Hz，1H，H-6)，6.83(d，J＝8.4Hz，1H，H-7)，6.63(s，1H，H-3’)，3.26(m，2H，CH2)，2.41-2.48(m，6H，CH2 & N(CH2CH3)2)，2.29(s，3H，CH3)，1.63(m，2H，CH2)，0.93(t，J＝7.1Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 458 and 460[M+-1 and M++1].
实施例14
3-甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2- 羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(105mg，0.5mmol)与5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺缩合，得到67.8mg(30％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.37(s，br，1H，NH)，11.02(s，br，1H，NH)，7.23-7.73(m，11H)，3.29(m，2H，CH2)，2.41-2.48(m，6H，CH2 & N(CH2CH3)2)，2.29(s，3H，CH3)，1.64(m，2H，CH2)，0.94(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 456[M+].
实施例15
5-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H-吡咯 -2-羧酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-甲氧基-1，3-二氢吲哚-2-酮(82.5mg，0.5mmol)与5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺缩合，得到80mg(39％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.45(s，br，1H，NH)，10.70(s，br，1H，NH)，7.68-7.70(m，2H)，7.32(d，J＝1.8Hz，1H)，6.72-6.79(m，2H)，6.60(s，1H)，3.73(s，3H，OCH3)，3.28(m，2H，CH2)，2.41-2.48(m，6H，CH2 & N(CH2CH3)2)，2.29(s，3H，CH3)，1.63(m，2H，CH2)，0.93(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS m/z 410[M+].
实施例16
5-(6-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H-吡咯 -2-羧酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将6-甲氧基-1，3-二氢吲哚-2-酮(82.5mg，0.5mmol)与5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺缩合，得到63mg(31％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.22(s，br，1H，NH)，10.86(s，br，1H，NH)，7.39-7.63 and 6.37-6.55(m，6H)，3.73(s，3H，OCH3)，3.3(m，2H，CH2)，2.45(m，6H，CH2 &N(CH2CH3)2)，2.28(s，3H，CH3)，1.63(m，2H，CH2)，0.93(m，6H，N(CH2CH3)2).
MS m/z 410[M+].
实施例17
3-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四氢-2H-异 吲哚-1-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺
用方法A然后B将4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸乙酯(May，Donald A.；Lash，Timothy D.； J.Org.Chem.，1992，57：18，4820-4828)甲酰化，获得3-甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸。
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(1.43g，6.8mmol)与3-甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(1.97g)缩合，得到2.2g(67％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.47(s，1H，NH)，11.0(s，1H，NH)，8.0(d，1H，NH)，7.70(s，1H，CH)，7.28(dd，J＝2.1 and 8.2Hz，1H，ArH)，7.16(m，1H，ArH)，6.8(d，J＝8.3Hz，1H，ArH)，3.3(s，2H，CONH)，2.5(m，6H，3xNCH2)，2.78(br m，2H，pyrrole CH2)，2.72(br m，2H，pyrroleCH2)，1.7(br m，4H，N(CH2CH3)2)，1.74(br s，4H，CH2CH2CH2CH2)，0.96(t，J＝7.4Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 484 and 486[M+-1 and M++1].
实施例18
3-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四氢-2H-异 吲哚-1-羧酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(20mg，0.1mmol)与3-甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(30mg)缩合，得到33mg(46％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ10.9(s，1H，NH)，8.0(m，1H，NH)，7.68(m，1H，ArH)，7.4(m，1H，ArH)，7.29(d，J＝1.9 and 8.5Hz，1H，ArH)，6.8(d，J＝8Hz，1H，ArH)，2.7(br m，4H，2xNCH2)，2.4(m，8H，4xNCH2)，1.7(br m，4H，N(CH2CH3)2)，1.6(br m，2H，CH2CH2CH2)，0.93(t，J＝7.4Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 499 and 501[M+ and M++2].
实施例19
3-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四氢-2H-异 吲哚-1-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(80mg，0.4mmol)与3-甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺(120mg)缩合，得到43mg(22％)标题化合物，为橙褐色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.4(s，1H，NH)，10.9(s，1H，NH)，8.0(m，1H，NH)，7.69(m，1H，ArH)，7.49(m，1H，ArH)，7.28(d，J＝1.7 and 7.8Hz，1H，ArH)，6.8(d，J＝8Hz，1H，ArH)，3.3(br m，2H，2xNCH2)，2.8(m，4H，2xpyrroleCH2)，2.5(br m，4H，N(CH2CH3)2)，1.6(br m，8H，2xpyrroleCH2CH2，CH2CH2CH2 and CONHCH2).
MS-EI m/z 497 and 499[M+ and M++2].
实施例20
3-(2-氧代-6-吡啶-3-基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四氢 -2H-异吲哚-1-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将6-吡啶-3-基-1，3-二氢吲哚-2-酮(60mg，0.4mmol)与3-甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(80mg)缩合，得到50mg(38％)标题化合物，为带红颜色的固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.4(s，1H，NH)，11(s，1H，NH)，8.9(d，1H，NH)，8.7(dd，1H，ArH)，8.1(dd，1H，ArH)，7.9(d，1H，ArH)，7.6(s，1H，CH)，7.5(dd，1H，ArH)，7.3(dd，1H，ArH)，7.1(m，2H，ArH)，3.35(m，2H，CONHCH2)，2.8(m，4H，2xpyrroleCH2)，2.5(br m，6H，N(CHzCH3)2 and NCH2)，1.75(br s，4H，2xpyrroleCH2CH2)，0.9(t，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 484[M+].
实施例21
4-苯甲酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基 -1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
向苯甲酰氯(1当量)和氯化铝(1当量)在二氯乙烷中的混合物中在0℃加入3，5-二甲基-2-吡咯羧酸乙酯(1当量)。将该混合物在80℃搅拌4小时。然后将混合物用乙酸乙酯(EtOAc)和H2O提取。将合并的有机提取物用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤，干燥并浓缩，获得(51％)4-苯甲酰基-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸。
将4-苯甲酰基-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯(4.13g，15.2mmol)和硝酸铵高铈(ceric ammonium nitrate)(33g，4当量)在50mL四氢呋喃(THF)∶乙酸(HOAc)∶H2O 1∶1∶1中的混合物回流过夜。然后将反应混合物冷却，用EtOAc提取，然后用碳酸钠碱化至pH9。然后将有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩后进行柱色谱分析，获得3.25g(75％)4-苯甲酰基-5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯，为黄色固体。
使用方法D将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮与4-苯甲酰基-5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸缩合，得到4-苯甲酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸。
然后使用方法C将上述羧酸与N，N-二乙基-1，3-丙二胺偶联，得到标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ7.96(m，1H，CONHCH2)，7.76(d，J＝7.0Hz，2H)，7.68(t，1H)，7.56(m，2H)，7.40(s，2H)7.33(dd，J＝1.6 & 8.3Hz，1H，H-6)，6.84(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，3.33(m，2H，CH2)，2.42-2.46(m，6H，3xCH2)，2.10(s，3H，CH3)，1.65(m，2H，CH2)，0.94(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS Electron Impact m/z 564[M++1].
实施例22
4-苯甲酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基 -1H-吡咯-2-羧酸(3-吗啉-4-基丙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.10(s，1H，NH)，11.14(br s，1H，NH)，7.92(m，1H，CONHCH2)，7.75(m，2H)，7.69(t，1H)，7.56(m，2H)，7.42(m，2H)，7.33(dd，J＝1.9 &8.3Hz，1H，H-6)，6.85(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，3.56(m，4H，2xCH2)，3.33(m，2H，CH2)，2.35(m，6H，3xCH2)，2.10(s，3H，CH3)，1.70(m，2H，CH2).
实施例23
4-苯甲酰基-3-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.18(s，1H，NH)，11.14(br s，1H，NH)，8.01(m，1H，CONHCH2)，7.74(m，1H)，7.67(m，1H)，7.55(m，1H)，7.32(s，1H，H-vinyl)，7.17(m，1H)，6.92(m，1H)，3.36(m，2H，CH2)，2.44(m，6H，3xCH2)，2.11(s，3H，CH3)，1.65-1.75(m，6H，3xCH2).
MS Electron Impact m/z 482[M+].
实施例24
4-苯甲酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基 -1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.01(s，1H，NH)，11.18(br s，1H，NH)，7.98(m，1H，CONHCH2)，7.75(m，2H)，7.68(m，1H)，7.55(m，2H)，7.40(m，2H)，7.33(dd，J＝2.0 &8.2Hz，1H，H-6)，6.84(d，J＝8.2Hz，1H，H-7)，3.34(m，2H，CH2)，2.42-2.47(m，6H，3xCH2)，2.09(s，3H，CH3)，1.70(m，2H，CH2)，1.64(m，4H，2xCH2).
实施例25
4-苯甲酰基-3-甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基)-1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.15(s，1H，NH)，11.16(br s，1H，NH)，7.98(m，1H，CONHCH2)，7.77(d，J＝7.7Hz，2H)，7.69(m，1H)，7.53-7.63(m，4H)，7.44(m，2H)，7.33-7.37(m，2H)，7.24(s，2H)，7.12(s，1H)，3.36(m，2H，CH2)，2.43-2.48(m，6H，3xCH2)，2.12(s，3H，CH3)，1.74(m，2H，CH2)，1.69(m，4H，2xCH2).
MS Electron Impact m/z 558[M+].
实施例26
4-苯甲酰基-5-(6-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲 基-1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.99(s，1H，NH)，11.05(br s，1H，NH)，7.93(m，1H，CONHCH2)，7.72(m，2H)，7.65(m，1H)，7.54(m，2H)，7.15(s，1H，H-vinyl)，7.04(d，J＝8.4Hz，1H，H-4)，6.51(dd，J＝2.3 & 8.4Hz，1H，H-5)，6.44(d，J＝2.3Hz，1H，H-7)，3.74(s，3H，OCH3)，3.35(m，2H，CH2)，2.42-2.46(m，6H，3xCH2)，2.10(s，3H，CH3)，1.72(m，2H，CH2)，1.65(m，4H，2xCH2).
MS Electron Impact m/z 512[M+]
实施例27
4-苯甲酰基-5-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲 基-1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.24(s，1H，NH)，10.90(br s，1H，NH)，7.97(m，1H，CONHCH2)，7.75(d，J＝7.2Hz，2H)，7.69(m，1H)，7.56(m，2H)，7.24(s，1H，H-vinyl)，6.79(m，2H)，6.66(m，1H)，3.67(s，3H，OCH3)，3.34(m，2H，CH2)，2.43-2.48(m，6H，3xCH2)，2.14(s，3H，CH3)，1.71(m，2H，CH2)，1.66(m，4H，2xCH2).
MS Electron Impact m/z 512[M+].
实施例28
4-苯甲酰基-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基 -1H-吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.20(s，1H，NH)，11.14(br s，1H，NH)，8.03(m，1H，CONHCH2)，7.75(m，2H)，7.68(m，1H)，7.55(m，2H)，7 38(s，1H，H-vinyl)，7.08(m，1H)，7.01(m，1H)，6.87(m，1H)，3.34(m，2H，CH2)，2.42-2.48(m，6H，3xCH2)，2.09(s，3H，CH3)，1.70(m，2H，CH2)，1.65(m，4H，2xCH2).
MS Electron Impact m/z 500[M+].
实施例29
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢-吲哚-2-酮与4-乙酰基-5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(通过方法B然后C从4-乙酰基-5-甲酰基-3-甲基-1H-吡咯-2-羧酸乙酯制备)缩合，得到标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.19(s，1H，NH)，11.19(br s，1H，NH)，8.15(m，1H，CONHCH2)，8.11(s，1H，H-vinyl)，7.72(d，J＝1.8Hz，1H，H-4)，7.38(dd，J＝1.8 & 8.2Hz，1H，H-6)，6.87(d，J＝8.2Hz，1H，H-7)，3.27(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.46(m，9H，CH3 & 3xCH2)，1.64(m，2H，CH2)，0.93(t，J＝7.1Hz，6H，N(CH2CH3)2).
实施例30
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.14(m，1H，CONHCH2)，8.10(s，1H，H-vinyl)，7.70(d，1H，H-4)，7.36(dd，J＝1.6 & 8.1Hz，1H，H-6)，6.85(d，J＝8.1Hz，1H，H-7)，3.32(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.44(s，3H，CH3)，2.35-2.48(m，6H，3xCH3)，1.65-1.71(m，6H，3xCH2).
MS m/z 499 & 501[M+]&[M++2].
实施例31
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(3-吗啉-4-基丙基)酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.20(s，1H，NH)，11.26(br s，1H，NH)，8.09(m，2H，H-vinyl & CONHCH2)，7.73(d，J＝1.5Hz，1H，H-4)，7.38(dd，J＝1.5 & 8.3Hz，1H，H-6)，6.87(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，3.55(m，4H，2xCH2)，3.26(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.44(s，3H，CH3)，2.35(m，6H，3xCH3)，1.68(m，2H，CH2).
MS-EI m/z 514 & 516[M+-1]&[M++1].
实施例32
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(3-羟基丙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.17(s，1H，NH)，11.25(br s，1H，NH)，8.10(s，1H，H-vinyl)，8.03(m，1H，CONHCH2)，7.71(br s，1H，H-4)，7.37(br d，J＝8.4Hz，1H，H-6)，6.87(d，J＝8.4Hz，1H，H-7)，4.51(br s，1H，OH)，3.51(br s，2H，CH2)，3.36(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.43(s，3H，CH3)，1.70(m，2H，CH2).
MS-EI m/z 445 & 447[M+-1]&[M++1].
实施例34
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(2-吗啉-4-基乙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.19(s，1H，NH)，11.14(br s，1H，NH)，8.10(s，1H，H-vinyl)，7.84(m，1H，CONHCH2)，7.71(d，J＝1.8Hz，1H，H-4)，7.38(dd，J＝1.8 & 8.2Hz，1H，H-6)，6.87(d，J＝8.2Hz，1H，H-7)，3.58(m，4H，2xCH2)，3.40(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.45(m，CH3 & CH2).
MS-EI m/z 500 & 502[M+-1]&[M++1].
实施例35
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸(2-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.17(s，1H，NH)，11.23(s，1H，NH)，8.11(s，1H，H-vinyl)，7.91(m，1H，CONHCH2)，7.73(d，J＝1.9Hz，1H，H-4)，7.39(dd，J＝1.9 & 8.3Hz，1H，H-6)，6.88(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，3.40(m，2H，CH2)，2.62(m，2H，CH2)，2.57(s，3H，CH3CO)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.44(s，3H，CH3)，1.69(m，4H，2xCH2).
实施例36
4-乙酰基-5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-3-甲基-1H- 吡咯-2-羧酸[2-(4-羟基苯基)乙基]酰胺
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.21(s，1H，NH)，11.18(s，1H，OH)，9.09(s，1H，NH)，8.06-8.10(m，2H)，7.73(s，1H)，7.38(d，J＝7.8Hz，1H)，7.04(d，J＝7.1Hz，2H)，6.88(d，J＝7.8Hz，1H)，6.67(d，J＝7.1Hz，2H)，3.42(m，2H，CH2)，2.72(m，2H，CH2)，2.56(s，3H，CH3CO)，2.37(s，3H，CH3).
MS-EI m/z 507 & 509[M+-1]&[M++1].
实施例37
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H- 吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将2-氨基苯乙酮氢氯化物(1当量)、异丁酰乙酸乙酯(1.2当量)和乙酸钠(2.4当量)在H2O中的混合物在100℃搅拌18小时，然后冷却到室温。将水层轻轻移出，并将油溶解在乙酸乙酯中。然后将其用水和盐水洗涤，然后干燥获得(93％)2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯，为红棕色油。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.21(s，br，1H，NH)，7.14-7.27(m，5H)，6.70(d，J＝2.7Hz，1H)，4.02(q，J＝7.1Hz，2H，OCH2CH3)，3.65(m，1H，CH(CH3)2)，1.22(d，J＝7.5Hz，6H，CH(CH3)2)，1.04(t，J＝7.1Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 257[M+].
使用方法A将上述吡咯甲酰化，获得(41％)5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯，为带红色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.35(s，br，1H，NH)，9.14(s，1H，CHO)，7.36(s，5H)，3.96(q，J＝7.1Hz，2H，OCH2CH3)，3.74(m，1H，CH(CH3)2)，1.29(d，J＝6.9Hz，6H，CH(CH3)2)，0.90(t，J＝7.1Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 285[M+].
使用方法B将吡咯羧酸酯水解，获得(57％)5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸，为米黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ12.28(s，br，1H，COOH)，12.02(s，br，1H，NH)，9.10(s，1H，CHO)，7.35(s，5H)，3.81(m，1H，CH(CH3)2)，1.28(d，J＝6.9Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 257[M+].
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(120mg，0.31mmol)与5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(通过方法C制备)缩合，得到120mg(71％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.23(s，br，1H，NH)，11.08(s，br，1H，NH)，7.38-7.55(m，7H，Ar-H &CONHCH2)，7.30(s，1H，H-vinyl)，7.26(dd，J＝1.8 & 7.8Hz，1H)，6.85(d，J＝8.7Hz，1H)，3.36(m，1H，CH(CH3)2)，3.07(m，2H，CH2)，2 34(q，J＝7.1Hz，4H，N(CH2CH3)2)，2.22(t，J＝6.9Hz，2H，CH2)，1.40(m，2H，CH2)，1.31(d，J＝6.9Hz，6H，CH(CH3)2)，0.86(t，J＝7.1Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS m/z 565.1[M++1].
实施例38
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
将5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(127mg，0.28mmol)与3-吡咯烷-1-基-丙基酰胺(43mg，0.336mmol)缩合，得到140mg(66％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.40(s，br，1H，NH)，7.38-7.47(m，7H)，7.23-7.27(m，2H)，6.84(d，J＝8.1Hz，1H)，3.36(m，1H，CH(CH3)2)，3.08(m，2H，CH2)，2.30(m，4H，2xCH2)，2.20(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，1.62(m，4H，2xCH2)，1.42(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，1.31(d，J＝7.2Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 560 and 562[M+-1 and M++1].
实施例39
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H- 吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(57g，0.27mmol)与5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(120mg)缩合，得到78mg(53％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.23(s，br，1H，NH)，11.09(s，br，1H，NH)，7.38-7.51(m，6H)，7.25-7.28(m，2H)，7.19(t，1H，CONHCH2)，6.85(d，J＝7.8Hz，1H)，3.43(m，1H，CH(CH3)2)，3.11(m，2H，CH2)，2.28-2.39(m，6H，N(CH2CH3)2 & CH2，1.31(d，J＝6.9Hz，CH(CH3)2)，0.85(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2.
MS-EI m/z 548 and 550[M+-1 and M++1].
实施例40
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H- 吡咯-3-羧酸[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(53mg，0.25mmol)与5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]酰胺(300mg)缩合，得到65mg标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.22(s，br，1H，NH)，11.08(s，br，1H，NH)，7.23-7.50(m，9H)，6.85(d，J＝8.7Hz，1H)，3.37(m，1H，CH(CH3)2)，3.05(m，2H，CH2)，2.24(m，8H，4xCH2)，2.11(m，5H，CH2 & CH3)，1.42(m，2H，CH2)，1.31(d，J＝7.2Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 589 and 591[M+-1 and M++1].
实施例41
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-异丙基-4-苯基-1H- 吡咯-3-羧酸
使用方法D将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(170mg，0.8mmol)与5-甲酰基-2-异丙基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(205mg)缩合，得到210mg(58％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.31(s，br，1H，NH)，11.16(s，br，1H，NH)，7.26-7.44(m，7H)，7.11(s，1H，H-vinyl)，6.85(d，J＝7.8Hz，1H)，3.78(m，1H，CH(CH3)2)，1.34(d，J＝6.9Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 452[M++1].
实施例42
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-甲基-4-苯基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(44mg，0.21mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(70mg，与上面异丙基类似物相同的方式制备)缩合，得到0.03g(27％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.87(s，br，1H，NH)，11.11(s，br，1H，NH)，7.36-7.51(m，6H)，7.26(dd，J＝1.8 & 8.1Hz，1H)，7.2(s，1H，H-vinyl)，7.09(m，1H，CONHCH2)，6.83(d，J＝8.1Hz，1H)，3.17(m，2H，NCH2)，2.48(m，CH3)，2.29-2.35(m，6H，3xNCH2)，1.59(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 518 and 520[M+-1 and M++1].
实施例43
5-[6-(2-甲氧基-苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2-甲基 -4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将6-(2-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(50mg，0.21mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(70mg)缩合，得到0.04g(35％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.82(s，br，1H，NH)，11.02(s，br，1H，NH)，7.48(m，2H)，7.43(m，1H)，7.38(m，2H)，7.32(m，1H)，7.24(m，2H)，7.16(s，1H，H-vinyl)，7.08(m，2H)，7.03(m，1H)，7.0(m，2H)，3.74(s，3H，OCH3)，3.19(m，2H，NCH2)，2.49(m，CH3)，2.32-2.38(m，6H，3xNCH2)，1.59(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 546[M+].
实施例44
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(46mg，0.22mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(65mg)缩合，得到60mg(55％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.86(s，br，1H，NH)，11.09(s，br，1H，NH)，7.47-7.49(m，2H)，7.38-7.41(m，4H)，7.26(dd，J＝2.2 & 8.3Hz，1H)，7.21(s，1H，H-vinyl)，7.04(m，1H，CONHCH2)，6.77(d，J＝8.3Hz，1H)，3.15(m，2H，NCH2)，2.48(m，CH3)，2.16(t，J＝6.8Hz，2H，3xNCH2)，2.02(s，6H，2xNCH3).
MS m/z 493 and 494.8[M+ and M++2].
实施例45
5-[6-(2-甲氧基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺
将6-(2-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(53mg，0.22mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(65mg)缩合，得到0.05g(44％)标题化合物，为橙色树胶。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.82(s，br，1H，NH)，11.02(s，br，1H，NH)，7.37-7.52(m，5H)，7.32(m，1H)，7.22-7.27(m，2H)，7.16(s，1H)，7.08(m，2H)，7.03(m，1H)，7.0(m，2H)，3.74(s，3H，OCH3)，3.15(m，2H，NCH2)，2.49(m，CH3)，2.16(t，J＝6.5Hz，2H，NCH2)，2.02(s，6H，2xNCH3).
MS m/z 521[M++1].
实施例46
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-甲基-4-苯基-1H-吡 咯-3-羧酸乙酯
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(60mg，0.29mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(75mg)缩合，得到78mg(60％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ14.01(s，br，1H，NH)，11.13(s，br，1H，NH)，7.42-7.46(m，3H)，7.27-7.34(m，4H)，7.12(s，1H)，6.84(dd，J＝2.2 & 8.3Hz，1H)，3.99-4.03(m，2H，OCH2CH3)，2.61(s，3H，CH3)，0.98-1.03(m，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 450 and 452[M+-1 and M++1].
实施例47
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.47g，2.2mmol)与5-甲酰基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(0.75g)缩合，得到0.11g(42％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.86(s，br，1H，NH)，7.42-7.46(m，3H)，7.37-7.50(m，7H)，7.24-7.28(m，2H)，6.83(d，J＝8.1Hz，1H)，3.09(m，2H，NCH2)，2.45(s，3H，CH3)，2.38(q，J＝7.1Hz，4H，2xNCH2CH3)，2.26(t，J＝6.9Hz，2H，NCH2)，1.42(m，2H，NCH2)，0.87(t，J＝7.1Hz，6H，2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 535.0 and 537[M+ and M++2].
实施例48
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)酰胺
将3-氧代丁酸叔丁酯和亚硝酸钠(1当量)在乙酸中的混合物在室温搅拌，得到叔丁基-2-肟基-3-氧代丁酸酯。
将乙基-3-丁酸酯(1当量)、锌粉(3.8当量)和未加工的叔丁基-2-肟基-3-氧代丁酸酯在乙酸中在60℃搅拌1小时。将反应混合物倾倒入H2O中，收集滤液得到(65％)2-叔丁基氧基羰基-3，5-二甲基-4-乙氧基羰基吡咯。
将2-叔丁基氧基羰基-3，5-二甲基-4-乙氧基羰基吡咯和原甲酸三乙酯(1.5当量)在三氟乙酸中的混合物在1 5℃搅拌1小时。将反应物浓缩并将残余物纯化获得(64％)2，4-二甲基-3-乙氧基羰基-5-甲酰基吡咯，为黄色针状结晶。
用方法B将2，4-二甲基-3-乙氧基羰基-5-甲酰基吡咯水解得到(90％)5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12(br s，2H，NH and CO2H)，9.58(s，1H，CHO)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3).
