EA008137B1 - Комбинированная терапия для лечения рака - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака с использованием ингибитора протеинкиназы в комбинации с селективным ингибитором циклооксигеназы-2, где указанный ингибитор протеинкиназы представляет собой 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид или его фармацевтически приемлемую соль, и указанный селективный ингибитор циклооксигеназы-2 представляет собой 4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил]фенилсульфонамид (целекоксиб) или его фармацевтически приемлемую соль.

Description

Настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения неоплазийных расстройств с использованием ингибиторов протеин-тирозинкиназ в комбинации с ингибиторами циклооксигеназ, в частности селективными ингибиторами циклооксигеназы-2.

Уровень техники

Неоплазма, или опухоль, представляет собой аномальную, нерегулируемую и дезорганизованную пролиферацию роста клеток. Неоплазма является злокачественной, или раковой, если она проявляет свойства деструктивного роста, инвазивности и метастазирования. Под инвазивностью подразумевается локальное распространение неоплазмы путем инфильтрации или разрушения окружающей ткани, обычно с прорывом базальных пластинок, которые определяют границы тканей, и из-за этого часто с прониканием в кровеносную систему организма. Под метастазированием обычно подразумевается диссеминация опухолевых клеток по лимфатическим или кровеносным сосудам. Под метастазированием также подразумевается миграция опухолевых клеток путем прямого распространения через серозные полости или субарахноидальные или другие пространства. В процессе метастазирования миграция опухолевых клеток в другие участки организма порождает неоплазмы в областях вдали от места их первоначального возникновения.

В настоящее время рак является второй лидирующей причиной смерти в Соединенных Штатах Америки, и у более 8000000 человек в Соединенных Штатах Америки был диагностирован рак. В 1995 г. рак был причиной 23,3% всех смертей в Соединенных Штатах Америки (см. и.8. Эер1. οί Неа11й апб Нитап 8егу1се§, Ναΐίοηαΐ СеШег ίοτ НеаИй 8ΐαΙίδΙίθ5. Неа11й Ипйеб 81а1е§ 1996-1997 и 1нщгу СйайЬоок 117(1997)).

Рак не вполне осмыслен на молекулярном уровне. Известно, что воздействие канцерогена на клетку, такого как некоторые вирусы, некоторые химические вещества или излучение, приводит к альтерации ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), которая инактивирует супрессивный ген или активирует онкоген. Супрессивные гены представляют собой гены-регуляторы роста, которые после мутации больше не могут контролировать рост клеток. Онкогены представляют собой изначально нормальные гены (называемые проонкогенами), которые в результате мутации или изменения окружения экспрессии становятся трансформирующими генами. Продукты трансформирующих генов вызывают неадекватный рост клеток. Более чем двадцать разных нормальных клеточных генов могут стать онкогенами в результате генетической альтерации. Трансформированные клетки отличаются от нормальных клеток во многих отношениях, включая клеточную морфологию, взаимодействие клетка-клетка, состав мембран, цитоскелетную структуру, секрецию белков, экспрессию генов и смертность (трансформированные клетки могут расти бесконечно).

В настоящее время рак лечат главным образом одним из или комбинацией трех типов терапии: хирургическое вмешательство, облучение и химиотерапия. Хирургическое вмешательство включает удаление всей массы больной ткани. Хотя хирургическое вмешательство иногда эффективно в удалении опухолей, расположенных в определенных местах, например в молочной железе, толстой кишке и коже, его нельзя применять ни в лечении опухолей, расположенных в других областях, таких как позвоночник, ни в лечении диссеминированных неопластических состояний, таких как лейкемия.

Химиотерапия вызывает нарушение репликации клеток или клеточного метаболизма. Ее чаще всего применяют в лечении рака молочной железы, легких и яичников.

Неблагоприятные воздействия системной химиотерапии, применяемой при лечении неопластического заболевания, больше всего пугают пациентов, подвергаемых лечению от рака. Из этих неблагоприятных воздействий наиболее распространенными и тяжелыми побочными воздействиями являются тошнота и рвота. Другие неблагоприятные побочные воздействия включают цитопению, инфекцию, кахексию, мукозит у пациентов, получающих высокие дозы химиотерапии с трансплантацией костного мозга или радиотерапию; алопецию (потерю волос); кожные осложнения (см. М. Ό. АЬе1о0·, е! а1: А1орес1а апб Сн1апеон5 СотрйсаНопк. Р. 755-756. В АЬе1ой; Μ. Ό. Агтйаде, 1. О. ЫсИег, А. 8. апб МебегйиЬег 1. Е. (издатели) С11шса1 Опсо1оду. СйигсЫП ЬМпд^оп, Νονν Уогк, 1992, относительно кожных реакций на химиотерапевтические агенты), такие как зуд, крапивница и ангионевротический отек; неврологические осложнения; легочные и сердечные осложнения у пациентов, получающих облучение или химиотерапию; и репродуктивные и эндокринные осложнения.

Побочные воздействия, вызванные химиотерапией, сильно сказываются на качестве жизни пациента и могут драматически влиять на соблюдение пациентом режима лечения.

Кроме того, неблагоприятным побочным воздействием, связанным с химиотерапевтическими агентами, обычно является большая, ограничивающая дозу токсичность (боке-Нтйшд 1ох1сйу, ΌΕΤ) при введении этих лекарств. Например, мукозит является одним из проявлений большой ограничивающей дозу токсичности для нескольких противораковых агентов, включая антиметаболические цитотоксические агенты 5-БИ (5-фторурацил), метотрексат и противоопухолевые антибиотики, такие как доксорубицин. Многие из этих вызванных химиотерапией побочных воздействий, если они являются тяжелыми, могут привести к госпитализации или требуют лечения анальгетиками для снятия боли.

- 1 008137

Побочные воздействия, вызываемые химиотерапевтическими агентами и радиотерапией, стали проблемой особой важности в организации лечения раковых пациентов.

В настоящее время ученые рассматривают лечение рака путем применения антиангиогенных агентов. Полагают, что ангиогенез является тем механизмом, посредством которого опухоли получают питательные вещества, необходимые для роста и метастазирования в другие части организма. Антиангиогенные агенты вмешиваются в эти процессы и разрушают или сдерживают рост опухоли.

Например, в патенте США 5854205 описан выделенный белок эндостатин, который является ингибитором пролиферации эндотелиальных клеток и ангиогенеза; в патенте США 5843925 описан способ ингибирования ангиогенеза и пролиферации эндотелиальных клеток с использованием 7-[замещенный амин]-9-[(замещенный глициламидо]-6-деметил-6-дезокситетрациклина; в патенте США 5861372 описано применение сборного эндотелиального ингибитора ангиостатина в ингибировании ангиогенеза; в РСТ/СВ97/00650 описано применение производных циннолина для продуцирования антиангиогенного воздействия и/или снижения проницаемости сосудов; ТаиРшд Ω. описывает возможные антиангиогенные терапии (смотри Тгепйз Рйагшасо1. 8ст 16, Νο. 2, 57-66, 1995); Ьойе, Н. е! а1. сообщают, что синергия между антиангиогенным антагонистом интегрина альфа ν и антителоцитокиновым слитым белком уничтожает спонтанные метастазы опухоли (см. Ргос. Να!. Асай. 8ст И8Л, 96 (4), 1591-1596, 1999); С|апшз А. е! а1. описывают антагонисты интегринов и другие низкомолекулярные соединения в качестве ингибиторов ангиогенеза (см. Ν®\ν йгидз ίη сапсег Легару. Апде\\'. СЬеш. Ιη!. ей. Епд1. 36(6), 588-590, 1997); в МО 97/41844 описан способ применения комбинаций ангиостатических соединений для предупреждения и/или лечения неоваскуляризации у пациентов-людей; в МО 98/22101 описан способ применения [пиразол-1-ил]бензолсульфонамидов в качестве антиангиогенных агентов; и в патенте США 5792783 описано применение 3-гетероарил-2-индолинонов, которые являются ингибиторами протеинкиназ и антиангиогенными агентами для лечения различных видов рака.

Недавно появилось сообщение о том, что лечение колоректального рака селективным ингибитором циклооксигеназы-2, конкретно Се1есох|Ь®, в комбинации с ингибитором АКТ-2, конкретно Негсерйп®, является более эффективным, чем если использовать любой из этих агентов по отдельности. Соответственно, существует потребность найти новые комбинации химиотерапевтических агентов, которые, если их использовать вместе, являются более эффективными, чем если их использовать по отдельности. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, при котором млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вводят терапевтически эффективное количество ингибитора протеинкиназы в комбинации с селективным ингибитором циклооксигеназы-2, где указанный ингибитор протеинкиназы представляет собой 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-

или его фармацевтически приемлемую соль, и указанный селективный ингибитор циклооксигеназы-2 представляет собой 4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил]фенилсульфонамид (целекоксиб) формулы

или его фармацевтически приемлемую соль.

Предпочтительно, указанные выше соединения вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей одно или более чем одно указанное выше соединение и фармацевтически приемлемый эксципиент. В частности, терапевтические агенты по данному изобретению могут быть приготовлены в виде отдельных композиций, которые вводят одновременно или в разное время, или терапевтические агенты можно вводить в виде одной композиции.

- 2 008137

Способ по настоящему изобретению пригоден для лечения или предупреждения неоплазийных расстройств, включая акральную лентигинозную меланому, актинический кератоз, аденокарциному, аденокистозную карциному, аденому, аденосаркому, аденосквамозную карциному, астроцитарные опухоли, карциному бартолиновой железы, базально-клеточную карциному, карциномы бронхиальных желез, капиллярные, карциноиды, карциному, карциносаркому, кавернозную, холангиокарциному, хондросаркому, папиллому/карциному хориоидного сплетения, светлоклеточную карциному, цистаденому, эндодермальную опухоль, эндометриальную гиперплазию, эндометриальную стромальную саркому, эндометриоидную аденокарциному, эпендимальную, эпителиоидную, саркому Юинга, фиброламеллярную, очаговую узловую гиперплазию, гастриному, опухоли зародышевых клеток, глиобластому, глюкагоному, гемангиобластому, гемангиоэндотелиому, гемангиому, аденому печени, аденоматоз печени, гепатоцеллюлярную карциному, инсулиному, внутриэпителиальную неоплазию, внутриэпителиальную сквамозноклеточную неоплазию, инвазивную сквамозно-клеточную карциному, крупноклеточную карциному, лейомиосаркому, лентиго злокачественное меланомное, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителиому, меланому, менингеальную, мезотелиальную, метастатическую карциному, мукоэпидермоидную карциному, нейробластому, нейроэпителиальную аденокарциному, узловатую меланому, овсяно-клеточную карциному, олигодендроглиальную, остеосаркому, панкреатическую полипептидную, папиллярную серозную аденокарциному, пинеальноклеточные, гипофизарные опухоли, плазмацитому, псевдосаркому, легочную бластому, почечноклеточную карциному, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозную саркому, мелкоклеточный рак, саркомы мягких тканей, соматостатин-секретирующую опухоль, сквамозную карциному, плоскоклеточный рак, субмезотелиальную, поверхностную меланому, недифференцированную карциному, увеальную меланому, бородавчатый рак, випому, хорошо дифференцированную карциному и опухоль Вильмса.

Способы по настоящему изобретению обладают одним или более преимуществами. Одним из этих преимуществ является то, что композиции, агенты и терапевтические средства по настоящему изобретению вводят в комбинации в низкой дозе, т.е. в дозе, более низкой, чем традиционно используемая в клинических случаях доза каждого индивидуального компонента, который вводят один.

Преимущество от снижения дозы соединений, композиций, агентов и терапевтических средств по настоящему изобретению, вводимых млекопитающему, включает снижение частоты побочных воздействий, связанных с более высокими дозировками. Например, снижение дозировки химиотерапевтического агента, такого как метотрексат, должно приводить к уменьшению частоты и тяжести тошноты и рвоты по сравнению с наблюдаемыми при более высоких дозировках. Аналогичных преимуществ можно ожидать, если ингибитор протеинкиназы по настоящему изобретению использовать в комбинации с ингибитором циклооксигеназы, в частности селективным ингибитором циклооксигеназы-2.

Благодаря снижению частоты побочных воздействий ожидается улучшение качества жизни пациента, подвергающегося лечению от рака. Дополнительные преимущества снижения частоты побочных воздействий включают улучшение соблюдения пациентом режима лечения, снижение количества госпитализаций, необходимых для лечения побочных воздействий, и уменьшение введения анальгетических агентов, необходимых для снятия боли, связанной с побочными воздействиями.

Другим ожидаемым преимуществом является то, что ингибирование опухолей сильнее, когда ингибитор протеинкиназы вводят в комбинации с ингибитором циклооксигеназы, предпочтительно селективным ингибитором циклооксигеназы-2, чем в случае, когда любой из этих агентов вводят один.

Подробное описание изобретения Определения

Фармацевтическая композиция относится к смеси одного или более чем одного соединения, описанного в данной заявке, или их физиологически/фармакологически приемлемых солей или пролекарств с другими химическим компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции - способствовать введению соединения в организм.

Соединения по настоящему изобретению могут также действовать как пролекарства. Пролекарство относится к агенту, который ίη νίνο превращается в родительское лекарственное средство. Пролекарства часто используют, поскольку в некоторых ситуациях их вводить легче, чем родительское лекарственное средство. Например, они могут быть биодоступными при пероральном введении, а родительское лекарственное средство не может. Пролекарство также может иметь улучшенную растворимость в фармацевтических композициях по сравнению с родительским лекарственным средством. Например, без ограничения, пролекарство может представлять собой соединение по настоящему изобретению, которое вводят в виде сложного эфира (пролекарства), чтобы способствовать прохождению через клеточную мембрану, где водорастворимость вредна для подвижности, зато потом это пролекарство метаболически гидролизуется до карбоновой кислоты, активного вещества, внутри клетки, где водорастворимость полезна.

Еще одним примером пролекарства может быть короткий полипептид, например, без ограничения, полипептид из 2-10 аминокислот, связанный через концевую аминогруппу с карбоксильной группой соединения по данному изобретению, причем этот полипептид гидролизуется или метаболизируется ίη νίνο

- 3 008137 с высвобождением активной молекулы. Пролекарства соединения 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы

р.

входят в объем данного изобретения.

Кроме того, предполагается, что соединение 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы может быть метаболизирован ферментами в теле организма, такого как человек, с образованием метаболита, который может модулировать активность протеинкиназ. Такие метаболиты входят в объем данного изобретения.

Используемый здесь термин физиологически/фармацевтически приемлемый носитель относится к носителю или разбавителю, который не вызывает значимого раздражения в организме и не аннулирует биологическую активность и свойства вводимого соединения.

Фармацевтически приемлемый эксципиент относится к инертному веществу, добавляемому в фармацевтическую композицию для дополнительного облегчения введения соединения. Примеры эксципиентов включают, без ограничения, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

Используемый здесь термин фармацевтически приемлемая соль относится к тем солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства родительского соединения. Такие соли включают в себя:

1) соли присоединения кислот, которые получают путем взаимодействия родительского соединения в форме свободного основания с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромоводородная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и перхлорная кислота и тому подобные, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, (Ό) или (Ь) яблочная кислота, малеиновая кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, птолуолсульфоновая кислота, салициловая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота и тому подобные, предпочтительно соляная кислота или (Ь)-яблочная кислота, такие как Ь-малат 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида; или

2) соли, которые образуются, когда кислотный протон, присутствующий в родительском соединении, либо замещается ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочно-земельного металла, либо координируется с органическим основанием. Примерами ионов являются ионы алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка в их обычных валентностях. Предпочтительные органические основания включают протонированные третичные амины и четвертичные аммониевые катионы, включая частично триэтиламин, диэтиламин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, меглюмин (Ν-метилглюкамин) и прокаин.

Способ относится к методам, средствам, приемам и процедурам для осуществления заданной задачи, включая, но не ограничиваясь ими, те методы, средства, приемы и процедуры, которые либо известны, либо легко могут быть разработаны на основе известных методов, средств, приемов и процедур специалистами в химической, фармацевтической, биологической, биохимической и медицинской областях.

Лечить и лечение относятся к любому процессу, действию, применению, терапии или т.п., где млекопитающее, включая человека, является объектом медицинской помощи с целью улучшения его состояния прямо или косвенно. В частности, в отношении рака эти термины означают только то, что ве

- 4 008137 роятная продолжительность жизни индивидуума, пораженного раком, будет увеличена или что один или более чем один симптом этого заболевания будет устранен. Контролировать это можно по отсроченному возникновению первичных или вторичных опухолей, замедлению развития первичных или вторичных опухолей, уменьшению распространения первичных и вторичных опухолей, ослаблению или уменьшению тяжести вторичных воздействий заболевания, замедлению роста опухолей и регрессии опухолей.

Термин предупреждение включает в себя либо предупреждение начала клинически явной неоплазии в целом, либо предупреждение начала предклинически явной стадии неоплазии у субъектов группы риска. Предполагается также, что это определение охватывает предупреждение зарождения злокачественных клеток или приостановление или реверсирование развития презлокачественных клеток в злокачественные клетки. Это включает в себя профилактическое лечение субъектов с риском развития неоплазии.

Предполагается, что выражение терапевтически эффективное определяет количество противоракового агента, которое достигает цели снижения тяжести неопластического заболевания и частоты неопластического заболевания по сравнению с лечением каждым агентом в отдельности с одновременным избежанием нежелательных побочных воздействий, обычно связанных с альтернативными терапиями.

Предполагается, что термины терапевтическое воздействие или терапевтически эффективное количество определяют количество противоракового агента, которое требуется для ослабления до некоторой степени одного или более чем одного симптома неопластического расстройства, включая, но не ограничиваясь ими: 1) уменьшение количества раковых клеток; 2) уменьшение размера опухоли; 3) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановку) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; 3) ингибирование (т.е. замедление до некоторой степени, предпочтительно остановку) метастазирования опухоли; 4) ингибирование до некоторой степени роста опухоли; 5) ослабление или уменьшение до некоторой степени одного или более чем одного симптома, связанного с данным расстройством; и/или 6) ослабление или уменьшение побочных воздействий, связанных с введением противораковых агентов.

Выражение комбинированная терапия (или ко-терапия) включает в себя введение ингибитора протеинкиназы и ингибитора циклооксигеназы-2 в рамках конкретного режима лечения, предназначенного для обеспечения полезного эффекта от совместного действия этих терапевтических агентов. Полезный эффект данной комбинации включает, но не ограничивается ими, фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие комбинации терапевтических агентов. Введение этих терапевтических агентов в комбинации в типичном случае осуществляют за определенный период времени (обычно минуты, часы, сутки или недели в зависимости от выбранной комбинации). В общем случае, предполагается, что комбинированная терапия не охватывает введение двух или более чем двух этих терапевтических агентов в рамках режимов отдельных монотерапий, которое случайно и произвольно приводит к комбинации по настоящему изобретению. Предполагается, что комбинированная терапия охватывает введение этих терапевтических агентов последовательным образом, т. е. каждый терапевтический агент вводят в разное время, а также введение этих терапевтических агентов или по меньшей мере двух терапевтических агентов практически одновременно. В сущности, одновременное введение можно осуществлять, например, путем введения субъекту одной капсулы, имеющей фиксированную пропорцию каждого терапевтического агента, или групп отдельных капсул каждого из этих терапевтических агентов. Последовательное или практически одновременное введение каждого терапевтического агента можно осуществлять любым подходящим путем, включая, но не ограничиваясь ими, пероральные пути, внутривенные пути, внутримышечные пути и прямое всасывание через ткани мембран слизистой. Терапевтические агенты можно вводить одним и тем же путем или разными путями. Например, выбранный первый терапевтический агент данной комбинации можно вводить внутривенной инъекцией, а другие терапевтические агенты данной комбинации можно вводить перорально. Альтернативно, например, оба терапевтических агента можно вводить перорально или оба терапевтических агента можно водить внутривенной инъекцией. Последовательность, в которой терапевтические агенты вводят, не является строго критичной. Комбинированная терапия также может включать в себя введение терапевтических агентов, как описано выше, в комбинации с дополнительными другими биологически активными ингредиентами (например, но без ограничения, вторым и другим противоопухолевым агентом) и нелекарственными видами терапии (например, но без ограничения, хирургическим или радиационным лечением). Когда комбинированная терапия дополнительно включает в себя радиационное лечение, это радиационное лечение можно проводить в любое подходящее время при условии, что достигается полезный эффект от совместного действия комбинации терапевтических агентов и радиационного лечения. Например, в соответствующих случаях полезный эффект по-прежнему достигается, когда радиационное лечение отдалено по времени от введения терапевтических агентов, может быть на сутки или даже недели.

Дополнительная терапия охватывает лечение субъекта агентами, которые уменьшают или позволяют избежать побочных воздействий, связанных с комбинированной терапией по настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, те агенты, которые, например, уменьшают токсическое воздействие противораковых лекарств, например ингибиторы резорбции кости, кардиозащитные агенты; предотвращают или снижают количество случаев тошноты и рвоты, связанных с химиотерапией, радио- 5 008137 терапией или операцией; или снижают количество случаев инфекций, связанных с введением миелосупрессивных противораковых лекарственных средств.

Предпочтительные воплощения

Целекоксиб, используемый в терапевтических комбинациях по настоящему изобретению, можно получить способом, изложенным в патенте США 5466823.

В комбинации по изобретению также включают изомерные формы, пролекарства и таутомеры описанных соединений и их фармацевтически приемлемые соли. В качестве примера, фармацевтически приемлемые соли получают из муравьиной, уксусной, пропионовой, янтарной, гликолевой, глюконовой, молочной, яблочной, винной, лимонной, аскорбиновой, глюкуроновой, малеиновой, фумаровой, пировиноградной, аспарагиновой, глутаминовой, бензойной, антраниловой, мезиловой, стеариновой, салициловой, п-гидроксибензойной, фенилуксусной, миндальной, эмбоновой (памовой), метансульфоновой, этансульфоновой, бензолсульфоновой, пантотеновой, толуолсульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, сульфаниловой, циклогексиламиносульфоновой, альгиновой, бета-гидроксимасляной, галактаровой и галактуроновой кислот.

Полезность

Соединения по настоящему изобретению являются ингибиторами протеинкиназ (РК) и фермента циклооксигеназы, в частности фермента циклооксигеназы-2, и, следовательно, полезны в лечении рака.

РК, каталитическое действие которых модулируется соединением 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы по данному изобретению, включают протеинтирозинкиназы, такие как рецепторные тирозинкиназы (КТК), клеточные тирозинкиназы (СТК), и серин-треониновые киназы (ЗТК). КТК-опосредованная сигнальная трансдукция инициируется внеклеточным взаимодействием со специфическим фактором роста (лигандом) с последующей димеризацией рецепторов, временной стимуляцией активности внутренних протеинтирозинкиназ и фосфорилированием. В результате, для молекул, передающих внутриклеточный сигнал, создаются сайты связывания, и это ведет к образованию комплексов со спектром цитоплазматических сигнальных молекул, что облегчает соответствующие клеточные ответы (например деление клеток, метаболические воздействия на внеклеточное микроокружение и так далее) (ЗсИ1е881пдег апб и11пс11,

1992, Αιιιόπ 9:303-391).

