BG108622A

BG108622A - Комбинирана терапия за лечение на рак

Info

Publication number: BG108622A
Application number: BG108622A
Authority: BG
Inventors: Jaime Masferrer; Parul Doshi; Julie Cherrington
Original assignee: Sugen, Inc.; Pharmacia Corporation
Priority date: 2001-08-15
Filing date: 2004-03-08
Publication date: 2005-10-31
Also published as: EA008137B1; AU2002329744B2; ECSP045021A; PL368921A1; WO2003015608A2; HUP0500424A3; US20030216410A1; MA27060A1; CA2457745A1; OA12651A; TNSN04015A1; NZ530792A; IL159887A0; ATE414512T1; PE20030332A1; RS13204A; AR038957A1; JP2005501843A; GEP20063868B; ZA200400849B

Abstract

Изобретението се отнася до използване на инхибитори на протеинтирозинкиназа в комбинация с инхибитори на циклооксигеназа и по-специално на селективни инхибитори на циклооксигеназа-2, за получаване на лекарствено средство за лечение или профилактика на неоплазийни заболявания.

Description

КОМБИНИРАНА ТЕРАПИЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА РАК

Област на техниката

Изобретението се отнася до методи за лечение или профилактика на неоплазийни заболявания с използване на инхибитори на протеинтирозинкиназа в комбинация с инхибитори на циклооксигеназа, по-специално селективни инхибитори на циклооксигеназа-2.

Предшестващо състояние на техниката

Неоплазма или тумор е ненормална, нерегулирана и дезоргажтзирана пролиферация на клетъчно развитие. Неоплазмата е злокачествена или ракова, ако тя се характеризира с деструктивно развитие, инвазивност и метастаза. Инвазивността се отнася до локалното разпространение на неоплазма чрез инфилтрация или деструкция на заобикалящата тъкан, обикновено прониквайки през базалните ламини, които определят тъканните граници, като по този начин често навлиза в кръвоносната система на тялото. Метастаза обикновено се отнася до разсейването на туморни клетки по лимфатичните или кръвоносните съдове. Метастаза също се отнася до миграцията на туморни клетки чрез директна експанзия през лимфатични пространства или субарахноидни или други пространства. Посредством процеса на метастаза, миграцията на туморна клетка към други области на тялото създава неоплазми в области, които са отдалечени от мястото на първоначалното появяване.

Сега, ракът е втората причина, водеща до смърт в САЩ и над 8,000,000 души в САЩ са диагностицирани като болни от • · « · рак. През 1995 г ракът е представлявал 23.3% от всички смъртни случаи в САЩ. (Виж, U.S. Dept, of Health and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996-97 и Injury Chartbook 1 17 (1997)).

Ракът не е изучен напълно на молекулно ниво. Известно е, че излагането на клетка на въздействието на канцероген, такъв като някои вируси, някои химикали или облъчване, води до изменение на ДНК, което инактивира “супресорен” ген или активира “онкоген”. Супресорни гени са гени, регулиращи раз витието, които след мутация не могат да контролират повече клетъчното развитие. Онкогените са първоначално нормални гени (наречени проонкогени), които чрез мутация или изменен контекст на експресия стават трансформиращи гени. Продуктите на трансформиращите гени водят до ненормално клетъчно развитие. Повече от двадесет различни нормални клетъчни гена могат да се превърнат в онкогени чрез генно изменение. Трансформираните клетки се различават от нормалните клетки по много неща, включително клетъчна морфология, взаимодействия клетка с клетка, мембранно съдържание, цитоскелетна структура, протеинова секреция, генна експресия и смъртност (трансформираните клетки могат да се развиват неопределено).

Сега, ракът се лекува главно посредством една или комбинация от три типа терапии: хирургична, облъчване и химиотерапия. Хирургията включва значително отстраняване на болна тъкан. Докато хирургията е ефикасна понякога при от страняване на тумори, разположени на определени места, като например, в гърдата и кожата, тя не може да се приложи при лечението на тумори, разположени в други области, като • · • · « · гръбначния стълб, както и за лечението на разсеяни неопластични състояния, такива като левкемия.

Химиотерапията включва нарушаване на клетъчната реп ликация или клетъчния метаболизъм. Най-често се използва при лечението на рак на гърдата, на белия дроб или на тестикуларен рак.

Най-страшни са страничните ефекти на системната хи миотерапия, използвана за лечение на неопластично заболя ване при болни, подложени на лечение за рак. От тези нежелани ефекти гаденето и повръщането са най-честите и найсериозни странични ефекти. Други неблагоприятни странични ефекти са цитопения, инфекция, кахексия, възпаление на лигавицата при болни, получаващи високи дози химиотерапия с освобождаване на костен мозък или терапия чрез облъчване; алопеция (загуба на коса); кожни усложнения (виж, М. D. Abeloff, et al: Alopecia and Cutaneous Complications, стр. 75556. B Abeloff, M.D., Armitage, J.0., Lichter, A.S. и Niederhuber, J.E. (и др.) Clinical Oncology, Churchill Livingston, New York, 1992, за кожни реакции към химиотерапевтични средства), такива като пруритус, уртикария и ангиоедема (болест на Квинке); неврологични усложнения; белодробни и сърдечни усложнения при болни, получаващи облъчване или химиотерапия; и репродуктивни и ендокринни усложнения.

Предизвиканите от химиотерапията странични ефекти влияят значително върху качеството на живот на болния и могат драматично да повлияят върху съгласието на болния за прилагане на терапията.

Освен това, неприятните странични ефекти, свързани с химиотерапевтичните средства, се свеждат главно до токсичността, ограничаваща дозата (DLT) при прилагане на тези • · • · « · ···· ·· · ···· • ·· ··· · ··· ····· ···· ···· · · · • · ·· · · ·· ·» · лекарства. Така например, възпалението на лигавицата е една първостепенна токсичност, ограничаваща дозата при някои противоракови средства, включително антиметаболитни цитотоксични средства 5-FU, метотрексат и противотуморни антибиотици, като доксорубицин. Много от тези странични ефекти, причинени от химиотерапия, ако са силни, могат да доведат до хоспитализация или да изискват лечение с аналгетици за лекуване на болката.

Нежеланите странични ефекти, предизвикани от химиотерапевтични средства и от терапия чрез облъчване, са придобили основно значение за клиничното, лечение на болни от рак.

Понастоящем, учените се ориентират към третиране на рака с помощта на антиангиогенни средства. Предполага се, че ангиогенезата е механизмът, чрез който тумори получават необходимите хранителни вещества, за да се развиват и метастазират на други места в тялото. Антиангиогенните средства участват в тези процеси и разрушават или контролират туморите.

Така например, патент на САЩ № 5,854,205 се описва изолиран ендостатинон протеин, който е инхибитор на ендотелиална клетъчна пролиферация и ангиогенеза; в патент на

САЩ №

5,843,925 се описва метод за инхибиране на ангиогенеза и на ендотелиална клетъчна пролиферация с използване на 7-[заместен амино]-9-[(заместен глицилоамидо]-6-деметил

6-деокситетрациклин; в патент на САЩ № 5,861,372 се описва използването на съвкупност от ендотелиален инхибитор и ангиостатин и използването й за инхибиране на ангиогенеза; в PCT/GB97/00650 се описва използването на цинолинови производни за получаване на антиангиогенен и/или редуциращ

I

cancer

590, 1997;

• ·· ··· · · · · ····· ···· · · · · ·· · _ · · · · ···· · · · съдовата пропускливост, ефект; Tai-Ping, D. описва потенциални антиангиогенни терапии, виж, Trends Pharmacol. Sci. 16, N 2, 57-66, 1995; Lode, H et al. описва, че синергизъм между антиангиогенен интегрин алфа v антагонист и антитялоцитокин слят протеин премахва спонтанни туморни метастази, виж, Proc.Nat. Acad. Sci. USA., 96(4), 1591-1596, 1999; Giannis, A. et al. описва интегринови антагонисти и други нискомолекулни съединения като инхибитори на ангиогенеза, виж, New therapy. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36(6), 58897/41, 844 описва метод за използване на ангиостатични съединения за профилактика на реваскуларизация (образуване на нови съдове) при болни; WO 98/22,101 описва метод за използване на [пиразол-1-ил]бензенсулфонамиди като антиангиогенни средства; и патент на САЩ № 5,792,783 описва използване на 3хетероарил-2-индолинони, които са протеинкиназни инхибитори и антиангиогенни средства за лечение на различни ракови заболявания.

В последно време се съобщава, че лечението на колоректален рак със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2, по-точно Celecoxib®, в комбинация с инхибитор на ART-2, поконкретно Herceptin®, е по-ефикасно от това, при което се използва всяко средство самостоятелно. Следователно, има необходимост от откриване на нови комбинации от химиотерапевтични средства, които при съвместно използване са поефикасни, отколкото при самостоятелното им използване. Изобретението отговаря на тази необходимост.

• · • · · ·

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Един аспект на изобретението се отнася до метод за лечение или профилактика на ракови заболявания, включващ прилагане към бозайник, нуждаещ се от такова лечение на терапевтично ефективно количество от:

инхибитор на протеинкиназа с формула (I):

в която:

R е избран от групата, състояща се от водород, пиперазин-1 -илметил, 4-метилпиперазин-1 -илметил, пиперидин-1илметил, 2-хидроксиметилпиролидин-1 -илметил, 2-карбоксипи ролидин-1-илметил и пиролидин-1-илметил;

R¹ е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, циклоалкил, заместен циклоалкил, арил, хетероарил, хетероалициклен, хидрокси, алкокси, -C(O)NR⁸R⁹, -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵, -(CH₂)_rR¹⁶;

R² е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, циано, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -(CO)R¹⁵, арил, хетероарил и

-S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, арил, хетероарил, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴,

-NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ и -SO₂R¹⁹;

• · · « • · · · · · · • · · · · «··«· • · · · · · ·

R⁴ е избран от групата, състояща се от водород, халоген -NR¹³R¹⁴;

алкил, заместен алкил, хидрокси, алкокси и

R⁵ е заместен

R⁶ е заместен

R⁷ е заместен избран от групата алкил и -C(O)R¹⁰;

състояща се от водород, алкил, избран алкил и избран алкил, от групата, -C(O)R¹⁰;

от групата, арил, условие, че когато R⁶ и R⁷ е —C(O)R¹⁰;

или ата, състояща състояща се се от от хетероарил, -C(O)R¹⁷ водород, тогава заедно да образуват водород, алкил, водород и -C(O)R¹⁰, при алкил най-малко един от R⁵, група, избрана от грусъстояща се от -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, и — (СН₂)б,

R⁸ и

R⁹ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, _R1° алкил, заместен алкил и арил;

алкокси, е избран от групата, състояща се арилокси, -N(R¹¹)(anKnneH)_nR¹², като от хидрокси, алкиленовата група е заместена по желание с хидроксигрупа и

R¹¹ е избран от групата, състояща се от водород, алкил и заместен алкил;

от групата, състояща се от -NR¹³R¹⁴, хидарил, хетероарил, -N ⁺ (O)R¹³R

R¹² е избран рокси, -C(O)R¹⁵, -NHC(O)R¹⁸ (където R'^u е алкил, заместен ¹⁴, -N(OH)R¹³ и алкил, халолакил или аралкил);

R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил, нисш алкил, заместен с хидроксиалкиламино, цианоалкил, циклолакил, заместен циклоалкил, арил и хетероарил; или ¹⁴ могат заедно да образуват хетероцикло група;

R¹⁵ е избран от групата, състояща се от водород, хидрокси, алкокси и арилокси;

• ♦ • « · · • · · · · · · · · · · • · · · · · · · a · · « · « · “8“ ·· ·· · a « · е» ·

R¹⁶ е избран от групата, състояща се от хидрокси, -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ и -C(O)NR¹³R¹⁴;

R¹⁷ е избран от групата, състояща се от алкил, заместен алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

R¹⁹ е избран от групата, състояще се от алкил, заместен алкил, арил, аралкил, хетероарил или хетероалкил; и η и г са поотделно 1, 2, 3 или 4;

в комбинация с инхибитор на циклооксигеназа;

или негова фармацевтично приемлива сол.

За предпочитане, инхибиторът на протеинкиназа с формула (I) се използва в комбинация, със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2, избран от групата, състояща се от:

(i) съединение с формула (II):

_R1°a

G е избран от групата, състояща се от О, S, и -NR^a-, като R^a е водород или алкил;

R^10a е избран от групата, състояща се от водород и арил;

R^11a е избран от групата, състояща се от карбоксил, ал кил, аралкил, аминокарбонил, алкилсулфониламинокарбонил и алкоксикарбонил;

R^12a е избран от групата, състояща се от халолакил, алкил, аралкил, циклолакил и арил, по желание заместен с един или повече радикали, избрани от алкилтио, нитро и алкилсулфонил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани поотделно от групата, състояща се от водород, хало, алкил, аралкил, ал• · · »· • · · · · • · · · ·· • · · ·· • · ♦ · кокси, арилокси, хетероарилокси, аралкилокси, хетероаралкилокси, халоалкил, халоалкокси, алкиламино, ариламино, аралкиламино, хетероариламино, хетероарилалкиламино, нит ро, амино, аминосулфонил, алкиламиносулфонил, ариламино сулфонил, хетероариламиносулфонил, аралкиламиносулфонил, хетероаралкиламиносулфонил, хетероциклосулфонил, алкил сулфонил, хидроксиарилкарбонил, нитроарил, по желание заместен арил, по желание заместен хетероарил, аралкилкарбонил, хетероарилкарбонил, арилкарбонил, аминокарбонил и алкилкарбонил;

или R^13a заедно с пръстен

Е образува нафтилов пръстен;

или (Н) съединение с формула (III)

(III) в която:

А е избран от групата, състояща се от частично ненаситен или ненаситен хетероциклил и частично ненаситен или ненаситен карбоциклен пръстен;

избран от групата, състояща се от хетероциклил, циклоалкил , циклоалкенил и арил, като

R^1b е по желание заместен при заместваема позиция с един или повече радикали, избрани поотделно от алкил , халоалкил, циано, карбоксил, алкоксикарбонил, хидроксил, хидроксиалкил, халоалкокси, амино, алкиламино, ариламино нитро, алкоксиалкил, алкилсулфинил, хало, алкокси и алкилтио;

R^2b е избран от групата, състояща се от метил и амино; и

R^3b е избран от групата, състояща се от радикал, избран от Н, хало, алкил, алкенил, алкинил, оксо, циано, карбоксил, цианоалкил, хетероциклилокси, алкилокси, алкилтио, алкил карбонил, циклоалкил, арил, халоалкил, хетероциклил, цикло-

алкенил, аралкил, хетероциклилалкил, ацил, алкилтиоалкил, хидроксиалкил, алкоксикарбонил, арилкарбонил, аралкилкарбонил, аралкенил, алкоксиалкил, арилтиоалкил, арилоксиалкил, аралкилтиоалкил, аралкоксиалкил, алкоксиаралкоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонил, аминокарбонилалкил, алкиламинокарбонил, N-ариламинокарбонил, N-алкил-М-ариламинокарбонил, алкиламинокарбонилалкил, карбоксиалкил, алкиламино, N-ариламино, N-аралкиламино, N-алкилN-аралкиламино, N-алкил-М-ариламино, аминоалкил, алкиламиноалкил, N-ариламиноалкил, N-аралкиламиноалкил, N-алкил-Г\1-ариламиноалкил, N-алкил-М-аралкиламиноал кил, арилокси, аралкокси, арилтио, аралкилтио, алкилсулфинил, алкилсулфонил, аминосулфонил, алкиламиносулфонил, N-арил-аминосулфонил, арилсулфонил и N-алкил-М-ариламиносулфонил;

За предпочитане, горните съединения се прилагат като фармацевтичен състав, съдържащ едно или повече от горните съединения и фармацевтично приемлив пълнител. По-конкретно, терапевтичните средства съгласно изобретението могат да се формулират като отделни състави, които се дават в едно и също време или в различни времена, или терапевтичните средства могат да се дават като един отделен състав.

Методите съгласно изобретението са приложими за лечение или профилактика на неоплазии, включително акрален лентигинозен меланом, актинични кератози, аденокарцином,

44444· 4«

4444 44 ·444 ••44 · 4 44444 • *4 · · · 4 4 · · 4 4· 4 · •444 4444 444 · 44 ·4 44 ·44 аденокистозен карцином, аденоми, аденосарком, аденолюспест карцином, астроцитни тумори, карцином на бартолиновите жлези, базално-клетъчен рак, карциноми на бронхиалната жлеза, капилярна (неоплазия), карциноиди, карцином, карциносарком, кавернозна (неоплазия), холангиокарцином, хондосарком, хориоиден плексус папилом/карцином, светлоклетъчен рак, кистозен аденом, ендодермален синусен тумор,

ендометриална хиперплазия, ендометриален сарком, ендометриоиден аденокарцином, епендимална (неоплазия), епителоидна (неоплазия), сарком на Евинг, фиброламеларна неоплазия), фокална възлеста .хиперплазия, гастринома, герминоми, глиобластом, глюкагоном, ангиоглиоми, хемангиоендотелиом, хемангиоми, чернодробен аденом, чернодробна аденоматоза, хепатоцелуларен карцином, аденом на ларгенхансовите ост рови, интерепителиална неоплазия, интерепителиална плоско клетъчна неоплазия, инвазивен плоскоклетъчен карцином, едроклетъчен карцином, лейомиосарком, злокачествено лентиго, злокачествен меланом, злокачествени мезотелиални тумори, медулобластом, медулоепителиом, меланом, менингеална (неоплазия), мезотелиална (неоплазия), метастатичен карцином, слизеобразуващ плоскоклетъчен рак, невробластом, невроепителиален аденокарцином, нодуларен меланом, дребноклетъчен белодробен карцином, олигодендроглиома, остеосарком, панкреасна полипептидна неоплазия, папиларен серозен аденокарцином, пинеалоцитна неоплазия, хипофизни тумори, плазмацитом, псевдосарком, белодробен бластом, рак на бъбрека, ретинобластом, рабдомиосарком, сарком, серозен карцином, дребноклетъчен карцином, карциноми на мека тъкан, соматостатин-секретиращ тумор, плоскоклетъчен карцином, субмезотелиална (неоплазия), повърхностен меланом, • · ···· • · ·· · · · · · · ·

-12- _# j ··;· • · ·· ·· ·· ·· « недиференциран карцином, увеален меланом, верукозен карцином, випом, добре диференциран карцином и тумор на Уилм.

Методите съгласно изобретението имат едно или повече предимства. Едно от предимствата е, че съставите, средствата и терапиите съгласно изобретението се прилагат комбинирано в ниска доза, т.е., при доза, която е по-ниска от общоприетата използвана доза в клинични услония за всеки от отделните

компоненти, прилагани самостоятелно.

Предимството, свързано с по-ниското дозиране на съединенията, средствата и терапиите съгласно изобретението при прилагане към бозайник, включва и намаляване на честотата на неблагоприятните ефекти, свързани с прилагането на по-високи дози. Така например, понижаването на дозата на химиотерапевтично средство, като метотрексат, ще доведе до редуциране в честотата и остротата на гаденето и повръщането, в сравнение с наблюдаваните при по-високи дози. Подобни предимства се имат предвид, когато се използва инхибитор на протеинкиназа съгласно изобретението в комбинация с инхибитор на циклооксигеназа, по-специално на селективен инхибитор на циклооксигеназа-2.

Чрез ограничаване честотата на вредните ефекти се предвижда подобряване качеството на живот на болния, подложен на лечение на рак. Други предимства, свързани с намаляване на честотата на вредните ефекти, включват по-голяма склонност към съгласие на болния, намаляване броя на хоспитализациите, необходими за лечението на страничните ефекти и ограничаване прилагането на обезболяващи средства, необходими за облекчаване на болката, свързана със страничните вредни ефекти.

• · · · ·· ······· · · · · ····

- I ο - ···· · · · · ··· ·· · · · · · · · ·

Друго предимство, което се има предвид е, че инхибирането на туморите е по-силно, когато инхибитор на протеинкиназа се прилага в комбинация с инхибитор на циклооксигеназа, за предпочитане, селективен инхибитор на циклооксигеназа-2, в сравнение със самостоятелното прилагане на всяко от тези средства.

Изобретението се отнася и до китове, включващи инхиби тор на СОХ-2 и инхибитор на протеинкиназа с формула (I).

ПОДРОБНО

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Дефиниции

Ако не е казано изрично друго, следващите термини, използвани в описанието и претенциите, имат значенията, дадени по-долу:

“Алкил” се отнася до наситен алифатен въглеводороден радикал, включващ групи с права и до 20 въглеродни атома (когато е разклонена верига с от 1 даден цифров обхват, например, “1-20”, това означава тук, че групата, в случая алкило-

вата група, може да съдържа 1 въглероден атом, 2 въглеродни атома, 3 въглеродни атома и т.н. до, включително, 20 въглеродни атома). Алкилови групи, съдържащи от 1 до 4 въглеродни атома, се споменават като нисши алкилови групи. Кога то споменатите нисши алкилови групи не са заместени, те се споменават като нисши алкилови групи. За предпочитане, алкиловата група е със среден алкил, имащ от 1 до 10 въглеродни атома, например, метил, етил, пропил, 2-пропил, н.-бутил, изо-бутил, трет.-бутил, пентил и други. Още по-предпочитан е нисшият алкил с от 1 до 4 въглеродни атома, например, метил, етил, пропил, 2-пропил, н-бутил, изо-бутил или трет.-бутил и други.

г·

- 14 • · ·· • · · • ·· • · · • · ···· · · • · · · · · • · · · · · • · · ··· ·· “Заместен алкил” определена по-горе, е почитане от един до заместителя, избрани хало, една групи означава, че алкиловата заместена с един или група повече, , както е за предтри и още поотделно по-добре, от групата с един или два състояща се от хидрокси, нисш алкокси, арил, по желание заместен с или повече групи, за предпочитане една, две или три които са избрани независимо една от друга от хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, арилокси, по желание заместен с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи, които една от друга хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 6-членен хетероарил с от 1 до 3 азотни атома пръстена, въглеродите в пръстена са заместени по желание една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи, които означават поотделно хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 5-членен хетероарил с от 1 до 3 хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород или сяра, като въглеродът и азотните атоми в групата са заместени, по желание, с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи , които са независимо една от друга хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 5или 6-членна хетероалициклена група с от 1 до 3 хетероатома избрани от групата, състояща се от азот, кислород и сяра, въглеродните и азотните присъстват) атоми в групата са заместени, по желание, с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи , които са независимо една от друга, хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, меркапто (нисш алкил)тио, арилтио, по желание, заместен с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи, които са независимо една от друга, хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, циано, ацил, тиоацил, ♦· ··«·

- 15 • · · · ···· ·· · ·'· • · · · ·· · ·· • ·· ··· · ··· · • · · · ···· · · · « · ·

О-карбамил, N-карбамил, О-тиокарбамил, N-тиокарбамил, Самидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо,

R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- и -NR¹⁸R¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, нисш алкил, трихалометил, (С₃-С₆)циклолакил , нисш алкенил, нисш алкинил и арил, по желание заместени с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи, избрани независимо една от друга, от хало, хидрокси нисш алкил или нисш алкокси.

За предпочитане, алкиловата група е заместена с един или повече заместители, избрани независимо от групата , състояща се от хидрокси, 5или 6-членна хетероалициклена група с от

ДО 3 хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород и сяра, въглеродните и азотните (ако присъсатоми в групата са заместени, по желание, с една или повече групи, за предпочитане една две или три групи, които са независимо една от друга хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 5-членен хетероарил с от 1 до 3 хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород и сяра като въглеродните и азотните атоми в групата са заместени по желание, с една или повече групи , за предпочитане една, две или три групи, които са независимо една от друга хало хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси,

6-членен хетероарил с от 1 до 3 азотни атома в пръстена, въглеродите в пръстена са заместени, по желание, с една или повече групи, за предпочитане една, две или три групи, които са независимо една от друга -NR^1SR¹⁹, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, или където R¹⁸ и R¹⁹ са избрани поотделно от групата, хало, състояща се от водород, нисш алкил. Особено предпочитаната алкилова група е заместена с един или повече заместители, • · · · · · · · 9 · ·· • · · · · · · ·«« J /-> · · ·· ···94«·

-ΙΌ- ; :^#: :, ζ·::···· ·· · ·· · ·· които са независимо един от друг хидрокси, диметиламино, етиламино, диетиламино, дипропиламино, пиролидино, липеридино, морфолино, пиперазино, 4-нисшалкилпиперазино, фенил, имадазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, оксазолил, триазинил и други.

“Циклоалкил” се отнася до от 3- до 8-членен само въглеродна (карбоциклена) едноциклена пръстенна, само с въглеродни атоми 5-членна/6-членна или 6-членна/6-членна конден зирана двуциклена пръстенна или многоциклена кондензирана пръстенна (“кондензирана” пръстенна система означава, че всеки пръстен в системата притежава прилежаща двойка въглеродни атоми с всеки друг пръстен в системата) група, като един или повече пръстени могат да съдържат една или повече двойни връзки, но никой от пръстените няма напълно спретната пи-електронна система.

Примери, без да служат за ограничение, на циклоалкилови групи са циклопропан, циклобутан, циклопентан, циклопентен, циклохексан, циклохексадиен, адамантан, циклохептан, циклохептатриен и други.

“Зместен циклоалкил” означава циклоалкилова група, както е определена по-горе, заместена с един или повече, за предпочитане с един или два заместителя, поотделно избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, хало, хидрокси, нисш алкокси, арил, по желание, заместен с една или повече, за предпочитане една или две групи, които незаисимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, арилокси, по желание, заместен с една или повече, за предпочитане една или две групи, които независимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 6членен хетероарил с от 1 до 3 азотни атома в пръстена, като ·· ····

- 17 въглеродите в пръстена са заместени, по желание с една или повече, за предпочитане една или две групи, които независимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 5-членен хетероарил с от 1 до 3 хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород и сяра, въглеродните и азотните атоми в групата са заместени, по желание, с една или повече, за предпочитане една или две групи, които независимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, 5- или 6-членна хетероалициклена група с от 1 до 3 хетероатома, избрани от групата, състояща се от азот, кислород и сяра, като въглеродните и азотните (ако присъстват) атоми в групата са заместени по желание, с една или повече, за предпочитане една или две групи, които независимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, меркапто, (нисш алкил)тио, арилтио, по желание, заместен с една или повече, за предпочитане една или две групи, които независимо една от друга, са хало, хидрокси, нисш алкил или нисш алкокси, циано, ацил, тиоацил, О-карбамил, N-карбамил, О-тиокарбамил, N-тиокарбамил, С-амидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- и -NR¹⁸R¹⁹, които са определени по-горе.

“Алкенил” се отнася до нисша алкилова група, както е определена тук, състояща се от най-малко два въглеродни атома и най-малко една въглерод-въглерод двойна връзка. Представителни примери са (без да служат за ограничение) етенил, 1пропенил, 2-пропенил, 1-, 2-, или 3-бутенил и други.

“Алкинил” се отнася до нисша алкилова група, както е определена тук, състояща се от най-малко два въглеродни атома и най-малко една въглерод-въглерод тройна връзка. Предста···· ♦ · ·«99

9 9 9 ··

Π ······

-18- ··♦···· ^{1 u} ···»·· · · *v · вителни примери са (без да служат за ограничение) пропинил, 2-пропинил, 1-, 2-, или 3-бутинил и други.

“Арил” се отнася до само въглеродни едноциклени или с кондензирани пръстени полициклени (т.е., пръстени, които имат общи прилежащи двойки въглеродни атоми) групи с от 1 • · ···· етинил, до 12 въглеродни атома, които имат напълно спретната пиелектронна система. Примери, без да служат за ограничение, на арилови групи са фенил, нафталенил и антраценил. Ариловата група може да бъде заместена или незаместена. Когато е заместена, заместената(ите) група(и) е(са) за предпочитане една или повече, за предпочитане една, две или три, като особено се предпочита когато са една или две, поотделно избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, хало, хидрокси, нисш алкокси, меркапто (нисш алкил)тио, циано, ацил, тиоацил, О-карбамил, N-карбамил, О-тиокарбамил, N тиокарбамил, С-амидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R^1sS(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- и -NR¹⁸R¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ са, както са определни по-горе. За предпочитане, ариловата група е по желание заместена с един или два заместителя, поотделно избрани от хало, нисш алкил, трихалоалкил, хидрокси, меркапто, циано, N-амидо, моно- или диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероарил” се отнася до едноциклена или кондензирана пръстенна (т.е., пръстени, които имат обща прилежаща двойка атоми) група с от 5 до 12 пръстенни атома, съдържаща един, два или три пръстенни хетероатома, избрани от азот, кислород или сяра, като останалите пръстенни атоми са въглеродни и освен това, имат напълно спретната пи-електронна система. Примери, без да служат за ограничение, на незаместени хетероарилови групи са пиролова, фуранова, тиофенова, • · ♦ · имидазолова, оксазолова, тиазолова, пиразолова, пиридинова, пиримидинова, хинолинова, изохинолинова, пуринова и карбазолова. Хетероариловата група може да бъде заместена или незаместена. Когато е заместена, заместената(ите) група(и) е(са) за предпочитане една или повече, за предпочитане една, две или три, като особено се предпочита когато са една или две, поотделно избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, хало, хидрокси, нисш алкокси, меркапто (нисш алкил)тио, циано, ацил, тиоацил, О-карбамил, N-карбамил, О-тиокарбамил, N-тиокарбамил, С-амидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O),₂-, -C(O)OR¹⁸, R¹⁸C(O)O- и -NR¹⁸R¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ са, както са определни по-горе. За предпочитане, хетероариловата група е по желание заместена с един или два заместителя, поотделно избрани от хало, нисш алкил, трихалоалкил, хидрокси, меркапто, циано, N-амидо, моно- или диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероалициклен” се отнася до едноциклена или кондензирана пръстенна група, която има в пръстена(ите) от 5 до 9 пръстенни атома, от които един или два са хетероатоми, избрани от азот, кислород или S(O)_n (където η е цяло число от 0 до 2), като останалите пръстенни атоми са въглеродни. Пръстените могат да имат една или повече двойни връзки. Но, пръстените нямат напълно спретната пи-електронна система. Примери, без да служат за ограничение, на незаместени хетероалициклени групи са пиролидинова, пиперидинова, пиперазинова, морфолинова, тиоморфолинова, хомопиперазинова и други. Хетероалициклената група може да бъде заместена или незаместена. Когато е заместена, заместената(ите) група(и) е(са) за предпочитане една или повече, за предпочитане една,

-20- Σ Σ Σ Σ * Σ Σ · Σ * Σ Σ ’’Σ* ·· · · · · ·· ·· · две или три, като особено се предпочита когато са една или две, поотделно избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, хало, хидрокси, нисш алкокси, меркапто (нисш алкил)тио, циано, ацил, тиоацил, О-карбамил, N-карба' мил, О-тиокарбамил, N-тиокарбамил, С-амидо, N-амидо, нитро,

N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R¹⁸S(O)-, R¹⁸S(O)₂-, -C(O)OR¹⁸, ►

R¹⁸C(O)O- и -NR¹⁸R¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ са, както са определни по-горе. За предпочитане, хетероалициклената група е по желание заместена с един или два заместителя, поотделно избрани от хало, нисш алкил, трихалоалкил, хидрокси, меркапто, ©

циано, N-амидо, моно- или диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероцикъл” означава наситен цикличен радикал с от 3 до 8 пръстенни атома, в който един или два пръстенни атома са хетероатоми, избрани от азот, кислород или S(O)_n (където η е цяло число от 0 до 2), като останалите пръстенни атоми са въглеродни и един или два въглеродни атома могат да бъдат заместени, по желание, от карбонилна група. Хетероциклило-

вият пръстен може да бъде заместен, по желание, независимо от един, два или три заместителя, избрани от, по желание, заместен нисш алкил (заместен с 1 или 2 заместителя, поотделно избрани от карбокси или естер), халоалкил, цианоалкил, хало, нитро, циано, хидрокси, алкокси, амино, моноалкиламино, диалкиламино, аралкил, хетероаралкил, -COR където R е алкил) или -COOR, където R е водород или алкил. По-конкретно, терминът “хетероциклил” включва, без да се ограничава до изброените, тетрахидропиранил, 2,2-диметил-1,3-диоксолан, пиперидино, N-метилпиперидин-З-ил, пиперазино, N-ме тилпиролидин-3-ил, 3-пиролидино, морфолино, тиоморфолино, тиоморфолино-1-оксид, тиоморфолино-1,1-диоксид, 4-етилокси- 21 карбонилпиперазино, 3-оксопиперазино, 2-имидазолидон, 2 пиролидинон, 2-оксохомопиперазино, тетрахидропиримидин-2он и техни производни. За предпочитане, хетероциклената група е заместена, по желание, с един или два заместителя поотделно избрани от хало, нисш алкил, нисш алкил, заместен с карбокси, естерхидрокси, моно- или диалкиламино.

“Хидрокси” означава -ОН група.

“Алкокси” се отнася до -О-(алкилова) и до -О-(циклоалкилова) група. Представителни примери, без да се ограничават до изброените, са, например, метокси, етокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклохексилокси и други.

“Арилокси” се отнася, както до -О-арилна, така и до -Охетероарилна група, както е определена тук. Представителни примери са, без да се ограничават до изброените, фенокси, пиридинилокси, фуранилокси , тиенилокси, пиримидинилокси, пиразинилокси и други, както и техни производни.

“Меркапто” се отнася до

-SH група.

“Алкилтио” се отнася, както до -S-алкилова, така и до -S циклоалкилова група. Представителни примери, без да се ограничават до изброените, са, например, метилтио, етилтио, пропилтио, бутилтио, циклопропилтио, циклобутилтио, циклопентилтио, циклохексилтио и други.

“Арилтио” се отнася, както до -S-арилова, така и до -Sхетероарилова група, както са определени тук. Представителни примери без да се ограничават до изброените, са фенилтио, пиридинилтио, фуранилтио, тиенилтио, пиримидинилтио и други, както и техни производни.

“Ацил” се отнася до група -C(O)-R”, в която R” е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил, трихало• · ♦ · • · · · ·· · ··· ···· ·· · · · · ·

- 22 • · · · ·· ·· ·· ·

	метил, циклоалкил, арил, по желание, заместен с един или
	повече, за предпочитане един, два или три заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалометил,
е	нисш алкокси, хало и -NR¹⁸R¹⁹, хетероарил (свързан чрез
	пръстенен въглерод), по желание заместен с един или повече, за предпочитане един, два или три заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, нисш алкокси, хало и -NR¹⁸R¹⁹ и хетероалициклен (свързан чрез пръстенен въглерод), по желание, заместен с един или повече, за предпочитане един, два или три заместителя, избрани от
	групата, състояща се от нисш алкил, трихалоалкил, нисш алкокси, хало и -NR¹⁸R¹⁹. Представителни ацилни групи са, без да се ограничават до изброените, ацетил, трифлуороацетил, бензоил и други. “Алдехид” е ацилна група, в която R” е водород. “Тиоацил е група -C(S)-R”, в която R” е, както е определен тук. “Естер” се отнася до група -C(O)O-R”, като R” е както е определен тук, с изключение на това, че не може да бъде во-
	дород. “Ацетилна” група е група -С(О)СН₃. “Хало” означава флуор, хлор, бром или йод, за предпочитане флуор или хлор. “Трихалометилова” група е група -СХ₃, в която X е хало, както е определен тук. “Трихалометансулфонилна” група се отнася до групи X₃CS( = O)₂-, като X е както е определен по-горе. “Циано” е група -C^N.

- 23 ·· · « · · «·· ·· · · · · · · «·

Метилендиокси” се отнася до група -ОСН₂О-, в която двата кислородни атома са свързани със съседни въглеродни атоми.

{(

Етилендиокси” група е -ОСН₂СН₂О-, където двата кислородни атома са свързани със съседни въглеродни атоми.

R¹⁸

S-сулфонамидо” се и R¹⁹ са, както са определени отнася до група тук.

-S(O)₂NR¹⁸R¹⁹, като

R¹⁸ “N-сулфонамидо” се отнася и R¹⁹ са, както са определени до група

-NR като са, са, “О-карбамил” се отнася както са определени тук.

“N-карбамил” се отнася както са определени тук.

ДО

О-тиокарбамил” се отнася тук.

-OC(O)NR

R¹⁸OC(O)NR¹⁹ като като до -OC(S)NR¹⁸R¹⁹

R¹⁸

R¹⁸ като

R¹⁹ са, както са определени тук.

N-тиокарбамил” се отнася до R¹⁸OC(S)NR като

R¹⁹ са, както са

Амино” е определени тук.

група -NR¹⁸R¹⁹ която R¹⁸

R¹⁹ са двата водород.

“С-амидо” се отнася до като

R¹⁸ r19 са, както са определени тук.

ДО

R¹⁸C(O)NR¹⁹ като

R¹⁸

R¹⁹ са, както са определени тук.

Нитро” е група -ΝΟ₂.

Халоалкил” означава алкил, за предпочитане нисш алкил, както е определен по-горе, заместен с един или повече, еднакви или различни, хало атоми, като например, -СН₂С1, -CF₃, -CH₂CF₃, -CH₂CCI₃ и други.

“Аралкил” означава алкил, за предпочитане нисш алкил, както е определен по-горе, заместен с арилна група, опре- 24 - I · Σ Σ * Σ Σ . Σ ’ Σ Σ **Σ* • · · · ·· «· ·· · делена по-горе, като например, -СН₂фенил, -(СН₂)₂фенил, -(СН₂)₃фенил, СН₃СН(СН₃)СН₂фенил и други и техни производни.

“Хетероаралкил” означава алкил, за предпочитане нисш алкил, както е определен по-горе, който е заместен с хетероарилна група, като например, -СН₂пиридинил, -(СН₂)₂пиримидинил, -(СН₂)₃имидазолил и други и техни произ-водни.

“Моноалкиламино” означава радикал -NHR, в който R е незаместена алкилова или циклоалкилова група, както е определена по-горе, например, метиламино, (1-метилетил)амино, циклохексиламино и други.

“Диалкиламино” означава радикал -NRR, в който R е по отделно незаместена алкилова или циклоалкилова група, как то е определена по-горе, например, диметиламино, диетиламино, (1-метилетил)-етиламино, циклохексилметиламино, циклопентилметиламино и други.

“Циано алкил” означава алкил, за предпочитане нисш алкил, както е определен по-горе, който е заместен с 1 или 2 цианогрупи.

“Евентуален” или “по желание” означава, че след това се описва събитие или обстоятелство, което може, но не е необходимо да се случи и че описанието включва случаи, в които събитието или обстоятелството се случва и случаи, в които не се случва. Например, “хетероциклена група, по желание заместена с алкилова група” означава, че алкилът може, но не е необходимо да присъства и описанието включва ситуации, в които хетероциклената група е заместена с алкилова група и ситуации, в които хетероциклената група не е заместена с алкилова група.

« ♦ « · · « · ·

- 25 Термините “2-индолинон”, “индолин-2-он” и “2-оксиндол” се използват тук взаимозаменяемо по отношение на молекула с химичната структура:

Терминът “пирол” се отнася до молекула с химична структура:

Термините “2-индолинон, заместен с пирол” и “3-пироли денил-2-индолинон” тук се използват взаимозаменяемо за хи мично съединение с основна структура, показана във формула (I).

Съединения които имат една и съща молекулна формула, но се различават по характер или последователност на свързване на техните атоми, или по пространственото подреждане на атомите си, се наричат “изомери”. Изомери, които се различават по пространственото подреждане на атомите си, се наричат “стереоизомери”.

Стереоизомери, които не са огледални образи един на друг, се наричат “диастереомери”, а тези, които не са наслагващи се огледални образи, се наричат “енантиомери”. Когато едно съединение има асиметричен център, например, е свързано с четири различни групи, тогава е възможна двойка нантиомери. Един енантиомер се характеризира с абсолютна конфигурация на асиметричния си център и се представя R- м S- правилата за последователност на Кан и Прелог или зсредством начина, по който молекулата върти равнината на зляризованата светлина и се означава като дясновъртящ или вовъртящ (т.е., като ( + ) или (-)-изомери, съответно). Хиралсъединение може да съществува или като отделен енаномер, или като тяхна смес. Смес, съдържаща равни пропори от енантиомерите се нарича “рацемична смес”.

Съединенията съгласно изобретението могат да притежаг ^ин или повече асиметрични центъра; следователно, таза съединения могат да се получат като отделни (R)- или (S)реоизомери или като техни смеси. Например, ако замести; ят R⁶ в съединение с формула (I) е 2-хидроксиетил, тогава i леродният атом, с който е свързана хидрокси групата, е ί метричен център и оттук, съединението с формула (I) може j съществува като (R)- или (в)-стереоизомер. Ако не е посо; о друго, описанието или наименованието на конкретно съе! ение в описанието и претенциите са предназначени да с^ат, както отделни енантиомери, така и смеси, рацемич? 1ли други. Методите за определяне на стереохимията и за ξ деляне на стереоизомерите са известни (виж, коментар в за 4 на “Advanced Organic Chemistry”. 4-то издание, J.

; ;h, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Съединенията съгласно изобретението могат да проявягавтомерия и структурна изомерия. Така например, описатук съединения с формула (I) могат да приемат Е или Z ] >игурация относно двойната връзка, свързаваща 2-индоновият остатък с пироловата част или те могат да бъдат от Е и Z. В обхвата на изобретението се включва всяка «wmhJn a· ·· ······ ·· ···· ·· · ··· «····· · ···· ······· a a a · aaaa

-2/- a a a · · · · ···· ' a··· a · · aa· · тавтомерно или структурно изомерна форма и техни смеси, които притежават способността да модулират RTK, СТК и/или

STK активността и няма ограничение до която и да е тавтомерна или структурно изомерна форма.

“фармацевтичен състав” означава смес от едно или повече съединения, описани тук, или техни физиологично/фармацевтично приемливи соли, или техни пролекарства и други химични компоненти, такива като физиологично/фармацевтично приемливи носители или пълнители.

Предназначението

на фармацевтичния състав е да улеснява прилагането на съединението към организма.

Съединенията съгласно изобретението могат да действат и като пролекарство. “Пролекарство” означава средство, кое то се превръща в основното лекарство in vivo. Пролекарствата се използват често, тъй като в някои ситуации те могат да се прилагат по-лесно, отколкото основното лекарство. Те могат, например, да бъдат билогично налични чрез перорално прилагане, докато основното лекарство не може.

Пролекарството може, също да има по-добра разтворимост във фармацев

тичните състави от основното лекарство. Пример, който не ог раничава, на пролекарство може да бъде съединение съгласно изобретението, което се прилага като естер (“пролекарството”), за да се улесни преминаването през клетъчна мембрана, където водоразтворимостта е вредна за подвижността, но след това се хидролизира метаболитно до карбоксилната киселина, която е активната единица, тъй като вътре в клетката водоразтворимостта е предимство.

Друг пример за пролекарство може да бъде къс поли-пептид, например, без това да служи за ограничение, 2-10 аминокиселинен полипептид, свързан посредством крайна • ♦ · · » · • е·· · · · ··· • · ·· · · · ····

- 28 - ··:· ·· ·· ·· ·· · · · аминогрупа с карбокси група на съединение съгласно изобретението, като полипептидът се хидролизира или метаболизира in vivo, за да освободи активната молекула. Пролекарствата на съединение с формула (I) се включват в обхвата на изобретението.

Допълнително, се има предвид, че съединение с формула (I) може да метаболизира с ензими в тялото на организма, като човешко същество, като генерира метаболит, който може да промени активността на протеинкиназите. Такива метаболити, също, се включват в обхвата на изобретението.