MS m/z 267[M+].
用方法B将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.17g，0.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(0.2g，通过方法C制备)缩合，得到0.3g(83％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，br，1H，NH)，10.94(s，br，1H，NH)，8.07(d，J＝1.8Hz，1H，H-4)，7.75(s，1H，H-vinyl)，7.44(t，J＝5.2Hz，1H，CONHCH2)，7.24(dd，J＝1.8 & 8.4Hz，1H，H-6)，6.82(d，J＝8.4Hz，1H，H-7)，3.26-3.33(m，2H，NCH2)，2.42(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.38(t，J＝6.7Hz，2H，NCH2)，2.18(s，6H，N(CH3)2).
MS-EI m/z 430 and 432[M+-1 and M++1].
实施例49
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.17g，0.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(0.2g)缩合，得到0.13g(36％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.59(s，br，1H，NH)，10.93(，br，1H，NH)，7.85(d，J＝7.92Hz，1H，H-4)，7.63-7.65(m，3H)，7.40-7.47(m，3H，)，7.32-7.36(m，1H，Ar-H)，7.30(dd，J＝1.6 & 7.9Hz，1H，H-5)，7.11(d，J＝1.6Hz，1H，H-7)，3.28-3.34(m，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.38(t，J＝6.8Hz，2H，NCH2)，2.18(s，6H，N(CH3)2).
MS-EI m/z 428[M+].
实施例50
5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)酰胺
将5-氯-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.1g，0.6mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(0.15g)缩合，得到0.22g(90％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，10.98(，br，1H，NH)，7.96(d，J＝2.0Hz，1H，H-4)，7.75(s，1H，H-vinyl)，7.50(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2)，7.12(dd，J＝2.0 & 8.3Hz，1H，H-6)，6.86(d，J＝8.3Hz，1H，H-7)，3.26-3.31(m，2H，NCH2)，2.42(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，2.36(t，J＝6.6Hz，2H，NCH2)，2.17(s，6H，N(CH3)2).
MS-EI m/z 386[M+].
实施例51
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.17g，0.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(0.2g)缩合，得到0.09g(26％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，10.98(，br，1H，NH)，8.09(d，J＝1.7Hz，1H，H-4)，7.76(s，1H，H-vinyl)，7.42(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2)，7.24(dd，J＝1.7 & 8.0Hz，1H，H-6)，6.82(d，J＝8.0Hz，1H，H-7)，3.23-3.32(m，2H，NCH2)，2.46-2.55(m，6H，3xNCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.42(s，3H，CH3)，0.96(t，J＝7.2Hz，6H，2xNCH2CH2).
MS-EI m/z 458 and 460[M+-1 and M++1].
实施例52
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.09g，0.4mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺(0.1g)缩合，得到0.14g(81％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，10.98(，br，1H，NH)，8.09(d，J＝1.9Hz，1H，H-4)，7.76(s，1H，H-vinyl)，7.53(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2)，7.24(dd，J＝1.9 & 8.5Hz，1H，H-6)，6.81(d，J＝8.5Hz，1H，H-7)，3.29-3.35(m，2H，NCH2)，2.54(t，J＝6.9Hz，2H，NCH2)，2.47(m，under DMSO)，2.42(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.66-1.69(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 456 and 458[M+-1 and M++1].
实施例53
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.09g，0.4mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-咪唑-1-基丙基)酰胺(0.1g)缩合，得到0.1g(59％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.63(s，br，1H，NH)，10.99(，br，1H，NH)，8.09(d，J＝2.2Hz，1H，H-4)，7.77(s，1H，H-vinyl)，7.71(t，J＝5.7Hz，1H，CONHCH2)，7.65(s，1H，Ar-H)，7.25(dd，J＝2.2 & 8.4Hz，1H，H-6)，7.20(s，1H，Ar-H)，6.89(s，1H，Ar-H)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H，H-7)，4.02(t，J＝6.7Hz，2H，NCH2)，3.18(q，J＝6.7Hz，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，1.93(m，2H，CH2).
MS-EI m/z 467 and 469[M+-1 and M++1].
实施例54
5-[6-(2-甲氧基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺
将6-(2-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(30mg，0.13mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(30mg)缩合，得到0.06g(100％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，br，1H，NH)，10.89(s，br，1H，NH)，7.79(d，J＝8.4Hz，1H)，7.63(s，1H，H-vinyl)，7.46(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2)，7.28-7.35(m，2H)，6.99-7.11(m，4H)，3.76(s，3H，OCH3)，3.27-3.31(m，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.39(s，3H，CH3)，2.37(m，2H，NCH2)，2.18(s，6H，N(CH3)2).
MS-EI m/z 458[M+].
实施例55
5-[6-(3-甲氧基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)酰胺
将6-(3-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(30mg，0.13mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺(30mg)缩合，得到8mg(14％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.59(s，br，1H，NH)，10.92(s，br，1H，NH)，7.84(d，J＝7.6Hz，1H)，7.65(s，1H，H-vinyl)，7.42(m，1H，CONHCH2)，7.36(d，J＝7.8Hz，1H)，7.29(dd，J＝1.6 & 7.6Hz，1H)，7.20(d，J＝7.8Hz，1H)，7.14(d，J＝2.8Hz，1H)，7.11(d，J＝1.6Hz，1H)，6.91(dd，J＝2.8 & 7.8Hz，1H)，3.82(s，3H，OCH3)，3.21-3.33(m，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，2.36-2.40(m，2H，NCH2)，2.18(s，6H，N(CH3)2).
MS-EI m/z 458[M+].
实施例56
2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
用方法B将5-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(80mg，0.4mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(0.1g)缩合，得到79mg(46％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.66(s，br，1H，NH)，10.95(，br，1H，NH)，8.15(d，J＝1.2Hz，1H)，7.81(s，1H，H-vinyl)，7.71(d，J＝7.5Hz，1H)，7.40-7.47(m，4H)，7.31(m，1H)，6.95(d，J＝8.1Hz，1H)，3.2-3.31(m，2H，NCH2)，2.46-2.55(m，6H，3xNCH2)，2.44(s，6H，2xCH3)，0.96(t，J＝7.4Hz，6H，2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 456[M+].
实施例57
2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将5-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.04g，0.2mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(0.04g)缩合，得到标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.65(s，br，1H，NH)，10.96(，br，1H，NH)，8.15(d，J＝1.0Hz，1H)，7.80(s，1H，H-vinyl)，7.71(d，J＝7.2Hz，2H)，7.49(t，J＝6.3Hz，1H，CONHCH2)，7.41-7.46(m，3H)，7.31(m，1H)，6.95(d，J＝7.8Hz，1H)，4.08(m，4H，2xNCH2)，3.32(m，2H，NCH2)，2.55(t，J＝7.1Hz，2H，NCH2)，2.47(m，under DMSO)，2.43(s，6H，2xCH3)，1.66(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 454[M+].
实施例58
2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(3-咪唑-1-基丙基)酰胺
将5-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(8mg，0.04mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-咪唑-1-基丙基)酰胺(10mg)缩合，得到10mg(59％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.67(s，br，1H，NH)，10.96(，br，1H，NH)，8.16(d，J＝1.2Hz，1H)，7.81(s，1H，H-vinyl)，7.65-7.72(m，4H)，7.44(m，3H)，7.31(m，1H，CONHCH2)，7.21(s，1H，Ar-H)，4.02(t，J＝6.5Hz，2H，NCH2)，3.19(q，J＝6.5Hz，2H，CONHCH2)，2.44(s，6H，2xCH3)，1.93(m，2H，CH2CH2CH2).
MS-EI m/z 465[M+].
实施例59
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.08g，0.4mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(0.1g)缩合，得到65mg(38％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，10.99(，br，1H，NH)，7.86(d，J＝7.8Hz，1H)，7.62-7.66(m，3H)，7.40-7.47(m，3H)，7.28-7.36(m，2H)，7.10(d，J＝1.2Hz，1H)，3.26(m，2H，NCH2)，2.46-2.55(m，6H，3xNCH2)，2.44(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，0.97(t，J＝7.2Hz，6H，2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 456[M+].
实施例60
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(30mg，0.15mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(40mg)缩合，得到5.9mg(8.5％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，br，1H，NH)，10.99(，br，1H，NH)，7.86(d，J＝7.8Hz，1H)，7.63-7.66(m，3H)，7.51(m，1H，CONHCH2)，7.45(m，2H)，7.28-7.36(m，2H)，7.10(d，J＝1.5Hz，1H)，3.31(m，6H，3xNCH2)，2.55(t，J＝6.6Hz，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 454[M+].
实施例61
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(3-咪唑-1-基丙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(8mg，0.04mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-咪唑-1-基丙基)酰胺(10mg)缩合，得到7.3mg(43％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.62(s，br，1H，NH)，10.99(，br，1H，NH)，7.86(d，J＝8.2Hz，1H)，7.62-7.70(m，5H)，7 45(m，2H)，7.35(m，1H)，7.30(dd，J＝1.4 & 8.2Hz，1H)，7.21(s，1H)，7.10(d，J＝1.4Hz，1H)，6.89(s，1H)，4.02(t，J＝6.9Hz，2H，CH2)，3.19(m，2H，NCH2CH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，1.93(t，J＝6.9Hz，2H，NCH2).
MS-EI m/z 465[M+].
实施例62
5-[6-(3，5-二氯苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将6-(3，5-二氯苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(64mg，0.23mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(60mg)缩合，得到53mg(44％)标题化合物，为淡棕色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.62(s，br，1H，NH)，10.99(s，1H，NH)，7.89(d，J＝7.9Hz，1H，H-4)，7.69-7.71(m，3H)，7.55(m，1H，CONHCH2)，7.37(m，2H)，7.14(d，J＝1.4Hz，1H，H-7)，3.27(m，2H，NCH2)，2.48-2.58(m，6H，3xNCH2)，2.45(s，3H，CH3)，2.42(s，3H，CH3)，0.97(t，J＝6.8Hz，6H，3xNCH2CH3).
MS m/z 526.9[M++1]
实施例63
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-吡啶-3-基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基)-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将6-吡啶-3-基-1，3-二氢吲哚-2-酮(40mg，0.19mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(50mg)缩合，得到29mg(33％)标题化合物，为淡橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.62(s，br，1H，NH)，11.05(s，br，1H，NH)，8.86(s，br，1H)，8.53(d，J＝5.8Hz，1H)，8.04(m，1H)，7.91(d，J＝8.1Hz，1H)，7.70(s，1H，H-vinyl)，7.40-7.48(m，2H)，7.35(d，J＝7.5Hz，1H)，7.14(s，1H)，3.26(m，2H，NCH2)，2.48-2.55(m，3xNCH2)，2.42(s，3H，CH3)，2.38(s，3H，CH3)，0.96(t，J＝6.9Hz，6H，2xNCH2CH3).
MS-EI m/z 457[M+].
实施例64
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-吡啶-3-基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基)-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺
将6-吡啶-3-基-1，3-二氢吲哚-2-酮(60mg，0.28mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺(75mg)缩合，得到90mg(71％)标题化合物，为淡橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，11.05(s，br，1H，NH)，8.86(d，J＝1.5Hz，1H)，8.54(dd，J＝1.5 & 4.8Hz，1H)，8.05(m，1H)，7.91(d，J＝7.8Hz，1H)，7.70(s，1H，H-vinyl)，7.44-7.53(m，2H)，7.36(dd，J＝1.5 & 8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝1.2Hz，1H)，3.33(m，2H，NCH2)，2.47-2.57(m，6H，3xNCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 455[M+].
实施例65
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-吡啶-3-基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基)-1H-吡咯-3-羧酸(3-二甲基氨基-丙基)酰胺
将6-吡啶-3-基-1，3-二氢吲哚-2-酮(42mg，0.2mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二甲基氨基-丙基)酰胺(50mg)缩合，得到67mg(75％)标题化合物，为黄棕色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，br，1H，NH)，11.00(s，br，1H，NH)，8.86(s，br，1H)，8.54(s，br，1H)，8.04(m，1H)，7.90(d，J＝8.0Hz，1H)，7.69(s，1H，H-vinyl)，7.63(m，1H)，7.45-7.48(m，1H)，7.35(dd，J＝1.7 & 8.0Hz，1H)，7.15(d，J＝1.7Hz，1H)，3.21-3.27(m，2H，NCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.28(m，2H，NCH2)，2.14(s，6H，2xNCH3)，1.64(m，2H，CH2).
MS-EI m/z 443[M+].
实施例66
2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(3-二甲基氨基丙基)酰胺
将5-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(67mg，0.32mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二甲基氨基丙基)酰胺(81mg)缩合，得到40mg(28％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.66(s，br，1H，NH)，10.92(s，br，1H，NH)，8.14(s，1H)，7.79(s，1H)，7.71(m，2H)，7.62(m，1H)，7.44(m，3H)，7.32(m，1H)，6.95(m，1H)，3.33(m，2H，NCH2)，2.43(s，6H，2xCH3)，2.27(m，2H，NCH2)，2.13(s，6H，2xNCH3)，1.63(m，2H，CH2).
MS-EI m/z 442[M+].
实施例67
2，4-二甲基-5-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将5-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(1.5g，7.16mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(2g)缩合，得到1.3g(40％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.64(s，1H，NH)，10.91(s，1H，NH)，8.14(d，J＝1.4Hz，1H，ArH)，7.8(s，1H，ArH)，7.7(dd，J＝1.2 and 8.5Hz，2H，ArH)，7.6(t，J＝5.3Hz，1H，CONHCH2)，7.4(m，3H，ArH)，7.3(t，J＝7.4Hz，1H，ArH)，6.9(d，J＝8.0Hz，1H，ArH)，3.2(m，2H，CONHCH2)，2.5(m，12H，3xNCH2 and 2xCH3)，1.61(m，2H，CH2CH2CH2)，0.93(t，J＝6.7Hz，6H，NCH2CH3).
MS-EI m/z 470[M+].
实施例68
2，4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡 咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺
将6-苯基-1，3-二氢吲哚-2-酮(1.5g，7.16mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(2g)缩合，得到1.9g(57％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.58(s，1H，NH)，10.94(s，1H，NH)，7.8(d，J＝7.9Hz，1H，ArH)，7.6(m，4H，ArH)，7.4(t，J＝7.5Hz，2H，ArH)，7.3(m，2H)，7.1(d，J＝1.4Hz，1H，ArH)，3.2(m，2H，CONHCH2)，2.5(m，12H，3xNCH2 and 2xCH3)，1.61(m，2H，CH2CH2CH2)，0.93(t，J＝6.7Hz，6H，NCH2CH3).
MS-EI m/z 470[M+].
实施例69
3-[4-(3-二乙氨基丙基氨甲酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲 基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-4-羧酸(3-氯-4-甲氧基苯基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-4-羧酸(3-氯-4-甲氧基苯基)酰胺(1g，3.16mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(1g，3.58mmol)缩合，得到1.7g(85％)标题化合物，为黄橙色固体。
MS-EI m/z 578.2[M+].
实施例70
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.5g，2.36mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(3-二乙氨基丙基)酰胺(0.51g)缩合，得到0.84g标题化合物，为红橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.61(s，1H，NH)，10.99(s，1H，NH)，8.09(d，J＝1.8Hz，1H，ArH)，7.7(m，4H)，7.2(dd，J＝1.8 and 8.3Hz，2H，ArH)，6.8(d，J＝7.8Hz，1H，ArH)，3.3(br s，4H，2xNCH2)，3.2(m，2H，CONHCH2)，2.6(br s，2H，NCH2 and 2xCH3)，2.4(s，6H，2xCH3)，1.66(m，2H，CH2CH2CH2)，0.98(t，J＝7.1Hz，6H，NCH2CH3).
MS-EI m/z 472 and 474[M+-1 and M++1].
实施例71
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二异丙基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(100mg，0.47mmol)与5-甲酰基-2，4-二异丙基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(150mg)缩合，得到0.15g(62％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.97(s，1H，NH)，10.95(s，1H，NH)，8.09(d，J＝1.3Hz，1H，ArH)，7.84(m，1H)，7.79(s，1H)，7.23(dd，J＝1.3 and 8.1Hz，1H，ArH)，6.8(d，J＝8.1Hz，1H，ArH)，3.5(m，1H，CH)，3.3(m，3H，CH and NHCH2)，2.5(br m，6H，3xNCH2)，1.28(d，J＝6.9Hz，6H，2xCH3)，1.23(d，J＝6.6Hz，6H，2xCH3)，0.96(m，6H，2xCH2CH3).
MS-EI m/z 514 and 516[M+-1 and M++1].
实施例72
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二异丙基-1H-吡 咯-3-羧酸(3-二乙氨基-丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(90mg，0.42mmol)与5-甲酰基-2，4-二异丙基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基丙基)酰胺(140mg)缩合，得到54mg(25％)标题化合物，为红橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.98(s，1H，NH)，10.96(s，1H，NH)，8.09(d，J＝1.7Hz，2H)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.23(dd，J＝1.7 and 8.1Hz，1H，ArH)，6.82(d，J＝8.1Hz，1H，ArH)，3.5(m，1H，CH)，3.25(m，2H，NHCH2)，3.15(m，1H，CH)，2.7(br s，6H，3xNCH2)，1.7(brm，2H，CH2CH2CH2)，1.28(d，J＝6.9Hz，6H，2xCH3)，1.24(d，J＝5.9Hz，6H，2xCH3)，1.06(m，6H，2xCH2CH3).
MS-EI m/z 528 and 530[M+-1 and M++1].
实施例73
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二异丙基-1H-吡 咯-3-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(130mg，0.6mmol)与5-甲酰基-2，4-二异丙基-1H-吡咯-3-羧酸(3-吡咯烷-1-基丙基)酰胺(150mg，0.45mmol)缩合，得到36mg(15％)标题化合物，为褐橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.98(s，1H，NH)，10.97(s，1H，NH)，8.10(d，J＝1.6Hz，2H)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.23(dd，J＝1.6 and 7.6Hz，1H，ArH)，6.82(d，J＝7.6Hz，1H，ArH)，3.5(m，1H，CH)，3.25(m，2H，NHCH2)，3.15(m，1H，CH)，2.7(br s，6H，3xNCH2)，1.7(br m，6H，3xNCH2CH2)，1.28(d，J＝5.6Hz，6H，2xCH3)，1.24(d，J＝5.7Hz，6H，2xCH3).
MS-EI m/z 526 and 528[M+-1 and M++1].
实施例74
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(吡啶-4-基甲基)酰胺
将5-溴-1，3-二氢吲哚-2-酮(170mg，0.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(吡啶-4-基甲基)酰胺(200mg)缩合，得到14mg(4％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.67(s，1H，NH)，11.01(s，br，1H，NH)，8.51(dd，J＝1.6 & 4.3Hz，2H)，8.23(t，J＝6.0Hz，1H，CONHCH2)，8.11(d，J＝1.9Hz，1H)，7.78(s，1H，H-vinyl)，7.31(d，J＝6.0Hz，2H)，7.25(dd，J＝1.9 & 8.1Hz，1H)，6.82(d，J＝8.1Hz，1H)，4.45(d，J＝6.0Hz，2H，NCH2)，2.46(s，6H，2xCH3).
MS-EI m/z 450 and 452[M+-1 and M++1].
实施例75
5-[6-(4-丁基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将5-[6-(4-丁基苯基)]-1，3-二氢吲哚-2-酮(50mg，0.19mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(50mg)缩合，得到74mg(76％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.58(s，1H，NH)，10.93(s，br，1H，NH)，7.82(d，J＝7.9Hz，1H)，7.63(s，1H，H-vinyl)，7.54(d，J＝7.9Hz，2H)，7.46(m，1H，CONH)，7.26(m，3H)，7.09(s，1H)，3.30(m，2H，CH2)，2.52-2.63(m，4H，2xCH2)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.68(m，4H，2xCH2)，1.58(m，2H，CH2)，1.34(m，2H，CH2)，0.91(t，J＝7.2Hz，3H，CH2CH3).
MS-EI m/z 510[M+].
实施例76
5-[6-(5-异丙基-2-甲氧基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将6-(5-异丙基-2-甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(50mg，0.17mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(45mg)缩合，得到67mg(75％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，1H，NH)，10.82(s，br，1H，NH)，7.77(d，J＝7.9Hz，1H)，7.61(s，1H，H-vinyl)，7.45(m，1H，CONH)，7.0-7.19(m，5H)，3.73(s，3H，OCH3)，3.32(m，2H，CH2)，2.87(m，1H，CH(CH3)2)，2.56(m，2H，CH2)，2.48(m，4H，2xCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.68(m，4H，2xCH2)，1.21(d，J＝6.8Hz，6H，CH(CH3)2).
MS m/z 527.2[M++1].
实施例77
5-[6-(4-乙基-苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺
将6-(4-乙基-苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(45mg，0.19mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(50mg)缩合，得到60mg(65％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.59(s，1H，NH)，10.96(s，br，1H，NH)，7.83(d，J＝8.4Hz，1H)，7.64(s，1H，H-vinyl)，7.51-7.56(m，3H)，7.25-7.30(m，3H)，7.08(d，J＝1Hz，1H)，3.31(m，2H，CH2)，2.63(m，2H，CH2CH3)，2.55(m，2H，CH2)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.42(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2)，1.20(t，J＝7.5Hz，3H，CH2CH3).
MS-EI m/z 482[M+].
实施例78
5-[6-(2，4-二甲氧基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲 基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将6-(2，4-二甲氧基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(51mg，0.19mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(50mg)缩合，得到30mg(31％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.59(s，1H，NH)，10.86(s，br，1H，NH)，7.75(d，J＝7.8Hz，1H)，7.60(s，1H，H-vinyl)，749(m，1H，CONH)，7.22(d，J＝8.4Hz，1H)，7.03(m，1H)，6.97(s，1H)，6.58-6.65(m，2H)，3.79(s，3H，OCH3)，3.76(s，3H，OCH3)，3.33(m，2H，CH2)，2.55(m，2H，CH2)，2.50(m，4H，2xCH2)，2.42(s，3H，CH3)，2.39(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2).
MS-EIm/z 514[M+].
实施例79
5-[6-(3-异丙基苯基)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二 甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将6-(3-异丙基苯基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(48mg，0.19mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(50mg)缩合，得到59mg(63％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz；DMSO-d6)δ13.63(s，1H，NH)，10.97(s，br，1H，NH)，7.87(d，J＝7.8Hz，1H)，7.68(s，1H，H-vinyl)，7.24-7.55(m，6H)，7.13(s，1H)，3.34(m，2H，CH2)，3.30(m，1H，CH(CH3)2)，2.60(m，2H，CH2)，2.50(m，4H，2xCH2)，2.45(s，3H，CH3)，2.43(s，3H，CH3)，1.70(m，4H，2xCH2)，1.27(d，J＝6.9Hz，6H，CH(CH3)2).
MS-EI m/z 496[M+].
实施例80
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3(Z)-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺
将5-氟-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.54g，3.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺缩合，得到0.83g(55％)标题化合物，为黄绿色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.66(s，1H，NH)，10.83(s，br，1H，NH)，7.73(dd，J＝2.5 & 9.4Hz，1H)，7.69(s，1H，H-vinyl)，7.37(t，1H，CONHCH2CH2)，6.91(m，1H)，6.81-6.85(m，1H)，3.27(m，2H，CH2)，2.51(m，6H，3xCH2)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，0.96(t，J＝6.9Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 398[M+].
实施例80(另外合成)
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺
将水合肼(55％，3000mL)和5-氟靛红(300g)加热到100℃。另外的5-氟-靛红(500g)以每部分(100g)超过120分钟搅拌加入。将该混合物加热到110℃并搅拌4小时。将所得混合物冷却到室温，通过真空过滤收集固体获得未加工的(2-氨基-5-氟-苯基)-乙酰肼(748g)。将该酰肼悬浮于水(700mL)并以12N盐酸调节其pH到＜3。将该混合物室温搅拌12小时。通过真空过滤收集固体，并以水洗涤两次。将产物真空干燥，得到5-氟-1，3-二氢吲哚-2-酮(600g，73％产率)，为棕色粉末。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ3.46(s，2H，CH2)，6.75，6.95，7.05(3xm，3H，aromatic)，10.35(s，1H，NH).MS m/z 152[M+1].