Было показано, что сайты фосфорилирования тирозина на рецепторах факторов роста функционируют как сайты связывания с высокой аффинностью к 8Н2 (зсг гомология) доменам сигнальных молекул (Рап!1 е! а1., 1992, Се11 69: 413-423; Зопдуапд е! а1., Мо1. Се11. Бю1. 14:2777-2785; Зопдуапд е! а1., 1993, Се11 72:767-778 и КосИ е! а1., 1991, Зсзепсе 252:668-678). Было идентифицировано несколько внутриклеточных белков-субстратов, которые связываются с КТК. Их можно разделить на две основные группы: 1) субстраты, которые имеют каталитический домен, и 2) субстраты, у которых отсутствует такой домен, но которые служат адаптерами и связываются с каталитически активными молекулами (Зопдуапд е! а1.,

1993, Се11 72:767-778). Специфичность взаимодействий между рецепторами и 8Н2 доменами их субстратов определяется аминокислотными остатками, непосредственно окружающими фосфорилированный тирозиновый остаток. Различия в аффинности связывания между 8Н2 доменами и аминокислотными последовательностями, окружающими фосфотирозиновые остатки на конкретных рецепторах, согласуются с наблюдаемыми различиями в профилях фосфорилирования их субстратов (Зопдуапд е! а1., 1993, Се11 72:767-778). Эти наблюдения позволяют предполагать, что функция каждой КТК определяется не только характером ее экспрессии и доступностью лиганда, но и порядком путей нисходящей трансдукции сигналов, которая активируется конкретным рецептором. Таким образом, фосфорилирование обеспечивает важную регуляторную стадию, которая определяет селективность сигнальных путей, рекрутированных рецепторами специфических факторов роста, а также рецепторами фактора дифференциации.

ЗТК, будучи главным образом цитозольными, влияют на внутреннюю биохимию клетки, часто по линии ответа на РТК событие. ЗТК участвуют в сигнальных процессах, которые инициируют синтез ДНК и последующий митоз, приводящий к клеточной пролиферации.

Таким образом, РК сигнальная трансдукция приводит, наряду с другими ответами, к клеточной пролиферации, дифференциации, росту и метаболизму. Аномальная клеточная пролиферация может привести к целому ряду расстройств и заболеваний, в том числе к развитию неоплазии, такой как карци

- 6 008137 нома, саркома, глиобластома и гемангиома, расстройствам, таким как лейкемия, псориаз, атеросклероз, артрит и диабетическая ретинопатия, и другим расстройствам, связанным с неконтролируемым ангиогенезом и/или васкулогенезом.

Чтобы применять на практике настоящее изобретение, не требуется точного понимания механизма, посредством которого соединения по данному изобретению ингибируют РК. Однако без привязки к какому-либо конкретному механизму или теории представляется, что соединение 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы взаимодействуют с аминокислотами в каталитической области РК. РК обычно имеют двудольную структуру, где АТР (аденозинтрифосфат), вероятно, связывается в щели между двумя долями в области, где между РК сохраняются аминокислоты. Представляется, что ингибиторы РК связываются посредством не ковалентных взаимодействий, таких как водородное связывание или Ван-дер-Ваальсовы силы, и ионных взаимодействий в одной и той же общей области, где вышеуказанный АТР связывается с РК. Более конкретно предполагается, что 2-индолиноновый компонент соединения 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы связывается в общем пространстве, обычно занятом адениновым кольцом АТР. Специфичность конкретной молекулы к конкретной РК затем может возрасти в результате дополнительных взаимодействий между различными заместителями на 2-индолиноновым ядре и аминокислотными доменами, специфичными к конкретным РК. Таким образом, разные индолиноновые заместители могут внести вклад в предпочтительное связывание с конкретными РК. Возможность выбора соединений, активных в разных сайтах связывания АТР (или другого нуклеотида), позволяют использовать 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид для направленного воздействия на любой белок с таким сайтом. Таким образом, соединение 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы раскрытое в данной заявке, полезно в ίπ νίΐΓο анализах на такие белки, а также как соединение, обладающее ίπ νΐνο терапевтическими воздействиями через взаимодействие с такими белками.

Кроме того, соединение 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид формулы

- 7 008137

Η обеспечивают терапевтический подход к лечению многих видов солидных опухолей, включая, но не ограничиваясь ими, карциномы, саркомы, в том числе саркому Капоши, эритробластому, глиобластому, менингиому, астроцитому, меланому и миобластому. Лечение или предупреждение не солидного опухолевого рака, такого как лейкемия, также входит в объем данного изобретения. Показания могут включать, но не ограничиваться ими, рак мозга, рак мочевого пузыря, рака яичника, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак крови, рак легкого и рак кости.

Дополнительными примерами, без ограничения, типов расстройств, связанных с неадекватной активностью РК, в предупреждении, лечении и исследовании которых могут быть полезны соединения по настоящему изобретению, являются клеточные пролиферативные расстройства, фиброзные расстройства и метаболические расстройства.

Клеточные пролиферативные расстройства, которые можно предупреждать, лечить или дополнительно исследовать согласно настоящему изобретению, включают рак, пролиферативные расстройства кровеносных сосудов и пролиферативные расстройства мезангиальных клеток.

К пролиферативным расстройствам кровеносных сосудов относятся расстройства, связанные с аномальным васкулогенезом (образование кровеносных сосудов) и ангиогенезом (распространение кровеносных сосудов). Хотя васкулогенез и ангиогенез играют важную роль в ряде нормальных физиологических процессов, таких как развитие эмбриона, образование желтого тела, заживление ран и регенерация органов, они также играют центральную роль в развитии рака, где они приводят к образованию новых капилляров, необходимых для сохранения опухоли живой. Другие примеры расстройств пролиферации кровеносных сосудов включают артрит, где новые капиллярные кровеносные сосуды оккупируют сустав и разрушают хрящ, и глазные заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, где новые капилляры в сетчатке вторгаются в стекловидное тело, кровоточат и вызывают слепоту.

Было установлено, что две структурно родственные ВТК связывают УБОР (васкулярный эндотелиальный фактор роста) с высокой аффинностью: Ртз-подобный тирозиновый 1 (й!-1) рецептор (8Н1Ьиуа е! а1., 1990, Опсодепе, 5:519-524; Эе Упез е! а1., 1992, 8с1епсе. 255:989-991) и КОВ/РБК-1 рецептор, также известный как УЕОР-К2. Известно (Реггага и Непхе1, 1989, ВюсНеп. ВюрНуз. Кез. Сотт., 161:851-858; Уа1зтап е! а1., 1990, I. Вю1. СНет., 265:19461-19566), что васкулярный эндотелиальный фактор роста (УЕОР) является специфическим митогеном эндотелиальных клеток с т уйго стимулирующей рост эндотелиальных клеток активностью. Из информации, изложенной в заявках США 08/193829, 08/038596 и 07/975750, строго следует, что УЕОР не только ответственен за пролиферацию клеток эндотелия, но и является первичным регулятором нормального и патологического ангиогенеза (в целом см. К1адзЬигп и 8окег, 1993, Сиггеп! Вю1оду, 3(10) 699-702; Ноиск е! а1., 1992, I. Вю1. СНет., 267:26031-26037).

Нормальный васкулогенез и нормальный ангиогенез играют важную роль в различных физиологических процессах, таких как развитие эмбриона, заживление ран, регенерация органов и женские репродуктивные процессы, такие как развитие фолликул в желтом теле в процессе овуляции и рост плаценты при беременности (Ро1ктап и 8Нтд, 1992, I. Вю1од1са1 СНет., 267(16): 10931-34). Неконтролируемый васкулогенез и/или ангиогенез связан с такими заболеваниями, как диабет, а также со злокачественными солидными опухолями, рост которых зависит от васкуляризации (К1адзЬигп и 8окег, 1993, Сиггеп! Вю1оду, 3(10):699-702; Ро1кНат, 1991, I. Ха!1. Сапсег 1пз!., 82:4-6; \Уе1йпег е! а1., 1991. \е\\ Епд1. I. Мей. 324:1-5).

Предполагаемая роль УЕОР в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции в ходе ангиогенеза и васкулогенеза указывает на важную роль КОК/РБКЛ рецептора в этих процессах. Результатом неконтролируемого васкулогенеза могут быть такие заболевания, как сахарный диабет (Ро1ктап, 198, в Х1!Н Сопдгезз оР ТНготЬоз1з апй Наетоз!аз1з (Уегз!гае!е е! а1., ейз.), рр. 583-596, Беиуеп Итуегзйу Ргезз, Беиуеп) и артрит, а также рост злокачественных опухолей (см., например, Ро1ктап 1971, N. Епд1. I. Мей., 285:1182-186). Рецепторы, с которыми специфически связывается УЕОР, являются важной и мощной терапевтической мишенью для регуляции и модуляции васкулогенеза и/или ангиогенеза и ряда тяжелых заболеваний, в которые вовлечен аномальный клеточный рост, вызванный такими процессами (Р1о\\тап е! а1., 1994, ΏΝ&Ρ, 7(6):334-339). Более конкретно, весьма специфическая роль КОК/РБКЛ рецептора в неоваскуляризации делает его целью выбора терапевтических подходов к лечению рака и других заболеваний, в которые вовлечено неконтролируемое образование кровеносных сосудов.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает использование соединений, способных регулировать и/или модулировать сигнальную трансдукцию тирозинкиназами, включая КОК/РБК-1 рецеп

- 8 008137 торную сигнальную трансдукцию, чтобы ингибировать или прокотировать ангиогенез и/или васкулогенез, т.е. соединения, которые ингибируют, предупреждают или препятствуют сигналу, передаваемому ΚΌΚ/ΕΈΚ-1, при активации лигандами, такими как УЕСР. Хотя считается, что соединения по настоящему изобретению действуют на рецептор или другой компонент по пути тирозинкиназной передачи сигнала, они также могут действовать непосредственно на клетки опухоли, которые являются результатом неконтролируемого ангиогенеза.

Хотя номенклатура человеческой и мышиной копий общего Г1к-1 рецептора различается, они во многих аспектах являются взаимозаменяемыми. Мышиный рецептор, РЬК-1, и его человеческая копия, ΚΌΚ, имеют общую гомологию последовательности 93,4% в пределах внутриклеточного домена. Аналогично, мышиный РЬК-1 связывает человеческий УЕСР с такой же аффинностью, как и мышиный УЕСР, и, соответственно, активируется лигандом, производным от обоих видов (МШаие! е! а1., 1993, Се11, 72:835-846; ^и^ηη е! а1., 1993, Ргос. Ыа11. Асаб. 8οί. И8А, 90:7533-7537). РЬК-1 также связывается с, а затем фосфорилирует по тирозину человеческие ВТК субстраты (например, РЬС-γ (фосфолипаза С гамма) или р85), при совместной экспрессии в 293 клетках (фибробласты почки человеческого эмбриона).

Таким образом, модели, рассчитанные на РЬК-1 рецептор, непосредственно применимы для распознавания КЭВ рецептора. Например, использование мышиного РЬК-1 рецептора в способах идентификации соединений, регулирующих пути сигнальной трансдукции у мышей, непосредственно применимо к идентификации соединений, которые можно использовать для регуляции пути сигнальной трансдукции у человека, т.е. соединений, которые регулируют активность, связанную с КОК рецептором. Так, химические соединения, идентифицированные как ингибиторы КЬК/РЬК-1 ίη νίΐτο, могут быть утверждены в подходящих ίη νίνο моделях. Было показано, что ίη νίνο как мышиная, так и крысиная животные модели имеют исключительное значение для исследования клинического потенциала агентов, действующих на КОВ/РЬК-1-индуцируемый путь сигнальной трансдукции.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает использование соединений, которые регулируют, модулируют и/или ингибируют васкулогенез и/или ангиогенез, воздействуя на ферментативную активность КЭВ/РЬК-1 рецептора и препятствуя сигналу, передаваемому КЭВ/РЬК-1. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен терапевтический подход к лечению многих видов солидных опухолей, включая, но не ограничиваясь ими, глиобластому, меланому и саркому Капоши, и рак яичника, легкого, молочной железы, простаты, поджелудочной железы, прямой кишки и эпидермиса. Кроме того, данные дают основание ожидать, что введение соединений, которые ингибируют КЭВ/РЬК-1-опосредованный путь сигнальной трансдукции, можно применять также в лечении гемангиомы, рестеноза и диабетической ретинопатии.

Кроме того, данное изобретение предусматривает ингибирование васкулогенеза и ангиогенеза другими рецептор-опосредованными путями, в том числе путем, включающим в себя Ы1-1 рецептор.

Сигнальная трансдукция, опосредованная рецепторной тирозинкиназой, инициируется внеклеточным взаимодействием со специфическим фактором роста (лигандом) с последующей димеризацией, временной стимуляцией активности внутренней протеинтирозинкиназы и аутофосфорилированием. В результате этого, для молекул внутриклеточной сигнальной трансдукции создаются сайты связывания, что приводит к образованию комплексов с рядом цитоплазматических сигнальных молекул, которые облегчают соответствующий клеточный ответ, например деление клеток и метаболические воздействия на внеклеточное микроокружение (см. 8сЫеззшдег анб ЬИнсй 1992, Ыеигоп 9:1-20).

Близкая гомология внутриклеточных областей КЭВ/РЬК-1 с областью рецептора РЬСР-β (тромбоцитарный фактор роста β) (гомология 50,3%) и/или родственного рецептора Г11-1 указывает на индуцирование перекрывающихся путей сигнальной трансдукции. Например, для рецептора РЬСР-β было показано, что члены згс семейства (Т\сат1еу е! а1., 1993, Ргос. N311. Асаб. 8сг И8А, 90:7696-7700), фосфатидилинозитол-3'-киназа (Ни е! а1., 1992, Мо1. Се11. ΒίοΙ., 12:981-990), фосфолипаза сγ (КазЫзЫап и Соорег, 1993, Мо1. Се11. Вю1., 4:49-51), газ-СТРаза-активирующий белок (СТР - гуанитрифосфатаза) (КазЫзЫап еГ а1., 1992, ЕМВО 1., 11:1373-1382), РТР-Ш/зур (КаЯапзказ е! а1., 1993, Ргос. Νοίΐ. Асаб. 8с1. И8А. 10 90:6939-6943), СгЬ2 (белок, связывающийся с фактором роста) (АМбззоп е! а1., 1994, Мо1. Се11. Вю1., 14:6715-6726) и адаптерные молекулы 811с и №к (МзЫтига е! а1., 1993, Мо1. Се11. Вю1., 13:6889-6896) связываются с областями, включающими в себя разные сайты аутофосфорилирования (в общем см. С1аеззоп-^е1зй, 1994, Ргод. Сго\\111 Рас!ог Вез., 5:37-54). Так, пути сигнальной трансдукции, активируемые КЭВ/РЬК-1, включают газ путь (Кохак1з е! а1., 1992, №Ыге, 360:689-692), Р1 (фосфатидилинозитол)3'-киназный, згс-опосредованный и р1сγ-опосредованный пути. Каждый из этих путей может играть критическую роль в ангиогенном и/или васкулогенном эффекте КЬК/РЬК-1 в эндотелиальных клетках. Следовательно, органические соединения, описанные здесь, могут применяться для модулирования ангиогенеза и васкулогенеза, так как эти процессы регулируются этими путями.

Расстройства, относящиеся к сморщиванию, сужению или смыканию кровеносных сосудов, такие как рестеноз, также подразумеваются и могут быть подвергнуты лечению или могут быть предотвращены способом по данному изобретению.

Фиброзные расстройства относятся к аномальному образованию внеклеточных матриксов. Примерами фиброзных расстройств являются цирроз печени и пролиферативные расстройства мезангиальных

- 9 008137 клеток. Цирроз печени характеризуется увеличением составляющих внеклеточного матрикса, приводящих к образованию рубцов на печени. Увеличение составляющих внеклеточного матрикса, приводящее к образованию рубцов на печени, также может быть вызвано вирусной инфекцией, такой как гепатит. Представляется, что в циррозе печени важную роль играют липоциты. Другие подразумеваемые фиброзные расстройства включают атеросклероз.

Пролиферативные расстройства мезангиальных клеток относятся к расстройствам, вызываемым аномальной пролиферацией мезангиальных клеток. Мезангиальные пролиферативные расстройства включают различные почечные заболевания человека, такие как гломерулонефрит, диабетическая нефропатия и злокачественный нефросклероз, а также такие расстройства, как тромботические микроангиопатические синдромы, отторжение трансплантата и гломерулопатии. КТК ΡΌΘΡ-К вовлечен в поддержание пролиферации мезангиальных клеток (Поеде е! а1., 1993, К1бпеу 1п1етпа1юпа1 43:478-548).

Многие виды рака представляют собой клеточные пролиферативные расстройства и, как указывалось ранее, РК связаны с клеточными пролиферативными расстройствами. Таким образом, не удивительно, что РК, такие как, например, члены КТК семейства, связаны с развитием рака. Некоторые из этих рецепторов, такие как БОРК (Τυζί е! а1., 1991, Вг. 1. Сапсег 63:227-233, Тогр е! а1., 1992, ΑΡΜΙ8 100:713719), НЕК2 (рецептор человеческого эпидермального фактора роста типа 2 )/пеи (81атоп е! а1., 1989, 8с1епсе 244:707-712) и ΡΌΘΡ-К (рецептор ΡΌΘΡ) (КцтаЬе е! а1., 1992, Опсодепе, 7:627-633) сверхэкспрессируются во многих опухолях и/или постоянно активируются аутокринными петлями. Действительно, при большинстве распространенных и тяжелых видов рака были продемонстрированы эти сверхэкспрессии рецепторов (АкЬакак апб 8ипег-АкЬакак е! а1., 1992, 1. №ито1. 8а 111:119-133, Эюккоп е! а1.,1992, Сапсег Тгеа!теп! Кек. 61:249-273, Когс е! а1., 1992, 1. С1ш. 1пуе§!. 90:1352-1360) и аутокринные петли (Бее аиб Ооподйие, 1992, 1. Се11. Вю1., 118:1057-1070, Когс е! а1., выше, АкЬакак апб 8ипег-АкЬакак е! а1., выше). Например, ЕОРК связан со сквамозно-клеточной карциномой, астроцитомой, глиобластомой, раком в области головы и шеи, раком легкого и раком мочевого пузыря. НЕК2 связан с раком молочной железы, яичника, желудка, легкого, поджелудочной железы и мочевого пузыря. ΡΌΘΡ-К связан с глиобластомой и меланомой, а также раком легкого, яичника и простаты. КТК с-те! также связан с образованием злокачественных опухолей. Например, с-те! связан, наряду с другими видами рака, с колоректальной, тиреоидной, панкреатической, желудочной и гепатоцеллюляной карциномами и лимфомами. Кроме того, сте! также связан с лейкемией. Сверхэкспрессия с-те! гена также обнаружена у пациентов с болезнью Ходжкина и болезнью Беркита.

1ОР-1К (рецептор инсулиноподобного фактора роста-Ι), в дополнение к тому, что он вовлечен в обеспечение питания и диабет типа II, также связан с некоторыми видами рака. Например, ΙΘΡ-Ι задействован как аутокринный стимулятор роста для некоторых видов опухолей, например карциномных клеток рака молочной железы человека (Айеада е! а1., 1989, 1. С1ш. 1пуе§!. 84:1418-1423) и мелких клеток рака легкого (Масаи1еу е! а1., 1990, Сапсег Кек., 50:2511-2517). Кроме того, оказывается, что ΙΘΡ-Ι, полностью вовлеченный нормальный рост и дифференциацию нервной системы, одновременно является также аутокринным стимулятором глиом человека (8апбЬегд-Хогбсрз81 е! а1., 1993, Сапсег Кек. 53:2475-2478). Важность ΙΘΡ-ГК и его лигандов в клеточной пролиферации подтверждается также тем фактом, что рост многих типов клеток в культуре (фибробласты, эпителиальные клетки, клетки гладких мышц, Тлимфоциты, миелоидные клетки, хондроциты и остеобласты (стволовые клетки костного мозга) стимулируется ΙΘΡ-Ι (Оо1бтшд апа Оо1бппд. 1991, Ецкатуобс Оепе Ехртеккюп, 1:301-326). Вакега апб Сорро1а высказывают предположение, что ΙΘΡ-ГК играет центральную роль в механизме трансформации и, как таковые, могут быть предпочтительной мишенью терапевтических вмешательств в широкий спектр злокачественных образований человека (Вакегда, 1995, Сапсег Кек., 55:249-252; Вакегда, 1994, Се11 79:927930; Сорро1а е! а1., 1994, Мо1. Се11. Вю1.. 14:4588-4595).

8ТК вовлечены во многие виды рака, в том числе в частности рак молочной железы (Сапсе е! а1., Ш:. I. Сапсег, 54:571-77 (1993)).

Связь между аномальной активностью РК и заболеванием не ограничена раком. Например, КТК связаны с такими заболеваниями, как псориаз, сахарный диабет, эндометриоз, ангиогенез, развитие атероматозных бляшек, болезнь Альцгеймера, рестеноз, болезнь Гиппеля-Линдау, эпидермальная гиперпролиферация, нейродегенеративные заболевания, возрастная дегенерация желтого пятна и гемангиома. Например, ЕΘΡΚ участвует в заживлении ран роговицы и кожи. Дефекты в инсулин-К и ΙΘΡ-ГК служат признаком сахарного диабета ΙΙ типа. Более полная корреляция между специфическими КТК и их терапевтическими признаками изложена в Б1о^тап е! а1., 1994, ΌΝ&Ρ 7:334-339.

Как отмечалось ранее, не только КТК, но и СТК, включая, но не ограничиваясь ими, кгс, аЬ1, !рк, уек, !уп, 1уп, 1ск, Ь1к, йск, Гдт и угк (обзор Во1еп е! а1., 1992, ΡΑ8ЕВ 1., 6:3403-3409) вовлечены в пролиферативный и метаболический путь сигнальной трансдукции и, таким образом, можно ожидать, и это было показано, что они вовлечены во многие РТК-опосредованные расстройства, на которые направлено настоящее изобретение. Например, было показано, что мутировавший кгс (ν-кгс) является онкопротеином (рр60’^кгс) у цыплят. Более того, его клеточный гомолог, протоонкоген рр60^с-кгс передает онкогенные сигналы многих рецепторов. Сверхэкспрессия ЕΘΡΚ или НЕК-2/пеи в опухолях приводит к конститутивной активации рр60^с-кгс, что характерно для злокачественных клеток, но отсутствует в нормальных клетках. С

- 10 008137 другой стороны, мыши с дефицитом экспрессии с-кгс обладают остеопетрозным фенотипом, что указывает на ключевое участие с-кгс в функционировании остеокластов и возможное его вовлечение в связанные с этим расстройства.