Както е използван тук терминът “физиологично/фармацевтично приемлив носител” означава носител или разредител, който не причинява съществено дразнене на организма и не нарушава биологичната активност и свойствата на прилаганото съединение.

“Фармацевтично приемлив пълнител” означава инертно вещество, добавено към фармацевтичния състав, за да улесни допълнително прилагането на съединението. Примери, които

не ограничават, на пълнители са калциев карбонат, калциев фосфат, различни захари и видове нишесте, целулозни производни, желатин, растителни масла и полиетиленгликоли.

Както е използван тук, терминът “фармацевтично приемлива сол” се отнася до тези соли, които запазват билогичната ефективност и свойствата на основното съединение. Такива соли включват:

(1) Присъединителна с киселина сол, която се получава чрез взаимодействие на свободната основа на основното съе динение с неорганични киселини, като хлороводородна киселина, бромоводородна киселина, азотна киселина, фосфорна киселина, сярна киселина, перхлорна киселина и други, или с • · • · ♦ · ♦ · ·

- 29 органични киселини, като оцетна киселина, оксалова кисе лина, (D) или (L) ябълчна киселина, малеинова киселина, метансулфонова киселина, етансулфонова киселина, р-толуенсулфонова киселина, салицилова киселина, винена киселина,

янтарна киселина или малонова киселина и други, за предпочитане хлороводородна киселина или (Ь)-ябълчна киселина, като L-малатна сол на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид; или (2) Соли, образувани, когато киселинен протон, присъстващ в основното съединение, или се замества от метален йон, например, алкалнометален йон, йон на алкалоземен метал; или се координира с органична основа. Примерни йони са алуминиев, калциев, литиев, магнезиев, калиев, натриев и цинков в техните обичайни валенции. Предпочитани органични основи са протонирани третични амини и кватернерни амониеви катиони, включително отчасти, триметиламин, диетиламин, Ν,Ν-дибензилетилендиамин, хлоропрокаин, холин, диетаноламин, етилендиамин, меглумин (N-метилглюкамин) и

прокаин.

“Метод” се отнася до начините, средствата, техниките и процедурите за изпълнение на дадена задача включително, без ограничение да изброените, такива начини, средства и процедури, които са известни или които лесно се доразвиват от известни начини, средства, техники и процедури от практикуващите в областта на химията, фармацията, биологията, био химията и медицината.

“Третиране” и “лечение” се отнасят до всеки процес, действие, прилагане, терапия или подобни, при които бозай ник, включително човешко същество, се подлага на медицинс•· ····

-30- ίΣίί*ίΣ·ί*ί· · • · ·· · · ·· · · · ка помощ с цел да се подобри състоянието на бозайника директно или индиректно. По отношение на рака, тези термини просто означават, че очакванията за живот на поразения от рак ще се подобрят или че ще се повлияят добре един или повече симптоми на заболяването. Това може да се проследи чрез забавяне появяването на първични или вторични тумори, забавяне развитието на първични или вторични тумори, намаляване появяването на първични или вторични тумори, забавяне или отслабване остротата на вторичните ефекти от болестта, задържане на туморното развитие и регресия на тумори.

Терминът “профилактика” включва както изобщо предотвратяване началото на клинично изразена неоплазия, така и предотвратяване на настъпване на предклинично изразен етап на неоплазия у рисковите индивиди. В тази дефиниция се включва и предотвратяването на иницииране на злокачествени клетки или забавяне, или обръщане развитието на премалигнени клетки в злокачествени. Това включва профилактично

лечение на тези, които са рискови за развитие на неоплазия.

Изразът “терапевтично ефективен” е предназначена да определи количеството от всяко средство, което ще постигне целта да се подобри остротата на неопластичното заболяване и честотата на неопластично заболяване, в сравнение с всяко средство, приложено самостоятелно, като се избегнат нежеланите странични ефекти, които са свързани обикновено с алтернативни терапии.

“Терапевтичен ефект” или “терапевтично ефективнно количество” имат за цел да определят количеството противораково средство, което е необходимо да облекчи до известна степен един или повече симптоми на неоплазията, включи- 31 телно, без да се ограничават до изброените: 1) намаляване броя на ракови клетки; 2) намаляване размера на тумора; 3) инхибиране (т.е., забавяне до известна степен, за предпочитане, спиране) инфилтрацията на ракови клетки в периферни органи; 4) инхибиране (т.е., забавяне до известна степен, за предпочитане, спиране) развитието на туморни метастази; 5) инхибиране, до известна степен, на туморно развитие; 6) облекчаване или ограничаване до определена степен на един или повече от симптомите, свързани със заболяването; и/или 7) облекчаване или ограничаване на страничните ефекти, свързани с прилагането на противоракови средства. ,

Изразът “комбинирана терапия” (или “съ-терапия”) включва прилагането на инхибитор на протеинкиназа и инхибитор на циклооксигеназа-2 като част от определена схема на лечение, за да се получи благоприятен ефект от съ-действието на тези терапевтични средства. Благоприятният ефект от комбинацията включва, без да се ограничава до изброеното, фармакокинетично или фармакодинамично съ-действие в резултат на комбинацията от терепавтичните средства. Прилагането на тези терапевтични средства в комбинация, обикновено, става за определен период от време (обикновено, минути, часове, дни или седмици, в зависимост от избраната комбинация). “Комбинирана терапия” принципно не се предвижда да обхваща прилагането на две или повече от тези терапевтични средства като част от отделни схеми на монотерапия, които случайно и произволно водят до комбинациите съгласно изобретението. “Комбинирана терапия” има за цел да обхване прилагане на тези терапевтични средства последователно, тоест, при което всяко терапевтично средство се прилага в различно време, както и прилагане на тези терапевтични средства или

- 32 ·· ·· ·· ···· ' · • · Μ · V · · *· Φ • · ·· ·· · · · · · • · · ··· · · е · ···«· ···· · · * · »· « &· ·· ·· · « ·4« на поне две от тези терапевтични средства, по същество едновременно. Едновременното прилагане може да се осъществи, например, чрез прилагане към болния на единична капсула, съдържаща определено количество от всяко терапевтично средство или чрез многократно прилагане на единични капсули за всяко от терапевтичните средства. Последователното или по същество едновременното прилагане на всяко терапевтично средство може да стане по подходящ начин, вклю чително перорално, интравенозно, интрамускулно и чрез директно абсорбиране през мукозни мембранни тъкани. Терапевтичните средства могат да се прилагат по един и същ или по различни начини. Така например, първо терапевтично средство от избраната комбинация може да се приложи чрез интравенозно инжектиране, докато другите терапевтични

средства от комбинацията могат да се приложат перорално. Алтернативно, например, всички терапевтични средства могат да се приложат перорално или чрез интравенозно инжектиране. Последователността, в която се прилагат терапевтичните средства не е строго критична. “Комбинирана тепария” включва и прилагането на терапевтичните средства, както са описани по-горе, в друга комбинация с други биологично активни ингредиенти (като, без да се ограничават до изброените, второ и различно антинеопластично средство) и безлекарствени терапии (като хирургична или облъчване). Когато комбинираната терапия включва допълнително облъчване, последното може да се извърши във всяко подходящо време с такава продължителност, че да се постигне положителен ефект от комбинираното действие между комбинацията от терапевтични средства и облъчването. Например, в подходящи случаи, благоприятен ефект се постига, когато облъчването се отмести • · ··

- 33 във времето от прилагането на терапевтичните евентуално с дни или дори със седмици.

“Съпътстваща терапия” се отнася до третиране средства, на болния със средства, които редуцират или отстраняват страничните ефекти, свързани с комбинираната терапия съгласно изобретението, включително, такива средства, които редуцират токсичният ефект от противораковите лекарства, например, инхибитори на костна резорбция, кардиозащитни средства; предотвратяват или ограничават честотата на гадене и повръщане, свързани с химиотерапията, радиотерапията или операцията; или ограничават честотата на инфекциите, свързани с прилагането на миелосупресивните противоракови лекарства.

ПРЕДПОЧИТАНИ ИЗПЪЛНЕНИЯ

Докато в “Същността на изобретението” са дадени найшироки дефиниции, определени съединения с формули (I), (II) и (III), изложени по-долу, са предпочитани за осъществяване на изобретението.

А. Протеинтирозинкиназен инхибитор - съединения с формула (I):

(1) Предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R¹, R³ и R⁴ са водород.

(2) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R¹, R² и R⁴ са водород.

(3) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R¹, R² и R³ са водород.

(4) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R², R³ и R⁴ са водород.

(5) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R¹, R², R³ и R⁴ са водород.

: ·”.···: .·· ·

- 34 - ·*:::···’ ···· ..··..· ί : ··;· (6) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁵, R⁶ или R⁷, за предпочитане R⁵ и R⁶, още попредпочитано R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹¹ (CH₂)_nR¹², като:

R¹¹ е водород или нисш алкил, за предпочитане водород или метил;

η е 2, 3 или 4, за предпочитане 2 или 3; и

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ означават поотделно алкил, за предпочитане нисш алкил или R¹³ и R¹⁴ заедно образуват група, избрана от -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, -(СН₂)₂-О-(СН₂)₂или -(CH₂)2N(CH₃)(CH₂)₂-, за предпочитане R¹³ и R¹⁴ са поотделно водород, метил, етил или заедно образуват морфолин-4ил, пиролидин-1-ил, пиперазин-1-ил или 4-метилпиперазин-1ил.

Още повече се предпочита, когато R⁵ или R⁶ в (6) е 1\!-(диметиламиноетил)аминокарбонил, Г\1-(2-етиламиноетил)-М-метиламинокарбонил, М-(3-диметиламинопропил)аминокарбонил, М-(2-диетиламиноетил)аминокарбонил, И-(З-етиламинопропил)аминокарбонил, М-(3-диетиламинопропил)аминокарбонил, 3пиролидин-1 -ил-пропиламинокарбонил, З-морфолин-4-илпропил-аминокарбонил, 2-пиролидин-1-илетиламинокарбонил, 2 морфолин-4-илетиламинокарбонил, 2-(4-метилпиперазин-1-ил)етиламинокарбонил, 2-(4-метилпиперазин-1 - ил)пропиламинокарбонил, 2-(3,5-ди метил пиперазин-1 -ил)етиламинокарбонил, или 2-(3,5-диметилпиперазин-1-ил)припиламинокарбонил и най-вече се предпочита М-(2-диетиламиноетил)аминокарбонил или М-(2-етиламиноетил)аминокарбонил.

(7) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁵, R⁶ или R⁷, за предпочитане R⁵ и R⁶, още попредпочитано R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ е водород, a R¹⁴ е алкил, за предпочитане никш алкил, заместен ··»· ·· · с хидрокси, арил, хетероарил, хетероалициклен или карбокси, още повече се предпочита, когато е метил, етил, пропил или бутил, заместен с хидрокси, арил, хетероалициклен, като пиперидин, пиперазин, морфолин и други, хетероарил или карбокси. Особено се предпочита, когато в тази група (7) R⁵ или R⁶ е 2-етоксикарбонилметиламинокарбонил, карбоксиметиламинокарбонил, 3-хидроксипропиламинокарбонил, 2-хидроксиетиламинокарбонил, З-триазин-1 -илпропиламинокарбонил, триазин-1 -илетиламинокарбонил, 4-хидрокси-фенилетиламинокарбонил, З-имидазол-1-ил пропил-аминокарбонил, пиридин-4-илметиламинокарбонил, 2-пиридин-2-илетиламинокарбонил или 2-имидазол-1 - илетиламинокарбонил.

(8) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁵, R⁶ или R⁷, за предпочитане R⁵ и R⁶, още попредпочитано R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹¹ (CH2)nR^,21 като:

R¹¹ е водород или алкил, за предпочитане водород или метил;

η е 2, 3 или 4, за предпочитане 2 или 3; и

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ заедно образуват хетероцикъл, за предпочитане 5, 6, или 7-членен хетероцикъл, съдържащ карбонилна група и 1 или 2 азотни атома. За предпочитане, R⁵ или R⁶ е 2-(3-етоксикарбонилметилпиперазин-1-ил)етиламинокарбонил, 2-(3-оксопиперазин-1 -ил) етиламинокарбонил, 2-(имидазолидин-1 -и л-2-он) етил аминокарбонил, 2-(тетрахидропиримидин-1 -ил-2-он)етиламинокарбонил, 2-(2-оксопиролидин1 -и л) етил ами но карбон ил, 3-(4-метилпиперазин-1 - ил) пропиламинокарбонил, 3-(3-етоксикарбонил метил пиперазин-1 -ил) пропил аминокарбонил, 3-(3-оксопиперазин-1 -ил)пропиламинокарбонил, 3-(имидазолидин-1-ил-2-он)пропиламинокарбонил, 3(тетрахидропиримидин-1 -и л-2-он) пропил аминокарбонил, 3-(2 • · ··

- 36 оксопиролидин-1 - ил)пропиламинокарбонил, 2-(2-оксохомопи перидин-1-ил)етиламинокарбонил или 3-(2-оксохомопиперидин

-ил)пропиламинокарбонил.

(9) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е та- * зи, в която R⁵, R⁶ или R⁷, за предпочитане R⁵ и R⁶, още попредпочитано R⁶ е -COR¹⁰, където:

(a) R¹⁰ е -NR¹¹ (CH₂)_nR¹², като:

η е 2, 3 или 4, за предпочитане 2 или 3; и (ft

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ е водород и R¹⁴ е цианоалкил или NHCOR^a, където R^a е алкил;

(b) R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ заедно образуват хетероцикъл, който не съдържа карбонилна група в пръстена. За предпочитане, R⁵ или R⁶ е 2-(2-цианоетиламино)етиламинокарбонил, 2-(ацетиламино)етиламинокарбонил, морфолинокарбонил, пиперидин-1-ил-карбонил, 2-цианометиламиноетиламинокарбонил или пиперидин-1-илкарбонил.

(10) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁵ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, като R¹³ е водород и R¹⁴ е нисш алкил, заместен с хидрокси, нисш алкил, заместен с хидроксиалкиламино, карбокси или -NR^1SR¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ означават поотделно водород или нисш алкил, за предпочитане R⁵ е 2-[(диетиламино)-2-хидрокси]етиламинокарбонил, 2-(М-етил-М-2-хидроксиетиламино)етиламинокарбонил, карбоксиметиламинокарбонил, или 2-(2-хидроксиетиламино)етиламинокарбонил.

(11) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, като R¹³ е водород и R¹⁴ е нисш алкил, заместен с хидрокси, нисш алкил, • · ♦ · заместен с хидроксиалкиламино, карбокси или -NR¹⁸R¹⁹, където R¹⁸ и R¹⁹ означават поотделно водород или нисш алкил, за предпочитане R⁶ е 2-[(диетиламино)-2-хидрокси]етиламинокарбонил, 2-(N-етил-N-2-хидрокси етил амин о)етил ами но карбонил, карбоксиметил аминокарбонил, или 2-(2-хидроксиетиламино)етиламинокарбонил.

(12) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁵ е -COR¹⁰, където R’° е -NR¹¹ (CH2)nR¹², като R¹² е -N ⁺ (O')NR’³R’⁴ или -N(OH)R¹³, като R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород и нисш алкил, за предпочитане R⁵ е 2-(М-хидрокси-М-етиламино)етиламинокарбонил или 2-[М ⁺ (О )(С2Н₅)₂]етиламинокрабонил.

(13) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹¹ (CH2)nR¹², като R¹² е -N ⁺ (O )NR¹³R¹⁴ или -N(OH)R¹³, като R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород и нисш алкил, за предпочитане R⁵ е 2-(Г\1-хидрокси-М-етиламино)етиламинокарбонил или 2-[N ⁺ (О’)(С2Н₅)₂]етиламинокрабонил.

(14) В по-горе предпочитаните групи (6)-(13), в които R⁵ е -COR¹⁰, още по-предпочитана група съединения е тази, в която:

R⁶ е избран от групата, състояща се от водород и алкил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил или н.-бутил, за предпочитане водород или метил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н.-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, като особено се предпочита метил, водород или фенил.

• · • ···

(15) В по-горе предпочитаните групи (6)-(13), в които R⁵ е -COR¹⁰, още по-предпочитана група съединения е тази, в която R⁶ и R⁷ заедно образуват -(СН₂)₄-.

(16) В по-горе предпочитаните групи (6)-(13), в които R⁶ е -COR¹⁰, още по-предпочитана група съединения е тази, в която:

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород и алкил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил или н.-бутил, за предпочитане водород или метил; и

(17) В обхвата на по-горе предпочитаните групи (6)-(16), особено предпочитана група съединения е тази, в която:

R¹ е водород, алкил, -C(O)NR⁸R⁹, циклолакил или арил, за предпочитане водород, фенил, 3,4-диметоксифениламинокарбонил, 4-метокси-З-хлорофениламинокарбонил, още по-предпочитани са водород или метил и най-предпочитан е водород;

R² е циано, водород, хало, нисш алкокси, арил или -S(O)₂NR¹³R¹⁴, където R¹³ е водород и R¹⁴ е водород, арил или алкил, за предпочитане R² е водород, хлоро, бромо, флуоро, метокси, етокси, фенил, диметиламиносулфонил, 3-хлорофениламиносулфонил, карбокси, метокси, аминосулфонил, метиламиносулфонил, фениламиносулфонил, пиридин-3-ил-аминосулфонил, диметиламиносулфонил, изопропиламиносулфонил, за предпочитане водород, флуоро или бромо;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкокси, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, арил, за предпочитане арил,

• « · по желание заместен с един или два заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, хало или нисш алкокси и хетероарил, за предпочитане хетероарил, по желание заместен с един или два заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, хало или нисш алкокси; за предпочитане водород, метокси, карбокси, фенил, пиридин-3-ил, 3,4-дихлорофенил, 2-метокси-5-изопропилфенил, 4-н-бутилфенил, 3-изопропилфенил, особено се предпочита водород или фенил; и

R⁴ е водород.

(18) Друга особено предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която:

R¹ е водород, алкил, -C(O)NR⁸R⁹, циклолакил или арил, за предпочитане водород, 3,4-диметоксифениламинокарбонил, 4метокси-3-хлорофениламинокарбонил, още по-предпочитани са водород или метил и най-предпочитан е водород;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкокси, -C(O)R¹⁵, -NR¹³C(O)R¹⁴, арил, за предпочитане арил, по желание заместен с един или два заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, хало или нисш алкокси и хетероарил, за предпочитане хетероарил, по желание заместен с един или два заместителя, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, хало или нисш алкокси; за предпочитане • ·

	40 : :^;·;· ·· ·· ·
водород,	метокси, карбокси, фенил, пиридин-3-ил, 3,4-дихло-
рофенил,	2-метокси-5-изопропилфенил, 4-н-бутилфенил, 3-изо-

пропилфенил, особено се предпочита водород или фенил; и R⁴ е водород.

В обхвата на по-горе предпочитаната група (18), особено предпочитана група съединения е тази, в която:

R⁵ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е както е определен в същността на изобретението, за предпочитане е -NR¹¹ (CH₂)_nR¹² или

-NR¹³R¹⁴, както е определена в същността на изобретението.

R⁶ е избран от групата, състояща се от водород и алкил, за предпочитане водород, метил етил изопропил, трет.-бутил, изобутил, или н.-бутил, повече се предпочита водород или метил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, като особено се предпочита метил, водород или фенил.

В обхвата на по-горе предпочитаната група (18), друга особено предпочитана група съединения е тази, в която:

R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е, както е определен в същността на изобретението, за предпочитане е -NR¹¹ (CH₂)_nR¹² или -NR¹³R¹⁴, както е определена в същността на изобретението.

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород и алкил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил, или н.-бутил, повече се предпочита водород или метил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил, за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н·· ···· изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси като особено се предпочита метил, водород или фенил.

(19) Друга предпочитана група съединения с формула (I) е тази, в която:

R¹ и R⁴ са водород;

R² е избран от групата, състояща се от водород, хало, нисш алкокси, -C(O)R¹⁵ и -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкокси, -C(O)R¹⁵, -S(O)₂NR¹³R¹⁴, арил и хетероарил;

R⁵ е -C(O)R¹⁰;

R⁶ е избран от групата, състояща се от водород и нисш алкил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил и -C(O)R¹⁷.

Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението

е съединение със структура, както е описана в (15):

R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, нисш алкокси и е -NR¹¹ (CH₂)_nR¹², където η е 2 или 3;

R¹¹ е избран от групата, състояща се от водород и нисш алкил; и

R¹² е избран от групата, състояща се от арил и -NR^,3R¹⁴.

Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение със структура, както е описана в предходните два параграфа, като R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, нисш алкил и заедно са -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, -(СН₂)₂О(СН₂)₂-, или -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.

(20) Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение, в което:

• ·

··♦·

R¹ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил, -(CH₂)_rR¹⁶ и -C(O)NR⁸R⁹;

R² е избран от групата, състояща се от водород, халоген, арил и -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил, нисш алкокси, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁵;

е водород;

е избран от групата, състояща се от водород и нисш e-C(O)R¹⁰;

е избран от групата, състояща се от водород, нисш арил;

R¹⁶ е избран от групата, състояща се от хидрокси и -C(O)R¹⁵; и г е 2 или 3.

Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение със структура, както е описана в предходния параграф, по-горе, като R³ е арил, по желание заместен с една или повече групи, избрани от групата, състояща се от нисш алкил, нисш алкокси и хало.

(21) Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение, в което:

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил, нисш алкокси, арил, хетероарил и -C(0)R¹³;

R⁴ е водород;

- 43 R⁵ е избран от групата, състояща се от водород и нисш алкил;

R⁶ e-C(O)R¹⁰;

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкил и арил;

R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, нисш алкокси, -NR¹³R¹⁴ и -NR¹¹ (СН₂)_ПК¹²- където η е 1, 2 или 3, R¹¹ е водород и R¹² е избран от групата, състояща се от хидрокси, нисш алкокси, -C(O)R¹⁵, хетероарил и -NR¹³R¹⁴.

(22) Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение със структура, както е описана в предходния параграф, по-горе, в което R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, нисш алкил, хетероарил и заедно са -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, -(СН₂)₂О(СН₂)₂- или -(CH₂)₂N(СН₃)(СН₂)₂- (23) Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението

е съединение, в което:

R¹ е -C(O)NR⁸R⁹, където R⁸ е водород и R⁹ е арил, по же лание заместен с една или повече групи, избрани от групата, състояща се от хало, хидрокси и нисш алкокси.

R⁴ е водород;

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород и нисш алкил;

R⁶ e-C(O)R¹⁰;

• · ··

- 44 R⁷ е избран от групата, състояща

.. ..· :··:· *· ·· * се от водород, нисш алкил и арил;

(24) Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението

е съединение, в което:

R	е избран	от	групата,	състояща се	от	водород и	нисш
алкил;
R²	е избран	от	групата,	състояща се	от	водород,	хало,
нисш алкокси, арил,	-C(O)R¹⁵	и -S(O)₂NR¹³R	1 4 .
R³	е избран	от	групата,	състояща се	от	водород,	хало,
арил, хетероарил	и -	C(O)R¹⁵;

R⁴ е водород;

R⁵ е -C(O)R¹⁰; и

R⁶ и R⁷ заедно образуват група -(СН₂)₄-.

В съединение със структура, както е описана в предходния параграф, предпочитано изпълнение е, когато R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, алкокси, -NR¹³R¹⁴ и -NH(CH₂)_nR¹³R¹⁴, където η е 2 или 3.

Друго предпочитано изпълнение съгласно изобретението е съединение със структура, както е описана в предходните два параграфа, в което R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, нисш алкил, хетероарил и заедно са -(СН₂)₄-, -(СН₂)5-, (СН₂)₂О(СН₂)₂-, или

-(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-.

В таблица I, по-долу, са показани представителни съединения с формула (I).

• · • · ·♦

- 45 ТАБЛИЦА I ·· •· •· •· •· • · ·· • · • · · • · · ··

Пример	Структура	Наименование
1	L JlT /=° ⁰ н	4-метил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)- 1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина
2	\	4-метил-5-(1-метил-2-оксо-1,2дихидроиндол-3-илиденметил)- 1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина
3	I г )=° °	4-метил-5-(2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина, метилов естер
4	н	5-(5-хлоро-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-4метил-1Н-пирол-2-карбоксилна к-на, етилов естер
5	Z \ 1 ЮН [ j2/=0 ⁰ н	5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро и ндол-3-и ли ден метил)-4метил-1Н-пирол-2-карбоксилна киселина
6	r-^Ί ^н О ^ΒΥΥ\ н ^{N W}' н	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-4метил-1Н-пирол-2-карбоксилна к-на (З-пиролидин-1 илпропил)амид
7	н	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-ди- хидроиндол-3-илиденметил)-4метил-1Н-пирол-2-карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид
8		5-(5-6 ромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Нпирол-2-карбоксилна к-на (2диетиламиноетил)амид

·♦ ··

9		’·..------ 5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Hпирол-2-карбоксилна к-на (2диетиламиноетил)амид
10		5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Нпирол-2-карбоксилна к-на (2диетиламиноетил)метиламид
11		5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Нпирол-2-карбоксилна к-на (2диетиламиноетил)метиламид
12	H	3-метил-5-(2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Нпирол-2-карбоксилна к-на (3диетиламинопропил)амид
13	H	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3метил-1Н-пирол-2-карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид
14	H	3-метил-5-(2-оксо-6-фенил-1 ,2дихидроиндол-3-илиденметил)- 1 Н-пирол-2-карбоксилна к-на (З-диетиламинопропил)амид
15	H	5-(5-метокси-2-оксо-1,2-дихи- дроиндол-3-илиденметил)-3метил-1Н-пирол-2-карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид
16		5-(6-метокси-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид

• ·

17	BE .. J Η	N H >=o	jf HN	¢.0 <	3-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихиДроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1 -карбоксилна к-на (2диетиламиноетил)амид
18			< Ν’*		3-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид-
BE	Γ		роиндол-3-илиденметил)-
			H 0	HN\	4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изо-
		H			индол-1-карбоксилна к-на (3-
				0	диетиламинопропил)амид
19			/ N		3-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид-
ВЧ	Γ	v	роиндол-3-илиденметил)-
	Yj		H 0	HN\	4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изо-
		'“N H		P	индол-1-карбоксилна к-на (3- пиролидин-1-илпролил)амид
20			J Ν'		3-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-
BE _	1	v	дихидроиндол-3-илиденметил)-
	I I		H = 0	HN\	4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изо-
		H		Ό	индол-1-карбоксилна к-на (2-
				1	диетиламиноетил)амид
21		0			4-бензоил-5-(5-бромо-2-оксо-
			][	η Ί	1 ,2-дихидроиндол-З-илиден- метил)-3-метил-1Н-пирол-2-
		N H		^N\/'S/-'^N''-\	карбоксилна к-на (3-диетил-
	I JL> H	= 0	0	аминопропил)амид
	л~\				4-бензоил-5-(5-бромо-2-оксо-
22				1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
	<1	H	o	метил)-3-метил-1Н-пирол-2-
	Br /Τ' Χ^4γ-*Λ	H	S/^N	карбоксилна к-на (3-морфо-
	1 1)= H	0	0		лин-4-илпропил)амид
					4-бензоил-3-метил-5-(2-оксо-
23	(~\-	0			1,2-дихидроиндол-З-илиден-
		H		метил)-1 Н-пирол-2-карбок-
	jr		N	силна к-на (З-пиролидин-1 -
	11)= H	0	0		илпропил)амид

··♦·

• to • to • · · • · ·· • « · • · ·

24	BL -. 11	Λ__ )=( N H	.0 <Ύ Ν'·⁴ Η D	Η s/^Nx/X 0	.Ο	----«—r·---~ « » « ·—. — 4-бензоил-5-(5-бромо-2-Ькс<5- 1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-3-метил-1Н-пирол-2карбоксилна к-на (3-пиролидин-1-илпропил)амид
25			o	0		4-бензоил-3-метил-5-(2-оксо-6-
			у/ Ν	Ύ ^н Λ		фенил-1,2-дихидроиндол-3- илиденметил)-1Н-пирол-2-

		f⁴	Η >=ο	0		карбоксилна к-на {3-пироли-
	i 1		ⁱ^N H				дин-1 -илпропил)амид
26		//		0			4-бензоил-5-(6-метокси-2-ок-
			=Z-X			X	со-1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
			f	1	Τ Η k ,Ν	метил)-3-метил-1 Н-пирол-2-
		ί	Η = 0	0	карбоксилна к-на (3-пироли-
			'N H			дин-1 - илпропил)амид
27			Λ	0			4-бензоил-5-(5-метокси-2-ок-
					X	со-1,2-дихидроиндол-З-илиден-
	1		Γ	<ιί	Η	метил)-3-метил-1 Н-пирол-2-
	0		Ν'** Η		карбоксилна к-на (3-пироли-
			•N H	0			дин-1- илпропил)амид
28		//		0			4-бензоил-5-(5-флуоро-2-оксо-
		JT		Η	X	1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-3-метил-1 Н-пирол-2-

			Ν'** Η	. Ν	карбоксилна к-на (3-пироли-
	[		**N H	0	0		дин-1 - илпропил)амид
29				0 <1 Ν'**		/	4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
Br		Γ	Η 4 Χ^Νχ	ί	метил)-3-метил-1 Н-пирол-2-
				Η 0	0		карбоксилна к-на (3-диетил-
			*N H				аминопропил)амид
30				0		X	4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-З-илиден-
Br		j~	<ιί	Η Ν	метил)-3-метил-1 Н-пирол-2-
		Ν*** Η		карбоксилна к-на (3-пироли-
	(		N H				дин-1 -илпропил)амид

• *··

31	Br. .	.о 1 2=0 о N Н	Η -\ζχ	Ο \	------··---«----4»· ·%.*---«-;·» » 4-а цетил-5-(5-6 ромо-2-сткс ΟΙ ,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-3-метил-1Н-пирол-2карбоксилна к-на (3-морфолин-4-илпропил)амид
32		/°			4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-З-илиден-
Вг	^гЬ ΓΎνο	Η χ,Ν . ο	.0И	метил)-3-метил-1 Н-пирол-2карбоксилна к-на (3-хидрокси-
		1 1 /^и н			пропил)амид
33		о			4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-З-илиден-
		ϊί ^Η		метил)-3-метил-1Н-пирол-2-
	Вг_ч	< J Ν ΥΎΛ=ο^Η	-4.Ν 0	^ΟΗ	карбоксилна к-на (2-хидрокси-
		1 /—ο Η		етил)амид
34		0		ρ	4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
Вг Y		Η ,Ν.	метил)-3-метил-1Н-пирол-2-
	^τΆ η Π		карбоксилна к-на (2-мор-
	\|l	Η			фолин-4-ил-етил)амид
35		0			4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
	Ύ>«	Η		метил)-3-метил-1 Н-пирол-2-
	Вг	0	Ο /	карбоксилна к-на (2-
		Η	пиролидин-1-ил-етил)амид
36		0			4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
	Γ-<Τ	Η		мети л)-3-мети л-1 Н-пирол-2-
	Вг.	Xy^A Η 1!	Ν	/А I	карбоксилна к-на [2-(4-хи-
	[I	Η		^ΟΗ	дрокси-фенил)-етил]амид
37					5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихи-
	V // 0
			Η	“\ /—	дроиндол-3-илиденметил)-2-
	Вг	^Τ \ ^Η	'“Ν	изопропил-4-фенил-1Н-пирол- 3-карбоксилна к-на (3-диетил-

	\|1	Xj^^N Η			аминопропил)амид
38					5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихи-
	\_y	0	-Ο	дроиндол-3-ил иден метил)-2-
				изопропил-4-фенил-1Н-пирол-
	Вг		Η	3-карбоксилна к-на (3-пиро-
		Гт>=°^н Η			лидин-1-илпропил)амид

«···

· • · · • ····

39	V_У о ⁸ 'γγν Ύ Η	” r.---„ ; 5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2изопропил-4-фенил-1Н-пирол- 3-карбоксилна к-на (2-ди- етиламиноетил)амид
40	«Υ Η	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид- роиндол-3-илиденметил)-2изопропил-4-фенил-1Н-пирол3-карбоксилна к-на [3-(4-метил-пиперазин-1-ил)-пропил]амид
41	⁶¹ Η	5-(5-бромо-2-оксо-1 , 2-диxидpoиндoл-3-илидeнмeτил)-2изопропил-4-фенил-1Н-пирол3-карбоксилна к-на
42	9χ^ο Η	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2метил-4-фенил-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-пиролидин-1-ил-етил)амид
43	^0 1	5-[6-(2-метокси-фенил)-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-2-метил-4-фенил-1Нпирол-3-карбоксилна к-на (2пиролидин-1-ил-етил)амид
44	θ' Η	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2метил-4-фенил-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-диметиламино-етил)амид

• · ♦ ·

• · • · · • · · · · • · • <

45	ι 1	V_ / o jQ>° H 0 1	. \_Nν' ' H	• · ·---------------------- 5-[6-(2-метокси-фенил)-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-2-метил-4-фенил-1 Hпирол-3-карбоксилна к-на (2диметиламино-етил)амид
46					5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
			~4 ⁰	-o^	роиндол-3-илиденметил)-2- метил-4-фенил-1Н-пирол-3-
	Br	I I >= H	<T	карбоксилна к-на етилов
	N\. H 0		естер
47		/=r\			5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
			0	/	роиндол-3-илиденметил)-2-
		X	>T^N Π ^H	v_	метил-4-фенил-1Н-пирол-3-
	Br^	J ⁴N		карбоксилна к-на (3-ди-
		Ί— \ ^H I / ⁰i^'N H			етиламинопропил)амид
48			0	x H N	5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
		/1	роиндол-3-илиденметил)-2,4-
	Br.	. JT Z\X	'n-^\ H	/Νχ	диметил-1Н-пирол-3-карбок-
	I	1 /=	0		силна к-на (2-диметиламино-
		H			етил)амид
49				0	2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-
			_-Λιϊ	N	1 ,2-дихидроиндол-З-илиден-
		; νΛ h		метил)-1Н-пирол-3-карбок-
		1 1	/=0	силна к-на (2-диметиламино-
	I	H			етил)амид
					5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихид-
50			0		роиндол-3-илиденметил)-2,4-
		/1		диметил-1Н-пирол-3-карбок-
	^Cl\		'n^X	/Νχ	силна к-на (2-диметиламино-
			0		етил)амид

• * • · · · • f

51	ΤΊ	'N H	J N’ H = 0	0 J^H v^v	?4	——------<-< · · «------------- • · · · · 5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
52				0		5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
		/Г	H ύ ^N		роиндол-3-илиденметил)-2,4-
		J	N	JL ^λ--⁴	диметил-1Н-пирол-3-карбок-
	I		= 0		4	силна к-на (2-пиролидин-1 -ил-
		H			етил)амид
53				0 14		5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид-
		Xr		роиндол-3-илиденметил)-2,4-
		JT	V			диметил-1 Н-пирол-З-карбок-
	X/%z T I		H 0		силна к-на (З-имидазол-1-ил-
		N H				пропил)амид
54				0 V.A		5-[6-(2-метокси-фенил)-2-оксо-
				X.H	1,2-дихидроиндол-З-илиден-
			JT	<1		метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-
	f			H = 0	/^N^	3-карбоксилна к-на (2-диме-
	h I \ -^x 0 I		‘‘N H			тиламино-етил)амид
55				0		5-[6-(3-метокси-фенил)-2-оксо-
				-<T	<. H	1,2-дихидроиндол-З-илиден-
			/		метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-
		Q	H = 0		3-карбоксилна к-на (2-диме-
	I I /°		H			тиламино-етил)амид
56				0		2,4-диметил-5-(2-оксо-5-фенил-
				H N	1,2-дихидроиндол-З-илиден-
	I x> z\ s		JT	X A N^\	\---_χ	метил)-1 Н-пирол-З-карбок-
	ζ			0	a	силна к-на (2-диетиламино-
			**N H		\	етил)амид

- 53 • · ·♦··

57	0 Η	2,4-диметил-5-(2-оксо-5фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (2пиролидин-1-ил-етил)амид
58	0 Η	2,4-Диметил-5-(2-оксо-5фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (3имидазол-1-илпропил)амид
59	0 п>^я о ργ4Α·ι '	2,4-диметил-5-(2-оксо-6фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1Н-лирол-3карбоксилна к-на (2диетиламино-етил)амид
60	0 Г^Х X jCCx 0 ZV^^N	2,4-диметил-5-(2-оксо-5фенил-1,2-дихидроиндол-3илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (2пиролидин-1-ил-етил)амид
61	0 /XX Il Т/=°^н	2,4-д и метил-5-(2-0 ксо-6фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1Н-лирол-3карбоксилна к-на (3имидазол-1-илпропил)амид
62	Cl	5-[6-(3,5-дихлоро-фенил)-2оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил]-2,4-диметил- 1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид

• · · ·

63		~: 2,4-ДИметил-5-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-3илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
64	\ O ΑΓ	2,4-диметил-5-(2-оксо-6-пиридин-З-ил-1 ,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-пиролидин-1-ил-етил)амид
65	0 /	2,4-диметил-5-(2-оксо-6-пиридин-З-ил-1 ,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (3-диметиламинопропил)амид
66	H	2,4-диметил-5-(2-оксо-5фенил-1,2-дихидроиндол-3илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (3-диметиламинопропил)амид
67	0 H	2,4-д и метил-5-(2-0 ксо-5фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид

• · ss · ·· · * j · * · ί ί · ·

68	0	------------------------------------; 2,4-диметил-5-(2-оксо-6фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (3диетиламинопропил)амид
69	.Xjj ' ⁴—___	3-[4-(3-диетиламино-пропилкарбамоил)-3,5-диметил-1Нпирол-2-илметилен]-2-оксо2,3-дихидро-1 Н-индол-4-карбоксилна киселина (3-хлоро4-метокси-фенил)амид-
70	0	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид
71	Η	5-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диизопропил-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
72	—^Ν? Η	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диизопропил-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (3-диетиламинопропил)амид
73	⁵Υν\ l\| JL / ⁰ '— Η	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диизопропил-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (3-пиролидин-1-илпропил)амид
74	\Αζ\ н	5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диизопропил-1Н-пирол-3карбоксилна к-на (пиридин4-илметил)амид

75		-----—··—,,—»---- 5-[6-(4-бутил-фенил)-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол- 3-карбоксилна к-на (2-пиро- лидин-1-ил-етил)амид
76	ЗА J N-^X ο i\| γΑ_=ο ^Η ΛΧ/Νλ N	5-[6-(5-изопропил-2-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил]-2,4-ДИ- метил-1Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1 -илетил)амид
77	tk A	5-[6-(4-етил-фенил)-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна к-на (2пиролидин-1-ил-етил)амид
78	\A A ⁴o^z^^x;:^o 1	5-[6-(2,4-диметокси-фенил)-2оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил]-2,4-диметил- 1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1-ил-етил)амид
79	X °xx O	5-[6-(3-изопропил-фенил)-2оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил]-2,4-диметил- 1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-пирол идин-1-ил-етил)амид

• · · ·

80	° Г Η	------------.. ..----·,,. ;-------- 5-(5-флуоро-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
81	OH	3-(4-(2-диетиламиноетилкарбамоил)-3,5-диметил-1Нпирол-2-илметилен]-2-оксо2,3-дихидро-1Н-индол-6-карбоксилна киселина
82	νχ '</глА	5-(5-диметилсулфамоил-2- оксо-1,2-дихидроиндол-З- илиденметил)-2,4-Диметил- 1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1-ил-етил)амид
83	η \λΧ ίΎ ^Ν /уур^	5-[5-(3-хлоро-фенилсулфамоил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол3-илиденметил]-2,4-ДИметил1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1-ил-етил)амид
84	A νλ X АхА β >γγ£^	2,4-ДИметил-5-[2-оксо-5(пиридин-3-илсулфамоил)- 1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1 ил-етил)амид
85	0 Η	3-[3,5-диметил-4-(4-метил-пиперазин-1-карбонил)-1ААпирол-2-илметилен]-4-(2-хидроксиетил)-1,3-дихидроиндол-2-он
86	Ρ \Α- _Ν' __у—	3-[3,5-диметил-4-(4-метил-пиперазин-1-карбонил)-1 Н-пирол-2-илметилен]-2-окс 0-2,3дихидро-1Н-индол-5-сул фонова к-на фениламин

• · ··

87	Νζ ^N	-----------.. -,,- .---------- 5-(5-диметилсулфамоил-2- оксо-1,2-дихидроиндол-3илиденметил)-2,4-диметил- 1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
88	Ь JX -°	5-[5-(3-хлоро-фенилсулфамоил)-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол3-илиденметил]-2,4-диметил1/7-пирол-З-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)амид
89	Xj^ N N^Z 1	3-[5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил]4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна к-на (2диметиламиноетил)амид
90	^N Г ⁰Г L/“ °\ X^^N \|	3-(2-оксо-1,2-дихидроиндол3-илиденметил]-4,5,6,7тетрахидро-2Н-изоиндол-1карбоксилна к-на етилов естер
91	—/ o	3-(4-метил-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2/-/-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
92	Ν-^γί·⁰[ L>° °\ V^·. ]	3-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
93	^N r° I Z / ⁰ °\	3-(3-ето ксикарбонил-4,5,6,7- тетрахидро-2Н-изоиндол-1илметилен)-2-оксо-2,3-дихидро-1Н-индол-5-карбоксилна к-на

94	o^/'nX^⁰ T ТУ⁰ °\ ]	*· .. ; 3-(5-метокси-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1 -карбоксилна к-на етилов естер
95	(N'^^⁰ ХЗО^^{0 Οχ}]	3-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
96	NH /^ r— S\ .-. Jl' /W\ ¹ ° ¢,1 / ° °\	3-(2-оксо-5-сулфамоил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
97	F<I o ^N 1 O II /=0 Оч ЧА·. ]	3-(5-метилсулфамоил-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-4,5,6,7-тетрахидро-2/-/изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
98	У r-<ii /wC^NV oil /=0 °\ V^r. \|	3-(5-диметилсулфамоил-2оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1- карбоксилна к-на етилов естер
99	1 o /— o M-z ^г-“\. d	3-(2-оксо-5-фенилсулфамоил- 1 ,2-дихидроиндол-З-илиденм етил)-4,5,6,7-тетрахидро-2 Низоиндол-1 -карбоксилна к-на етилов естер

• · ··

100		----”-----—--4. ---*--·---·-------·· 3-(6-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
101	^Ν 1^^υί Υ>ο СК	3-(2-оксо-6-фенил-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
102	₀ΧΧ °\ 0	3-(3- етоксикарбонил-4,5,6,7- тетрахидро-2Н-изоиндол-1илметилен)-2-оксо-2,3-дихид- ро-1Н-индол-6-карбоксилна к-на
103	ί Τ>0 <Κ ''Ο^'χΧ'-Ν \|	3-(6-метокси-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна к-на етилов естер
104	^Λκ / Χύ ^Ν τ° ο^Ζ 1 1/=0 ο_χ 4Αν ]	3-(5-изопропилсулфамоил-2оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-4,5,6,7-тетрахидро-2/-/-изоиндол-1- карбоксилна к-на етилов естер
105	⁰ lX/° ^Νχ	3-(3-м етилкарбамоил-4,5,6,7тетрахидро-2Н-изоиндол-1илметилен)-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-карбоксилна к-на