将3，5-二甲基-1H-吡咯-2，4-二羧酸2-叔丁酯4-乙酯(2600g)和乙醇(7800mL)剧烈搅拌同时缓慢加入10N盐酸(3650mL)。温度从25℃升高到35℃并开始释放气体。将混合物加温到54℃，并搅拌另加热1小时，此时温度是67℃。将所得混合物冷却到5℃，并将32L冰和水缓慢加入。固体通过真空过滤收集，用水洗涤三次。将该固体通风干燥至恒定重量，得到2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(1418g，87％产率)，为略带粉红色的固体。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ2.10，2.35(2xs，2x3H，2xCH3)，4.13(q，2H，CH2)，6.37(s，1H，CH)，10.85(s，1H，NH).MS m/z 167[M+1].
将二甲基甲酰胺(322g)和二氯甲烷(3700mL)在冰浴中冷却到4℃，并搅拌加入磷酰氯(684g)。将固体的2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(670g)以每份超过15分钟缓慢加入。达到的最高温度是18℃。将该混合物加热回流1小时，在冰浴中冷却到10℃，且在剧烈搅拌下迅速加入1.6L冰水。温度升高到15℃。剧烈搅拌下加入10N盐酸(1.6L)。温度升高到22℃。允许混合物静置30分钟，并允许层分离。温度达到最高的40℃。在加入期间以允许温度达到并保持在55℃的速率用10N氢氧化钾(3.8L)将水层调节到pH12-13。在添加完成后，将该混合物冷却到10℃并搅拌1小时。所得固体通过真空过滤收集并以水洗涤四次，获得5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(778g，100％产率)，为黄色固体。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.25(t，3H，CH3)，2.44，2.48(2xs，2x3H，2xCH3)，4.16(q，2H，CH2)，9.59(s，1H，CHO)，12.15(br s，1H，NH).MS m/z 195[M+1].
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(806g)、氢氧化钾(548g)、水(2400mL)和甲醇(300mL)搅拌回流2小时，然后冷却到8℃。用二氯甲烷提取该混合物两次。保持温度在15℃下用1000mL10N盐酸将所获水层调节到pH4。加入水以便容易搅拌。所得固体通过真空过滤收集，用水洗涤三次，于50℃真空干燥，得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(645g，93.5％产率)，为黄色固体。
NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.43(2xs，2x3H，2xCH3)，9.57(s，1H，CHO)，12.07(br s，2H，NH+COOH).MS m/z 168[M+1].
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(1204g)和6020mL二甲基甲酰胺室温搅拌，同时加入1-(3-二甲基-氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2071g)、羟基苯并三唑(1460g)、三乙胺(2016mL)和二乙基乙烯二胺(1215mL)。将该混合物室温搅拌20小时。将该混合物用3000mL水、2000mL盐水和3000mL饱和碳酸氢钠溶液稀释，并且用10N氢氧化钠将pH调节到高于10。将该混合物用每次10％甲醇在二氯甲烷溶液5000mL洗涤两次，将提取物合并，在无水硫酸镁上干燥，旋转蒸发至干燥。将混合物用1950mL甲苯稀释并再次旋转蒸发至干。将残余物用3∶1己烷∶乙醚(4000mL)。将所得固体通过真空过滤收集，用400mL乙酸乙酯洗涤两次，在34℃真空干燥21小时，得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(819g，43％产率)，为淡棕色固体。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ0.96(t，6H，2xCH3)，2.31，2.38(2xs，2xCH3)，2.51(m，6H 3xCH2)，3.28(m，2H，CH2)，7.34(m，1H，amide NH)，9.56(s，1H，CHO)，11.86(s，1H，pyrrole NH).MS m/z 266[M+1].
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(809g)、5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(438g)、乙醇(8000mL)和吡咯烷(13mL)在78℃加热3小时。将该混合物冷却至室温，将固体通过真空干燥收集，用乙醇洗涤。将该固体与乙醇(5900mL)在72℃搅拌30分钟。将所得混合物冷却至室温。真空过滤收集所得固体，用乙醇洗涤并于54℃真空干燥130小时，得到5[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(1013g，88％产率)，为橙色固体。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ0.98(t，6H，2xCH3)，2.43，2.44(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，6H，3xCH2)，3.28(q，2H，CH2)，6.84，6.92，7.42，7.71，7.50(5xm，5H，aromatic，vinyl，CONH)，10.88(s，1H，CONH)，13.68(s，1H，pyrrole NH).MS m/z 397[M-1].
实施例81
3-[4-(2-二乙氨基乙基氨甲酰基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲 基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-羧酸
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-羧酸(80mg，0.45mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺缩合，得到210mg(92％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.6(s，1H，NH)，7.76(d，J＝8.0Hz，1H)，7.66(s，1H，H-vinyl)，7.57(dd，J＝1.5 & 8.0Hz，1H)，7.40-7.42(m，2H)，3.28(m，2H，CH2)，2.88(m，H-piperidine)，2.54(m，6H，3xCH2)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.56(m，H-piperidine)，0.97(t，J＝6.98Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS m/z 424[M+].
实施例82
5-(5-二甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸二甲基酰胺(90mg，0.38mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(100mg)缩合，得到100mg(54％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.65(s，1H，NH)，11.30(s，br，1H，NH)，8.25(d，1H)，7.92(s，1H，H-vinyl)，7.48-7.53(m，2H)，7.07(d，J＝8.2Hz，1H)，3.33(m，2H，CH2)，2.61(s，6H，N(CH3)2)，2.56(t，2H，CH2)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.45(s，3H，CH3)，2.44(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 485[M+].
实施例83
5-[5-(3-氯-苯基氨磺酰)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸(3-氯-苯基)酰胺(120mg，0.38mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(100mg)缩合，得到150mg(69％)标题化合物，为黄橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.55(s，1H，NH)，11.26(br s，1H，NH)，10.30(brs，1H，NH)，8.26(d，1H)，7.79(s，1H，H-vinyl)，7.51-7.57(m，2H)，7.22(t，J＝8.1Hz，1H)，7.15(m，1H)，7.07(m，1H)，7.0(m，2H)，3.44(m，2H，CH2)，2.57(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.44(s，3H，CH3)，2.43(s，3H，CH3)，1.68(m，4H，2xCH2).
MS m/z 568[M+].
实施例84
2，4-二甲基-5-[2-氧代-5-(吡啶-3-基氨磺酰)-1，2-二氢吲哚-3-亚 基甲基]-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸吡啶-3-基酰胺(110mg，0.38mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)酰胺(100mg)缩合，得到150mg(74％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.58(s，1H，NH)，8.21(d，J＝2.0Hz，2H)，8.04(m，1H)，7.76(s，1H，H-vinyl)，7.49-7.54(m，2H)，7.41(m，1H)，7.14(m，1H)，6.94(d，J＝8.5Hz，1H)，3.33(m，2H，CH2)，2.56(t，J＝7.06Hz，2H，CH2)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.43(s，6H，2xCH3)，1.68(m，4H，2xCH2).
MS m/z 535[M+].
实施例85
3-[3，5-二甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-4- (2-羟基乙基)-1，3-二氢吲哚-2-酮
将4-(2-羟基乙基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(71mg，0.4mmol)与3，5-二甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-甲醛(carbaldehyde)缩合，得到90mg(55％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ14.25(s，1H，NH)，10.88(s，1H，NH)，7.57(s，1H，H-vinyl)，7.03(m，1H)，6.75-6.82(m，2H)，4.86(m，1H，OH)，3.70(m，2H，CH2)，3.04(m，2H，CH2)，2.48(m，4H，2xCH2)，2.28(br s，7H)，2.19(s，3H，CH3)，2.18(s，3H，CH3).
MS m/z(+ve)4.09.3[M+].
实施例86
3-[3，5-二甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2- 氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸苯基酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸苯基酰胺(110mg，0.4mmol)与3，5-二甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-基-甲醛(100mg)缩合，得到50mg(24％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.52(s，1H，NH)，11.26(s，1H，NH)，10.08(s，1H，NH)，8.21(d，J＝1.6Hz，1H)，7.75(s，1H，H-vinyl)，7.50(dd，J＝1.6 & 8.3Hz，1H)，7.19(m，2H)，7.10(m，2H)，6.97(m，2H)，2.49(m，4H，2xCH2)，2.28(m，10H，2xCH3 & 2xCH2)，2.18(s，3H，CH3).
MS-EI m/z 519[M+].
实施例87
5-(5-二甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸二甲基酰胺(90mg，0.38mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(100mg)缩合，得到80mg(43％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ11.30(s，1H，NH)，8.27(d，J＝1.7Hz，1H)，7.94(s，1H，H-vinyl)，7.49(dd，J＝1.7 & 8.0Hz，1H)，7.44(m，1H，CONHCH2CH2)，7.07(d，J＝8.0Hz，1H)，3.26(m，2H，CH2)，2.60(s，6H，N(CH3)2)，2.53(m，2H，CH2)，2.45-2.50(m，10H，2xCH3 & N(CH2CH3)2，0.96(t，J＝7.2Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS-EI m/z 487[M+].
实施例88
5-[5-(3-氯苯基氨磺酰)-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基]-2，4- 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺
将2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸(3-氯-苯基)酰胺(120mg，3.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)酰胺(100mg)缩合，得到80mg(37％)标题化合物，为黄色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.55(s，1H，NH)，11.24(s，1H，NH)，10.29(s，1H，NH)，8.25(d，J＝1.87Hz，1H)，7.79(s，1H，H-vinyl)，7.52(dd，J＝1.87 & 8.3Hz，1H)，7.42(m，1H，CONHCH2CH2)，7.22(t，J＝8.02Hz，1H)，7.15(t，J＝2Hz，1H)，7.08(m，1H)，7.0(m，2H)，3.27(m，2H，CH2)，2.48-2.57(m，6H，3xCH2)，2.45(s，3H，CH3)，2.44(s，3H，CH3)，0.97(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2)
MS m/z 570.1[M+].
实施例95
3-(2-氧代-5-苯基-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四氢-2H- 异吲哚-1-羧酸乙酯
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.74(s，1H，NH)，11.00(s，1H，NH)，8.13(d，J＝1.7Hz，1H)，7.74(s，1H，H-vinyl)，7.70(d，J＝7.7Hz，2H)，7.49(dd，J＝1.7 & 8.0Hz，1H)，7.44(t，J＝7.7Hz，2H)，7.32(m，1H)，6.96(d，J＝8.0Hz，1H)，4.26(q，J＝7.0Hz，2H，OCH2CH3)，2.79(m，2H，CH2)，2.72(m，2H，CH2)，1.73(m，4H，2xCH2)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 412[M+].
实施例99
3-(2-氧代-5-苯基氨磺酰-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-4，5，6，7-四 氢-2H-异吲哚-1-羧酸乙酯
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.64(s，1H，NH)，11.33(s，1H，NH)，10.07(s，1H，NH)，8.24(d，J＝1.8Hz，1H)，7.74(s，1H，H-vinyl)，7.57(dd，J＝1.8 & 8.0Hz，1H)，7.21(t，J＝7.6Hz，2H)，7.11(d，J＝7.6Hz，2H)，6.99(d，J＝8.0Hz，1H)，6.98(d，J＝7.6Hz，1H)，4.27(q，J＝7.0Hz，2H，OCH2CH3)，2.80(m，2H，CH2)，2.73(m，2H，CH2)，1.73(m，4H，2xCH2)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 491[M+].
实施例109
3-[3-(吗啉-4-羰基)-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-基亚甲基]-2-氧 代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-羧酸
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，1H，NH)，12.75(br s，1H，COOH)，11.08(s，1H，NH)，7.85(d，J＝7.8Hz，1H)，7.71(s，1H，H-vinyl)，7.62(dd，J＝1.4 & 7.8Hz，1H)，7.41(d，J＝1.4Hz，1H)，3.65(m，4H，2xCH2)，3.55(m，4H，2xCH2)，2.81(m，2H，CH2)，2.54(m，2H，CH2).1.73(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 421[M+].
实施例112
5-溴-3-[3-(吡咯烷-1-羰基)-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-基亚甲 基]-1，3-二氢-吲哚-2-酮
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.56(s，1H，NH)，1100(s，1H，NH)，8.05(d，J＝1.8Hz，1H)，7.74(s，1H，H-vinyl)，7.28(dd，J＝1.3 & 8.3Hz，1H)，6.83(d，J＝8.3Hz，1H)，3.57(m，4H，2xCH2)，2.79(m，2H，CH2)，2.65(m，2H，CH2)，1.88(m，4H，2xCH2)，1.71(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 439 & 441[M+-1]&[M++1].
实施例114
3-(3-二甲基氨基甲酰基-4，5，6，7-四氢-2H-异吲哚-1-基亚甲基)-2- 氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-羧酸
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.60(s，1H，NH)，12.72(br s，1H，COOH)，11.05(s，1H，NH)，7.85(d，J＝7.9Hz，1H)，7.72(s，1H，H-vinyl)，7.62(dd，J＝1.3 & 7.9Hz，1H)，7.42(d，J＝1.3Hz，1H)，3.03(s，6H，N(CH3)2)，2.81(m，2H，CH2)，2.55(m，2H，CH2)，1.73(m，4H，2xCH2).
MS-EI m/z 379[M+].
实施例115
4-甲基-5-(5-甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H- 吡咯-3-羧酸
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)□13.56(br s，1H，NH)，8.24(d，J＝1.5Hz，1H)，7.86(s，1H，H-vinyl)，7.74(d，J＝2.96Hz，1H)，7.56(dd，J＝1.5 & 8.1Hz，1H)，7.20(br m，1H，NHCH3)，7.03(d，J＝8.1Hz，1H)，2.57(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3).
MS-EI m/z 361[M+].
实施例116
{[4-甲基-5-(4-甲基-5-甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基 甲基)-1H-吡咯-3-羰基]-氨基}-乙酸乙酯
用方法A将4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(lit.ref.D.O.Cheng，T.L.Browman and E.LeGoff；J.Heterocyclic Chem；1976；13；1145-1147)甲酰化，用方法B水解，随后酰胺化(方法C)，获得[(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨基]-乙酸乙酯。
将4-甲基-5-甲基氨磺酰-2-羟吲哚(50mg，0.21mmol)与[(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨基]-乙酸乙酯(100mg，0.42mmol)和哌啶(0.1mL)在乙醇(2mL)中缩合，获得50mg(52％)标题化合物。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.59(s，1H，NH)，11.29(v.br.s，1H，NH-CO)，8.33(t，J＝5.8Hz，1H，CONHCH2)，7.83(d，J＝3.11Hz，1H)，7.80(s，1H，H-vinyl)，7.71(d，J＝8.5Hz，1H)，7.34(br m，1H，NHCH3)，6.89(d，J＝8.5Hz，1H)，4.11(q，J＝7.1Hz，2H，OCH2CH3)，3.92(d，J＝5.8Hz，2H，GlyCH2)，2.86(s，3H，CH3)，2.48(s，3H，CH3)，2.42(d，J＝4.71Hz，3H，HNCH3)，1.20(t，J＝7.1Hz，3H，OCH2CH3).
MS-EI m/z 460[M+].
实施例117
{[4-甲基-5-(5-甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基) -1H-吡咯-3-羰基]-氨基}-乙酸乙酯
将5-甲基氨基磺酰基-2-羟吲哚(0.06g，0.22mmol)、[(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨基]-乙酸乙酯(0.075g，0.27mmol)和哌啶(2滴)在乙醇(5mL)中的混合物在密封管中于90℃加热12小时。冷却后，将沉淀通过真空过滤收集，用乙醇洗涤，用二氯甲烷/乙醚研磨并干燥，获得0.035g(36％)标题化合物，为黄棕色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.6(s，1H，NH)，11(v.br.s，1H，NH-CO)，8.30(t，J＝5.7Hz，1H，CONHCH2)，8.25(d，J＝1.2Hz，1H)，7.88(s，1H，H-vinyl)，7.84(d，J＝3.3Hz，1H)，7.57(dd，J＝1.9 & 8.5Hz，1H)，7.14(br m，1H，NHCH3)，7.04(d，J＝8.5Hz，1H)，4.11(q，J＝6.7Hz，2H，OCH2CH3)，3.92(d，J＝5.7Hz，2H，GlyCH2)，2.55(s，3H，CH3)，2.41(m，3H，NCH3)，1.20(t，J＝6.7Hz，3H，OCH2CH3).
MS m/z 446[M+].
实施例118
{[4-甲基-5-(5-甲基氨磺酰-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基) -1H-吡咯-3-羰基]-氨基}-乙酸
将[(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-羰基)-氨基]-乙酸乙酯(0.142g，0.59mmol)和1N NaOH(1.2mL)在甲醇(10mL)中的混合物室温搅拌1小时。将反应物浓缩并将残余物与5-甲基氨基磺酰基-2-羟吲哚(0.13g，0.48mmol)和哌啶(0.12mL)在乙醇(12mL)中缩合，得到0.11g(52％)标题化合物。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.98(br s，1H，NH)，8.17(s，1H)，7.80(s，1H)，7.75(d，J＝3.1Hz，1H)，7.51(dd，J＝2 & 8.2Hz，1H)，7.21(m on br s，2H)，6.97(d，J＝8.1Hz，1H)，3.41(d，J＝4.2Hz，2H，CH2NH)，2.54(s，3H，pyrrole-CH3)，2.39(s，3H，ArCH3).
MS m/z 417[M-1]+.
实施例120
5-甲基-2-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.77(br s，1H，NH)，12.49(s，1H，COOH)，11.07(s，1H，NH)，8.39(s，1H，H-vinyl)，7.43(d，J＝7.47Hz，1H)，7.20(t，J＝7.47Hz，1H)，7.03(t，J＝7.47Hz，1H)，6.91(d，J＝7.47Hz，1H)，6.49(d，J＝1.53Hz，1H)，2.34(s，3H，CH3).
MS m/z 269[M+H]+.
实施例121
5-甲基-2-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-3-羧酸乙 酯
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.79(s，1H，NH)，11.08(s，1H，NH)，8.31(s，1H，H-vinyl)，7.45(d，J＝7.52Hz，1H)，7.20(t，J＝7.52Hz，1H)，7.03(t，J＝7.52Hz，1H)，6.91(d，J＝7.52Hz，1H)，6.50(d，J＝2.1Hz，1H)，4.26(q，J＝7.2Hz，2H，OCH2CH3)，2.33(s，3H，CH3)，1.32(t，J＝7.2Hz，3H，OCH2CH3).
MS m/z 297.1[M+H]+.
实施例122
2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-5-甲基-1H-吡咯-3-羧 酸乙酯
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.72(s，1H，NH)，11.16(s，1H，NH)，8.29(s，1H，H-vinyl)，7.53(d，J＝2.0Hz，1H)，7.35(dd，J＝2.0 & 8.05Hz，1H)，6.87(t，J＝8.05Hz，1H)，6.53(d，J＝2.4Hz，1H)，4.28(q，J＝7.03Hz，2H，OCH2CH3)，2.35(s，3H，CH3)，1.33(t，J＝7.03Hz，3H，OCH2CH3).
MS m/z 375 & 377[M+H]+.
实施例123
2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-5-甲基-1H-吡咯-3- 羧酸
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.72(s，1H，NH)，12.57(s，1H，COOH)，11.19(s，1H，NH)，8.36(s，1H，H-vinyl)，7.51(d，J＝1.4Hz，1H)，7.34(dd，J＝1.4 & 8.17Hz，1H)，6.87(t，J＝8.17Hz，1H)，6.52(d，J＝2.5Hz，1H)，2.35(s，3H，CH3).
MS m/z 347 & 349[M+H]+.
实施例124
2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-5-甲基-1H-吡咯-3- 羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺
向2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(250mg，1.63mmol)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(376mg，1.2当量)、1-羟基苯并三唑(265mg，1.2当量)、三乙胺(0.45mL，2当量)和1-(2-氨基乙基)吡咯烷(0.23mL，1.1当量)。在室温搅拌过夜后，将反应物用饱和碳酸氢钠和盐水(用过量盐)稀释并以10％甲醇在二氯甲烷中提取。将合并的有机层用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥并浓缩得到130mg 2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺。
将5-溴-2-羟吲哚(106mg，0.5mmol)、2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺(125mg，1当量)和哌啶(0.2mL)在乙醇(2mL)中的混合物在密封管中于80℃加热1小时，然后冷却。所形成的沉淀通过真空过滤收集，用乙醇和乙酸乙酯洗涤，并干燥获得标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ13.62(s，1H，NH)，11.06(br s，1H，NH)，8.56(s，1H，H-vinyl)，8.15(m，1H，CONHCH2)，7.48(d，J＝1.8Hz，1H)，7.31(dd，J＝1.8 & 7.9Hz，1H)，6.86(d，J＝7.9Hz，1H)，6.60(d，J＝2.3Hz，1H)，3.35(m，2H，HNCH2CH2)，2.56(t，J＝6.91Hz，2H，HNCH2CH2)，2.35(s，3H，CH3)，1.67(m，4H，2xCH2).
MS m/z 443/445[M+ and M++2].
实施例125
2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-5-甲基-1H-吡咯-3- 羧酸(2-二乙氨基乙基)-酰胺
向2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(320mg，2.1mmol)在二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(483mg，1.2当量)、1-羟基苯并三唑(340mg，1.2当量)、三乙胺(0.59mL，2当量)和N，N-二-乙基乙烯二胺(0.32mL，1.1当量)。在室温搅拌过夜后，将反应物用饱和碳酸氢钠和盐水(用过量盐)稀释并以10％甲醇在二氯甲烷中提取。将合并的有机层用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥并浓缩得到2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)-酰胺。
将5-溴-2-羟吲哚(106mg，0.5mmol)、2-甲酰基-5-甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基乙基)-酰胺(126mg，1当量)和哌啶(0.2mL)在乙醇(2mL)中的混合物在密封管中于80℃加热1小时，然后冷却。所形成的沉淀通过真空过滤收集，用乙醇和乙酸乙酯洗涤，并干燥获得标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ13.62(s，1H，NH)，11.11(br s，1H，NH)，8.54(s，1H，H-vinyl)，8.1(m，1H，CONHCH2)，7.49(d，J＝2.2Hz，1H)，7.31(dd，J＝2.2 & 8.3Hz，1H)，6.86(d，J＝8.3Hz，1H)，6.58(d，J＝2.24Hz，1H)，3.31(m，2H，HNCH2CH2)，2.59(m，6H，3xCH2)，2.36(s，3H，CH3)，0.99(t，J＝6.8Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS m/z 445/447[M+ and M++2].
实施例126
2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基]-1H-吡咯-3-羧 酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺
将1，3-二氢-吲哚-2-酮(266mg，2mmol)、5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(530mg，2mmol)和哌啶(1滴)在乙醇中的混合物于90℃加热2小时。将反应物冷却到室温，所产生的沉淀通过真空过滤收集，用乙醇洗涤，并干燥获得422mg(55％)标题化合物，为淡黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.7(s，1H，NH)，10.9(s，1H，NH)，7.88(d，J＝7.6Hz，1H)，7.64(s，1H，H-vinyl)，7.41(t，J＝5.4Hz，1H，NH)，7.13(dt，J＝1.2 & 7.6Hz，1H)，6.99(dt，J＝1.2 & 7.6Hz，1H)，6.88(d，J＝7.6Hz，1H)，3.28(m，2H)，2.48-2.55(m，6H)，2.44(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，0.97(t，J＝7.2Hz，6H，N(CH2CH3)2).
MS+ve APCI 381[M++1].
实施例127
5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺
将5-氯-1，3-二氢-吲哚-2-酮(335mg，2mmol)、5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(530mg，2mmol)和哌啶(1滴)在乙醇中的混合物于90℃加热2小时。将反应物冷却到室温，所产生的沉淀通过真空过滤收集，用乙醇洗涤，并干燥获得565mg(68％)标题化合物，为橙色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.65(s，1H，NH)，11.0(s，1H，NH)，7.98(d，J＝2.1Hz，1H)7.77(s，1H H-vinyl)，7.44(t，NH)，7.13(dd，J＝2,1 & 8.4Hz，1H)6.87(d，J＝8.4Hz，1H)，3.28(g，2H)，2.48-2.53(m，6H)，2.44(s，3H，CH3)，2.43(s，3H，CH3)，0.97(t，J＝7.0Hz，6H，N(CH2CH3)2)
MS+ve APCI 415[M++1].