Аналогично, Ζαρ70 вовлечен в Т-клеточную сигнализацию, которая может быть связана с аутоиммунными заболеваниями.

8ТК связаны с воспалением, аутоиммунным заболеванием, иммунореакциями и гиперпролиферативными расстройствами, такими как рестеноз, фиброз, псориаз, остеоартрит и ревматоидный артрит.

РК также вовлечены в имплантацию эмбриона. Поэтому соединения по настоящему изобретению могут обеспечить эффективный способ предупреждения такой имплантации эмбриона и, тем самым, быть полезными в качестве агентов контроля рождаемости. Дополнительными расстройствами, которые можно лечить или предупреждать, используя соединения по данному изобретению, являются иммунологические расстройства, такие как аутоиммунное заболевание, СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) и сердечно-сосудистые расстройства, такие как атеросклероз.

Наконец, в настоящее время существует мнение, что как ВТК, так и СТК вовлечены в гипериммунные расстройства.

Пример воздействия соединения 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид по изобретению на некоторые РТК приведен в табл. 2 ниже.

Ингибитор циклооксигеназы-2, или ингибитор СОХ-2, включает агенты, которые специфически ингибируют один класс ферментов, циклооксигеназу-2, при менее значительном ингибировании циклооксигеназы-1. Предпочтительно, он включает соединения, которые имеют 1С₅₀ (концентрацию, вызывающую 50% ингибирование) циклооксигеназы-2 менее 0,2 мкМ, а также имеют отношение селективности ингибирования циклооксигеназы-2 к ингибированию циклооксигеназы-1 по меньшей мере 50, а более предпочтительно по меньшей мере 100. Еще более предпочтительно эти соединения имеют 1С₅₀ циклооксигеназы-1 более примерно 1 мкМ, а более предпочтительно более 10 мкМ.

Исследования показывают, что простагландины, синтезируемые циклооксигеназами, играют критическую роль в инициировании и активизации рака. Кроме того, СОХ-2 сверхэкспрессируется в неопластических поражениях толстой кишки, молочной железы, легкого, простаты, пищевода, поджелудочной железы, кишечника, шейки, яичников, мочевого пузыря и головы и шеи. В некоторых ίη νίίτο и животных моделях ингибиторы СОХ-2 ингибировали рост опухолей и метастазирование.

Кроме рака как такового, СОХ-2 также экспрессируется в ангиогенной сосудистой сети в пределах и по соседству с гиперпластическими и неопластическими поражениями, что указывает на то, что СОХ-2 участвует в ангиогенезе. И у мыши, и у крысы ингибиторы СОХ-2 значительно ингибировали ЬЕСЕиндуцированную неоваскулярязацию (ЬЕСЕ - основной фактор роста фибробластов). Полезность ингибиторов СОХ-2 в качестве химиопревентивных, антиангиогенных и химиотерапевтических агентов также описана в литературе (Кок1 с1 а1., ΡοΙοηΙίαΙ ι.ιίίΐίίν οί СОХ-2 1пЫЬйог§ ίη сйетορ^еνеηί^οη апб сйстоШсгару. Εχρ. Ορίη. ΙηνοδΙ. Огидк (1999) 8(10) рр. 1623-1638, включен в данное описание изобретения ссылкой). Амплификация и/или сверхэкспресиия ΗΕΒ-2/пси (ЕгЬВ2) происходит в 20-30% случаев рака молочной железы и яичника человека, а также в 5-15% случаев рака желудка и пищевода и ассоциируется с плохим прогнозом. Кроме того, недавно было обнаружено ίη νίίτο, что экспрессия СОХ-2 позитивно регулируется в клетках, сверхэкспрессирующих ΗΕΡ-2/псн онкоген (8иЬЬагата1ай с1 а1., Шсгеакеб ехргекκίοη οί сус1οοxудеηаке-2 ίη НΕΚ-2/ηеи-ονе^еxρ^екктд Ьгеак! саисег. Самсет Векеагсй (представлено в 1999), включено в данное описание изобретения ссылкой). В этом исследовании существенно повышенные уровни продукции ΡΟΕ₂ (простагландина Е₂), СОХ-2 белка и тРНК определяли в ΗΕΡ-2/ικιι трансформированных эпителиальных клетках млекопитающих по сравнению с нетрансформированной партнерской клеточной линией. Продукты активности СОХ-2, т.е. простагландины, стимулируют пролиферацию, увеличивают инвазивность злокачественных клеток и усиливают продукцию васкулярного эндотелиального ростового фактора, который стимулирует ангиогенез. Кроме того, ΗΕΡ-2/ικιι индуцирует продукцию ангиогенных факторов, таких как васкулярный эндотелиальный ростовой фактор.

Следовательно, введение ингибитора СОХ-2 в комбинации с антиНΕΒ-2/ηеи антителами, такими как трастузумаб (Негсер1ш®) и другими терапевтическими средствами, направленными на ингибирование ΗΕΡ-2/ικιι. предполагается для лечения рака, в котором сверхэкспресируется ΗΕΡ-2/ικιι.

Предполагается также, что уровни СОХ-2 повышаются в опухолях с амплификацией и/или сверхэкспрессией других онкогенов, включая, но не ограничиваясь ими, с-тус, Ν-тус, Ь-тус, К-гак, Н-гак, Νгак. Продукты активности СОХ-2 стимулируют клеточную пролиферацию, ингибируют иммунный контроль, увеличивают инвазивность злокачественных клеток и стимулируют ангиогенез. Следовательно, введение ингибитора протеинкиназы в комбинации с ингибитором СОХ-2 по настоящему изобретению полезно для предупреждения или лечения рака, в котором сверхэкспрессируются онкогены.

Специфические ингибиторы СОХ-2 полезны для лечения рака (\УО 98/16227) и в некоторых животных моделях уменьшают ангиогенез, управляемый различными факторами роста (\УО 98/22101). Антиангиогенез был достигнут с использованием ингибитора СОХ-2 у крыс с имплантированным ЬЕОЕ, васкулярного эндотелиального фактора роста (ΥΕΟΕ) или каррагенана, белков с общеизвестными ангиоген

- 11 008137 ными свойствами (МакГетгег с1 а1., 89^4Ь Аппиа1 Меейпд о£ 111е Лшспеап ΛδδοοίαΙίοη £ог 111е Сапсег Кекеагсй, Магсй 1998).

Фармацевтическая композиция и введение

Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить пациенту-человеку само по себе или в фармацевтической композиции, в которой вышеупомянутые вещества смешаны с подходящими носителями или эксципиентом(ами). Методики приготовления препаратов и введения лекарственных средств можно найти в Кетшд1оп'8 Рйагтасо1од1са1 8с1епсе5, Маск РиЫЦЫпд Со., Еайоп, РА., последнее издание.

Используемые здесь термины вводят или введение относятся к доставке соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, или фармацевтически композиции, содержащей соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, в организм с целью предупреждения или лечения РК-связанного расстройства.

Подходящие пути введения могут включать, без ограничения, пероральное, ректальное, местное, трансмукозальное или кишечное введение или внутримышечные, подкожные, внутримозговые, внутритрахеальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, в стекловидное тело, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Предпочтительными путями введения являются пероральный и парентеральный.

Альтернативно, соединение можно вводить местным, а не системным путем, например инъекцией соединения непосредственно в солидную опухоль, часто в виде депо или препарата с замедленным высвобождением.

Кроме того, лекарственное средство можно вводить в нацеленной на мишень системе доставки лекарственного средства, например в липосомах, покрытых специфичным к опухоли антителом. Липосомы будут нацелены на опухоль и селективно захвачены ею.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены способами, общеизвестными в данной области техники, например традиционными способами смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения или лиофилизации.

Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением можно приготовить традиционным способом, используя один или более чем один физиологически приемлемый носитель, включая эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые можно применять фармацевтически. Подходящий препарат зависит от выбранного пути введения.

Для инъецирования соединения по изобретению могут быть приготовлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для трансмукозального введения в препарате используют подходящие пенетранты - вещества, улучшающие проникание через барьер. Такие пенетранты известны в данной области техники.

Для перорального введения препарат соединения может быть приготовлен путем объединения активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, общеизвестными в данной области техники. Такие носители дают возможность изготовлять препарат соединения по данному изобретению в форме таблеток, пилюль, леденцов, драже, капсул, жидкостей, сиропов, взвесей, суспензий и тому подобного для перорального приема пациентами. Фармацевтические препараты для перорального применения можно приготовить, используя твердый эксципиент, возможно измельчая полученную смесь и обрабатывая смесь гранул после добавления других подходящих вспомогательных веществ, если это требуется, с получением таблеток или ядер драже. Пригодными эксципиентами являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит, препараты целлюлозы, такие как, например, маисовый крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал и картофельный крахмал, и другие вещества, такие как желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон (РУР). Если требуется, можно добавлять разрыхляющие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота. Также можно добавлять соль, такую как альгинат натрия.

Ядра драже снабжают подходящими оболочками. Для этой цели можно использовать концентрированные растворы сахара, которые возможно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В таблетки или оболочки драже можно добавлять красители или пигменты для идентификации или чтобы отличать разные комбинации доз активных компонентов.

Фармацевтические композиции, которые можно применять перорально, включают вставные капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, герметичные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Вставные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающим веществом, таким как крахмал, и/или смазывающим веществом, таким как тальк или стеарат магния, и, возможно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях,

- 12 008137 таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. В эти препараты также можно добавлять стабилизаторы.

Капсулы могут быть упакованы в сосуды из коричневого стекла или пластика для защиты активного соединения от света. Контейнеры, содержащие капсульный препарат активного соединения, необходимо хранить при контролируемой комнатной температуре (15-30°С).

Для введения ингаляцией соединения для использования по настоящему изобретению удобно доставлять в форме аэрозольного спрея, используя упаковки под давлением или распылитель и подходящий пропеллент, например, без ограничения, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан или диоксид углерода. В случае аэрозоля под давлением дозировочную единицу можно регулировать при помощи клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например желатиновые, для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут содержать порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Данные соединения могут быть приготовлены также в виде препарата для парентерального введения, например болюсной инъекцией или длительной инфузией. Препараты для инъекции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных разбавителях, и могут содержать препаратообразующие вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы водорастворимой формы, такой как, без ограничения, соль активного соединения. Кроме того, могут быть приготовлены суспензии активных соединений в липофильном носителе. Подходящие липофильные носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, сложные эфиры синтетических жирных кислот, такие как этилолеат и триглицериды, или такие вещества, как липосомы. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит или декстран. Суспензия возможно может содержать также подходящие стабилизаторы и/или агенты, которые увеличивают растворимость соединений, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.

Альтернативно, активный ингредиент может быть в порошковой форме для разведения перед использованием подходящим разбавителем, например стерильной, апирогенной водой.

Соединения также могут быть приготовлены в виде ректальных композиций, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием, например, стандартных суппозиторных основ, таких как масло какао или другие глицериды.

Кроме препаратов, описанных ранее, соединения могут быть приготовлены также в виде депопрепаратов. Такие длительно действующие препараты можно вводить имплантацией (например подкожной или внутримышечной) или внутримышечной инъекцией. Препарат соединения по данному изобретению можно приготовить для этого пути введения с использованием подходящих полимерных или гидрофобных веществ (например в эмульсии с фармакологически приемлемым маслом), с ионообменными смолами или в виде трудно растворимого производного, такого как, без ограничения, трудно растворимая соль.

Не ограничивающим примером фармацевтического носителя для гидрофобных соединений по изобретению является система со-растворителей, содержащая бензиловый спирт, неполярное поверхностноактивное вещество, смешиваемый с водой органический полимер и водную фазу, такая как система сорастворителей νΡΌ. ΥΡΌ представляет собой раствор 3% мас./об. бензилового спирта, 8% мас./об. неполярного поверхностно-активного вещества Ро1у5ОгЬа1с 80 и 65% мас./об. полиэтиленгликоля 300, доведенный до нужного объема абсолютным этанолом. Система сорастворителей νΡΌ (νΡΌ:Ό5^) состоит из νΡΌ, разбавленного 1:1 5% раствором декстрозы в воде. Эта система сорастворителей хорошо растворяет гидрофобные соединения, и сама имеет низкую токсичность при систематическом введении. Естественно, соотношения сорастворителей в такой системе могут существенно меняться с сохранением ее свойств растворимости и токсичности. К тому же, индивидуальные компоненты системы сорастворителей можно варьировать: например, другие низкотоксичные неполярные поверхностноактивные вещества можно использовать вместо ΡοΚδοΛαΙο 80, можно варьировать фракционный размер полиэтиленгликоля, полиэтиленгликоль можно заменить другими биосовместимыми полимерами, например поливинилпирролидоном, а декстрозу можно заменить другими сахарами или полисахаридами.

Альтернативно, можно использовать другие системы доставки гидрофобных фармацевтических соединений. Липосомы и эмульсии являются общеизвестными примерами средств доставки или носителей для гидрофобных лекарственных средств. Кроме того, можно использовать некоторые органические растворители, такие как диметилсульфоксид, хотя часто ценой большей токсичности.

Кроме того, соединения можно доставлять, используя систему пролонгированного высвобождения, такую как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие терапевтический агент. Были разработаны различные материалы, обеспечивающие пролонгированное высвобождение, и они общеизвестны специалистам в данной области техники.

Капсулы пролонгированного высвобождения в зависимости от их химической природы могут вы

- 13 008137 свобождать соединения в течение времени от нескольких недель до более 100 суток. В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического реагента можно использовать дополнительные методики для стабилизации белка.

Фармацевтические композиции могут содержать также подходящие твердофазные и гель-фазные носители и эксципиенты. Примеры таких носителей и эксципиентов включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Многие из РК модулирующих соединений по изобретению могут быть предоставлены в виде физиологически приемлемых солей, где заявленное соединение может образовывать отрицательно или положительно заряженные частицы. Примерами солей, в которых соединение может образовывать положительно заряженную группировку, включают, без ограничения, четвертичный аммоний (определенный в другом месте в данном описании изобретения), соли, такие как гидрохлорид, сульфат, карбонат, лактат, тартрат, малат, малеат, сукцинат, где атом азота четвертичной аммониевой группы представляет собой азот выбранного соединения по данному изобретению, который прореагировал с соответствующей кислотой. Соли, в которых соединение по данному изобретению образует отрицательно заряженные частицы, включают, без ограничения, натриевые, калиевые, кальциевые и магниевые соли, образованные путем взаимодействия карбоксильной кислотной группы соединения с соответствующим основанием (например гидроксидом натрия (ΝαΟΗ), гидроксидом калия (КОН), гидроксидом кальция (Са(ОН)₂ и т.д.).

Фармацевтические композиции, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, достаточном для достижения намеченной цели, например модулирования активности РК или лечения или предупреждения связанного с РК расстройства.

Более конкретно, терапевтически эффективное количество означает количество соединения, эффективное для предупреждения, ослабления или улучшения симптомов заболевания или продления жизни субъекта, которого лечат.

Определение терапевтически эффективного количества находится в рамках компетентности специалистов в данной области техники, в частности в свете подробного описания, представленного в данной заявке.

Для любого соединения, используемого в способах по данному изобретению, терапевтически эффективное количество или дозу можно оценить первоначально из анализов клеточных культур. Затем эту дозу можно приготовить в виде препарата для использования в животной модели так, чтобы достичь интервала циркулирующей в системе кровообращения концентрации, которое включает 1С₅₀, как она определена в клеточной культуре (т. е. концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается половина от максимального ингибирования активности РК). Эту информацию затем можно использовать для более точного определения доз, пригодных для человека.

Токсичность и терапевтическую эффективность соединений, описанных в заявке, можно определить по стандартным фармацевтическим методикам в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например путем определения 1С₅₀ и ЬП₅₀ (ЬП₅₀ - доза, при которой летальность составляет 50%) (обе из которых обсуждаются в другом месте данного описания изобретения) подвергнутого испытанию соединения. Данные, полученные из этих анализов клеточных культур и исследований на животных, можно использовать для определения интервала дозировки для применения у людей. Дозировка может меняться в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозировку может выбрать лечащий врач с учетом состояния пациента (см., например, Пп§1 с1 а1., 1975 в ТИе Рйаттасо1одюа1 Ва818 о£ ТйегареиНсз, СИ. 1, р. 1).

Дозировочное количество и интервал можно регулировать индивидуально для обеспечения уровня активных компонентов в плазме, который достаточен для поддержания модулирующих эффектов в отношении киназ. Этот уровень в плазме называется минимальной эффективной концентрацией (МЕС). МЕС будет различаться для каждого соединения, но ее можно оценить, основываясь на ίπ νίίτο данных, например концентрация, необходимая для достижения 50-90% ингибирования киназы, может быть установлена с использованием анализов, описанных в данной заявке. Дозировки, необходимые для достижения МЕС будут зависеть от индивидуальных особенностей и пути введения. Для определения концентрации в плазме можно использовать ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) анализы или биоанализы.

Интервалы дозировок также можно определить, используя значения МЕС. Соединения следует вводить, используя схему, которая обеспечивает поддержание уровней в плазме выше МЕС в течение 1090% времени, предпочтительно 30-90% и наиболее предпочтительно 50-90%.

На данный момент терапевтически эффективное количество 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида может находиться в пределах от приблизительно 0,25 до 1500 мг/мл² в сутки; предпочтительно около 3 мг/м² в сутки. Еще более предпочтительно от 50 мг/каждое утро ежедневно до 400 мг/ежедневно.

Терапевтически эффективное количество ингибитора циклооксигеназы составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10000 мг для лечения указанных выше состояний, с предпочтительными

- 14 008137 уровнями от приблизительно 1,0 до приблизительно 1000 мг.

Количество активного ингредиента, которое можно объединять с другими противораковыми агентами для получения единичной лекарственной формы, будет подбираться в зависимости от подвергаемого лечению хозяина и конкретного способа введения.

В случаях местного введения или селективного захвата эффективную местную концентрацию лекарственного средства можно не связывать с концентрацией в плазме, и для определения точного количества дозировки и интервала можно использовать другие способы, известные в данной области техники.

Разумеется, количество вводимого соединения будет зависеть от субъекта, которого лечат, тяжести болезни, способа введения, мнения лечащего врача и т.д.

Композиция может, если требуется, быть представлена в упаковке или дозирующем устройстве, например в наборе, одобренном ΡΌΆ (Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США)), который может содержать одну или более чем одну стандартную лекарственную форму, содержащую активный ингредиент. Например, упаковка может содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство может сопровождаться инструкциями по введению. Упаковка или дозирующее устройство может также сопровождаться извещением, объединенным с контейнером, в форме, предписанной правительственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств, которое отражает одобрение этим органом формы данной композиции или ее введения человеку или животному. Такое извещение может представлять собой, например, этикетку, одобренную ΡΌΑ для предписываемого лекарственного средства, или одобренный вкладыш. Также можно изготавливать композиции, содержащие соединение по изобретению, в совместимом фармацевтическом носителе, поместить их в подходящий контейнер и маркировать для лечения указанного состояния. Подходящие состояния, указанные на маркировке, могут включать лечение опухоли, ингибирование ангиогенеза, лечение фиброза, диабета и т.п.

Соединение, описанное в данной заявке, или его соль или пролекарство можно объединять с другими химиотерапевтическими агентами для лечения заболеваний или расстройств, описанных выше. Например, соединение, соль или пролекарство по данному изобретению можно объединять с алкилирующими агентами, такими как фторурацил (5-РИ), один или дополнительно в комбинации с лейковорином; или другими алкилирующими агентами, такими как, без ограничения, другие пиримидиновые аналоги, например ИРТ, капецитабин, гемцитабин и цитарабин, алкилсульфонаты, например бусульфан (используемый в лечении хронической гранулоцитарной лейкемии), импросульфан и пипосульфан; азиридины, например бензодепа, карбоквион, метуредепа и уредепа; этиленимины и метилмеламины, например алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; и азотистые аналоги иприта, например хлорамбуцил (применяемый в лечении хронической лимфоцитарной лейкемии, первичной макроглобулинемии и неходжкинской лимфомы), циклофосфамид (применяемый в лечении болезни Ходжкина, множественной миеломы, нейробластомы, рака молочной железы, рака яичника, рака легкого, опухоли Вильмса и рабдомиосаркомы), эстрамустин, ифосфамид, новембрицин, преднимустин и урациловый аналог иприта (используемый при лечении первичного тромбоцитоза, неходжкинской лимфомы, болезни Ходжкина и рака яичников); и триазины, например дакарбазин (применяемый при лечении саркомы мягких тканей).

Соединение, соль или пролекарство по данному изобретению можно применять также в комбинации с другими антиметаболическими химиотерапевтическими агентами, такими как, без ограничения, аналоги фолиевой кислоты, например метотрексат (применяемый в лечении острой лимфоцитарной лейкемии, хориокарциномы, фунгоидной гранулемы, рака молочной железы, рака в области головы и шеи и остеогенной саркомы) и птероптерин; и пуриновые аналоги, такие как меркаптопурин и тиогуанин, которые находят применение в лечении острой гранулоцитарной, острой лимфацитарной и хронической гранулоцитарной лейкемий.

Предполагается, что соединение, соль или пролекарство по данному изобретению также можно применять в комбинации с химиотерапевтическими агентами на основе природных продуктов, такими как, без ограничения, винка-алкалоиды, например винбластин (применяемый в лечении рака молочной железы или яичка), винкристин и виндезин; эпиподофилотоксины, например этопозид и тенипозид, которые оба используют в лечении рака яичка и саркомы Капоши; антибиотические химиотерапевтические агенты, например даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, митомицин (применяемые в лечении рака желудка, шейки, прямой кишки, молочной железы, мочевого пузыря и поджелудочной железы), дактиномицин, темизоломид, пликамицин, блеомицин (применяемые в лечении рака кожи, пищевода и мочеполового тракта); и энзиматические химиотерапевтические агенты, такие как Ь-аспарагиназа.

В дополнение к перечисленному выше соединение, соль или пролекарство по данному изобретению можно применять также в комбинации с координационными комплексами платины (цисплатин и т.д.); замещенными мочевинами, такими как гидроксимочевина; производными метилгидразина, например прокарбазином; аденокортикоидными супрессивными средствами, например митотаном, аминоглутетимидом; гормоном и антагонистами гормона, такими как адренокортикостероиды (например, преднизон), прогестины (например, гидроксипрогестерона капроат); эстрогенами (например, диэтилстилбестеролом);

- 15 008137 антиэстрогенами, такими как тамоксифен; андрогенами, например тестостерона пропионатом; и ингибиторами ароматазы, такими как анастрозол.