····

106		··------.. ;------- 3-(3-диметилкарбамоил- 4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-илметилен)-2-оксо- 2,3-дихидро-1 Н-индол-5- карбоксилна к-на
107	⁰ ( χ>° _r\	2-оксо-3-[3-(пиролидин-1карбонил)-4,5,6,7-тетрахи дро-2Н-изоиндол-1-илметилен]-2,3-дихидро-1/7-индол-5карбоксилна к-на
108	°ΎΥ>° r^N> U. Q	3-[3-(морфолин-4-карбонил)- 4,5,6,7-тетрахидро-2/т'-изоиндол-1-илметилен]-2-оксо2,3-дихидро-1 Н-индол-5карбоксилна к-на
109	o 0	3-[3-(морфолин-4-карбонил)4,5,6,7-тетрахидро-2/-/-изоиндол-1-илметилен]-2-оксо2,3-дихидро-1 Н-индол-6карбоксилна к-на
110	'^,J 'g^⁰ X^Q=° ^N^	3-(5-бромои-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна к-на метиламид
111	Ν^ψ⁵·⁰ ⁰	3-(5-бромои-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)- 4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна к-на диметиламид

112	ijlY⁰	·· ·· . 5-бромо-3-[3-(пиролидин-1карбонил)-4,5,6,7-тетрахидp o-2 H- изоиндол-1-илм етилен]-! ,3-дихидро-индол-2-он
113	TZO=° <ⁿ> Q	5-бромо-3-[3-(морфолин-4карбонил)-4,5,6,7-тетрахидро-2 Н- изоин до л-1-илм етилен]-! ,3-дихидро-индол-2-он
114	Y° o	3-(3-диметилкарбамоил- 4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-илметилен)-2-оксо2,3-дихидро-1 /7-индол-бкарбоксилна к-на
115	0 ° ^q/ lJX·-'°	4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол3-илиденметил)-1 /7-пирол-Зкарбоксилна к-на
116	0 /\ Hj ° °^{Ζ 0}	{[4-метил-5-(4-метил-5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1/7пирол-3-карбонил]-амино}оцетна к-на етилов естер
117	0 /w! ^N o °^Z TJv⁰ (	{[4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-3-карбонил]-амино}оцетна к-на етилов естер
118	0 y°	{[4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-! Н-пирол-3-карбонил]-амино}оцетна к-на

• · ··

119		0 I	o	·_·------------·---·-·---9 i---* **U---------> ·· ·· ·.,· . 3-[3-метил-4-(пиперидин-1карбонил)-1 Н-пирол-2-илме- тилен]-2-оксо-2,3-дихидро- 1 /-/-индол-5-сулфонова киселина метиламид
120		0 оА		5-метил-2-(2-оксо-1,2-дихид-
			роиндол-3-илиденметил)-1 Н-
				пирол-3-карбоксилна к-на
	[	>=0

		₀А		5-метил-2-(2-оксо-1,2-дихид-
121
			роиндол-3-илиденметил)-1Н-
				пирол-3-карбоксилна к-на
		'^Т\ /=0		етилов естер
		₀А
122				2-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
			роиндол-3-илиденметил)-5-
	^Вгх			метил-1/7-пирол-З-карбок-
		s< 1 11 / °		силна к-на етилов естер
123		0 ⁰⁼\		2-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
	_-<М1		роиндол-3-илиденметил)-5-
	Вг			метил-1 /7-пирол-З-карбок-
		\|l jT/^o		силна к-на
124			Ό	2-(5-бромо-2-оксо-1 ,2-дихид-
^Вг\			роиндол-3-илиденметил)-5- метил-1 /-/-пирол-3-карбоксил-

	V	I )=0		на к-на (2-пиролидин-1-ил-
				етил)-амид
125			-V	2-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид-
	0=/		роиндол-3-илиденметил)-5-
		XX		метил-1 Н-п и рол-3-карбоксил-
	Вгх т			на к-на (2-диетиламино-
	[I			етил)-амид

• ·

- 64 • * ··

• · · · • · ···· • · ♦ ·· ·

126	^нз^{с 0} л Z' JL ^н — ^снз Η ^СН₃ Η	2,4-диметил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)-амид	381 [М + 1 ]
127	^нз^{с 0} ζ—-\ II Η \---CH. Ck J Ν-^ ³ γη^\ ^{н сн}з Η	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-ди-хидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1/7-пирол-3-карбоксилна к-на (2-диетиламиноетил)-амид	415 [М + 1]
128	Н₃С ο Η	2,4-ди метил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]-2,4-Диметил1Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1 -ил-етил)а м и д	379 [М + 1 ]
129	^нз^{с 0} F. Ji N''\ ^{Η сн}з Η	5-[5-флуоро-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1 ил-етил)-амид	397 [М + 1 ]
130	^нз^{с 0} 3ηΑ<\/Ο Ck ___ II N\ ууА ^{н СНз} Η	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]1/-/-пирол-3-карбоксилна к-на (2-пиролидин-1 -илетил)амид	413 [М + 1 ]
131	\л '^Нз н ^СНз Η	2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-диметиламино-етил)амид	353 [М + 1 ]

132	H„C 0 ³\ \\ ^CH3 °^НЗ^ΟΧύ⁼°^{η СНз}Η	--------------------а а --------- 5-[5-флуоро-2-оксо-*' 1,2-дихидроиндол(3Z)-и ли ден метил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-диметиламино-етил)-амид	1-----«---------------- • 371 [М + 1 ]
133	^нз^{с 0 н} CH Λ ,__/^Nx^^CH3 _C\| Π Η ο Η	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-ацетиламино-етил)-амид	399 [М-1]
134	н,С ^{0 Η} ΓΗ J/'s 5 ^F\ J! ^{н СНз} Н	5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на (2-ацетиламино-етил)-ам ид	383 [М-1]
135	^Н3^{С 0 Н} гн Л \\ Z^N\^^CH3 ja л ХЧр-Л_ н ^сн₃ н	2,4-диметил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(ЗИ)-илиденметил]-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на (2-ацетиламиноетил)-амид	365 [М-1]
136	0 ^нз^с ° \/%.л, ^{Н СНз} н	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-ДИметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксо-тетрахидропиримидин1 -ил)-пропил]-амид	500[М + 1 ] 502[ М + 1 ]
137	0 ^нз^с ° 7~n ^Cl\ ^н о^{Н СНз} н	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-или-денметил]2,4-Диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксо-тетрахидропиримидин- 1 -ил)-пропил]-амид	454 [М-1]

··»·

• ·

138	^F\ J γγΑ ^{н СНз} н	—--«-r 5-[5-флуоро-2-оксо- * 1,2-дихидроиндол(ЗИЬилиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксо-тетрахидропиримидин1-ил)-пропил]-амид	·.....· ' • 438 [М-1 ]
139	J3?° JM Н ^снз н	2,4-диметил-5-[2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на [3-(2оксо-тетрахидропиримидин-1 -ил)-пропил]-амид	422 [М + 1]
140	0 Н,С ⁰ /—N н	5-[5-циано-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-или-денметил]2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксо-тетрахидропиримидин1-ил)-пропил]-амид	447 [М + 1]
141	°v ^βΓν^γΛ н 4 ϊϊ>° . ,? >д ^{r 1} OH F	трифлуороацетат 4[2-({5-[5-бромо-2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбонил}-амино)-етил]-2оксо-пиперазин-1	486[М +1 ] 488[М + 1]
142	0 ^H3? °a A H	5-[5-циано-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(ЗЕ)-илиденметил]2,4-диметил-1 77-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксопиролидин-1 -ил)пропил]-амид	430 [М-1]
143	^H3^C 0 Г\н /-\i] ^° ^BrX /-Х / Ν^Χ_ΓΗ Il7/=O^{H c 3} H	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол[32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-оксо-имидазолидин-1 -ил)етил]-амид	470[М-1] 472[М-1 ]

·· ··»·

144	^H3\v Q ^C\|\ /n-X.” \|\|>=o^{H 3} H	-------- -·------. » »---·----.y 5-[5-xnopo-2-oitio1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-оксоимидазолидин-1-ил)етил]амид	• · • · 428 [М + 1]
145	^нз^с 0 rA_H ^РААу_о ^й^^СНз H	5-[5-флуоро-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(ЗИ)-илиденметил]2,4-диметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-оксо-имидазолидин-1 -ил)етил]-амид	41 2 [М + 1 ]
146	^нз^с °w O^H /-AL н J Ν —\.._μ \|pN-A_°^{H сн}з H	2,4-диметил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 /7-пирол-3карбоксилна к-на [2-(2-оксо-имидазолидин-1-ил)-етил]ам ид	392 [М-1 ]
147	^H3^C °. N ⁴'JH ^N<A^zX<\_=oh'^{Ax ch}3 H	5-[5-циано-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна к-на [2-(2оксо-имидазолидин-1 -ил)-етил]амид	419 [М + 1]
148	^H ₃R H,C ⁰ /^^ΧΝ^χΛ^-^Ό> Br [i 'м*—'x. ХАЛ / ^СНз H	{4-[2-({5-[5-бромо-2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-ди метил-1 Нпирол-3-карбонил}амино)-етил]-пиперазин-1 -ил}-оцетна к-на етилов естер	558[М + 1 ] 560[М+1]

• · ··

149	^нз^ ^α\ \|\|\|>=о^Н °^Нз н	{4-[2-({5-[5-хлоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-Диметил- 1 Н-пирол-З-карбонил}амино)-етил]пиперазин-1 -ил}оцетна к-на етилов естер	51 4 [М + 1 ]
150	^нз^ ^F\ /¾. JΝ·^\_ΓΗγχ\ _о ^{н СНз} н	{4-[2-({5-[5-флуоро2-оксо-1,2-дихидроHHflon-(3Z)-nnnfleHметил]-2,4-диметил1/7-пирол-З-карбонил}-амино)-етил]. пиперазин-1 -ил}оцетна к-на етилов естер	498 [М + 1 ]
153	_и,« „ f VX. А-^^Н /¾. J~~~ н ^снз ^Х н	2,4-ДИметил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 Н-пирол-3карбоксилна к-на [2-(цианометиламино)-етил]-амид	362 [М-1]
154	°\\ Вг хь. J N -'А ^{н сн}з н	5 - [ 5 - б р о м о - 2 - о к с о - 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксоазепан-1 -ил)-пропил]-амид	511 [М-1 ] 51 3[М-1 ]
155	х_ ^Нзх °\\ ХЛХО р I J! N ^{н СНз} н	5-[5-хлоро-2-оксо1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-ДИметил-1 Нпирол-3-карбоксилна к-на [3-(2-оксоазепан-1 -ил)-пропил]-амид	469 [М + 1 ]

• · • · · · · · • «

156		H₃C ° Ax T \ ^H I 2=0 H	v-b H ⁴CH₃	5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксил- на к-на [3-(2-оксоазепан-1 -ил)-пропил]-амид	453 [М +1 ]
157			K	2,4-диметил-5-[2-	435
		3?	λ	оксо-1,2-дихидро-
			N ___J H	индол-(32)-илиден-	[М + 1]
		^V\ ^H	⁴C^H3	метил]-1 /7-пирол-З-
	(	I 2=0 N		карбоксилна к-на
		H		[3-(2-оксо-азепан-1 -
				и л) - п р ο п и л ] - а м и д
158		^нз9	λζ-Ь	5-[5-циано-2-оксо- 1,2-дихидроиндол-	460
		_-А	(32)-илиденметил]-	[М + 1]
	^N%		^чсн_п	2,4-диметил-1 /7-
	I	T/=°		пирол-3-карбоксил-
		Η		на к-на [3-(2-оксоазепан-1 -ил)-про-
				пил]-амид
159			A^V¹ ΪΙ ^{N 0}	5-[5-бромо-2-оксо-
	^вз9	1,2-дихидроиндол-	443[М-1 ]
			(32)-илиденметил]-	445[М-1 ]
	^Brx.	J n	II h	2,4-диметил-1 Н-
		1 JL	ch₃	пирол-3-карбоксил-
		H		на к-на (2-ацетиламино-етил)-амид
160		H₃C	V Z**N °A i )	трифлуороацетат 4- [2-({5-[5-флуоро-2-	426
			Vi _ZN^/	оксо-1,2-дихид рои н-	[М + 1 ]
	F.	^H )=0	H CH_q ^J 0	дол-(3Z)-и ли ден метил]^,4-диметил-1 Н-
		\An H		пирол-3-карбонил}-
			^{r 1} OH F	амино)-етил]-2оксо-пиперазин-1

• · • · · ·

161	I V^h ^Η3Υλ Cx>° ¹ k s ^{r 1} OH F	трифлуороацетат 4[2-({2,4-диметил-5[2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 Н-пирол-Зкарбонил}-амино)етил]-2-оксо-пиперазин-1	408 [М + 1 ]
162	4 H Z-N ^NCYVt h ^ch₃ ί 1 )=° _R π kA. ^{h 1} OH F	трифлуороацетат 4[2-({5-[5-циано-2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(3Z)-и ли денметил]^,4-диметил1 Н-пирол-З-карбонил}-амино)-етил]-2оксо-пиперазин-1	433 [М + 1]
163	N ^H3^C 0 ^__уМ\3 Br Jf 'n'''''^. ^{н сн}з H	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-цианоетиламино)-етил]амид	454[М-1 ] 456[М-1 ]
164	N ^H3^C ° //N\3 C1 Ji ' N у%Л ^{н сн}з H	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-цианоетиламино)-етил]амид	410 [М-1]
165	N ^H3^C ° ,~/Νχ3 F /s. J^'n**^,^⁴s. 111^4= ^{н СНз} H	5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 /-/-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-цианоетиламино)-етил]амид	394 [М-1]

♦ · • · • · « · • «

• · · · · · · ··· • · · · ·· · ···· • ·· ··· · · · · ····· ···· · · · · · · · · • · · · ·· ·· ·· ·

166	N ^Н3^С ° '__/N-^3 СХх° ^СНз Η	2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 Н-пирол-Зкарбоксилна к-на [2-(2-циано-етиламино)-етил]-амид	376 [М-1 ]
167	N cP ,_ н	5-[5-циано-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(ЗЕ)-илиденметил]2,4-ДИметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(2-цианоетил-амино)-етил]амид	401 [М-1]
168	V^h ^нз\1 й^сн Ί L >^с и кА_й \д ^{Н 1} OH F	трифлуороацетат 4[2-({5-[5-хлоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-Диметил1Н-пирол-3-карбонил}-амино)-етил]-2оксо-пиперазин-1	440 [М-1]
168	(ΧΑ/Α ^Η3= ° F Jj N'-''^'χ ^{Η CH}3 Η	5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-Диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на [2-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-етил]амид	424 [М-1]
169	_fX-_Nx^CH3 α Κ γ~ CI. χχ J Ν'^'Χ ]\|\|^)с==о^{Н СНз} Η	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(4-метил-пилеразин-1-ил)-етил]амид	440 [М-1]
170	[X^n/^CH3 ^н ₃с ° '/X Br. J Ν'Χ.,.. °^{Η 3} Η	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(ЗЕ)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на [2-(4-метил-пиперазин-1-ил)-етил]амид	484[М-1 ] 486[М-1 ]

• · • · · ·

• · · ·

АА ДА ДА.

171	^n/^CH3 VkA (ΥΧ)==°^{Η снз} Η	2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1/-/-пирол-3карбоксилна к-на [2-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-етил]ам и д	406 [М-1 ]
172	CH_q Λ yj^A ΓΎ>=ο ^СНз Ή	2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1Н-пирол-3карбоксилна к-на [2-(3,5-диметил-пиперазин-1-ил)-етил]амид	422 [М + 1 ]
173	Λ γχ ^Λ., F\ J nA ^{н сн}з Η	. 5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил)2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]-амид	438 [М-1]
174	CH_q A \A A^“· Ck ~ ΖνΛ. Yvy ^{н СНз} H	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]-амид	456 [М + 1 ]
175	CH_q A и,^с o ;+A “\Д /-7 Bk Y'n\ ^{н СНз} H	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол- (32)-илиденметил]- 2,4-диметил-1/-/-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]-амид	498[М-1 ] 500[М-1 ]
176	h₃c o H	2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 /-/-пирол-3карбоксилна к-на [3-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-пропил]-амид j	422 [M +1 ]

• · ·· · · · ·

···· ·· · « · · · • ·· ··· · ··· ····· ···· · · · · ·· · ** ····Μ»« »

177	Н₃С 0 /А ³ ^F\ /А ^СНз Η	5-[5-флуоро-2-оксо1,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 /Н-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-пропил]-амид	438 [М-1 ]
178	^Н3<? 0 ,,τ-ΑΧ /А/ ³ Cl\ J N-'X 11/3= ^{H CH}3 / H	5-[5-хлоро-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(ЗЕ)-илиденметил]2,4-Диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-пропил]-амид	454 [М-1]
179	^H3^{C 0} __/—;/ ^BtX J ' N-^X 11//= ^{H СНЗ} H	5-[5-бромо-2-оксо- • 1 ,2-дихидроиндол(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 /7-пирол-3-карбоксилна к-на [3-(4-метил-пиперазин-1 -ил)-пропил]-амид	498[М-1 ] 500[М-1 ]
180	^H+ k \ ) ιΓ^Ύ)= * ^СНз Η	2,4-диметил-5-[2оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-1 Н-пирол-Зкарбоксилна к-на [2-(4-бензил-пипера- зин-1 -ил)-етил]- амид	482 [М-1]
181	p/Q ^H3? °л \ ) VA Fx — Jf N*^A 1ΐΓ>= ^{н СНз} й	5-[5-флуоро-2-оксо1,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на [2-(4-бензилпиперазин-1 -ил)етил]-амид	500 [М-1]
182	Ζ~νΑ2) ^нз? к ' ) \Дл-А Cl N-^\ VyA ^{н СНз} н	5-[5-хлоро-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(4-бензилпиперазин-1 -ил)етил]-амид	517 [М-1]

« « •· •· •· •· • · • · •· • · •· •· • · • · ·· • · • ·

183	^Η3θ ° ( ) ^Br< Ji ν^χ ^{Η СНз} Η	5-[5-бромо-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(3Z)-ил иден метил ]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на [2-(4-бензилпиперазин-1-ил)етил]-амид	560[М-1] 562[М-1 ]
184	CFL J н₃с 0 ГУУИ \Д ° iOc^°^{H СНз} Η	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(Зг)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (З-пиролидин-1 ил-2-он)-амид	480 [М + 1 ]
185	0 κ / N ^Н3^С\ JA N-У ^снз cf₃co₂h	трифлуороацетат 4- [2-({5-[5-хлоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-Диметил- 1 Н-пирол-З-карбо- нил}-амино)-етил]-2оксо-пиперазин-1	440 [М-1 ]
186	0 c5 cr Ji n--\ ^{н СНз} H	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (З-пиролидин-1ил-2-он)-амид
187	УХ^У F Л N'^X. ₀ ^{н сн}з H	5-[5-флуоро-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол(32)-илиденметил(2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (З-пиролидин-1ил-2-он)-амид
188	o yyy c5 n ^СНз H	5-[2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна к-на (3-пиролидин-1 -ил-2-он)амид

·· ···· • · · · « · · · · _ г- ···· ··· ····

- 7 Η - ······· «······· * ···········

------------------ · ·----9-9--------99----9-Г1-------Г·------·--

189		N Н	^Η3θ ч Ν' Н =0	д^-^ДО 1 Н СН₃ cf₃co₂h	5-[5-хлоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол(3Z)-и ли ден мети л]2,4-ДИметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна к-на (2-пиридин-2илетил)-амид трифлуороацетатна сол
190			^н ₃с -<	к Ό	5-[5-флуоро-2-оксо- 1,2-дихидроиндол- (32)-илиденметил]-
			Ν'*	^“сн„	2,4-диметил-1 /7-пи-
	Ц		=0		рол-3-карбоксилна
		н		cf₃co₂h	к-на (2-пиридин-2илетил)-амид три-
					флуороацетатна сол
191					5-[2-оксо-1 ,2-дихид-
		^нз?	л.х0	роиндол-(32)-или-
			Ν'	денметил]-2,4-Диме-
		f	L ^н	тил-1Н-пирол-3-кар-
	ί Г		Н =0	СН₃	боксилна к-на (2-пи-
		N Н		HCI	ридин-2-илетил)-
				амид хидрохло-
					ридна сол
192			^нз^с	X /х JO	5-[5-бромо-2-оксо- 1 ,2-дихидроиндол- (32)-илиденметил]-
	BL·	/	Ν*	_1\| н	2,4-диметил-1 Н-пи-
	1 Ί		Н =0	^снз	рол-3-карбоксилна
		“'•N н		cf₃co₂h	к-на (2-пиридин-2илетил)-амид три-
					флуороацетатна сол

193	^н ^СНз н	5-[5-флуоро-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна к-на (2-етиламиноетил)амид
194	^НА °\\ ^F'^x\|j^x^⁴\|^\₌ н СН₃ Η	5-[5-флуоро-2-оксо-1 ,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на (2-аминоетил)-амид

• · ··

195	F	КС	Ο ΪΓ Ν' 1 ^Η СН₃	0	• ’ ” ------**——·-·------ГТ1-----·— 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4диметил-1 /-/-пирол-3-карбоксилна к-на (2-диетил-М-оксоаминоетил)-амид
S«^S?>^N Η	Ν* Η =0
196		щс	0		ΟΗ I	5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-
			-<				индол-(32)-илиденметил]-2,4-
			τ'	Η		диметил-1 /7-пирол-З-карбок-
	Ύ	Η =0		СН₃		силна к-на (2-етил-1\1-хидрокси-
		Η					аминоетил)-амид
197			^Η3?	0		Г, ΟΗ	5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-
					ν' Η	индол-(32)-илиденметил]-2,4- диметил-1/7-пирол-З-карбок-
	II	Η —ο		~СН₃		силна к-на (2-диетиламино-2-
		Ν Η					хидрокси етил)-амид
198		Η	Λ	0			5-[5-флуоро-2-оксо-1 ,2-дихидро- индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-
			<Ί		'^>Ν^/' Η	Υη	диметил-1 Н-пирол-З-карбоксил-
		Ν^ Η		СН₃		на к-на [2-етил-2-(2-хидрокси-
	\|l	^sS>k^N Η					етил)аминоетил]-амид
199		Η	³\	0		_r\	5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро- индол-(32)-илиденметил]-2,4-
			<1		^Ν'' Η	Υη	диметил-1/7-пирол-3-карбо кс ил-
	1	Ν**’ Η		СН₃		на к-на [2-етил-2-(1-хидрокси-
	\|l	^'Ν Η					етил)аминоетил]-амид
200				0			5-[5-циано-2-оксо-1,2-дихидро-
	^нз^с.		Η	индол-(32)-илиденметил]-2,4-
				ν	^Ν Η		диметил-1 Н-пирол-З-карбок-
		Ν' Η		^^снз	0	силна к-на (2-М-ацетиламино-
		Η	>=ο				етил)-амид
201			^нз^с		0		5-[5-флуоро-2-оксо-1 ,2-дихидро-
			f	'ν'^^ο,η	индол-(32)-илиденметил]-2,4-
			/^		Η ^ά	диметил-1 /7-пирол-З-карбок-
		ί Γ	\=с	Η	^снз	силна к-на (карбоксиметил)-
			’Ν Η				амид

•· · · ······ · · • · · · · · · «·· ···· ·· · ···· • ·· ··· · ··· · ····

• · · ·»1 9 9

202	.ΑΧ чАх LL	Ο Η ^XCH₃	Η	5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидрои н дол-(3Ζ)-и ли де н м етил]-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна к-на [2-(2-хидроксиетилмино)етил]-амид
203	^нз^с	0		5-[5-циано-2-оксо-1,2-дихидро-
			L Ο	индол-(Зг)-илиденметил]-2,4-
	_7	Ι\| Η		диметил-1 /7-пирол-З-карбок-
	СН₃		силна к-на (2-пиридин-2-етил)-
	[I \| 7=0 н		CF₃CO₂H	амид трифлуороацетат
204		ο		5-[5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-
	^нз^с _х		индoл-(ЗZ)-илидeнмeτил]-2,4-
	fr-WA й	1 Η	диметил-1 Н-пирол-З-карбок-
	сн₃	силна к-на (З-пиролидин-1 -ил-2-
	i 1 7=°			онпропил)-амид трифлуоро-
	Η			ацетат
205	Η	з^с\
				3-(3,5-диметилпирол-2-илмети-
	J	Ν·\ Η		лиден)-1-(4-метилпиперазин-1-
	ί L /	=0		илметил)-2-индолинон
	L		^CH3
206		3^С\		3-(3,5-ди метили и рол-2-илмети-
				лиден)-1-(пиролидин-1-илме-
	ί	\ У		тил)-2-индолинон
	ί Σ >	Η =0	^ЧСН₃
		ο

Номерата на съединенията съответстват на номерата от примерите в частта “Примери”. Тоест, синтезът на съединение 1 в Таблица I е описан като пример 1. Съединенията, дадени в таблица 1, са само примерни и не са предназначени да ограничават обхвата на изобретението по какъвто и да е начин. Допълнителни инхибитори на протеинкиназа, които могат да се използват в този метод, са 3-(3,5-диметилпропил-2-илметилиден)-2-индолинон (su 5416) 3-[3,5-диметил-4-(2-карбоксиет·♦ ♦«♦·

- 78 ил)пирол-2-илметилиден]-2-индолинон • · · · · · · ·· · • · · · · · ····· • · · · · · · · · · · ···· • · · · < · · · ·· · •· ·· ·· ·· ·· · (su 6668) и 3-[3-(2-карбоксиетил)-5-метилпирол-2-илметилиден]-2-индолинон.

В. Селективни инхибитори на циклооксигеназа-2 - съединения с формули (II) и (1111:

Неограничаващи примери на инхибитори на СОХ-2, които могат да се използват съгласно изобретението, са посочени в таблици II и III, по-долу.

ТАБЛИЦА II

съединение	търговско/ научно-изследов.име		Дозира- не
1,5-дифенил-З- заместени пиразоли		WO 97/13755
	радицикол	WO 96/25928 Kwon et al (Cancer Res.(1992)526296)
	GB-02283745
	ТР-72	Cancer Res 1 998 58 4717-723
1-(4-хлоробензоил)3-[4-(4-флуоро-фенил )тиазол-2-ил метил ]-5-метокси-2-метиндол	А-1838270
	GR-253035
4-(4-циклохексил-2-	JTE-522	JP 9052882

• · ··♦·

·· , ».· ·

метилоксазол-5-ил)- 2-флуоробензенсулфонамид
5-хлоро-3-(4-(метилсулфо нил) фенил )-2(метил-5-пиридинил)-пиридин
2-(3,5-дифлуоро-фенил)-3,4-(^метилсУЯ· фо нил)-фенил-2-циклопентен-1 -он
	L-768277
	L-783003
	МК-966; VIOXX®	US 5968974	12.5-100 mg/po
индометациново производно		WO 96/374679	200 mg/kg/дневно
1 - метилсулфонил-4[1,1 -диметил-4-(4флуоро-фенил)циклопента-2,4-диен-3ил]бензен		WO 95/30656 WO 95/30652 WO 96/38418 WO 96/38442
4,4-диметил-2-фенил-3-[4-(метилсулфонил)фенил]циклобутенон
2-(4-метоксифенил)4-метил-1 -(4-сулфамоилфенил)-пирол		ЕР 799823

• · ·· ··♦·

• · · · · · •У......Λ»-ft-ft ft.

Ν-[5-(4-φηγορο)φθнокси]тиофен-2-метансулфон-амид	RWJ-63556
5(Е)-(3,5-ди-трет.бутил-4-хидрокси)бензилиден-2-етил- 1,2-изотиазолидин- 1,1 -диоксид	S-2474	ЕР 595546
З-формиламино-7метансулфониламин о-6-фенокси-4Н-1 бензопиран-4-он	Т-614	DE 38/34204
Бензенсулфонамид, 4-(5-(4-метил фенил) З-(трифлуорометил)1Н-пиразол-1 -ил)	целекоксиб	US 5466823
CS 502	(Sankyo)
2-[(2-хлоро-6-флуорофенил)амино]-5метилбензеноцетна киселина	лумиракоксиб (Сох-189)	WO 99/1 1605
5-хл оро-6’- метил-3[4-(метилсулфонил)фенил]-2,3’-бипиридин	еторикоксиб (МК 663)	WO 98/03484
	BMS 34070	US 6180651
	мелоксикам	US 4233299	15-30 mg/днев но
	нимезулид	US 3840597

• · ····

ТАБЛИЦА III

WO 99/30721	WO 99/30729	US 5760068	WO 98/15528
WO 99/25695	WO 99/24404	WO 99/23087	FR 27/71005
EP 921119	FR 27/70131	WO 99/18960	WO 99/15505
WO 99/15503	WO 99/14205	WO 99/14195	WO 99/14194
WO 99/13799	GB 23/30833	US 5859036	WO 99/12930
WO 99/11605	WO 99/10332	WO 99/10331	WO 99/09988
US 5869524	WO 99/05104	US 5859257	WO 98/47890
WO 98/47871	US 583091 1	US 5824699	WO 98/45294 ,
WO 98/43966	WO 98/41511	WO 98/41846	WO 98/41516
WO 98/37235	EP 86/3134	JP 10/175861	US 5776967
WO 98/29382	WO 98/25896	ZA 97/04806	EP 84/6689
WO 98/21195	GB 23/19772	WO 98/11080	WO 98/06715
WO 98/06708	WO 98/07425	WO 98/04527	WO 98/03484
FR 27/51966	WO 97/38986	WO 97/46524	WO 97/44027
WO 97/34882	US 5681842	WO 97/37984	US 5686460
WO 97/36863	WO 97/40012	WO 97/36497	WO 97/29776
WO 97/29775	WO 97/29774	WO 97/28121	WO 97/28120
WO 97/27181	WO 95/1 1883	WO 97/14691	WO 97/13755
WO 97/13755	CA 21/80624	WO 97/1 1701	WO 96/41645
WO 96/41626	WO 96/41625	WO 96/38418	WO 96/37467
WO 96/37469	WO 96/36623	WO 96/36617	WO 96/31509
WO 96/25405	WO 96/24584	WO 96/23786	WO 96/19469
WO 96/16934	WO 96/13483	WO 96/03385	US 5510368
WO 96/09304	WO 96/06840	WO 96/06840	WO 96/03387
WO 95/21817	GB 22/83745	WO 94/27980	WO 94/26731
WO 94/20480	WO 94/13635	FR 27/70131	US 5859036

• · · to to to

WO 99/01131	WO 99/01455	·· ·< WO 99/01452	WO 99/01130
WO 98/57966	WO 98/53814	WO 98/53818	WO 98/53817
WO 98/47890	US 5830911	US 5776967	WO 98/22101
DE 19/753463	WO 98/21195	WO 98/16227	US 5733909
WO 98/05639	WO 97/44028	WO 97/44027	WO 97/40012
WO 97/38986	US 5677318	WO 97/34882	WO 97/16435
WO 97/03678	WO 97/03667	WO 96/36623	WO 96/31509
WO 96/25928	WO 96/06840	WO 96/21667	WO 96/19469
US 5510368	WO 96/09304	GB 22/83745	WO 96/03392
WO 94/25431	WO 94/20480	WO 94/13635	JP 09052882
GB 22/94879	WO .95/15316	WO 95/15315	WO 96/03388
WO 96/24585	US 5344991	WO 95/00501	US 5968974
US 5945539	US 5994381	US 6180651

Пиразоли могат да се получат по методи, описани в WO 95/15316. Пиразоли могат да се получат и по методи, описани в WO 95/15315, както и по методи, описани в WO 96/03385. Тиофенови аналози могат да се получат по методи, описани в WO 95/00501. Получаване на тиофенови аналози е описано и в WO 94/ 15932. Оксазоли могат да се получат по методите, описани в WO 95/00501. Получаването на оксазоли е описано и в WO 94/27980. Изоксазоли могат да се получат по методите, описани в WO 96/25405. Имидазоли могат да се получат по методите, описани в WO 96/03388. Получаване на имидазоли е описано, също, в WO 96/03387. Инхибитори на циклопентен циклооксигеназа-2 могат да се получат по методите, описани в патент на САЩ № 5,344,991. Получаване на инхибитори на циклопентан Сох-2 е описано и в WO 95/00501. Терфенилни съединения могат да се получат по методи, описани в WO 96/03392. Тиазолови и пиридинови съединения могат да се получат по

- 83 методите, описани в WO

96/03392. Получаването на пиридинови съединения е описано и в WO 96/24585.

Целекоксибът, използван в терапевтичните комбинации : съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен в патент на САЩ № 5,466,823.

Валдекоксибът, използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен в патент на САЩ № 5,633,272.

Парекоксибът, използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен ® в патент на САЩ № 5,923,598.

Рофекоксибът, използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен в патент на САЩ № 5,968,974.

JTE-522 на The Japan Tobacco, използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен в JP 90/52882.

Лумиракоксибът (Сох-189), използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, описан в WO 99/1 1605.

Еторикоксибът (МК 663), използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, описан в WO 98/03484.

BMS 34070 на Bristol Meyers Squibb, използван в терапевтичните комбинации съгласно изобретението, може да се получи по начин, изложен в патент на САЩ № 6,180,651.

По-горе дадените цитати, изброени в Таблици II и III, описват различни инхибитори на СОХ-2, подходящи за използване съгласно изобретението, както е дадено тук, а методи за тяхното получаване са включени поотделно тук чрез цитиране.

·· ····

- 84 • · ·· ·· • · < · • · ·· • · · · < · · · ·· ··

Предпочитани инхибитори на СОХ-2, които могат да се използват съгласно изобретението, са, без ограничение до изброените:

С1) • * • 9 · • ··«·

JTE-522, 4-(4-циклохексил-2-метилоксазол-5-ил)-2-флуоробензенсулфонамид;

С2) 5-хлоро-3-(4-(метилсулфонил)фенил)-2-(метил-5-пиридинил)пиридин;

СЗ) 2-(3,5-дифлуорофе нил )-3-(4-(метил сул фон ил) фенил)-2циклопентен-1 -он;

С4)

4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 ил]бензенсулфонамид;

• · · ·

- 85 С5)

рофекоксиб, 4-[4-(метил сулфонил)фенил]-3-фенил-2(5Н)фуранон;

С6)

4-(5-метил-3-фенилизоксазол-4-ил)бензенсулфонамид;

07) М-[[4-(5-метил-3-фенилизоксазол-4-ил)фенил]сулфонил]пропанамид;

4-[5-(4-хлорофенил)-3-(трифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 -ил]бензенсулфонамид;

• · · · · ·

- 86 С9)

С10)

С11)

6-[[5-(4-хлоробензоил)-1,4-д и метил-1 Н-пирол-2-ил] метил ]-

3-(2Н)-пиридазинон;

С12)

о.

« · · · · ·

- 87 М-(4-нитро-2-феноксифенил)метансулфонамид;

С13)

С14)

3-(3,4-дифлуорофенокси)-5,5-диметил-4-[4-(метилсулфонил)фенил]-2(5Н)-фуранон;

М-[в-[(2,4-дифлуорофенил)тио]-2,3-дихидро-1 -оксо-1 Нинден-5-ил]метансулфонамид;

• 4 · • · · • · · · • · · · · · • · · • · ·

С16)

3-(4-хлорофенил)-4-[4-(метилсулфонил)фенил]-2(ЗН)оксазолон;

С С17)

4-[3-(4-флуорофенил)-2,3-дихидро-2-оксо-4-оксазолил]бен-

зенсулфонамид;

С18)

3-[4-(метилсулфонил)фенил]-2-фенил-2-циклопентен-1 -он;

• · • ·

С19)

4-(2-метил-4-фенил-5-оксазолил)бензенсулфонамид;

С20)

3-(4-флуорофенил)-4-[4-(метилсулфонил)фенил]-2(ЗН)оксазолон;

С21)

5-(4-флуорофенил)-1 - [4-(метилсулфонил)фенил]-3-(трифлуорометил)-1 Н-пиразол;

- 90 С22)

4-[5-фенил-3-(трифлуорометил)-1Н-пиразол-1-ил]бензенсулфонамид;

4-[1 -фенил-З-(трифлуорометил)-! Н-пиразол-5-ил]бензен-

сулфонамид;

С24)

4-[5-(4-флуорофенил)-3-(трифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 и л]бензен сулфонамид;

С25)

1\1-[2-(циклохексилокси)-4-нитрофенил] метансулфонамид;

С26)

1\1-[6-(2,4-дифлуорофенокси)-2,3-дихидро-1 -оксо-1 Н-инден-

5-ил] метансулфонамид;

С27)

3-(4-хлорофенокси)-4-[(метилсулфонил)амино]бензенсул фонамид;

- 92 С28)

3-(4-флуорофенокси)-4-[(метилсулфонил)амино]бензенсул фонамид;

С29)

[ (1 -метил-1 Н-имидазол-2-ил)тио]-4-[(метилсулфонил)амино]бензенсул фонамид;

СЗО)

СН₃

5,5-диметил-4-[4-(метилсулфонил)фенил]-3-фенокси-2(5Н)фуранон;

- 93 С31)

М-[6-[4-етил-2-тиазолил]-1,3-дихидро-1-оксо-5-изобензофуранил]метансулфонамид;

С32) с

3-[(2,4-дихлорофен ил )тио]-4-[ (метил сулфонил) амино] бензенсулфонамид;

СЗЗ)

-флуоро-4-[2-[4-(метилсулфонил)фенил]циклохептен-1 ил]бензен;

- 94 ·· ···· ♦ · ·· • · · ♦ • · «· • · · · • · · · ·· · ·

• · · • ····

С34)

4-[5-(4-хлорофенил)-3-(дифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 ил]бензенсулфонамид;

С 35)

3-[1 -[4-(метил сулфонил) фенил ]-4-(трифлуорометил)-1 Нимидазол-2-ил]пиридин;

С36)

• · ···· • ·

4-[2-(3-пиридинил)-4-(трифлуорометил)-1 Н-имидазол-1 - ил] бензенсулфонамид;

С37)

4-[5-(хидроксиметил)-3-фенил изоксазол-4-ил]бензен сулфонамид;

38)

4-[3-(4-хлорофенил)-2,3-дихидро-2-оксо-4-оксазол]бензен сулфонамид;

С39)

• ·

9 9 99

- 96 4-[5-(дифлуорометил)-3-фенилизоксазол-4-ил]бензенсул фонамид;

С40)

[1,1 ’: 2’, 1 ”-терфенил]-4-сулфонамид;

С41)

4-[(метилсулфонил)-1,Г,2],1 ’’-терфенил;

С42)

4-(2-фенил-3-пиридинил)бензенсулфонамид;

• · ··♦ ·

С43)

М-(2,3-дихидро-1,1 - диоксидо-6-фенокси-1,2-бензизотиазол-

5-ил)метансулфонамид;

С44)

Г\1-[3-(формилам1/1но)-4-оксо-6-фенокси-4Н-1-бензопиран-7-ил]метансулфонамид;

С45)

CI

С46)

С47)

С48)

С49)

лумиракоксиб (СОХ-189)

NH·

Cl

Me·

·· ·♦<··

- 99 2-[(2-хлоро-6-флуорофенил)амино]-5-метилбензеноцетна киселина;

С50) еторикоксиб (МК 663)

5-хл оро-6’-метил-3-[4-(метилсул фон ил) фенил ]-2,3’-били ри- дин;

С51)

Особено предпочитани инхибитори на СОХ-2, които могат да се използват съгласно изобретението, са избраните от групата, състояща се от:

·· ····

- 100 -

I)

Η)

5-хл оро-3-(4-(метилсул фон ил) фенил )-2-(мети л-5-пиридинил)пиридин;

Hi)

2-(3,5-дифлуорофенил)-3-(4-(метилсулфонил)фенил)-2циклопентен-1 -он;

V)

рофекоксиб, 4-[4-(метилсулфонил)фенил]-3-фенил-2(5Н)фуранон;

^w VI)

^w VII)

М-[[4-(5-метил-3-фенилизоксазол-4-ил)фенил]сулфонил]пропанамид;

VIII)

Cl ·· ·*·· • ·

- 102 ·· ·· ·· ·

4-[5-(4-хлорофенил)-3-(трифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 -ил]бензенсулфонамид; и

IX) лумиракоксиб (СОХ-189)

Н₂

2-[(2-хлоро-6-флуорофенил)амино]-5-метилбензеноцетна киселина.

Още по-предпочитани инхибитори на СОХ-2, които могат да се използват съгласно изобретението, без да се ограничават до изброените, са целекоксиб, валдекоксиб, парекоксиб, рофекоксиб, лумиракоксиб и Japan Tobacco JTE-522.

В комбинацията съгласно изобретението се включват също изомерните форми, пролекарствата и тавтомерите на описаните съединения и техните фармацевтично приемливи соли. Примерни фармацевтично приемливи соли се получават от мравчена, оцетна, пропионова, янтарна, гликолова, млечна, ябълчна, винена, лимонена, аскорбинова, глюкоронова, малеиова, фумарова, пирогроздена, аспарагинова, глутамова, бензоена, антранилова, мезилова, стеаринова, салицилова, р-хидроксибензоена, фенилоцетна, бадемена, памоева, метансулфонова, етансулфонова, бензенсулфонова, пантотенова, толуенсулфонова, 2-хидроксиетансулфонова, сулфанилова, циклохексиламиносулфонова, алгенова, b-хидроксимаслена, галактуронова киселини.

- 103 * ·

ПОЛЕЗНОСТ

Съединенията съгласно изобретението са инхибитори на протеинкинази (PKs) и циклооксигеназен ензим, по-специално на ензима циклооксигеназа-2 и оттук са приложими за лечение на рак.

Протеинкиназите, чието каталитично действие се модулира от съединенията с формула (I) съгласно изобретението, включват протеинтирозинкинази, като рецепторни тирозинкинази (RTKs), клетъчни тирозинкинази (CTKs) и серин-треонинкинази (STKs). Сигнална трансдукция, медиирана от RTK се стимулира от извънклетъчно взаимодействие със специфичен растежен фактор (лиганд), следвано от рецепторна димеризация, транзиторна стимулация на свойствено действие на протеинтирозинкиназа и фосфорилиране. По този начин се създават места за свързване на молекули на вътреклетъчна сигнална трансдукция и това води до образуването на комплекси със спектър от цитоплазмени сигнални молекули, които улесняват съответния клетъчен отговор (например, клетъчно делене, метаболитни влияния върху извънклетъчната микросреда и т.н.). Виж, Schlessinger and Ulrich, 1992, Neuron 9:303-391.

Показано е, че места за фосфорилиране на тирозин върху рецептори на растежен фактор действат като свързващи места със силен афинитет към SH2 (src хомология) домени за сигнални молекули. Fant et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778 и Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Идентифицирани са няколко вътреклетъчни субстратни протеина, които се свързват с RTKs. Те могат да се разделят на две основни групи: (1) субстрати, които имат каталитичен домен и (2) суб- 104 • ·

които служат като страти, които нямат каталитичен домен, но адаптери и се свързват с каталитично активни молекули. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Специфичността на взаимодействията между рецептори и SH2 домени за техни субстрати се определя чрез аминокиселинните остатъци, заобикалящи непосредствено фосфорилирания тирозинов остатък.

Разлики в афинитетите към свързване между SH2 домени и аминокиселинните последователности, заобикалящи фосфоти розиновите остатъци върху конкретни рецептори съответстват на наблюдаваните разлики в техните профили на фосфорилиране на субстрата. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Тези наблюдения подсказват, че действието на всяка RTK се определя не само от нейния модел на експресия и наличност на лиганд, но и от редуването на пътищата на сигнална трансдукция в ориентация “downstream”, които се активират от определен рецептор. Така, фосфорилиране осигурява важен регулаторен етап, който определя селективността на сигнални пътища, възстановени от специфични рецептори за растежен фактор, както и от рецептори на диференциращ фактор.