实施例128
2，4-二甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-3- 羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺
将1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
MS+ve APCI 379[M++1].
实施例129
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺
将5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
MS+ve APCI 397[M++1].
工艺放大过程
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(61g)、5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(79g)、乙醇(300mL)和吡咯烷(32mL)回流4.5小时。将乙酸(24mL)加入该混合物，并继续回流30分钟。将所得混合物冷却至室温，将固体通过真空过滤收集并以乙醇洗涤两次。将该固体在40％丙酮在含12N盐酸(6.5mL)水(400mL)中搅拌130分钟。将所获固体通过真空过滤收集，获得5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(86g，79％产率)，为橙色固体。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ2.48，2.50(2xs，6H，2xCH3)，6.80，6.88，7.68，7.72(4xm，4H，aromatic and vinyl)，10.88(s，1H，CONH)，12.12(s，1H，COOH)，13.82(s，1H，pyrrole NH).MS m/z 299[M-1].
将5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(100g)和二甲基甲酰胺(500mL)搅拌，加苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(221g)、1-(2-氨基乙基)吡咯烷(45.6g)和三乙胺(93mL)。将该混合物在室温搅拌2小时。将固体产物通过真空过滤收集，以乙醇洗涤。将所得固体通过在乙醇(500mL)中搅拌于64℃浆洗1小时，并冷却到室温。将所得固体通过真空过滤收集，用乙醇洗涤，真空干燥获得5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺(101.5g，77％产率)。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ1.60(m，4H，2xCH2)，2.40，2.44(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，4H，2xCH2)，2.57，3.35(2xm，4H，2XCH2)，7.53，7.70，7.73，7.76(4xm，4H，aromatic and vinyl)，10.88(s，1H，CONH)，13.67(s，1H，pyrrole NH).MS m/z 396[M+1].
实施例130
5-(5-氨-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺
将5-氯-1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
MS+ve APCI 413[M++1].
实施例131
2，4-二甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-3- 羧酸(2-二甲基氨基乙基)-酰胺
将1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.63(s，1H，NH)，10.90(s，1H，NH)，7.78(d，J＝7.8Hz，1H)，7.63(s，1H H-vinyl)，7.48(t，1H，NH)，7.13(dt，1H)，6.98(dt，1H)，6.88(d，J＝7.7Hz，1H)，3.31(q，J＝6.6Hz，2H)，2.43(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，2.38(t，J＝6.6Hz，2H)，2.19(s，6H，N(CH2CH3)2)
MS+ve APCI 353[M++1].
实施例132
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)-酰胺
将5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.68(s，1H，NH)，10.90(s，1H，NH)，7.76(dd，J＝2.4 &9.4Hz，1H)，7.71(s，1H H-vinyl)，7.51(t，1H，NH)，6.93(m，1H)，6.84(dd，J＝4.6 & 8.4Hz，1H)，3.31(q，J＝6.6Hz，2H)，2.43(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，2.38(t，J＝6.6Hz，2H)，2.19(s，6H，N(CH2CH3)2)
MS+ve APCI 371[M++1].
实施例193
5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸(2-乙氨基-乙基)-酰胺
将5-甲酰氨-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-乙氨基-乙基)-酰胺(99g)、乙醇(400mL)、5-氟-2-羟吲哚(32g)和吡咯烷(1.5g)搅拌回流3小时。将该混合物冷却到室温并通过真空过滤收集固体。将所获固体于60℃在乙醇中搅拌，冷却到室温并通过真空过滤收集。将产物真空干燥获得5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-乙氨基-乙基)-酰胺(75g，95％产率)。
1H-NMR(dimethylsulfoxide-d6)δ1.03(t，3H，CH3)，2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，2.56(q，2H，CH2)，2.70，3.30(2xt，4H，2xCH2)，6.85，6.92，7.58，7.72，7.76(5xm，5H，aromatic，vinyl and CONH)，10.90(br s，1H，CONH)，13.65(br s，1H，pyrrole NH).MS m/z 369[M-1].
实施例195
5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸(2-二乙基-N-氧代氨基-乙基)-酰胺
方法A：
将5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(598mg)和二氯甲烷(60mL)在冰浴中用3-氯过苯甲酸(336mg)处理，并将混合物室温搅拌过夜。将溶剂旋转蒸发并将残余物悬浮在甲醇(20mL)中。加入含氢氧化钠(240mg)的水(20mL)，将所得混合物搅拌1小时。将沉淀通过真空过滤收集，用5mL水洗涤并真空干燥，获得5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基-N-氧代氨基-乙基)-酰胺(510mg，82％产率)，为橙色固体。
1H-NMR(DMSO-d6)δ13.72(br s，1H，NH)，11.02(br s，1H，CONH)，9.81(br s，1H，CONH)，7.75(dd，1H，aromatic)，7.70(s，1H，aromatic)，6.93(td，1H，aromatic)，6.84(m，1H，aromatic)，3.63(m，2H，CH2)，3.29(m，2H，CH2)，3.14(m，4H，2xCH2)，2.47(s，1H，CH3)，2 45(s，3H，CH3)，1.64(t，6H，2xCH3).MS m/z415[M+1].
方法B：
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)-酰胺(10g)悬浮于二氯甲烷(100mL)中，并在冰浴中冷却。搅拌加入三氯过苯甲酸(13.1g)，该混合物允许加温到室温，然后搅拌过夜。将所得混合物旋转蒸发至干燥，在硅胶柱上以20％甲醇在二氯甲烷中洗脱进行色谱分析。将含产物部分合并，且旋转蒸发至干，获得5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基-N-氧代氨基-乙基)-酰胺(9g，83％产率)。
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基-N-氧代氨基-乙基)-酰胺(9g)、5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮((9g，83％产率))和吡咯烷((9g，83％产率(0.1g)在乙醇(30mL)中回流4小时。将混合物在冰浴中冷却，沉淀通过真空过滤收集并以乙醇洗涤。所得固体在乙酸乙酯(30mL)中搅拌，通过真空过滤收集，用乙酸乙酯洗涤并真空干燥得到5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙基-N-氧代氨基-乙基)-酰胺(10.3g，80％产率)，为橙色固体。
1H-NMR(DMSO-d6)δ13.72(br s，1H，NH)，11.02(br s，1H，CONH)，9.81(br s，1H，CONH)，7.75(dd，1H，aromatic)，7.70(s，1H，aromatic)，6.93(td，1H，aromatic)，6.84(m，1H，aromatic)，3.63(m，2H，CH2)，3.29(m，2H，CH2)，3.14(m，4H，2xCH2)，2.47(s，1H，CH3)，2.45(s，3H，CH3)，1.64(t，6H，2xCH3).MS m/z 415[M+1].
实施例190
5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
将5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(120mg，0.4mmol)与EDC、HCl(96mg，0.5mmol)、无水1-羟基-benztriazole(68mg，0.5mmol)和购自Aldrich的2-(2-氨基乙基吡啶在无水DMF(3mL)中室温振荡2-3天。将反应混合物用1M NaHCO3(1.5ml)稀释，然后用8ml水稀释。过滤收集沉淀的未加工产物，用水洗涤，干燥并通过结晶或色谱分析纯化，获得5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺。
实施例189
5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
如在前一个实施例中所述的进程，只是以5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(127mg)取代5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸得到5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺。
实施例192
5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
如上面在实施例190中所述的进程，只是以5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(145mg)取代5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸得到5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
实施例191
5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
如上面在实施例190中所述的进程，只是以5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(113mg)取代5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸得到5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺。
实施例203
5-[5-氰基-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基 -1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺
如上面在实施例190中所述的进程，只是以5-[5-氰基-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(123mg)取代5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸得到5-[5-氰基-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(吡啶-1-基)乙基]-酰胺。
实施例142、186、187、188和204
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以购自Aldrich Chemical Company，Inc.的1-(2-氨基乙基)吡咯烷取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例143-147
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以1-(2-氨基乙基)咪唑啉-2-酮(按照在属于Rohm & Haas Co.美国专利2613212(1950)中描述的方法通过在密封瓶将碳酸二甲酯与双(2-氨基乙基)胺(2当量)加热到150℃30分钟制备。未加工产物在硅石上使用氯仿-甲醇-氨水80∶25∶2洗脱液混合物纯化)取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例148-151和184
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以4-(2-氨基乙基)哌嗪-1-乙酸乙酯(如下制备：将哌嗪-1-乙酸乙酯(11.22g)用碘乙腈(5.0mL)在碳酸钾(6.9g)存在下在乙酸乙酯(260mL)中于0℃处理。在完成碘乙腈添加后(45分钟)，随后将反应混合物在室温搅拌11小时。将反应化合物过滤，并将滤液蒸发。在乙醇中于50psi在硼化钴(从CoCl2和硼氢化钠制备)存在下于室温使残余物氢化2天。过滤、蒸发并使用氯仿-甲醇-氨水80∶25∶2洗脱液混合物色谱纯化，得到所要求的胺(3.306g)，为浅黄色油)取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例152-153
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以2-[(2-氨基乙氨基)]乙腈(如下制备：于0℃在超过30分钟的时间将碘乙腈(50mL)在乙醇(80mL)中的溶液加入到乙烯二胺(150mL)在乙醇(60mL)中的溶液中。于0℃继续再搅拌1小时，然后室温搅拌14小时。加入55mmol碳酸钾，搅拌30分钟，过滤并将滤液在室温浓缩。所获残余物在硅石上使用氯仿-甲醇-氨水80∶15∶1.5洗脱液混合物纯化，得到2-[(2-氨基乙氨基)]乙腈(3.550g)，将其立刻使用)取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例154-158
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以1-(3-氨基丙基)-氮杂-2-酮(除了极佳在氢氧化锂存在下于145℃进行水解DBU(1小时，5ml DBU，2ml水，420mg水合氢氧化锂)外，按照Kraft A.：J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，6，1999，705-14中的方法制备。使用氯仿-甲醇-氨水80∶40∶4洗脱液混合物在硅石上纯化未加工产物，得到1-(3-氨基丙基)-氮杂-2-酮(4.973g，87％产率))取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例133-135、159和200
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以N-乙酰基乙烯二胺(通过在密封容器内将乙酸乙酯与乙烯二胺(1.5当量)的混合物加热到160℃ 1小时制备。真空蒸馏得到所要求的产物，产率56％。N-乙酰基乙烯二胺也从Aldrich获得)取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例146-140
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以1-(3-氨基丙基)-四氢-嘧啶-2-酮(按照Kraft A.：J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，6，1999，705-14中的方法以与1-(3-氨基丙基)-氮杂-2-酮相同的方法制备：主要地，不用溶剂将1，3，4，6，7，8-六氢-2H-嘧啶并[1，2-a]嘧啶(4.939g)、水合氢氧化锂(918mg)和2ml水在密封容器内加热到145℃ 1小时。在氯仿-甲醇-氨水80∶40∶4中在硅石柱上纯化未加工产物，得到纯胺(5.265g，94％产率))取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例141、160-162和185
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以1-(2-氨基乙基)-哌嗪-2-酮(如下制备：于5分钟内在水浴冷却的室温将纯叔丁基二苯基甲硅烷基氯化物(25mL，97.7mmol)逐滴加入到DBU(19.5ml，130mmol)和双(2-氨基乙基)胺(4.32ml，40mmol)在无水二甲基乙酰胺(80mL)中的溶液。将所得混合物搅拌5小时。加入溴乙酸乙酯(6.70mL，60mmol)，在冷却到室温极佳。将反应混合物搅拌25分钟，然后高真空蒸发。残余物溶解在甲醇(200ml)中，加入KHCO3(10g)和KF(12g，200mmol)，将所得混合物在60℃搅拌5小时。加入10gNa2CO3，搅拌10分钟，冷却并过滤。将滤液蒸发。残余物用己烷提取(2次，250ml)。将己烷-不溶的物质溶解在乙醇(60ml)中，过滤并蒸发。将残余物在氯仿-甲醇-氨水80∶40∶4中在硅石柱上纯化，得到纯胺(4.245g，74％产率))取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例163-167
如上面在实施例190、189、191、192和203中所述的进程，只是以3-[(2-氨基乙基)氨基]丙腈(如在Israel，M.et al： J.Med Chem.7，1964，710-16.中所描述，于室温从乙烯二胺(150mmol)和丙烯腈(50mmol)在THF中制备，提供所需求的胺(4.294g))取代2-(2-氨基乙基)吡啶，得到所要求的化合物。
实施例168
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺
向在20mL反应管中的5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(90mg)、DMF(0.8mL)和TEA(0.084mL)的搅拌的黄色浑浊混合物中加BOP试剂(199mg)。该混合物在5分钟内被变澄清。将2-(4-甲基哌嗪-1-基)-乙胺1(51mg)加入到该澄清的混合物中。将所得溶液在室温搅拌过夜。黄色固体产物从反应系统沉淀。薄层色谱分析(10％甲醇在二氯甲烷中)显示所有的起始物质都转化为该产物。通过真空过滤分离所得固体，用乙醇(1mL)洗涤一次。将该固体在乙醚(2mL)中超声处理20分钟，并真空过滤收集。真空干燥后，得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(4-甲基哌嗪-1-基-乙基)-酰胺(79mg，62％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.13(s，3H，CH3)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.41(m，2H，CH2)，2.47(m，8H，4xCH2)，3.30(m，2H，CH2)，6.82(dd，J＝4.5，8.7Hz，1H)，6.91(td，2J＝2.4，3J＝8.8Hz，1H)，7.43(t，J＝5.6Hz，1H)，7.70(s，1H)，7.75(dd，J＝2.8，9.6Hz，1H)(aromatic andvinyl)，10.88(s，1H，CONH)，13.67(s，1H，NH).LC-MS(m/z)424.4(M-1).
实施例169
5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(4-甲基-哌嗪-1-基-乙基)-酰胺
按在上面实施例168中的方法，只是以5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(95mg，0.3mmol)取代5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸，获得5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(4-甲基-哌嗪-1-基-乙基)-酰胺(76mg，58％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.13(s，3H，CH3)，2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.42(m，2H，CH2)，2.48(m，8H，4xCH2)，3.30(m，2H，CH2)，6.84(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.44(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.98(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)440.2(M-1).
实施例170
5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡 咯-3-羧酸(4-甲基哌嗪-1-基-乙基)-酰胺
按实施例168中描述的方法，只是以5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸取代5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸，获得5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(4-甲基哌嗪-1-基-乙基)-酰胺(39mg，54％产率)，从SU011670(54mg，0.15mmol)得到。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.14(s，3H，CH3)，2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.42(m，2H，CH2)，2.48(m，8H，4xCH2)，3.31(m，2H，CH2)，6.80(d，J＝8.0Hz，1H)，7.23(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.44(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.99(s，1H，CONH)，13.61(s，1H，NH).LC-MS(m/z)486.6(M).
实施例172
5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3- 羧酸(4-甲基哌嗪-1-基-乙基)-酰胺
按在上面实施例168中描述的方法，只是以5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸取代5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸SU014900，获得5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(4-甲基哌嗪-1-基-乙基)-酰胺(136mg，84％产率)，得到(112.8mg，0.4mmol)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ2.13(s，3H，CH3)，2.39，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.42(m，2H，CH2)，2.48(m，8H，4xCH2)，3.30(t，2H，CH2)，6.86(d，J＝8.0Hz，1H)，6.96(t，J＝7.4Hz，1H)，7.10(t，J＝7.8Hz，1H)，7.41(t，J＝5.4Hz，1H)，7.62(s，1H)，7.76(d，J＝7.6Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.88(s，1H，CONH)，13.61(s，1H，NH).LC-MS(m/z)406.6(M-1).
实施例171
5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯 -3-羧酸[2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)乙基]-酰胺
向在20mL反应管中的5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(112.8mg，0.4mmol)、DMF(0.5mL)和三乙胺(0.111mL)的搅拌的黄色浑浊混合物中加BOP试剂(265mg)。该混合物在5分钟内被变澄清。将2-(2，6-二甲基哌嗪-1-基)乙胺(68.6mg)加入到该澄清的混合物中(参见，Tapia，L.Alonso-Cires，P.Lopez-Tudanca，R.Mosquera，L.Labeaga，A.Innerarity，A.Orjales， J.Med.Chem.，1999，42，2870-2880)。将所得溶液在室温搅拌过夜。薄层色谱分析(10％甲醇在二氯甲烷中)显示所有的起始物质都转化为该产物。将反应混合物蒸发至干，然后通过闪色谱分析(CH2Cl2/CH3OH＝20/1-15/1)纯化，其后再结晶得到5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)乙基]-酰胺(83mg，50％产率)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.15，1.16(2xs，6H，2xCH3)，1.95(t，J＝11.6Hz，2H，CH2)，2.41，2.47(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，2H，CH2)，3.03(d，J＝10Hz，2H)，3.19(m，2H)，3.30(m，2H，CH2)，6.86(d，J＝8.0Hz，1H)，6.97(t，J＝7.2Hz，1H)，7.11(t，J＝7.8Hz，1H)，7.48(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.75(d，J＝7.6Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)422.2(M+1).
实施例173
5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺
按在上面实施例168中描述的方法，得到所要求的化合物(60mg，0.2mmol)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.891，0.907(2xs，6H，2xCH3)，1.49(t，J＝10.4Hz，2H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.41(m，2H，CH2)，2.74(m，4H)，3.30(m，2H)，6.82(dd，J＝4.5，8.7Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.4，3J＝8.4Hz，1H)，7.42(t，J＝5.6Hz，1H)，7.70(s，1H)，7.74(dd，J＝4.6，8.4Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.88(s，1H，CONH)，13.65(s，1H，NH).LC-MS(m/z)438.4(M-1).
实施例174
5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺
按在上面实施例171的方法，从5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(63mg，0.2mmol)得到所要求的化合物(31.2mg，34％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.15，1.16(2xs，6H，2xCH3)，1.95(t，J＝11.6Hz，2H，CH2)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，2H，CH2)，3.03(d，J＝11.2Hz，2H)，3.19(m，2H)，3.30(m，2H，CH2)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.52(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.99(s，1H，CONH)，13.63(s，1H，NH).LC-MS(m/z)456.2(M+1).
实施例175
5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-羧酸[2-(3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-乙基]-酰胺
按在上面实施例171中描述的方法，从5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(74mg，0.2mmol)得到所要求的化合物(40mg，40％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.15，1.16(2xs，6H，2xCH3)，1.95(t，J＝11.6Hz，2H，CH2)，2.40、2.42(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，2H，CH2)，3.03(d，J＝10.4Hz，2H)，3.19(m，2H)，3.30(m，2H，CH2)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，7.51(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.10(d，J＝2.0Hz，1H)(aromatic and vinyl)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)498.4(M-1).
实施例205
(3Z)3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1-[1-(4-甲基哌嗪基)甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮
将N-甲基哌嗪(10g，100mmol)加入到含水甲醛(38％的溶液10g，100mmol)和3-(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮(2.38g，10mmol)在甲醇(100mL)中的搅拌溶液中。将该溶液在60℃加热1小时，浓缩到低容积，并将沉淀过滤，用甲醇洗涤，干燥获得2.38g标题化合物，mp160-164℃。
HPLC Rt 4.72min. 1H NMR(CDCl3)δ2.26(s，3H)，2.33(s，3H)，2.38(s，3H)，2.43(br s，4H)，2.70(br s，4H)，4.59(s，2H)，5.96(d，1H)，7.02-7.08(m，2H)，7.15(dd，1H)，7.38(s，1H)，7.48(dd，1H)and 13.0(br s，1H).Anal.Calcd for C21H26N4O：C，71.97；H，7.48；N，15.99.Found：C，71.75；H，7.46；N，15.87.
将(3Z)3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1-[1-(4-甲基哌嗪基)甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮转化为二盐酸盐。
实施例206
合成(3Z)3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1-(1-吡咯烷基甲基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮
将吡咯烷(450mg，6.3mmol)加入到含水甲醛(38％的溶液500mg，6.0mmol)和3-(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮(900mg，3.8mmol)在甲醇(50mL)中的搅拌溶液中。15分钟后，将该溶液冷却到0℃，并将沉淀过滤，用水洗涤，干燥获得1.08g标题化合物，mp129-132℃。
HPLC Rt 4.87min.1H NMR[(CD3)2SO]δ1.65(m，4H)，2.32 9s，3H)，2.34(s，3H)，2.62(m，4H)，4.72(s，2H)6.07(d，1H)，7.00(m，1H)，7.15(m，2H)，7.61(s，1H)，7.76(d，2H)and 13.1(br s，1H).Anal.Calcd forC20H23N3O：C，74.74；H，7.21；N，13.07.Found：C，74.61；H，7.25；N，13.03.
                        生物实施例
式(I)蛋白激酶抑制剂：
下列检测方法可用于测定本式(I)化合物对一种或多种蛋白激酶(此后简称PKs)的活性或作用水平。使用本领域所熟知的技术能设计对任何PK沿相同路线的类似检测方法。
A.检测步骤
本文中所述的几种实验是以ELISA(酶联免疫吸附夹心法)的形式进行(Voller，et al.，1980，“Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，”Manual of Clinical Immuology，2d ed.，Rose and Friedman，Am.Soc.Of Microbiology，Washington，D.C.，pp.359-371)。一般的步骤如下：将或天然或重组的式(I)化合物导入到表达测试激酶的细胞指定的时间之后，如果测试激酶是受体，将激活该受体的已知配体加入。溶解细胞并将溶解产物移至预先以识别酶促磷酸化反应底物的特异性抗体包被的ELISA板的孔中。洗去细胞溶解产物的非底物性组分，用抗体特异性识别的磷酸酪氨酸检测对底物磷酸化的量，并与未与测试化合物接触的对照细胞比较。
下面提供目前对特异性PKs实施ELISA实验的优选方案。然而，采用这些方案用于测定抗其他受体酪氨酸激酶(RTKs)的化合物活性，以及对细胞质酪氨酸激酶(CTKs)和丝氨酸苏氨酸酪氨酸激酶(STKs)方面，是本领域技术人员知识范围内显而易见的。本文中描述的其他检测方法测量对测试激酶活化反应生成的DNA数量，其通常是测量增殖反应。该检测方法的一般步骤如下：将或天然或重组的式(I)化合物导入到表达测试激酶的细胞指定的时间之后，如果测试激酶是受体，将激活该受体的已知配体加入。培养至少过夜之后，加入DNA标记试剂诸如5-溴脱氧尿苷(BrdU)或H3-胸腺嘧啶脱氧核苷。用抗BrdU抗体或通过测量放射活性测定标记DNA的数量，并与未接触测试化合物的对照细胞比较。
GST-FLK-1生物检测法
本方法分析GST-Flk 1对poly(glu，tyr)肽的酪氨酸激酶活性。
材料与试剂：
1.Corning 96孔ELISA培养板(Corning Catalog No.5805-96)。
2.poly(glu，tyr)4∶1，冻干粉(lyophilizate)(Sigma Catalog# P0275)。
3.制备poly(glu，tyr)(pEY)包被的检测板：在100ul PBS中包被poly(glu，tyr)2ug/孔，室温维持2小时或4℃过夜。覆盖板孔以防蒸发。
4.PBS缓冲液：配制1L，将0.2g KH2PO4、1.15g Na2HPO4、0.2g KCl和8g NaCl在约900ml dH2O中混合。当所有试剂溶解时，用盐酸调节酸碱度到7.2。用dH2O调整总体积为1L。
5.PBST缓冲液：向1L PBS缓冲液中加1.0ml土温-20。
6.TBB-Blocking缓冲液：配制1L，将1.21g TRIS，8.77g NaCl，1ml土温-20在约900ml dH2O中混合。用盐酸调节酸碱度到7.2。加10g BSA，搅拌至溶解。用dH2O调整总体积为1L。过滤除去颗粒物质。
7.含1％BSA的PBS：为配制1×工作液，向约990ml PBS缓冲液中加10g BSA，搅拌至溶解。用PBS调整总体积为1L，过滤除去颗粒物质。
8. 50mM Hepes pH7.5.