Другие противораковые агенты, известные в данной области техники, можно применять параллельно с комбинированной терапией по настоящему изобретению. Примеры этих и других антинеопластических агентов приведены в заявке на патент США 60/113786, поданной 23 декабря 1998 г., и в международной публикации РСТ МО 00/38716, описание которых включено в данное описание изобретения ссылкой.

Наконец, предполагается также, что комбинация соединения по данному изобретению будет эффективной в комбинации с митоксантроном или паклитакселем для лечения солидноопухолевого рака или лейкемий, таких как, без ограничения, острая миелогенная (нелимфоцитарная) лейкемия.

Примеры

Следующие ниже подготовительные примеры и примеры приведены, чтобы дать возможность специалистам в данной области техники более ясно понять настоящее изобретение и применять его на практике. Они должны рассматриваться не как ограничивающие объем изобретения, а только как иллюстративные и типичные.

Синтез ингибитора протеинкиназ по настоящему изобретению

Общая методика синтеза

Следующую общую методологию можно использовать для получения соединений по данному изобретению.

Соответственно замещенный 2-оксиндол (1 эквивалент), соответственно замещенный альдегид (1,2 эквивалента) и основание (0,1 эквивалент) смешивают в растворителе (1-2 мл/ммоль 2-оксиндола), и эту смесь затем нагревают в течение от 2 до приблизительно 12 ч. После охлаждения отфильтровывают образовавшийся осадок, промывают его холодным этанолом или эфиром и сушат вакуумом с получением твердого продукта. Если осадок не образуется, реакционную смесь концентрируют, и остаток растирают со смесью дихлорметан/эфир, полученное в результате твердое вещество собирают фильтрацией и затем сушат. Продукт возможно очищают хроматографией.

Основание может представлять собой органическое или неорганическое основание. Если используют органическое основание, оно предпочтительно представляет собой азотистое основание. Примеры органических азотистых оснований включают, но не ограничиваются ими, диизопропиламин, триметиламин, триэтиламин, анилин, пиридин, 1,8-диазабицикло[5.4.1]ундец-7-ен, пирролидин и пиперидин.

Примерами неорганических оснований являются, без ограничения, гидроксиды аммония, щелочных металлов или щелочно-земельных металлов, фосфаты, карбонаты, бикарбонаты, бисульфаты и амиды. Щелочные металлы включают литий, натрий и калий, а щелочно-земельные земли включают кальций, магний и барий.

В предпочтительном на данный момент воплощении данного изобретения, если растворитель является протонным растворителем, таким как вода или спирт, то основание представляет собой неорганическое основание щелочного металла или щелочно-земельного металла, предпочтительно гидроксид щелочного или щелочно-земельного металла.

Специалистам в данной области техники должно быть ясно, на основе известных общих принципов органического синтеза и на основе описаний данного изобретения, какое основание будет наиболее подходящим для предполагаемого взаимодействия.

Растворитель, в котором проводят взаимодействие, может быть протонным или апротонным, предпочтительно он является протонным растворителем. Протонный растворитель - это растворитель, который имеет атом(ы) водорода, ковалентно связанный(е) с атомами кислорода или азота, что делает атомы водорода существенно кислотными и, соответственно, способными быть общими с растворенным веществом благодаря образованию водородных связей. Примеры протонных растворителей включают, без ограничения, воду и спирты.

Апротонный растворитель может быть полярным или неполярным, но в любом случае он не содержит кислотных атомов водорода и, следовательно, не способен образовывать водородные связи с растворенными веществами. Примерами неполярных апротонных растворителей являются, без ограничения, пентан, гексан, бензол, толуол, метиленхлорид и четыреххлористый углерод. Примерами полярных апротонных растворителей являются хлороформ, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид и диметилформамид.

В предпочтительном на данный момент воплощении данного изобретения растворитель представляет собой протонный растворитель, предпочтительно воду или спирт, такой как этанол.

Взаимодействие осуществляют при температуре выше комнатной температуры. Температура в общем случае составляет от примерно 30 до примерно 150°С, предпочтительно от примерно 80 до примерно 100°С, наиболее предпочтительно от примерно 75 до примерно 85°С, что является примерно точкой кипения этанола. Под примерно подразумевается, что интервал температур предпочтительно находится в пределах 10°С от указанной температуры, более предпочтительно в интервале 5°С от указанной температуры и наиболее предпочтительно в пределах 2°С от указанной температуры. Так, например, под примерно 75°С подразумевается 75±10°С, предпочтительно 75±5°С и наиболее предпочтительно

- 16 008137

75±2°С.

2-Оксиндолы и альдегиды легко можно синтезировать, используя методики, общеизвестные в химической области. Специалистам в данной области техники должно быть ясно, что для образования соединений по данному изобретению доступны другие пути синтеза, и что нижеследующее предложено в качестве примера, а не ограничения.

Способ А: Формилирование пирролов

РОС1₃ (1,1 эквивалент) добавляют по каплям к диметилформамиду (3 эквивалента) при -10°С, затем добавляют соответствующий пиррол, растворенный в диметилформамиде. После перемешивания в течение двух часов реакционную смесь разбавляют Н₂О и подщелачивают до рН 11 10 н КОН. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией, промывают Н₂О и сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением целевого альдегида.

Способ Б: Омыление эфиров пирролкарбоновой кислоты

Смесь эфира пирролкарбоновой кислоты и КОН (2-4 эквивалента) в Е1ОН кипятят с обратным холодильником до тех пор, пока тонкослойная хроматография (ТХС) не укажет на окончание реакции. Охлажденную реакционную смесь подкисляют 1 н. НС1 до рН 3. Образовавшийся осадок собирают фильтрацией, промывают Н₂О и сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением целевой пирролкарбоновой кислоты.

Способ В: Амидирование

К перемешиваемому раствору пирролкарбоновой кислоты, растворенной в диметилформамиде (0,3 М), добавляют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (1,2 эквивалента), 1гидроксибензотриазол (1,2 эквивалента) и триэтиламин (2 эквивалента). Добавляют соответствующий амин (1 эквивалент), и эту реакционную смесь перемешивают до тех пор, пока ТХС не укажет на окончание реакции. Затем к реакционной смеси добавляют этилацетат и раствор промывают насыщенным ЫаНСО₃ и рассолом (с солью высшего качества), сушат над безводным Мд§О₄ и концентрируют с получением целевого амида.

Способ Г: Конденсация альдегидов и оксиндолов, содержащих карбоновокислотные заместители

Смесь оксиндола (1 эквивалент), 1 эквивалента альдегида и 1-3 эквивалентов пиперидина (или пирролидина) в этаноле (0,4 М) перемешивают при 90-100°С до тех пор, пока ТХС не укажет на окончание реакции. Смесь затем концентрируют, и остаток подкисляют 2 н. НС1. Образовавшийся осадок промывают Н₂О и Е1ОН и затем сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением продукта.

Способ Д: Конденсация альдегидов и оксиндолов, не содержащих карбоновокислотных заместителей

Смесь оксиндола (1 эквивалент), 1 эквивалента альдегида и 1-3 эквивалента пиперидина (или пирролидина) в этаноле (0,4 М) перемешивают при 90-100°С до тех пор, пока ТХС не укажет на окончание реакции. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и образовавшееся твердое вещество собирают вакуумной фильтрацией, промывают этанолом и сушат с получением продукта. Если при охлаждении реакционной смеси осадок не образуется, эту смесь концентрируют и очищают колоночной хроматографией.

Синтез 2-оксииндолов

5-фтор-2-оксиндол

5-Фторизатин (8,2 г) растворяли в 50 мл гидразина гидрата и кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Реакционную смесь затем вливали в воду. Осадок затем отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакуумной сушилке с получением указанного в заголовке соединения.

Синтез пиррол-замещенных 2-индолинонов

Пример 80.

5-(5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламино-этил)амид

5-Фтор-1,3-дигидроиндол-2-он (0,54 г, 3,8 ммоль) конденсировали с 5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амидом с получением 0,83 мг (55%) указанного в заголовке соединения в виде желто-зеленого твердого вещества.

Ή ЯМР (300 МГц, ДМСО-а₆ ) δ 13,66 (8, 1Н, ЦН), 10,83 (8, Ьг, 1Н, НН), 7,73 (аа, 1=2,5 и 9,4 Гц, 1Н), 7,69 (8, 1Н, Н-винил), 7,37 (ΐ, 1Н, СОЦНСН₂СН₂), 6,91 (т, 1Н), 6,81-6,85 (т, 1Н), 3,27 (т, 2Н, СН₂), 2,51 (т, 6Н, 3хСН₂), 2,43 (8, 3Н, СН₃), 2,41 (8, 3Н, СН₃), 0,96 (ΐ, 1=6,9 Гц, 6Н, Ц(СН₂ СН₃)₂).

МС-ЭУ т/ζ 398 [М⁺].

Пример 80 (Альтернативный синтез)

5-[5-Фтор-2-оксо-1,2-дигидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-метил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид

Гидразина гидрат (55%, 3000 мл) и 5-фторизатин (300 г) нагревали до 100°С. Порциями (100 г) добавляли дополнительное количество 5-фторизатина (500 г) за 120 мин при перемешивании. Смесь нагревали до 110°С и перемешивали в течение 4 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, и твердые вещества собирали вакуумной фильтрацией с получением сырого (2-амино-5-фторфенил)уксусной ки

- 17 008137 слоты гидразида (748 г). Гидразид суспендировали в воде (700 мл), и рН смеси доводили 12 н соляной кислотой до значения рН менее 3. Смесь перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре. Твердые вещества собирали вакуумной фильтрацией и дважды промывали водой. Продукт сушили под вакуумом с получением 5-фтор-1,3-дигидроиндол-2-она (600 г, выход 73%) в виде коричневого порошка. ¹Н ЯМР (диметилсульфоксид-й₆) δ 3,46 (8, 2Н, СН₂), 6,75, 6,95, 7,05 (3 х т, 3Н, ароматический), 10,35 (8, 1Н, ΝΗ). МС т/ζ 152 [М+1].

3,5-Диметил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты 2-трет-бутиловый эфир 4-этиловый эфир (2600 г) и этанол (7800 мл) интенсивно перемешивали, одновременно медленно добавляя 10 н соляную кислоту (3650 мл). Температура повышалась с 25 до 35°С, и начиналось газовыделение. Смесь нагревали до 54°С и перемешивали при дальнейшем нагревании в течение одного часа, при этом температура была 67°С. Смесь охлаждали до 5°С и при перемешивании медленно добавляли 32 л льда и воды. Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали три раза водой. Твердое вещество сушили воздухом до постоянной массы с получением 2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты этилового эфира (1418 г, выход 87%) в виде розоватого твердого вещества. 'Н ЯМР (диметилсульфоксид-й₆) δ 2,10, 2,35 (2x8, 2х3Н, 2хСН₃), 4,13 (φ 2Н, СН₂), 6,37 (8, 1Н, СН), 10,85 (8, 1Н, ΝΗ). МС т/ζ 167 [М+1].

Диметилформамид (322 г) и дихлорметан (3700 мл) охлаждали в ледяной бане до 4°С и при перемешивании добавляли оксихлорид фосфора (684 г). Медленно добавляли твердый 2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (670 г) аликвотами за 15 мин. Максимальная достигнутая температура была 18°С. Смесь нагревали до образования флегмы в течение 1 ч, охлаждали до 10°С в ледяной бане, и быстро добавляли 1,6 л ледяной воды при интенсивном перемешивании. Температура возрастала до 15°С. При интенсивном перемешивании добавляли 10 н. соляную кислоту (1,6 л). Температура поднималась до 22°С. Смесь оставляли стоять в течение 30 мин и давали возможность слоям разделиться. Температура достигала максимума 40°С. Водный слой доводили 10 н. гидроксидом калия (3,8 л) до рН 12-13 со скоростью, которая позволяла температуре во время добавления достичь и оставаться при 55°С. После окончания добавления смесь охлаждали до 10°С и перемешивали в течение 1 ч. Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали четыре раза с получением 5-формил-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты этилового эфира (778 г, выход 100%) в виде желтого твердого вещества. Ή ЯМР (ДМСО-й₆) δ 1,25 (1, 3Н, СН₃), 2,44, 2,48 (2x8, 2х3Н, 2хСН₃), 4,16 (ф 2Н, СН₂), 9,59 (8, 1Н, СНО), 12,5 (Ьг 8, 1Н, ЫН). МС т/ζ 195 [М+1].

5-Формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты этиловый эфир (806 г), гидроксид калия (548 г), воду (2400 мл) и метанол (300 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч при перемешивании, а затем охлаждали до 8°С. Смесь экстрагировали дважды дихлорметаном. Водный слой доводили 1000 мл 10 н. соляной кислоты до рН 4, поддерживая температуру ниже 15°С. Для облегчения перемешивания добавляли воду. Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией, промывали три раза водой и сушили под вакуумом при 50°С с получением 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3карбоновой кислоты (645 г, выход 93,5%) в виде желтого твердого вещества.

ЯМР (ДМСО-й₆) δ 2,40, 2,43 (2x8, 2х3Н, 2хСН₃), 9,57 (8, 1Н, СНО), 12,07 (Ьг 8, 2Н, МН+СООН). МС т/ζ 168 [М+1].

5-Формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновую кислоту (1204 г) и 6020 мл диметилформамида перемешивали при комнатной температуре, одновременно добавляя 1-(3-диметиламинопропил-3этилкарбодиимида гидрохлорид (2071 г), гидроксибензотриазол (1460 г), триэтиламин (2016 мл) и диэтилэтилендиамин (1215 мл). Смесь перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре. Смесь разбавляли 3000 мл воды, 2000 мл рассола и 3000 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и рН доводили до значения выше 10 с использованием 10 н. гидроксида натрия. Смесь экстрагировали дважды, каждый раз 5000 мл 10% метанола в дихлорметане, и экстракты объединяли, сушили над безводным сульфатом магния и досуха упаривали на роторном испарителе. Смесь затем разбавляли 1950 мл толуола и снова досуха упаривали на роторном испарителе. Остаток растирали со смесью 3:1 гексан:диэтиловый эфир (4000 мл). Твердые вещества собирали вакуумной фильтрацией, дважды промывали 400 мл этилацетата и сушили под вакуумом при 34°С в течение 21 ч с получением 5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (819 г, выход 43%) в виде светло-коричневого твердого вещества.

Ή ЯМР (диметилсульфоксид-й₆) δ 0,96 (1, 6Н, 2хСН₃), 2,31, 2,38 (2x8, 2 х СН₃), 2,51 (т, 6Н, 3хСН₂), 3,28 (т, 2Н, СН₂), 7,34 (т, 1Н, амидный МН), 9,56 (8, 1Н, СНО), 11,86 (8, 1Н, пиррольный МН). МС т/ζ 266 [М+1].

5-Формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (809 г), 5-фтор1,3-дигидроиндол-2-он (438 г), этанол (8000 мл) и пирролидин (13 мл) нагревали при 78°С в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и твердые вещества собирали вакуумной фильтрацией и промывали этанолом. Твердые вещества перемешивали с этанолом (5900 мл) при 72°С в течение 30 мин. Смесь охлаждали до комнатной температуры. Твердые вещества собирали вакуумной фильтрацией, промывали этанолом и сушили под вакуумом при 54°С в течение 130 ч с получением 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-(31)-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)

- 18 008137 амида (1013 г, выход 88%) в виде оранжевого твердого вещества.

Ή ЯМР (диметилсульфоксид-б₆) δ 0,98 (ΐ, 6Н, 2хСН₃), 2,43, 2,44 (2x8, 6Н, 2хСН₃), 2,50 (т, 6Н, 3хСН₂), 3,28 (ф 2Н, СН₂), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5хт, 5Н, ароматический, винил, СОИН), 10,88 (8, 1Н, СОИН), 13,68 (8, 1Н, пиррольный ИН). МС т/ζ 397 [М-1].

Биологические примеры

Ингибиторы протеинкиназы:

Следующие анализы можно использовать для определения уровня активности и воздействия ингибиторов протеинкиназ на одну или более чем одну протеинкиназу (ниже РК). Аналогичные анализы могут быть разработаны по тем же направлениям для любой РК с использованием методик, общеизвестных в данной области техники.

А. Методики анализа

Некоторые описанные здесь анализы осуществляют в формате ЕЬ18А (твердофазный иммуноферментный анализ) (Уо11ег с1 а1., 1980, Еηζуте-^^ηкеб 1ттипо8ОгЬеп1 А88ау, Мапиа1 οί С11шса1 1ттипо1оду, 26 еб., К.О8е апб Епебтап. Ат. 8ос. οί МюгоЬю1оду, \Уа81ипд1оп Ό. С., рр. 359-371). Общая методика представляет собой следующее: соединение вводят в клетки, экспрессирующие тестируемую киназу, либо естественным образом, либо рекомбинантно, в течение выбранного периода времени, после которого, если тестируемая киназа является рецептором, добавляют лиганд, который, как известно, активирует этот рецептор. Клетки лизируют и лизат переносят в лунки ЕЬ18А планшета, предварительно покрытого специфическим антителом, распознающим субстрат реакции ферментного фосфорилирования. Несубстратные компоненты клеточного лизата вымывают, и количество фосфорилирования на субстрате определяют с использованием антитела, специфически распознающего фосфотирозин, по сравнению с контрольными клетками, которые не контактировали с тестируемым соединением.

Предпочтительные на данный момент протоколы проведения ЕЬ18А экспериментов в отношении конкретных РК предложены ниже. Однако адаптация этих протоколов для определения активности соединений в отношении других рецепторных тирозинкиназ (НТК), а также цитоплазматических тирозинкиназ (СТК) и серин-треониновых тирозинкиназ (8ТК) находится полностью в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Другие описанные здесь анализы позволяют измерять количество ДНК, продуцированной в ответ на активацию тестируемой киназы, которое является главным критерием пролиферативного ответа. Общая методика этого анализа представляет собой следующее: соединение вводят в клетки, экспрессирующие тестируемую киназу, либо естественным образом, либо рекомбинантно, в течение выбранного периода времени, после которого, если исследуемая киназа является рецептором, добавляют лиганд, который, как известно, активирует этот рецептор. После инкубации в течение, по меньшей мере, ночи добавляют реагент, вводящий метку в ДНК, такой как 5бромдезоксиуридин (ВгбИ) или Н³-тимидин. Количество меченой ДНК определяют либо при помощи анти-Вгби антитела, либо путем измерения радиоактивности, и его сравнивают с контрольными клетками, не контактировавшими с тестируемым соединением.

Биоанализ О8Т-БЬК-1

В этом анализе анализируют тирозинкиназное действие О8Т-Б1М (О8Т -глутатион-8-трансфераза) на поли(д1ц,1уг)пептиды.

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные планшеты Согшпд (Согшпд Са1а1од № 5805-96).

2. Поли(д1и, 1уг) 4:1, лиофилизат (81дта Са1а1од № Р0275).

3. Подготовка покрытых поли(д1ц,!уг)(рЕ¥) аналитических планшетов: покрывают 2 мкг/лунку поли(д1иДуг)(рЕУ) в 100 мкл РВ8 (фосфатный буферный раствор), выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч или при 4°С в течение ночи. Хорошо закрывают планшеты, чтобы предотвратить испарение.

4. РВ8 буфер: на 1 л смешивают 0,2 г КН₂РО₄, 1,15 г Иа₂НРО₄, 0,2 г КС1 и 8 г ИаС1 в приблизительно 900 мл бН2О. Когда все реагенты растворятся, доводят рН до 7,2 с использованием НС1. Доводят общий объем до 1 л бН₂О.

5. РВ8Т буфер: к 1 л РВ8 буфера добавляют 1,0 мл Т^ЕЕИ-20.

6. ТВВ-блокирующий буфер: на 1 л смешивают 1,21 г ТК18 (трис(гидроксиметил)аминометана), 8,77 г ИаС1, 1 мл Т^ЕЕИ-20 в приблизительно 900 мл бН₂ О. Доводят рН до 7,2 с использованием НС1. Добавляют 10 г В8А (бычьего сывороточного альбумина), перемешивают до растворения. Доводят общий объем до 1 л бН₂О. Фильтруют для удаления частиц вещества.

7. 1% В8А в РВ8: Для приготовления 1х рабочего раствора добавляют 10 г В8А к приблизительно 990 мл РВ8 буфера, перемешивают до растворения. Доводят общий объем до 1 л РВ8 буфером, фильтруют для удаления частиц вещества.

8. 50 мМ НЕРЕ8 (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) рН 7,5.

9. О8Т-БЬК1 сб, очищенный из 8ί9 рекомбинантной бакуловирусной трансформации (ЗИОЕИ, 1пс.).

10. 4% ДМСО в бН2О.

11. 10 мМ АТР (аденозин 5'-трифосфат) в бН₂О.

12. 40 мМ МпС1₂

- 19 008137

13. Буфер для разведения киназы (КЭВ): смешивают 10 мл НЕРЕ8 (рН 7,5), 1 мл 5М №С1, 40 мкл 100 мМ ортованадата натрия и 0,4 мл 5% В8А в 6Н₂О с 88,56 мл 6Н₂О.

14. 96-луночные полипропиленовые планшеты NυNС с У-образным дном, АррНеб 8аепЦПс Са!а1од № А8-72092

15. ЕЭТА: смешивают 14,12 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΈΩΤΛ) с приблизительно 70 мл 6Н₂О. Добавляют 10 н. №ОН, пока ЕЭТА не растворится. Доводят рН до 8,0. Доводят общий объем до 100 мл 6Н₂О.

16. 1° буфер для разведения антител: смешивают 10 мл 5% В8А в РВ8 буфере с 89,5 мл ТВ8Т.

17. Антифосфотирозиновое моноклональное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (ΡΥ99 НИР, 8ап!а Сгих Вю1ес11).

18. 2,2'-Азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота (АВТ8, Мо§8, Са!. №. АВ8Т).

19. 10% 8Ό8 (додецилсульфат натрия).

Методика:

1. 96-луночные ЕЫ8А планшеты Согшпд покрывают 2 мкг полиЕΥ пептидом в стерильном РВ8, как описано в п.3 в разделе Материалы и реагенты.

2. Удаляют несвязанную жидкость из лунок переворачиванием планшета. Промывают один раз ТВ8Т. Похлопывают планшет по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

3. Добавляют по 100 мкл 1% В8А в РВ8 в каждую лунку. Инкубируют, при встряхивании, в течение 1 ч при комнатной температуре.

4. Повторяют стадию 2.

5. Пропитывают лунки 50 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5) (150 мкл/лунку).

6. Разводят тестируемое соединение смесью бН₂О/4% ДМСО до 4-кратной желаемой конечной аналитической концентрации в 96-луночных полипропиленовых планшетах.