Серин-треонинкинази (STKs), които са главно цитозоли, засягат вътрешната биохимия на клетката, често като низходящ отговор на РТК събитие. STKs участват в сигналния процес, който стимулира ДНК синтез и следваща митоза, водеща до клетъчна пролиферация.

И така, РК сигнална трансдукция води до, между другите отговори, клетъчна пролиферация, диференциация, развитие и метаболизъм. Ненормална клетъчна пролиферация може да доведе до широк кръг от нарушения и заболявания, включително развитие на неоплазия, като карцином, сарком, глиобластом и хемангиома, нарушения, като левкемия, псориазис, ар- 105 • · ·· ·· ·· .. :

и други наруи/или васку♦ · · · • · · · • · · · • · · · · • · · · ·· ·· териосклероза, артрит и диабетна ретинопатия шения, свързани с неконтролиран ангиогенезис логенезис.

Не се изисква детайлно разбиране на механизма, по който съединенията съгласно изобретението инхибират PKs, за да се прилага изобретението. Но, доколкото тук не се обвързва с даден конкретен механизъм или теория, то се счита, че съединенията с формула (I) взаимодействат с аминокиселини в каталитичната област на PKs. PKs обикновено притежава двуделна структура, в която, вероятно, АТР се свързва в цепнатината между двата дяла в област,'в която аминокиселините са запазени между PKs. Счита се, че инхибитори на PKs се свързват чрез нековалентни взаимодействия, като водородно свързване, вандервалсови сили и йонни взаимодействия в същата обща област, в която споменатата по-горе АТР се свързва с PKs. По-точно, се смята, че 2-индолиноновият компонент на съединенията с формула (I) се свързва в общото пространство, което нормално е заето от адениновия пръстен на АТР. Като резултат на допълнителни взаимодействия между различните заместители в 2-индолиноновото ядро и аминокиселинните домени, специфични към определени PKs, може да възникне специфичност на определена молекула към определена РК. Оттук, различни индолинонови заместители могат да спомогнат за преференциално свързване с определени PKs. Възможността да се изберат съединения, които са активни при различни места за свързване на АТР (или друг нуклеотид) прави съединенията с формула (I), полезни за въздействие върху всеки протеин с такова място. По този начин, описаните тук съединения с формула (I) са приложими в in vitro опити за такива протеини, като показват и in vivo терапевтични ефекти,

- 106 благодарение на взаимодействие с такива протеини.

Допълнително, съединенията с формула (I) имат терапевтична роля при лечението на много видове твърди тумори, включително, без да се ограничават до тях, карциноми, саркоми, включително сарком на Капоши, еритробластом, глиобластом, менингиом, астроцитом, меланом и лиобластом. Лечение или профилактика на нетвърди туморни ракови образувания, като левкемия, също се имат предвид съгласно изобретението. Показанията могат да включват, но не се ограничават до тях, рак на мозъка, рак на пикочния мехур, рак на яйчниците, рак на стомаха, рак на панкреаса, рак на колона, рак на кръвта, рак на белите дробове и костен рак.

Други примери, без ограничение, за видовете нарушения, свързани с ненормална активност на РК, при които съединенията съгласно изобретението могат да бъдат полезни за профилактика, лечение или изследване, са клетъчни пролиферативни нарушения, фиброзни нарушения и метаболитни наруше ния.

Клетъчни пролиферативни нарушения, които могат да бъдат предотвратени, лекувани или изследвани по-нататък с помощта на изобретението са рак, пролиферативни нарушения на кръвоносен съд и пролиферативни нарушения на мезангиални клетки.

Пролиферативни нарушения на кръвоносен съд се наричат нарушения, свързани с ненормален васкулогенезис (образуване на кръвоносен съд) и ангиогенезис (разпространение на кръвоносни съдове). Доколкото васкулогенезисът и ангиогенезисът играят важна роля в множество нормални физиологични процеси, като ембрионално развитие, образуване на

- 107 .··.···; .·· · жълто тяло, зарастване на рани и органова регенерация, те играят, също, централна роля при развитие на рак, където водят до образуване на нови капиляри, ване на тумора жив. Други примери за необходими за запазнарушения в пролифепри който нови капирацията на кръвоносен съд са артрит, лярни кръвоносни съдове обхващат ставата и разрушават хрущяла, очни заболявания, като диабетна ретинопатия, при която нови капиляри в ретината обхващат стъкловидното тяло, кървят и причиняват слепота.

Идентифицирани са две структурно свързват VEGF със силен афинитет’: fms-подобен тирозинов (fit-1) рецептор (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., Science, 255: 989-991) и KDR/FLK-1 рецептор, изблизки RTKs, които вестен също като VEGF-R2. За васкуларен ендотелиален расте(VEGF) се съобщава, че е ендотелиален клетъчно жен фактор специфичен клетъчно развитие действие. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461-19566. В информация, дадена в американски ,596 и 07/975,750, убедимитоген с in vitro промотиращо ендотелиалното заявки сер. №№ 08/193,829; 08/038 телно се само отговорен за ендотелиална предполага, че VEGF е не клетъчна пролиферация, но и патологичен ангиогенезис. Виж главно, Klagsburn е и основен регулатор на нормален & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Hguck, et al., 1992,

J. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Нормални васкулогенезис и ангиогенезис играят важни роли в различни физиологични процеси, като ембрионално развитие, зарастване на репродуктивни процеси, рани, органова регенерация и женски като развитие на лимфен възел в жълтото тяло при овулация и развитие на плацентен тумор след ·· ····

- 108 ·♦ · • · · • · · · • · · · · · ·· ·· *··* : бременност. Folkman & Shing, 1992, J. Biol.fqical Chem,,

267(16):10931-34. Неконтролирани васкулогенезис и/или ангиогенезис се свързват със заболявания като диабет, както и със злокачествени твърди тумори, които нарастват благодарение на васкуларизация. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology,

3(10): 699-702; Folkham, 1991, J, Natl. Cancer Inst., 82:4-6;

Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Обобщената роля на VEGF в ендотелиална клетъчна про лиферация и миграция при ангиогенезис и васкулогенезис е показана като важна за KDR/FLK-1 рецептора в тези процеси. Заболявания като диабет (Folkman, ‘198, в Xl-ти Конгрес по тромбоза и хемостаза (Verstraeta et al), стр. 583-596, Leuven University Press, Leuven) и артрит, както и развитие на злокачествен тумор, могат да се дължат на неконтролиран ангиогенезис. Виж, например, Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182-1 186. Рецепторите, c които VEGF се свързва специфично, са важна терапевтична цел за регулиране и модулиране на васкулогенезис и/или ангиогенезис и различни остри заболя-

вания, които са свързани с ненормално клетъчно развитие, причинено от такива процеси. Plowman et al., 1994, DN&P,

7(6):334-339. По-конкретно, KDR/FLK-1 рецепторът, който има много специфична роля в неоваскуларизацията, я прави избрана цел за терапевтичните приоми за лечение на рак и други заболявания, които включват неконтролираното образуване на кръвоносни съдове.

Оттук, изобретението предоставя съединения, които са способни да регулират и/или модулират тирозинкиназна сигнална трансдукция, включително сигнална трансдукция на

KDR/FLK-1 рецептор, за да се инхибира или промотира ангиогенезис и/или васкулогенезис, тоест, съединения, които инхи- 109 ’· ·· · · ·· бират, предотвратяват или възпрепятстват сигналната трансдукция чрез KDR/FLK-1, когато се активира от лиганди, като VEGF. Независимо от това, че се счита, че съединенията съгласно изобретението действат върху рецептор или друг компонент, покрай биосинтетичния път на тирозинкиназната сигнална трансдукция, те могат да действат и директно върху туморните клетки, които са резултат от неконтролиран ангиогенезис.

Въпреки, че номенклатурата на човешките и мишите съответствия на родовия “flk-1 ” рецептор са различни, те са в много отношения равностойни. Мишият рецептор, FLK-1 и неговото човешко съответствие, KDR, имат хомоложна последователност 93.4% във вътреклетъчния домен. Подобно, мишият FLK-1 се свързва човешки VEGF със същия афинитет, както с мишия VEGF съответно, се активира от лиганда, получен от двата вида.

1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 е свързан, също, c тирозинфосфорилати на човешки RTK субстрати пример, PLC-γ или р85), като съекспресира в 293 клетки (човешки ембрионални бъбречни фибропласти).

Следоветелно, модели, които се основават на FLK-1 рецептор, са директно приложими за разбиране на

KDR рецептора. Например, използване на мишия FLK-1 рецептор в методи, с които се идентифицират съединения, регулиращи мишия биосинтетичен път на сигнална трансдукция, са директно приложими за идентифициране на съединения, които могат да се използват за регулиране на човешкия биосинтетичен път на сигнална трансдукция, тоест, които регулират активността по отношение на KDR рецептора. И така, химични съединения, определени като инхибитори на KDR/FLK-1 in vitro, могат да • · ····

- 110 -

бъдат потвърдени в подходящи in vivo модели.

. · · · · ΐ I. · · · · *··· ·· * * · ·

Както in' vivo миши, така и с плъхове животински модели, са показали, че имат висока стойност за изследването на клиничния потен циал на средства, действащи върху стимулиран от KDR/FLK-1 биосинтетичен път на сигнална трансдукция.

Следователно, изобретението предоставя съединения, които регулират, модулират и/или инхибират васкулогенезис и/или ангиогенезис чрез въздействие върху ензимната актив ност на KDR/FLK-1 рецептора и възпрепятстване на сигналната трансдукция чрез KDR/FLK-1. Така, изобретението осигурява терапевтичен подход към лечението на много видове твърди тумори, включително, без да се ограничава до изброените, глиобластом, меланом и сарком на Капоши и яйч ников, белодробен, гръден, простатен, панкреасен карцином, карцином на колона и епидермоиден карцином. Допълнително, данни показват, че прилагането на съединения, които инхибират биосинтетичния път на сигнална трансдукция, медиирана от KDR/FLK-1, могат също да се използват за лечение на хемангиома, рестеноза и диабетна ретинопатия.

Освен това, изобретението се отнася до инхибирането на васкулогенезис и ангиогенезис чрез други пътища, медиирани от рецептор, включително биосинтетичен път, включващ fit-1 рецептора.

Сигнална трансдукция, медиирана от тирозинкиназен рецептор, се стимулира чрез извънклетъчно взаимодействие със специфичен растежен фактор (лиганд), следвано от рецеп торна димеризация, транзиторна стимулация на присъщото действие на протеинтирозинкиназа и автофосфорилиране. По този начин се създават места за свързване за вътреклетъчни молекули на сигнална трансдукция, което води до образуване•· ··♦·

-111

.......... ;

то на комплекси със спектър от цитоплазмени сигнални молекули, които подпомагат подходящия клетъчен отговор, например, клетъчно делене и метаболитни влияния върху извънклетъчната среда. Виж, Schlessinger и Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

Близката хомоложност на вътреклетъчните области на KDR/FLK-1 с тези на PDGF-β рецептора (50.3% хомоложност) и/или на сродния fit-1 рецептор показва причината за частичното съвпадане на биосинтетичните пътища на сигнална трансдукция. Така например, за PDGF-β рецептора, членове на src фамилия (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7696-7700), фосфатидилинозитол-3’-киназа (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), фосфолипаза cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTPase-активиращ протеин (Kashishian et al., 1992, EMBO J.. 1 1:1373-1382), PTPID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1090: 6393-6934), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:67156726) и адаптерни молекули She Nek (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896), е посочено, че се свързват с области, включващи различни места за автофосфорилиране. Виж главно, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Следователно, възможно е биосинтетичните пътища на сигнална трансдукция, активирани от KDR/FLK-1, включително ras пътя (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), PI 3’-киназният, src-медиираните и р1су-медиираните биосинтетични пъти ща. Всеки от тези биосинтетични пътища може да играе критична роля в ангиогенното и/или васкулогенното действие на

KDR/FLK-1 в ендотелиални клетки. Следователно, още един аспект на изобретението се отнася до използването на органичните съединения, описани тук, за модулиране на ангиоге ·· ·9

- 112 незис и васкулогенезис, доколкото тези процеси се контролират от тези биосинтетични пътища.

Обратно, нарушения, свързани със свиване, съкращаване или затваряне на кръвоносни съдове, като рестеноза, също се имат предвид и могат да бъдат лекувани или предотвратявани по методи съгласно изобретението.

Под фиброзни нарушения се разбира ненормално образуване на извънклетъчно междуклетъчно вещество. Примери на фиброзни нарушения са чернодробна цироза и пролиферативни нарушения на мезангиални клетки. Чернодробната цироза се характеризира с нарастване на компонентите на извънклетъчното междуклетъчно вещество, което води до образу ване на чернодробен цикатрикс. Повишеното междуклетъчно вещество, което води до чернодробен цикатрикс, може да се дължи на вирусна инфекция, като хепатит. Вероятно липоцити играят основна роля в чернодробната цироза. Друго фиброзно нарушение, което се има предвид, е атеросклерозата.

Мезангиално клетъчни пролиферативни нарушения са нарушения, които се предизвикват от ненормална пролиферация на мезангиални клетки. Мезангиални пролиферативни нарушения включват различни човешки бъбречни заболявания, като гломерулонефрит, диабетна нафропатия и злокачествена нефросклероза, както и заболявания, като синдроми на тромботична микроангиопатия, отхвърляне на трансплантат и гломерулопатии. В поддържането на мезангиалната клетъчна пролиферация участва RTK PDGFR. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.

Много ракови заболявания са клетъчни пролиферативни нарушения и както е отбелязано по-горе, протеинкинази (Pks) са свързани с клетъчни пролиферативни нарушения. Ето защо, • · ····

- 113 ·· ♦· ·· « не е изненадващо, че протеинкинази, като например, членовете на RTK семейството са свързани с развитието на рак. Някои от тези рецептори, като EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719)

HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) и PDGF-R (Kumale et al., 1992,

Oncogene, 7:627-633) са свръхекспресирани в много тумори и/или постоянно се активират от автокринни бримки. В действителност, в повечето общи и остри ракови заболявания са доказани тези рецепторни свръхекспресии (Akbasak и

Suner-Akbasak

111: 119-133,

Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249273, Korc. Et al., 1992, J. Cln. Invest. 90:1352-1360) и автокринни бримки (Lee и Donoghue, 1992, J. Cell.Biol.

118:1057-1070, Korc et al.

както no-rope, Akbasak и Suner-Akbask, както no-rope).

Така например, EGFR е свързан c плоскоклетъчния рак, астроцитома, глиобластома, с рака на главата и врата, с белодробния рак и рака на пикочния мехур. HER2 е свързан с рака на млечните жлези, яйчниците, стомаха, белите дробове, панкреаса и пикочния мехур. PDGFR е свързан с глиобластом и меланом, както и с рака на белите дробове, яйчниците и простатата. RTK c-met е свързан и с образуване на злокачествен тумор. Така например, c-met е свързан, между другите ракови заболявания, с колоректални, тироидни, панкреасни, стомашни и хепатоклетъчни карциноми и лимфоми. Допълнително, c-met е свързан с левкемия. Свръхекспресия на гена на c-met е открита у болни от болестта на Ходжкин и болестта на

Буркит.

IGF-IR, заедно с участието му в парентерално хранене и диабет тип II, е свързан и с няколко типа рак. Така например, IGF-I се намесва като автокринен растежен стимулатор за ня- 114 -

• · колко типа тумори, например, човешки карциномни клетки от рак на млечната жлеза (Atreaga et al., 1989, J, Clin. Invest.

84:1418-1423) и дребни клетки от белодробен тумор (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Освен това, IGF-I, дока то като цяло участва в нормалното развитие и диференциа цията на нервната система, вероятно се явява и автокринен стимулатор на човешки глиоми. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. Значимостта на IGF-IR и негови лиганди в клетъчната пролиферация е подкрепена допълнително от факта, че много клетъчни типове в култура (фибробласти, епителиални клетки, клетки на гладък мускул, Т-лимфоцити, миелоидни клетки, хондроцити и остеобласти (стволни клетки на костния мозък) се стимулират към растеж от IGF-I. Goldring r Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. Baserga и Coppola предполагат, че IGF-IR играе централна роля в механизма на трансформация и като такъв, може да бъде предпочитана цел за терапевтични интервенции за широк спектър от човешка злокачественост. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595.

STKs се намесва в много типове рак, включително, осоено, в рак на млечната жлеза (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Връзката между неправилното действие на РК и заболяване не се ограничва само до рака. Така например, RTKs се свързва със заболявания като псориазис, захарен диабет, ендометриоза, ангиогенезис, развитие на атеросклеротична плака, болест на Алцхаймер, рестеноза, болест на ХипелЛиндау, епидермална хиперпролиферация, невродегенеративни заболявания, възрастова петниста дегенерация и хе·· · · ··

- 115 ·· ·· ·· ; мангиоми. Например, EGFR е показан за заздравяване на корнеална и кожна травма. По-пълна корелация между специфични RTKs и техни терапевтични индикации е дадена в Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.

Както е отбелязано преди това, не само RTKs, но и CTKs включително,-без да се ограничава до, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, hck, fgr и yrk (разгледани от Bolen et al., 1992, FASEB J,, 6:3403-3409) участват в пролиферативния и метаболитен биосинтетичен път на сигнална трансдукция и по този начин може да се очаква и е показано, че се намесват в много РТКмедиирани нарушения, към които е насочено изобретението. Така например, мутирал src (v-src) е установено, че е онкопротеин (pp60^vsrc) на пиле. Освен това, негов клетъчен хомолог, прото-онкогенът pp60^{c src} пренася онкогенни сигнали на много рецептори. Свръхекспресия на EGFR или HER2/neu в тумори води до органично действие на pp60^c'^src, което е характерно за злокачествени клетки, но отсъства в нормални клетки. От друга страна, мишки с недостатъчна експресия на c-src проявяват остеопетротен фенотип, с което се посочва ключово участие на c-src в остеокластната функция и възможно участие в сродни нарушения.

Подобно, Zap70 участва в Т-клетъчно сигнализиране, което може да се отнесе към автоимунни болести.

STKs се свързват с възпаления, автоимунни заболявания, имунни отговори и хиперпролиферации, като рестеноза, фиб роза, псориазис, остеоартрит и ревматоиден артрит.

PKs участват също в ембрионно имплантиране. Оттук, съединенията съгласно изобретението могат да осигурят ефективен метод за предотвратяване на такова ембрионно имплантиране и по този начин да бъдат полезни като средства за

-116.··.···; .·· · : :.-. .: : · · - . ·..··..· · ·· · ’ ί :-:· *· ·· ·· ·· .. .

контролиране на раждане. Други заболявания, които могат да бъдат лекувани или предотвратявани с помощта на съединенията съгласно изобретението, са имунологични заболявания, като автоимунна болест, СПИН и сърдечно-съдови болести, като атеросклероза.

И накрая, и 3aRTKs, и за CTKs понастоящем се предполага, че участват в хиперимунни нарушения.

Примери за влиянието на редица примерни съединения « съгласно изобретението върху PTKs са дадени в Таблица 2, подолу. Съединенията, както и представените данни не трябва да се разглеждат като ограничаващи обхвата на изобретението по какъвто и да е начин.

В. Инхибитор на циклооксигеназа-2 или инхибитор на СОХ-2 включва средства, които инхибират специфично клас ензими, циклооксигеназа-2, с незначително инхибиране на циклооксигеназа-1. За предпочитане, тук се включват съединения, които имат 1С₅₀ за циклооксигеназа-2 по-ниска от 0.2 цМ и имат показател на селективност за инхибиране на циклооксигеназа-2 по отношение на инхибиране на циклооксигеназа-1 най-малко 50, за предпочитане най-малко 100. Дори се предпочитат съединенията, които имат 1С₅₀ за циклооксигеназа-1 по-висока от около 1 μΜ и още по-добре над 10 μΜ.

Изследвания показват, че простагландини, синтезирани от циклооксигенази, играят критична роля в инициирането и промотирането на рак. Освен това, СОХ-2 свръхекспресира в неопластични лезии на колона, гърдата, белия дроб, простатата, хранопровода, панкреаса, червата, шийката, яйчниците, пикочния мехур и главата и врата. СОХ-2 инхибитори инхибират туморно развитие и метастази в някои in vitro и живо тински модели.

117 допълнение към самия рак, СОХ-2 експресира,

също, в ангиогенната съдова система в или близко до хиперпластични и неопластични лезии, което показва, че СОХ-2 играе роля в ангиогенезиса. Както при мишки, така и при плъхове, инхибиторите на СОХ-2 забележимо инхибират индуцираната от bFGF неоваскуларизация. Приложимостта на инхибитори на СОХ-2 като химиопрофилактични антиангиогенни и химиотерапевтични средства е описана в литературата (Koki et al.,

Potential

utility of COX-2 inhibitors

Exp. Opin. Invest. Drugs in chemoprevention and chemotherapy.

(1999) 8(10), 1623-1638 цитирана тук).

Нарастване и/или свръхекспресия на HER-2/nue (ЕгЬВ2) се, среща в 20-30% от рака на млечната жлеза и яйчниците при хора, както и в 5-15% от рака на стомаха и хранопровода и е свързано с лоша прогноза. Допълнително, напоследък е установено in vitro, че експресията на СОХ-2 е наднормена в клетки, свръхекспресиращи HER-2/neu онкоген. (Subbaramaiah et al., Increased expression of cyclooxigenase-2 in HER-2/neuoverexpressing breast cancer. Cancer Research (представено 1999), включено тук чрез цитиране). В това изследване, се открива значително повишаване на нивата на произвеждане на PGF₂, СОХ-2 протеин и иРНК в HER-2/neu трансформирани мамарни епителиални клетки в сравнение с нетрансформирана партнираща клетъчна линия. Продукти на действие на СОХ-2, т.е., простагландини, стимулират пролиферация, повишават инвазивността на злокачествени клетки и усилват производството на съдов ендотелиален растежен фактор, който промотира ангиогенезис. Освен това, HER-2/neu стимулира производството на ангиогенни фактори, като съдов ендотелиален растежен фактор.

• · ····

-118• · • · · • · · · • · ···«·

Следователно, прилагането на инхибитор на СО\-2 в’комбинация с анти-НЕВ-2/пеи антитела, като трастузумаб (Herceptin®) и други терапии, насочени към инхибиране на HER-2/neu, се очаква да лекува ракови заболявания, в които HER-2/neu е свръхекспресиран.

Очаква се, също, нивата на СОХ-2 да се повишат в тумори с увеличение и/или свръхекспресия на други онкогени, включително, без това да ги ограничава) c-myc, N-myc, L-myc, K-ras, H-ras, N-ras. Продукти на действието на СОХ-2 стимулират клетъчна пролиферация, инхибират имунния контрол, повишават инвазивността на злокачествени клетки и промотират ангиогенезис. Следователно, прилагането на протеинкиназен инхибитор в комбинация с инхибитор на СОХ-2 съгласно изобретението е приложимо за профилактика или лечение на ракови заболявания, при които онкогени свръхекспресират.

Специфични инхибитори на СОХ-2 са полезни за лечението на рак (WO 98/16227) и в няколко модела с животни редуцират ангиогенезис, причинен от различни растежни фактори (WO 98/22101). Анти-ангиогенезис се постига с инхибитор на СОХ-2 при плъхове, имплантирани с bfGF, съдов ендотелиален растежен фактор (VEGF) или карагенин, протеини с добре известни ангиогенни свойства. (Masferrer, et al., 89-th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 1998).

фармацевтичен състав и приложение

Съединение съгласно изобретението или негова фармацевтично приемлива сол могат да се прилагат като такива към болен човек или могат да се прилагат във фармацевтичен състав, в който споменатите вещества са смесени с подходящи ·» ···«

-119·· ·· · · · носители или пълнител(и). Техники за формулиране и прилагане на лекарства могат да се намерят в “Remington’s Pharmacological Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, последно издание.

Както е използван по-горе терминът ’’прилагане” или “приложение” се отнася до довеждане на съединение с формула (I) или негова фармацевтично приемлива сол или на фармацевтичен състав, съдържащ съединение с формула (I) или негова фармацевтично приемлива сол съгласно изобретението

до организъм с цел профилактика или лечение на заболяване, свързано с протеинкиназа.

Подходящи начини за прилагане могат да бъдат, без ограничение до тях, перорално, ректално, локално, трансмускулно или чревно прилагане, или вътремускулно, субкутанно, интрамедуларно, интратекално, интравентрикулно, интравенозно, интравитрозно, интраперитонеално, интраназално или вътреочно инжектиране. Предпочитаните начини за прилагане са перорално и парентерално.

Алтернативно, съединението може да се прилага локално, а не системно, като например, чрез инжектиране на съединението директно в твърдия тумор, често с форма с депо действие или с продължително освобождаване

Освен това, лекарството може да се прилага в предназначена за освобождаване на лекарството система, като например, липозом, покрит с тумор-специфично антитяло. Липозомите се насочват и приемат селективно от тумора.

фармацевтични състави съгласно изобретението могат да се получат по методи, известни за целта, като например, посредством обичайно смесване, разтваряне, гранулиране, дра ·· ····

-120жиране, разпрашаване, емулгиране, капсулиране, обвиване или лиофилизиране.

фармацевтични състави за използване съгласно изобретението могат да се формулират по общоприет начин с използване на един или повече физиологично приемливи носители, включващи пълнители и спомагателни добавки, които улесняват обработването на активните съединения до препарати, които могат да се използват след това фармацевтично. Определената лекарствена форма зависи от избрания начин на прилагане.

За инжектиране, съединенията съгласно изобретението могат да се формулират във водни разтвори, за предпочитане във физиологично съвместими буфери, като разтвор на Ханкс, разтвор на Рингер или физиологичен солев буфер. За трансмукозно прилагане, във формата се използват подходящи за бариерата, през която трябва да преминат, пенетранти (проникващи вещества). Такива пенетранти са по принцип известните за целта.

За перорално прилагане, съединенията могат да се формулират чрез смесване на активните съединения с фармацвтично приемливи носители, известни за целта. Такива носители позволяват съединенията съгласно изобретението да се формулират като таблетки, прахове, хапчета за смукане, дражета, капсули, разтвори, гелове, сиропи, суспензии и други, за орално приемане от болен, фармацевтични препарати за перорално приложение могат да се получат с помощта на твърд пълнител, по желание смилане на получената смес и обработване на сместа от гранули, след добавяне на други подходящи добавки, ако е необходимо, за да се получат таблетки или дражирани сърцевини. Подходящи пълнители са, по·· ····

- 121 ·» ·· *· ·,.· ;

специално, такива като захари, включително лактоза, заЯароза, манитол или сорбитол, целулозни препарати, като например, царевично нишесте, пшенично нишесте, оризово нишесте и картофено нишесте и други вещества, като желатин, трагант, метилцелулоза, хидроксипропилметилцелулоза, натриева карбоксиметилцелулоза и/или поливинилпиролидон. По желание, могат да се добавят и дезинтегриращи средства, като омрежен поливинилпиролидон, агар или алгинова киселина. Може да се добави и сол, като натриев алгинат.

Дражетата се предлагат с подходящи покрития. За тази цел, могат да се използват концентрирани захарни разтвори, които по желание могат да съдържат гумиарабика, талк, поливинилпиролидон, карбопол гел, полиетиленгликол и/или тита нов диоксид, лакиращи разтвори и подходящи органични разтворители или смеси от разтворители. Могат да се добавят бои или пигменти към таблетките или тифициране или характеризиране на филм-дражетата за иденразлични комбинации от дозирани активни съединения.

фармацевтични състави, които могат да се използват перорално включват подходящи за избутване капсули от желатин, както и меки, затворени капсули от желатин и пластификатор, като глицерин или сорбитол.

Подходящите за избутване капсули могат да съдържат активните ингредиенти в смес с пълнител, като лактоза, свързващо вещество, като нишесте и/или смазващо вещество, като талк или магнезиев стеарат и по желание, стабилизатори. В меки капсули, активните съединения може да се разтворят или да се суспендират в подходящи течности, като масла, течен парафин или течни полиетиленгликоли. В такива форми могат да се добавят и стабилизатори.

···· · ζ _е· ···

-122- · *...... · ; · ····

........ ..· :

Капсулите могат да се опаковат в кафяво стъкло или пластмасови бутилки, за да се предпази активното съединение от светлина. Контейнерите, съдържащи активното съединение под формата на капсула, трябва да се съхраняват при контролирана температура (15-30°С).

За прилагане чрез инхалиране, съединенията за използване съгласно изобретението се освобождават удобно под формата на аерозолен спрей, като се използва опаковка под налягане или пулверизатор и подходящ пропелент, например, дихлородифлуорометан, трихлорофлуорометан, дихлоротетрафлуороетан или въглероден диоксид/В случая на аерозол под налягане, дозираната единица може да се контролира с помощта на вентил за освобождаване на дозирано количество. Капсули и патрони от, например, желатин, за използване в инхалатор или инсуфлатор могат да се приготвят с помощта на прахообразна смес от съединението и подходяща основа на прах, като лактоза или нишесте.

Съединенията могат да бъдат формулирани за парентерално приложение, например, чрез болусно инжектиране или непрекъсната инфузия. формите за инжектиране могат да бъдат единични дозирани форми, например, в ампули или в контейнери с многократни дози, с добавен консервант. Съставите могат да бъдат под формата на суспензии, разтвори или емулсии в маслени или водни вехикулуми и могат да съдържат подпомагащи формулирането средства, като суспендиращи, стабилизиращи и/или диспергиращи средства.

Фармацевтични състави за парентерално приложение са водни разтвори на водноразтворима форма, като сол на активното съединение. Освен това, суспензии на активните съединения могат да се получат в лиофилни вехикулуми. Подхо• · · · · ·

- 123 дящи лиофилни вехикулуми са масла като сусамено, синтетични мастнокисели естери, като етилолеат и триглицериди или вещества като липозоми. Водни инжекционни суспензии могат да съдържат вещества, които повишават вискозитета на суспензията, като натриева карбоксиметилцелулоза, сорбитол или декстран. По желание, суспензията може да съдържа подходящи стабилизатори и/или средства, които повишават разтворимостта на съединенията, като така позволяват получаването на високо концентрирани разтвори.

Алтернативно, активният ингредиент може да бъде във вид на прах, който се разтваря в подходящ вехикулум, на ример стерилна, свободна от пироген, вода, преди употреба.

Съединенията могат да се формулират и като ректални състави, като супозитории или задържащи клизми, като се използват, например, общоприети основи за супозитории, като какаово масло или други глицериди.

В допълнение към лекарствените форми, описани по-горе, съединенията могат да се формулират като препарати с депо действие. Такива форми с продължително действие могат да се прилагат чрез имплантиране (например, субкутанно или интрамускулно) или чрез интрамускулно инжектиране. За този начин на приложение, съединението съгласно изобретението може да се формулира с подходящи полимерни или хидрофобни материали (като например, емулсия с фармакологично приемливо масло), с йонообменни смоли или като производно с умерена разтворимост, като например, слабо раз творима сол.

Неограничаващ пример за фармацевтичен носител за хидрофобните съединения съгласно изобретението е система от съразтворители, включваща бензилов алкохол, неполярно по-124 върхностноактивно вещество, органичен полимер вода и водна фаза, като VPD съразтворителна система. VPD е разтвор на 3% т./об. бензилов алкохол, 8% т./об. неполярно повърхностоактивно вещество Polysorbate 80 и 65% т./об. полиетиленгликол 300, доведени до определен обем в абсолютен етанол. VPD съразтворителната система (VPD:D5W) се състои от VPD, разреден 1:1 с 5% декстроза във воден разтвор. Тази съразтворителна система разтваря добре хидрофобни съединения и самата тя има ниска токсичност при системно прилагане. Естествено, пропорциите в такава съразтворителна система могат да варират в широки граници, без да се нарушава нейната разтворимост и токсичността й. Освен това, същността на компонентите в съразтворителната система може да варира, като например,: могат да се използват други неполярни повърхностноактивни вещества с ниска токсичност вместо Polysorbate 80, номерът на фракцията на полиетиленгликола може да варира, други биосъвместими полимери могат да заместят полиетиленгликола, като например поливинилпиролидон и други захари или полизахариди могат да се използват вместо декстроза.

Алтернативно, могат да се използват други системи за прилагане на хидрофобни фармацевтични съединения. Липозомите и емулсиите са добре известни примери за вехикулуми или носители на хидрофобни лекарства. Освен това, някои органични разтворители, като диметилсулфоксид, могат да се използват също, въпреки, че често това коства по-висока токсичност.

Допълнително, съединенията могат да се освобождават с помощта на система за продължително освобождаване, като полупропускливи матрици от твърди хидрофобни полимери, · ··’. .:: · • · ·· · z · · · ·

I zb - · ·· · : ··· ·.»».

·· *· .. ..· · · · ·· ·· · съдържащи терапевтичното средство. Създадени са различни материали с продължително освобождаване и те са известни на специалиста в областта. Капсули с продължително осво бождаване могат, в зависимост от химичния им характер, да освобождават съединенията в продължение на няколко седмици до над 100 дни. В зависимост от химичния характер и биологичната стабилност на терапевтичното средство, могат да се използват допълнителни стратегии за протеинова стабилизация.

Фармацевтичните състави могат да съдържат подходяща твърда или гелна фаза от носители или пълнители. Примери за такива носители или пълнители са, без да се ограничават до изброените) калциев карбонат, калциев фосфат, различни захари, нишестета, целулозни производни, желатин и полимери, като полиетиленгликоли.

Много от съединенията съгласно изобретението, модулиращи протеинкиназа, могат да бъдат като фармацевтично приемливи соли, като претендираното съединение може да образува отрицателно или положително заредени форми. Примери на соли, в които съединението образува положително заредена форма са, без да се ограничават до тях, кватернерни амониеви (определени тук на друго място) соли, като хидрохлоридна, сулфатна, карбонатна, лактатна, тартаратна, малатна, малеатна, сукцинатна, в които азотният атом на кватернерната амониева група е азот от избраното съединение съгласно изобретението, който реагира с подходящата киселина. Соли, в които съединение съгласно изобретението образува отрицателно заредени форми, са, без изброените да ги ограничават, натриева, калиева, калциева и магнезиева, образувани при взаимодействието на карбоксилнокиселинната

- 126 -

• · .· · (например, група в съединението с подходяща основа натриев хидроксид (NaOH), калиев хидроксид (КОН), калциев хидроксид (Са(ОН)г и други).

фармацевтични състави, подходящи за използване съг ласно изобретението са състави, в които активните ингреди енти се съдържат в количество, достатъчно, за да се постигне желаната цел, например, модулирането на протеинкиназно действие или лечението или профилактиката на свързано с протеинкиназа заболяване.

По-точно, терапевтично ефективно количество означава количество от съединение, ефикасно да предотврати, облекчи или намали интензивността на симптомите на заболяване или да продължи живота на лекувания болен.

Определянето на терапевтично ефективно количество е от значение за специалиста в областта, по-специално в светлината на подробното описание, дадено тук.

За всяко съединение, използвано в методите съгласно изобретението, терапевтично ефективното количество или доза могат да се изчислят първоначално в опити с клетъчна култура. След това, може да се определи дозата за използване в модели с животни, така че да се постигне затворен концентрационен обхват, който включва 1С₅₀, както е определена за клетъчна култура (т.е., концентрацията на опитното съединение, с която се постига половината от максималното инхибиране на РК действието). Такава информация може да се използва след това за по-точно определяне на приложимите дози при хора.

Токсичността и терапевтичната ефикасност на съединенията, описани тук, могат да се определят чрез стандартни фармацевтични процедури в клетъчни култури или с опитни животни, например, чрез определяне на 1С₅₀ и на LD₅₀ (и двете

- 127 ·· «· • ·· • ·· • ·· • ·· са дискутирани тук, на друго място) за • · · · • · · · • · · *···· • · · · • · · въпросното съединение. Получените изследвания върху деляне граничните данни от тези опити с клетъчна култура и от животни могат да се използват при опре дози за използване при хора. Дозата може да варира в зависимост от използваната дозирана форма и от начина на прилагане, който се предвижда. Конкретната фор ма, начина на прилагане и дозата могат да се изберат от отделния лекар от гледна точка на състоянието на болния. (Виж, например, Fing, et al., 1975, в “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, глава 1, стр.1).

Дозата и интервалът на приемане могат да се регулират индивидуално, за да се осигурят плазмени нива на активните вещества, които са достатъчни за поддържане на модулира щите ефекти върху киназата. Тези плазмени нива са познати като минимални ефективни концентрации (MECs). Минималната ефективна концентрация ще варира за всяко съединение, но може да се определи от in vitro данни, например, концентрацията, необходима, за да се постигнат 50-90% инхибиране на киназа, може да се установи, като се използват опитите, описани тук. Необходимите дози за достигане на МЕС ще зависят от индивидуалните характеристики и начина на прилагане. За определяне на плазмените концентрации могат да се използват анализи с ВЕТХ или биоанализи.

Интервалите на дозиране могат да се определят, също, с помощта на стойността за МЕС. Съединенията следва да се прилагат по схема, която поддържа плазмени нива над стойности за МЕС 10-90% във времето, за предпочитане, между 3090% и най-добре между 50-90%.

Понастоящем, терапевтично ефективните количества от съединения с формула (I) могат да бъдат в границите от при·« ·· • · • ·· • · • · ·· ··

1500 тд/т²/дневно; за

Особено се предпочита, ····

- 1 28 - ·^:близително 0.25 тд/т²/дневно до предпочитане около 3 тд/т²/дневно. когато е 50 mg/qm qd до 400 mg/qd.

Терапевтично ефективните количества за циклооксигеназния инхибитор са от около 0.1 mg до около 10,000 mg, за лечение на горните състояния, като се предпочитат концентрации от около 1.0 до около 1,000 mg.

Количеството активен ингредиент, което може да се комбинира с други противоракови средства, за да се получи единична дозирана форма, ще варира в зависимост от лекувания реципиент и от конкретния начин на прилагане.

В случаите на локално приложение или селективен прием, ефективната локална концентрация от лекарството може да не е близка до плазмената концентрация и могат да се из ползват други известни методи, за да се определи правилното дозирано количество и интервала на приемане.

Количеството на прилагания състав ще зависи от лекувания болен, остротата на заболяването начина на прилагане,

преценката на лекуващия лекар и други.

Съставите могат, по желание, да бъдат в опаковка или дозиращо (освобождаващо) приспособление, като одобрен от FDA кит, който може да съдържа една или повече единични дозирани форми, съдържащи активния ингредиент. Опаковката може, например, да включва метално или пластмасово фолио, като блистерна опаковка. Опаковката или дозиращото приспособление могат да бъдат съпроводени от инструкции за приложение, както и от бележка, свързана с контейнера, във форма, предписана от Правителствена агенция, регулираща производството, използването или продажбата на лекарствени средства, която бележка отразява одобрението на агенцията ···· «ί. ···

129 ' :. : ·: ;·’·:· ·· ·· ·· ;

за формата на съставите или приложението за хуманни или ветеринарни цели. Такава бележка, например, може да бъде етикет, одобрен от U.S. Food and Drug Administration за поместените предписани лекарства или одобрени продукти. Състави, съдържащи съединение съгласно изобретението, формулирани със съвместим фармацевтичен носител могат да се приготвят, да се поставят в подходящ контейнер и да се означат за лечение на указано състояние. Подходящи състояния, указани на етикета, могат да включват лечение на тумор инхибиране на ангиогенезис, лечение на фиброза, диабет и други.

Друг аспект на изобретението е, че описано тук съединение или негова сол, или пролекарство, могат да се комбинират с други химиотерапевтични средства за лечение на болести или нарушения, дискутирани по-горе. Така например, съединение, сол или пролекарство съгласно изобретението могат да се комбинират с алкилиращи средства, като флуоро урацил (5-FU), самостоятелно или в комбинация с леуковорин; или с други алкилиращи средства, като, без ограничение до изброените, други пиримидинови аналози, като UFT, капецитабин, гемцитабин и цитарабин, алкилсулфонати, например бусулфан (използван за лечение на хронична гранулоцитна левкемия), импросулфан и пипосулфан; азиридини, например, бензодепа, карбохон метуредепа и уредепа; етиленимини и метилмеламини, например, алтретамин, триетиленмеламин, триетиленфосфорамид, триетилентиофосфорамид и триметилолмеламин; и азотни иприти, например, хлорамбуцил (използван за лечение на хронична лимфоцитна левкемия, първична макроглобулинемия и неХоджкинова лимфома), циклофосфамид (използван за лечение на болест на Ходжкин, мно- 130 • · ··. ···· ♦ .

• · · · · · ..· · : : : ··:· ·· ·· ·· .

жествена миелома, невробластом, рак на млечната жлеза, рак на яйчниците, белодробен рак, тумор на Уилм и рабдомиосарком), естрамустин, ифосфамид, новембрихин, преднимустин и урацилиприт (използвани за лечение на първична тромбоцитоза, неХоджкинова лимфома, болест на Ходжкин и рак на яйчниците); и триазини, например, дакарбазин (използван за лечение на сарком на мека тъкан).

Съединение, сол или пролекарство съгласно изобретението могат да се използват и в комбинация с други антиметаболитни химиотерапевтични средства, като, без ограничение, аналози на фолиева киселина, например, метотрексат (използван за лечение на остра лимфоцитна левкемия, хориокарцином, микозен гъбовиден рак на млечната жлеза, рак на главата и врата и остеогенен сарком) и птероптерин; и пуринови аналози, като меркаптопурин и тиогуанин, които намират приложение за лечение на остра гранулоцитна, остра лимфоцитна и хронична гранулоцитна левкемии.

Подразбира се, че съединение, сол или пролекарство съгласно изобретението могат да се използват и в комбинация

с химиотерапевтични средства на база природен продукт, като, без ограничение до изброените, винкаалкалоидите, на пример, винбластин (използван за лечение на рак на гърдата и на тестикуларен рак), винкристин и виндезин; епиподофилотоксините, например, етопозид и тенипозид, като и двата се използват за лечение на тестикуларен рак и сарком на Капоши; антибиотични химиотерапевтични средства, напри мер, даунорубицин, доксорубицин, епирубицин, митомицин (използвани за лечение на рак на стомаха, на шийката, на колона, на гърдата, на пикочния мехур и на панкреаса), дактиномицин, темозоломид, пликамицин, блеомицин (използвани

- 131 • · · за лечение на рак на кожата, рак на хронопровода и на урогениталния тракт) и ензимни химиотерапевтични средства, като L-аспарагиназа.

Освен това, съединение, сол или пролекарство съгласно изобретението могат да се използват и в комбинация с платинови координационни комплекси (цисплатин и други); заместени уреи, като хидроксиуреа; метилхидразинови производни, например, прокарбазин; адренокортикални супресори, например, митотан, аминоглутетимид; и хормон и хормонни антагонисти, като адренокортикостероиди (например, преднизон), прогестини (например, хидроксипрогестерон капроат), естрогени (например, диетилстилбестерол); антиестрогени, като тамоксифен; андрогени, например, тестостерон пропионат; и ароматни инхибитори, като анастрозол.

Могат да се използват и други известни антинеопластични средства заедно с комбинираната терапия съгласно изобретението. Примери за такива антинеопластични средства и други са дадени в заявка за патент в САЩ на настоящите заявители сер. № 60/1 13,786, подадена на 23.12.1998 г. и публикувана международна заявка за патент WO 00/38716, чието описание е включено тук чрез цитиране.

И накрая, се има предвид, че комбинацията от съединение съгласно изобретението ще бъде ефективна в комбинация с митоксантрон или паклитаксел за лечение на твърди туморни ракови образувания или левкемии, като, без ограничение до посочените, остра миелогенна (нелимфоцитна) левкемия.