9.从sf9重组的杆状病毒转化的纯化的GST-Flk 1 cd(SUGEN，Inc.)。
10. 4％DMSO的dH2O溶液
11. 10mM ATP的dH2O溶液
12. 40mM MnCl2
13.激酶稀释缓冲液(KDB)：将10ml Hepes(酸碱度7.5)、1ml 5M氯化钠、40μL 100mM原钒酸钠和0.4ml 5％BSA的dH2O溶液与88.56ml的dH2O混合。
14.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板，Applied Scientific Catalog# AS-72092
15.EDTA：将14.12g乙二胺四乙酸(EDTA)与约70ml的dH2O混合。加10N NaOH直到EDTA溶解。调节酸碱度为8.0。用dH2O调整总体积为100ml。
16. l0抗体稀释缓冲液：将10ml含5％BSA的PBS缓冲液与89.5mlTBST混合。
17.与辣根过氧化物酶交联的抗-磷酸酪氨酸单克隆抗体(PY99 HRP，Santa Cruz Biotech)。
18. 2，2’-连氮基双(3-乙基benz噻唑啉-6-磺酸(ABTS，Moss，Cat.No.ABST)
19. 10％SDS。
步骤：
1.按材料和试剂中步骤3所描述，用2μg polyEY肽在灭菌PBS中包被Corning 96孔ELISA培养板。
2.用转化板从培养孔中除去未结合的液体。用TBST洗1次。在纸塔上轻拍除去过量的液体。
3.每孔加100μl含1％BSA的PBS。室温振荡培养1小时。
4.重复步骤2。
5.将50mM HEPES(pH7.5)吸入培养孔(每孔150μl)。
6.在96孔聚丙烯培养板用dH2O/4％DMSO将测试化合物稀释为最终所需检测浓度的4倍。
7.加25μl稀释的测试化合物到ELISA培养板。在对照孔，加25μl的dH2O/4％DMSO。
8.每孔加25μl与4×ATP(2μM)的40mM MnCl2。
9.阴性对照孔加25μl 0.5M EDTA。
10.用KDB稀释GST-Flk1到0.005μg(5ng)/孔。
11.每孔加50μl稀释的酶。
12.室温振荡培养15分钟。
13.通过加入50μl 250mM EDTA(pH8.0)终止反应。
14.用TBST洗3次，在纸塔上轻拍除去过量的液体。
15.每孔加100μl抗-磷酸酪氨酸HRP交联抗体，在抗体稀释缓冲液中1∶5,000稀释。室温振荡培养90分钟。
16.如步骤14中洗涤。
17.每孔加100μl室温ABTS溶液。
18.室温振荡培养10-15分钟。除去任何泡。
19.通过向每孔中加入20μl 10％SDS终止反应。
20.用410nM测试滤光片和630nM参比滤光片在Dynatech MR 7000ELISA读数器读取结果。
PYK2生物检测法
本方法用于在ELISA检测中测量HA表位标记的全长pyk2(FL.pyk2-HA)体外激酶活性。
材料与试剂：
1.Corning 96孔Elisa培养板。
2. 12CA5单克隆抗-HA抗体(SUGEN，Inc.)。
3.PBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(Gibco Catalog # 450-1300EB)
4.TBST缓冲液：配制1L，将8.766g NaCl、6.057g TRIS和1ml 0.1％Triton X-100在约900ml dH2O中混合。调酸碱度到7.2。调总体积为1L。
5.Blocking缓冲液：配制1L，将100g 10％BSA、12.1g 100mM TRIS、58.44g 1M NaCl和10ml 1％土温-20混合。
6.来自sf9细胞溶解产物的FL.pyk2-HA(SUGEN，Inc.)。
7.含4％DMSO的MilliQue水。
8. 10mM ATP的dH2O溶液。
9. 1M MnCl2。
10. 1M MnCl2。
11. 1M二硫苏糖醇(DTT)。
12. 10X激酶缓冲液磷酸化：将5.0ml Hepes(酸碱度7.5)、0.2ml1M MnCl2、1.0ml 1M MgCl2、1.0ml 10％Triton X-100在2.8ml dH2O中混合。临使用前，加0.1ml 1M DTT。
13.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板。
14. 500mM EDTA dH2O溶液。
15.抗体稀释缓冲液：配制100mL，将1mL 5％BSA/PBS和1mL 10％土温-20加入88mL TBS。
16.辣根过氧化物酶交联的抗-磷酸酪氨酸单克隆抗体PY99)，SantaCruz Biotech Cat.No.SC-7020)。
17.ABTS，Moss，Cat.No.ABST-2000。
18. 10％SDS。
步骤：
1.用0.5μg每孔12CA5抗HA抗体在100μl PBS中包被Corning 96孔ELISA培养板。在4℃保存过夜。
2.用转化板从培养孔中除去未结合的HA抗体。用dH2O洗培养板。在纸塔上轻拍除去过量的液体。
3.每孔加150μl Blocking缓冲液。室温振荡培养30分钟。
4.用TBS-T洗培养板4×。
5.在PBS中稀释溶解产物(1.5μg溶解产物/100μl PBS)。
6.每孔加100μl稀释的溶解产物。室温振荡1小时。
7.如在步骤4中洗涤。
8.向含被捕获的ELISA培养板加50μl 2X激酶缓冲液。
9.向每孔加入在4％DMSO中的25μl 400μM测试化合物。对照孔单独用4％DMSO。
10.向阴性对照孔加25μl 0.5M EDTA。
11.每孔加25μl 20μM ATP。振荡培养10分钟。
12.通过向每孔加入25μl 500mM EDTA(pH8.0)终止反应。
13.如步骤4洗涤。
14.每孔加入100μl在抗体稀释缓冲液中1∶6,000稀释的抗-磷酸酪氨酸HRP交联抗体。室温振荡培养1小时。
15.用TBST洗培养板3×，用PBS洗1×。
16.每孔加100μl ABST溶液。
17.如果必要，通过向每孔中加入20μl 10％SDS停止发育反应。
18.用410nM测试滤光片和630nM参比滤光片在ELISA读数器读取培养板结果。
FGFR1生物检测法
本方法用于在ELISA检测中测量FGF1-R体外激酶活性。
材料与试剂：
1.Costar 96孔Elisa培养板(Corning Catalog # 3369)。
2.Poly(Glu，Tyr)(Sigma Catalog # P0275)。
3.PBS(Gibco Catalog # 450-1300EB)
4.50mM Hepes缓冲液。
5.Blocking缓冲液(5％BSA/PBS)。
6.纯化的GST-FGFR1(SUGEN，Inc.)。
7.激酶稀释缓冲液。
将500μL 1M Hepes(GIBCO)、20μL 5％BSA/PBS、10μL 100mM原钒酸钠。
8. 10mM ATP。
9.ATP/MnCl2磷酸化混合液：将20μL ATP、400μL 1M MnCl2和9.56mldH2O混合。
10.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板(Applied Scientific Catalog# AS-72092)。
11. 0.5M EDTA。
12. 0.05％TBST
向1L TBS中加500μL。
13.兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)
14.山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(Biosource，Catalog # ALI0404)。
15.ABTS溶液
16.ABTS/H2O2溶液。
步骤：
1.用1μg每孔Poly(Glu，Tyr)在100μl PBS中包被Costar 96孔ELISA培养板。在4℃保存过夜。
2.用PBS洗包被的培养板1次。
3.每孔加150μl 5％BSA/PBS Blocking缓冲液。室温振荡培养1小时。
4.用PBS洗培养板2×，然后用50mM Hepes洗1次。在纸塔上轻拍除去过量的液体和气泡。
5.向培养板加入在4％DMSO中的25μl 0.4mM测试化合物或单独的4％DMSO(对照孔)。
6.在激酶稀释缓冲液中稀释纯化的GST-FGFR1溶解产物(5ng激酶/50μlKDB/孔)。
7.每孔加50μl稀释的激酶。
8.通过加入25μl/孔新鲜制备的ATP/Mn++(0.4ml 1M MnCl2、40μl10mM ATP、9.56ml dH2O)，新鲜制备)开始激酶反应。
9.这是快速激酶反应，必须用类似于加入ATP的方式以25μl 0.5MEDTA停止反应。
10.用新鲜的TBST洗培养板4×。
11.配制抗体稀释缓冲液：每50ml：
将5ml 5％BSA、250μl 5％牛奶和50μl 100mM钒酸钠混合，以0.05％TBST调整至终末体积。
12.培育，在室温下摇1小时。向每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在ADB中1∶10000稀释)。
13.如步骤10洗涤。
14.每孔加入100μl Biosource的山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(在ADB中1∶6000稀释)。室温振荡培养1小时。
15.如步骤10洗涤，然后用PBS除去气泡和过量的土温。
16.每孔加100μl ABTS/H2O2溶液。
17.振荡培养10-20分钟。除去任何气泡。
18.在Dynatech MR 7000 ELISA读数器读取结果：测试滤光片用410nM，参比滤光片在630nM。
EGFR生物检测法
本方法用于在ELISA检测中的FGF1-R体外激酶活性。
材料与试剂：
1.Corning 96孔Elisa培养板。
2.SUMO1单克隆抗-EGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
3.PBS
4.TBST缓冲液
5.Blocking缓冲液：配制100ml，将5.0g Carnation Instant Non-fatMilk_与100ml PBS混合。
6.A431细胞溶解产物(SUGEN，Inc.)。
7.TBS缓冲液。
8.TBS+10％DMSO：配制1L，将1.514g TRIS、2.192g NaCl和25mlDMSO混合；用dH2O调整总体积为1L。
9.ATP(腺苷-5’-三磷酸，来自马的肌肉，Sigma Cat.No.A-5394)，1.0mM dH2O溶液。本试剂在使用前即刻配制，并在冰上保存。
10. 1.0mM MnCl2
11.ATP/MnCl2磷酸化混合液：配制10ml，将300μL 1mM ATP、500μL MnCl2和9.2ml dH2O混合。在使用前即刻配制，并在冰上保存。
12.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板。
13.EDTA。
14.兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)
15.山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(Biosource，Cat.No.ALI0404)。
16.ABTS
17. 30％过氧化氢。
18.ABTS/H2O2溶液。
19. 0.2M HCl。
步骤：
1.用0.5μg每孔SUMO1在100μl PBS中包被Corning 96孔ELISA培养板，在4℃保存过夜。
2.通过除去液体的转化培养板从培养孔除去未结合的SUMO1。用dH2O洗1×。在纸塔上轻拍除去过量的液体。
3.每孔加150μl Blocking缓冲液。室温振荡培养30分钟。
4.用去离子水洗培养板3×，然后用TBST洗1次。在纸塔上轻拍除去过量的液体和气泡。
5.在PBS中稀释溶解产物(7μg溶解产物/100μl PBS)。
6.每孔加入100μl稀释的溶解产物。室温振荡培养1小时。
7.如上面4中洗培养板。
8.向含被捕获的EGFR的ELISA培养板加入120μl的TBS。
9.在TBS中1∶10稀释测试化合物，放在培养孔中。
10.向ELISA培养板加13.5μl稀释的测试化合物。对于对照孔加入在10％DMSO中的13.5μl TBS。
11.室温振荡培养30分钟。
12.除了阴性对照孔外，向每孔加入15μl磷酸化混合液。终末的培养孔体积应该是约150μl伴每孔3μM ATP/5mM MnCl2的终末浓度。振荡培养5分钟。
13.通过在振荡时加入16.5μl EDTA溶液停止反应。另振荡1分钟。
14.用去离子水洗涤4×，用TBST洗2×。
15.每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中1∶3000稀释)。室温振荡培养30-45分钟。
16.如上面4洗涤。
17.每孔加入100μl Biosource的山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(在TBST中1∶2000稀释)。室温振荡培养30分钟。
18.如上面4洗涤。
19.每孔加100μl ABTS/H2O2溶液。
20.振荡培养5-10分钟。除去任何气泡。
21.如果必要，通过每孔加入100μl 0.2M HCl停止反应。
22.在Dynatech MR 7000 ELISA读数器读取结果：测试滤光片用410nM，参比滤光片在630nM。
PDGFR生物检测法
本方法用于在ELISA检测中的FGF1-R体外激酶活性。
材料与试剂：
1.Corning 96孔Elisa培养板。
2. 28D4C10单克隆抗-PDGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
3.PBS。
4.TBST缓冲液。
5.Blocking缓冲液：(与用于EGFR生物检测的相同)。
6.PDGFR-β表达的NIH 3T3细胞溶解产物(SUGEN，Inc.)。
7.TBS缓冲液。
8.TBS+10％DMSO。
9.ATP。
10.MnCl2。
11.激酶缓冲液磷酸化混合液：为配制10ml，将250μL 1M TRIS、200μL 5M NaCl、100μL 1M MnCl2和50μL 100mM Triton X-100在足够的dH2O中混合以配制10ml。
12.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板。
13.EDTA。
14.兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(SUGEN，Inc.)
15.山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(Biosource，Cat.No.ALI0404)。
16.ABTS。
17.30％过氧化氢溶液。
18.ABTS/H2O2。
19. 0.2M HCl。
步骤：
1.用0.5μg每孔28D4C10在100μl PBS中包被Corning 96孔ELISA培养板，在4℃保存过夜。
2.通过除去液体的转化培养板从培养孔除去未结合的28D4C10。用dH2O洗1×。在纸塔上轻拍除去过量的液体。
3.每孔加150μ Blocking缓冲液。室温振荡培养30分钟。
4.用去离子水洗培养板3×，然后用TBST洗1次。在纸塔上轻拍除去过量的液体和气泡。
5.在HNTG中稀释溶解产物(10μg溶解产物/100μl HNTG)。
6.每孔加入100μl稀释的溶解产物。室温振荡培养60分钟。
7.如在步骤4中所述洗培养板。
8.向含被捕获的PDGFR的ELISA培养板加入80μl的激酶缓冲工作液。
9.在96-孔聚丙烯培养板中于TBS中1∶10稀释测试化合物。
10.向ELISA培养板加10μl稀释的测试化合物。对于对照孔加10μl TBS+10％DMSO。室温振荡培养30分钟。
11.除了阴性对照孔外，直接向所有培养孔加入10μl ATP(终末的培养孔体积应该是约100μl伴每孔中20μM ATP)。室温振荡培养30分钟。
12.通过向每孔加入10μl EDTA溶液停止反应。
13.用去离子水洗涤4×，用TBST洗2次。
14.每孔加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中1∶3000稀释)。室温振荡培养30-45分钟。
15.如在步骤4中洗涤。
16.每孔加入100μl Biosource的山羊抗兔IgG过氧化酶交联剂(在TBST中1∶2000稀释)。室温振荡培养30分钟。
17.如在步骤4中洗涤。
18.每孔加100μl ABTS/H2O2溶液。
19.振荡培养5-30分钟。除去任何气泡。
20.如果必要，通过每孔加入100μl 0.2M HCl停止反应。
21.用410nM测试滤光片和用630nM参比滤光片在Dynatech MR 7000ELISA读数器读取结果。
细胞HER-2激酶检测
本方法用于以ELISA方法测量在完整细胞中的HER-2激酶活性。
材料与试剂：
1.DMEM(GIBCO Catalog # 11965-092)。
2.胎牛血清(FBS，GIBCO Catalog # 16000-044)，56℃水浴30分钟灭活。
3.Trypsin(GIBCO Catalog # 25200-056)。
4.L-谷氨酰胺(GIBCO Catalog # 25030-081)。
5.HEPES(GIBCO Catalog # 15630-080)。
6.生长培养基
将500ml DMEM、55ml加热灭活的FBS、10ml HEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
7.Starve培养基
将500ml DMEM、2.5ml加热灭活的FBS、10ml HEPES和5.5ml L-谷氨酰胺。
8.PBS。
9.平底96-孔组织培养微量测定培养板(Corning Catalog # 25860)。
10.15cm组织培养皿(Corning Catalog # 08757148)。
11.Corning 96-孔ELISA培养板。
12.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板。
13.Transtar 96 Costar移液器(Costar Catalog # 7610)。
14.SUMO1：单克隆抗-EGFR抗体(SUGEN，Inc.)。
15.TBST缓冲液。
16.Blocking缓冲液：5％Carnation Instant Milk_PBS溶液。
17.EGF配体：EGF 201，Shinko American，Japan.将粉末悬浮于100μL 10mM HCl中。加100μL 10mM NaOH。加800μL PBS并转移到Eppendorf管，-20℃保存直到即将使用。
18.HNTG Lysis缓冲液
对贮存5×HNTG，将23.83g Hepes、43.83g NaCl、500ml甘油和100ml Triton X-100和足够dH2O混合，使总溶液为1L。
对1×HNTG*，将2ml HNTG、100μL 0.1M Na3VO4、250μL 0.2MNa4P2O7和100μl EDTA混合。
19.EDTA。
20.Na3VO4。为配制贮存溶液，将1.84g Na3VO4与dH2O混合。调pH为10。微波沸腾1分钟(溶液变澄清)。冷却至室温。调pH为10。重复加热/冷却循环直到pH保持为10。
21. 200mM Na4P2O7。
22.对磷酸酪氨酸特异的兔多克隆抗血清(抗-Ptyr抗体，SUGEN，Inc.)。
23.亲合纯化的抗血清，山羊抗兔IgG抗体，过氧化酶交联剂(Biosource，Catalog # ALI0404)。
24.ABTS溶液。
25. 30％过氧化氢溶液。
26.ABTS/H2O2。
27. 0.2M HCl。
步骤：
1.用在PBS中的1.0μg每孔SUMO1包被Corning 96孔ELISA培养板，每孔终末容积为100μl。在4℃保存过夜。
2.在使用那天，除去包被缓冲液并以dH2O洗培养板3次，且以TBST缓冲液洗1次。除非另外说明，在本方法中所有洗涤都应按此方式进行。
3.每孔加100μl Blocking缓冲液。室温振荡培养30分钟。在使用前，洗培养板。
4.本方法中使用EGFr/HER-2嵌合体/3T3-C7细胞系。
5.选择有80-90％汇合的培养皿。胰酶消化收集细胞，室温1000rpm离心5分钟。
6.重悬细胞于starve培养基并以台盼蓝计数。要求存活超过90％。以每孔2,500个细胞、90ul每孔的密度将在starve培养基中的细胞接种于96孔微量测定板。在5％CO2下37℃培养所接种的细胞过夜。
7.接种2天后开始检测。
8.将测试化合物溶解于4％DMSO中。然后将样品在板上用starve-DMEM直接稀释。典型地，稀释将为1∶10或更高。然后将所有的孔转移到细胞培养板进一步1∶10稀释(10μl样品和培养基加入到90μl starve培养基。最终的DMSO浓度应该为1％或更低。也可使用标准系列稀释液。
9. 5％CO2下37℃培养2小时。
10.通过在暖的DMEM中稀释贮存EGF(16.5uM)至150nM制备EGF配体。
11.制备足够每孔100ul的新鲜的HNTG*；置冰上。
12.与测试化合物培养2小时后，向细胞加所制备的EGF配体，每孔50ul，终末浓度为50nM。阳性对照孔使用等量的EGF。阴性对照无EGF。37℃培养10分钟。
13.除去测试化合物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞1次。
14.转移HNTG*到细胞，100ul每孔。置冰上5分钟。
15.用微量吸移管管理器从培养板刮掉细胞并通过重复吹打HNTG*lysis缓冲液混匀细胞物质。转移溶解产物到已经包被、封闭、洗涤的ELISA培养板。或者使用Costar移液器将溶解产物转移到培养板。
16.室温振荡培养1小时。
17.除去溶解产物，洗涤。向ELISA培养板加新鲜稀释的抗-Ptyr抗体(1∶3000在TBST中)，100ul每孔。
18.室温振荡培养30分钟。
19.除去抗-Ptyr抗体，洗涤。向ELISA培养板加新鲜稀释的BIOSOURCE抗体(1∶8000在TBST中，100ul每孔)。
20.室温振荡培养30分钟。
21.除去BIOSOURCE抗体，洗涤。向ELISA培养板加新鲜制备的ABTS/H2O2溶液，100ul每孔。
22.振荡培养5-10分钟。除泡。
23.通过每孔加入100μl 0.2M HCl停止反应。
24.用410nM测试滤光片和用630nM参比滤光片在Dynatech MR 7000ELISA读数器读取结果。
CDK2/CYCLIN A检测
本方法用于在闪烁近似检测法(Scintillation ProximityAssay，SPA)中测量人cdk2/cyclin A在体外丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
材料与试剂：
1.Wallac 96-孔聚对苯二甲酸乙二醇酯(flexi)培养板(wallacCatalog # 1450-401)。
2.Amersham Redivue[γ33P]ATP(Amersham catalog # AH 9968)。
3.Amersham链霉亲和素包被的聚乙烯甲苯SPA珠(Amersham catalog# RPNQ0007)。应将这些珠在20mg/ml不含镁或钙的PBS中重组。
4.从Sf9细胞纯化的活化的cdk2/cyclin A酶复合体(SUGEN，Inc.)。
5.生物素酰基化肽底物(Debtide).将肽生物素-X-PKTPKKAKKL以5mg/ml的浓度溶解在dH2O中。
6.肽/ATP混合物：配制10ml，将9.979ml dH2O、0.00125ml“冷”ATP、0.010ml Debtide和0.010mlγ33P ATP混合。每孔最终浓度将为0.5μM“冷”ATP、0.1μg Debtide和0.2μCiγ33P ATP。
7.激酶缓冲液：配制10ml，将8.85ml dH2O、0.625ml TRIS(pH7.4)、0.25ml 1M MgCl2、0.25ml 10％NP40和0.025ml 1M DTT混合，在临用前加入。
8. 10mM ATP dH2O溶液。
9. 1M Tris，用HCl将酸碱度调到7.4。
10. 1M MgCl2。
11. 1M DTT。
12. PBS(Gibco Catalog # 14190-144)。
13. 0.5M EDTA。
14.缓冲液：配制10ml，将9.25ml PBS、0.005ml 100mM ATP、0.1ml0.5M EDTA、0.1ml 10％Triton X-100和1.25ml 20mg/ml的SPA珠混合。
步骤：
1.在5％DMSO中配制测试化合物溶液为5×所需的最终浓度。每孔加10ul。关于阴性对照，孔中单独用10ul 5％DMSO。
2.用2.1ml 2×激酶缓冲液稀释5μl cdk2/cyclin A溶液。
3.每孔加20μl酶。
4.向阴性对照孔加10μl 0.5M EDTA。
5.每孔加20μl肽/ATP混合物开始激酶反应。不振荡培养1小时。
6.每孔加200μl停止缓冲液。
7.放置至少10分钟。
8.约2300rpm旋转培养板3-5分钟。
9.用Trilux或类似读数器计数培养板。
MET转磷酸作用检测
本方法用于测量对聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))底物磷酸酪氨酸水平，作为该底物蛋氨酸转磷酸作用增效剂/抑制剂的鉴别方法。
材料与试剂：
1.Corning 96孔Elisa培养板，Corning Catalog # 25805-96。
2.Poly(glu，tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P0275。
3.PBS，Gibco Catalog # 450-1300EB
4. 50mM HEPES
5.Blocking缓冲液：在500ml PBS中溶解25g牛血清白蛋白，Sigma，Cat.No.A-7888，通过4μm滤器过滤。
6.纯化的含蛋氨酸激酶区的GST融合蛋白，Sugen，Inc.。
7.TBST缓冲液。
8. 10％DMSO水溶液(MilliQue H2O)。
9. 10mM腺苷-5’-三磷酸水溶液(dH2O)，Sigma，Cat.No.A-5394。
10. 2×激酶稀释缓冲液：配制100ml，将pH7.5 10ml 1M HEPES与0.4ml5％BSA/PBS、0.2ml 0.1M原钒酸钠和1ml 5M氯化钠在88.4ml dH2O中混合。
11. 4×ATP反应混合物：配制10ml，将0.4ml 1M氯化锰和0.02ml 0.1MATP在9.56ml dH2O中混合。
12. 4×阴性对照混合物：配制10ml，将0.4ml 1M氯化锰在9.6ml dH2O中混合。
13.NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板，Applied Scientific Catalog# S-72092。
14. 500mM EDTA。
15.抗体稀释缓冲液：配制100ml，将10ml 5％BSA/PBS、0.5ml 5％Carnation Instant Milk_PBS溶液和0.1ml 0.1M原钒酸钠在88.4mlTBST中混合。
16.兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，Sugen，Inc.。
17.山羊抗兔辣根过氧化酶交联抗体，Biosource，Inc.。
18.ABTS溶液：配制1L，将19.21g柠檬酸、35.49g Na2HPO4和500mg ABTS与足够的dH2O混合以达到1L。
19.ABTS/H2O2：用前5分钟将15ml ABST溶液与2μl H2O2混合。
20. 0.2M HCl。
步骤：
1.用2μg每孔Poly(Glu-Tyr)在100μl PBS中包被ELISA培养板。在4℃保存过夜。
2.用150μl 5％BSA/PBS阻断(Block)培养板60分钟。
3.用PBS洗培养板2次，用50mM pH7.4 Hepes洗1次。
4.向所有孔加50μl稀释的激酶。(用激酶稀释缓冲液将纯化的激酶稀释。终浓度应为10ng/孔)。
5.向培养板加入25μl 0.4mM测试化合物(在4％DMSO中)或对照孔加单独的DMSO(4％dH2O溶液)。
6.培养激酶/化合物混合物15分钟。
7.向阴性对照孔加25μl 40mM MnCl2。
8.向其他孔加25μl ATP/MnCl2混合物(除对照孔)。培养5分钟。
9.加25μl 500mM EDTA停止反应。
10.用TBST洗培养板3×。
11.每孔加100μl在抗体稀释液中1∶10,000稀释的兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体。室温振荡培养1小时。
12.用TBST洗培养板3×。
13.在抗体稀释液中1∶6,000稀释Biosource HRP交联的抗兔抗体。向每孔加入100μl，并室温振荡培养1小时。
14.用PBS洗培养板1×。
15.每孔加100μl ABTS/H2O2溶液。
16.如果必要，每孔加100μl 0.2M HCl停止发育反应。
17.用410nM测试滤光片和在630nM的参比滤光片在Dynatech MR 7000ELISA读数器读取结果。
IGF-1转磷酸作用检测
本方法用于测量在聚(谷氨酸∶酪氨酸(4∶1))中磷酸酪氨酸水平，作为底物gst-IGF-1转磷酸作用增效剂/抑制剂的鉴别方法。
材料与试剂：
1.Corning 96孔Elisa培养板。
2.Poly(Glu-tyr)4∶1，Sigma，Cat.No；P0275。
3.PBS，Gibco Catalog # 450-1300EB。
4. 50mM HEPES
5.TBB Blocking缓冲液：配制1L，将100g BSA、12.1g TRIS(pH7.5)、58.44g氯化钠和10ml 1％土温-20。
6.纯化的含IGF-1激酶区的GST融合蛋白(Sugen，Inc.)。
7.TBST缓冲液：配制1L，将6.057g Tris、8.766g氯化钠和0.5ml土温-20与足够的dH2O混合，达到1L。
8. 4％DMSO Milli-Q H2O溶液。
9. 10mM ATP dH2O溶液。
10. 2×激酶稀释缓冲液：配制100ml，将10ml 1M HEPES(pH7.5)、0.4ml5％BSA dH2O溶液、0.2ml 0.1M原钒酸钠和1ml 5M氯化钠与足够的dH2O混合，达到100ml。
11. 4×ATP反应混合物：配制10ml，将0.4ml 1M MnCl2和0.008ml 0.01MATP与9.56ml dH2O混合。
12. 4×阴性对照混合物：将0.4ml 1M氯化锰在9.60ml dH2O中混合。
13. NUNC 96-孔V形底聚丙烯培养板。
14. 500mM EDTA dH2O溶液。