7. Добавляют 25 мкл разведенного тестируемого соединения в ЕЬ18А планшет. В контрольные лунки помещают по 25 мкл бН₂О/4% ДМСО.

8. Добавляют по 25 мкл 40 мМ МпС1₂ с 4х АТР (2мкМ) в каждую лунку.

9. Добавляют по 25 мкл 0,5М ЕЭТА в лунки с отрицательным контролем.

10. Разбавляют 68Т-РЬК1 до 0,005 мкг (5 нг)/лунку КЭВ.

11. Добавляют по 50 мкл разбавленного фермента в каждую лунку.

12. Инкубируют при встряхивании в течение 15 мин при комнатной температуре.

13. Останавливают реакцию добавлением 50 мкл 250 мМ ЕЭТА (рН 8,0).

14. Промывают трижды ТВ8Т и похлопывают планшет по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

15. Добавляют по 100 мкл на лунку антифосфотирозинового НИР конъюгата (конъюгата с пероксидазой хрена), разведение 1:5000 в буфере для разведения антител. Инкубируют при встряхивании в течение 90 мин при комнатной температуре.

16. Промывают, как на стадии 14.

17. Добавляют по 100 мкл АВТ8 раствора комнатной температуры в каждую лунку.

18. Инкубируют при встряхивании в течение 10-15 мин. Удаляют все пузырьки.

19. Останавливают реакцию добавлением 20 мкл 10% 8Ό8 в каждую лунку.

20. Считывают результаты на ЭупаЮсН МИ7000 ЕЬ18А считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

Биоанализ ΡΥΚ2

Этот анализ используют для определения т ν 11го киназной активности НА эпитоп-меченного полноразмерного рук2 (РЬ.рук2-НА) в ЕЫ8А анализе.

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ЕЫ8А планшеты от Согшпд.

2. 12СА5 моноклональное анти-НА антитело (8иСЕН 1пс.)

3. РВ8 (фосфатный буферный раствор по Дульбекко (61Ьсо Са!а1од № 450-1300ЕВ)

4. ТВ8Т буфер: на 1 л смешивают 8,766 г №С1, 6,057 г ТИ18 и 1 мл 0,1% ТгПоп Х-100 в приблизительно 900 мл 6Н₂О. Доводят рН до 7,2, доводят объем до 1 л.

5. Блокирующий буфер: на 1 л смешивают 100 г 10% В8А, 12,1 г 100 мМ ТИ18, 58,44 г 1М №С1 и 10 мл 1% ΊΛνΡΡΝ-20.

6. РЬ.рук2-НА из ί9 клеточных лизатов (8иСЕН 1пс.).

7. 4% ДМСО в МзШОие Н₂О.

8. 10 мМ АТР в 6Н₂О.

9. 1М МпС1₂

10. 1М М§С1₂.

11. 1М дитиотрейтол (ЭТТ).

12. 10х киназный буфер для фосфорилирования: смешивают 5,0 мл НЕРЕ8 (рН 7,5), 0,2 мл 1М МпС1₂, 1,0 мл 1М МдС1₂, 1,0 мл 10% ТгПоп Х-100 в 2,8 мл 6Н₂О. Непосредственно перед использованием добавляют 0,1 мл 1М ЭТТ.

- 20 008137

13. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝΠΝΠ с У-образным дном.

14. 500 мМ ЕЭТА в 6Н₂О.

15. Буфер для разведения антител: на 100 мл 1 мл 5% смеси ВЗА/РВЗ и 1 мл 10% Ψ^ΕΕΝ-20 в 88 мл ТВЗ.

16. НКР-конъюгированный анти-Р!уг ΡΥ99, Зап!а Сгих В1о1есй Са!. № ЗС-7020.

17. АВТЗ, Мо§8, каталожный № АВЗТ-2000.

18. 10% 3Ό3.

Методика

1. 96-луночные ЕБ18А планшеты Согшпд покрывают 0,5 мкг на лунку 12СА5 анти-НА антителом в 100 мкл РВЗ. Хранят в течение ночи при 4°С.

2. Удаляют несвязанное НА антитело из ячеек путем переворачивания планшета. Промывают планшет один раз 6Н₂О. Похлопывают планшет по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

3. Добавляют по 150 мкл блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

4. Промывают планшет 4 раза ТВЗ-Т.

5. Разводят лизат в РВЗ (1,5 мкг лизата/100 мкл РВЗ).

6. Добавляют по 100 мкл разведенного лизата в каждую лунку. Встряхивают при комнатной температуре в течение 1 ч.

7. Промывают как на стадии 4.

8. Добавляют 50 мкл 2х киназного буфера в ЕЫ8А планшет, содержащий захваченный рук2-НА.

9. Добавляют по 25 мкл 400 мкМ тестируемого соединения в 4% ДМСО в каждую лунку. Для контрольных лунок используют только 4% ДМСО.

10. Добавляют 25 мкл 0,5М ЕЭТА в лунки с отрицательным контролем.

11. Добавляют 25 мкл 20 мкМ АТР во все лунки. Инкубируют при встряхивании в течение 10 мин.

12. Останавливают реакцию добавлением 25 мкл 500 мМ ЕЭТА (рН 8,0) во все лунки.

13. Промывают как на стадии 4.

14. Добавляют в каждую лунку по 100 мкл НКР конъюгированного анти-Р!уг, разведенного 1:6000 в буфере для разведения антител. Инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре.

15. Промывают планшет 3 раза ТВЗТ и 1 раз РВЗ.

16. Добавляют по 100 мкл АВТЗ раствора в каждую лунку.

17. Если требуется, останавливают развитие реакции добавлением 20 мкл 10% ЗЭЗ в каждую лунку.

18. Считывают планшет на ЕБ1ЗА считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

Биоанализ ЕСЕК1

Этот анализ используют для измерения ίη νίΙΐΌ киназной активности ЕСЕ1-К в ЕЫЗА анализе.

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ЕБ1ЗА планшеты Со§!аг (Согшпд Са!а1од № 3369).

2. Поли(д1и,!уг) (З1дша Са!а1од № Р0275).

3. РВЗ (Каталог СпЬсо. № 450-1300ЕВ).

4. 50 мМ НЕРЕЗ буферный раствор.

5. Блокирующий буфер (5% ВЗА/РВЗ).

6. Очищенный СЗТ-ЕСЕК1 (ЗиСЕН 1пс.).

7. Буфер для разведения киназ.

Смешивают 500 мкл 1М НЕРЕЗ (С1ВСО), 20 мкл 5% ВЗА/РВЗ, 10 мкл 100 мМ ортованадата натрия и 50 мкл 5М №С1.

8. 10 мМ АТР.

9. Смесь для фосфорилирования АТР/МпС1₂: смешивают 20 мкл АТР, 400 мкл 1М МпС1₂ и 9,56 мл 6Н₂О.

10. 96-луночные полипропиленовые планшеты NυNС с У-образным дном (АррНеб 8с1еп!1Дс Са!а1од № АЗ-72092).

11. 0,5М ЕЭТА.

12. 0,05% ТВЗТ. Добавляют 500 мкл Т\VЕЕN к 1 л ТВЗ.

13. Кроличья поликлональная антифосфотирозиновая сыворотка (ЗиСЕН 1пс.).

14. Конъюгат козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой (Вюкоигсе, Са!а1од № АБ10404).

15. АВТЗ раствор.

16. АВЗТ/Н₂О₂ раствор.

Методика

1. 96-луночные ЕБ1ЗА планшеты Сойаг покрывают 1 мкг на лунку поли(д1и,!уг) в 100 мкл РВЗ. Хранят в течение ночи при 4°С.

2. Промывают покрытые планшеты один раз РВЗ.

- 21 008137

3. Добавляют по 150 мкл 5% В8А/РВ8 блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре.

4. Промывают планшет 2 раза РВ8, затем один раз 50 мМ НЕРЕ8. Похлопывают планшеты по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков.

5. Добавляют 25 мкл 0,4 мМ тестируемого соединения в 4% ДМСО или 4% ДМСО один (контроль) в планшет.

6. Разбавляют очищенный С8Т-ЕСЕР1 в буфере для разведения киназ (5 нг киназы/50 мкл КЭВ/лунку).

7. Добавляют по 50 мкл разведенной киназы в каждую лунку.

8. Начинают киназную реакцию добавлением 25 мкл/лунку свежеприготовленного АТР/Мп++ (0,4 мл 1М МпС1₂, 40 мкл 10 мМ АТР, 9,56 мл 6Н₂О), свежеприготовленный).

9. Это быстрая киназная реакция, и ее следует остановить 25 мкл 0,5М ЕЭТА способом, аналогичным добавлению АТР.

10. Промывают планшет 4 раза свежим ТВ8Т.

11. Готовят буфер для разведения антител: на 50 мл:

Смешивают 5 мл 5% В8А. 250 мкл 5% молока и 50 мкл 100 мМ ванадата натрия, доводят до конечного объема 0,05% ТВ8Т.

12. Добавляют 100 мкл на лунку антифосфотирозина (1:10000 разведение в АЭВ). Инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре.

13. Промывают как на стадии 10.

14. Добавляют по 100 мкл на лунку Вюкоигсе конъюгата козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой (1:6000 разведение в АЭВ). Инкубируют при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре.

15. Промывают как на стадии 10, а затем РВ8 для удаления пузырей и избытка Т^ЕЕЫ.

16. Добавляют по 100 мкл АВТ8/Н₂О₂ раствора в каждую лунку.

17. Инкубируют при встряхивании в течение 10-20 мин. Удаляют все пузырьки.

18. Считывают анализ на Эупа1ес11 МР7000 ЕЫ8А считывающем устройстве: тест-фильтр при 410 нм и фильтр сравнения при 630 нм.

Биоанализ ЕСЕК

Этот анализ используют для определения ίη νίίτο киназной активности ЕСЕ1-Р в ЕЫ8А анализе. Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ЕБ18А планшеты Согшпд.

2. 8ИМО1 моноклональное анти-ЕСЕР антитело (8ибЕЫ, 1пс.).

3. РВ8.

4. ТВ8Т буфер.

5. Блокирующий буфер: на 100 мл смешивают 5,0 г СагпаНоп 1п81ап1 ΝοηΓαΙ М11к® с 100 мл РВ8.

6. А431 клеточный лизат (8иСЕН 1пс.).

7. ТВ8 буфер.

8. ТВ8+10% ДМСО: на 1 л смешивают 1,514 г ТК18, 2,192 г №1С1 и 25 мл ДМСО; доводят до общего объема 1 л 6Н₂О.

9. АТР (аденозин-5'-трифосфат, из конской мышцы, 8щша Са1а1од № А-5394), 1,0 мМ раствор в 6Н₂О. Этот реагент следует готовить непосредственно перед использованием и хранить на льду.

10. 1,0 мл МпС1₂.

11. АТР/МпС12 смесь для фосфорилирования: для приготовления 10 мл смешивают 300 мкл 1 мМ АТР, 500 мкл МпС1₂ и 9,2 мл 6Н₂О. Готовят непосредственно перед использованием, хранят на льду.

12. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝυΝΤ с У-образным дном.

13. ЕЭТА.

14. Кроличья поликлональная антифосфотирозиновая сыворотка (8иСЕН 1пс.).

15. Конъюгат козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой (Вюкоигсе Са1. № АЕ10404).

16. АВТ8.

17. 30% перекись водорода.

18. АВ8Т/Н₂О₂.

19. 0,2М НС1.

Методика

1. 96-луночные ЕЬ18А планшеты Согшпд покрывают 0,5 мкг 8ИМО1 в 100 мкл РВ8 на лунку, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Удаляют несвязанный 8ИМО1 из лунок путем переворачивания планшета для удаления жидкости. Промывают 1 раз 6Н₂О. Похлопывают планшетом по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

3. Добавляют по 150 мкл блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

4. Промывают планшет 3 раза деионизированной водой, затем один раз ТВ8Т. Похлопывают план

- 22 008137 шет по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков.

5. Разводят лизат в РВ8 (7 мкг лизата/100 мкл РВ8).

6. Добавляют по 100 мкл разведенного лизата в каждую лунку. Встряхивают при комнатной температуре в течение 1 ч.

7. Промывают планшеты как на стадии 4.

8. Добавляют 120 мкл ТВ8 в ЕЫ8А планшет, содержащий захваченный ЕСЕК.

9. Разводят тестируемое соединение 1:10 в ТВ8, помещают в лунку.

10. Добавляют 13,5 мкл разведенного тестируемого соединения в ЕЬ18А планшет. В контрольные лунки добавляют 13,5 мкл ТВ8 в 10% ДМСО.

11. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

12. Добавляют 15 мкл смеси для фосфорилирования во все лунки за исключением лунки с отрицательным контролем. Конечный объем в лунке должен составлять приблизительно 150 мкл с 3 мкМ АТР/5 мМ МпС1₂ конечной концентрации в каждой лунке. Инкубируют при встряхивании в течение 5 мин.

13. Останавливают реакцию путем добавления 16,5 мкл ЕЭТА раствора при встряхивании. Встряхивают в течение еще 1 мин.

14. Промывают 4 раза деионизированной водой, 2 раза ТВ8Т.

15. Добавляют по 100 мкл антифосфотирозина (1:3000 разведение в ТВ8Т) на лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30-45 мин при комнатной температуре.

16. Промывают как на стадии 4.

17. Добавляют по 100 мкл Вюкоигсе конъюгата козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой (1:2000 разведение в ТВ8Т) в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре

18. Промывают как на стадии 4.

19. Добавляют по 100 мкл АВТ8/Н2О2 раствора в каждую лунку.

20. Инкубируют от 5 до 10 мин при встряхивании. Удаляют все пузырьки.

21. Если необходимо, останавливают реакцию добавлением 100 мкл 0,2М НС1 на лунку.

22. Считывают анализ на Эупа1есН МК.7000 ЕЫ8А считывающем устройстве: тест-фильтром при 410 нм и фильтр сравнения при 630 нм.

Биоанализ РБСЕК

Этот анализ используют для определения ίη νίΙΐΌ киназной активности ЕСЕ1-К в ЕЫ8А анализе. Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ЕЬ18А планшеты Согшпд.

2. 28Э4С10 моноклональное анти-РЭСЕК антитело (8иСЕМ 1пс.).

3. РВ8.

4. ТВ8Т буфер.

5. Блокирующий буфер (такой же, как для ЕСЕК биоанализа).

6. РИСЕК-β экспрессирующий ΝΙΗ 3Т3 клеточный лизат (8иСЕМ 1пс.).

7. ТВ8 буфер.

8. ТВ8+10% ДМСО.

9. АТР.

10. МпС1₂.

11. Киназная буферная смесь для фосфорилирования: на 10 мл смешивают 250 мкл 1М ТК18, 200 мкл 5М №С1, 100 мкл 1М МпС1₂ и 50 мкл 100 мМ ТгПоп Х-100 в количестве йН₂О, достаточном для приготовления 10 мл.

12. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝΌΝΕ с У-образным дном.

13. НОТА.

14. Кроличья поликлональная антифосфотирозиновая сыворотка (8иСЕМ 1пс.).

15. Конъюгат козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой (Вюкоигсе СаЕ № АБ10404).

16. АВТ8.

17. Перекись водорода, 30% раствор.

18. АВ8Т/Н₂О₂.

19. 0,2М НС1.

Методика

1. 96-луночные ЕЫ8А планшеты Согшпд покрывают 0,5 мкг 28Э4С10 в 100 мкл РВ8 на лунку, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Удаляют несвязанный 28Э4С10 из лунок путем переворачивания планшета для удаления жидкости. Промывают 1 раз йН2О. Похлопывают планшетом по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

3. Добавляют по 150 мкл блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании.

4. Промывают планшет 3 раза деионизированной водой, затем один раз ТВ8Т. Похлопывают планшетом по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков.

- 23 008137

5. Разводят лизат в ΗΝΤΟ (10 мкг лизата/100 мкл ΗΝΤΟ).

6. Добавляют по 100 мкл разведенного лизата в каждую лунку. Встряхивают при комнатной температуре в течение 60 мин.

7. Промывают планшеты как описано на стадии 4.

8. Добавляют 80 мкл рабочей киназной буферной смеси к ЕЬ18А планшету, содержащему захваченный РЭСЕК.

9. Разводят тестируемое соединение 1:10 в ТВ8 в 96-луночных полипропиленовых планшетах.

10. Добавляют 10 мкл разведенного тестируемого соединения в ЕЫ8А планшет. В контрольные лунки добавляют 10 мкл ТВ8+10% ДМСО. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

11. Добавляют 10 мкл АТР прямо во все лунки за исключением лунки с отрицательным контролем (конечный объем в лунке должен составлять приблизительно 100 мкл с 20 мкМ АТР в каждой лунке). Инкубируют 30 мин при встряхивании.

12. Останавливают реакцию путем добавления 10 мкл ЕЭТА раствора в каждую лунку.

13. Промывают 4 раза деионизированной водой, 2 раза ТВ8Т.

14. Добавляют 100 мкл антифосфотирозина (1:3000 разбавление в ТВ8Т) на лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30-45 мин при комнатной температуре.

15. Промывают как на стадии 4.

16. Добавляют 100 мкл Вюзоигсе конъюгата козьих антител к 1дО кролика с пероксидазой (1:2000 разведение в ТВ8Т) в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

17. Промывают как на стадии 4.

18. Добавляют по 100 мкл АВТ8/Н2О2 раствора в каждую лунку.

19. Инкубируют 10-30 мин при встряхивании. Удаляют все пузырьки.

20. Если необходимо, останавливают реакцию добавлением 100 мкл 0,2М НС1 на лунку.

21. Считывают анализ на ЭупаЮсН МВ7000 ЕЬ18А считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

Анализ клеточной НЕК-2 КИНАЗЫ

Этот анализ используют для измерения НЕК-2 киназной активности в цельных клетках в ЕЫ8А формате.

Материалы и реагенты:

1. ЭМЕМ (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) (С1ВСО Са!а1од №11965-092).

2. Сыворотка плода коровы (РВ8, С1ВСО Са!а1од № 16000-044), инактивированная нагреванием в водяной бане в течение 30 мин при 56°С.

3. Трипсин (О1ВСО Са!а1од № 25200-056).

4. Ь-глутамин (С1ВСО Са!а1од № 25030-081).

5. НЕРЕ8 (О1ВСО Са!а1од № 15630-080).

6. Среда для выращивания.

Смешивают 500 мл ЭМЕМ. 55 мл инактивированной нагреванием РВ8, 10 мл НЕРЕ8 и 5,5 мл Ьглутамина.

7. Голодная среда.

Смешивают 500 мл ЭМЕМ, 2,5 мл инактивированной нагреванием РВ8, 10 мл НЕРЕ8 и 5,5 мл Ьглутамина.

8. РВ8.

9. 96-луночные микротитровальные планшеты для культуры ткани с плоским дном (Согшпд Са!а1од № 25860).

10. 15 см чашки для культуры ткани (Согшпд Са!а1од № 08757148).

11. 96-луночные ЕЫ8А планшеты Согшпд.

12. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝυΝΟ с У-образным дном.

13. Переносные картриджи Соз!аг для Тгапз!аг 96 (Соз!аг Са!а1од № 7610).

14. 8иМО 1: моноклональное анти-ЕСРВ антитело (8иСЕК 1пс.).

15. ТВ8Т буфер.

16. Блокирующий буфер: 5% Сагпайоп 1пз!ап! М11к® в РВ8.

17. ЕСР лиганд: ЕСР-201, 8Ыпко Атепсап, 1арап. Суспендируют порошок в 100 мкл 10 мМ НС1. Добавляют 100 мкл 10 мМ №1ОН. Добавляют 800 мкл РВ8 и переносят в пробирку Эппендорфа, хранят при -20°С до готовности к использованию.

18. НОТО буфер для лизиса.

Для исходного 5-кратного раствора НОТО смешивают 23,83 г НЕРЕ8, 43,83 г №С1, 500 мл глицерина и 100 мл Тп!оп Х-100 и достаточное количество йН₂О для приготовления 1 л общего раствора.

Для 1-кратного НОТО* смешивают 2 мл НОТО, 100 мкл 0,1М №₃УО₄, 250 мкл 0,2М №₄Р₂О₇ и 100 мкл ЕЭТА.

19. НОТА.

- 24 008137

20. ΝΗ₃νθ4. Чтобы приготовить исходный раствор, смешивают 1,84 г Να₃νθ₄ с 90 мл 6Н₂О. Доводят рН до 10. Кипятят в микроволновой печи в течение 1 мин (раствор становится прозрачным). Охлаждают до комнатной температуры. Доводят рН до 10. Повторяют цикл нагревание/охлаждение, пока рН остается 10.

21. 200 мМ Να₄Ρ₂Ο₇.

22. Кроличья поликлональная антисыворотка, специфичная к фосфотирозину антитело, δυΟΕΝ, 1пс.).

23. Аффинно очищенная антисыворотка, конъюгат антител козы к 1дС кролика с пероксидазой (Вююнгсс Εαΐαίοβ № ЛЫ0404).

24. ЛВТ8 раствор.

25. 30% раствор перекиси водорода.

26. ЛВТ8/Н₂О₂.

27. 0,2М НС1.

Методика

1. Покрывают ί.'οΓπίη§ 96-луночные ЕЫ8Л планшеты §иМО1 в количестве 1,0 мкг на лунку в ΡΒ8, 100 мкл конечного объема/лунку. Хранят в течение ночи при 4°С.

2. В день использования удаляют покрывающий буфер и промывают планшет 3 раза 6Н₂О и один раз ТВ8Т буфером. Все промывания в данном анализе следует выполнять этим способом, если не указано иное.

3. Добавляют по 100 мкл блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием планшет промывают.

4. Для этого анализа используют ЕСРг/НЕВ-2 химерную/3Т3-С7 клеточную линию

5. Выбирают чашки, имеющие 80-90% конфлюэнтность. Клетки собирают трипсинизацией и центрифугируют при 1000 об./мин при комнатной температуре в течение 5 мин.

6. Ресуспендируют клетки в голодной среде и подсчитывают с использованием трипанового синего. Требуется жизнеспособность выше 90%. Клетки засевают в голодную среду с плотностью 2500 клеток на лунку, 90 мкл на лунку, в 96-луночный микротитровальный планшет. Инкубируют засеянные клетки в течение ночи при 37°С под 5% СО₂.

7. Начинают анализ через 2 суток после посева.

8. Тестируемые соединения растворяют в 4% ДМСО. Образцы затем дополнительно разбавляют на планшетах с голодной-ЭМЕМ. Обычно это разбавление составляет 1:10 или более. Все лунки затем переносят на клеточный планшет при дополнительном разведении 1:10 (10 мкл образца и среды в 90 мкл голодной среды. Конечная концентрация ДМСО должна составлять 1% или ниже. Также можно использовать стандартное серийное разведение.