···· · J · ···

132 ::: : · : :. _: ·:

·· ♦· ·· ·.’ ’..· :

ПРИМЕРИ

	Примери за синтез Следващите получавания и примери са дадени, за да дадат възможност на специалиста в тази област да разбере по-ясно и да приложи настоящото изобретение. Те не трябва да се разглеждат като ограничаващи обхвата на изобретението, а са само илюстративни и представителни за изобретението.
	СИНТЕЗ НА ИНХИБИТОР НА ПРОТЕИНКИНАЗА СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТО - СЪЕДИНЕНИЯ С ФОРМУЛА (I) Основен метод за синтез: Може да се използва следващата принципна методология за получаване на съединенията съгласно изобретението: Съответният заместен 2-оксиндол (1 екв.), съответният заместен алдехид (1.2 екв.) и основа (0.1 екв.) се смесват в разтворител (1-2 ml/mmol 2-оксиндол) и сместа се загряма от
	около 2 до около 12 часа. След охлаждане, образувалата се утайка се филтрува, промива се със студен етанол или етер и се суши вакуумно, като се получава твърд продукт. Ако не се образува утайка, реакционната смес се концентрира и остатъкът се обработва с дихлорометан/етер, полученото твърдо вещество се събира чрез филтруване и се суши. Продуктът може, по желание, да се пречисти по-нататък чрез хроматография. Основата може да бъде органична или неорганична. Ако се използва органична основа, за предпочитане е азотна. Примери за органични азотни основи включват, без ограничение до изброените, диизопропиламин, триметиламин, три-

- 133 етиламин, анилин пиридин, 1,8-диазабицикло [5.4.1 ]ундец-7-ен, пиролидин и пиперидин.

Примери за неорганични основи, без ограничение до изброените, са амоняк, хидроксиди на алкални метали или алкалоземни хидроксиди, фосфати, карбонати, бикарбонати, бисулфати и амиди. Алкалните метали включват литий, натрий и калий, докато алкалоземните мелементи са калций, магнезий и барий.

Съгласно предпочитано изпълнение на изобретението, когато разтворителят е протонен разтворител, като вода или алкохол, основата е алкалнометална или алкалоземна неоранична основа, за предпочитане, алкалнометален или алкаоземен хидроксид.

За сециалиста в областта е ясно, въз основа на известните основни принципи на органичния синтез и на дадените описания тук, коя основа би била най-подходяща за провеждане на въпросната реакция.

Разтворителят, в който протича реакцията, може да бъде протонен или апротонен, като за предпочитане е протонен. “Протонен разтворител” е разтворител, който има водороден(дни) атом(и), свързан(и) ковалентно с кислородни или азотни атоми, което прави водородните атоми подчертано киселинни и по този начин, способни да бъдат “споделяни” с разтвореното вещество чрез водородна връзка. Примери на протонни разтворители са, без ограничение до изброените, вода и алкохол.

“Апротонен разтворител” може да бъде полярен или неполярен, но и в двата случая не съдържа киселинни водороди и следователно, не е способен да се свързва водородно с разтворените вещества. Примери, без ограничение до изброе.·· ·· ··

- 134 - : :: : ·: ·

......

ните, на неполярни апротонни разтворители • · • · са • · · • · · · • · · · · · • · · ·· · пентан, хексан, бензен, толуен, метиленхлорид и тетрахлорметан. Приме ри за полярни апротонни разтворители са хлороформ, тетра хидрофуран, диметилсулфоксид и диметилформамид.

Съгласно предпочитано изпълнение на изобретението, разтворителят е протонен, за предпочитане вода или алкохол, като етанол.

Реакцията протича при температури над стайната. Температурата е принципно от около 30°С до около 150°С, за предпочитане от около 80°С до около 100°С и най-добре от около 75°С до около 85°С, което е около точката на кипене на етанола. Под “около” се разбира, че температурният обхват е за предпочитане в границите от 10°С от посочената температура, предпочитат се 5°С от посочената температура и най-добре 2°С от посочената температура. Така например под “около 75°С” следва да се разбира 75°С ± 10°С, за предпочитане 75°С ± 5°С и най-добре 75°С ± 2°С.

2-оксиндоли и алдехиди могат лесно да се синтезират, като се използват известните методи в химията за тази цел. За специалиста в областта е ясно, че съществуват и други схеми за синтез за получаване на съединенията съгласно изобретението и че следващите са примерни и не служат за ограничение.

Метод А: формилиране на пироли

РОС1₃ (1.1 екв.) се накапва към диметилформамид (3 екв.) при -10°С, след което се добавя съответният пирол, разтворен в диметилформамид. След разбъркване два часа, реакционната смес се разрежда с вода и се алкализира до pH 11 с 10 N КОН. Образувалата се утайка се събира чрез филтруване, про···♦

- 135 • ·· · · · ft ♦ · · · · · · ·

......... ·..· :

мива се с вода и се суши във вакуумсушилня, като се получава желаният алдехид.

Метод В: Осапунване на естери на пиролкарбоксилна киселина

Смес от естер на пиролкарбоксилна киселина и КОН (2-4 екв.) в етанол се нагрява при температурата на кипене до за-

вършване на реакцията, което се установява чрез тънкослойна хроматография (ТСХ). Охладената реакционна смес се подкиселява до pH 3 с 1 N HCI. Образувалата се утайка се събира чрез филтруване, промива се с вода и се суши във вакуумсушилня, като се получава желаната пиролкарбоксилна киселина.

Метод С: Амидиране

Към разбъркван разтвор на пиролкарбоксилна киселина, разтворена в диметилформамид (0.3 М), се добавят 1-етил-3-(3диметиламино-пропил)карбодиимид (1.2 екв.), 1-хидроксибензотриазол (1.2 екв.) и триетиламин (2 екв.). Добавя се съответният амин (1 екв.) и реакционната смес се разбърква до завършване на реакцията, установено чрез ТСХ. След това се добавя етилацетат към реакционната смес и разтворът се промива с наситен натриев бикарбонат и със солна луга (с допълнително сол), суше се над безводен магнезиев сулфат и се концентрира, за да се получи желаният амид.

Метод D: Кондензация на алдехиди и оксиндоли, съдържащи карбоксилнокиселинни заместители

Смес от оксиндола (1 еквивалент), 1 еквивалент от алдехида и 1-3 еквивалента пиперидин (или пиролидин) в етанол (0.4 М) се разбърква при 90-100°С до завършване на реакцията, установено чрез ТСХ. След това, сместа се концентрира и остатъкът се подкиселява с 2 N HCI. Образувалата се • · •· • « •· •· • · ···· •» • · •· * ·· ·· · · утайка се промива с вода и етанол и се суши • · · • · · · · • · във вакуумсушилня до получаване на продукта.

Метод Е: Кондензация на алдехиди и оксиндоли, несъдържащи карбоксилнокиселинни заместители

Смес от оксиндола (1 еквивалент), 1 еквивалент от алдехида и 1-3 еквивалента пиперидин (или пиролидин) в етанол (0.4 М) се разбърква при 90-100°С до завършване на реакцията, установено чрез ТСХ. Сместа се охлажда до стайна температура и полученото твърдо вещество се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с етанол и се суши, като се получава продуктът. Ако, след охлаждането на реакционната смес не се получи утайка, сместа се концентрира и се пре чиства чрез колонна хроматография.

С. Примери за синтез на оксиндоли

Следващите примери за синтез на представителни оксиндоли не трябва да се тълкуват като ограничаващи обхвата на изобретението по какъвто и да е начин. Алтернативни начини за получаване на показаните оксиндоли, както и на други оксиндоли, които се използват за получаване на съединенията съгласно изобретението, са очевидни за специалиста в тази област, въз основа на следващите описания. Такива синтези и оксиндоли са в обхвата и духа на изобретението.

5-амино-2-оксиндол

5-нитро-2-оксиндол (6.3 д) се хидрогенира в метанол над

10% паладий върху въглерод, като се получават 3.0 g (60% добив) от съединението , посочено в заглавието, като бяло твърдо вещество.

5-бромо-2-оксиндол ♦· ····

2-оксиндол (1.3 g) в 20 mL ацетонитрил се охлажда до -10°С и се добавят бавно с разбъркване 2.0 g N-бромосукцинимид. Реакционната смес се разбърква 1 час при -10°С и 2 часа при 0°С. Утайката се събира, промива се с вода и се суши, като се получават 1.9 g (90% добив) от съединението, посочено в заглавието.

4-метил-2-оксиндол

Диетилоксалат (30 mL) в 20 mL сух етер се добавя, при разбъркване, към 19 g калиев етоксид, суспендиран в 50 mL сух етер. Сместа се охлажда на ледена баня и бавно се добавят 20 mL 3-нитро-о-ксилен в 20 mL сух етер. Гъстата тъмночервена смес се загрява до температурата на кипене в продължение на 0.5 ч, концентрира се до тъмночервено твърдо вещество и се обработва с 10% натриев хидроксид, докато се разтвори почти цялото количество от твърдото вещество. Тъмночервената смес се обработва с 30% водороден пероксид, докато червеният цвят се промени в жълт. Сместа се обработва· последователно с 10% натриев хидроксид и 30% водороден пероксид до изчезването на тъмночервеното оцветяване. Твърдото вещество се отфилтрува и филтратът се подкиселява с 6 N HCI. Получената утайка се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с вода и се суши под вакуум, като се получават 9.8 g (45% добив) от 2-метил-6-нитрофенилоцетна киселина във вид на белезникаво твърдо вещество. Твърдото вещество се хидрогенира в метанол над 10% паладий върху въглерод, като се получават 9.04 g от съединението, посочено в заглавието, като бяло твърдо вещество.

7-бромо-5-хлоро-2-оксиндол

5-хлоро-2-оксиндол (16.8 д) и 19.6 д N-бромосукцинимид се суспендират в 140 mL ацетонитрил и се нагряват при темпе-

- 138 ратурата на кипене 3 часа. На втория час от нагряването,

ТСХ (силициев диоксид, етилацетат) показва 5-хлоро-2-оксиндол или N-бромосукцинимид (Rf 0.8), първи продукт (Rf 0.85) и втори продукт (Rf 0.9), чиито пропорции не се изменят след още един час нагряване. Сместа се охлажда до 10°С, утайката се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с 25 mL етанол и се изсмуква за 20 минути във фуния, като се получават 14.1 g влажен продукт (56% добив). Твърдото вещество се суспендира в 200 mL денатуриран етанол и суспензията се промива при разбъркване и нагряване при температурата на кипене 10 минути. Сместа се охлажда на ледена баня до 10°С. Твърдият продукт се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с 25 mL етанол и се суши под вакуум при 40°С, като се получават 12.7 g (51% добив) от 7-бромо-5-хлоро-2-оксиндол.главието.

5-флуоро-2-оксиндол

5-флуороизатин (8.2 д) се разтваря в 50 mL хидразин хидрат и се нагрява при температурата на кипене 1 час. Реакционната смес се излива в ледена вода. Утайката се филтрува, промива се с вода и се суши във вакуумсушилня, като се получава съединението, посочено в заглавието.

5-Н1/1тро-2-оксиндол

2-оксиндол (6.5 д) се разтваря в 25 mL концентрирана сярна киселина и сместа се поддържа при от -10°С до -15°С, като междувременно се накапват 2.1 mL димяща азотна киселина. След като се добави азотната киселина, реакционната смес се разбърква при 0°С в продължение на 0.5 часа и се излива в ледена вода. Утайката се събира чрез филтруване, промива се с вода и кристализира от 50% оцетна киселина. Кристалният продукт се филтрува, промива се с вода и се • · • · · to

суши под вакуум, като се получават 6.3 g (70% добив) 5-нитро

2-оксиндол.

5-аминосулфонил-2-оксиндол

В 100-милилитрова колба, заредена с 27 mL хлоросулфонова киселина се добавят бавно 13.3 g 2-оксиндол. Реакционната температура се поддържа под 30°С по време на добавянето. След добавянето, реакционната смес се разбърква при стайна температура 1.5 часа, загрява се до 68°С за 1 час, охлажда се и се излива във вода. Утайката се промива с вода и се суши във вакуумсушилня, като се получават 11.0 g 5-хлоросулфонил-2-оксиндол (50% добив), който се използва без до пълнително пречистване.

5-хлоросулфонил-2-оксиндол (2.1 д) се добавя към 10 mL амониев хидроксид в 10 mL етанол и се разбърква при стайна температура една нощ. Сместа се концентрира и твърдото вещество се събира чрез вакуумфилтруване, като се получават 0.4 g (20% добив) от съединението, посочено в заглавието, във вид на белезникаво твърдо вещество.

5-и з о проп иламиносулфонил-2-оксиндол

В 100-милилитрова колба, заредена с 27 mL хлоросулфонова киселина се добавят бавно 13.3 g 2-оксиндол. Реакционната температура се поддържа под 30°С по време на добавянето. Реакционната смес се разбърква при стайна температура 1.5 часа, загрява се до 68°С за 1 час, охлажда се и се излива във вода. Утайката, която се образува, се филтрува, промива се с вода и се суши във вакуумсушилня, като се получават.11.0 g (50%) 5-хлоро-сулфонил-2-оксиндол, който се използва без допълнително пречистване.

Суспензия от 3 g 5-хлоросулфонил-2-оксиндол, 1.15 g изопропиламин и 1.2 mL пиридин в 50 mL дихлорометан се раз• · • · · · е «

бърква при стайна температура 4 часа, през което време се образува бяло твърдо вещество. Твърдото вещество се събира чрез вакуумфилтруване, суспензията се промива с горещ ета нол, охлажда се и се събира чрез вакуумфилтруване и се суши под вакуум при 40°С една нощ, като се получават 1.5 g (45%

добив) 5-изопропиламиносулфонил-2-оксиндол.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.69 (s, br, 1H, NH), 7.63 (dd, J = 2 и 8 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7 Hz, 1H, NH-SO2-), 6.93 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.57 (s, 2H), 3.14-3.23 (m, 1H, CH-(CH₃)₂), 0.94 (d, J = 7 Hz, 6H, 2x CH₃).

-фенил ам и носул фон и л -2-окси ндол

Суспензия от 5-хлоросулфонил-2-оксиндол (1.62 д, 7 mmol), анилин (0.782 mL, 8л4 mmol) и пиридин (1 mL) в дихло рометан (20 mL) се разбърква при стайна температура 4 часа. Реакционната смес се разрежда с етилацетат (300 mL) и се подкиселява с 1N солна киселина (16 mL). Органичният слой се промива с натриев бикарбонат и солна луга, суши се и се концентрира. Остатъкът се промива с етанол (3 mL) и се хроматографира върху силикагел, елуиране с метанол/дихлорометан 1:9, като се получава 5-фениламиносулфонил-2-окс индол.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.71 (s, br, 1H, NH), 10.10 (s, br, 1H, NH), 7.57-7.61 (m, 2H), 7.17-7.22 (m, 2H), 7.06-7.09 (m, 2H), 6.97-7.0 (m, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.52 (s, 2H).

2-оксо-2,3-дихидро-1Н-индол-5-селфонова киселина пиридин-3-иламид

Разтвор на 5-хлоросулфонил-2-оксиндол (3 д) и 3-аминопиридин (1.46 д) в пиридин (15 mL) се разбърква при стайна температура една нощ, през което време се появява кафяво твърдо вещество. Твърдото вещество се филтрува, промива се • · • · · · « · с етанол и се суши под вакуум, като се получават 1.4 g (38%) 2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина пиридин-3иламид.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.74 (s, 1 Η, NH), 10.39 (s, 1H, SO₂NH), 8.27-8.28 (d, 1H), 8.21-8.23 (m, 1H), 7.59-7.62 (m, 2H), 7.44-7.68 (m, 1H), 7.24-7.28 (m, 1H), 6.69-6.71 (d, 1H), 3.54 (s, 2H). MS m/z (APCI + ) 290.2.

5-фенилоксиндол

5-бромо-2-оксиндол (5 g, 23.5 mmol) се разтваря в 110 mL толуен и 110 mL етанол c разбъркване и слабо загряване. Добавя се тетракис(трифенилфосфин)паладий(0) (1.9 д, 1.6 mmol), следван от 40 mL (80 mmol) 2М воден натриев карбонат. Към тази смес се добавя бензенова борна киселина (3.7 д, 30.6 mmol) и сместа се загрява на 100°С маслена баня в продъл жение на 12 часа. Реакцията се охлажда, разрежда се с етилацетат (500 mL), промива се с наситен натриев бикарбонат (200 mL), вода (200 mL), 1N HCI (200 mL) и солна луга (200 mL). Органичният слой се суши над магнезиев сулфат, концентрира се и се получава кафяво твърдо вещество. Обработване с дихлорометан дава 3.8 g (77%) 5-фенил-2-оксинидол, като червеникаво-кафяво твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.4 (br, s, 1H, NH), 7.57 (dd, J = 1.8 и 7.2 Hz, 1H), 7.5 до 7.35 (m, 5H), 7.29 (m, 1H), 6.89 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.51 (s, 2H, CH₂CO).

MS m/z 209 [M ⁺ ].

По подобен начин се получават следващите оксиндоли:

6-(3,5-дихлорофенил)-1,3-дихидроиндол-2-он • · • · • · · · ¹ЯМР (360

1.8 Hz, 2Н), 7.57 (m, 1 Η), 7.27 (m, 2Η), 7.05 (d, J = 1.1 Hz, 1H),

3.5 (s, 2H).

MS-EI m/z 277/279 [M ⁺ ],

6-(4-бутилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.39 (s, 1H, NH), 7.49 (d, J =

8.0 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8 Hz, 3H), 7.17 (dd, J = 1.5 и 7.8 Hz, 1H),

6.99 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 3.48 (s, 2H, CH₂CO), 2.60 (t, J = 7.5 Hz, 2

Hz, CH₂CH₃), 1.57 (m, 2H, CH₂), 1.32 (m, 2H, CH₂), 1.32 (m, 2H,

CH₂), 0.9 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH₃).

6-( 5-и 30 προ п и л-2-мето кси фенил )-1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.29 (br, s, 1H, NH), 7.16-7.21 (m, 2H), 7.08 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.97-7.01 (m, 2H), 6.89 (d, J =

0.8 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H, OCH₃), 3.47 (s, 2H, CH₂CO), 2.86 (m, 1H,

CH(CH₃)₂), 1.19 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂)·

MS-EI m/z 281 [M ⁺ ],

6-(4-етилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.39 (br, s, 1H, Λ/Η), 7.50 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 1.6 & 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.48 (s, 2H, CH₂CO), 2.63 (q, J = 7.6 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.20 (t, J = 7.6 Hz, 3H, CH₂CH₃).

MS-EI m/z 237 [M] ⁺ .

6-(3-изопропилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.37 (br, s, 1H, NH), 7.43 (m, 1H), 7.35-7.39 (m, 1H), 7.17-7.27 (m, 3H), 7.01 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.49 (s, 2H, CH₂CO), 2.95 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1.24 (d, J = 6.8 Hz,

6H, CH(CH₃)₂).

6-(2,4-диметоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он • · • · · · • · α

• · · · · • · · ····· ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-06) δ 10.28 (br, s, 1H, NH), 7.17 (m, 2H),

6.93 ((dd, J = 1.6 и 7.6 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 2.4 и 8.5 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H, OCH₃),

3.74 (s, 3H, OCH₃), 3.45 (s, 2H, CH₂CO).

MS-EI m/z 269 [M] ⁺ .

б-пиридин-3-ил -1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.51 (s, 1H, NH), 8.81 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.55 (dd, J = 1.8 и 5.7 Hz, 1H), 8 (m, 1H), 7.45 (dd, J = 5.7 и 9.3 Hz, 1H), 7.3 (m, 2H), 7.05 (s, 1H), 3.51 (s, 2H, CH₂CO).

MS m/z 210 [M] ⁺ .

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-4-карбоксилна киселина (3

хлоро-4-етокс1/|фенил)-ам1/1д

Към разтвор на 4-карбокси-2-оксиндол (200 mg, 1.13 mmol) и З-хлоро-4-метоксифениламин (178 mg, 1.13 mmol) в диметилформамид (15 mL) при стайна температура се добавя бензотриазол-1 -илокситрис(диметиламино)фосфониев хексафлуорофосфат (ВОР реагент, 997 mg, 2.26 mmol), следван от 4диметиламинопиридин (206 mg, 1.69 mmol). Сместа се разбърква при стайна температура 72 часа. След това, реакционната смес се разрежда с етилацетат (300 mL), промива се с наситен натриев бикарбонат (10 mL), вода, 2N солна киселина (100 mL), вода (3 х 200 mL) и солна луга. Суши се върху магнезиев сулфат и се концентрира. Остатъкът се обработва с етилацетат, като се получава 2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-4карбоксилна киселина (3-хлоро-4-метоксифенил)-амид, във вид на розово твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.50 (s, br, 1H, NH), 10.12 (s, br, 1H, NH), 7.9 (s, J = 2.5 & 9 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 9 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H, OCH₃ ), 3.69 (s, 2H, CH₂).

• · · ·

MS-EI m/z 316 [M] ⁺ .

4-карбокси-2-оксиндол

Разтвор на триметилсилилдиазометан в хексан (2 М) се накапва към разтвор на 2.01 g 2-хлоро-З-карбокси-нитробензен в 20 mL метанол при стайна температура, докато се преустанови отделянето на газ. След това се добавя оцетна киселина, за да неутрализира излишния триметилсилилдиазометан. Реакционната смес се изпарява под вакуум и остатъкът се суши в сушилня една нощ. Полученият 2-хлоро-З-метоксикарбонилнитробензен е достатъчно чист за следващата реакДобавя се диметилмалонат (6.0 mL) към ледено-студена суспензия на 2.1 g натриев хидрид в 15 mL ДМСО. Реакционната смес се разбърква при 100°С 1 час и след това се охлажда до стайна температура. Добавя се 2-хлоро-З-метоксикарбонилнитробензен (2.15 д) в една порция и сместа се загрява до 100°С 1.5 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна тем пература, излива се в ледена вода, подкиселява се до pH 5 и се екстрахира с етилацетат. Органичният слой се промива със солна луга, суши се над безводен натриев сулфат и се концентрира, като се получават 3.0 g диметил 2-метоксикарбонил-6нитрофенил-малонат.

Диметил 2-метоксикарбонил-6-нитрофенилмалонат (3.0 д) се нагрява при температурата на кипене в 50 mL 6 N HCI една нощ. Сместа се концентрира до сухо, добавят се 20 mL етанол и 1.1 g калаен(Н) хлорид и сместа се нагрява при температурата на кипене 2 часа. Сместа се филтрува през целит, концентрира се и се хроматографира върху силикагел с използване на етилацетат:хексан:оцетна киселина като елуент и се

получават 0.65 g (37%) 4-карбокси-2-оксиндол като бяло твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 12.96 (s, br, 1H, COOH), 10.74 (s, br, 1H, NH), 7.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.67 (s, 2H).

D. Синтез на 2-индолинони, заместени с пирол Пример Т

4-метил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол2-карбоксилна киселина

4-метил-2-пиролкарбоксилна киселина етилов естер (търговски продукт) се формилира, като се прилага метод А и се получава (73%) 5-формил-4-метил-2-пиролкарбоксилна киселина етилов естер. Последният се хидролизира, като се използва метод В и се получава 5-формил-4-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (58%).

Оксиндол (133 mg, 1 mmol) се кондензира с 5-формил-4метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (153 mg), като се използва метод D и се получават 268 mg (100%) от съединението, посочено в заглавието, като орнжево-червено твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.84 (s, br, 1H, NH), 12.84 (s, br, 1H, COOH), 10.98 (s, br, 1H, NH), 7.82 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H, Н-винил), 7.18 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.01 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.32 (s, 3H, CH₃).

MS (отрицателна форма) 266.8 [M-1] ⁺ .

Пример 2

4-метил-5-(1 -метил-2-оксо-1,2-дихидроин дол-3-ил иден метил )1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина •4 •4

44 • · 4 4 · ··

Г4’6-;

4 4 • 4 4 4 • · 4 · · 4 е ·· • · · • V ·· •·· · •4*4

1-метил-1,3-дихидроиндол-2-он (147 mg, 1 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1 А/-пирол-2-карбоксилна киселина (153 mg), като се използва метод D и се получават 250 mg (86%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.82 (s, br, 1H, NA/), 12.88 (s, br, 1H, NH), 7.83 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H, Н-винил), 7.26 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.02-7.09 (m, 2H), 6.70 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 2.32 (s, 3H, C/7₃).

MS m/z 283.0 [M + 1] ⁺ .

Пример 3

4-метил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 /7-пирол2-карбоксилна киселина метилов естер

Оксиндол (105 mg, 0.79 mmol) се кондензира с 5-формил-

4-метил-1 А/-пирол-2-карбоксилна киселина метилов естер (110 mg, 0.67 mmol), като се използва метод Е и се получават 153.2 mg (81%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.98 (s, br, 1H, NA/), 10.97 (s, br, 1H, NA/), 7.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H, Н-винил), 7.2 (dt, J = 1.2 & 7.7 Hz, 1H), 7.01 (dt, J = 1.2, 7.7 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 2 Hz, 1H).

Пример 4

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-4-метил-

Н-пирол-2-карбоксилна киселина етилов естер

5-хлоро-1,3-дихидроиндол-2-он (2.22 д, 13.2 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1/-/-пирол-2-карбоксилна киселина етилов естер (2.43 g), като се използва метод Е и се получават 4.1 g (94%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.95 (s, br, 1H, NA/), 7.98 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-4), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.18 (dd, J = 2.2 & 8.3

Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 7.34 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-3’), 4.27 (q, J = 7.2 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.33 (s, 3H, CH₃), 1.29 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 330 [M ⁺ ].

Пример 5

5-(5-хлоро^:2-оксо-1, 2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил )-4-метил1/-/-пирол-2-карбоксилна киселина

Смес от 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-4-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина етилов естер (1.3 g, 4 mmol) и калиев хидроксид в метанол (25 mL) и етанол (25 mL) се загрява до температурата на кипене една нощ. Неразтворимите вещества се отделят чрез филтруване и сместа се неутрализира с 6 N солна киселина, като се получават 0.876 g (70%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.80 (s, br, 1H, NH), 12.90 (s, br, 1H, COOH), 11.06 (s, br, 1H, NH), 8.02 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.81 (s, 1H, Н-винил), 7.20 (dd, J = 1.8 & 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.89 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 6.72 (d, J = 1.8 Hz, 1 Η, H-3’), 2.35 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 302 [M ⁺ ],

Пример 6

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-4-мети л1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-ил-пропил) амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.16 д, 0.76 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-илпропил)амид (0.2 д, получен по метод С) и се получават 60 mg (17%) от съединението, посочено в заглавие то, като оранжево твърдо вещество.

«· ·« ·· ·· ·’ ^w ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 11.02 (s, br, 1H, NH), 8.42 (t, J = 5.8 Hz, 1H, CONHCH₂), 8.12 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.30 (dd, J = 1.8 & 8.4 Hz, 1H, H-6), 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 6.77 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3’), 3.22-3.31 (m, 2H, CH₂), 2.38-2.43 (m, 6H, 3xCH₂), 2.35 (s, 3H, CH₃), 1.62-1.71 (m, 6H, 3xCH₂).

MS-EI m/z 456 и 458 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 2].

Пример 7

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихи дроиндол-3-ил иден метил )-4-метил-

Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3-диетиламино-пропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.16 д, 0.75 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (0.2 д, получен по метод С) и се получават 30 mg (8%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

’ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 11.02 (s, br, 1 Η, NH), 8.40 (m, 1H, CONHCH₂), 8.1 2 (d, J = 1.5 Hz, 1 Η, H-4), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.30 (dd, J = 1.5 & 8.2 Hz, 1H, H-6), 6.82 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-7), 6.78 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-3’), 3.23 (m, 2H, CH₂), 2.38-2.45 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2.35 (s, 3H, CH₃), 1.61 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 и 460 [M ⁺ -1 и M ⁺+ 2].

Пример 8

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (212 mg, 1 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (получен от етил пирол-2-карбок• · :- :i й9:·· ·« силат по метод А, В и след това • ·

С) и се получават 162 (38%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-66) δ 13.53 (s, br, 1 Η, NW), 11.06 br, 1H, NH), 8.37 (t, 1H, CONHCH₂), 7.89 (m, 2H), 7.32 (dd, J =

Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.80-6.84 (m, 2H), 3.3 (m, 2H, CH₂), 2.45-2.55 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂) & CH₂), 0.95 (t, J = 7.2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 430 и 432 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 1].

mg (s,

2.0

Пример 9

5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 /7-пирол-

2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

6-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (209 mg, 1 mmol) се кондензира с,5-формил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид, като се получават 182 mg (42%) от съеди нението, посочено в заглавието.

’ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.56 (s, br, 1 H, NH), 11.06 (s, br, 1H, N/7), 8.36 (t, 1H, CONHCH₂), 7.77 (s, 1H, Н-винил), 7.73 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.46 (m, 2H), 7.32 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 6.96 (m, 1H), 6.80 (m, 1H), 3.31-3.32 (m, 2H, © CH₂), 2.46-2.53 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂) & CH₂), 0.96 (t, J = 6.9 Hz,

6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 428 [M ⁺ ],

Пример 10

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-

2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)-метил-амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (212 mg, 1 mmol) се кондензира с 5-формил-4-метил-1/-/-пирол-2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)метиламид, като се получават 246 mg (55%) от съединението, посочено в заглавието.

* · ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.54 (s, br, 1H, NH), 11.06 (s, br, 1H, NH), 7.90 (m, 2H), 7.33 (dd, J = 1.8 & 8.4 Hz, 1H), 6.826.85 (m, 3H), 3.55 (s, br, 2H, CH₂), 3.25 (s, br, 3H, NCH₃), 2.57 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂), 2.45 (m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 0.91 (m, 6H,

N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 444 и 446 [M⁺-1 и M ⁺ + 1 ].

Пример 11

5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-

2- карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)-метил-амид

6-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (209 mg, 1 mmol) се кондензира с 5-формил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)метиламид, като се получават 277 mg (63%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.58 (s, br, 1H, NH), 11.04 (s, br, 1H, NH), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.73 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.46 (m, 2H), 7.33-7.36 (m, 2H), 7.11 (s, 1H), 6.84 (m, 1H), 6.78 (m, 1H), 3.55 (s, br, 2H, CH₂), 3.25 (s, br, 3H, NCH₃), 2.58 (t, 2H, CH₂), 2.44 (m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 0.92 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

Пример 12

3- метил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-1 Н-пирол-

2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид

Оксиндол (66.5 mg, 0.5 mmol) се кондензира с 5-формил-Зметил-1 Н-пирол-2-карбоксил на киселина (3-диетиламинопропил)амид (получен от З-формил-З-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина етилов естер по метод В, след това С), като се получават 39 mg (21%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.34 (s, br, 1H, NH), 10.88 (s, br, 1H, NH), 7.62-7.67 (m, 3H), 7.17 (m, 1H), 6.99 (m, 1H), 6.87 (d, <» · • · · • · · · ♦

J = 7.6 Hz, 1 H>, 6.63 (d, J = 1 Hz, 1H), 3.26-3.32 (m, 2H, CH₂), 2.41-2.48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2.29 (s, 3H, CH₃), 1.63 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 380 [M ⁺ ],

Пример 13

5-(5-6 ром 0-2-0 кс Q-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3-метил1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид

5- бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (106 mg, 0.5 mmol) се кондензира с 5-формил-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид, като се получават 35 mg (15%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, br, 1H, NH), 11.00 (s, br, 1H, NH), 7.89 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-4), 7.80 (s, 1H, Н-винил), 7.74 (t, J = 5.3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.31 (dd, J = 1.9 & 8.4 Hz, 1H, H-6), 6.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 6.63 (s, 1H, H-3’), 3.26 (m, 2H, CH₂), 2.41-2.48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2.29 (s, 3H, CH₃), 1.63 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 и 460 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 2].

Пример 14

3-метил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид

6- фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (105 mg, 0.5 mmol) се кондензира с 5-формил-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид, като се получават 67.8 mg (30%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.37 (s, br, 1H, NH), 11.02 (s, br, 1H, NW), 7.23-7.73 (m, 11H), 3.29 (m, 2H, CH₂), 2.41-2.48 (m,

6H, CH₂ & N(C/7₂CH₃)₂), 2.29 (s, 3H, CH₃), 1.64 (m, 2H, CH₂), 0.94 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 456 [M ⁺ ].

·· ··to·

Пример 15

5-(5-метокси-2-оксо-1,2-дихид роиндол-3-и ли денметил)-З-метил1/7-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид

5- метокси-1,3-дихидроиндол-2-он (82.5 mg, 0.5 mmol) се кондензира с 5-формил-3-метил-1 /-/-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид, като се получават 80 mg (39%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-06) δ 13.45 (s, br, 1H, NH), 10.70 (s, br, 1H, NH), 7.68-7.70 (m, 2H), 7.32 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.72-6.79 (m, 2H), 6.60 (s, 1H), 3.73 (s, 3H, OCH₃), 3.28 (m, 2H, CH₂), 2.412.48 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2.29 (s, 3H, CH₃), 1.63 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 410 [M⁺ ],

Пример 16

5-(6-метокси-2-оксо-1, 2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-3-мети л1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид

6- метокси-1,3-дихидроиндол-2-он (82.5 mg, 0.5 mmol) се кондензира с 5-формил-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид, като се получават 63 mg (31%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.22 (s, br, 1H, NH), 10.86 (s, br, 1H, NH), 7.39-7.63 и 6.37-6.55 (m, 6H), 3.73 (s, 3H, OCH₃), 3.3 (m, 2H, CH₂), 2.45 (m, 6H, CH₂ & N(CH₂CH₃)₂), 2.28 (s, 3H, CH₃), 1.63 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 410 [M ⁺ ],

Пример 17

3-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид • · ·· ·*

4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1 - карбокси л на киселина етилов естер (May, Donald A.; Lash Timothy D.; J. Orq. Chem., 1992, 57:18, 4820-4828) се формилира, като се използват метод А и след това метод В и се получава З-формил-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1 -карбоксилна киселина.

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (1.43 д, 6.8 mmol) се кондензира с З-формил-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (1.97 д), като се получават 2.2 д (67%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на жълто-оранжево твърдо вещество.

^]ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.47 (s, br, 1H, NH), 11.00 (s, br, 1H, NH), 8.0 (d, 1H, NH), 7.70 (s, 1H, CH), 7.28 (dd, J = 2.1 и

8.2 Hz, 1H, ArH), 7.16 (m, 1H, ArH), 6.8 (d, J = 8.3 Hz, 1H, ArH),

3.3 (s, 2H, CON/-/), 2.5 (m, 6H, 3xNC/7₂), 2.78 (br m, 2H, пирол CH₂), 2.72 (br m, 2H, пиролСН₂), 1.7 (br m, 4H, N(C/7₂CH₃)₂), 1.74 (br s, 4H, CH₂CH₂CH₂CH₂), 0.96 (t, J = 7.4 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 484 и 486 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

Пример 18

3-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иден метил)-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (20 mg, 0.1 mmol) се кондензира с З-формил-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (30 mg), като се получават 33 mg (46%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.97 (s, 1H, NH), 8.0 (m, 1H, NW), 7.68 (m, 1H, Ar/-/), 7.4 (m, 1H, ArH), 7.29 (d, J = 1.9 и 8.5 Hz, 1H, Ar/-/), 6.8 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 2.7 (br m, 4H, 2xNCH₂), 2.4 • · ·♦·· • · • · · • ····

(m, 8H, 4xNC/7₂), 1.7 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1.6 (br m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0.93 (t, J = 7.4 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 499 и 501 [M⁺ и М ⁺ + 2].

Пример 19

3-(5-6 ром 0-2-0 кс 0-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1илпропил)амид

5- бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (80 mg, 0.4 mmol) се кондензира с З-формил-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1 -илпропил)амид (120 mg), като се получават 43 mg (22%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на кафеникаво-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР.(360 MHz, DMSO-d6) δ 13.4 (s, 1H, NH), 10.9 (s, 1H, NH), 8.0 (m, 1H, ArH), 7.69 (m, 1H, ArH), 7.49 (m, 1H, ArH), 7.28 (d, J = 1.7 и 7.8 Hz, 1H, ArH), 6.8 (d, J = 8 Hz, 1H, ArH), 3.3 (br m, 2H, 2xNCH₂), 2.8 (m, 8H, 4хпиролСН₂), 2.5 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1.6 (br m, 8H, 2хпиролСН₂СН₂. CH₂CH₂CH₂ и

CONHCH₂).

MS-EI m/z 497 и 499 [M⁺ и М ⁺ + 2].

Пример 20

3-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-

4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

6- пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-2-он (60 mg, 0.4 mmol) се кондензира с З-формил-4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (80 mg), като се получават 50 mg (38%) от съединението, посочено в загла вието, във вид на червеникаво твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.4 (s, 1 Η, NH), 11 (s, 1H, NH),

8.9 (d, 1H, NH), 8.7 (dd, 1H, ArH), 8.1 (dd, 1H, ArH), 7.9 (d, 1H, ·· ··♦· • · • · · • ····

• · · · · * • · · · · · : - :iss - : ϊ ·· ·♦ ··

ArH), 7.6 (s, 1Н, CH), 7.5 (dd, 1 H, ArH), 7.3 (dd, 1 Н, ArH), 7.1 (m 2H, Ar/-/), 3.35 (m, 2Н, CONHCH₂), 2.8 (m, 4H, 2хпиролСН₂), 2.5 (br m, 6H, N(CH₂CH₃)₂ и NCH₂), 1.75 (br s, 4H, 2хпиролСН₂СН₂), 0.9 (t, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 484 [M ⁺ ],

Пример 21

4-бензоил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил и ден метил )З-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

Към смес на бензоилхлорид (1 екв.) и алуминиев хлорид (1 екв.) в дихлороетан при 0°С се добавя етил 3,5-диметил-2пиролкарбоксилат (1 екв.). Сместа се разбърква при 80°С 4 часа. След това, сместа се екстрахира с етилацетат и вода. Събраните органични екстракти се промиват с наситен натриев бикарбонат и солна луга, сушат се и се концентрират, като се получава (51%) 4-бензоил-3,5-диметил-1/-/-пирол-2-карбоксилна киселина.

Смес от 4-бензоил-3,5-диметил-1 Н-пирол-2-карбоксил на киселина етилов естер (4.13 д, 15.2 mmol) и цериево амониев ф нитрат (33 д, 4 екв.) в 50 mL тетрахидрофуран (ТХф):оцетна киселина (НОАс):вода 1:1:1 се нагрява при температурата на кипене една нощ. След това, реакционната смес се охлажда, екстрахира се с етилацетат и се алкализира до pH 9 с натриев карбонат. Органичният слой се промива със солна луга, суши се над магнезиев сулфат и се концентрира, следвано от колонна хроматография, като се получават 3.25 g (75%) 4-бензоил-5формил-З-метил-1/7-пирол-2-карбоксилна киселина етилов естер, като жълто твърдо вещество.

5-бромо-1,3-дихидро-индол-2-он се кондензира с 4-бензоил-5-формил-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина, като • · · · *·

се използва метод D, за да се получи 4-бензоил-5-(5-бромо-2оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-3-метил-1 Н-пирол-2карбоксилна киселина.

Горната карбоксилна киселина се свързва с Ν,Ν-диетил- l, 3-пропандиамин, като се използва метод С и се получава съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (m, 1H, CONHCH₂), 7.76 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.68 (t, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.40 (s, 2H), 7.33 (dd, J = 1.6 и 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.84 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 3.33 (m, 2H, CH₂), 2.42-2.46 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.10 (s, 3H, CH₃), 1.65 (br m, 2H, пиролСН₂), 1.7 (br m, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 1.74 (m, 2H, CH₂}, 0.94 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS електронен удар m/z 564 [М ⁺ + 1].

Пример 22

4-бензоил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-

3- метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-морфолин-4-илпропил)амид ’ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 14.10 (s, 1H, N/7), 11.14 (br, s, 1H, NH), 7.92 (m, 1H, CONHCH₂), 7.75 (m, 2H), 7.69 (t, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.33 (dd, J = 1.9 и 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 3.56 (m, 4H, 2xCH₂), 3.33 (m, 2H, CH₂), 2.35 (m, 6H, 3xCH₂), 2.10 (s, 3H, CH₃), 1.70 (m, 2H, CH₂).

Пример 23

4- бензоил-3-метил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-

Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-ил-пропил) амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.18 (s, 1 Η, NH), 11.14 (br, s,

1H, NH), 8.01 (m, 1H, CONHCH₂), 7.74 (m, 1H), 7.67 (m, 1H), 7.55 (m, 1H), 7.32 (s, 1H, Н-винил), 7.17 (m, 1H), 6.92 (m, 1H), 3.36 (m, • · ·· ··

·· ·· * » · • · ·· : ·« ·*

2H, CH₂), 2.44 (m, 6Н, ЗхСН₂), 2.11 (s, ЗН, СН₃), 1.65-1.75 (m, 6Н, ЗхСН₂).

MS електронен удар m/z 482 [М ⁺ ].

Пример 24

4-бензоил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидрои ндол-3-ил иден метил )-

3- метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-илпропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-66) δ 14.01 (s, 1 Η, NH), 11.18 (br, s, 1H, NH), 7.98 (m, 1H, CONHCH₂), 7.75 (m, 2H), 7.68 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.33 (dd, J = 2.0 и 8.2 Hz, 1H, H-6), 6.84 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-7), 3.34 (m, 2H, CH₂), 2.42-2.47 (m, 6H, 3xCH₂), 2.09 (s, 3H, CH₃), 1.70 (m, 2H, CH₂), 1.64 (m, 4H, 2xCH₂).

Пример 25

4- бензоил-З-метил-5-(2-оксо-6-фен ил-1,2-дихидрои ндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1 ил-пропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.15 (s, 1 Η, NH), 11.16 (br, s, 1H, NH), 7.98 (m, 1H, CONHCH₂), 7.77 (d, J = 7.7 Hz, 2H,) 7.69 (m, 1H), 7.53-7.63 (m, 4H), 7.44 (m, 2H), 7.33-7.37 (m, 2H), 7.24 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 3.36 (m, 2H, CH₂), 2.43-2.48 (m, 6H, 3xCH₂), 2.12 (s, 3H, CH₃), 1.74 (m, 2H, CH₂), 1.69 (m, 4H, 2xCH₂).

MS електронен удар m/z 558 [М ⁺ ].

Пример 26

4-бензоил-5-(6-метокси-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-ил-пропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.99 (s, 1 Η, NH), 11.05 (br, s, 1H, NH), 7.93 (m, 1H, CONHCH₂), 7.72 (m, 2H), 7.65 (m, 1H), 7.54 (m, 2H), 7.15 (s, 1H, Н-винил), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-4), 6.51 (dd, J = 2.3 & 8.4 Hz, 1H, H-5), 6.44 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-7), 3.74

(s, ЗН, OCH₃), 3.35 (m, 2Н, СН₂), 2.42-2.46 (m, 6Н, ЗхСН₂), 2.10 (s, ЗН, СН₃), 1.72 (m, 2Н, СН₂), 1.65 (т, 4Н, 2хСН₂).

MS електронен удар m/z 512 [М ⁺ ].

Пример 27

4-бензоил-5-(5-метокси-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3-пиролидин-1-ил-пропил)амид ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 14.24 (s, 1H, NH), 10.90 (br, s, 1H, NH), 7.97 (m, 1H, CONHCH₂), 7.75 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.69 (m, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.24 (s, 1H, Н-винил), 6.79 (m, 2H), 6.66 (m, 1H), 3.67 (s, 3H, OCH₃), 3.34 (m, 2H, CH₂), 2.43-2.48 (m, 6H, 3xCH₂), 2.14 (s, 3H, CH₃), 1.71 (m, 2H, CH₂), 1.66 (m, 4H, 2xCH₂).