15.抗体稀释缓冲液：配制100ml，将10ml 5％BSA的PBS溶液、0.5ml5％Carnation Instant Non-fat Milk_PBS溶液和0.1ml 0.1M原钒酸钠在88.4ml TBST中混合。
16.兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，Sugen，Inc.。
17.山羊抗兔HRP交联抗体，Biosource。
18.ABTS溶液。
19.ABTS/H2O2：用前5分钟将15ml ABTS溶液与2μl H2O2混合。
20. 0.2M HCl dH2O溶液。
步骤：
1.用2.0μg每孔Poly(Glu，Tyr)4∶1(Sigma P0275)在100μl PBS中包被ELISA培养板。在4℃保存过夜。
2.用PBS ash培养板1次。
3.每孔加100μl TBB Blocking缓冲液。室温振荡培养1小时。
4.用PBS洗培养板1次，然后用50mM pH7.5 Hepes缓冲液洗2次。
5.向培养板加入25μl在4％DMSO中的测试化合物(通过用dH2O稀释在100％DMSO中的10mM测试化合物贮存溶液得到)。
6.向所有孔加10.0ng在50μl激酶稀释液中)的gst-IGF-1激酶。
7.向所有测试孔和阳性对照孔加25μl 4×ATP反应混合物开始反应。向所有阴性对照孔加25μl 4×阴性对照混合物。室温振荡培养10分钟。
8.向所有孔加25μl 0.5M EDTA(pH8.0)。
9.用TBST洗培养板4×。
10.每孔加入在100μl抗体稀释液中1∶10,000稀释的兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清。室温振荡培养1小时。
11.如步骤9洗涤培养板。
12.向所有孔加入100μl在抗体稀释液中以1∶10,000稀释的Biosource抗兔抗体HRP。室温振荡培养1小时。
13.如在步骤9中洗涤培养板，随后用PBS洗1次以减少气泡和过量土温-20。
14.每孔加100μl ABTS/H2O2发育。
15. 5分钟后，在ELISA读数器上用410nm测试滤光片和在630nm的参比滤光片读取结果。
BRDU结合检测
下面的检测使用通过基因工程表达选择性受体的细胞，然后通过测定Brd-U结合入DNA评价兴趣化合物对配体介导的DNA合成活性的作用。
下列材料、试剂和步骤是对下列每种BrdU结合检测通用的。已经注明特定检测中的不同。
材料和试剂：
1.合适的配体。
2.合适的基因工程细胞。
3.BrdU标记试剂：10mM PBS(pH7.4)溶液(Boehringer Mannheim，Germany)。
4.FixDenat：固定液(已备好)(Boehringer Mannheim，Germany)。
5.抗-BrdU-POD：与过氧化酶交联的鼠单克隆抗体(BoehringerMannheim，Germany)。
6.TMB底物液：四甲联苯胺(TMB，Boehringer Mannheim，Germany)。
7.PBS洗涤液：1×PBS，pH7.4。
8.牛白蛋白(BSA)，部分(fraction)V粉末(Sigma Chemical Co.，USA)。
通用步骤：
1.在10％CS、2mM Gln在DMEM中以8000个细胞/孔将细胞接种于96孔板。5％CO2、37℃培养细胞过夜。
2. 24小时后，用PBS洗涤细胞，然后在不含血清培养基(含0.1％BSA，0％CS DMEM)中贫血清培养(serum-starved)24小时。
3.在第3天，将合适的配体和测试化合物同时加入细胞。阴性对照孔只加含0.1％BSA不含血清的DMEM；阳性对照孔加配体不加测试化合物。在96孔板中在不含血清的DMEM中制备测试化合物，并连续地稀释为7种测试浓度。
4.配体活化18小时后，将稀释的BrdU标记试剂(在含0.1％BSA DMEM中1∶100)加入，并将细胞与BrdU(终浓度＝10μM)培养1.5小时。
5.与标记试剂培养后，通过轻轻倒出和翻转板在纸塔上轻拍除去培养基。加入FixDenat液(50μl/孔)，并将培养板在培养板振荡器上室温培养45分钟。
6.通过轻轻倒出和翻转板在纸塔上轻拍充分除去FixDenat液。加入作为阻断液的牛奶(含5％去水牛奶的PBS，200μl/孔)，将培养板在培养板振荡器上室温培养30分钟。
7.通过轻轻倒出和翻转板在纸塔上轻拍充分除去阻断液。将抗-BrdU-POD液(在含1％BSA的PBS中1∶200稀释)加入(50μl/孔)，将培养板在培养板振荡器上室温培养90分钟。
8.通过轻轻倒出和用PBS清洗孔5次充分除去抗体交联剂，且通过翻转板并在纸塔上轻拍使培养板变干。
9.加入TMB底物液(100μl/孔)并将培养板在培养板振荡器上室温培养20分钟，直到颜色发展适合光度测定。
10.在Dynatech ELISA平板读数器上于410nm测量样品的吸光率(在“双波长”模式中具有作为在参比波长490nm读数的滤光片)。
EGF-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2. 3T3/EGFRc7。
EGF-诱导的Her-2-驱动的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr(有Her-2激酶区的EGFr)。
EGF-诱导的Her-4-驱动的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.鼠EGF，201(Toyobo Co.，Ltd.，Japan)。
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr(有Her-4激酶区的EGFr)。
PDGF-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.人PDGF B/B(Boehringer Mannheim，Germany)。
2. 3T3/EGFRc7。
FGF-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.人FGF2/bFGF(Gibco BRL，USA)。
2. 3T3c7/EGFr。
IGF1-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.人，重组体(G511，Promega Corp.，USA)。
2. 3T3/IGF1r。
胰岛素-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.牛结晶锌胰岛素(13007，Gibco BRL，USA)。
2. 3T3/H25。
HGF-诱导的BrdU结合检测
材料和试剂：
1.重组人HGF(Cat.No.249-HG，R&D Systems，Inc.USA)。
2.BxPC-3细胞(ATCC CRL-1687)。
步骤：
1.在含10％FBS RPMI中以9000个细胞/孔将细胞接种于96孔板。5％CO2、37℃培养细胞过夜。
2. 24小时后，用PBS洗涤细胞，然后在100μl不含血清培养基(含0.1％BSA的RPMI)中贫血清培养24小时。
3.在第3天，将含配体的25μl培养基(在1μg/ml于含0.1％BSA的RPMI中制备；HGF终浓度为200ng/ml)和测试化合物加入细胞。阴性对照孔只加25μl含0.1％BSA不含血清的RPMI；阳性对照孔加配体(HGF)但不加测试化合物。在96孔板中在含配体不含血清的RPMI中制备5倍于终浓度测试化合物，并连续地稀释为7种测试浓度。典型地，测试化合物的最高终浓度是100μM，且使用1∶3稀释(即测试化合物的终浓度是0.137-100μM)。
4.配体活化18小时后，将12.5μl稀释的Brd-U标记试剂(在含0.1％BSA RPMI中1∶100)加入各孔，并将细胞与Brd-U(终浓度是10μM)培养1小时。
5.与通用步骤相同。
6.与通用步骤相同。
7.通过轻轻倒出除去阻断液并以PBS将这些孔洗涤1次。将抗-BrdU-POD液(在含1％BSA的PBS中1∶100稀释)加入(100μl/孔)，将培养板在培养板振荡器上室温培养90分钟。
8.与通用步骤相同。
9.与通用步骤相同。
10.与通用步骤相同。
HUV-EC-C检测
本方法用于测量化合物抗PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF或Flk-1/KDR的活性，所有这些都由HUV-EC细胞天然表达。
第0天
1.洗涤并胰酶消化HUV-EC-C细胞(人脐静脉内皮细胞，美国模式培养物收集中心，catalogue no.1730 CRL)。以约1ml/10cm2组织培养瓶面积用Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，获自Gibco BRL，catalogue no.14190-029)洗涤2次。用0.05％胰酶-EDTA非酶促细胞分离液(Sigma Chemical Company，catalogue no.C-1544)消化。该0.05％胰酶通过在细胞分离液中稀释0.25％胰酶/1mM EDTA(Gibco，catalogue no.25200-049)制得。用约1ml/25-30cm2组织培养瓶面积于37℃消化5分钟。细胞从培养瓶分开后，加入等量的分析培养基(assay medium)并转移到50ml无菌离心管(Fisher Scientific，catalogue no.05-539-6)。
2.在50ml离心管中通过加入分析培养基用约35ml分析培养基洗涤细胞，以约200×g离心10分钟，吸上清，并以35ml D-PBS重悬。用D-PBS重复洗涤另外2次，重悬细胞在约1ml分析培养基/15cm2组织培养瓶面积。分析培养基由F12K培养基(Gibco BRL，catalogueno.21127-014)和0.5％灭活的胎牛血清组成。用Coulter Counter_(Coulter Electronics，Inc.)计数细胞并向细胞加入分析培养基得到浓度为0.8-1.0×105个细胞/ml。
3.向96孔平底板中以100μl/孔或0.8-1.0×104细胞/孔加入细胞，于37℃，5％CO2培养～24小时。
第1天
1.在分离的96孔培养板中配制测试化合物等比(two-fold)滴定，一般50μM向下至0μM。使用如上面第0天步骤2所提到的相同分析培养基。通过加90μl/孔200μM测试化合物(4×终孔浓度)到特定培养板列的顶孔中制成滴定。由于贮存的测试化合物常常在DMSO中为20mM，所以200μM药物浓度含2％DMSO。
使用已将含2％DMSO分析培养基(F12K+0.5％胎牛血清)配制成的稀释液作为稀释液用于测试化合物的滴定，目的是稀释测试化合物但保持DMSO浓度恒定。向此列中剩余的孔中加此稀释液60μl/孔。从此列中顶孔中120μl 200μM测试化合物中取60μl，并将其与此列中第二个孔中的60μl液体混合。从此孔中取60μl，并将其与此列中第三个孔中的60μl液体混合，依次类推直到等比滴定完成。当倒数第二个孔混合后，从这个孔的120μl中取60μl弃掉。留下有60μl DMSO/培养基稀释液的最后的孔作为不含测试化合物对照。制9列滴定的测试化合物，足够用于三倍复孔，分别是：(1)VEGF(获自Pepro Tech Inc.，catalogue no.100-200)，(2)内皮细胞生长因子(ECGF)(也称为酸性成纤维细胞生长因子，或aFGF)(获自Boehringer Mannheim Biochemica，catalogue no.1439 600)，或(3)人PDGF B/B(1276-956，Boehringer Mannheim，Germany)和分析培养基对照。ECGF为肝素钠制剂。
2.转移50μl/孔测试化合物稀释液到第0天的含HUV-EC-C细胞0.8-1.0×104个细胞/100μl/孔的96孔分析培养板上，并于37℃，5％CO2培养～2小时。
3.在三倍复孔中，向每个测试化合物条件加50μl/孔80μg/ml VEGF、20ng/ml ECGF或培养基对照。对于测试化合物，生长因子浓度为4×所需的终浓度。使用第0天步骤2的分析培养基制备生长因子浓度。于37℃，5％CO2培养约24小时。每孔将有50μl测试化合物稀释液、50μl生长因子或培养基和100μl细胞，每孔总计为200μl。因此一旦每种物质都加到孔中，4×测试化合物和生长因子的浓度变为1×。
第2天
1.以1μCi/孔(由RPMI培养基+10％热灭活胎牛血清配制的10μl/孔100μCi/ml溶液)加3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham，catalogueno.TRK-686)并于37℃，5％CO2培养～24小时。RPMI获自Gibco BRL，catalogue no.11875-051。
第3天
1.-20℃冻存培养板过夜。
第4天
解冻培养板并以96-孔板harvester(Tomtec Harvester 96_)收获细胞到滤垫(Wallac，catalogue no.1205-401)上，在WallacBetaplateTM液闪计数器上读数。
表2显示式(I)化合物部分实例生物检测的结果。这些结果以IC50形式报告，IC50即在目的性PKT活性方面与未加测试化合物的对照组的PKT活性相比引起50％改变的被测试化合物的微摩尔(μM)浓度。特别地，所显示的结果指出了引起50％的目的性PKT活性降低所需要的测试化合物的浓度。已经或能够用于评价化合物的生物检测法在下面详细描述。
                                     表2
Example     bioflkGSTIC50(μM)     bioFGFR1IC50(μM)   bioPDGFIC50(μM) bio EGFIC50(μM) cell EGFIC50(μM)     Her2KinaseIC50(μM) cdk2spaC50(μM) bio pyk2IC50(μM)
    1     57.68     15.16   ＞100     ＞100     ＞100   ＞100
    2     ＞100   ＞100     ＞100     ＞100
    3     9.85     9.62   ＞100     ＞100     ＞100   ＞100
    4     3.57     ＞20   ＞100     ＞100     ＞100     ＞100
    5     8.3     16.06   ＞100     ＞100     ＞100     ＞100
    6     4.04   ＞100     3.26     7.82     2.43
    7     7.74   ＞100     5.07     9.8     4.24
    8     12.1   ＞100     51.34     20.08     5.5
    9     0.96   ＞100     ＞100     ＞100     16.38
    10     5.72   ＞100     94.04     15.86     8.06
    11     9.77   ＞100     ＞100     ＞100     ＞100
    12     ＞20   21.46     ＞100     27.73
    13     ＞20   81.92     8.17     2.66
    14     13.01   42.41     ＞100     66.02
    15     ＞20   ＞100     ＞100     98.61
    16     ＞20   98.06     ＞100     23.32
    17     8.25     2.47   94.35     0.83     11.47     15.94   ＞10
    18     2.67     2.57     9.23     4.99
    19     7.5     6.86     34.18     8.37
    20     11.53     ＞100     41.16     8
    21     7.18   ＞100     40.34     27.69
    22     ＞20   ＞100     ＞100     87.67
    23     ＞20   ＞100     36.64     4.05
    24   ＞100     16.84     5.31
    25     12.55   ＞100     23.48     7.9
    26     16.03   66.87     34.67     10.04
    27   ＞100     26.5     3.91
Example     bioflkGSTIC50(μM)   bioFGFR1IC50(μM)    bioPDGFIC50(μM) bio EGFIC50(μM) cell EGFIC50(μM)   Her2KinaseIC50(μM) cdk2spaC50(μM) bio pyk2IC50(μM)
    28     4.5    71.27   53.66   2.67
    29     10.12    ＞100   26.72   3 98
    30     9.4    ＞100   18.69   4.1
    31     ＞50    ＞100   9.83   47.19
    32     45.74    5.94   ＞100   ＞100
    34     ＞50    ＞100   ＞100   ＞100
    35     ＞20    ＞100   80.4   54.14
    36     ＞20    ＞100   ＞100   ＞100
    37     0.22    3.06   10.78   9.84   1.4
    38     4.17    3.06   6.04   8.97   2.16
    39     3.38    4.69   3.67   14.54   3.53
    40     4.5    7.9   6.52   6.27
    42     0.1    0.12   11.95   74.55   20.43
    43     1.12    8.38   ＞100   37.33   53.37
    44     ＜0.05    0.02   20.73   67.46   6.99
    45     1.71    ＞100   ＞100   29.95   ＞100
    46     30.62    6.18   ＞100   ＞100   ＞100
    47     0.08   1.56    0.06   11.42   41.54   8.4   ＞20   1.05
    48     0.006   0.3    ＜0.78   17.88   21.58   7.93   0.09
    49    ＜0.78   ＞100   43.86   ＞100
    50    ＜0.78   ＞100   20.34   ＞100
    51     0.006   1.66    0.01   18.1   21.61   23.24   16.69   0.35
    52     0.08   1.26    ＜0.78   12.53   ＞100   ＞100   10.66   0.45
    53    ＜0.78   ＞100   ＞100   ＞100
    54     1.98    ＜0.78   23.88   9.76   7.02
    55     0.27    0.53   6.03   35.99   77.82
    56     2.32    3.19   ＞100   10.03   7.11
    57     0.06    7.98   ＞100   9.97   6.94
    58    21.14   ＞100   ＞100   ＞100
    59    ＜0.78   ＞100   ＞100   ＞100
    60    ＜0.78   ＞100   ＞100   ＞100
    61    ＜0.78   ＞100   ＞100   ＞100
    62     8.00    8.32   ＞100   ＞100   ＞100
    63     0.21    ＜0.78   8.59   ＞100   ＞100
    64     0.55    ＜0.78   30.49   ＞100   ＞100
    65     0.37    ＜0.05   ＞100   74.36   15.97
    66     ＜0.05   ＞100   11.84   2.76
    67     0.39    24.77   31.38   19.79   2.56
Example     bioflkGSTIC50(μM)     bioFGFR1IC50(μM)     bioPDGFIC50(μM) bio EGFIC50(μM) cell EGFIC50(μM)     Her2KinaseIC50(μM) cdk2spaC50(μM) bio pyk2IC50(μM)
    68     1.16     0.03     ＞100     23.52     34.13
    69     0.3     56.55     ＞100     97.54     ＞100
    70     0.09     1.50     0.0030     10.57     6.42     7.99   12.62   0.63
    71     15.21     22.5     ＞100     9.91
    72     6.06     10.54     ＞100     39.94     9.65
    73     5.95     14.12     ＞100     39.5     8.59
    74     1.2     0.09     46.75     ＞100
    75     2.7     61.55     ＞100     ＞100
    76     3.33     19.18     5.11     3.01
    77     0.49     25.01     ＞100     ＞100
    78     1.94     70.62     9.33     4.25
    79     1.49     ＞100     27.39     ＞100
    80     0.13     4.29     0.001     ＞100     50.19   17.19   0.28
    81     0.21     0.18     ＞100     ＞100
    82     2.03     7.69     6.88     ＞100     ＞100   0.31
    83     0.34     0.41     9.46     2.18     86.9   0.008
    84     1.38     12.51     67.2     5.86   0.006
    85     0.2     0.8     2.59     ＞100     3.76
    86     1.45     1.3     19.6     41.8     ＞100   3.58
    87     3.27     7.56     6.46     ＞100     9.1   0.17
    88     0.35     1.18     8.06     2.36     ＞100   0.09
    89     7.84     47.58     8.53     9.67     15.97
    115     7.3     7.48     ＞100     ＞100   0.006
    116     ＞20     ＞100     ＞100     ＞100   ＜0.0005
    117     0.91     12.9     ＞100     ＞100   0.006
    118     1.93     1.2     ＞100     ＞100   0.002
    119     1.38     61.63     ＞100     ＞100   ＜0.0005
在体内的动物实验
异种移植物动物实验
人类肿瘤作为异种移植物在无胸腺小鼠(例如，Balb/c，nu/nu)上生长能力为研究治疗人类肿瘤的生物反应提供了有用的在体模型。从第一次成功的异种移植人类肿瘤到无胸腺小鼠(Rygaard andPovlsen，1969， Acta Pathol.Microbial.Scand.77：758-760)开始，已经将许多不同的人类肿瘤细胞系(例如乳房的、肺的、生殖泌尿的、胃肠的、头颈的、成胶质细胞瘤、骨的和恶性黑素瘤)移植并在裸鼠上生长。下面的检测法可用于测定式(I)不同化合物的活性水平、特异性和作用。
三种常用的方法可用于评价式(I)化合物：细胞的/催化的方法、细胞的/生物的方法和在体内的方法。细胞的/催化的检测法的目的是测定式(I)化合物对TK在细胞内已知底物上磷酸化酪氨酸的能力的效应。细胞的/生物的检测法的目的是测定式(I)化合物对由细胞内TK刺激的生物反应的效应。在体内的检测法是为了测定式(I)化合物在特定病症诸如癌症的动物模型中的效应。
适合于皮下移植物实验的细胞系包括C6细胞(神经胶质瘤，ATCC#CCL 107)、A375细胞(黑素瘤，ATCC# CRL 1619)、A431细胞(表皮样癌，ATCC# CRL 1555)、Calu 6细胞(肺癌，ATCC# HTB 56)、PC3细胞(前列腺癌，ATCC# CRL 1435)、SKOV3TP5细胞和一般经基因改造的过表达EGFR、PDGFR、IGF-1R或其他测试激酶的NIH 3T3成纤维细胞。下列方案可用于进行异种移植物实验：
雌性无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu)获自Simonsen Laboratories(Gilroy，CA)。所有动物在有Alpha-dri寝具的分隔小笼中清洁级环境条件下饲养。它们自由摄取食物和水。
细胞系在适当培养基(例如，MEM、DMEM、Ham’s F10、或Ham’sF12加5％-10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN))中生长。除特殊说明，全部细胞培养基、谷氨酰胺和胎牛血清购买自Gibco LifeTechnologies(Grand Island，NY)。全部细胞于37℃在90-95％空气和5-10％CO2湿度环境生长。全部细胞系每周常规传代2次并当用Mycotect方法(Gibco)测定支原体为阴性。
在或近于汇合时用0.05％胰酶-EDTA收获细胞并以450×g离心10分钟。将沉淀重悬于无菌PBS或培养基(无FBS)至特定浓度并将细胞种植于小鼠的后侧部(每组8-10只小鼠，每只动物2-10×105个细胞)。肿瘤生长3-6周后用venier测径器测量。除非另外指出，肿瘤体积用长×宽×高计算。用Student t-检验计算P值。在50-100μl赋形剂(DMSO，或VPD：D5W)中式(I)测试化合物可通过IP注射以不同浓度给予，通常于种植后第一天开始。
肿瘤侵袭模型
下面的肿瘤侵袭模型已经得到发展并可用于评价特点为选择性抑制KDR/FLK-1受体的式(I)化合物的治疗价值和效力。
方法
实验动物用8周龄裸鼠(雌性)(Simonsen Inc.)。种植肿瘤细胞可在层流净化罩内进行。关于麻醉，将甲苯噻嗪/克他命混合物(100mg/kg克他命和5mg/kg甲苯噻嗪)腹膜内给药。中线切开暴露腹腔(约1.5cm长)，注射在100μl体积培养基内的107个细胞。将细胞或注射进胰腺的十二指肠壶腹部或注射到结肠浆膜下。用6-0丝线连续缝合关闭腹膜和肌肉，用伤口小夹闭合皮肤。每天观察动物。
分析
2-6周后，根据对动物的肉眼观察，将小鼠处死，将转移到不同器官(肺、肝、脑、胃、脾、心、肌肉)的局部肿瘤切除并分析(测量肿瘤大小、侵袭等级、免疫组化、原位杂交测定等)。
C-KIT检测
本方法用于检测c-kit酪氨酸磷酸化水平。
将MO7E(人急性髓性白血病)细胞在0.1％血清中贫血清培养过夜。在配体刺激前，将细胞用式(I)化合物预处理(与贫血清培养同时)。将细胞用250ng/ml rh-SCF刺激15分钟。刺激后，将细胞溶解并以抗c-kit抗体免疫沉淀。用Western blotting测定磷酸酪氨酸和蛋白水平。
MTT增殖检测
按磷酸化实验中描述将MO7E细胞贫血清培养和预处理。将细胞以@4×105个细胞/孔在100μl RPMI+10％血清中种植在96孔培养皿中。加rh-SCF(100ng/ml)，将培养板培养48小时。48小时后，加入10μl 5mg/ml MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴酸盐]，并进行培养4小时。加入酸异丙醇(100μl在异丙醇中的0.04N盐酸)，并在550nm波长测量光密度。
细胞凋亡检测
将MO7E细胞培养在含rh-GM-CSF(10ng/ml)和rh-IL-3(10ng/ml)的10％FBS中+/-SCF和+/-式(I)化合物。将样品在24和48小时检测。为测量活化的caspase-3，用PBS洗涤样品，并以冰冷的70％乙醇渗透。然后用PE交联的多克隆兔抗活性caspase-3将细胞染色，并通过FACS分析。为测量裂解(cleaved)的PARP，将样品溶解并通过western blotting用抗-PARP抗体分析。
其他检测方法
可用于评价式(I)化合物的其他方法包括但不限于：bio-flk-1检测、在完整细胞中EGF受体-HER2嵌合受体检测、bio-src检测、bio-lck检测和测量raf磷酸化功能的方法。这些方法中每种的方案可在美国专利申请第09/099,842中发现，其合并一起包括附图为本文中所参考。
细胞毒性测定
治疗化合物应该在抑制受体酪氨酸激酶活性方面比在实施细胞毒性效应方面更具有效力。测量化合物的有效性和细胞毒性可通过测定治疗指数，即IC50/LD50获得。IC50，要求达到50％抑制的剂量，可用标准技术诸如本文中所描述的来测量。LD50，导致50％毒性的剂量，也可通过标准技术来同样(Mossman，1983，J.Immunol.Methods，65：55-63)，通过测量所释放的LDH量(Korzeniewski and Callewaert，1983，J.Immunol.Methods，64：313，Decker and Lohmann-Matthes，1988，J.Immunol.Methods，115：61)，或通过动物模型中的致死剂量来测量。优选具有大的治疗指数的化合物。治疗指数应该高于2，优选至少10，更优选至少50。
B.使用5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)细胞检测结果的实施例