9. Инкубируют под 5% СО₂ при 37°С в течение 2 ч.

10. Готовят ЕСР лиганд путем разведения исходного ЕСР (16,5 мкМ) в теплой ИМЕМ до 150 нМ.

11. Готовят свежий НХТС* в количестве, достаточном для 100 мкл на лунку; помещают на лед.

12. После 2 ч инкубации с тестируемым соединением добавляют приготовленный ЕСР лиганд к клеткам, 50 мкл на лунку, до конечной концентрации 50 нМ. В лунки с положительным контролем добавляют такое же количество ЕСР. В отрицательные контроли не добавляют ЕСР. Инкубируют при 37°С в течение 10 мин.

13. Удаляют тестируемое соединение, ЕСР и ИМЕМ. Промывают клетки один раз ΡΒ8.

14. Переносят НКТС* к клеткам, 100 мкл на лунку. Помещают на лед на 5 мин. Тем временем, удаляют блокирующий буфер из ЕЫ8Л планшета и промывают.

15. Выскабливают клетки с планшета микропипеткой и гомогенизируют клеточный материал, многократно отсасывая и выпуская НЫТС* буфер для лизиса. Переносят лизат в покрытый, закрытый, промытый ЕЬ18Л планшет. Или используют картридж для переноса ί'οδΙαΓ для переноса лизата в планшет.

16. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

17. Удаляют лизат, промывают. Переносят свежеразведенное анти-Пуг антитело (1:3000 в ТВ8Т) в ЕЫ8Л планшет, 100 мкл на лунку.

18. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин.

19. Удаляют анти-Пуг антитело, промывают. Переносят свежеразведенное ВЮЗОИКСЕ антитело в ЕЫ8Л планшет (1:8000 в ТВ8Т, 100 мкл на лунку).

20. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин.

21. Удаляют В1О8ОиВСЕ антитело, промывают. Переносят свежеприготовленный ЛВТ8/Н₂О₂ раствор в ЕЫ8Л планшет, 100 мкл на лунку.

22. Инкубируют при встряхивании в течение 5-10 мин. Удаляют всякие пузырьки.

23. Останавливают реакцию добавлением 100 мкл 0,2 М НС1 на лунку.

24. Считывают анализ на Оупа1сс11 МВ7000 ЕЬ18Л считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

- 25 008137

Анализ циклинзависимой киназы (СБК2)/циклина А

Этот анализ используют для измерения ίη νίΙΐΌ серин/треонин киназной активности сбк2/циклина А человека в анализе сцинтилляционной близости (δΡΑ).

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные полиэтилен-терфталатные (гибкие) планшеты \Уа11ас (^а11ас Са1а1од № 1450-401).

2. Атегкйат РсШтис [γ³³Ρ] ΑΤΡ (Атегайат Са1а1од № АН 9968).

3. Покрытые стрептавидином поливинилтолуоловые δΡΑ гранулы Атегкйат (Атегкйат Са1а1од № ΡΡΝΟ0007). Гранулы следует растворить в ΡΒ8 без магния или кальция в концентрации 20 мг/мл.

4. Активированный сдк2/циклин А ферментный комплекс, очищенный, из δ£9 клеток (δϋΟΕΝ, 1пс.).

5. Биотинилированный пептидный субстрат (ОеЬНбе). Пептидный биотин-Χ-ΡΚΤΡΗΚΑΚΚΕ растворяют в άΗ₂Ο в концентрации 5 мг/мл.

6. Смесь пептид/ΑΤΡ: на 10 мл смешивают 9,979 мл άΗ₂Ο, 0,00125 мл холодного АТР, 0,010 мл ОеЬНбе и 0,010 мл у³³Р АТР. Окончательная концентрация на лунку будет 0,5 мкМ холодного АТР, 0,1 мкг ОеЬНбе и 0,2 мкКи у³³Р АТР.

7. Киназный буфер: на 10 мл смешивают 8,85 мл άΗ₂Ο, 0,625 мл ΤΚΙδ (рН 7,4), 0,25 мл 1М МдС1₂, 0,25 мл 10% ΝΡ40 и 0,025 мл 1М ΌΤΤ, добавляют свежим непосредственно перед использованием.

8. 10 мМ АТР в ан₂о.

9. 1М ΤΒΙδ, рН доводят до 7,4, используя НС1.

10. 1М М§01₂.

11.1М ΌΤΤ.

12. ΡΒδ (О1Ьсо Са1а1од № 14190-144).

13. 0,5М ΕΌΤΑ.

14. Стоп-раствор: на 10 мл смешивают 9,25 мл ΡΒδ, 0,005 мл 100 мМ АТР, 0,1 мл 0,5М ΕΌΤΑ, 0,1 мл 10% ΤύΦη Χ-100 и 1,25 мл 20 мг/мл δΡΑ гранул.

Методика:

1. Готовят растворы тестируемых соединений в 5-кратной требуемой конечной концентрации в 5% ДМСО. Добавляют 10 мкл в каждую лунку. Для отрицательных контролей используют 10 мкл 5% ДМСО одного в лунках.

2. Разводят 5 мкл раствора сбк2/циклин А в 2,1 мл 2х киназного буфера.

3. Добавляют по 20 мкл фермента в каждую лунку.

4. Добавляют 10 мкл 0,5М ΕΌΤΑ в лунки с отрицательным контролем.

5. Чтобы запустить киназную реакцию, добавляют по 20 мкл смеси пептид/ΑΤΡ в каждую лунку. Инкубируют в течение 1 ч без встряхивания.

6. Добавляют по 200 мкл стоп-раствора в каждую лунку.

7. Выдерживают по меньшей мере 10 мин.

8. Вращают планшет при приблизительно 2300 об./мин в течение 3-5 мин.

9. Считывают планшет, используя Τή1υχ или аналогичное считывающее устройство.

Анализ меттрансфосфорилирования

Этот анализ используют для измерения уровней фосфотирозина на субстрате поли(глутаминовая кислота: тирозин (4:1)) как средства идентификации агонистов/антагонистов меттрансфосфорилирования субстрата.

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ΕΌΙδΑ планшеты Согшпд (Согшпд Са!а1од № 25805-96).

2. Поли(Д1и.1уг) 4:1, 81§та Са1а1од № Ρ0275.

3. ΡΒδ, 01Ьсо Са1а1о§ № 450-1300ΕΒ.

4. 50 мМ ΗΕΡΕδ.

5. Блокирующий буфер: растворяют 25 г бычьего сывороточного альбумина, δίβΐηη Са!а1од № А7888, в 500 мл ΡΒδ, фильтруют через 4 мкм фильтр.

6. Очищенный ΟδΤ слитый белок, содержащий Ме1 киназный домен, διι^ΐ'!, 1пс.

7. ΤΒδΤ буфер.

8. 10% водный (МШ10ие Н₂О) ДМСО.

9. 10 мМ водный (άΗ₂Ο) аденозин-5'-трифосфат, δ^дта Са!а1од № А-5394.

10. 2х буфер для разбавления киназы: на 100 мл смешивают 10 мл 1М ΗΕΡΕδ с рН 7,5 с 0,4 мл 5% ΒδΑ/ΡΒδ, 0,2 мл 0,1М ортованадата натрия и 1 мл 5М хлорида натрия в 88,4 мл άΗ₂Ο.

11. 4х АТР реакционная смесь: на 10 мл смешивают 0,4 мл 1М хлорида марганца и 0,02 мл 0,1М АТР в 9,56 мл άΗ₂Ο.

12. 4х смесь для отрицательного контроля: на 10 мл смешивают 0,4 мл 1М хлорида марганца в 9,56 мл άΗ₂Ο.

13. 96-луночные полипропиленовые планшеты NυNС с У-образным дном, Аррйеб δ^ηίίίΕ Са!а1од № δ-72092

- 26 008137

14. 500 мМ ΕΌΤΛ.

15. Буфер для разведения антител: на 100 мл смешивают 10 мл 5% В8А/РВ8, 0,5 мл 5% Сагпабоп 1п51ап1 М11к® в РВ8 и 0,1М ортованадата натрия в 88,4 мл ТВ8Т.

16. Кроличье поликлональное антифосфотирозиновое антитело, 8идеп, 1пс.

17. Конъюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена, Вюкоигсе, 1пс.

18. АВ8Т раствор: на 1 л смешивают 19,21 г лимонной кислоты, 35,49 г №1₂НРО₄ и 500 мг АВТ8 с количеством 6Н₂О, достаточным для приготовления 1 л.

19. АВТ8/Н₂О: смешивают 15 мл АВ8Т раствора с 2 мкл Н₂О₂ за 5 мин до использования.

20. 0,2М НС1.

Методика:

1. Покрывают ЕЫ8А планшеты 2 мкг поли(д1и,!уг) в 100 мкл РВ8, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Блокируют планшет 150 мкл 5% В8А/РВ8 в течение 60 мин.

3. Промывают планшет дважды РВ8, один раз 50 мМ НЕРЕ8 буфера с рН 7,4.

4. Добавляют 50 мкл разведенной киназы во все ячейки (Очищенную киназу разводят в буфере для разведения киназы. Конечная концентрация должна составлять 10 нг/лунку).

5. Добавляют 25 мкл тестируемого соединения (в 4% ДМСО) или ДМСО один (4% в 6Н₂О) для контроля на планшете.

6. Инкубируют смесь киназа/соединение в течение 15 мин.

7. Добавляют 25 мкл 40 мМ МпС12 в лунки с отрицательным контролем.

8. Добавляют 25 мкл смеси АТР/МпС1₂ во все остальные лунки (за исключением отрицательных контролей). Инкубируют в течение 5 мин.

9. Добавляют 25 мкл 500 мМ ЕЭТА. чтобы остановить реакцию.

10. Промывают планшет 3х ТВ8Т.

11. Добавляют по 100 мкл кроличьего поликлонального анти-Р!уг, разведенного 1:10000 в буфере для разведения антител, в каждую лунку. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

12. Промывают планшет 3х ТВ8Т.

13. Разводят конъюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена (Вюкоигсе) 1:6000 в буфере для разведения антител. Добавляют по 100 мкл на лунку и инкубируют при комнатной температуре при встряхивании в течение 1 ч.

14. Промывают планшет 1х РВ8.

15. Добавляют по 100 мкл АВТ8/Н₂О₂ раствора в каждую лунку.

16. Если необходимо, останавливают развитие реакции добавлением 100 мкл 0,2М НС1 на лунку.

17. Считывают результаты на ЭупаЮсН МК.7000 ЕЬ18А считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

Анализ ЮР-1 трансфорилирования

Этот анализ использован для измерения уровня фосфотирозина в поли(глутаминовая кислота:тирозин (4:1) для определения агонистов/антагонистов §81-ЮР-1 трансфосфорилирования субстрата.

Материалы и реагенты:

1. 96-луночные ЕЫ8А планшеты Согшпд.

2. Поли(д1и,1уг) 4:1, 81§та Са1а1од № Р0275.

3. РВ8, 01Ьсо Са1а1о§ № 450-1300ЕВ.

4. 50 мМ НЕРЕ8.

5. ТВВ блокирующий буфер: на 1 л смешивают 100 г В8А, 12,1 г ТР18 (рН 7,5), 58,44 г хлорида натрия и 10 мл 1% Т\\'ЕЕ\-20.

6. Очищенный С8Т слитый белок, содержащий ЮР-1 киназный домен (8идеп, 1пс).

7. ТВ8Т буфер: на 1 л смешивают 6,075 г ТК18, 8,766 г хлорида натрия и 0,5 мл Т\ЕЕЮ20 с количеством 6Н₂О, достаточным для приготовления 1 л.

8. 4% ДМСО в М1Ш-9 Н₂О.

9. 10 мМ АТР в 6Н₂О.

10. 2х буфер для разведения киназы: на 100 мл смешивают 10 мл 1М НЕРЕ8 (рН 7,5), 0,4 мл 5% В8А в 6Н₂О, 0,2 мл 0,1М ортованадата натрия и 1 мл 5М хлорида натрия с количеством 6Н₂О, достаточным для приготовления 100 мл.

11. 4х АТР реакционная смесь: на 10 мл смешивают 0,4 мл 1М МпС1₂ и 0,008 мл 0,01М АТР и 9,56 мл 6Н₂О.

12. 4х смесь для отрицательного контроля: смешивают 0,4 мл 1М хлорида марганца в 9,60 мл 6Н₂О.

13. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝϋΝΟ с У-образным дном.

14. 500 мМ ЕЭТА в 6Н₂О.

15. Буфер для разведения антител: на 100 мл смешивают 10 мл 5% В8А в РВ8, 0,5 мл 5% СагпаБоп 1п51ап1 №п-Га1 М11к® в РВ8 и 0,1 мл 0,1М ортованадата натрия в 88,4 мл ТВ8Т.

16. Кроличье поликлональное антифосфотирозиновое антитело, 8идеп, 1пс.

17. Конъюгат козьих антикроличьих антител с пероксидазой хрена, Вюкоигсе.

- 27 008137

18. ЛВ8Т раствор.

19. ЛВТ8/Н₂О₂: смешивают 15 мл ЛВ8Т с 2 мкл Н₂О₂ за 5 мин до использования.

20. 0,2М НС1 в 6Н₂О.

Методика:

1. Покрывают ЕЬ18Л планшет 2 мкг/лунку поли(д1и,1уг) 4:1 (81дта Р0275) в 100 мкл РВ8. Планшет хранят в течение ночи при 4°С.

2. Промывают планшет один раз РВ8.

3. Добавляют по 100 мкл ТВВ блокирующего буфера в каждую лунку. Инкубируют планшет в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре.

4. Промывают планшет один раз РВ8, затем дважды 50 мМ НЕРЕ8 буфера с рН 7,5.

5. Добавляют 25 мкл тестируемого соединения в 4% ДМСО (получают путем разведения исходного раствора 10 мМ тестируемого соединения в 100% ДМСО 6Н₂О) в планшет.

6. Добавляют 10,0 нг д§1-ЮЕ-1 киназы в 50 мкл буфера для разведения киназы) во все ячейки.

7. Запускают киназную реакцию добавлением 25 мкл 4х АТР реакционной смеси во все тестируемые лунки и лунки с положительным контролем. Добавляют 25 мкл 4х смеси для отрицательных контролей во все лунки с отрицательным контролем. Инкубируют в течение 10 мин при встряхивании при комнатной температуре.

8. Добавляют 25 мкл 0,5М ЕЭТЛ (рН 8,0) во все лунки.

9. Промывают планшет 4 раза ТВ8Т буфером.

10. Добавляют кроличью поликлональную антифосфотирозиновую антисыворотку в разведении 1:10000 в 100 мкл буфера для разведения антител во все лунки. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

11. Промывают планшет как на стадии 9.

12. Добавляют 100 мкл конъюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена Вюкоигсе в разведении 1:10000 в буфере для разведения антител во все лунки. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

13. Промывают планшет как на стадии 9, затем один раз промывают РВ8 для сокращения пузырьков и избытка Т\УЕЕ^20.

14. Проявляют добавлением 100 мкл/лунку ЛВТ8/Н₂О₂ раствора в каждую лунку.

15. Через примерно 5 мин считывают на ЕЬ18Л считывающем устройстве с тест-фильтром при 410 нм и фильтром сравнения при 630 нм.

Анализы включения ΒΚΏϋ

В следующих анализах использованы клетки, сконструированные для экспрессии выбранного рецептора и последующей оценки воздействия интересующего соединения на активность лигандиндуцированного синтеза ДНК путем определения включения ВгбИ в ДНК.

Следующие материалы, реагенты и методика являются общими для каждого из следующих анализов включения ВгбИ. Отмечены различия в конкретных анализах.

Материалы и реагенты:

1. Подходящий лиганд.

2. Подходящие сконструированные клетки.

3. ВгбИ меченый реагент: 10 мМ в РВ8 (рН 7,4) (ВоеИппдег МаппНепп. Сегтапу).

4. ИхЭепа!: фиксирующий раствор (готовый) (ВоеИппдег Маппйе1т, Сегтапу).

5. АпИ-ВМИ-РОО: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой (ВоеИппдег МаппЕе1т, Сегтапу).

6. Раствор ТМВ субстрата:тетраметилбензидин (ТМВ, ВоеНппдег МаппЕе1т, Сегтапу).

7. РВ8 промывочный раствор: 1х РВ8, рН 7,4.

8. Альбумин, бычий (В8А), порошок фракции V (81дта СНет1са1 Со., И8Л).

Общая методика

1. Клетки засеивают в количестве 8000 клеток/лунку в 10% С8, 2 мМ С1п в ЭМЕМ в 96-луночном планшете. Клетки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% СО₂.

2. Через 24 ч клетки промывают РВ8, а затем выдерживают в не содержащей сыворотку среде (0% С8 ЭМЕМ с 0,1% В8Л) в течение 24 ч.

3. На день 3 к клеткам одновременно добавляют подходящий лиганд и тестируемое соединение. В лунки с отрицательным контролем добавляют только не содержащую сыворотку ЭМЕМ с 0,1% В8Л; в лунки с положительным контролем добавляют лиганд, но не добавляют тестируемое соединение. Тестируемые соединения готовят в не содержащей сыворотку ЭМЕМ с лигандом в 96-луночном планшете и серийно разводят с получением 7 тестируемых концентраций.

4. После 18 ч активации лигандом, добавляют разведенный ВгбИ меченный реагент (1:100 в ЭМЕМ, 0,1% В8Л), и клетки инкубируют с ВгбИ (конечная концентрация = 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

5. После инкубирования с меченым реагентом среду удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют ИхЭепа! раствор (50 мкл/лунку) и планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на шейкере для планшетов.

- 28 008137

6. Р1хОепа! раствор аккуратно удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют молоко (5% обезвоженное молоко в РВ8, 200 мкл/лунку) в качестве блокирующего раствора и планшеты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре на шейкере для планшетов.

7. Блокирующий раствор удаляют декантацией, и клетки промывают один раз РВ8. Добавляют анти-Вга-и-РОП раствор (разведение 1:200 в РВ8, 1% В8Л) (50 мкг/лунку) и планшет инкубируют в течение 90 мин при комнатной температуре на шейкере для планшетов.

8. Конъюгат антител аккуратно удаляют декантацией и ополаскиванием лунок РВ8 5 раз и планшет сушат путем переворачивания и постукивания по бумажной салфетке.

9. Добавляют раствор ТМВ субстрата (100 мкг/лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на шейкере для планшетов, пока проявление цвета не станет достаточным для фотометрического определения.

10. Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойная длина волны со считыванием через фильтр при 490 нм в качестве длины волны сравнения) на Оупа1ее11 ЕЬ18Л считывающем устройстве для планшетов.

Анализ ЕСР-индуцированного ΒιΌϋ включения

Материалы и реагенты:

1. Мышиный ЕСР, 201 (ТоуоЬо Со., На., Япония).

2. 3Е3/Е6РВс7.

Анализ ЕСР-индуцированного Нег-2-управляемого ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

1. Мышиный ЕСР, 201 (ТоуоЬо Со., На., Япония).

2. 3Е3/Е6Рг/Нег2/Е6Рг (ЕСРг с Нег-2 киназным доменом).

Анализ ЕСР-индуцированного Нег-4-управляемого ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

1. Мышиный ЕСР, 201 (ТоуоЬо Со., Ма., Япония).

2. 3Е3/Е6Рг/Нег4/Е6Рг (ЕСРг с Нег-4 киназным доменом).

Анализ РБСР-индуцированного ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

3. Человеческий РЭСЕ В/В (ВоеЬппдег МаппРет, Германия).

4. 3Т3/Е6РВс7.

Анализ РБР-индуцированного ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

5. Человеческий ЕСЕ2/ЬЕСЕ (С1Ьсо ВВЬ, США).

6. 3Т3с7/ЕСРг.

Анализ 1СР1-индуцированного ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

7. Человеческий, рекомбинантный (С511, Рготеда Согр., США).

8. 3Т3/ЮР1Г.

Анализ инсулин-индуцированного ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

1. Цинк-инсулин, кристаллический, бычий (13007 С1Ьсо ВРЬ, США).

2. 3Т3/Н25.

Анализ НСР-индуцированного ΒΓάϋ включения

Материалы и реагенты:

1. Рекомбинантный человеческий НСР (Са!. Ыо. 249-НС, Β&Ό 5>у81ет8. 1пс. США).

2. ВхРС-3 клетки (АТСС СВЬ-1687).

Методика:

1. Клетки засеивают в количестве 9000 клеток/лунку в КРМ1 10% РВ8 в 96-луночном планшете. Клетки инкубируют в течение ночи при 37°С в 5% СО₂.

2. Через 24 ч клетки промывают РВ8, а затем их держат без сыворотки в 100 мкл не содержащей сыворотку среде (ВРМ1 с 0,1% В8А) в течение 24 ч.

3. На день 3 к клеткам добавляют 25 мкл, содержащие лиганд (приготовленный в концентрации 1 мкг/мл в КРМ1 с 0,1% В8А; конечная концентрация НСР составляет 200 нг/мл) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только 25 мкл не содержащей сыворотку КРМ1 с 0,1% В8А; в лунки с положительным контролем добавляют лиганд (НСР), но не добавляют тестируемое соединение. Тестируемые соединения готовят в их 5-кратной конечной концентрации в не содержащей сыворотку КРМ1 с лигандом в 96-луночном планшете и серийно разводят с получением 7 тестируемых концентраций. Обычно самая высокая конечная концентрация тестируемого соединения составляет 100 мкМ, и используют разведения 1:3 (т.е. интервал конечных концентраций тестируемых соединений составляет 0,137-100 мкМ).

4. После 18 ч активации лигандом в каждую лунку добавляют 12,5 мкл разведенного Вгаи меченно

- 29 008137 го реагента (1:100 в КГМГ 0,1% В8А) и клетки инкубируют с ВгбИ (конечная концентрация составляет 10 мкМ) в течение 1 ч.

5. Так же, как в общей методике.

6. Так же, как в общей методике.

7. Блокирующий раствор удаляют декантацией, и лунки промывают один раз ΡВ8. Добавляют антиВгб-И-ΡΟΌ раствор (разведение 1:100 в ΡВ8, 1% В8А) (100 мкг/лунку) и планшет инкубируют в течение 90 мин при комнатной температуре на шейкере для планшетов.

8. Так же, как в общей методике.

9. Так же, как в общей методике.

10. Так же, как в общей методике.

Анализ Ηυν-ЕС-С

Этот анализ используется для измерения активности соединения по отношению к ΡΌΘΡ-К, ΡΘΡ-К, ΥΈΘΡ, аΡΘΡ или Ρ1к-1/К^Κ, которые все естественно экспрессируются НИУ-ЕС клетками.