MS електронен удар m/z 512 [М ⁺ ].

Пример 28

4-бензоил-5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1ил-пропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.20 (s, 1 Η, NH), 11.14 (br, s, 1H, NH), 8.03 (m, 1H, CONHCH₂), 7.68 (m, 1H), 7.55 (m, 2H), 7.38 Φ (s, 1H, Н-винил), 7.01 (m, 1H), 6.87 (m, 1H), 3.34 (m, 2H, CH₂),

2.42-2.48 (m, 6H, 3xCH₂), 2.09 (s, 3H, CH₃), 1.70 (m, 2H, CH₂), 1.65 (m, 4H, 2xCH₂).

MS електронен удар m/z 500 [М ⁺ ].

Пример 29

4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил )-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

5-бромо-1,3-дихидро-индол-2-он се кондензира с 4-ацетил-5-формил-3-метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3диетиламинопропил)амид (получен от 4-ацетил-5-формил-3-ме- ·· ···· *« ·· • · · • ·4 « · · ·

a· «*· • · • ·· • · ·» • · ····♦ • ·· «·♦ · тил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина по метод В и след това С), като се получава съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.19 (s, 1 Η, NH), 11.19 (br, s, 1H, NH), 8.15 (m, 1H, CONHCH₂), 8.11 (s, 1H, Н-винил), 7.72 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.38 (dd, J = 1.8 & 8.2 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-7), 3.27 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH₃CO), 2.46 (m, 9H, CH₃ & 3xCH₂), 1.64 (m, 2H, CH₂), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

Пример 30

4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил и ден метил )-3метил-1/7-пирол-2-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1 илпропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.14 (m, 1 H, CONHCH₂), 8.10 (s, 1H, Н-винил), 7.70 (d, 1H, H-4), 7.36 (dd, J = 1.6 & 8.1 Hz, 1H, H6), 6.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-7), 3.32 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH₃CO), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.35-2.48 (m, 6H, 3xCH₃), 1.65-1.71 (m, 6H, 3xC/7₂).

MS m/z 499 & 501 [M ⁺ ] & [M ⁺ +2J.

Пример 31

4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо-1, 2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил )-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (З-морфолин-4-илпропил)амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.20 (s, 1 Η, NH), 11.26 (br, s, 1H, NH), 8.09 (m, 2H, Н-винил & CONHCH₂), 7.73 (d, J = 1.5 Hz, 1H, H-4), 7.38 (dd, J = 1.5 & 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 3.55 (m, 4H, 2xCH₂), 3.26 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH₃CO), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.35 (m, 6H, 3xCH₃), 1.68 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 51 4 & 51 6 [M ⁺ -1 ] & [M ⁺ + 1 ].

	.. .. ,··.···: .·.: ···· ! 1 · · · · · ^:.5^:^ -·..··-· ’··· ^: Пример 32 4-ацетил-5-(5-6 ром 0-2-0 кс 0-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3-
a 4	метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (3-хидроксипропил)- амид
*	¹ЯМР (300 MHz, DMS0-d6) δ 14.17 (s, 1 Η, NH), 11.25 (br, s, 1H, NH), 8.10 (s, 1H, Н-винил), 8.03 (m, 1H, CONHCH₂), 7.71 (br
φ	s, 1H, H-4), 7.37 (br d, J = 8.4 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 4.51 (br s, 1H, OH), 3,51 (br s, 2H, CH₂), 3.26 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH₃CO), 2.43 (s, 3H, CH₃), 1.70 (m, 2H, CH₂). MS-EI m/z 445 & 447 [M ⁺ -1] & [M ⁺ +1 ]. Пример 34 4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксил на киселина (2-морфолин-4-илетил)амид ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 14.19 (s, 1 Η, NH), 11.14 (br, s, 1H, NH), 8.10 (s, 1H, Н-винил), 7.84 (m, 1H, CONHCH₂), 7.71 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.38 (dd, J = 1.8 & 8.2 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-7), 3,58 (m, 4H, 2xCH₂), 3.40 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH₃CO), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.45 (m, CH₃ & CH₂).
φ	MS-EI m/z 500 & 502 [M ⁺ -1] & [M ⁺ + 1 ]. Пример 35 4-ацетил-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 14.17 (s, 1 Η, NH), 11.23 (s, 1H, NH), 8.11 (s, 1H, Н-винил), 7.91 (m, 1H, CONHCH₂), 7.73 (d, J = 1.9 Hz, 1H, H-4), 7.39 (dd, J = 1.9 & 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.88 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 3.40 (m, 2H, CH₂), 2.62 (m, 2H, CH₂), 2.57 (s, 3H, CH3CO), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.44 (s, 3H, CH₃), 1.69 (m, 4H 2xCH₂).

• ·	• ·	• ·	• · · ·	• 9 • ·	• •
• · • ·	• · • ·	• · • ·	• •	• · • · ·	• · • ·· ·
• · • ·	• · • · 4 ·	• · · • · • ·	• · • ·	• · • ·	• •

- 161

Пример 36

4- ацетил-5-(5-6 ром 0-2-0 ксо-1,2-д ихидроиндол-3-и л иден метил )-3метил-1 Н-пирол-2-карбоксилна киселина [2-(4-хидроксифенил)етил]амид ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-06) δ 14.21 (s, 1 Η, ΝΗ), 11.18 (s, 1 Η, OH), 9.09 (s, 1 Η, ΝΗ), 8.06-8.10 (m, 2Η), 7.73 (s, 1H), 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.42 (m, 2H, CH₂), 2.72 (m, 2H, CH₂), 2.56 (s, 3H, CH₃CO), 2.37 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 507 & 509 [M ⁺ -1 ] & [M ⁺ + 1 ].

Пример 37

5- (5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

Смес от 2-аминоацетофенон хидрохлорид (1 екв), етил изобутирилацетат (1.2 екв) и натриев ацетат (2.4 екв) във вода се разбърква при 100°С в продължение на 18 часа, след което се охлажда до стайна температура. Водният слой се отдекантира и маслото се разтваря в етилацетат. С*лед това се промива с вода и със солна луга, суши се и се получава (93%) 2изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер, като червено-кафяво масло.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.21 (s, br, 1H, NH), 7.14-7.27 (m, 5H), 6.70 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 4.02 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3.65 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1.22 (d, J = 7.5 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 1.04 (t, J = 7.1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 257 [M ⁺ ],

Горният пирол се формилира, като се използва метод А и се получава (41%) 5-формил-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-3• · · · · · ·· ·

карбоксилна киселина етилов естер, като червеникаво твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.35 (s, br, 1 Η, NW), 9.14 (s, 1H, CHO), 7.36 (s, 5H), 3.96 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3.74 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1.29 (d, J = 6.9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 285 [M ⁺ ],

Естерът на пиролкарбоксилната киселина се хидролизира, като се използва метод В и се получава (57%) 5-формил2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина, като бежово твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.28 (s, br, 1H, COOH), 12.02 (s, br, 1H, NH), 9.10 (s, 1H, CHO), 7.35 (s, 5H), 3.81 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1.28 (d, J = 6.9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 257 [M ⁺ ],

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (120 mg, 0.31 mmol) ce кондензира c 5-формил-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-3-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (получен по метод С), като се получават 120 mg (71%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.23 (s, br, 1H, NH), 11.08 (s, br, 1H, NH), 7.38-7.55 (m, 7H, Ar-H & CONHCH₂), 7.30 (s, 1H, Hви-нил), 7.26 (dd, J - 1.8 & 7.8 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.36 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3.07 (m, 2H, CH₂), 2.34 (q, J = 7.1 Hz, 4H, N(CH₂CH₃)₂), 2.22 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH₂), 1.40 (m, 2H, CH₂), 1.31 (d, J = 6.9 Hz, 6H, CHCH₃)₂), 0.86 (t, J = 7.1 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 565.1 [M ⁺ +1 ].

• · · ·

·..··..· .......

- 163 Пример 38

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-д ихид рои ндол-3-и ли ден метил)-2-и зопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1илпропил)амид

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (127 mg, 0.28 mmol) се кондензира с З-пиролидин-1-ил-пропиламин (43 mg, 0.336 mmol), като се получават 140 mg (66%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.40 (s, br, 1H, NW), 7.38-7.47 © (m, 7H), 7.23-7.27 (m, 2H), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.36 (m, 1H,

CH(CH₃)₂), 3.08 (m, 2H, CH₂), 2.30 (m, 4H, 2xCH₂), 2.20 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH₂), 1.62 (m, 4H, 2xCH₂), 1.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH₂), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 560 & 562 [M ⁺ -1 и M ⁺ + 1],

Пример 39

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (57 д, 0.27 mmol) се кондензира с 5-формил-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (120 mg), като се получават 78 mg (53%) от съединението, посочено в заглавието като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.23 (s, br, 1H, NH), 11.09 (s, br, 1H, NH), 7.38-7.51 (m, 6H), 7.25-7.28 (m, 2H), 7.19 (t, 1H, CONHCH₂), 6.85 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.43 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 3.11 (m, 2H, CH₂), 2.28-2.39 (m, 6H, N(CH₂CH₃)₂) & CH₂, 1.31 (d, J = 6.9 Hz, CH(CH₃)₂), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 548 & 550 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 1].

- 164 -

Пример 40

5-(5-бромо-2-оксо-1, 2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-2-изопропил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [3-(4-метилпиперазин-1 -ил)пропил]амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (53 mg, 0.25 mmol) се кон' дензира с 5-формил-2-изопропил-4-фенил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина [3-(4-метилпиперазин-1 -ил)пропил]амид (300 mg), като се получават 65 mg (53%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.22 (s, br, 1H, NH), 11.08 (s, Φ br, 1H, NH), 7.23-7.50 (m, 9H), 6.85 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.37 (m,

1H, CH(CH₃)₂), 3.05 (m, 2H, CH₂), 2.24 (m, 8H, 4xCH₂), 2.11 (m, 5H, CH₂ & CH₃), 1.42 (m, 2H, CH₂), 1.31 (d, J = 7.2 Hz, 6H, CH(C/7₃)₂).

MS-EI m/z 589 & 591 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

Пример 41

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иден метил )-2-изопропил-4-фенил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (170 mg, 0.8 mmol) се конф дензира с 5-формил-2-изопропил-4-фенил-1 А7-пирол-3-карбоксилна киселина (205 mg), като се използва метод D и се получават 210 mg (58%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.31 (s, br, 1H, NW), 11.16 (s, br, 1H, NH), 7.26-7.44 (m, 7H), 7.11 (s, 1H, Н-винил), 6.85 (d, J =

7.8 Hz, 1H), 3.78 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 1.341 (d, J = 6.9 Hz, 6H,

CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 452 [M ⁺ + 1].

Пример 42

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-метил-4фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид

5- бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (44 mg, 0.21 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (70 mg, получени по същия начин, както изопропиловия аналог, по-горе), като се получават 0.03 g (27%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.87 (s, br, 1 Η, N/7), 11.11 (s, br, 1H, NH), 7.36-7.51 (m, 6H), 7.26 (dd, J = 1.8 & 8.1 Hz, 1H), 7.2 (s, 1H, Н-винил), 7.09 (m, 1H, CONHCHJ, 6.83 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.17 (m, 2H, CH₂), 2.48 (m, CH₃), 2.29-2.35 (m, 6H, 3xNCH₂), 1.59 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 518 & 520 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 1].

Пример 43

5-[6-(2-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил!-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пирол идин-1 -илет-ил)амид

6- (2-метоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (50 mg, 0.21 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 /7-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (70 mg), като се получават 0.04 g (35%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.82 (s, br, 1H, NH), 11.02 (s, br, 1H, NH), 7.48 (m, 2H), 7.43 (m, 1H), 7.38 (m, 2H), 7.32 (m, 1H),

7.24 (m, 2H), 7.16 (s, 1H, Н-винил), 7.08 (m, 2H), 7.03 (m, 1H), 7.0 (m, 2H), 3.74 (s, 3H, OCH₃), 3.19 (m, 2H, NCH₂), 2.49 (m, CH₃),

2.32-2.38 (m, 6H, 3xNCH₂), 1.59 (m, 4H, 2xCH₂).

-166• ·

MS-EI m/z 546 [М ⁺ ].

Пример 44

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-метил-4фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

5- бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (46 mg, 0.22 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (65 mg), като се получават 60 mg (55%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-06) δ 13.86 (s, br, 1 Η, NH), 11.09 (s, br, 1H, NH), 7.47-7.49 (m, 2H), 7.38-7.41 (m, 4H), 7.26 (dd, J = 2.2 & 8.3 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H, Н-винил), 7.04 (m, 1H, CONHCH₂), 6.77 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.15 (m, 2H, NCH₂), 2.48 (m, CH₃), 2.16 (t, J = 6.8 Hz, 2H, 3xNCH₂), 2.02 (s, 6H, 2xNCH₃).

MS m/z 493 [M⁺ и М ⁺ +2].

Пример 45

5-[6-(2-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил1-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

6- (2-метоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (53 mg, 0.22 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (65 mg), като се получават 0.05 g (44%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжева смола.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.82 (s, br, 1H, NH), 11.02 (s, br, 1H, NH), 7.37-7.52 (m, 5H), 7.32 (m, 1H), 7.22-7.27 (m, 2H), 7.16 (s, 1H), 7.08 (m, 2H), 7.03 (m, 1H), 7.0 (m, 2H), 3.74 (s, 3H, OCH₃), 3.15 (m, 2H, NCH₂), 2.49 (m, CH₃), 2.16 (t, J = 6.5 Hz, 2H, NCH₂), 2.02 (s, 6H, 2xNCH₂).

MS-EI m/z 521 [M ⁺ +1 ].

Пример 46

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-д ихидроин дол-3-и ли ден метил )-2-метил-4фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (60 mg, 0.29 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (75 mg), като се получават 78 mg (60%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 14.01 (s, br, 1H, N/7), 11.13 (s, br, 1H, NH), 7.42-7.46 (m, 3H), 7.27-7.34 (m, 4H), 7.12 (s, 1H), 6.84 (dd, J = 2.2 & 8.3 Hz, 1H), 3.99-4.03 (m, 2H, OCH₂CH₃), 0.98-1.03 (m, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 450 & 452 [M⁺-1 и M ⁺ + 1 ].

Пример 47

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2-метил-4фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (47 mg, 2.2 mmol) се кондензира с 5-формил-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (0.75 д), като се получават 0.11 д (42%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.86 (s, br, 1H, NH), 7.42-7.46 (m, 3H), 7.37-7.50 (m, 7H), 7.24-7.28 (m, 2H), 6.83 (d, J = 8.1 Hz,

1H), 3.09 (m, 2H, NCH₂), 2.45 (s, 3H, CH₃), 2.38 (q, J = 7.1 Hz, 4H,

2xNCH₂CH₃), 2.26 (t, J = 6.9 Hz, 2H, NCH₂), 1.42 (m, 2H, NCH₂),

0.87 (t, J = 7.1 Hz, 6H, 2xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 535.0 & 537 [M⁺ и М ⁺ + 2].

• <

Γ' Г) ···· · · · ^w “ ’ ’

-168- .· ·· ·· ··

Пример 48

5-(5-бромо-2-оксо-1, 2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-2,4-ди-метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

Смес от трет.-бутил 3-оксобутират и натриев нитрит (1 екв.) в оцетна киселина се разбърква при стайна температура, като се получава трет.-бутил-2-хидроксимино-З-оксобутират.

Етил-З-оксобутират (1 екв.), цинк на прах (3.8 екв.) и непречистен трет.-бутил-2-хидроксимино-З-оксобутират в оцетна киселина се разбъркват при 60°С 1 час. Реакционната смес се излива във вода и се филтрува, а филтратът се събира, като се получава (65%) 2-трет.-бутилоксикарбонил-3,5-диметил-4-етоксикарбонилпирол.

Смес от 2-трет.-бутоксикарбонил-3,5-диметил-4-етоксикарбонилпирол и триетилортоформиат (1.5 екв.) в трифлуороцетна киселина се разбърква при 15°С 1 час. Реакционната смес се концентрира и остатъкът се пречиства, като се получава (64%) 2,4-диметил-3-етоксикарбонил-5-формилпирол, във вид на жълти игли.

2,4-диметил-3-етоксикарбонил-5-формилпиролът се хидролизира, като се използва метод В и се получава (90%) 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина.

’ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 12 (br, s, 2H, NH и CO₂H), 9.58 (s, 1H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃).

MS m/z 267 [M ⁺ ],

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.17 g, 0.8 mmol) се кондензира c 5-формил-2-метил-4-фенил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (0.2 g, получени по метод С), като се прилага метод В и се получават 0.3 g (83%) от ·· ·· съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-06) δ 13.60 (s, br, 1H, NH), 10.94 (s, br, 1H, NH), 8.07 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.75 (s, 1H, Н-винил), 7.44 (t, J = 5.2 Hz, 1H, CONCHCH₂), 7.24 (dd, J = 1.8 & 8.4 Hz, 1H, H-6), 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 3.26-3.33 (m, 2H, NCH₂),

2.42 (s, 3H, CH₃), 2.38 (t, J = 6.7 Hz, 2H, NCH₂), 2.18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 430 & 432 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

Пример 49 ** 2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дйхидроиндол-З-илиденметил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

6-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (0.17 д, 0.8 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (0.2 д), като се получават 0.13 д (36%) от съединението, посочено в заглавието, като жълтооранжево твърдо вещество.

’ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (s, br, 1H, NH), 10.93 (s, © br, 1H, NH), 7.85 (d, J = 7.92 Hz, 1H, H-4), 7.63-7.65 (m, 3H), 7.327.36 (m, 1H, Ar-H), 7.30 (dd, J = 1.6 & 7.9 Hz, 1H, H-5), 7.11 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-7), 3.28-3.34 (m, 2H, NCH₂), 2.43 (m, 2H, NCH₂),

2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 2.38 (t, J = 6.8 Hz, 2H, NCH₂), 2.18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 428 [M ⁺ ].

Пример 50

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид • · • · • · · · ♦ · “170^_ *»»’*·· ·· ·· ·· ·

5-хлоро-1,3-дихидроиндол-2-он (0.1 g, 0.6 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (0.15 д), като се получават 22 д (90%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 10.98 (s, br, 1H, NH), 7.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-4), 7.75 (s, 1H, Н-винил), 7.50 (t, J = 5.5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.12 (dd, J = 2.0 & 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 3.26-3.31 (m, 2H, NCH₂), 2.42 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 2.36 (t, J = 6.6 Hz, 2H, NCH₂), 2.17 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 386 [M ⁺ ],

Пример 51

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил и ден метил )-2,4-д им eтил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.17 д, 0.8 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (0.2 д), като се получават 0.09 д (26%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 10.98 (s, br, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-4), 7.76 (s, 1H, Н-винил), 7.42 (t, J = 5.5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.24 (dd, J = 1.7 & 8.0 Hz, 1H, H-6), 6.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-7), 3.23-3.32 (m, 2H, NCH₂), 2.442.55 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.42 (s, 3H, CH₃), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 6H, 2xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 458 и 460 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

• · • · · · · · · · ··· • · · ·»« « · · · · ··♦·

171· *»·*·· ·· ·· · · *

Пример 52

5-(5-бромо-2-оксо-1, 2-дихидро и н дол-3-и ли ден метил )-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-ил-етил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.09 д, 0.4 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 илетил)амид (0.1 д), като се получават 0.14 д (81%) от съединението, посочено в заглавието, като жълтооранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-06) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 10.98 (s, br, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.7.Hz, 1H, H-4), 7.76 (s, 1H, Н-винил), 7.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.24 (dd, J = 1.9 & 8.5 Hz, 1H, H-6), 6.81 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-7), 3.29-3.35 (m, 2H, NCH₂), 2.44 (t, J = 6.9 Hz, 2H, NCH₂), 2.47 (m, под ДМСО), 2.42 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.66-1.69 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 456 и 458 [Μ ⁺ Ί _и M ⁺ + 1J.

Пример 53

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-имидазол-1-ил-пропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.09 д, 0.4 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-имидазол-1-илпропил)амид (0.1 д), като се получава 0.1 д (59%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.63 (s, br, 1H, NH), 10.99 (s, br, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-4), 7.77 (s, 1H, Н-винил), 7.71 (t, J = 5.7 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.65 (s, 1H, Ar-H), 7.25 (dd, J = 2.2 & 8.4 Hz, 1H, H-6), 7.20 (s, 1H, Ar-H), 6.89 (s, 1H, Ar-H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 4.02 (t, J = 6.7 Hz, 2H, NCH₂), 3.18

-172-

(q, J = 67 Hz, 2, NCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 1.93 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 467 и 469 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 1].

Пример 54

5-[6-(2-метоксифенил)-2-оксо-1, 2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил]^,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметил аминоетил)амид

6-(2-метоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (30 mg, 0.13 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-3карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (30 mg), като се получават 0.06 g (100%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто-оранжева смола.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.60 (s, br, 1H, NH), 10.89 (s, br, 1H, NH), 7.79 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H, Н-винил), 7.46 (t, J = 5.5 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.28-7.35 (m, 2H), 6.99-7.11 (m, 4H), 3.76 (s, 3H, OCH₃), 3.27-3.31 (m, 2H, NCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.39 (s, 3H, CH₃), 2.37 (m, 2H, NCH₂), 2.18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 [M ⁺ ],

Пример 55

5-[6-(3-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил1-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

6-(3-метоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (30 mg, 0.13 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид (30 mg), като се получават 8 mg (14%) от съединението, посочено в загла вието, като жълто-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (s, br, 1H, NH), 10.92 (s, br, 1H, NH), 7.84 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 (s, 1H, Н-винил), 7.42 (m, 1H, CONHCH₂), 7.36 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 1.6 &

7.6 Hz, 1 Η), 7.20 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.11 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 2.8 & 7.8 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H, OCH₃), 3.21-3.33 (m, 2H, NCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 2.36-2.40 (m, 2H, NCH₂), 2.18 (s, 6H, N(CH₃)₂).

MS-EI m/z 458 [M ⁺ ],

Пример 56

2,4-диметил-5-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

5-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (80 mg, 0.4 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (0.1 д), като се прилага метод В и се получават 79 mg (46%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.66 (s, br, 1H, NH), 10.95 (s, br, 1H, NH), 8.15 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H, Н-винил), 7.71 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40-7.47 (m, 4H), 7.31 (m, 1H), 6.95 (d, J =

8.1 Hz, 1H), 3.2-3.31 (m, 2H, NCH₂), 2.46-2.55 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.44 (s, 6H, 2xCH₃),0.96 (t, J = 7.4 Hz, 6H, 2xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 456 [M ⁺ ],

Пример 57

2,4-диметил-5-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроин дол-3-ил иден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид

5-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (0.04 д, 0.2 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (0.04 д), като се получава съединението, посочено в заглавието, във вид на жълто оранжево твърдо вещество.

• «

- 174 ··· · · · · · · · • · ·«· · ··· ····· ··· «··· ·· · • β ♦ · · · · · · · * ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.65 (s, br, 1H, NH), 10.96 (s, br, 1H, NH), 8.15 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H, Н-винил), 7.71 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 6.3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.41-7.46 (m, 3H), 7.31 (m, 1H), 6.95 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.08 (m, 4H, 2xNCH₂), 3.32 (m, 2H, NCH₂), 2.55 (t, J = 7.1 Hz, NCH₂), 2.47 (m, под ДМСО), 2.43 (s, 6H, 2xCH₃), 1.66 (m, 4H, 2xCH₂),.

MS-EI m/z 454 [M ⁺ ],

Пример 58

2.4- диметил-5-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-имидазол-1-илпропил)-амид

5- фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (8 mg, 0.04 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксил на киселина (З-имидазол-1-илпропил)амид (10 mg), като се получават mg (59%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.67 (s, br, 1H, NH), 10.96 (s, br, 1H, NH), 8.16 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H, Н-винил), 7.657.72 (m, 4H), 7.44 (m, 3H), 7.31 (m, 1H, CONHCH₂), 7.21 (s, 1H, ArH), 4.02 (t, J = 6.5 Hz, 2H, NCH₂), 3.19 (q, J = 6.5 Hz, 2H, CONHCH₂), 2.44 (s, 6H, 2xCH₃), 1.93 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂).

MS-EI m/z 465 [M ⁺ ].

Пример 59

2.4- диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-З-ил и ден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

6- фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (0.08 д, 0.4 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (0.1 д), като се получават 65 mg · · · ♦ · • · (38%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 10.99 (s, br, 1H, NH), 7.86 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.62-7.66 (m, 3H), 7.40-7.47 (m, 3H), 7.28-7.36 (m, 2H), 7.10 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 3.26 (m, 2H, NCH₂), 2.46-2.55 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.44 (s, 3H, CH₃), 0.97 (t, J =

7.2 Hz, 6H, 2xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 456 [M ⁺ ].

Пример 60

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-З-илиденме- ® тил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид

6-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (30 mg, 0.15 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (40 mg), като се получават 5.9 mg (8.5%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на жълто-оранжево твърдо вещество..

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.60 (s, br, 1H, NH), 10.99 (s, br, 1H, NH), 7.86 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63-7.66 (m, 3H), 7.51 (m, © 1H, CONHCH₂), 7.45 (m, 2H), 7.28-7.36 (m, 2H), 7.10 (d, J = 1.5

Hz, 1H), 3.31 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.55 (t, J = 6.6 Hz, 2H, NCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 4H,2xCH₂),

MS-EI m/z 454 [M ⁺ ],

Пример 61

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-имидазол-1-илпропил)-амид

6-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (8 mg, 0.04 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-имидазол-1-илпропил)амид (10 mg), като се получават • · · · · ·

- 176 • · ·· ·· · ···· • ·· · 9 · · · · · ····· ···· ···· · · · » · ·· · · · · · · ·

7.3 mg (43%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-66) δ 13.62 (s, br, 1 Η, NH), 10.99 (s, br, 1H, NH), 7.86 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.62-7.70 (m, 5H), 7.45 (m, 1H), 7.35 (m, 1H), 7.30 (dd, J = 1.4 & 8.2 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.10 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.89 (s, 1H), 4.02 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH₂), 3.19 (m, 2H, NCH₂, CH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 1.93 (t, J = 6.9 Hz, 2H, NCH₂),.

MS-EI m/z 465 [M ⁺ ],

Пример 62 ^w 5-[6-(3,5-дихлорофенил)-2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил]-2,4-диметил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)-амид

6-(3,5-дихлорофенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (64 mg, 0.23 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (60 mg), като се получават 53 mg (44%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на светлокафяво твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (s, br, 1H, NA/), 10.99 (s, φ 1H, N/7), 7.89 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-4), 7.69-7.71 (m, 3H), 7.55 (m,

1H, CONHCH₂), 7.37 (m, 2H), 7.14 (d, J = 1.4 Hz, 1H, H-7), 3.27 (m, 2H, NC/7₂), 2.48-2.58 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.45 (s, 3H, CH₃), 2.42 (s, 3H, CH₃), 0.97 (t, J = 6.8 Hz, 6H, 3xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 526.9 [M ⁺ +1 ].

Пример 63

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)-амид

6-пиридин-3-ил-1,3-дихидроиндол-2-он (40 mg, 0.19 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксил-

• · ·· ······ 9· • 999 9 9 ····

-4-7-7 · · ·· · 9 9 9 9 99

- J ( / - ······· · · · · ····

9 9 9 9 9 9 9 ···

9 · 9 99 99 999 на киселина (2-диетиламиноетил)амид (50mg), като се получават 29 mg (33%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на светлооранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (s, br, 1H, NH), 11.05 (s, br, 1H, NH), 8.86 (s, br, 1H), 8.53 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 8.04 (m, 1H), 7.91 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H, Н-винил), 7.40-7.48 (m, 2H), 7.35 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 3.26 (m, 2H, NCH₂), 2.48-2.55 (m, 3xNCH₂), 2.42 (s, 3H, CH₃), 2.38 (s, 3H, CH₃), 0.96 (t, J = 6.9 Hz, 6H, 2xNCH₂CH₃).

MS-EI m/z 457 [M ⁺ ].

Пример 64

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1илетил)-амид

6-пиридин-3-ил-1,3-дихидроиндол-2-он (60 mg, 0.28 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (75 mg), като се получават 90 mg (71%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на светлооранжево твърдо вещество.

© ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 11.05 (s, br, 1H, NH), 8.86 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.54 (dd, J = 1.5 & 4.8 Hz, 1H), 8.05 (m, 1H), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H, Н-винил), 7.44-7.53 (m, 2H), 7.36 (dd, J = 1.5 & 8.1 Hz, 1 H),₂), 7.15 (d, J =

1.2 Hz, 1H), 3.33 (m, 2H, NCH₂), 2.47-2.57 (m, 6H, 3xNCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 42H, 2xCH₂),

MS-EI m/z 455 [M ⁺ ],

Пример 65

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-пиридин-3-ил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диметиламинопропил)амид ·«

- 178 • « ·

6-пиридин-3-ил-1,3-дихидроиндол-2-он (42 mg, 0.2 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диметиламинопропил)амид (50 mg), като се получават 67 mg (75%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на жълто-кафяво твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, br, 1H, NH), 11.00 (s, br, 1H, NH), 8.86 (s, br, 1H), 8.54 (s, br, 1H), 8.04 (m, 1H), 7.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.69 (s, 1H, Н-винил), 7.63 (m, 1H), 7.45-7.48 (m, 1H), 7.35 (dd, J = 1.7 & 8.0 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.213.27 (m, 2H, NCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 2.28 (m, 2H, NCH₂), 2.14 (s, 6H, 2xNCH₃), 1.64 (m, 2H, CH₂).

MS-EI m/z 443 [M ⁺ ],

Пример 66

2,4-диметил-5-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроиндол-З-ил иден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диметиламинопропил)амид

5-фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (67 mg, 0.32 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диметиламинопропил)амид (81 mg), като се получават 40 mg (28%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.66 (s, br, 1H, NH), 10.92 (s, br, 1H, NH), 8.14 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.62 (m, 1H), 7.44 (m, 3H), 7.32 (m, 1H), 6.95 (m, 1H), 6.95 (m, 1H), 3.33 (m, 2H, NCH₂), 2.43 (s, 6H, 2xCH₃), 2.27 (m, 2H, NCH₂), 2.13 (s, 6H, 2xNCH₃), 1.63 (m, 2H, NCH₂).

MS-EI m/z 442 [M ⁺ ], ·· ····

- 179 • · • · · • ·· ··

Пример 67

2,4-диметил-5-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроин дол-3-и ли ден метил)-! Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил) амид

5- фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (1.5 д, 7.16 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (2 д), като се получават 1.3 д (40%) от съединението, посочено в заглавието, като жълтооранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.64 (s, 1 Η, NH), 10.91 (s, 1H, © NH), 8.14 (d, J - 1.4 Hz, 1H, ArH), 7.8 (s, 1H, ArH), 7.7 (dd, J =

1.2 и 8.5 Hz, 2H, ArH), 7.6 (t, J = 5.3 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.4 (m, 3H, ArH), 7.3 (t, J = 7.4 Hz, 1H, ArH), 6.9 (d, J = 8.0 Hz, 1H, ArH),

3.2 (m, 2H, CONHCHs), 2.5 (m, 12H, ЗхИСНз и 2xCH₃), 1.61 (m, 2H, СНгСНзСНз), 0.93 (t, J = 6.7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 470 [M ⁺ ],

Пример 68

2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил)-!/7-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)ф амид

6- фенил-1,3-дихидроиндол-2-он (1.5 д, 7.16 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (2 д), като се получават 1.9 д (57%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.58 (s, 1 Η, NH), 10.94 (s, 1H, NH), 7.8 (d, J = 7.9 Hz, 1H, ArH), 7.6 (m, 4H, ArH), 7.4 (t, J = 7.5 Hz, 2H, ArH), 7.3 (m, 2H), 7.1 (d, J = 1.4 Hz, 1H, ArH), 3.2 (m, 2H, CONHCH₂), 2.5 (m, 12H, 3xNCH₂ и 2xCH₃), 1.61 (m, 2H,

CH₂CH₂CH₂), 0.93 (t, J = 6.7 Hz, 6H, NCH₂CH₃).

·· ····

- 180 MS-EI m/z 470 [М ⁺ ].

•	• ·	•	•	•		•	9	•
•	•	··	4	•	•	A ·	• ·
•	• ·	• · ·	•	•	• 9	•	····
• ··	• ·	• ··	•	• » · • 4	• · ··	9 9

Пример 69

3-[4-(3-диетиламинопропилкарбамоил)-3,5-ди метил-1 Н-пирол-2илметилен1-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-4-карбоксилна кисеина (3-хлоро-4-метоксифенил)амид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-4-карбоксилна киселина (3хлоро-4-метоксифенил)амид (1 д, 3.16 mmol) се кондензира с 5-

формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид (1 д, 3.58 mmol), като се получават 1.7 д (85%) от съединението, посочено в заглавието, като жълтооранжево твърдо вещество.

MS-EI m/z 578.2 [М ⁺ ].

Пример 70

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил) амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (0.5 д, 2.36 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (0.51 д), като се получават 0.84 д (57%) от съединението, посочено в заглавието, като червено-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.61 (s, 1 Η, NH), 10.99 (s, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.7 (m, 4H), 7.2 (dd, J = 1.8 и

8.3 Hz, 2H, ArH), 6.8 (d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH), 3.3 (br s, 4H, 2xNCH₂), 3.2 (m, 2H, CONHCH₂), 2.6 (br s, 2H, NCH₂ и 2xCH₃), 2.4 (s, 6H, 2xCH₃), 1.66 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂), 0.98 (t, J = 7.1 Hz, 6H, NCH₂CH₃).

MS-EI m/z 472 и 474 [M ⁺ -1 _и M ⁺ +1 ].

• · • · · ·

- 181

Пример 71

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диизо пропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноет ил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (100 mg, 0.47 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбок силна киселина (2-диетиламиноетил)амид (150 mg), като се получават 0.15 g (62%) от съединението, посочено в загла вието, като жълто-оранжево твърдо вещество.

’ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.97 (s, 1H, NH), 10.95 (s, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.3 Hz, 1H, ArH), 7.84 (m, 1 H), 7.79 (s, 1H), 7.23 (dd, J = 1.3 и 8.1 Hz, 2H, ArH), 6.8 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 3.5 (m, 1H, CH), 3.3 (m, 3H, CH и NHCH₂), 2.5 (br m, 6H, 3xNCH₂), 1.28 (d, J = 6.9 Hz, 6H, 2xCH₃), 1.23 (d, J = 6.6 Hz, 6H, 2xCH₃), 0.96 (m, 6H, 2xCH₂CH₃).

MS-EI m/z 514 и 516 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

Пример 72

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (3-диетиламинопропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (90 mg, 0.42 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-диетиламинопропил)амид (140 mg), като се получават 54 mg (25%) от съединението, посочено в заглавието, като червено-кафяво твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.98 (s, 1 Η, NH), 10.96 (s, 1H, NH), 8.09 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.23 (dd, J = 1.7 и 8.1 Hz, 2H, ArH), 6.82 (d, J = 8.1 Hz, 1H, ArH), 3.5 (m, 1H, CH), 3.25 (m, 2H, NHCH₂), 3.15 (m, 1H, CH), 2.7 (br s, 6H,

- 182 3xNCH₂), 1.7 (br m, 2H

CH₂CH₂CH₂), 1.28 • · · ·

(d, J =

6.9 Hz,

6H,

2xCH₃), 1.24 (d, J = 5.9 Hz, 6H, 2xCH₃), 1.06 (m, 6H, 2xCH₂CH₃).

MS-EI m/z 528 и 530 [M ⁺ -1 и М ⁺ + 1].

Пример 73

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-

илпропил)амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (130 mg, 0.6 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (З-пиролидин-1-илпропил)амид (150 mg, 0.45 mmol), като се получават 36 mg (15%) от съединението, посочено в заглавието, като червеникавокафяво-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.98 (s, 1H, NH), 10.97 (s, 1H, NH), 8.10 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.23 (dd, J = 1.6 и 7.6 Hz, 1H, ArH), 6.82 (d, J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 3.5 (m, 1H, CH), 3.25 (m, 2H, NHCH₂), 3.15 (m, 1H, CH), 2.7 (br s, 6H, 3xNCH₂), 1.7 (br m, 6H, NCH₂CH₂), 1.28 (d, J = 5.6 Hz, 6H, 2xCH₃).

MS-EI m/z 526 и 528 [M ⁺ -1 и M ⁺ +1 ].

Пример 74

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил и ден метил )-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (пиридин-4-илметил) амид

5-бромо-1,3-дихидроиндол-2-он (170 mg, 0.8 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (пиридин-4-илметил)амид (200 mg), като се получават 14 mg (4%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

• · ··

- 183 ·· ·· ·..· :

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.67 (s, 1H, NH), 11.01 (s, br, 1H, NH), 8.51 (dd, J = 1.6 & 4.3 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.23 (dd, J = 1.6 и 7.6 Hz, 1H, ArH), 8.23 (t, J = 6.0 Hz, 1H, CONHCH₂), 8.11 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H, Н-винил), 7.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.25 (dd, J = 1.9 и 8.1 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 6.0 Hz, 2H, NCH₂), 2.46 (s, 6H, 2xCH₃).

MS-EI m/z 450 и 452 [M ⁺ -1 и M ⁺ + 1],

Пример 75

5-[6-(4-бутилфенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 ^w илетил)амид

5- [6-(4-бутилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (50 mg, 0.19 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (50 mg), като се получават 74 mg (76%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.58 (s, 1 Η, NH), 10.93 (s, br, 1H, NH), 7.82 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H, Н-винил), 7.54 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.46 (m, 1H, CONH), 7.26 (m, 3H), 7.09 (s, 1H), 3.30 © (m, 2H, NHCH₂), 2.52-2.63 (m, 4H, 2xCH₂), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂),

2.43 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.68 (m, 4H, 2xCH₂), 1.58 (m, 2H, CH₂), 1.34 (m, 2H, CH₂), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃).

MS-EI m/z 51 0[M ⁺ ].

Пример 76

5-[6-(5-изопропил-2-метоксифенил)-2-оксо-1, 2-д ихидроин дол-3илиденметил|-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пирол иди н-1 - илетил)амид

6- (5-изопропил-2-метоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (50 mg, 0.17 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (45 • · ··

- 184 • · • · · mg), като се получават 67 mg (75%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.60 (s, 1 Η, NH), 10.82 (s, br,

1H, NH), 7.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H, Н-винил), 7.45 (m,

1H, CONH), 7.0-7.19 (m, 5H), 7.09 (s, 3H, OCH₃), 3.32 (m, 2H, CH₂), 2.87 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 2.56 (m, 2H, CH₂), 2.48 (m, 4H, 2xCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.68 (m, 4H, 2xCH₂), 1.21 (d, J = 6.8 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 527.2 [M ⁺ +1 ].

Пример 77

5-[6-(4-етилфенил)-2-оксо-1,2-дихидр'оиндол-3-илиденметил]-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид

6-(4-етилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (45 mg, 0.19 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (50 mg), като се получават 60 mg (65%) от съединението,. посочено в заглавието, като жълто-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (s, 1 Η, NH), 10.96 (s, br, © 1H, NH), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H, Н-винил), 7.51-7.56 (m, 3H), 7.25-7.30 (m, 3H), 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.31 (m, 2H, CH₂), 2.63 (m, 2H, CH₂CH₃), 2.55 (m, 2H, CH₂), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.42 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 4H, 2xCH₂), 1.20 (t, J = 7.5 Hz, 3H, CH₂CH₃).

MS-EI m/z 482 [M ⁺ ],

Пример 78

5-[6-(2,4-диметоксифенил)-2-оксо-1,2-д ихид рои н до л-3-и ли денметил]^,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид

- 185 ♦· ·· ·♦ ·· ; :·.· . . ...

··

6-(2,4-диметоксифенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (51 mg, 0.19 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (50 mg), като се получават 30 mg (31%) от съединението, посочено в загла вието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (s, 1 Η, ΝΗ), 10.86 (s, br, 1 Η, ΝΗ), 7.75 (d, J = 7.8 Hz, 1 Η), 7.61 (s, 1H, Н-винил), 7.49 (m, 1Н, CON/-/), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.03 (m, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.58-6.65 (m, 2H), 3.79 (s, 3H, OCH₃), 3.76 (s, 3H, OCH₃), 3.33 (m, 2H, CH₂), 2.55 (m, 2H, CH₂), 2.50 (m, 4H, 2xCH₂), 2.42 (s, 3H, CH₃), 2.39 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 514 [M ⁺ ],

Пример 79

5-[6-(3-изопропилфенил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил]-2,4-диметил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид

6-(3-изопропилфенил)-1,3-дихидроиндол-2-он (48 mg, 0.19 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (50 mg), като се получават 59 mg (63%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.63 (s, 1H, N/7), 10.97 (s, br, 1H, NW), 7.87 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.68 (s, 1H, Н-винил), 7.24-7.55 (m, 6H), 7.13 (s, 1H), 3.34 (m, 2H, CH₂), 3.30 (m, 1H, CH(CH₃)₂), 2.60 (m, 2H, CH₂), 2.50 (m, 4H, 2xCH₂), 2.45 (s, 3H, CH₃), 2.43 (s, 3H, CH₃), 1.70 (m, 4H, 2xCH₂), 1.27 (d, J = 6.9 Hz, 6H, CH(CH₃)₂).

MS-EI m/z 496 [M ⁺ ], • · ··

- 186 • ·

Пример 80

5-(5-флуоро-2-оксо-1, 2-дихидроин дол-3-и ли ден метил )-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

5-флуоро-1,3-дихидроиндол-2-он (0.54 д, 3.8 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диизопропил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (150 mg), като се получават 0.83 g (55%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто-зелено твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.66 (s, 1 Η, NH), 10.83 (s, br, 1H, NH), 7.73 (dd, J = 2.5 и 9.4 Ηζ,ΊΗ), 7.69 (s, 1H, Н-винил), 7.37 (t, 1H, CONHCH₂CH₂), 6.91 (m, 1H), 6.81-6.85 (m, 1H), 3.27 (m, 2H, CH₂), 2.51 (m, 6H, 3xCH₂), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃),0.96 (t, J = 6.9 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 398 [M ⁺ ],

Пр имер 80 (Алтернативен синтез)

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихи дроиндол-(32)-и ли ден метил 1-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид

Хидразин хидрат (55%, 300 mL) и 5-флуороизатин (300 д) се загряват до 100°С. Добавя се допълнително количество 5флуороизатин (500 д) на порции от по 100 д в продължение на 120 минути при разбъркване. Сместа се загрява до 110°С и се разбърква 4 часа. Сместа се охлажда до стайна температура и твърдите вещества се събират чрез вакуум-филтруване, като се получава суров хидразид на (2-амино-5-флуоро-фенил)оцетна киселина (748 д). Хидразидът се суспендира във вода (700 mL) и pH на сместа се довежда до < 3 с 12 N хлороводородна киселина. Сместа се разбърква 2 часа при стайна ····

- 187 ·· ·’ *..· ;

температура. Твърдите вещества се събират чрез вакуумфилтруване и се промиват двукратно с вода. Продуктът се суши под вакуум, като се получава 5-флуоро-1,3-дихидроиндол2-он (600 д, 73% добив) във вид на кафяв прах.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-с1₆) δ 3.46 (s, 2Н, СН₂), 6.75, 6.95, 7.05 (3 х т, ЗН, ароматен), 10.35 (s, 1Н, NH). MS m/z 152 [М + 1].