为确认在生物化学检测(见下页)中测定的5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)的效力，在基于细胞检测用基因改造过的过表达Flk-1或人PDGFRβ的NIH-3T3细胞评价所述化合物抑制配体-依赖的RTK磷酸化能力。5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制VEGF-依赖的Flk-1酪氨酸磷酸化，伴约0.03μM的IC50值。此值接近于在生物化学方法中测定的由5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制的Flk-1的0.009μM Ki测定值。这表明5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)容易渗透进入细胞。与生物化学数据(见下页)一致表明5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)具有相当抗Flk-1和PDGFRβ活性，还发现它抑制细胞内PDGF-依赖的受体磷酸化，伴约0.03μM的IC50值。5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制c-kit，紧密相关的结合干细胞因子(SCF)的RTK的能力用表达这种受体的MO7E细胞来测定。在这些细胞中，5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制SCF依赖的c-kit磷酸化，伴0.01-0.1μM的IC50值。此化合物还抑制在急性髓性白血病(AML)患者外周血分离的胚细胞中SCF-刺激的c-kit磷酸化。
除测试5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)在细胞内抑制配体-依赖的受体磷酸化之外，在体外还检测了其对细胞的配体依赖的增殖反应的作用(参见表4)。在这些研究中，在加入适当促有丝分裂配体基础上，通过过夜贫血清培养静止的细胞被诱导经历DNA合成。如在表3中所显示，5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制PDGF-诱导的过表达PDGFRβ或PDGFRα的NIH-3T3细胞增殖，IC50值分别是0.031μM和0.069μM，且抑制SCF-诱导的MO7E细胞增殖的IC50值为0.007μM。
                              表3
    生物化学                  细胞的IC50
    受体     Ki1(μM) 受体磷酰化(μM) 配体依赖的增殖(μM)
    Flk-1/KDR     0.009     0.032       0.0043
    PDGFRα     0.008     0.034       0.0314
    PDGFRβ     ND     ND       0.0695
    FGFR     0.83     ND       0.73
    c-kit     ND     0.01-0.16       0.0076
    ND＝未测1用重组酶测定的2用贫血清NIH-3T3细胞表达FLK-1测定的3用贫血清HUVECs测定的4用贫血清NIH-3T3细胞表达PDGFR测定的5用贫血清NIH-3T3细胞表达PDGFR测定的6用贫血清MO7E细胞测定的
如在表3中所显示，在5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)的生物化学的和细胞的活性之间有大体的一致，支持此化合物穿过了细胞膜的结论。另外，可得出结论：细胞反应是化合物80抗指定目标活性的结果。相反，当在体外有完全生长培养基存在下测量，抑制各种人类肿瘤细胞要求相当高的5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)的浓度(＞10μM)(参见表4)。这表明该化合物在抑制配体-依赖的受体磷酸化和细胞增殖所要求的浓度，不直接抑制这些细胞的生长。
                               表4
    细胞素     来源      IC50(μM)     LD50(μM)
    HT29     结肠瘤      10     22
    A549     肺癌      9.5     22
    NCI-H460     NSC肺癌      8.9     20
    SF767T     神经胶质瘤      7.9     14
    A431     表皮样瘤      6.0     18
简要地，表4所显示的结果是通过在完全生长培养基中，在系列稀释的5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺存在下培养细胞48小时得到的。在生长期末期，测定有关的细胞数。IC50值计算为相对于未处理细胞50％抑制细胞生长的化合物的浓度。LD50值计算为相对于在实验开始时的细胞引起细胞数减少50％的化合物的浓度。
更相关的基于细胞的为评价5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抗血管生成潜力的方法是使用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为对血管生成过程重要的内皮细胞增殖的模型系统的在体外的促有丝分裂方法。在此方法中，在贫血清培养HUVECs中，在加入VEGF或FGF基础上诱导作为DNA合成增加所测量的促有丝分裂反应。在这些细胞中，当化合物始终存在于48小时的检测时，5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)以剂量依赖方式抑制VEGF-或FGF-诱导的促有丝分裂反应，IC50值分别是0.004μM和0.7μM。
简要地，在5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)系列稀释液存在下，使用与促有丝分裂浓度的VEGF(100ng/ml)或FGF(30ng/ml)一起培养24小时的贫血清培养的HUVECs得到的前述结果。在随后的24小时，在配体和抑制剂存在下，促有丝分裂反应通过测量在溴脱氧尿苷结合入细胞DNA中基础上的DNA合成来测定。
在不同的实验中，化合物80以剂量依赖方式抑制VEGF依赖的Flk-1/KDR的早期下游目标ERK1/2(p42/44MAP激酶)的磷酸化。化合物80的抑制活性在此系统中还显示是长期持续的；短期(2小时)接触微摩尔浓度该化合物后，在从培养基除去5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)之后，抑制VEGF-依赖的ERK1/2的磷酸化48小时。
VEGF已经被认为是内皮细胞重要的生存因子。由于5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制HUVECs的VEGF-依赖的促有丝分裂反应，所以研究了化合物对HUVEC存活的作用。在这些实验中，将caspase3底物聚-ADP-核糖基聚合酶的裂解(PARP)用以显示细胞凋亡。当检测23kDa PARP裂解片段积聚时，在无血清条件下培养HUVECs24小时显示PARP裂解的真实水平。这种情况为向细胞培养基加入VEGF所防止，说明在本方法中VEGF是作为生存因子。已显示5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制KDR发信号。因此，5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)以剂量依赖的方式抑制VEGF-介导的HUVEC存活。因而，这些数据指出化合物80诱导在VEGF存在下在培养的内皮细胞中的细胞凋亡。
C.体内功效研究
i.抗已建立的肿瘤异种移植物功效
在使用人肿瘤细胞种植入无胸腺小鼠后侧部的皮下(SC)异种移植物模型中，研究5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)的在体内的功效。种植后，在用化合物口服治疗前，允许肿瘤开始建立达100-550mm3大小。
当肿瘤生长到400mm3大小后开始治疗时，每天口服施用化合物80引起A431肿瘤生长的剂量依赖性抑制。有统计意义(P＜0.05)的肿瘤生长抑制见于40mg/kg/天(74％抑制率)和80mg/kg/天(84％抑制率)(参见表6)。在预实验中，化合物的更高剂量(160mg/kg/天)与80mg/kg/天剂量相比无更高的抗已建立的A431肿瘤的效力。另外，以160mg/kg/天剂量化合物处理的小鼠体重减轻，表明更高剂量无同样的耐受。在其中仅允许A431肿瘤达到100mm3大小的实验中得到类似结果(参见表4)。在此第二个实验中，肿瘤完全消退发生于以80mg/kg/天处理21天的8只动物中的6只中。在这6只动物中，在处理结束后的110天观察期之中，肿瘤未重新长出。在其中肿瘤再生到大体积(2000-3000mm3)的2只动物中，响应第二次用化合物80处理，肿瘤消退。重要地，在全部效力实验中，即使当给药持续超过100天，80mg/kg/天的5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)耐受良好。
                                      表5
 起初肿瘤体积(mm3) 化合物(mg/kg/天)   抑制％(天)     P-值
    400     80     84(36)     0.001
    40     74(36)     0.003
    20     51(36)     0.130
    100     80     93(40)     0.002
    40     75(40)     0.015
    10     61(40)     0.059
    1化合物80
简要地，使用皮下种植入无胸腺小鼠后侧部的A431细胞(每只动物0.5×106个细胞)获得显示于表5中的结果。当肿瘤达到指定的平均体积时，开始每天口服施用在基于Cremophore的载体中的5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)或载体对照。用vernier测径器测量肿瘤，以长×宽×高的乘积计算肿瘤体积。在实验最后一天，通过对以化合物80处理的动物(n＝8)和以载体处理的动物(n＝16)的肿瘤大小比较，使用双侧Student’s t-检验计算P值。
使用Colo205(结肠癌)、SF763T(神经胶质瘤)和NCI-H460(非小细胞肺癌)异种移植物测定化合物80抗已建立的不同来源人肿瘤的效力(见表6)。使用80mg/kg/天5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)口服给药来实施这些实验；该剂量有效并良好耐受。
                                     表6
  肿瘤类型 起初肿瘤体积(mm3)   抑制％(天)     P-值
    A4311   表皮样瘤     100     93(40)     0.002
    A4311   表皮样瘤     400     84(36)     0.001
    Colo205   结肠     370     77(54)     0.028
    NCl-H460   肺     300     61(54)     0.003
    ST763T   神经胶质瘤     550     53(30)     0.001
1数据来自表5报导的实验
在上述实验中，一旦肿瘤达到指定体积，将在基于Cremophore的载体中的化合物80以80mg/kg每天一次给药。在实验结束后，计算与载体处理对照组比较的百分比抑制率。通过比较以化合物处理的动物和以载体处理的动物的肿瘤大小，使用双侧Student’s t-检验计算P值。
尽管5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺(化合物80)抑制所有显示于表7中的肿瘤类型的生长，但是在对不同异种移植物模型的反应方面存在差异。具体地，NCI-H460和SF763T肿瘤生长被抑制或极大减慢，然而Colo205肿瘤，类似于A431肿瘤，当用5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺处理，肿瘤消退。
为测定异种移植物模型间不同反应的分子基础，研究了SF763T肿瘤。因此，使用免疫组织学技术测定以化合物处理的作用在分子水平评价对5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二乙氨基-乙基)酰胺处理的响应较小的SF763T肿瘤。最初在这种肿瘤类型进行这些研究是因为SF763T肿瘤是伴高表达内皮细胞标记物CD31微脉管的高血管化的，并因此非常适合于肿瘤微脉管密度(MVD)研究。SF763T肿瘤的免疫组织学评价指出，相应于载体处理对照组，治疗组动物的肿瘤MVD降低，与化合物80抗血管生成作用机制一致；与仅用载体处理的动物的MVD 39.3±5.7比较，用化合物80处理的动物中的MVD为24.2±4.1。如从相关肿瘤生长抑制中所预期的，在以化合物80处理的肿瘤中证明肿瘤细胞增殖的明显抑制。这些肿瘤的有丝分裂指数是载体处理肿瘤有丝分裂指数的一半(未列数据)。化合物80对MVD和肿瘤细胞增殖的作用指出该化合物有意义深远的抗血管生成和抗肿瘤效应，即使在肿瘤为消退的情况下。
在表达高水平PDGFRβ的SF763T肿瘤中，还在体内评价了化合物80抑制PDGFR磷酸化和随后的发信号的能力。在所建立的SF763T肿瘤中，用化合物80处理SF763T肿瘤强烈抑制PDGFRβ酪氨酸磷酸化。化合物80还降低直接下游PDGFR活化指示器磷酸化的(活化的)磷酸化磷脂酶Cγ(PLC-γ)水平。这些数据说明口服施用化合物80引起对在体内肿瘤中目标(PDGFR)的活性的直接作用。
在证明化合物80抑制体外的HUVECs中VRGF-依赖的发信号的能力是长期持续的(见下文)的基础上，评价了在Colo205肿瘤模型中当间断给予该化合物时该化合物的效力。如表7所显示，当每天给药而不是每周给药2次时，80mg/kg(91％抑制率)和40mg/kg(84％抑制率)是有效的。相反，当每周给药2次时，较高剂量的化合物80(160mg/kg)却抑制(52％抑制率)所建立的Colo205肿瘤生长，提示当间断给予较高剂量时此化合物是有效的。应该注意到给药方案可由本领域技术人员无需过度的实验来确定。
                               表7
剂量(mg/kg)     频率     抑制％     P-值
    160     每周两次     52     0.085
    每周一次     17     NS
    80     每天     91     0.039
    每周两次     19     NS
    每周一次     0     NS
    40     每天     84     0.028
    每周两次     36     NS
 NS：无显著性(P＞0.05)
简要地，使用皮下种植入无胸腺小鼠后侧部的Colo205细胞(每只动物0.5×106个细胞)获得显示于表7中的结果。当肿瘤达到400mm3时，根据指定方案开始口服施用化合物80。用vernier测径器测量肿瘤，以长×宽×高的乘积计算肿瘤体积。在实验最后一天，通过对以化合物80处理的动物和以载体处理的动物的肿瘤大小比较，使用双侧Student’s t-检验计算P值。
ii.化合物80在转移疾病模型中的功效
除支持实体原发肿瘤持续生长之外，血管生成还是支持从原发肿瘤转移的转移性疾病发展必需的成分。在B16-F1小鼠黑素瘤肺移殖模型中检测化合物80对转移性疾病的作用。在此模型中，通过无胸腺小鼠尾静脉注射接种的B16-F1细胞移殖于肺并形成肿瘤。如表7中所显示，当通过测量总肺重量时，以80mg/kg/天口服给予化合物80有效地降低B16-F1细胞在肺中的负荷。这些数据提示化合物80能在体内抑制转移性疾病。
                              表8
    肺重量(g)     抑制％     P-值
    载体     0.83±0.07     -     -
    化合物1     0.41±0.04     50     ＜0.001
1化合物80
简要地，使用以B16-F1肿瘤细胞(每只动物5×105个细胞/小鼠)通过其尾静脉注射接种的无胸腺小鼠获得显示于表8中的结果。肿瘤接种后，以每天口服施用80mg/kg/天的化合物80(n＝10)或载体(n＝18)处理小鼠24天。在处理期结束时，处死动物，将它们的肺切除并称重。通过对以化合物80处理的动物的肺重量和仅以载体处理的动物肺重量比较计算百分比抑制率。使用双侧Student’s t-检验确定P值。
II.COX-2抑制剂
下面叙述使用Lewis肺模型检测COX-2抑制剂减缓肿瘤生长的能力。
在小鼠左爪皮下注射(悬浮于30％Matrigel中1×106个肿瘤细胞)，用phlethysmometer每周2次测量肿瘤体积30-60天。实验期间在24小时的方案中采血2次以估计血浆浓度并全部用AUC分析。数据表示为均数+/-SEM。用InStat软件包以Student’s和Mann-Whitney检验估计均数间差异。以160-3200ppm剂量在食物中给Celecoxib减慢这些肿瘤的生长。与对照肿瘤相比Celecoxib的抑制作用是剂量依赖的并在48％-85％范围。在全部动物中通过立体显微镜计数转移和通过连续的肺切片组织化学分析进行肺转移分析。在较低的160ppm剂量Celecoxib不影响肺转移，然而当给予480-3200ppm之间剂量时表面转移降低超过50％。此外，组织病理学分析揭示剂量依赖的Celecoxib降低肺中转移损害的大小。
2.HT-29模型：
在小鼠左爪皮下注射(悬浮于30％Matrigel中1×106个肿瘤细胞)，用phlethysmometer每周2次测量肿瘤体积30-60天。将人结肠癌细胞(HT-29)种植到裸鼠中产生肿瘤，肿瘤在30-50天之间将达到0.6-2ml。实验期间在24小时的方案中采血2次以估计血浆浓度并全部用AUC分析。数据表示为均数+/-SEM。用InStat软件包以Student’s和Mann-Whitney检验估计均数间差异。
A.在食物中存在和不存在Celecoxib情况下，用50mg/kg剂量的cytoxin i.p在第5、7和9天处理以HT-29癌细胞注射了的小鼠。通过测量肿瘤体积测定两种药物的效力。用Celecoxib相关的COX-2抑制剂(SC-58236)处理降低肿瘤体积为89％。在相同的方法中，在饮用的水中给接近最大耐受剂量2mg/kg/天的消炎痛抑制肿瘤形成为77％。而且，当非选择性NSAID消炎痛无效时，COX-2选择性抑制剂完美抑制肿瘤转移形成。这些研究结果证明当作为单独治疗给药时在食物中对荷瘤小鼠给予Celecoxib可延迟肿瘤生长和转移。而且当Celecoxib与细胞毒药物诸如环磷酰胺联合给药时观察到肯定的益处。
B.在另一个方法中，于第10天开始在食物中用Celecoxib(10、40或160ppm)处理注射了HT-29结肠癌细胞的小鼠。观察到近似的剂量依赖作用。(表9)
表9.Celecoxib抑制HT-29人结肠癌
天 载体 10ppm 40ppm 160ppm
    14     0.114     0.124     0.125     0.120
    22     0.25     0.25     0.19     0.14
    28     0.45     0.36     0.27     0.21
    35     0.79     0.57     0.4     0.3
    42     1.38     0.89     0.68     0.49
    50     1.9     1.49     1.04     0.8
                  体积(ml)
III. 用蛋白激酶与环氧合酶-2选择性抑制剂联合用于治疗癌症的在 体检测
在下面叙述的1483异种移植物模型中可检测蛋白激酶抑制剂与COX-2选择性抑制剂联合减慢肿瘤生长的能力。
1483异种移植物是模拟在肿瘤细胞和脉管系统中表达环氧合酶-2(COX-2)的人内皮细胞癌的异种移植物。
在肿瘤细胞和脉管系统中表达COX-2的头颈鳞状细胞癌(1483细胞系)的人类肿瘤异种移植物裸鼠模型类似于人上皮癌。我们相信此模型代表人上皮癌并将是抗癌药物包括COX-2抑制剂的效力与人类中效力相关的好的模型
材料和方法：
细胞培养：
1483人头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞保存于含3×106个细胞、90％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DMSO)的冷冻瓶中。取出冷冻瓶并迅速在37℃解冻，并放在包括含15mM Hepes缓冲液、L-谷氨酰胺、盐酸吡哆醇和10％FBS的D-MEM/F12培养基(GibcoBRL)的T-162cm2(Corning)瓶中。细胞在5％CO2培养箱中37℃培养。每两天更换培养基，当80-90％汇合时，将细胞传代。对传代的细胞，用10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤培养瓶，抽吸并加入2ml胰酶/EDTA(0.25％/1mM，GibcoBRL)放回培养箱，5分钟后，细胞将分开。加8ml上述培养基到培养瓶中冲洗并转移到无菌50ml离心管。另加30ml培养基，混合并在血球计数器上计数细胞，取出细胞放入T-162cm2培养瓶中，含3-4×106个细胞。
1483动物模型：
在注射入裸鼠中之前，在收获1483细胞前24小时更换培养基。如上面细胞培养部分中所描述，胰酶消化1483细胞。计数细胞并确定细胞数目。室温1000rpm离心细胞5分钟。重悬细胞颗粒并以Hank’s缓冲盐溶液(HBSS，GibcoBRL)将它们(如果多个50ml离心管)混合入一支50ml的离心管中，如前离心。你应该得到比你用于注射所需要的多约25％的额外细胞。如果你将要注射72只小鼠而你有100×106个细胞，制备全部细胞用于给小鼠注射。以1×106个细胞以0.03ml/鼠注射1483细胞。
以30％Matrigel(Collaborative Biomedical Products)和70％HBSS注射细胞。用2.1ml(70％)HBSS冷重悬混合的细胞颗粒，然后0.9ml(30％)解冻的液化的冷Matrigel，并在冰上良好混合。在注射到小鼠前一直在冰上保持此制剂。在这些研究中使用4-6周龄雄性裸鼠(Harlen)。用二氧化碳/氧气麻醉剂麻醉小鼠，然后用0.5cc结核菌素注射器(Beckerson & Dickerson)注射细胞到小鼠右后爪中部。在注射那天(第0天)称量小鼠体重，作为实验开始的基准体重。在第7天称小鼠体重，并以体积描记器(Stoelting Co.)测量小鼠右后爪肿瘤体积。体积描记器是通过排出水量测量爪体积的设备。测量几支左侧未注射的爪并从右侧荷瘤爪减去测量背景平均数。
当肿瘤为100-200ul大小时，给动物投含测试化合物的食物并在研究中一直给予。部分小鼠只给蛋白激酶抑制剂或环氧合酶-2选择性抑制剂。部分小鼠以基于体外实验结果确定的合适剂量给蛋白激酶抑制剂和环氧合酶-2选择性抑制剂两者。
在整个研究中的第7、10、14、17、21、24和28天称重并测量小鼠。动物可在第0天开始化合物处理(预防组)或一旦在约第7天建立肿瘤(治疗组)。约第30天载体组(对照组)小鼠将有巨大肿瘤(～1.0-1.5ml)并开始体重减轻，此时处死载体组动物。如果在治疗组观察到肿瘤抑制且它们健康良好，无痛处死治疗组一半的动物，并保持治疗组一半的动物存活以测定肿瘤生长的延迟。
本领域技术人员也将容易理解本发明非常适合于实施其目的和获得所提到的结果和益处以及本文中固有的。本文中描述的分子复合体和方法、步骤、治疗、分子、特异化合物是目前优选实施方案有代表性的，是示范性的，并不意味着限制本发明的范围。权利要求的范围定义了包含在本发明精神范围内的本领域技术人员将想到在其中的改变和其他应用。
对本领域技术人员显而易见的是对本文公开的本发明可进行改变取代基和修改，未脱离本发明的范围和精神。
在说明书中提到的全部专利和公开出版物表示本发明所属领域技术人员的水平。本文中引用的全部专利和公开出版物全文引入以供参考，至似乎具体地和个别地指出引用每篇单独的出版物作为参考的相同程度。

Claims (50)

1.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的：
式(I)的蛋白激酶抑制剂：
其中：
R选自氢、哌嗪-1-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基甲基、哌啶-1-基甲基、2-羟甲基吡咯烷-1-基甲基、2-羧基吡咯烷-1-基甲基和吡咯烷-1-基甲基组成的组；
R1选自氢、卤、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、-C(O)NR8R9、-NR13R14、-(CO)R15和-(CH2)rR16组成的组；
R2选自氢、卤、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR13R14、-NR13C(O)R14、-(CO)R15、芳基、杂芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、芳基、杂芳基、-NR13R14、-NR13S(O)2R14、-S(O)2NR13R14、-NR13C(O)R14、-NR13C(O)OR14、-(CO)R15和-SO2R19组成的组；
R4选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基和-NR13R14组成的组；
R5选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R6选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R7选自氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R17和-C(O)R10组成的组，条件是当R是氢那么至少R5、R6和R7之一是-C(O)R10；或
R6和R7可结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-和-(CH2)6-组成的组中的基团；
R8和R9独立地选自氢、烷基、取代的烷基和芳基组成的组；
R10选自羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R11)(亚烷基)nR12组成的组，其中亚烷基是以羟基和-NR13R14任选取代的；
R11选自氢、烷基和取代的烷基组成的组；
R12选自-NR13R14、羟基、-(CO)R15、芳基、杂芳基、-N+(O-)R13R14、-N(OH)R13和-NHC(O)R18组成的组，其中R18是烷基、取代的烷基、卤烷基或芳烷基；
R13和R14独立地选自氢、烷基、取代的烷基、以羟基烷基氨基取代的低级烷基、氰基烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或
R13和R14可结合形成杂环基；
R16选自氢、羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；
R16选自羟基、-NR13R14、-(CO)R15和-C(O)NR13R14组成的组；
R17选自烷基、取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；
R19选自烷基、取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基组成的组；且
n和r独立地是1、2、3或4；
与环氧合酶抑制剂联合；
或其可药用盐。
2.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的式(I)的蛋白激酶抑制剂：
其中：
R选自氢、哌嗪-1-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基甲基、哌啶-1-基甲基、2-羟甲基吡咯烷-1-基甲基、2-羧基吡咯烷-1-基甲基和吡咯烷-1-基甲基组成的组；
R1选自氢、卤、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、-C(O)NR8R9、-NR13R14、-(CO)R15和-(CH2)rR16组成的组；
R2选自氢、卤、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、氰基、-NR13R14、-NR13C(O)R14、-(CO)R15、芳基、杂芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、芳基、杂芳基、-NR13R14、-NR13S(O)2R14、-S(O)2NR13R14、-NR13C(O)R14、-NR13C(O)OR14、-(CO)R15和-SO2R19组成的组；
R4选自氢、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、烷氧基和-NR13R14组成的组；
R5选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R6选自氢、烷基、取代的烷基和-C(O)R10组成的组；
R7选自氢、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、-C(O)R17和-C(O)R10组成的组，条件是当R是氢那么至少R5、R6和R7之一是-C(O)R10；或
R6和R7可结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-和-(CH2)6-组成的组中的基团；
R8和R9独立地选自氢、烷基、取代的烷基和芳基组成的组；
R10选自羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R11)(亚烷基)nR12组成的组，其中亚烷基是以羟基和-NR13R14任选取代的；
R11选自氢、烷基和取代的烷基组成的组；
R12选自-NR13R14、羟基、-(CO)R16、芳基、杂芳基、-N+(O-)R13R14、-N(OH)R13和-NHC(O)R18组成的组，其中R18是烷基、取代的烷基、卤烷基或芳烷基；
R13和R14独立地选自氢、烷基、取代的烷基、以羟基烷基氨基取代的低级烷基、氰基烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基和杂芳基组成的组；或