День 0

1. Промывают и трипсинизируют НИУ-ЕС-С клетки (эндотелиальные клетки пупочной вены человека, Американская коллекция типовых культур, каталожный № 1730 СКИ). Промывают фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко (О-₽В8, приобретенным у Θίό^ ВКЬ, каталожный № 14190-029) 2 раза в количестве примерно 1 мл/10 см² культурального флакона. Трипсинизируют 0,05%-ным трипсин-ЕЭТА в неферментном растворе для диссоциации клеток (81дта СНет1са1 Сотрапу, каталожный № С-1544). 0,05% трипсин готовят путем разведения 0,25% трипсина/1 мМ ЕЭТА ^Ьсо, каталожный № 25200-049) в растворе для диссоциации клеток. Трипсинизируют примерно 1 мл/25-30 см² культурального флакона в течение примерно 5 мин при 37°С. После отсоединения клеток от флакона добавляют равный объем аналитической среды и переносят в стерильную центрифужную пробирку емкостью 50 мл (ЫкНег 8с1епййс, каталожный № 05-539-6).

2. Промывают клетки примерно 35 мл аналитической среды в стерильной центрифужной пробирке емкостью 50 мл путем добавления этой аналитической среды, центрифугируют в течение 10 мин при приблизительно 200хд, отсасывают супернатант и ресуспендируют с 35 мл Ό-ΡΕ8. Повторяют промывание Ό-ΡΕ8 еще два раза, ресуспендируют клетки в примерно 1 мл аналитической среды/15 см² культурального флакона. Аналитическая среда состоит из среды Ρ12К Щ1Ьсо ВКЬ, каталожный № 21127-014) и 0,5% инактивированной фетальной бычьей сыворотки. Подсчитывают клетки на Сои1!ег Соип!ег® (Сои1!ег Е1ес!гошск, Шс.) и к этим клеткам добавляют аналитическую среду до получения концентрации 0,81,0х10⁵ клеток/мл.

3. Добавляют клетки в 96-луночные планшеты с плоским дном в количестве 100 мкл/лунку или 0,81,0х10⁴ клеток/лунку, инкубируют примерно 24 ч при 37°С, 5% СО₂.

День 1

1. Выполняют двукратные титрования тестируемого соединения в отдельных 96-луночных планшетах, обычно с 50 мкМ с понижением до 0 мкМ. Используют такую же аналитическую среду, как в день 0 на стадии 2 выше. Титрования выполняют путем добавления 90 мкл/лунку тестируемого соединения при 200 мкМ (4-кратная конечная концентрация в лунке) в верхнюю лунку индивидуальной колонки планшета. Поскольку исходная концентрация тестируемого соединения обычно составляет 20 мМ в ДМСО, лекарственное средство в концентрации 200 мкМ содержит 2% ДМСО.

Разбавитель, приготовленный для 2% ДМСО в аналитической среде ^12К+0,5% фетальной бычьей сыворотки), используют в качестве разбавителя для титрований тестируемых соединений, чтобы разбавлять тестируемое соединение, но поддерживать концентрацию ДМСО постоянной. Добавляют этот разбавитель в остальные лунки в колонке в количестве 60 мкл/лунку. Отбирают 60 мкл из 120 мкл 200 мкМ разведения тестируемого соединения в верхней лунке колонки и смешивают с 60 мкл во второй лунке колонки. Отбирают 60 мкл из этой лунки и смешивают с 60 мкл в третьей лунке данной колонки и так далее, пока двукратные титрования не будут окончены. После смешивания содержимого предпоследней лунки отбирают 60 мкл из 120 мкл этой лунки и их отбрасывают. Оставляют последнюю лунку с 60 мкл смеси ДМСО/среда-разбавитель в качестве контроля, не содержащего тестируемого соединения. Готовят 9 колонок титрованного тестируемого соединения, достаточных для лунок в трех повторах, каждая для: (1) νΉΘΡ (приобретенного у Берго ТесН Шсй., каталожный № 100-200, (2) фактора роста эндотелиальных клеток (ЕСΘΡ) (также известного как кислотный фактор роста фибробластов, или аΡΘΡ) (приобретенного у Воейгшдег МаппНеип Вюсйетка, каталожный № 1439 600), или (3) ΡΌΘΡ В/В человека (1276-956, Воейппдег ΜаииНе^т. Θе^тапу) и аналитической среды-контроля. ЕСΘΡ поступает в виде препарата с натрий-гепарином.

2. Переносят 50 мкл/лунку разведений тестируемого соединения в 96-луночные аналитические планшеты, содержащие 0,8-1,0х10⁴ клеток/100 мкл/лунку НИУ-ЕС-С клеток с дня 0 и инкубируют примерно 2 ч при 37°С, 5% СО₂.

3. В трех повторах добавляют 50 мкл/лунку 80 мкг/мл ΥΈΘΡ, 20 нг/мл ЕСΘΡ или среду-контроль к тестируемому соединению в каждом состоянии. Как и в случае тестируемых соединений концентрации факторов роста в 4 раза больше требуемой конечной концентрации. Используют аналитическую среду со

- 30 008137 стадии 2 дня 0 для приготовления концентраций факторов роста. Инкубируют приблизительно 24 ч при 37°С, 5% СО₂. В каждой лунке будет 50 мкл разведения тестируемого соединения, 50 мкл фактора роста или среды и 100 мкл клеток, что составляет в сумме 200 мкл/лунку. Таким образом, 4-кратные концентрации тестируемого соединения и факторов роста становятся 1-кратными, как только их добавят в лунки.

День 2

1. Добавляют ³Н-тимидин (АтегзРат, каталожный № ТКК-686) в количестве 1 мкКи/лунку (10 мкл/лунку 100 мкКи/мл раствора в среде ΚΡΜΙ + 10% инактивированная нагреванием сыворотка плода коровы) и инкубируют примерно 24 ч при 37°С, 5% СО₂. ΚΡΜΙ приобретают у (',ΗΙκο ВКБ, каталожный № 11875-051.

День 3

1. Замораживают планшеты в течение ночи при -20°С.

День 4

1. Размораживают планшеты и собирают при помощи харвестера для 96-луночных планшетов (^т!^ Нагуе'81ег 96®) на фильтровальные маты (\\а11ас, каталожный № 1205-401), считывают импульсы на жидкостном сцинтилляционном счетчике \\'а11ас Ве1ар1а1е™.

В табл. 2 приведены результаты биологических испытаний 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80). Результаты представлены в виде 1С₅₀, причем тестировали микромолярную (мкМ) концентрацию соединения, которая вызывает 50% изменение активности РТК-мишени по сравнению с активностью РТК в контроле, к которому тестируемое соединение не было добавлено. Конкретно, представленные результаты указывают концентрацию тестируемого соединения, необходимую, чтобы вызвать 50% снижение активности РТК-мишени. Биоанализы, которые были использованы или которые можно использовать для оценки этого соединения, подробно описаны ниже.

Таблица 2

Пример	био ЯкСЗТ 1С50 (мкМ)	био Р6РК1 1С5о (мкМ)	био ΡϋΘΡ 1С50 (мкМ)	био ЕСР Юбо (мкМ)	клеточный ΕΘΡ 1С50 (мкМ)	Нег2 киназы 1С50 (мкМ)	сбк28ра С50 (мкМ)	био рук2 1С50 (мкМ)
80	0,13	4,29	0,001	>100		50,19	17,19	0,28

Ιη νίνο животные модели

Животные модели ксенотрансплантата

Способность опухолей человека расти как ксенотрансплантаты у бестимусных мышей (например Ва1Ь/с, пи/пи) обеспечивает пригодную ΐη νίνο модель для исследования биологического ответа на терапевтические средства для человеческих опухолей. Со времени первой успешной ксенотрансплантации человеческих опухолей в бестимусных мышей (Кудаагд апС Ρονί^η, 1969, Ас!а ΡηΐΙιοΙ. М1сгоЫа1. Зсапд. 77:758-760) много разных линий человеческих опухолевых клеток (например молочной железы, легочных, мочеполовых, желудочно-кишечных, головы и шеи, глиобластомы, костных и злокачественных меланом) было трансплантировано и успешно выращено на голых мышах. Следующие ниже анализы можно использовать для определения уровня активности, специфичности и воздействия различных ингибиторов протеинкиназ.

Для оценки ингибиторов протеинкиназ пригодны три основных типа анализов: клеточный/каталитический, клеточный/биологический и ΐη νίνο. Целью клеточных/каталитических анализов является определение воздействия 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида на способность ТК фосфорилировать тирозины на известном субстрате в клетке. Целью клеточных/биологических анализов является определение воздействия 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида на биологический ответ, стимулируемый ТК в клетке. Целью ΐη νίνο анализов является определение воздействия 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида в животной модели конкретного расстройства, такого как рак.

Подходящие клеточные линии для экспериментов по подкожной ксенотрансплантации включают клетки С6 (глиома, АТСС № ССБ 107), клетки А375 (меланома, АТСС № СКБ 1619), клетки А431 (эпидермоидная карцинома, АТСС № СКБ 1555), клетки Са1и 6 (легкое, АТСС № НТВ 56), клетки РС3 (простата, АТСС № СКБ 1435), клетки 8КОУ3ТР5 и фибробласты ΝΙΗ 3Т3, сконструированные методом генной инженерии для сверхэкспресии ЕОРК, ΡΌΟΡΚ, ЮР-1К или любой другой тестируемой киназы. Для осуществления экспериментов по ксенотрансплантации можно использовать следующий протокол:

Самок бестимусных мышей (Ва1Ь/с, пи/пи) доставляют из 8^тοη8еη Ρίώοΐ'ίΐΙο^κ (О11гоу, СА). Всех животных содержат в условиях чистой комнаты в клетках Μ^с^ο^8ο1аΐο^ с подстилкой А1рРа-дп. Они по

- 31 008137 лучают стерильную пищу для грызунов и воду по своему желанию.

Клеточные линии выращивают в подходящей среде (например МЕМ, ЭМЕМ. Нат'8 Е10 или Нат'8 Е12 плюс 5-10% сыворотка плода коровы (ЕВ8) и 2 мМ глутамина (ΟΕΝ)). Все среды для культуры клетки, глутамин и сыворотку плода коровы приобретают у 61Ьсо ЫГс Тссйпо1ощс8 (Сгапй Ыапй, ΝΥ), если не указано иное. Все клетки выращивают во влажной атмосфере 90-95% воздуха и 5-10% СО₂ при 37°С. Все клеточные линии регулярно инокулируют два раза в неделю, и они отрицательны на микоплазму при определении методом Мусо1сс (61Ьсо).

Клетки собирают при или почти при конфлюэнтности 0,05% трипсин-ΕΌΤΑ и гранулируют при 450хд в течение 10 мин. Гранулы ресуспендируют в стерильном РВ8 или среде (без ЕВ8) до конкретной концентрации, и эти клетки имплантируют в заднюю боковую область мышей (8-10 мышей на группу, 210х10⁶ клеток/животное). Рост опухоли измеряют от 3 до 6 недель, используя штангенциркуль. Объемы опухолей рассчитывают как произведение длина х ширина х высота, если не указано иное. Значения Р вычисляют, используя ΐ-критерий Стьюдента. Тестируемое соединение 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид в 50-100 мкл эксципиента (ДМСО или УРО:Э5\У) можно доставлять путем в.б. (внутрибрюшинной) инъекции в различных концентрациях, обычно начиная с первого дня после имплантации.

Модель инвазии опухолей

Следующая модель инвазии опухолей была разработана, и ее можно использовать для оценки терапевтического значения и эффективности 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида, идентифицированного для селективного ингибирования ΚΌΒ/ΡΕΚ-1 рецептора.

Методика

В качестве экспериментальных животных используют голых мышей (самок) (8нпоп8сп 1пс.) возрастом восемь недель. Имплантацию опухолевых клеток можно осуществить в верх ламинарного потока. Для анестезии внутрибрюшинно вводят смесь ксилазин/кетамин (100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина). Делают срединный разрез для вскрытия брюшной полости (приблизительно 1,5 см длиной) для инъекции 10⁷ опухолевых клеток в объеме 100 мкл среды. Клетки инъецируют либо в дуоденальную долю поджелудочной железы, либо под серозную оболочку толстой кишки. Брюшину и мышцы зашивают непрерывным швом шелком 6-0 и кожу закрывают, используя зажимы для ран. За животными ежедневно наблюдают.

Анализ

Через 2-6 недель, в зависимости от суммарных наблюдений за животными, мышей умерщвляют и местные опухолевые метастазы в различные органы (легкое, печень, мозг, желудок, селезенка, сердце, мышцы) вырезают и анализируют (измерение размера опухоли, степень инвазии, иммунохимия, ΐη 8Йи определение гибридизации и так далее).

Анализ С-К1Т

Этот анализ используют для определения уровня с-кй фосфорилирования тирозина.

Клетки МО7Е (острая миелоидная лейкемия человека) выдерживали в условиях сывороточного голодания в течение ночи в 0,1% сыворотке. Перед стимуляцией лигандами клетки предварительно обрабатывали 5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил] -2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амидом (одновременно с сывороточным голодом). Клетки стимулировали 250 нг/мл тй-8СЕ (гй-фактор стволовых клеток) в течение 15 мин. После стимуляции клетки лизировали и иммунологически осаждали анти-с-кй антителом. Уровни фосфотирозина и белка определяли Вестернблоттингом.

Анализ МТТ пролиферации

Клетки МО7Е выдерживали в условиях сывароточного голода и предварительно обрабатывали 5-[5фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2диэтиламиноэтил)амидом, как описано для экспериментов по фосфорилированию. Клетки помещали в 96-луночный планшет в количестве 4x105 клеток/лунку, в 100 мкл ВРМ1+10% сыворотка. Добавляли гй8СЕ (100 нг/мл) и планшет инкубировали в течение 48 ч. Через 48 ч добавляли 10 мкл 5 мг/мл МТТ [3(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) и оставляли инкубироваться в течение 4 ч. Добавляли кислотный изопропанол (100 мкл 0,04 н НС1 в изопропаноле) и измеряли оптическую плотность при длине волны 550 нм.

Анализ апоптоза

Клетки МО7Е ±8СЕ и ±5-[5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид инкубировали в 10% ЕВ8 с гй-СМ-С8Е (10 нг/мл) и тй-1Ь-3 (10 нг/мл). Образцы анализировали через 24 и 48 ч. Для измерения активированной каспазы-3 образцы промывали РВ8 и проницаемость мембран нарушали ледяным 70% этанолом. Клетки затем окрашивали с РЕ-конъюгированной поликлональной кроличьей антиактивной каспазой-3 и анализировали при помощи ЕАС8 (активируемого флюоресценцией анализатора клеток). Для определения расщепленной РАВР (поли-АЭР(аденозиндифосфат)рибозилполимеразы) образцы лизировали и анализировали вестерн-блоттингом с использованием анти-РАВР антитела.

- 32 008137

Дополнительные анализы

Дополнительные анализы, которые можно использовать для оценки 5-[5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида, включают, без ограничения, Ь1о-Гк-1 анализ, анализ ЕСР рецептор-НЕВ2 химерного рецептора в целых клетках, Ью-1ск анализ и анализ, измеряющий фосфорилирующую функцию гаГ. Протоколы каждого из этих анализов можно найти в заявке на патент США серийный № 09/099842, который включен в данное описание изобретения ссылкой, включая любые графические материалы.

Измерение клеточной токсичности

Терапевтические соединения должны быть более сильнодействующими в ингибировании активности рецепторных тирозинкиназ, чем в оказании цитотоксического воздействия. Оценку эффективности и клеточной токсичности соединения можно получить путем определения терапевтического индекса, т.е. !С, /ЕО, -!С, , дозу, необходимую для достижения 50% ингибирования, можно определить, используя стандартные методики, такие как методики, описанные в данной заявке. ЬП₅₀, дозу, которая приводит к 50% летальности, также можно определить стандартными методами (Моззтап, 1983, 1. 1ттипо1. МеЕйобз., 65:55-63) путем измерения количества высвобожденной ЬЭН (лактатдегидрогеназы) (Ког/еше\\'зк| апб СаИе^аетЕ, 1983, 1. 1ттипо1. МеЕйобз, 64:313, Эескег апб Ьойтапп-МаЕЕйез, 1988, 1. 1ттипо1. МеЕйобз, 115:61) или путем определения летальной дозы в животных моделях. Предпочтительными являются соединения с большим терапевтическим индексом. Терапевтический индекс должен быть выше 2, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 50.

Б. Пример результатов клеточного анализа с использованием 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (Соединение 80).

Для подтверждения силы действия 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламино-этил)амида (соединение 80), определенной биохимическими анализами (см. ниже), способность указанного соединения ингибировать лигандзависимое ВТК фосфорилирование оценивали в анализах, основанных на клетках, используя клетки мыши ΝΙΗ 3Т3, сконструированные для сверхэкспрессии Р1к-1 или человеческого ΓΩΟΕΚβ. 5-(5-Фтор-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламино этил)амид (соединение 80) ингибировал УЕСР-зависимое Р1к-1 фосфорилирование тирозина со значением 1С₅₀ приблизительно 0,03 мкМ. Это значение соответствует значению К₁ 0,009 мкМ, определенному в отношении ингибирования Р1к-1 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амидом (соединение 80) в биохимических анализах. Это указывает на то, что 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) легко проникает в клетки. В соответствии с биохимическими данными (смотри ниже), указывающими на то, что 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) имеет сравнимую активность в отношении Р1к-1 и РЭСРВв, было обнаружено также, что это соединение ингибирует РЭСР-зависимое фосфорилирование рецепторов в клетках со значением 1С₅₀ приблизительно 0,03 мкМ. Способность 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) ингибировать ск1Е, близкородственный ВТК, который связывает фактор стволовых клеток (8СР), определяли, используя клетки МО7Е, которые экспрессируют этот рецептор. В этих клетках 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибировал 8СР-зависимое с-к1Е фосфорилирование со значением 1С₅₀ 0,010,1 мкМ. Это соединение также ингибировало 8СР-стимулированнное с-к1Е фосфорилирование в бластах острой миелоидной лейкемии (АМЬ), выделенных из периферической крови пациентов.

В дополнение к испытанию на способность 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) ингибировать лиганд-зависимое фосфорилирование рецепторов в клетках, также исследовали ш ν 1Его его воздействие на лиганд-зависимый пролиферативный ответ клеток (см. табл. 4). В этих исследованиях в клетках, переведенных в пассивное состояние в результате сывороточного голодания в течение ночи, индуцировали синтез ДНК при добавлении подходящего митогенного лиганда. Как показано в табл. 3, 5-(5-фтор-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламино этил)амид (соединение 80) ингибировал РЭСР-индуцированную пролиферацию клеток МН-3Т3, сверхэкспрессирующих РЭСРВв или РЭСРВа со значениями 1С₅₀ 0,031 и 0,069 мкМ соответственно, и 8СРиндуцированную пролиферацию клеток МО7Е со значением 1С₅₀ 0,007 мкМ.

- 33 008137

Таблица 3

Биохимический Клеточная 1С₅о

Рецептор	К,' (мкМ)	Фосфорилирование рецептора (мкМ)	Лиганд-зависимая пролиферация (мкМ)
Пк-1/ΚϋΒ	0,009	0,032	0,0043
ΡϋΟΕΚα	0,008	0,034	0,0314
ΡϋΘΕΚβ	Νϋ	Νϋ	0,0695
ΕΘΕΡ	0,83	Νϋ	“от3
с-кИ	Νϋ	0,01-0,16	0,007е

N0 = Не определен ¹ Определен с использованием рекомбинантного фермента ²Определен с использованием сывороточно-голодавших клеток МН-3Т3, экспрессирующих Р1к-1 ³Определен с использованием сывороточно-голодавших НиУЕСз ⁴Определен с использованием сывороточно-голодавших клеток МН-3Т3, экспрессирующих РЭОРК ⁵Определен с использованием сывороточно-голодавших клеток МН-3Т3, экспрессирующих РЭОРК ⁶ Определен с использованием сывороточно-голодавших клеток МО7Е

Как показано в табл. 3, наблюдается общее соответствие между биохимическими и клеточными активностями 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80), подтверждающее вывод, что это соединение проходит сквозь клеточные мембраны. Можно также сделать вывод, что клеточные ответы являются результатом активности соединения 80 в отношении указанной мишени. Наоборот, при испытании в присутствии полной среды роста т νίΐΐΌ требовались значительно более высокие концентрации 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) (более 10 мкМ) для ингибирования роста различных человеческих опухолевых клеток (см. табл. 4). Это указывает на то, что данное соединение не прямо ингибирует рост этих клеток в концентрациях, требуемых для ингибирования лиганд-зависимого фосфорилирования рецепторов и клеточной пролиферации.

Таблица 4

Линия клеток	Происхождение	Ю50 (мкМ)	Ю50 (мкМ)
НТ29	Карцинома прямой кишки	10	22
А549	Карцинома легкого	9,5	22
ΝΟΙ-Η460	N80 карцинома легкого	8,9	20
8Е767Т	Глиома	7,9	14
А431	Эпидермоидная карцинома	6,0	18

Кратко, результаты, представленные в табл. 4, были получены путем инкубирования клеток в течение 48 ч в полной среде для роста в присутствии серийных разведений 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида. В конце периода роста определяли относительное количество клеток. Значения [С₅₀ вычисляли как концентрацию соединения, которая ингибирует рост клеток на 50% относительно необработанных клеток. Значения КО₅₀ вычисляли как концентрацию соединения, которая вызывает 50% сокращение количества клеток относительно количества клеток в начале эксперимента.

Более релевантным, основанным на клетках анализом для оценки антиангиогенного потенциала 5(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2диэтиламиноэтил) амида (соединение 80) является ш νίΐΐΌ анализ митогенеза с использованием эндотелиальных клеток пупочной вены человека (НЦУЕСз) в качестве модельной системы пролиферации эндотелиальных клеток, критической для ангиогенного процесса. В этом анализе митогенный ответ, измеряемый как увеличение синтеза ДНК, индуцируется в сывороточно-голодавших НЦУЕСз при добавлении УЕОР или РОР. В этих клетках 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибирует УЕОР- и РОРиндуцированный митогенный ответ дозозависимым образом со значениями [С₅₀ 0,004 и 0,7 мкМ соответственно, когда соединение присутствовало на всем протяжении 48-часового анализа.

Кратко, приведенные выше результаты были получены с использованием сывороточно-голодавших НиУЕСз, которые инкубировали с митогенными концентрациями УЕОР (100 нг/мл) или РОР (30 нг/мл)

- 34 008137 в присутствии серийных разведений 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) в течение 24 ч. Митогенный ответ в течение следующих 24 ч в присутствии лиганда и ингибитора количественно определяли путем измерения синтеза ДНК на основании включения бромдезоксиуридина в клеточную ДНК.