3,5-диметил-1 Н-пирол-2,4-дикарбоксилна киселина 2-трет,бутилов естер 4-етилов естер (2600 д) и етанол (7800 mL) се разбъркват енергично, като се добавя бавно 10 N хлороводородна киселина (3650 mL). Температурата се повишава от 25°С на 35°С и започва отделяне на газ. Сместа се затопля до 54°С и се разбърква с допълнително нагряване един час, през което време температурата е 67°С. Сместа се охлажда до 5°С и бавно се добавят, при разбъркване, 32 L лед и вода с разбъркване. Твърдото вещество се събира чрез вакуум-филтруване и се промива трикратно с вода. Твърдото вещество се суши въздушно до постоянно тегло, като се получава 2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (1418 д, 87% добив) като възрозово твърдо вещество.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксидА) δ 2.10, 2.35 (2xs, 2хЗН, 2хСН₃), 4.13 (q, 2Н, СН₂), 6.37 (s, 1Н, СН), 10.85 (s, 1 Н, NH). MS m/z 167 [М + 1].

Диметилформамид (322 д) и дихлорометан (3700 mL) се охлаждат на ледена баня до 4°С и се добавя, при разбъркване, фосфорен оксихлорид (684 д). Добавя се бавно на равни части твърд 2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (670 д) в продължение на 15 минути. Максималната температура достига 18°С. Сместа се загрява до температурата на кипене 1 час, охлажда се до 10°С на ледена баня и бързо се добавят 1.6 L ледена вода при енергично разбъркване. Температурата се повишава до

-188-

родна киселина (1.6 L) при енергично разбъркване. Температурата се повишава до 22°С. Сместа се оставя да престои 30 минути и слоевете се разделят. Температурата достига максимум 40°С. Водният слой се довежда до pH 12-13 с 10 N калиев хидроксид (3.8 L) със скорост, която позволява температурата да достигне и остане 55°С по време на добавянето. След като приключи добавянето, сместа се охлажда до 10°С и се разбърква 1 час. Твърдото вещество се събира чрез вакуум-фил труване и се промива четирикратно с вода, като се получава 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (778 д, 100% добив), във вид на жълто твърдо ве щество.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-с1₆) δ 1.25 (t, ЗН, СН₃), 2.44, 2.48 (2XS, 2хЗН, 2хСН₃), 4.16 (q, 2Н, СН₂), 9.59 (s, 1 Н, СНО), 12.15 (br s, 1 Н, NH). MS m/z 195 [М + 1].

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (806 д), калиев хидроксид (548 д), вода (2400 mL) и метанол (300 mL) се нагряват при температурата на кипене 2 часа при разбъркване и след това се охлаждат до 8°С. Сместа се екстрахира двукратно с дихлорометан. Водният слой се довежда до pH 4 с 1000 mL 10 N хлороводородна киселина, като температурата се поддържа под 15°С. За да се улесни разбъркването се добавя вода. Твърдото вещество се събира чрез вакуум-филтруване, промива се трикратно с вода и се суши под вакуум при 50°С, като се получава 5-формил-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (645 д, 93.5% добив) във вид на жълто твърдо вещество.

¹Н ЯМР (ДМСО-с1₆) δ 2.40, 2.43 (2xs, 2хЗН, 2хСН₃), 9.57 (s, 1Н,

СНО), 12.07 (br s, 2Н, NH + COOH). MS m/z 168 [М + 1].

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (1204 g) и 6020 mL диметилформамид се разбъркват при стайна температура, като междувременно се добавят 1 -(3-диметиламинопропил)-3-етилкарбодиимид хидрохлорид (2071 д), хидроксибензотриазол (1460 д), триетиламин (2016 mL) и диетилетилендиамин (1215 mL). Сместа се разбърква 20 часа при стайна температура. Сместа се разрежда с 3000 mL вода, 2000 mL солна луга и 3000 mL наситен разтвор на натриев бикарбонат и pH се довежда до над 10 с 10 N натриев хидроксид. Сместа се екстрахира двукратно с по 5000 mL 10% метанол в дихлорометан и екстрактите се събират, сушат се над безводен магнезиев сулфат и се изпаряват на ротационен изпарител до сухо. Сместа се разрежда с 1950 mL толуен и отново се изпарява ротационно до сухо. Остатъкът се обработва с 3:1 хексан:диетилетер (4000 mL). Твърдите вещества се събират чрез вакуум-филтруване, промиват се двукратно с 400 mL етилацетат и се сушат под вакуум при 34°С в продължение на 21 часа, като се получава 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (819 д, 43% добив), във вид на светлокафяво твърдо вещество.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-с1₆) δ 0.96 (t, 6Н, 2хСН₃), 2.31, 2.38 (2xs, 2хСН₃), 2.51 (m, 6Н, ЗхСН₂), 3.28 (т, 2Н, СН₂), 7.34 (т, 1Н, амиден NH), 9.56 (s, 1Н, СНО), 11.86 (s, 1 Н, пиролен NH). MS m/z 266 [М + 1].

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (809 д), 5-флуоро-1,3-дихидроиндол2-он (438 д), етанол (8000 mL) и пиролидин (13 mL) се нагряват при 78°С в продължение на 3 часа. Сместа се охлажда до стайна температура, твърдите вещества се събират чрез вакуумно филтруване и се промиват с етанол. Твърдите вещества ♦ · ··

-190се разбъркват с етанол (5900 mL) при 72°С 30 минути. Сместа се охлажда до стайна температура. Твърдите вещества се съ бират чрез вакуумно филтруване, промиват се с етанол и се сушат под вакуум при 54°С в продължение на 130 часа, като се

получава 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (1013 д, 88% добив) във вид на оранжево твърдо вещество.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-с1₆) δ 0.98 (t, 6Н, 2хСН₃), 2.43, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.50 (m, 6Н, ЗхСН₂), 3.28 (q, 2Н, СН₂), 6.84, 6.92, 7.42, 7.71, 7.50 (5хт, 5Н, ароматен, винил, CONH), 10.88 (s, 1Н, CONH), 13.68 (S, 1 Н, пироле.н NH). MS m/z 397 [М-1].

Пример 81

3-[4-(2-диетиламиноетилкарбамоил)-3,5-диметил-1 Н-пирол-2 илметилен]-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-6-карбоксилна кисе лина

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-6-карбоксилна киселина (80 mg, 0.45 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид, като се получават 210 mg (92%) от съединението, посочено в заглавието като жълто-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.6 (s, 1 Η, NH), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H, Н-винил), 7.57 (dd, J = 1 .5 & 8.0 Hz, 1H), 7.40-7.42 (m, 2H), 3.28 (m, 2H, CH₂), 2.88 (m, Н-пиперидин), 2.54 (m, 6H, 3xCH₂), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 1.56 (m, Hпиперидин), 0.97 (t, J = 6.98 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 424 [M ⁺ ].

- 191

Пример 82

5-(5-диметилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина диметиламид (90 mg, 0.38 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (100 mg), като се получават 100 mg (54%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.65 (s, 1 Η, NH), 11.30 (s, br,

1H, NH), 8.25 (d, 1H), 7.92 (s, 1H, Н-винил), 7.48-7.53 (m, 2H),

7.07 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.33 (m, 2H, CH₂), 2.61 (s, 6H, N(CH₃)₂), (s, 1H), 6.58-6.65 (m, 2H), 3.79 (s, 3H, OCH₃), 3.76 (s, 3H, OCH₃), 2.56 (t, 2H, CH₂), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.45 (s, 3H, CH₃), 2.44 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 485 [M ⁺ ],

Пример 83

5-[5-(3-хлорофенилсулфамоил)-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил1-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина (3хлоро-фенил)амид (120 mg, 0.38 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид (100 mg), като се получават 150 mg (69%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто-оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.55 (s, 1 Η, NH), 11.26 (br s, 1H, NH), 10.30 (br s, 1H, NH), 8.26 (d, 1H), 7.79 (s, 1H, Н-винил), 7.51-7.57 (m, 2H), 7.22 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.0 (m, 2H), 3.44 (m, 2H, CH₂), 2.57 (t, J = 7.00 Hz, 2H, CH₂),

- 192 ·· ·· ·..· ;

2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.44 (s, ЗН, СН₃), 2.43 (s, ЗН, СН₃), 1.68 (т, 4Н, 2хСН₂).

MS-EI m/z 568 [М ⁺ ].

Пример 84

2.4- диметил-5-[2-оксо-5-(пиридин-3-илсулфамоил)-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил1-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 - ил етил) ами д

2-оксо-2,3-дихидро-1 /7-индол-5-сулфонова киселина пиридин-3-иламид (110 mg, 0.38 mmol) се кондензира с 5-формил-

2.4- диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 илетил)амид (100 mg), като се получават 150 mg (74%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.58 (s, 1H, N /-/) , 8.21 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 8.04 (m, 1H), 7.76 (s, 1H, Н-винил), 7.49-7.54 (m, 2H), 7.41 (m, 1H), 7.14 (m, 1H), 6.94 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.33 (m, 2H, CH₂), 2.56 (t, J = 7.00.Hz, 2H, CH₂), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.43 (s, 6H, 2xCH₃), 1.68 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 535 [M ⁺ j.

Пример 85

3-[3,5-диметил-4-(4-метилпиперазин-1 -карбон и л)-1 Н-пирол-2ил метил ен 1-4-(2-хидроксиетил)-1,3-дихидроиндол-2-он

4-(2-хидроксиетил)-1,3-дихидроиндол-2-он (71 mg, 0.4 mmol) се кондензира с 3,5-диметил-4-(4-метил-пиперазин-1 карбонил)-1 Н-пирол-2-карбалдехид, като се получават 90 mg (55%) от съединението, посочено в заглавието, като оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.25 (s, 1 Η, NH), 10.88 (s, 1H,

NW), 7.57 (s, 1H, Н-винил), 7.03 (m, 1H), 6.75-6.82 (m, 2H), 4.86 ·« ···· ·· ·· ·..· · (m, 1H, OH), 3.70 (m, 2H, CH₂), 3.04 (m, 2H, CH₂), 2.48 (m, 4H, 2xCH₂),2.28 (br s, 7H), 2.19 (s, 3H, CH₃), 2.18 (s, 3H, CH₃).

MS m/z ( + ve) 4.09.3 [M ⁺ ],

Пример 86

3-[3,5-диметил-4-(4-метил пиперазин-1 -карбонил )-1 Н-пирол-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина фениламид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина фениламид (110 mg, 0.4 mmol) се кондензира с 3,5-диметил-4-(4метилпиперазин-1 -карбонил)-1 Н-пирол-2-карбалдехид (100 mg), като се получават 50 mg (24%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-06) δ 13.52 (s, 1 Η, NH), 11.26 (s, 1H, NH), 10.08 (s, 1H, NH), 8.21 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H, Hвинил), 7.50 (dd, J = 1.6 и 8.3 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.10 (m, 2H), 6.97 (m, 2H), 2.49 (m, 4H, 2xCH₂), 2.28 (m, 10H, 2xCH₃ & 2xCH₂), 2.18 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 519 [M ⁺ ].

Пример 87

5-(5-диметилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидро и н до л-3-и ли ден метил)^,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина диметиламид (90 mg, 0.38 mmol) се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (100 mg), като се получават 80 mg (43%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.30 (s, 1 Η, NH), 8.27 (d, J =

1.7Hz, 1H), 7.94 (s, 1H, Н-винил), 7.49 (dd, J = 1.7 & 8.0 Hz, 1H),

7.44 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.26 (m, 2H, ··

··♦· • · • · ·

-1949 9 ф g · ·

СН₂), 2.60 (s, 6Н, N(CH₃)₂), 2.53 (m, 2H, CH₂), 2.45-2.50 (m, 1OH, 2xCH₃ & N(CH₂CH₃)₂, 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 487 [M ⁺ ].

Пример 88

5-[5-(3-хлорофенилсулфамоил)-2-оксо-1, 2-дихид рои идол-3-и лиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-5-сулфонова киселина (3хлоро-фенил)амид (120 mg, 3.8 mmol) се кондензира с 5формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (100 mg), като се получават 80 mg (37%) от съединението, посочено в заглавието, като жълто твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.55 (s, 1H, NH), 11.24 (s, 1H, NH), 10.29 (s, 1H, NH), 8.25 (d, J = 1.87Hz, 1H), 7.79 (s, 1H, Hвинил), 7.52 (dd, J = 1.87 & 8.3 Hz, 1H), 7.42 (m, 1H, CONHCH₂CH₂), 7.22 (t, J = 8.02 Hz, 1H), 7.15 (t, J = 2 Hz, 1H), 7.08 (m, 1H), 7.0 (m, 2H), 3.27 (m, 2H, CH₂), 2.48-2.57 (m, 6H, 3xCH₂), 2.45 (s, 3H, CH₃), 2.44 (s, 3H, CH₃) 0.97 (t, J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS-EI m/z 570.1 [M ⁺ ],

Пример 95

3-(2-оксо-5-фенил-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-4,5,6,7-тетрахидро-2Н-изоиндол-1-карбоксилна киселина етилов естер ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.74 (s, 1 Η, NH), 11.00 (s, 1H, NH), 8.13 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 7.74 (s, 1 H, Н-винил), 7.70 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.49 (dd, J = 1.7 & 8.0 Hz, 1H), 7.44 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.32 (m, 1H), 6.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.79 (m, 2H, CH₂), 2.72 (m, 2H, CH₂), 1.73 (m, 4H, 2xCH₂), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

- 195 MS-EI m/z 412 [M ⁺ ].

Пример 99 ·· .· I ♦ · · • · ·· ; · · · • · · · ·· ··

.·· ···· • : .·	• « ·	• •
• :. : ♦	• « • «	• ·
·· *.	• · • ·	• •

3-(2-оксо-5-фенилсулфамоил-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)

4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1-карбоксилна киселина етил. ов естер ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-66) δ 13.64 (s, 1 Η, NH), 11.33 (s, 1H, NH), 10.07 (s, 1H, NH), 8.24 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H, Hвинил), 7.57 (dd, J = 1.8 & 8.0 Hz, 1H), 7.21 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.98 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.27 (q, J = 7.0 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.80 (m, 2H, CH₂), © 2.73 (m, 2H, CH₂), 1.73 (m, 4H, 2xCH₂), 1.30 (t, J = 7.0 Hz, 3H,

OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 491 [M ⁺ ],

Пример 109

3-[3-(морфолин-4-карбонил)-4,5,6,7-тетрахидро-2/7-изоиндол-1 илметилен]-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-6-карбоксилна киселина ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.60 (s, 1Η, NH), 12.75 (br s, 1H, COOH), 11.08 (s, 1H, NH), 7.85 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.71 (s, ф 1H, Н-винил), 7.62 (dd, J = 1.4 & 7.8 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 1.4 Hz,

1H), 3.65 (m, 4H, 2xCH₂), 3.55 (m, 4H, 2xCH₂), 2.81 (m, 2H, CH₂), 2.54 (m, 2H, CH₂), 1.73 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 421 [M⁺ ],

Пример 112

5-бромо-3-[3-(пиролидин-1 -карбон ил )-4,5,6,7-тетрахидро-2Низоиндол-1 - илметилен]-1,3-дихидроиндол-2-он ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.56 (s, 1 Η, NH), 11.00 (s, 1H, NH), 8.05 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H, Н-винил), 7.28 (dd, J = 1.3 & 8.3 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.57 (m, 4H, 2xCH₂), ····

- 196 ·· ·· ·

2.79 (m, 2H, CH₂), 2.65 (m, 2Н, СН₂), 1.88 (m, 4Н, 2хСН₂‘). 1* 71 (m, 4Н, 2хСН₂).

MS-EI m/z 439 & 441 [М ⁺ -1] & [М ⁺ + 1 ].

Пример 114 , 3-(3-диметилкарбамоил)-4,5,6,7-тетрахидро-2/-/-изоиндол-1 -илметилен)-2-оксо-2,3-дихидро-1 Н-индол-6-карбоксилна киселина ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.60 (s, 1 Η, NH), 12.72 (br s, 1H, COOH), 11.05 (s, 1H, NH), 7.85 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.72 (s, 1H, Н-винил), 7.62 (dd, J = 1.3 & 7.9 Hz, 1 H), 7.42 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 3.03 (s, 6H, N(CH₃)₂), 2.81 (m, 2H, CH₂), 2.55 (m, 2H, CH₂), © 1.73 (m, 4H, 2xCH₂).

MS-EI m/z 379 [M ⁺ ],

Пример 115

4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-1 /-/-пирол-3-карбоксилна киселина ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.56 (br s, 1H, NH), 8.24 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H, Н-винил), 7.74 (d, J = 2.96 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 1.5 & 8.1 Hz, 1H), 7.20 (br m, 1H, NHCH₃), 7.03 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 2.57 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 361 [M ⁺ ],

Пример 116 {[4-метил-5-(4-метил-5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-ил иден метил)-1 /-/-пирол-3-карбонил]амино}-оцетна киселина етилов естер

4-метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер (D.O. Cheng, T.L. Bowman & Е. LeGoff; J. Heterocyclic Chem.; 1976; 13; 1145-1147) се формилира като се използва метод А, хидролизира се по метод В и следва амидиране (метод С), като се получава [(5-формил-4-метил-1 Н-пирол-3-карбонил)амино]оцетна киселина етилов естер.

- 197 -

····

4-метил-5-метиламиносулфонил-2-оксиндол (50 mmol) се кондензира с [(5-формил-4-метил-1 Н-пирол-З-карбонил)-амино]оцетна киселина етилов естер (100 mg, 0.42 mmol) и пиперидин (0.1 mL) в етанол (2 mL), като се получават 50 mg (52%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (s, 1 Η, NH), 11.29 (v.br. s,

1H, NH-CO), 8.33 (t, J = 5.8 Hz, 1H, CONHCH₂), 7.83 (d, J = 3.11

Hz, 1H), 7.80 (s, 1H, Н-винил), 7.71 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.34 (br m, 1H, NHCH₃), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.11 (q, J = 7.1 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3.92 (d, J = 5.8 Hz, 2H, GlyCH₂), 2.86 (s, 3H, CH₃), 2.48 © (s, 3H, CH₃), 2.42 (d, J = 4.71 Hz, 3H,' HNCH₃), 1.20 (t, J = 7.1 Hz,

3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 460 [M ⁺ ],

Пример 117

-Н4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидро-индол-З ил иденметил)-1 Н-пирол-3-карбонил~|амино}-оцетна киселина етилов естер

Смес от 5-метиламиносулфонил-2-оксиндол (0.06 д, 0.22 mmol), [(5-формил-4-метил-1 Н-пирол-3-карбонил)-амино]оцетна киселина етилов естер (0.075 д, 0.27 mmol) и пиперидин (2 капки) в етанол (5 mL) се нагрява в затворена тръба при 90°С в продължение на 12 часа. След охлаждане, утайката се събира чрез вакуум-филтруване, промива се с етанол, обработва се с дихлорометан/етер и се получават 0.035 g (36%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на жълтеникаво-кафяво твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.6 (s, 1H, NH), 11 (v.br. s, 1H, NH-CO), 8.30 (t, J = 5.7 Hz, 1H, CONHCH₂), 8.25 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H, Н-винил), 7.84 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 1.9 & 8.5 Hz, 1H), 7.14 (br m, 1H, NHCH₃), 7.04 (d, J = 8.5 Hz, ··’ • · ·

5*7 Hz, 2Н,

J = 6.7 Hz, a * * · ·*·· • · aa J · a

- 198 - ·’ :: : · · : ·..

*· ··

1H), 4.11 (q, J = 6.7 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 3.92 (d, J = GlyCH₂), 2.55 (s, 3H, CH₃), 2.41 (m, 3H, NCH₃), 1.20 (t, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 446 [M ⁺ ],

Пример 118 {[4-метил-5-(5-метилсулфамоил-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-1 /7-пирол-3-карбонил1амино}-оцетна киселина

Смес от [(5-формил-4-метил-1 Н-пирол-3-карбонил)-амино]оцетна киселина етилов естер (0.142 д, 0.59 mmol) и 1 N NaOH (1.2 mL) в метанол (10 mL) се разбърква при стайна температура 1 час. Реакционната смес се концентрира и остатъкът се кондензира с 5-метиламиносулфонил-2-оксиндол (0.13 д, 0.48 mmol) и пиперидин (0.12 mL) в етанол (12 mL), като се получават 0.11 g (52%) от съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.98 (br s, 1H, NH), 8.17 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.75 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 7.51 (dd, J = 2 & 8.2 Hz, 1H), 7.21 (m on br s, 2H), 6.97 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.41 (d, J = 4.2 Hz, 2H, C/7₂NH), 2.54 (s, ЗН, пирол-СН₃), 2.39 (s, 3H, ArCH₃).

MS-EI m/z 417 [M-1] ⁺ .

Пример 120

5-метил-2-(2-оксо-1,2-дихидро-индол-З-ил иденметил)-1 Н-пирол3-карбоксилна киселина ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.77 (br s, 1H, NH), 12.49 (s, 1H, COOH), 11.07 (s, 1H, NH), 8.39 (s, 1H, Н-винил), 7.43 (d, J = 7.47 Hz, 1H), 7.20 (t, J = 7.47 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 7.47 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.47 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H, CH₃).

MS-EI m/z 269 [M + 1] ⁺ .

Пример 121

5-метил-2-(2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-1 /7-пирол

3-карбоксилна киселина етилов естер *··· ¹ЯМР (300

··

NH), 8.31 (s, 1H, Н-винил), 7.45 (d, J = 7.52 Hz, 1H), 7.20 (t, J =

7.52 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 7.52 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.52 Hz, 1H),

6.50 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.33 (s, 3H, C/7₃), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 297.1 [M + 1] ⁺ .

Пример 122

2-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-5-метил1/7-пирол-З-карбоксилна киселина етилов естер ¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.72 (s, 1H, NH), 11.16 (s, 1H, NH), 8.29 (s, 1H, Н-винил), 7.53 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.35 (dd,.J = 2.0 & 8.05 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 8.05 Hz, 1H), 6.53 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 7.03 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.35 (s, 3H, C/7₃), 1.33 (t,

J = 7.03 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

MS-EI m/z 375 & 377 [M + H] ⁺ .

Пример 123

2-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-5-метил1/7-пирол-З-карбоксилна киселина ¹ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.72 (s, 1 Η, NH), 12.57 (s, 1H, ф COOH), 11.19 (s, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, Н-винил), 7.51 (d, J = 1.4

Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 1.4 & 8.17 Hz, 1H), 6.87 (t, J = 8.17 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 2.35 (s, 3H, C/7₃).

MS-EI m/z 347 & 349 [M + H] ⁺ .

Пример 124

2-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-5-метил1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид

Към разтвор на 2-формил-5-метил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (250 mg, 1.63 mmol) в диметилформамид (3 mL) се добавят 1-етил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (376 mg, 1.2 екв.), 1-хидроксибензотриазол (265 mg, 1.2 екв.), три: *:·.’.*· ·”.···: .· .

200 : _;.: : ·. : . ···:·;· ···.

·· *. *_tt* · етиламин (0.45 mL, 2екв.) и 1 -(2-аминоетил)пиролидин (0.23 mL, 1.1 екв.). След разбъркване при стайна температура една нощ, реакционната смес се разрежда с наситен натриев бикарбонат и солна луга (с излишък от сол) и се екстрахира с 10% метанол в дихлорометан. Събраните органични слоеве се промиват със солна луга, сушат се над безводен натриев сулфат и се концентрират, като се получават 130 mg 2-формил-5-метил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид.

Смес от 5-бромо-2-оксиндол (106 mg, 0.5 mmol), 2-формил-

5-метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (125 mg, 1 екв.) се нагрява в затворена тръба при 80°С в продължение на 1 час, след което се охлажда. Образувалата се утайка се събира чрез вакуум-филтруване, промива се c етанол и етилацетат, суши се и се получава съедине нието, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (s, 1 Η, NH), 11.06 (br s, 1H, NH), 8.56 (s, 1H, Н-винил), 8.15 (m, 1H, CONHCH₂), 7.48 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 1.8 & 7.9 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 7.9 Hz, © 1H), 6.60 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 3.35 (m, 2H, HNCH₂CH₂), 2.56 (t, J =

6.91 Hz, 2H, HNCH₂CH₂), 2.35 (s, 3H, CH₃), 1.67 (m, 4H, 2xCH₂).

MS m/z 443/445 [M⁺ и М ⁺ +2].

Пример 125

2-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-5-метил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

Към разтвор на 2-формил-5-метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (320 mg, 2.1 mmol) в диметилформамид (3 mL) се добавят 1 -етил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (483 mg, 1.2 екв.), 1-хидроксибензотриазол (340 mg, 1.2 екв.), триетиламин (0.59 mL, 2 екв.) и Ν,Ν-диетилетилендиамин (0.32 mL,

- 201 ;**·’*** ·**.···· · · : ; : ·..: ·: ·

1.1 екв.). След разбъркване при стайна температура една*нощ, реакционната смес се разрежда с наситен натриев бикарбонат и солна луга (с излишък от сол) и се екстрахира с 10% метанол в дихлорометан. Събраните органични слоеве се промиват със солна луга, сушат се над безводен натриев сулфат и се концентрират, като се получава 2-формил-5-метил-1 Н-пирол-3карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид.

5-метил-1/-/-пирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (126 mg, 1 екв.) и пиперидин (0.2 mL) в етанол (2 mL) се нагрява в затворена тръба при 80°С в продължение на 1 час, след което се охлажда. Образувалата се утайка се събира чрез вакуум-филтруване, промива се с етанол и етилацетат, суши се и се получава съединението, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (s, 1 Η, NH), 11.11 (br s, 1H, NH), 8.54 (s, 1H, Н-винил), 8.1 (m, 1H, CONHCH₂), 7.49 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.31 (dd, J = 2.2 & 8.3 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 2.24 Hz, 1H), 3.31 (m, 2H, HNCH₂CH₂), 2.59 (m, Q 6H, 3xCH₂), 2.36 (s, 3H, CH₃), 0.99 (t, J - 6.8 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS m/z 445/447 [M⁺ и М ⁺ + 2].

Пр имер 126

2,2-диметил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

Смес от 1,3-дихидро-индол-2-он (266 mg, 2 mmol), 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид (530 mg, 2 mmol) и пиперидин (1 капка) в етанол се нагрява при 90°С в продължение на 2 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура, образувалата се утайка се събира чрез вакуум-филтруване, промива се с ета- 202 - • ·

нол и се суши, като се получават 422 mg (55%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на светложълто твърдо вещество.

¹ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.7 (s, 1 Η, NH), 10.9 (s, 1H, NH), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H, Н-винил), 7.41 (t, J =

5.4 Hz, 1H, NH), 7.13 (dt, J = 1.2 & 7.6 Hz, 1H), 6.99 (dt, J = 1.2 & 7.6 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.28 (m, 2H), 2.48-2.55 (m, 6H), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS + ve APCI 381 [M⁺ + 1].

Пример 127

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)амид

Смес от 5-хлоро-1,3-дихидро-индол-2-он 3356 mg, 2 mmol), 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2диетиламиноетил)амид (530 mg, 2 mmol) и пиперидин (1 капка) в етанол се нагрява при 90°С в продължение на 2 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура, образувалата се утайка се събира чрез вакуум-филтруване, промива се с етанол и се суши, като се получават 565 mg (68%) от съединението, посочено в заглавието, във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.65 (s, 1 Η, NH), 11.0 (s, 1H,

NH), 7.98 (d, J = 2.1 Hz, 1 H), 7.77 (s, 1H, Н-винил), 7.44 (t, NH),

7.13 (dd, J = 2.1 & 8.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.28 (g,

2H), 2.48-2.53 (m, 6H), 2.44 (s, 3H, CH₃), 2.43 (s, 3H, CH₃), 0.97 (t,

J = 7.0 Hz, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS + ve APCI 415 [M⁺ + 1].

··♦·

203 ·..··..· ·· :. : · ·· ·· ·..· :

Пример 128

2,4-диметил-5-(2-оксо-1,2-дихидооиндол-3-илиденметил)-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-етил)амид

1,3-дихидроиндол-2-он се кондензира с 5-формил-2,4-ди- метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-илетил)амид, като се получава съединението, посочено в заглавието.

MS + ve APCI 379 [М⁺ + 1].

Пр имер 129

5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроин дол-3-и ли ден метил )-2,4-д и метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-етил)амид

5-флуоро-1,3-дихидроиндол-2-он се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -ил-етил)амид, като се получава съединението, посочено в заглавието.

MS + ve APCI 397 [М⁺ + 1].

Допълващ метод:

5-формил-2,4-ди метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (61 д), 5-флуоро-1,3-дихидроиндол-2-он (79 д), етанол (300 mL) и пиролидин (32 mL) се нагряват при температурата на кипене

4.5 часа. Към сместа се добавя оцетна киселина (24 mL) и нагряването продължава още 30 минути. Сместа се охлажда до стайна температура и твърдите вещества се събират чрез вакуум-филтруване и се промиват двукратно с етанол. Твърдите вещества се разбъркват 130 минути в 40% ацетон във вода (400 mL), съдържаща 12 N солна киселина (6.5 mL). Твърдите вещества се събират чрез вакуум-филтруване и се промиват дву• · ·· • ·

кратно с 40% ацетон във вода. Твърдите вещества се сушат под вакуум и се получава 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (86 д, 79% добив) във вид на оранжево твърдо вещество.

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-с!₆) δ 2.48, 2.50 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 6.80, 6.88, 7.68, 7.72 (4xm, 4Н, ароматен или винил), 10.88 (s, 1 Н, CONH), 12.12 (s, 1Н, СООН), 13.82 (s, 1 Н, пиролен NH). MS m/z 299 [М-1].

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна'киселина (100 д) и диметилформамид (500 mL) се разбъркват и се добавят бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфониев хексафлуорофосфат (221 д), 1 -(2-аминоетил)пиролидин (45.6 д) и триетиламин (93 mL). Сместа се разбърква 2 часа при стайна температура. Твърдият продукт се събира чрез вакуумно филтруване и се промива с етанол. Твърдите вещества се промиват в суспензия, като се разбъркват с етанол (500 mL) при 64°С 1 час и се охлаждат до стайна температура. Твърдите вещества се събират чрез вакуумно филтруване, промиват се с етанол и се сушат под вакуум, като се получава 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1 -илетил)амид (101.5 д, 77% добив).

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-de) δ 1.60 (m, 4Н, 2хСН₂), 2.40, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.50 (m, 6Н, 2хСН₂), 2.57, 3.35 (2хт, 4Н, 2хСН₂), 7.53, 7.70, 7.73, 7.76 (4хт, 4Н, ароматен и винил), 10.88 (s, 1Н, CONH), 13.67 (s, 1Н, пиролен NH). MS m/z 396 [М + 1].

- 205 -

Пример 130

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пиролидин-1-етил)ам ид

5-хлоро-1,3-дихидроиндол-2-он се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-пироли дин-1-ил-етил)амид, като се получава съединението, посочено в заглавието.

MS + ve APCI 413 [М⁺ + 1].

Пример 131

2,4-диметил-5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид

1,3-дихидроиндол-2-он се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид, като се получава съединението, посочено в заглавието.

¹ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.63 (s, 1 Η, N/7), 10.9 (s, 1H, NW), 7.78 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H, Н-винил), 7.48 (t, 1H, NH), 7.13 (dt, 1H), 6.98 (dt, 1H), 6.88 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.31 (q, J Q = 6.6 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 3H, CH₃), 2.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS + ve APCI 353 [M⁺ + 1].

Пример 132

5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил) амид

5-флуоро-1,3-дихидроиндол-2-он се кондензира с 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диметиламиноетил)амид, като се получава съединението, посочено в заглавието.

····

- 206 - ·.*·..· ·..·· :·: :··’· ¹ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.68 (s, 1H, NH), 10.9 (s, 1H, NH), 7.76 (dd, J = 2.4 & 9.4 Hz, 1H), 7.71 (s, 1H, Н-винил), 7.51 (t, 1H, NH), 6.93 (m, 1H), 6.84 (dd, J = 4.6 & 8.4 Hz, 1H), 3.31 (q, J =

6.6 Hz, 2H), 2.43 (s, 3H, CH₃), 2.41 (s, 3H, CH₃), 2.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.19 (s, 6H, N(CH₂CH₃)₂).

MS + ve APCI 371 [M⁺ + 1].

Пример 193

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-етиламино-етил) амид

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол^:3-карбоксилна киселина (2-етиламино-етил)-амид (99 д), етанол (400 mL), 5-флуоро-2оксиндол (32 д) и пиролидин (1.5 д) се нагряват при температурата на кипене, с разбъркване, 3 часа. Сместа се охлажда до стайна температура и твърдите вещества се събират чрез вакуумфилтруване. Твърдите вещества се разбъркват в етанол при 60°С, охлаждат се до стайна температура и се събират чрез вакуумфилтруване. Продуктът се суши под вакуум и се получава 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-етиламино-етил)-амид (75 д, 95% добив).

¹Н ЯМР (диметилсулфоксид-de) δ 1.03 (t, ЗН, СН₃), 2.42, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.56 (q, 2Н, СН₂), 2.70, 3.30 (2xt, 4Н, 2хСН₂), 6.85, 6.92, 7.58, 7.72, 7.76 (5xm, 5Н, ароматен, винил и CONH), 10.90 (br s, 1 Н, CONH), 13.65 (br s, 1 Н, пиролен NH). MS m/z 369 [М-1].

Пример 195

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил1-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетил-Н-оксоамино-етил)-амид ····

- 207 -

Метод A:

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламиноетил)-амид (598 mg) и дихлорометан (60 mL) се обработват на ледена баня с 3-хлоропербензоена киселина (336 mg) и сместа се разбърква при стайна температура една нощ. Добавя се вода, съдържаща натриев хидроксид (240 mg) и сместа се разбърква 1 час. Утайката се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с 5 mL вода и се суши под вакуум, като се получава 5[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетил-М-оксоамино-етил)-амид (510 mg, 82% добив), във вид на оранжево твърдо вещество.

¹ЯМР (DMSO-d6) δ 13.72 (br s, 1H, NH), 11.02 (br s, 1H, CONH), 9.81 (br s, 1H, CONH), 7.75 (dd, 1H, ароматен), 7.70 (s, 1H, ароматен), 6.93 (td, 1H, ароматен), 6.84 (m, 1H, ароматен), 3.63 (m, 2H, CH₂), 3.29 (m, 2H, CH₂), 3.14 (m, 4H, 2xCH₂), 2.47 (s, 3H, CH₃), 2.45 (s, 3H, CH₃), 1.64 (t, 6H, 2xCH₃).

MS m/z 415 [М + 1].

Метод B:

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-етиламино-етил)-амид (10 g) се суспендира в дихлорометан (100 mL) и се охлажда на ледена баня. Добавя се 3хлоропероксибензоена киселина (13.1 д) при разбъркване и сместа се оставя да се затопли до стайна температура, след което се разбърква една нощ. СМеста се изпарява ротационно до сухо и се хроматографира върху колона от силикагел, елуиране с 20 % метанол в дихлорометан. фракции, съдържащи продукт, се събират и се изпаряват ротационно до сухо, като се получава 5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-3• · ··

208 ·..··..· :··:· • · » карбоксилна киселина (2-диетил-М-оксоамино-етил)-амид (9 д,

83% добив).

5-формил-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетил-М-оксоамино-етил)-амид (9 д), 5-флуоро-1,3-дихидроиндол-2-он (9 д, 83% добив) и пиролидин (9 д, 83% добив) (0.1

д) се нагряват при температурата на кипене в етанол (300 mL) часа. Сместа се охлажда на ледена баня и утайката се събира чрез вакуумфилтруване, промива се с етанол. Твърдите

вещества се разбъркват в етилацетат (30 mL), събират се чрез вакуумфилтруване, промиват се с етилацетат и се сушат под вакуум, като се получава 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна ки селина (2-диетил-М-оксоамино-етил)-амид (10.3 д, 80% добив), във вид на оранжево твърдо вещество.

MS m/z 415 [М + 1].

Пример 190

5-Г5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил1-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)етил1-амид

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-ил иденметил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (120 mg, 0.4 mmol) се разклаща с EDC, HCI (96 mg, 0.5 mmol), безводен 1хидрокси-бензтриазол (68 mg, 0.5 mmol) и 2-(2-аминоетилпиридин, продукт на Aldrich, в безводен ДМф (3 mL) в продължение на 2-3 дни при стайна температура. Реакционната смес

209 ’ . :··:· ·· · се разрежда с 1М натриев бикарбонат (1.5 mL), след това с 8 mL вода. Утаеният суров продукт се събира чрез филтруване, промива се с вода, суши се и се пречиства чрез кристализация или хроматография, като се получава 5-[5-флуоро-2-оксо1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)-етил]амид.

Пример 189

5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)етил]-амид

Като се работи, както е показано в предходния пример, но се замести 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (127 mg), се получава 5[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)-етил] амид.

Пример 192

5-[5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-ил иденметилТ^Л-диметил-Т Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)етил1амид

Като се работи, както е показано в пример 190, но се замести 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(Зг)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5-[5-бромо-2оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (145 mg), се получава 5-[5бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)-етил]амид.

• · ·

- 21 Ο -

• · • в _а

Пример 191

5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил1-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)етил1амид

Като се работи, както е показано в пример 190, по-горе, но се замести 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5[2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (113 mg), се получава 5-[2-оксо1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)-етил]-амид.

Пример 203

5-[5-циано-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1-ил)етил]амид

Като се работи, както е показано в пример 190, по-горе, но се замести 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5[5-циано-2-оксо-1,2-дихидро-ин дол-(3Z)-или ден метил ]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (123 mg), се получава 5[5-циано-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(ЗИ)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(пиридин-1 -ил)-етил]амид

Примери 142, 186, 187, 188 и 204

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 1-(2аминоетил)пиролидин, продаван от Aldrich Chemical Company, Inc., се получават желаните съединения.

Примери 143-147

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 1-(2····

аминоетил)имидазолин-2-он (получен чрез нагряване на диметилкарбонат с бис(2-аминоетил)амин (2 еквивалента), в затворена колба, до 150°С в продължение на 30 минути, следвано от процедурата, описана в патент на САЩ № 2613212 (1950) на името на Rohm & Haas Co. Суровият продукт се пречиства върху силициев диоксид, като се използва като елуент смес хлороформ-метанол-воден разтвор на амоняк 80:25:2), се получават желаните съединения.

Примери 148-151 и 184

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 4-(2аминоетил)пиперазин-1-оцетна киселина етилов естер (получен както следва: пиперазин-1-оцетна киселина етилов естер (11.22 д) се обработва с йодоацетонитрил (5.0 mL) в присъствието на калиев карбонат (6.9 д) в етилацетат (260 mL) при 0°С. След като завърши добавянето на йодоацетонитрила (45 минути), реакционната смесе се разбърква при стайна температура 11 часа. Реакционната смес се филтрува и филтратите се изпаряват. Остатъкът се хидрогенира в присъствието на кобалтов борид (получен от СоС1₂ и натриев борохидрид) при стайна температура при налягане 50 psi 2 дни в етанол. След филтруване, изпаряване и хроматографиране с използване като елуент на смес хлороформ-метанол-воден разтвор на амоняк 80:25:2, се получава желаният амин (3.306 д) във вид на бледожълто масло) и се получават желаните съединения.

Пр имери 152-153

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 2-[(2аминоетиламино)]ацетонитрил (получен както следва: разтвор на йодоацетонитрил (50 mmol) в етилов алкохол (80 mL) се

- 212 добавя към разтвор на етилендиамин (150 mL) в етилов алкохол (60 mL) при 0°С в продължение на 30 минути. Разбъркването продължава още 1 час при 0°С, след това при стайна температура още 14 часа. Добавят се 55 mmol калиев карбонат, разбърква се 30 минути, филтрува се и филтратът се концентрира при стайна температура. Остатъкът се пречиства върху силициев диоксид, елуент смес хлороформ-метанолводен разтвор на амоняк 80:15:1.5 и се получава 2-[(2-аминоетиламино)ацетонитрил] (3.550 д), който се използва веднага) и се получават желаните съединения.

Примери 154-158

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 1-(3аминопропил)-азепин-2-он (получен съгласно метода на Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14, c изключение на това, че хидролизата на DBU става при 145°С, в присъствието на литиев хидроксид (1 час, 5 mL DBU, 2 mL вода, 420 mg литиев хидроксид хидрат). След пречистване на суровия про-

дукт върху силициев диоксид с използване на елуент - смес хлороформ:метанол:разтвор на амоняк 80:40:4, се получава 1(3-аминопропил)азепин-2-он (4.973 д, 87% добив)) и се получават желаните съединения.

Пр имери 133-135 и 200

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с N-ацетилетилендиамин, (получен чрез загряване на смес от етилацетат и етилендиамин (1.5 еквивалента) до 160°С в продължение на 1 час в затворен съд. Вакуумната дестилация дава желания продукт с добив 56%. N-ацетилетилендиаминът може да • ·*· ·· · се достави и от Aldrich) при което се получават желаните съе динения.

Примери 146-140

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 1-(3аминопропил)-тетрахидро-пиримидин-2-он (получен по същия начин, както 1 -(3-аминопропил)азепин-2-она, съгласно метода на Kraft A.: J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 6, 1999, 705-14; накратко: 1,3,4,6,7,8-хексахидро-2Н-пиримидо[1,2-а]пиримидин (4.939 g), литиев хидроксид хидрат (918 mg) и 2 mL вода се нагряват без разтворител в затворен съд до 145°С в продължение на 1 час. Суровият продукт се пречиства върху колона от силициев диоксид в хлороформ:метанол:разтвор на амоняк 80:40:4 и се получава чист амин (5.265 д, 94% добив.

Примери 141, 160-162 и 185

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 1-(2аминоетил)-пиперазин-2-он (получен както следва: чист трет.бутилдифенилсилилхлорид (25 mL, 97.7 mmol) се накапва в разтвор на DBU (19.5 mL, 130 mmol) и бис(2-аминоетил)амин (4.32 mL, 40 mmol) в безводен диметилацетамидетат (80 mL) при стайна температура при охлаждане на водна баня за 5 минути. Сместа се разбърква 5 часа. Добавя се чист етилов естер на бромооцетна киселина (6.70 mL, 60 mmol) след охлаждане до стайна температура. Реакционната смес се разбърква 25 минути, след което се изпарява при висок вакуум. Остатъкът се разтваря в метанол (200 mL), добавят се КНСО₃ (10 д) и KF (12 д, 200 mmol) и сместа се разбърква при 60°С 5 часа. Добавят се 10 д натриев карбонат, разбъркват се 10 минути, охлажда се и се филтрува. филтратите се изпаряват. Остатъкът се екс- 214 • ·

трахира с хексани (2 пъти по 250 mL). Неразтворимият в хексан материал се разтваря в етанол (60 mL), филтрува се и се изпарява. Остатъкът се пречиства върху колона от силициев диоксид в хлороформ-метанол-разтвор на амоняк 80:40:4, като се получава чист амин (4.245 д, 74% добив)) и се получават желаните съединения.

Примери 163-167

Работи се, както е показано в примери 190, 189, 191, 192 и 203, по-горе, но се замества 2-(2-аминоетил)пиридин с 3-[(2аминоетил)амино]пропионитрил (получен от етилендиамин (150 mmol) и акрилонитрил (50 mmol) в тетрахидрофуран при стайна температура, както е описано в Israel, М. et al.: J. Med. Chem. 7, 1964, 710-16, при което се получава желаният амин (4.294 д)) и се получават желаните съединения.