R13和R14可结合形成杂环基；
R15选自氢、羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；
R16选自羟基、-NR13R14、-(CO)R15和-C(O)NR13R14组成的组；
R17选自烷基、取代的烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；
R19选自烷基、取代的烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基组成的组；且
n和r独立地是1、2、3或4；
与选自下列组的选择性环氧合酶-2选择性抑制剂结合：
(i)式(II)的化合物：
其中：
G选自O、S和-NRa-组成的组，其中Ra是氢或烷基；
R10a选自氢和芳基组成的组；
R11a选自羧基、烷基、芳烷基、氨基羰基、烷基磺酰氨基羰基和烷氧基羰基组成的组；
R12a选自卤烷基、烷基、芳烷基、环烷基和以一种或多种选自烷基硫基、硝基和烷基磺酰基的基团任选取代的芳基组成的组；和
R13a是独立地选自氢、卤、烷基、芳烷基、烷氧基、杂芳氧基、芳烷基氧基、杂芳烷基氧基、卤烷基、卤烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、硝基、氨基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基、杂芳烷基氨基磺酰基、杂环磺酰基、烷基磺酰基、羟基芳基羰基、硝基芳基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、芳烷基羰基、杂芳基羰基、芳基羰基、氨基羰基和烷基羰基的一种或多种基团；
或R13a与E环一起形成萘环；或
(ii)式(III)的化合物：
其中：
A选自部分未饱和的或未饱和的杂环基和部分未饱和的或未饱和的碳环；
R1b选自杂环基、环烷基、环烯基和芳基组成的组，其中R1b在可取代的位置是以独立地选自烷基、卤烷基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羟基、羟基烷基、卤烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、硝基、烷氧基烷基、烷基亚硫酰基、卤、烷氧基和烷基硫基的一种或多种基团任选取代的；
R2b选自甲基和氨基组成的组；且
R3b选自由选自氢、卤、烷基、链烯基、炔基、氧、氰基、羧基、氰基烷基、杂环基氧基、烷基氧基、烷基硫基、烷基羰基、环烷基、芳基、卤烷基、杂环基、环链烯基、芳烷基、杂环基烷基、酰基、烷基硫基烷基、羟基烷基、烷氧基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、芳链烯基、烷氧基烷基、芳基硫基烷基、芳氧基烷基、芳烷基硫基烷基、芳烷氧基烷基、烷氧基芳烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基、氨基羰基烷基、烷基氨基羰基、N-芳基氨基羰基、N-烷基-N-芳基氨基羰基、烷基氨基羰基烷基、羧基烷基、烷基氨基、N-芳基氨基、N-芳烷基氨基、N-烷基-N-芳烷基氨基、N-烷基-N-芳基氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、N-芳基氨基烷基、N-芳烷基氨基烷基、N-烷基-N-芳烷基氨基烷基、N-烷基-N-芳基氨基烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳基硫基、芳烷基硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、烷基氨基磺酰基、N-芳基氨基磺酰基、芳基磺酰基和N-烷基-N-芳基氨基磺酰基的基团组成的组；
或其可药用盐。
3.权利要求2的方法，其中环氧合酶-2选择性抑制剂是式(II)的化合物，其中：
G选自氧和硫组成的组；
R11a选自羧基、低级烷基、低级芳烷基和低级烷氧基羰基组成的组；
R12a选自低级卤烷基、低级环烷基和苯基组成的组；和
R13a是选自H、卤、低级烷基、低级烷氧基、低级卤烷基、低级卤烷氧基、低级烷基氨基、硝基、氨基、氨基磺酰基、低级烷基氨基磺酰基、5-元杂芳烷基氨基磺酰基、6-元杂芳烷基氨基磺酰基、低级芳烷基氨基磺酰基、5-元含氮杂环磺酰基、6-元含氮杂环磺酰基、低级烷基磺酰基、任选取代的苯基、低级芳烷基羰基和低级烷基羰基组成的组中的一种或多种基团；或R13a与E环一起形成萘基。
4.权利要求3的方法，其中：
R11a是羧基；
R12a是低级卤烷基；和
R13a是选自H、卤、低级烷基、低级卤烷基、低级卤烷氧基、低级烷基氨基、氨基、氨基磺酰基、低级烷基氨基磺酰基、5-元杂芳烷基氨基磺酰基、6-元杂芳烷基氨基磺酰基、低级芳烷基氨基磺酰基、低级烷基磺酰基、6-元含氮杂环磺酰基、任选取代的苯基、低级芳烷基羰基和低级烷基羰基组成的组中的一种或多种基团；或R13a与E环一起形成萘基。
5.权利要求4的方法，其中：
R12a选自氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基、二氯丙基、二氟甲基和三氟甲基组成的组；和
R13a是选自hydrido、氯、氟、溴、碘、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、丁基、异丁基、戊基、己基、甲氧基、乙氧基、异丙基氧基、叔丁基氧基、三氟甲基、二氟甲基、三氟甲氧基、氨基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙氨基、N-苯基甲基氨基磺酰基、N-苯基乙氨基磺酰基、N-(2-呋喃甲基)氨基磺酰基、硝基、N，N-二甲基氨基磺酰基、氨基磺酰基、N-甲基氨基磺酰基、N-乙基磺酰基、2，2-二甲基乙氨基磺酰基、N，N-二甲基氨基磺酰基、N-(2-甲基丙基)氨基磺酰基、N-吗啉代磺酰基、甲基磺酰基、苄基羰基、2，2-二甲基丙基羰基、苯乙酰基和苯基组成的组中的一种或多种基团；或其中R13a与E环一起形成萘基。
6.权利要求5的方法，其中：
R12a选自三氟乙基和五氟甲基组成的组；和
R13a是选自hydrido、氯、氟、溴、碘、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、甲氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、N-苯基甲基氨基磺酰基、N-苯基乙氨基磺酰基、N-(2-呋喃甲基)氨基磺酰基、N，N-二甲基氨基磺酰基、N-甲基氨基磺酰基、N-(2，2-二甲基乙基)氨基磺酰基、二甲基氨基磺酰基、2-甲基丙基氨基磺酰基、N-吗啉代磺酰基、甲基磺酰基、苄基羰基和苯基组成的组中的一种或多种基团；或其中R13a与E环一起形成萘基。
7.权利要求2的方法，其中环氧合酶-2选择性抑制剂选自下列组：
6-氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-7-甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-(1-甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-7-(1，1-二甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-8-(1-甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
2-三氟甲基-3H-萘并吡喃-3-羧酸；
7-(1，1-二甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-溴-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-三氟甲氧基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
5，7-二氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-苯基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
7，8-二甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6，8-双(二甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
7-(1-甲基乙基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
7-苯基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-7-乙基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-8-乙基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-7-苯基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6，7-二氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6，8-二氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
2-三氟甲基-3H-萘并[2，1-b]吡喃-3-羧酸；
6-氯-8-甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-氯-6-甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-氯-6-甲氧基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-溴-8-氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-溴-6-氟-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-溴-6-甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-溴-5-氟-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-氯-8-氟-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-溴-8-甲氧基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[(二甲基氨基)磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[(甲基氨基)磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[(4-吗啉代)磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[(1，1-二甲基乙基)氨基磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[(2-甲基丙基)氨基磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-甲基磺酰基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-氯-6-[[(苯基甲基)氨基]磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-苯基乙酰基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6，8-二溴-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
8-氯-5，6-二甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6，8-二氯-(S)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-苄基磺酰基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[[N-(2-呋喃基甲基)氨基]磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-[[N-(2-苯基乙基)氨基]磺酰基]-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-碘-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
7-(1，1-二甲基乙基)-2-五氟乙基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸；
6-碘-2-三氟甲基-2H-1-苯并噻喃-3-羧酸；或其可药用盐。
8.权利要求2的方法，其中环氧合酶-2选择性抑制剂选自下列组：
Figure A028159120011C1
6-硝基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
6-氯-8-甲基-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
Figure A028159120011C3
((S)-6-氯-7-(1，1-二甲基乙基)-2-(三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
2-三氟甲基-2H-萘并[2，3-b]吡喃-3-羧酸
6-氯-7-(4-硝基苯氧基)-2-(三氟甲基)-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
((S)-6，8-二氯-2-(三氟甲基)-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
6-氯-2-三氟甲基-4-苯基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
Figure A028159120013C1
6-(4-羟基苯甲酰基)-2-三氟甲基-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
2-三氟甲基-6-[(三氟甲基)硫基]-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸
6，8-二氯-2-三氟甲基-2H-1-苯并噻喃-3-羧酸；
6-(1，1-二甲基乙基)-2-(三氟甲基)-2H-1-苯并噻喃-3-羧酸；
Figure A028159120014C1
6，7-二氟-1，2-二氢-2-(三氟甲基)-3-喹啉羧酸；
Figure A028159120014C2
6-氯-1，2-二氢-1-甲基-2-(三氟甲基)-3-喹啉羧酸；
Figure A028159120014C3
6-氯-2-(三氟甲基)-1，2-二氢-[1，8]二氮杂萘-3-羧酸；
Figure A028159120014C4
((S)-6-氯-1，2-二氢-2-(三氟甲基)-3-喹啉羧酸或其可药用盐；和其任何联合。
9.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是选自下列组的式(III)的化合物：
Figure A028159120015C1
Figure A028159120016C1
或其可药用盐；和其任何联合。
10.权利要求3的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂选自下列组：
和
Figure A028159120016C3
或其可药用盐；和其任何联合。
11.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是：
或其可药用盐。
12.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是：
Figure A028159120017C1
或其可药用盐。
13.权利要求1的方法，其中环氧合酶-2选择性抑制剂是4-[4-(甲基)-磺酰基]苯基]-3-苯基-2(5H)-呋喃酮，或其可药用盐。
14.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是4-[(5-甲基-3-苯基)-4-异噁唑基]苯基磺酰胺，或其可药用盐。
15.权利要求1的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是2-(6-甲基吡啶-3-基)-3-(4-甲基磺酰基苯基)-5-氯吡啶，或可药用盐。
16.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基磺酰胺，或可药用盐。
17.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是4-[(2-甲基-4-环己基)-5-噁唑基]苯基磺酰胺，或可药用盐。
18.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是4-[5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-(二氟甲基)-1H-吡唑-1-基]-苯磺酰胺，或可药用盐。
19.权利要求2的方法，其中所述环氧合酶-2选择性抑制剂是(S)-6，8-二氯-2-(三氟甲基)-2H-1-苯并吡喃-3-羧酸，或可药用盐。
20.权利要求2的方法，其中环氧合酶-2选择性抑制剂是下式的化合物：
Figure A028159120018C1
其中：
X是O或S；
R12b是低级卤烷基；
R3b选自hydrido和卤组成的组；
R13b’选自hydrido、卤、低级烷基、低级卤烷氧基、低级烷氧基、低级芳烷基羰基、低级二烷基氨基磺酰基、低级烷基氨基磺酰基、低级芳烷基氨基磺酰基、低级杂芳烷基氨基磺酰基、5-元含氮杂环磺酰基和6-元含氮杂环磺酰基组成的组；
R13b”选自hydrido、低级烷基、卤、低级烷氧基和芳基组成的组；和
R13b_选自hydrido、卤、低级烷基、低级烷氧基和芳基组成的组；或
其可药用盐。
21.权利要求20的方法，其中：
R12b选自三氟甲基和五氟甲基组成的组；
R13b选自hydrido、氯和氟组成的组；
R13b’选自hydrido、氯、溴、氟、碘、甲基、叔丁基、三氟甲氧基、甲氧基、苄基羰基、二甲基氨基磺酰基、异丙基氨基磺酰基、甲基氨基磺酰基、苄基氨基磺酰基、苯乙基氨基磺酰基、甲基丙基氨基磺酰基、甲基磺酰基和吗啉代磺酰基组成的组；
R13b”选自hydrido、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、氯、甲氧基、二乙氨基和苯基组成的组；和
R13b_选自hydrido、氯、溴、氟、甲基、乙基、叔丁基、甲氧基和苯基组成的组。
22.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R1选自氢、卤、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、羟基、烷氧基、-(CO)R16、-NR13R14、-(CH2)rR16和-C(O)NR8R9组成的组；
R2选自氢、卤、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、-NR13R14、-NR13C(O)R14、-(CO)R15、芳基、杂芳基和-S(O)2NR13R14组成的组；
R3选自氢、卤素、烷基、三卤甲基、羟基、烷氧基、-(CO)R15、-NR13R14、芳基、杂芳基、-NR13S(O)2R14、-S(O)2NR13R14、-NR13C(O)R14和-NR13C(O)OR14组成的组；
R4选自氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基和-NRR13R14组成的组；
R5选自氢、烷基和-C(O)R10组成的组；
R6选自氢、烷基和-C(O)R10组成的组；
R7选自氢、烷基、芳基、3-羧基丙基、杂芳基、-C(O)R17和-C(O)R10组成的组；
R6和R7可结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-和-(CH2)6组成的组中的基团；
R8和R9独立地选自氢、烷基和芳基组成的组；
R10选自羟基、烷氧基、芳氧基、-N(R11)(CH2)nR12和-NR13R14组成的组；
R11选自氢和烷基组成的组；
R12选自-NR13R14、羟基、-(CO)R15、芳基和杂芳基组成的组；
R13和R14独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；
R13和R14可结合形成选自(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)2O(CH2)2-和-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-组成的组中的基团；
R15选自氢、羟基、烷氧基和芳氧基组成的组；
R16选自羟基、-(CO)R15、-NR13R14和-C(O)NR13R14组成的组；
R17选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；且n和r独立地是1、2、3或4；
或其可药用盐。
23.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R6是-COR10，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基；
n是2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和R14独立地是低级烷基。
24.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R6是-COR10，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基；
n是2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和14结合形成选自-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)2-O-(CH2)2-或-(CH2)2N(CH3)(CH2)2-的基团。
25.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，
其中R6是N-(2-二甲基氨基-乙基)氨基羰基、N-(2-二乙基-氨基乙基)-N-甲基氨基羰基、N-(3-二甲基氨基-丙基)氨基羰基、N-(2-二乙氨基乙基)-氨基羰基、N-(2-乙氨基乙基)-氨基羰基、N-(3-乙氨基丙基)氨基羰基或N-(3-二乙基氨基-丙基)氨基羰基。
26.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中R6是N-(2-二乙氨基乙基)-氨基羰基或N-(2-乙氨基乙基)-氨基羰基。
27.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中R6是3-吡咯烷-1-基丙基氨基羰基、3-吗啉-4-基丙基氨基-羰基、2-吡咯烷-1-基乙氨基羰基、2-吗啉-4-基乙氨基羰基、2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基-氨基羰基、2-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)乙基-氨基羰基、3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基氨基-羰基或3-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)丙基氨基-羰基。
28.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中R6是-COR10，其中R10为-NR13R14，其中R13是氢且R14是以羟基、芳基、杂脂环、杂芳基或羧基取代的低级烷基。
29.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中R6是2-三嗪-1-基丙基氨基羰基、2-三嗪-1-基乙氨基羰基、3-咪唑-1-基丙基氨基羰基、吡啶-4-基甲基-氨基羰基、2-吡啶-2-基乙氨基羰基或2-咪唑-1-基乙氨基羰基。
30.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R6是-COR10，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基；
n是2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和R14结合形成杂环。
31.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R6是-COR10，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中：
R11是氢或低级烷基；
n是2或3；和
R12是-NR13R14，其中R13和R14结合形成在环内含羰基和1个或2个氮原子的5、6或7原子杂环。
32.权利要求2的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中R6是2-(3-氧代哌嗪-1-基)乙氨基羰基、2-(咪唑烷-1-基-2-酮)乙氨基羰基、2-(四氢嘧啶-1-基-2-酮)乙氨基羰基、2-(2-氧代吡咯烷-1-基)-乙氨基羰基、3-(3-氧代哌嗪-1-基)丙基-氨基羰基、3-(咪唑烷-1-基-2-酮)丙基-氨基羰基、3-(四氢嘧啶-1-基-2-酮)丙基-氨基羰基或3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基-氨基羰基。
33.权利要求22-32中任何一项的方法，其中蛋白激酶抑制剂是式(I)的化合物，其中：
R5选自氢和低级烷基组成的组；和
R7选自氢、烷基、芳基、杂芳基和-C(O)R17组成的组，其中R17是羟基、低级烷基或芳基。
34.权利要求33的方法，其中：
R1是氢、低级烷基、-C(O)NR8R9、环烷基或芳基；
R2是氢、卤、低级烷氧基、氰基、芳基、-SO2R20或-S(O)2NR13R14，其中R13是氢且R14是氢、芳基或烷基；
R3选自氢、低级烷氧基、-C(O)R15、-NR13C(O)R14、芳基和杂芳基组成的组；和
R4是氢。
35.权利要求34的方法，其中：
R1是氢或苯基；
R2是氢、氯、溴、氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲基氨基磺酰基、氰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、苄基磺酰基、3-氯苯基-氨基磺酰基、羧基、甲氧基、氨基磺酰基、甲基氨基磺酰基、苯基氨基磺酰基、吡啶-3-基-氨基磺酰基、二甲基氨基磺酰基或异丙基氨基磺酰基；
R3是氢、甲氧基、羧基、苯基、吡啶-3-基、3，4-二氯苯基、2-甲氧基-5-异丙基苯基、4-正-丁基苯基、3-异丙基苯基；和
R4是氢。
36.权利要求35的方法，其中：
R1是氢；
R2是氢、氰基、氟、氯或溴；
R3是苯基；和
R4是氢。
37.权利要求2的方法，其中：
R1是氢、低级烷基、-C(O)NR8R9、环烷基或芳基；
R2是氢、卤、低级烷氧基、氰基、芳基或-S(O)2NR13R14，其中R13是氢且R14是氢、芳基或烷基；
R3选自氢、低级烷氧基、-C(O)R15、-NR13C(O)R14、芳基和杂芳基组成的组；和
R4是氢。
38.权利要求2的方法，其中：
R1是氢或甲基；
R2是氢、氰基、氯、氟或溴；
R3选自氢或苯基组成的组；和
R4是氢。
39.权利要求2的方法，其中R6是-COR10，其中R10是-NR13R14，其中R13是氢且R14是以羟基取代的低级烷基、以羟基烷基氨基取代的低级烷基、羧基或-NR18R19，其中R18和R19独立地是氢或低级烷基。
40.权利要求2的方法，其中R6是[2-(二乙氨基)-2-羟基]乙氨基羰基、2-(N-乙基-N-2-羟基乙氨基)-乙氨基羰基、羧甲基氨基羰基或2-羟基乙基-氨基羰基。
41.权利要求2的方法，其中R6是-COR10，其中R10为-NR11(CH2)nR12，其中R12是-N+(O-)NR13R14或-N(OH)R13，其中R13和R14独立地选自低级烷基组成的组：
42.权利要求2的方法，其中R6是2-(N-羟基-N-乙氨基)乙氨基羰基或2-[N+(O-)(C2H5)2]乙基-氨基羰基。
43.权利要求41或42的方法，其中：
R5选自氢或甲基组成的组；和
R7选自甲基、氢或苯基组成的组。
44.权利要求2的方法，其中：
R1是氢；
R2是氢、氰基、氯、氟或溴；
R3是氢；和
R4是氢。
45.权利要求2的方法，其中激酶抑制剂选自下列组：
Figure A028159120025C2
和
或其L-苹果酸盐。
46.权利要求2的方法，其中激酶抑制剂是下式的化合物：
47.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的：
式(I)的蛋白激酶抑制剂：
和下式的环氧合酶-2选择性抑制剂：
Figure A028159120026C2
或其可药用盐。
48.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的：
式(I)的蛋白激酶抑制剂：
与下式的环氧合酶-2选择性抑制剂：
Figure A028159120026C4
或其可药用盐。
49.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的：
式(I)的蛋白激酶抑制剂：
Figure A028159120027C1
与下式的环氧合酶-2选择性抑制剂：
Figure A028159120027C2
或其可药用盐。
50.治疗或预防癌症的方法，包括对需要这种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的：
式(I)的蛋白激酶抑制剂：
与下式的环氧合酶-2选择性抑制剂：
Figure A028159120028C1
或其可药用盐。
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