В отдельных экспериментах соединение 80 ингибировало УЕСЕ-зависимое фосфорилирование ЕКК 1/2 (р42/44МАР киназы), ранней по нисходящей мишени Е1к-1/КЭК, дозозависимым способом. Также было показано, что ингибирующее действие соединения 80 в этой системе длится долго с ингибированием УЕСЕ-зависимого фосфорилирования ЕКК 1/2 в течение 48 ч после удаления 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты (2-диэтиламино этил)амида (соединение 80) из среды после короткого (2 ч) воздействия микромолярных концентраций этого соединения.

УЕСЕ признан важным фактором выживания эндотелиальных клеток. Так как 5-(5-фтор-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибирует УЕСЕ-зависимый митогенный ответ НИУЕСк, исследовали воздействие данного соединения на выживание НИУЕС. В этих экспериментах в качестве показателей апоптоза использовали расщепление субстрата каспазы 3 поли-АИР-рибозилполимеразы (РАКР). НИУЕСк, культивированные в отсутствие сыворотки в течение 24 ч, имели значительные уровни расщепления РАКР, определенные путем аккумуляции 23 кДа фрагмента РАКР расщепления. Этому в значительной степени мешало добавление УЕСЕ к клеточной среде, указывая на то, что УЕСЕ действует как фактор выживания в данном анализе. Было показано, что 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибирует КОК сигнализацию. Следовательно, 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибирует УЕСЕопосредованное НИУЕС выживание дозозависимым образом. Таким образом, эти данные показывают, что соединение 80 индуцирует апоптоз в эндотелиальных клетках в культуре в присутствии УЕСЕ.

В. 1п νί\Ό исследования эффективности

1. Эффективность против установленных опухолевых ксенотрансплантатов

1п νί\Ό эффективность 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) исследовали в моделях подкожного (8С) ксенотрансплантата с использованием клеток человеческой опухоли, имплантированных в заднюю боковую область бестимусных мышей. После имплантации опухолям давали возможность развиться до размера 100-550 мм³ до начала перорального лечения данным соединением.

Ежедневное пероральное введение соединения 80 вызывало дозозависимое ингибирование роста опухоли А431, когда лечение начинали после того, как опухоли вырастали до размера 400 мм³. Статистически значимое (Р<0,05) ингибирование роста опухоли наблюдалось при дозах 40 мг/кг/сутки (74% ингибирование) и 80 мг/кг/сутки (84% ингибирование) (см. табл. 6). В предварительных экспериментах более высокая (160 мг/кг/сутки) доза соединения не была более эффективной против установленных опухолей А431 по сравнению с дозой 80 мг/кг/сутки. Кроме того, мыши, которых лечили дозой 160 мг/кг/сутки, теряли вес, что указывает на то, что более высокие дозы также были не очень толерантными. Аналогичные результаты были получены в эксперименте, где опухолям А431 давали возможность достичь размера только 100 мм³ (см. табл. 4). В этом втором эксперименте полная регрессия опухолей произошла у шести из восьми животных при дозе 80 мг/кг/сутки в течение 21 суток. У этих шести животных опухоли не возобновляли рост в течение 110-дневного периода наблюдения после окончания лечения. У двух животных, у которых опухоли выросли до большого размера (2000-3000 мм³), эти опухоли регрессировали в ответ на второй раунд лечения соединением 80. Важно, что во всех экспериментах на эффективность 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) в количестве 80 мг/кг/сутки был в высокой степени толерантным, даже при непрерывном введении в течение более 100 суток.

- 35 008137

Таблица 5

Начальный объем опухоли (мм3)	Соединение1 (мг/кг/сутки)	% ингибирования (сутки)	Р-значение
400	80	84 (36)	0,001
40	74 (36)	0,003
20	51 (36)	0,130
100	80	93 (40)	0,002
40	75 (40)	0,015
10	61 (40)	0,059

Соединение 80.

Кратко, результаты, представленные в табл. 5, были получены с использованием клеток А431 (0,5х10⁶ клеток/мышь), которые имплантировали подкожно в заднюю боковую область бестимусных мышей. Ежедневное пероральное введение 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80) в носителе на основе кремофора или носителя-контроля начинали, когда опухли достигали указанного среднего объема. Опухоли измеряли, используя штангенциркуль, и объем опухоли рассчитывали как произведение длина х ширина х высота. Р-значения вычисляли путем сравнения размера опухолей животных, которых лечили соединением 80 (п=8), с опухолями животных, которых лечили носителем (п=16), в последний день эксперимента, используя двусторонний !-критерий Стьюдента.

Эффективность соединения 80 против установленных человеческих опухолей различного происхождения определяли, используя ксенотрансплантаты Со1о205 (карцинома прямой кишки), ЗЕ763Т (глиома) и N0-4460 (немелкоклетоный рак легкого) (см. табл. 6). Эти эксперименты проводили с использованием 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амида (соединение 80), который вводили перорально в количестве 80 мг/кг/сутки - доза, которая была эффективной и в высокой степени толерантной.

Таблица 6

	Тип опухоли	Начальный объем опухоли (мм3)	% ингибирования (сутки)	Рзначение
А4311	Эпидермоидная	100	93 (40)	0,002
А4311	Эпидермоидная	400	84 (36)	0,001
Со1о205	Толстой кишки	370	77 (54)	0,028
N01- Н460	Легкого	300	61 (54)	0,003
8Е763Т	Глиома	550	53 (30)	0,001

Данные из эксперимента, представленного в табл. 5

В вышеупомянутых экспериментах соединение 80 вводили один раз в сутки в количестве 80 мг/кг/сутки в носителе на основе кремофора сразу после того, как опухоли достигали указанного размера. Процент ингибирования по сравнению с контрольной группой, которую лечили носителем, вычисляли по окончании экспериментов. Р-значения вычисляли путем сравнения размеров опухолей животных, которых лечили соединением, с размерами опухолей тех животных, которых лечили носителем, используя двусторонний !-критерий Стьюдента.

Хотя 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид (соединение 80) ингибировал рост всех типов опухолей, приведенных в табл. 7, существовало различие в ответе разных моделей ксенотрансплантации. Конкретно, рост опухолей ΝΟΉ640 и ЗЕ763Т приостанавливался или значительно замедлялся, а опухоли Со1о205, такие как опухоли Е431, регрессировали при лечении 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амидом.

Чтобы дать молекулярное обоснование различия в ответе между моделями ксенотрансплантации, исследовали опухоли ЗЕ763. Поэтому опухоли ЗЕ763, которые были менее чувствительными к лечению 5-(5-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2

- 36 008137 диэтиламиноэтил)амидом, оценивали на молекулярном уровне с использованием иммуногистологических методов определения эффекта лечения этим соединением. Эти исследования вначале проводили на опухолях 8Р763Т, так как опухоли этого типа сильно васкуляризированы микрососудами, которые интенсивно экспрессируют маркер эндотелиальных клеток С1)31, и, следовательно, хорошо подходят для исследований плотности микрососудов (МVI)) в опухолях. Иммуногистологическая оценка опухолей 8Р763 показала, что опухоли животных, которых лечили, имели пониженную \1\'1) по сравнению с контролями, которые лечили носителем, что согласуется с антиангиогенным механизмом действия соединения 80; \1\4) составила 24,2±4,1 у животных, которых лечили соединением 80, по сравнению с 39,3±5,7 у животных, которых лечили только носителем. Как и ожидалось от остановки связанного с этим роста опухоли, ярко выраженное ингибирование пролиферации опухолевых клеток было явным в опухолях, которые лечили соединением 80. Эти опухоли имели половинное значение митотического индекса от опухолей, которые лечили носителем (данные не приведены). Воздействие соединения 80 на \1\'1) и пролиферацию опухолевых клеток указывает на то, что соединение обладает сильным антиангиогенным и противоопухолевым эффектами, даже в условиях, когда опухоли не регрессируют.

Способность соединения 80 ингибировать фосфорилирование РЭОРК и последующую сигнализацию ΐπ у1уо оценивали также на опухолях 8Р763, которые экспрессировали высокие уровни РЭОРК8. Лечение опухолей 8Р763 соединением 80 сильно ингибировало фосфорилирование тирозина РЭОРКЗ в установленных опухолях 8Р763Т. Соединение 80 также снижало уровни фосфорилированной (активированной) фосфолипазы С гамма (РЬС-γ), непосредственного следующего по нисходящей индикатора активации РЭОРК. Эти данные показывают, что пероральное введение соединения 80 оказывает прямое воздействие на активность мишени (РЭОРК) в опухолях ш у1уо.

На основании того, что способность соединения 80 ингибировать νΈΘΡ-зависимую сигнализацию в Ни\ЕС8 ш νίΐΐΌ была продолжительной (см. выше), эффективность соединения оценивали, когда это соединение вводили в модель опухоли Со1о205 не часто. Как показано в табл. 7, 80 мг/кг (91% ингибирование) и 40 мг/кг/ (84% ингибирование) были эффективными при введении ежедневно, но не при введении два раза в неделю. Наоборот, более высокая доза соединения 80 (160 мг/кг) не ингибирует (52% ингибирование) рост укрепившихся опухолей Со1о205 при введении два раза в неделю, что позволяет предположить, что это соединение может продемонстрировать эффективность при нечастом введении в более высоких дозах. Следует отметить, что режимы дозирования может определить специалист в данной области техники без большего, чем необходимо экспериментирования.

Таблица 7

Доза (мг/кг)	Частота
160	Два раза в неделю
	Один раз в неделю
80	Ежедневно
	Два раза в неделю
	Один раз в неделю
40	Ежедневно
	Два раза в неделю

% ингибирования	Р-значение
52	0,085
17	N8
91	. 0,039
19	N8
0	N8
84	0,028
36	N8

N8: не значимо (Р>0,05)

Кратко, результаты, представленные в табл. 7, были получены с использованием клеток Со1о205 (0,5х10⁶ клеток/мышь), которые имплантировали подкожно в заднюю боковую область бестимусных мышей. Пероральное введение соединения 80 в соответствии с указанной схемой начинали, когда опухоли достигали размера 400 мм³. Опухоли измеряли штангенциркулем и объем опухолей вычисляли как произведение длина х ширина х высота. Р-значения вычисляли путем сравнения размера опухолей у животных, которых лечили соединением 80, с опухолями животных, которых лечили носителем, в последний день эксперимента, используя двусторонний ΐ-критерий Стьюдента.

2. Эффективность соединения 80 в модели диссеминированного заболевания

В дополнение к поддержанию непрерывного роста солидных первичных опухолей, ангиогенез также является существенным компонентом, поддерживающим развитие диссеминированного заболевания

- 37 008137 в результате метастазирования из первичной опухоли. Воздействие соединения 80 на развитие диссеминированного заболевания исследовали в мышиной модели колонизации меланомы легкого В16-Р1. В этой модели клетки В16-Р1, инокулированные внутривенно через хвостовую вену бестимусных мышей, колонизируют легкие и образуют опухоли. Как показано в табл. 7, пероральное введение соединения 80 в количестве 80 мг/кг/сутки эффективно снижает содержание клеток В16-Р1 в легком, как это оценено путем измерения общей массы легкого. Эти данные показывают, что соединение 80 может ингибировать диссеминированное заболевание т у1уо.

Таблица 8

	Масса легкого (г)	% ингибирования	Р-значение
Носитель	0,83±0,07	-	-
Соединение1	0,41±0,04 .	50	<0,001
Соединение 80

Кратко, результаты, представленные в табл. 8, были получены с использованием бестимусных мышей, которым инокулировали опухолевые клетки В16-Р1 (5х10⁵ клеток/мышь) через хвостовую вену. Мышей лечили ежедневно перорально вводимым соединением 80 в количестве 80 мг/кг/сутки (п=10) или носителем (п=18) в течение 24 суток после инокуляции опухолевых клеток. В конце периода лечения мышей умерщвляли и их легкие извлекали и взвешивали. Процент ингибирования вычисляли путем сравнения массы легких тех животных, которых лечили соединением 80, с массой легких животных, которых лечили только носителем. Р-значения определяли, используя двусторонний !-критерий Стьюдента.

II. Ингибиторы СОХ-2

Способность ингибиторов СОХ-2 замедлять рост опухолей испытывали, используя легочную модель Льюиса, описанную ниже.

Мышам делали подкожные инъекции в левую лапу (1х10⁶ опухолевых клеток, суспендированных в 30% Матригель) и объем опухоли оценивали, используя плетизмометр, два раза в неделю в течение 30-60 дней. Кровь брали дважды в течение эксперимента по 24-часовому протоколу для оценки концентрации в плазме и общего воздействия анализом АиС (площади под кривой). Данные выражают как среднее ± 8ЕМ (стандартная ошибка среднего). Тесты Стьюдента и Манн-Витнея применяли для оценки различий между средними значениями, используя пакет программного обеспечения 1п8!а!. Целекоксиб, даваемый с пищей в дозах между 160-3200 м.д. (миллионные доли), удерживал рост этих опухолей. Ингибирующее воздействие целекоксиба было дозозависимым и находилось в пределах от 4 до 85% по сравнению с контрольными опухолями. Анализ легочного метастазирования выполняли у всех животных путем подсчета метастазов в стереомикроскопе и путем гистохимического анализа соседних участков легкого. Целекоксиб не воздействует на легочное метастазирование в более низкой дозе 160 м.д., однако поверхностное метастазирование снижались более чем на 50%, когда его вводили в дозах 480-3200 м.д. Кроме того, гистопатологический анализ выявил, что целекоксиб дозозависимым образом уменьшает размер метастатических поражений в легком.

2. Модель НТ-20

Мышам делали подкожные инъекции в левую лапу (1х10⁶ опухолевых клеток, суспендированных в 30% Матригель), и объем опухоли оценивали, используя плетизмометр, дважды в неделю в течение 3060 дней. Имплантация раковых клеток толстой кишки человека (НТ-29) голым мышам порождает опухоли, которые достигают 0,6-2 мл за 30-50 суток. Кровь берут два раза в ходе эксперимента по 24-часовому протоколу для оценки концентрации в плазме и общего воздействия анализом АиС. Данные выражают как среднее ± 8ЕМ. Тесты Стьюдента и Манн-Витнея использовали для оценки различий между средними значениями, используя пакет программного обеспечения 1п8!а!.

А. Мышей, инъецированных раковыми клетками НТ-29, лечили цитоксином внутрибрюшинно в дозах 50 мг/кг на день 5, 7 и 9 в присутствии или в отсутствие целекоксиба в пище. Эффективность обоих агентов оценивали путем измерения объема опухоли. Лечение с использованием родственного целекоксибу ингибитора СОХ-2 (8С-58236) уменьшало объем опухоли на 89%. В таком же анализе индометацин, который вводили в почти максимально толерантной дозе 2 мг/кг/сутки с питьевой водой, ингибировал образование опухоли на 77%. Более того, селективный ингибитор СОХ-2 полностью ингибировал образование легочных метастазов, тогда как неселективный Ν8ΛΙΙ) (нестероидное противовоспалительное средство) индометацин был неэффективным. Результаты этих исследований показывают, что целекоксиб, вводимый с пищей имеющим опухоль мышам, может задерживать рост опухолей и метастазирование при введении в качестве единственного терапевтического средства. Кроме того, положительный результат наблюдался, когда целекоксиб вводят в комбинации с цитотоксическим агентом, таким как циклофосфамид.

Б. Во втором анализе мышей, которым инъекцировали клетки рака толстой кишки НТ-29, лечили целекоксибом (10, 40 или 160 м.д.) в пище, начиная с дня 10. Наблюдали приблизительно дозозависимый эффект (табл. 9).

- 38 008137

Таблица 9. Ингибирование целекоксибом карциномы толстой кишки человека НТ-29

Дни	Носитель	10 м. д.	40 м. д.	160 м. д.
14	0,114	0,124	0,125	0,120
22	0,25	0,25	0,19	0,14
оо	л Λς	Л ОК	Л 07	Л 0-1
	ν ,-г*-/	V ,	ν,Λ. 1	ν,ί- 1
35	0,79	0,57	0,4	0,3
42	1,38	0,89	0,68	0,49
50	1,9	1.49	1,04	0,8

Объем (мл)

III. 1п ν^νο анализы с использованием протеинкиназ в комбинации с селективным ингибитором циклооксигеназы-2 для лечения рака.

Способность ингибитора протеинкиназы сдерживать рост опухолей в комбинации с селективным ингибитором СОХ-2 можно испытывать в модели ксенотрансплантата 1483, описанной ниже.

Ксенотрансплантат 1483 представляет собой животный ксенотрансплантат, который моделирует эпителиальный рак человека, экспрессирующий циклооксигеназу-2 (СОХ-2) в опухолевых клетках и в сосудистой сети.

Модель ксенотрансплантата человеческой опухоли сквамозно-клеточной карциномы головы и шеи голых мышей (клеточная линия 1483), которая экспрессирует СОХ-2 в опухолевых клетках и в сосудистой сети, аналогична человеческому эпителиальному раку. Авторы полагают, что эта модель представляет собой человеческий эпителиальный рак и должна быть хорошей моделью для корреляции эффективности противораковых лекарственных средств, включая СОХ-2 ингибиторы, с эффективностью у людей.

Материалы и методы:

Культура клеток:

Клетки 1483 сквамозно-клеточной карциномы шеи и головы человека (Н^СС) хранят в замороженных виалах, содержащих 3х10⁶ клеток, 90% сыворотку пода коровы (РВ8) и 10% диметилсульфоксид (ДМСО). Берут замороженный виал и быстро размораживают при 37°С и помещают во флакон Т-162 см² (Согшпд), содержащий среду Э-МЕМ/Р12 (ОтЬсоВКЕ) с 15 мМ НЕРЕ8 буфером, Р-глутамином, пиридоксина гидрохлоридом и 10% РВ8. Клетки выращивают в инкубаторе с 5% СО₂ и температурой 37°С. Среду меняют каждый день и клетки пассируют при конфлюэнтности 80-90%. Для пассирования клеток флакон промывают 10 мл фосфатного буферного солевого раствора (РВ8), отсасывают и добавляют 2 мл трипсин/ЕОТА (0,25%/1 мМ, ОЛсоВКЕ), помещают обратно в инкубатор, через 5 мин клетки отсоединяются. Добавляют 8 мл указанной выше среды к промывке флакона и переносят в стерильную центрифужную пробирку емкостью 50 мл. Добавляют 30 мл среды, смешивают, подсчитывают клетки, используя гемацитометр, и пассируют клетки в Т-162 см², вмещающий 3-4х10⁶ клеток.

Животная модель 1483:

Меняют среду за 24 ч до сбора клеток 1483 перед инъекцированием голым мышам. Трипсинизируют клетки 1483 как описано выше в разделе Культура клеток. Подсчитывают клетки и определяют количество клеток. Центрифугируют клетки при 1000 об./мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранулы клеток и объединяют их (если центрифужных пробирок емкостью 50 мл несколько) в одну центрифужную пробирку емкостью 50 мл с буферным солевым раствором Хэнкса (НВ88, ОАсоВКЕ) и центрифугируют как раньше. Следует иметь приблизительно на 25% клеток больше, чем реально требуется для инъекции, чтобы иметь лишние клетки. Если делают инъекции 72 мышам и имеется 100х10⁶ клеток, все эти клетки готовят для инъекции мышам. Инъецируют клетки 1483 в количестве 1 х10⁶ клеток в 0,03 мл/мышь.

Инъецируют клетки с 30% Матригелем (Со11аЬога1^е В1отеЛса1 Рго8ис1з) и 70% НВ88. Ресуспендируют объединенные гранулы с 2,1 мл (70%) холодного НВ88, затем добавляют 0,9 мл (30%) размороженного разжиженного холодного Матригеля и хорошо смешивают на льду. Хранят этот клеточный препарат на льду все время до инъекции мышам. В этих исследованиях используют самцов голых мышей в возрасте 4-6 недель (Наг1еп). Анестезируют мышей, используя СО₂/О₂ газ, а затем делают им инъекцию в середину правой задней лапы, используя туберкулиновый шприц на 0,5 см³ (Вескегзоп & Эюкегзоп). Мышей взвешивают для определения массы тела на день инъекции (день 0) - исходной массы на начало исследования. Взвешивают мышей в день 7 и измеряют правую заднюю лапу для определения объема опухоли на лапе, используя плетизмометр (81ое11т§ Со.). Плетизмометр представляет собой прибор для измерения объема лапы путем вытеснения воды. Измеряют несколько левых неинъецированных лап и среднее для фонового измерения для вычитания из правой лапы, имеющей опухоль.

Животным дают тестируемые соединения в жевательной пище, когда размер опухолей достигает

- 39 008137

100-200 мкл, и продолжают давать пищу с соединением в течение всего исследования. Некоторым мышам дают только ингибитор протеинкиназы или селективный ингибитор циклооксигеназы-2. Некоторым мышам дают и ингибитор протеинкиназы, и селективный ингибитор циклооксигеназы-2 ежедневно в соответствующей дозе, определенной по результатам ίη νΐίΓο анализа.

Взвешивают и измеряют мышей на протяжении всего исследования в дни 7, 10, 14, 17, 21, 24 и 28. Лечение животных соединением можно начать в день 0 (профилактическое) или сразу после того, как только образуется опухоль, приблизительно в день 7 (терапевтическое). Примерно на день 30 мыши, которым давали носитель (контроль) будут иметь большие опухоли (примерно 1,0-1,5 мл) и начнут терять вес, и в это время животных, которым давали носитель, умерщвляют. Если в подвергнутых лечению группах ингибирование заметно, и их состояние здоровья хорошее, умерщвляют половину этой группы лечения, а половину подвергнутой лечению группы оставляют в живых для определения задержки роста опухоли.

Специалисту в данной области очевидно, что данное изобретение пригодно для выполнения задач и достижения целей и получения преимуществ, упомянутых, так же как и неотъемлемых, в данном описании изобретения. Молекулярные комплексы и способы, процедуры, обработки, молекулы, конкретные соединения, описанные в данной заявке, на данный момент являются иллюстративными и не предназначены ограничивать объем изобретения. Изменения и другие применения, которые будут иметь место у специалистов в данной области, которые охвачены замыслом данного изобретения, определены объемом формулы изобретения.

Специалисту в данной области очевидно, что можно вносить модификации в данное изобретение, раскрытое в данной заявке, не выходя за рамки объема и замысла данного изобретения.

Все патенты и публикации, упомянутые в материалах заявки, характеризуют уровень техники в области, к которой относится данное изобретение. Все патенты и публикации включены в данное описание изобретения ссылкой в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация была отдельно и конкретно указана, как включенная в данное описание изобретения ссылкой.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Способ лечения или предупреждения рака, при котором млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вводят терапевтически эффективное количество ингибитора протеинкиназы в комбинации с селективным ингибитором циклооксигеназы-2, где указанный ингибитор протеинкиназы представляет собой 5-[фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты или его фармацевтически приемлемую соль, и указанный селективный ингибитор циклооксигеназы-2 представляет собой 4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил]фенилсульфонамид (целекоксиб) формулы

   СР₃ или его фармацевтически приемлемую соль.