Пр имер 168

5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихид рои н дол-3-и ли ден метил)-2,4-д и метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(4-метилпиперазин-1 ил)-етил!-амид

Към мътна жълта смес от 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-ил иден метил ]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (90 mg), ДМФ (0.8 mL) и TEA (0.084 mL) в 20 mL реакционна тръба се добавя, при разбъркване, реагент ВОР (199 mg). Сместа се избистря за 5 минути. Добавя се 2-(4-метилпиперазин-1-ил)етиламин¹ (51 mg) към бистрата смес. Полученият разтвор се разбърква при стайна температура една нощ. От реакционната система се утаяват жълти твърди продукти. Тънкослойна хроматография (10% метанол в метиленхлорид) показва, че цялото количество изходен продукт се е превърнало в продукта. Твърдото вещество се изолира чрез вакуумфилтруване и се промива веднъж с етанол (1 mL). Твър• ·♦·

-215дото вещество се обработва с ултразвук в диетилетер (2 mL) в продължение на 20 минути и се събира чрез вакуумфилтруване. След сушене под вакуум се получава 5-(5-флуоро

2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пиролЗ-карбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1-ил-етил)-амид (79 mg, 62% добив).

¹ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.13 (s, ЗН, СН₃), 2.40, 2.42 (2xs, 6Н, 2х

СН₃), 2.41 (m, 2Н, СН₂), 2.47 (т, 8Н, 4хСН₂), 3.30 (т, 2Н, СН₂), 6.82 (dd, J = 4.5 & 8.7 Hz, 1 Η), 6.91 (td, ²J = 2.4, ³J = 8.8 Hz, 1H), 7.43 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.75 (dd, J = 2.8, 9.6 Hz, 1H, (ароматен и винил), 10.88 (s, 1 H, CONH), 13.67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424.4 [М-1].

Пример 169

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1-илетил)-амид

Като се следва процедурата в Пример 168, по-горе, но се замести 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(3/)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (95 mg, 0.3 mmol), се получава 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1 -илетил)-амид (76 mg, 58% добив).

’ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.13 (S, ЗН, СН₃), 2.41, 2.42 (2xs, 6Н, 2х СН₃), 2.42 (m, 2Н, СН₂), 2.48 (т, 8Н, 4хСН₂), 3.30 (т, 2Н, СН₂), 6.84 (d, J = 8.0 Hz, 1 Η), 7.11 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.44 (t, J =

5.6 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H, (ароматен и винил), 10.98 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440.2 [M-1 ].

·· ····

-216Пример 170

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1-илетил)-амид

Като се следва процедурата, описана в Пример 168, погоре, но се замести 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина с 5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина се получава 5-(5-бромо-

2- оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-

3- карбоксилна киселина (4-метил’пиперазин-1-ил-етил)-амид (39 mg, 54% добив) от SU01 1670 (54 mg, 0.15 mmol).

¹ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.14 (s, ЗН, CH₃), 2.41, 2.42 (2xs, 6Н, 2х СН₃), 2.42 (m, 2Н, СН₂), 2.48 (т, 8Н, 4хСН₂), 3.31 (т, 2Н, СН₂), 6.80 (d, J = 8.0 Hz, 1Н), 7.23 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.44 (t, J =

5.6 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J = 2.0 Hz, 1H, (ароматен и винил), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z)

486.6 (M).

Пример 172

5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Hпирол-3-карбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1 -ил)-етил) амид

Като се следва процедурата, описана в Пример 168, погоре, но се замести 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина SU014900 с 5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина се получава 5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (4-метилпиперазин-1-ил-етил)-амид (112.8 mg, 0.4 mmol).

• ···

’ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.13 (s, ЗН, СН₃), 2.39, 2.42 (2xs, 6Н, 2х СН₃), 2.42 (m, 2Н, СН₂), 2.48 (т, 8Н, 4хСН₂), 3.30 (t, 2Н, СН₂), 6.86 (d, J = 8.0 Hz, 1 Η), 6.96 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.96 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.76 (d, J = 7.6 Hz, 1H) (ароматен и винил), 10.88 (s, 1 H, CONH), 13.61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406.6 (M-1).

Пример 171

5-[2-оксо-1,2-дихидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4-диметил-1 Hпирол-3-карбоксилна киселина [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]амид

Към мътна жълта смес от 5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол(3/)-илиденметил]-2,4-диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (112.8 mg, 0.4 mmol), ДМФ (0.5 mL) и триетиламин (0.111 mL) в 20 mL реакционна тръба, при разбъркване, се добавя реагент ВОР (265 mg). Сместа се избистря за 5 минути. Добавя се 2-(2,6-диметилпиперазин-1 -ил)етиламин (68.6 mg) (виж, Tapia, L. Alonco-Cires, Р. Lopez-Tudanca, R. Mocquera, L. Labeaga, A. Innerarity, A. Orjales, J, Med. Chem., 1 999, 42, 28702880) към бистрата смес. Полученият разтвор се разбърква при стайна температура една нощ. Тънкослойна хроматография (10% метанол в метиленхлорид) показва, че цялото количество изходен продукт се е превърнало в продукта. Реакционната смес се изпарява до сухо и след това се подлага на флашхроматография (CH₂CI₂/CН₃ОН = 20/1 -15/1), следвана от прекристализация, като се получава 5-[2-оксо-1,2-дихид рои н дол-(3Z)-и ли ден метил ]-2,4-д и мети л-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]амид (83 mg, 50% добив).

’ЯМР (DMSO-d₆) δ 1.15, 1.16 (2xs, 6Н, 2х СН₃), 1.95 (t, J =

11.6 Hz, 2Н, СН₂), 2.41, 2.47 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.50 (m, 2Н, СН₂), ·· ····

218 ···*..· :··:· ·· ·

3.03 (d, J = 10 Hz, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.30 (m, 2H, CH₂), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 1H) (ароматен и винил), 10.88 (s, 1 H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LCMS (m/z) 422.2 (M + 1).

Пример 173

5-[5-флуоро-2-оксо-1, 2-дихид рои н дол-(3Z)-и ли ден метил 1-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(3,5-диметилпиперазин-1-ил)етил]амид

Като се следва процедурата, описана в Пример 168, погоре, се получава желаното съединение (60 mg, 0.2 mmol).

¹ЯМР (DMSO-d₆) δ 0.891, 0.907 (2xs, 6H, 2x CH₃), 1.49 (t, J = 10.4 Hz, 2H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2.41 (m, 2H, CH₂), 2.74 (m, 4H), 3.30 (m, 2H, CH₂), 6.82 (dd, J = 4.5 & 8.7 Hz, 1H), 6.90 (td, ²J = 2.4, ³J = 8.4 Hz, 1H), 7.42 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.74 (dd, J = 4.6, 8.4 Hz, 1H) (ароматен и винил), 10.88 (s, 1 H, CONH), 13.65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438.4 [M-1]..

Пример 174

5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихид рои н дол-(3Z)-и ли ден метил 1-2,4-д и метил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил) етил 1 амид

Като се следва процедурата, описана в Пример 171, погоре, се получава желаното съединение (31.2 mg, 34%) от 5-[5хлоро-2-оксо-1,2-дихид роин дол- (3Z)-и ли ден метил ]-2,4-д и метил 1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (63 mg, 0.2 mmol).

¹ЯМР (DMSO-d₆) δ 1.15, 1.16 (2xs, 6H, 2x CH₃), 1.95 (t, J =

11.6 Hz, 2H, CH₂), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2.50 (m, 2H, CH₂), 3.03 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.30 (m, 2H, CH₂), 6.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 5.6 Hz,

- 219 -

1Н), 7.76 (s, 1 Η), 7.97 (d, J = 2.0 Hz,

10.99 (s, 1H, CONH), 13.63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456.2 (M + 1).

Пример 175

5-[5-б ром 0-2-0 кс 0-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]-2,4-ди метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-(3,5-диметилпиперазин-1 -ил)етил]амид

Като се следва процедурата, описана в Пример 171, погоре, се получава желаното съединение (40 mg, 40%) от 5-[5бромо-2-оксо-1,2-дихидро и н дол-(3Z)-и ли ден метил]-2,4-д и мети л1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (74 mg, 0.2 mmol).

¹ЯМР (DMSO-d₆) δ 1.15, 1.16 (2'xs, 6H, 2x CH₃), 1.95 (t, J =

11.6 Hz, 2H, CH₂), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2.50 (m, 2H, CH₂), 3.03 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.30 (m, 2H, CH₂), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 5.6 Hz,

1H), 7.76 (s, 1H), 8л10 (d, J = 2.0 Hz, 1H) (ароматен и винил),

10.99 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498.4 (M-1).

Пример 205 (32)-3-[(3,5-диметил-1 Н-пирол-2-ил)-метил иден!-1 - [1 -(4-метилпиперазин)метил]-1,3-дихидро-2Н-индол-2-он

Добавя се N-метилпиперазин (10 д, 100 mmol) към разбъркван разтвор на воден формалдехид (10 g от 38%-ен разтвор, 100 mmol) и 3-(3,5-диметил-1 Н-пирол-2-илметилиден)1,3-дихидро-индол-2-он (2.38 д, 10 mmol) в метанол (100 mL). Разтворът се нагрява при 60°С 1 час, концентрира се до малък обем и утайката се отфилтрува, промива се с метанол и се суши, като се получават 2.38 g от съединението, посочено в заглавието, т.т. 1 60-164°С.

ВЕТХ Rt 4.72 min. ¹ЯМР (CDCI₃) δ 2.26 (s, ЗН), 2.33 (s, ЗН), 2.38 (s, ЗН), 2.43 br s, 4H), 2.70 (br s, 4H), 4.59 (s, 2H), 5.96 (d, ···· ·· Λ

Η), 7.02-7.08 (m, 2Η), 7.15 (dd, 1H), 7.38 (s, 1 Η), 7.48 (dd, 1 H) и 13.0 (br s, 1H).

Анализирано: Изчислено за C₂₁H₂₆N₄O: С, 71.97; Н, 7.48; N, 15.99. Намерено: С, 71.75; Н, 7.46; N, 15.87.

(37)-3-[(3,5-диметил-1 /7-пирол-2-ил)-метилиден]-1 -[1 -(4-метилпиперазин)метил]-1,3-дихидро-2/7-индол-2-он се превръща в дихидрохлоридна сол.

Пример 206

Синтез на (32)-3-[(3,5-диметил-1/7-пирол-2-ил)-метилиден]-1-(1 чг пиролидинилметил)-1,3-дихидро-2/7-йндол-2-он

Добавя се пиролидин (450 mg, 6.3 mmol) към разбъркван разтвор на воден формалдехид (500 mg от 38%-ен разтвор, 6.0 mmol) и 3-(3,5-диметил-1 /7-пирол-2-илметилиден)-1,3-дихидроиндол-2-он (900 mg, 3.8 mmol) в метанол (50 mL). След 15 минути, разтворът се охлажда до 0°С и утайката се отфилтрува, промива се с вода и се суши, като се получават 1.08 g от съединението, посочено в заглавието, т.т. 129-132°С.

ВЕТХ Rt 4.87 min. ¹ЯМР [(CD₃)₂SO] δ 1.65 (m, 4H), 2.32 (s, ф ЗН), 2.34 (s, ЗН), 2.62 (m, 4Н), 4.72 (s, 2Н), 6.07 (d, 1Н), 7.00 (m,

Η), 7.15 (m, 2Η), 7.61 (s, 1 Η), 7.76 (d, 2Η) и 13.1 (br s, 1Н).

Анализирано: Изчислено за C₂₀H₂₃N₃O: С, 74.74; Н, 7.21; N, 13.07. Намерено: С, 74.61; Н, 7.25; N, 13.03.

Биологични примери

Инхибитори на протеинкиназа с формула (I):

Следващите изпитания могат да се използват за определяне степента на активност и ефекта на съединенията с формула (I) върху една или повече протеинкинази (оттук нататък • to

PKs). Подобни изследвания могат да се проведат аналогично за всяка РК, като се използват известни за целта техники.

А. Опитни процедури.

Някои от описаните тук опити се изпълняват в ELISA (ензимсвързан имуносорбентен сандвич тест) формат (Voller, et al., 1980, “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”, Manual of Clinical Immunology, 2-po изд., Rose and Friedman, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., стр. 359-371). Основната процедура е както следва: съединение с формула (I) се въвежда в клетки, експресиращи опитната киназа, както естествено, така и рекомбинантно, за избран период от време, след който, ако опитната киназа е рецептор, се добавя лиганд, за който е известно, че активира рецептора. Клетките се лизират и лизатът се прехвърля в гнездата на ELISA паничката, предварително покрита със специфично антитяло, разпознаващо субстрата на ензимно фосфорилираната реакция. Несубстратни компоненти на клетъчния лизат се отмиват и степента на фосфорилиране върху субстрата се открива с антитяло, специфично разпознаващо фосфотирозин в сравнение с контролни клетки, които не са в контакт с опитно съединение.

По-долу се дават предпочитаните протоколи за провеждане на ELISA опитите за конкретни PKs. Въпреки това, е подходящо адаптиране на тези протоколи за определяне активността на съединения по отношение на други рецепторни тирозинкинази (RTKs), както и към цитоплазмени тирозинкинази (CTKs) и серинтреонинтирозинкинази (STKs), в рамките на познанията на специалиста в тази област. Други изследвания, описани тук, определят количеството произведена ДНК в отговор на активирането на опитна киназа, което е основна

- 222 -

·· • ♦	·· • φ	·· ····
• ·	• ·	• · ·
• · • ·	• · · • ·	ί · « ; · ·
··	♦ ·	· · · ·· »·

мярка за пролиферативен отговор. Принципната процедура за това изследване е както следва: въвежда се съединението в клетки, експресиращи опитната киназа, както естествено, така и рекомбинантно, за избран период от време, след който, ако опитната киназа е рецептор, се добавя лиганд, за който е известно, че активира рецептора. След инкубиране най-малко една нощ, се добавя реагент за белязане на ДНК, като 5-бромодеоксиуридин (BrdU) или Н³-тимидин. Количеството белязана ДНК се открива или чрез анти-BrdU антитяло, или чрез измерване на радиоактивността и се сравнява с контролни клетки, които нямат контакт с опитно съединение.

GST-FLK-1 БИОАНАЛИЗ

С това изследване се анализира тирозинкиназната активност на GST-Flk1 върху поли(д1и, tyr) пептиди.

Материали и реагенти:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички (Corning Каталожен № 5805-96).

2. поли(д1и, tyr) 4:1, лиофилизат (Sigma Каталожен N2 Р0275).

3. Получаване на покрити с поли(д!и, tyr) (pEY) опитни панички: Покритие 2 ид/гнездо от поли(д1и, tyr) (pEY) в 100 ul PBS, се държи при стайна температура 2 часа или при 4°С една нощ. Паничките се покриват добре, за да се предотврати изпарение.

4. PBS буфер: за 1 L, смесват се 0.2 g КН₂РО₄, 1.15 g Na₂HPO₄, 0.2 g KCI и 8 g NaCI в приблизително 900 ml dH₂O. Когато всички реагенти се разтворят, pH се довежда до 7.2 с HCI. Общият обем се довежда до 1 L с dH₂O.

5. PBS буфер: към 1 L PBS буфер се добавя 1.0 ml Tween-20.

·* ····

- 223 • · • · · • ····

6. ТВВ-блокиращ буфер: за 1 L се смесват 1.21 g TRIS, 8.77 g NaCI, 1 ml TWEEN-20 в приблизително 900 ml dH₂O. PH ce довежда до 7.2 c HCI. Добавят ce 10 g BSA, разбърква ce до разтваряне. Общият обем се довежда до 1 L с dH₂O. филтрува се, за да се отстрани наситнената маса.

7. 1% BSA в PBS: За да се приготви 1х работен разтвор, се добавят 10 g BSA към приблизително 990 ml PBS буфер, разбърква се до разтваряне. Общият обем се довежда до 1 L с PBS буфер, филтрува се, за да се отстрани наситнената маса.

8. 50 mM Hepes pH 7.5.

9. GST-Flk 1 cd пречистен от st9 рекомбинантна бакулови- русна трансформация (SUGEN, Inc.).

10. 4% ДМСО в dH₂O.

11.10 mM АТР в dH₂O.

2. 40 mM МпС1₂.

13. Буфер за разреждане на киназа (KDB): смесват се 10 ml Hepes (pH 7.5), 1 ml 5 М NaCI, 40 μΙ_ 100 mM натриев ортованад и 0.4 ml 5% BSA в dH₂O с 88.56 ml dH₂O.

14. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-образно дъно, Applied Scientific каталожен № AS-72092.

ЕДТА: смесват се 14.12 g етилендиаминтетраоцетна киселина (ЕДТА) с приблизително 70 ml dH₂O. Добавя се 10 N NaOH до разтваряне на ЕДТА. РН се довежда до 8.0. Общият обем се довежда до 100 ml с dH₂O..

16. 1° буфер за разреждане на антитяло: смесват се 10 ml от 5% BSA в PBS буфер с 89.5 ml TBST.

17. Анти-фосфотирозиново моноклонално антитяло, конюгирано с хрянова пероксидаза (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

18.

- 224 -

2,2’-азинобис (З-етил бе нзтиазол и н-6-сул фонова киселина (ABTS, Moss, каталожен № ABST).

19. 10% SDS.

Процедура:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички се покриват с 2 дд полиЕУ пептид в стерилен PBS , както е описано в етап 3 от “Материали и реагенти”.

2. От гнездата се отстранява несвързаната течност чрез обръщане на паничката. Изплаква се веднъж с TBST. Потупва се паничката върху хартиена салфетка, за да се отстрани излишната течност.

3. Към всяко гнездо се добавят 100 _buL 1% BSA в PBS. Инкубира се с разклащане в продължение на 1 час при стайна температура.

4. Повтаря се етап 2.

5. Намокрят се гнездата с 50 mM HEPES (pH 7.5) (150 μί/гнездо).

6. Разрежда се опитно съединение с dH₂O/4% ДМСО до 4 пъти желаната крайна опитна концентрация в 96гнездовите полипропиленови панички.

7. Добавят се 25 μί от разредено опитно съединение в ELISA паничка. В контролни гнезда се поставят 25 μί от dH₂O/4% ДМСО.

8. Добавят се 25 μί от 40 mM MnCI₂ с 4х АТР (2 μΜ) във всяко гнездо.

9. Добавят се 25 μί 0.5 М ЕДТА към гнездата с отрицателни контроли.

10. Разрежда се GST-Flk1 до 0.005 дд (5 пд)/гнездо с KDB.

11. Добавят се по 50 μί разреден ензим във всяко гнездо.

12. Инкубира се, с разклащане, в продължение на 15 минути при стайна температура.

13. Реакцията се спира чрез добавяне на 50 μΙ_ 250 mM ЕДТА (pH 8.0).

14. Изплаква се Зх с TBST и паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстрани излишната течност.

15. Добавят се 100 μΙ_ на гнездо анти-фосфотирозинов HRP конюгат, 1:5,000 разреждане в буфер за разреждане на антитяло. Инкубира се, с разклащане, 90 минути, при стайна температура.

16. Изплаква се, както в етап 14.

17. Добавят се 100 μι разтвор на ABTS със стайна температура към всяко гнездо.

18. Инкубира се, с разклащане, в продължение на 10-15 минути. Отстраняват се всякакви мехурчета.

19. Реакцията се спира чрез добавяне на 20 μΙ_ от 10% SDS към всяко гнездо.

20. Отчитат се резултати върху Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство с опитен филтър с 410 пМ и сравнителен филтър с 630 nm.

PYK2 БИОАНАЛИЗ

Това изследване се използва за определяне на in vitro киназната активност на НА епитоп с пълна дължина на tag pyk2 (FL.pyk2-HA) в ELISA тест.

Материали и реагенти:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички.

2. 12СА5 моноклонално анти-НА антитяло (SUGEN, Inc.).

3. PBS (фосфатно-буфериран солев разтвор на Dulbecco) (Gibco каталожен № 450-1300ЕВ).

4. TBST буфер: за 1 L се смесват 8.766 g NaCI, 6.057 g TRIS и 1 ml от 0.1% Triton X-100 в приблизително 900 ml dH₂O. pH се довежда до 7.2, обемът до 1 L.

5. Блокиращ буфер: за 1 L се смесват 100 g 10% BSA, 12.1 g 100 mM TRIS, 58.44 g 1М NaCI и 10 ml от 1% TWEEN-20.

6. FL.pyk2-HA от sf9 клетъчни лизати (SUGEN, Inc.).

7. 4% ДМСО в MilliQue Н₂О.

8. 10 mM ATP в dH₂O.

9. 1 M MnCI₂.

10. 1 M MgCI₂.

11. 1 M дитиотреитол (DTT).

12. 10хкиназен буфер за фосфорилиране: смесват се 5.0 ml 1 М Hepes (pH 7.5), 0.2 ml 1 М MnCI₂, 1.0 М MgCI₂, 1.0 ml 10% Triton Х-100 в 2.8 ml dH₂O. Непосредствено преди използването се добавя 0.1 ml 1 М DTT.

13. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с Vобразно дъно.

14. 500 тМ ЕДТА в dH₂O.

15. Буфер за разреждане на антитяло: за 100 ml, 1 ml 5% BSA/PBS и 1 ml 10% Tween-20 в 88 ml TBS.

16. HRP-конюгиран анти-Ptyr PY99, Santa Cruz Biotech каталожен № SC-7020.

17. ABTS, Moss, каталожен № ABST-2000.

18. 10%SDS.

- 227 • to

Процедура:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички се покриват с 0.5 дд на гнездо 12СА5 анти-НА антитяло в 100 μί PBS. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. От гнездата се отстранява несвързано НА антитяло чрез обръщане на паничката. Паничката се изплаква с dH₂O. Паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстрани излишната течност.

3.

Към всяко гнездо се добавят по

150 μι блокиращ бу-

фер. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30 минути при стайна температура.

4. Паничката се изплаква 4х с TBS-T.

5. Разрежда се лизата в PBS (1.5 tig лизат/100 μί PBS).

6.

Във всяко гнездо се добавят по 100 μί разреден лизат.

7.

Изплаква, както в етап 4.

8. Към ELISA паничка, съдържаща захванат рук2-НА, се добавят 50 μί 2х киназен буфер.

9. Във всяко гнездо се добавят по 25 μι 400 μΜ опитно съединение в 4% ДМСО. За контролни гнезда се използва само 4% ДМСО.

10. Добавят се 25 μί от 0.5 М ЕДТА към отрицателни контролни гнезда.

11. Във всички гнезда се добавят по 25 μι от 20 μΜ ATP. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 10 минути.

12. Реакцията се спира чрез добавяне на 25 μί 500 mM ЕДТА (pH 8.0) във всички гнезда.

13. Изплаква се, както в етап 4.

14. Във всяко гнездо се добавят по 100 μί HRP конюгиран анти-Ptyr, разреден 1:6000 в буфер за разреждане на * « • · • · · · • ·

- 228 -

9··· · · · · · · · • ·· ··· · · · · · ♦ · · · • » · · · · · · · · · * · ·· ·· ·· · · · антитяло. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 1 час при стайна температура.

15. Паничката се изплаква Зх с TBST и 1х с PBS.

16. Във всяко гнездо се добавят по 100 μί. разтвор на ABST.

17. Ако е необходимо, се прекъсва протичането на реакцията чрез добавяне на 20 μΙ_ 10% SDS във всяко гнездо.

18. Паничката се отчита на ELISA отчитащо устройство с опитен филтър с 410 пМ и сравнителен филтър с 630

FGFR1 БИОАНАЛИЗ

Това изследване се използва за определяне на in vitro киназната активност на FGF1-R в ELISA тест.

Материали и реагенти

1. Costar 96-гнездови ELISA панички (Corning каталожен N° 3369).

2. Поли(д1и, tyr) (Sigma каталожен N2 РО275).

3. PBS (Gibco каталожен № 450-1300ЕВ).

4. 50 mM Hepes буферен разтвор.

5. Блокиращ буфер (5% BSA/PBS).

6. Пречистен GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.).

7. Буфер за киназно разреждане. Смесват се 500 μι 1 М Hepes (Gibco), 20 μι 5% BSA/PBS, 10 μί 100 mM натриев ортованадат и 50 μι 5 М NaCI.

8. 10 mM ATP.

9. ATP/MnCI₂ смес за фосфорилиране: смесват се 20 μί ATP, 400 μί 1М MnCI₂ и 9.56 ml dH₂O.

• · • · · ·

- 229 -

10. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-образно дъно (Appliad Scientific каталожен № AS-72092).

11. 0.5 М ЕДТА.

12. 0.05% TBST. Добавят се 500 ц!_ TWEEN към 1 L TBS.

13. Заешки поликлонален анти-фосфотирозинов серум (SUGEN, Inc.).

14. Кози анти-заешки IgG пероксидазен конюгат (Biosource, каталожен № ALI0404).

15. Разтвор на ABTS.

16. ABTS/H₂O₂ разтвор.

Процедура:

1. Покриват се Costar 96-гнездови ELISA панички с 1 цд/гнездо поли(д1и, tyr) в 100 μί PBS. Съхраняват се една нощ при 4°С.

2. Покритите панички се изплакват веднъж с PBS.

3. Във всяко гнездо се добавят по 150 μί от 5% BSA/PBS блокиращ буфер. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 1 час, при стайна температура.

4. Паничката се изплаква 2х с PBS, след това веднъж с 50 тМ Hepes. Потупва се паничката върху книжна салфетка, за да се отстранят излишната течност и мехурчетата.

5. В паничката се добавят 25 μί от 0.4 тМ опитно съединение в 4% ДМСО или 4% ДМСО само (контроли).

6. Разрежда се пречистен GST-FGFR1 в буфер за киназно разреждане (5 ng киназа/50и1 KDB/гнездо).

7. Към всяко гнездо се добавят 50 μΙ.

8. Стартира се киназна реакция чрез добавяне на 25 μΙ/гнездо прясно приготвен АТР/Мп ^{+ +} (0.4 mL 1М MnCI₂, μΙ ЮтМ АТР, 9.56 mL dH₂O).

· · ·* · · *·

- 230 9.

Това е бърза • · ·· ·· · · ♦· · киназна реакция и трябва да се спре с 25

10.

μΙ 0.5 М ЕДТА

Паничката се по начин, подобен на добавянето на АТР.

изплаква 4х с пресен TBST.

11.

Приготвя се буфер за разреждане на антитяло: за 50

250 μΙ от 5% мляко и 50 μΙ от 100 mM натриев ванадат, довежда се до краен обем с 0.05% TBST.

12.

Добавят се по 100 μΙ на гнездо от анти-фосфотирозин (1:10000 разреждане в ADB).

13.

Изплаква се , както в етап

10.

14.

Добавят се по 100 μΙ на гнездо

Biosource кози анти15.

заешки в ADB).

час при igG пероксидазен конюгат (1:6000 разреждане

Инкубира се, с разклащане в стайна температура.

Изплаква се, както в етап 10 и след продължение на 1 това с PBS, за да се отстранят мехурчетата и излишният TWEEN.

16.

Добавят се по 100 μΙ от ABTS/H₂O₂ разтвор към всяко гнездо.

17.

Инкубира се, с разклащане, в продължение на

10-20 минути. Отстраняват се всички мехурчета.

18.

Опитът се отчита на Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство: опитен филтър с 41 0 пМ, сравнителен филтър с 630 пМ.

EGFR

БИОАНАЛ1/13

Това изследване се използва за in vitro киназна активност на

FGF1-R в ELISA тест.

Материали и реагенти:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички.

* · • · « · · ·

- 231 - ··;· • · · · ·· ·3 ·· ·

2. SUM01 моноклонално анти-EGFR антитяло (SUGEN, Inc.).

3. PBS.

4. TBST буфер.

5. Блокиращ буфер: за 100 mL се смесват 5.0 g разтворимо непълномаслено мляко на Carnation® със 100 mL PBS.

6. А431 клетъчен лизат (SUGEN, Inc.).

7. TBS буфер.

8. TBS + 10% ДМСО: за 1 L се смесват 1.514 g TRIS, 2.192 g NaCI и 25 mL ДМСО; довежда се до 1 литър общ обем с dH₂O.

9. ATP (аденозин-5’-трифосфат, от Equine muscle, Sigma каталожен № А-5394), 1.0 mM разтвор в dH₂O. Реагентът трябва да се приготви непосредствено преди употреба и да се държи върху лед.

10. 1.0 mM MnCI₂.

11. ATP/MnCI₂ фосфорилираща смес: за да се приготвят 10 mL, се смесват 300 μΙ от 1 mM АТР, 500 μΙ MnCI₂ и 9.2 mL dH₂O. Приготвя се непосредствено преди използване и се държи върху лед.

12. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-образно дъно.

13. ЕДТА.

14. Заешки поликлонален анти-фосфотирозинов серум (SUGEN, Inc.).

15. Кози анти-заешки IgG пероксидазен конюгат (Biosource каталожен № ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% водороден пероксид.

• 9 · · · ·

9 ·

- 232 - ··· · 9 9 9 9 9 9 • · · « · · · · · ····· ·· 9 9 99 99 9 9 9

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0.2 M HCI.

Процедура:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички се покриват с 0.5 цд SUMO1 в 100 μΙ PBS за гнездо, съхраняват се една нощ при 4°С.

2. Отстранява се несвързания SUMO1 от гнездата чрез обръщане на паничката, за да се отстрани течността. Изплаква се 1х с dH₂O. Паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстрани излишната течност.

3. Добавят се 150 μΙ блокиращ буфер във всяко гнездо. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30 минути при стайна температура.

4. Паничката се изплаква Зх с дейонизирана вода, след това веднъж с TBST. Паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстраният излишната течност и мехурчетата.

5. Лизатът се разрежда в PBS (7 дд лизат/100 μΙ PBS).

6. Във всяко гнездо се добавят по 100 μΙ разреден лизат. Разклащат се при стайна температура 1 час.

7. Паничките се изплакват, както в етап 4, по-горе.

8. В ELISA паничка, съдържаща заловен EGFR, се добавят 120 μΙ TBS.

9. Опитното съединение се разрежда 1:10 в TBS и се поставя в гнездо.

10. Към ELISA паничка се добавят 13.5 μΙ разредено опитно съединение. Към контролни гнезда се добавят 13.5 μΙ

TBS в 10% ДМСО.

♦ * • · · ·

- 233 -

11. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30 минути при стайна температура.

12. Добавят се 15 μΙ фосфорилираща смес във всички гнезда, без отрицателното контролно гнездо. Крайният обем на гнездото трябва да бъде приблизително 150 μΙ с 3 μΜ АТР/5 тМ MnCI₂ крайна концентрация във всяко гнездо. Инкубират се, с разклащане, в продължение на минути.

13. Реакцията се спира чрез добавяне на 16.5 μΙ разтвор на ЕДТА при разклащане. Разклаща се още 1 минута.

14. Изплакват се 4х с дейонизирана вода, 2х с TBST.

15. Добавят се по 100 μΙ на гнездо анти-фосфотирозин (1:3000 разреждане в TBST). Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30-45 минути при стайна температура.

16. Изплакват се, както в етап 4, по-горе.

17. Добавят се по 100 μΙ във всяко гнездо Biosource кози анти-заешки IgG пероксидазен конюгат (1:2000 разреждане в TBST). Инкубират се, с разклащане в продължение на 30 минути при стайна температура.

18. Изплаква се, както в етап 4, по-горе.

19. Добавят се по 100 μΙ от ABTS/H₂O₂ разтвор към всяко гнездо.

20. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 5-10 минути. Отстраняват се всички мехурчета.

21. Ако е необходимо, реакцията се спира чрез добавяне на 100 μΙ 0.2М HCI на гнездо.

22. Опитът се отчита на Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство: опитен филтър с 410 пМ, сравнителен филтър с 630 пМ.

• · • ···

EGFR БИОАНАЛИЗ

Това изследване се използва за in vitro киназна активност на FGF1-R в ELISA тест.

Материали и реагенти:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички.

2. 28D4C10 моноклонално анти-PDGFR антитяло (SUGEN, Inc.).

3. PBS.

4. TBST буфер.

5. Блокиращ буфер (същият, както за EGFR биоанализа).

6. PDGFR-β експресиращ NIH ЗТЗ клетъчен лизат (SUGEN, Inc.).

7. TBS буфер.

8. TBS + 10% ДМСО.

9. ATP.

10. MnCI₂.

11. Смес на киназен фосфорилиращ буфер: за 10 mL се смесват 250 μΙ 5 М NaCI, 100 μΙ 1М MnCI₂ и 50 μΙ 100 mM Triton Х-100 в достатъчно dH₂O, за да се получат 10 mL.

12. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-об- разно дъно.

13. ЕДТА.

14. Заешки поликлонален анти-фосфотирозинов серум (SUGEN, Inc).

15. Кози анти-заешки IgG пероксидазен конюгат (Biosource каталожен Ns ALI0404).

16. ABTS.

17. 30% разтвор на водороден пероксид.

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0.2 М HCI.

• »··

- 235 Процедура:

Corning 96-гнездови ELISA панички се покриват с 0.5 цд

28D4C10 в 100 μΙ PBS за гнездо, съхраняват се една нощ при 4°С.

2.

Отстранява се несвързания 28D4C10 от гнездата чрез обръщане на паничката, за да се отстрани течността.

Изплаква се 1х с dH₂O.

Паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстрани излишната течност.

3.

Добавят се 150 блокиращ буфер във всяко гнездо.

4.

Инкубират се, с нути при стайна разклащане, температура.

Паничката се изплаква Зх с в продължение на 30 мидейонизирана вода , след това веднъж с TBST. Паничката се потупва върху книжна салфетка, за да се отстраният излишната течност и мехурчетата.

5.

Лизатът се разрежда в HNTG (10 цд лизат/100 μΙ

HNTG).

6.

Във всяко гнездо се добавят по 100 μΙ разреден лизат.

Разклащат се при стайна температура 1 час.

7.

Паничките се изплакват, както е дадено в етап 4.

8.

В ELISA паничка, съдържаща уловен

PDGFR, се добавят μΙ работен киназен буфер.

9.

Опитното съединение се разрежда

1:10 в

TBS в 96гнездови полипропиленови панички.

10.

Към ELISA паничка се добавят 10 μΙ разредено опитно съединение. Към контролни гнезда се добавят 10 μΙ TBS + 10% ДМСО. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30 минути при стайна температура.

- 236 - ··:· «· · · · · ·· · · ·

11. Добавят се по 10 μΙ ATP директно във всички гнезда, без отрицателно контролно гнездо (крайният обем на гнездото трябва да бъде приблизително 100 μΙ с 20 μΜ ATP във всяко гнездо). Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30 минути.

12. Реакцията се спира чрез добавяне на 10 μΙ разтвор на ЕДТА във всяко гнездо.

13. Изплакват се 4х с дейонизирана вода, 2х с TBST.

14. Добавят се по 100 μΙ на гнездо анти-фосфотирозин (1:3000 разреждане в TBST). Инкубират се, с разклащане, в продължение на 30-45 минути при стайна температура.

15. Изплакват се, както в етап 4, по-горе.

16. Добавят се по 100 μΙ във всяко гнездо Biosource кози анти-заешки IgG пероксидазен конюгат (1:2000 разреждане в TBST). Инкубират се, с разклащане в продължение на 30 минути при стайна температура.

17. Изплакват се, както в етап 4.

18. Добавят се по 100 μΙ от ABTS/H₂O₂ разтвор към всяко гнездо.

19. Инкубират се, с разклащане, в продължение на 10-30 минути. Отстраняват се всички мехурчета.

20. Ако е необходимо, реакцията се спира чрез добавяне на 100 μΙ 0.2М HCI на гнездо.

21. Опитът се отчита на Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство: опитен филтър с 410 пМ, сравнителен филтър с 630 пМ.

- 237 -

ОПИТ С КЛЕТЪЧНА HER-2

КИНАЗА

Този опит се използва за измерване на HER-2 киназната активност в целите клетки в ELISA формат.

Материали и реагенти

1. DMEM (GIBCO каталожен № 1 1965-092).

2. Ембрионален волски серум (FBS, GIBCO каталожен № 16000-044), се инактивира топлинно във водна баня в продължение на 30 минути при 56°С.

3. Трипсин (GIBCO каталожен № 25200-056).

4. L-глутамин (GIBCO каталожен № 25030-081).

5. HEPES (GIBCO каталожен №‘156301965-08092).

6. Хранителна среда. Смес от 500 mL DMEM, 55 mL топлинно инактивиран FBS, 10 mL HEPES и 5.5 mL L-глутамин.

7. Непълна среда. Смес от 500 mL DMEM, 2.5 mL топлинно инактивиран FBS, 10 mL HEPES и 5.5 mL L-глутамин.

8. PBS.

9. Облодънни 96-гнездови микротитърни панички за тъканна култура (Corning каталожен № 25860).

10. 15 cm блюда за тъканна култура (Corning каталожен N9 08757148).

11. Corning 96-гнездови ELISA панички.

13. Costar преносни капсули за Transtar 96 (Costar каталожен № 761 0).

14. SUMO 1: моноклонално анти-EGFR антитяло (SUGEN, Inc.).

15. TBST буфер.

• · • * • · ··

16. Блокиращ буфер: 5% разтворимо мляко Carnation® в PBS.

17. EGF лиганд: EGF-201, Shinko American, Япония. Суспендира се прах в 100 ul от 10 mM HCI. Добавят се 100 uL 10 mM NaOH. Добавят се 800 uL PBS и се прехвърлят в тръба на Епендорф, съхраняват се при -20°С до готовност за използване.

18. HNTG лизисен буфер. За изходен разтвор 5Х HNTG се смесват 23.83 g Hepes, 43.83 g NaCI, 500 mL глицерин и 100 mL Triton X-100 и достатъчно dH₂O, за да се получи 1 L общ разтвор. За 1Х HNTG* се смесват 2 mL HNTG, 100 μΙ 0.1 М Na₃VO₄, 250 μΙ 0.2 Μ Na₄P₂O₇ и 100 μΙ ЕДТА.

19. ЕДТА.

20. Na₃VO₄. За да се приготви изходен разтвор се смесват 1.84 g Na₃VO₄. с 90 mL dH₂O. pH се довежда до 10. Кипи се в микровълнова печка 1 минута (разтворът става бистър). Охлажда се до стайна температура. РН се довежда до 10. Повтарят се цикълът нагряване/охлаждане докато pH се запази 10.

21. 200 mM Na₄P₂O₇.

22. Заешки поликлонален антисерум, спицифичен за фосфотирозин (анти-Ptyr антитяло, SUGEN, Inc.).

23. Афинитетно пречистен антисерум, козе анти-заешко IgG антитяло, пероксидазен конюгат (Biosource каталожен № ALI0404).

24. ABTS разтвор.

25. 30%-ен разтвор на водороден пероксид.

26. ABTS/H₂O₂.

27. 0.2 М HCI.

• · ·· ·····♦ · · ···· ·· · ··· ···· ·· · ····

- 239 - : : : ··:· • · 9t ·· ♦ · ·· ·

Процедура:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички се покриват със SUMO1 с концентрация 1.0 ug/гнездо в PBS, 100 ul краен обем/гнездо. Съхраняват се една нощ при 4°С.

2. Използват се един ден, отстранява се покриващия буфер и паничката се изплаква 3 пъти с dH₂O и веднъж с TBST буфер. Всички изплаквания в този опит трябва да бъдат направени по този начин, ако изрично не е указано друго.

3. Във всяка паничка се добавят по 100 ul блокиращ буфер. Паничката се инкубира, с разклащане, в продължение на 30 минути при стайна температура. Непосредствено преди използването, паничката се изплаква.

4. За този опит се използва EGFr/HER-2 химерна/ЗТЗ-С7 клетъчна линия.

5. Избират се блюда с 80-90% сливане. Събират се клетки чрез трипсинизация и се центрофугират при 1000 об/мин при стайна температура в продължение на 5 минути.

6. Клетките се ресуспендират в непълна среда и се отчитат с трипан блу. Необходима е жизнеспособност над 90%. Клетките се посяват в непълна среда с плътност 2,500 клетки/гнездо, 90 ul/гнездо, в 96-гнездова мкротитърна паничка. Посетите клетки се инкубират една нощ при 37°С под 5% СО₂.

7. Опитът започва два дни след посяването.

8. Разтварят се опитни съединения в 4% ДМСО. След това, пробите допълнително се разреждат директно в паничките с непълна DMEM. Обикновено, това разреждане е 1:10 или по-голямо. След това, всички гнезда се • * ·· • ·

- 240 -

прехвърлят в клетъчна паничка с допълнително разреждане 1:10 (10 μΙ проба и среда в 90 μΙ непълна среда. Крайната концентрация на ДМСО трябва да бъде

1% или по-ниска. Може да се използва стандартно серийно разреждане.

9. Инкубират се под 5% СО₂ при 37°С в продължение на 2 часа.

10. Приготвя се EGF лиганд чрез разреждане на изходен EGF (16.5 иМ) в топъл DMEM до 150 пМ.

11. Приготвя се пресен HNTG*, достатъчен за 100 ul на гнездо; поставя се върху лед.

12. След 2 часа инкубиране с опитно съединение, към клетките се добавя приготвеният EGF лиганд, 50 ul на гнездо, за крайна концентрация 50 пМ. Гнездата с положителна контрола получават същото количество EGF От- рицателните контроли не получават EGF. Инкубират се

при 37°С 1 0 минути.

13. Отстраняват се опитното съединение, EGF и DMEM. Клетките се изплакват веднъж с PBS.

14. HNTG* се пренася в клетките, 100 ul на гнездо. Поставя се върху лед за 5 минути. Междувременно, се отстранява блокиращият буфер от ELISA паничката и се из- плаква.

15. Клетките се изстъргват от паничката с микропипета и клетъчният материал се хомогенизира чрез повтарящо се аспириране и се дозира HNTG* лизисният буфер. Лизатът се прехвърля в покрита, блокирана, изплакната ELISA паничка. Или, се използва Costar капсула за прехвърляне на лизата в паничката.

16.

Инкубират се, с ·· ······ « · • · · ·· · · ·· ··· ·· · · · · • · · · · · ··· ·· • · ·· ♦ · · · разклащане, при стайна

- 241 температура в продължение на 1 час.

17. Отстранява се лизатът, изплаква се. Прехвърля се прясно разредено анти-Ptyr антитяло (1:3000 в TBST) в ELISA паничка, 100 ul/гнездо.

18. Инкубира се, с разклащане, при стайна температура, 30 минути.

19. Отстранява се анти-Ptyr антитялото, изплаква се. Прехвърля се прясно разреденото BIOSOURCE АНТИТЯЛО в ELISA паничка (1:8000 в TBST, 100 ul/гнездо).

20. Инкубира се, с разклащане, при стайна температура, 30 минути.

21. Отстранява се BIOSOURCE антитялото, изплаква се. Прехвърля се прясно приготвен разтвор на ABTS/H₂O₂в ELISA паничка, 100 ul/гнездо.

22. Инкубира се, с разклащане, 5-10 минути. Отстраняват

се всички мехурчета.

23. Реакцията се прекъсва с добавяне на 100 ul 0.2 М HCI/гнездо.

24. Опитът се отчита на Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство с опитен филтър с 410 пМ 630 и сравни- телен филтър с 630 пМ.

СОК2/ЦИКЛ1/1Н А	ОПИТ
Този опит се	използва за измерване на in vitro серин/-
треонинкиназната	активност на човешки сс!к2/циклин А в

сцинтилационен приблизителен анализ (SPA).

Материали и реагенти

1. Wallac 96-гнездови полиетилентерефталатни (гъвкави) панички (Wallac каталожен № 1450-401).

• · · · ······ · · • · · · · · · · · · ο л ο ···· ··· ····

- Ζ4-Ζ - ······· . · · · ···· • * · · ···· · · · • · · · ·· · · · · «

2. Amersham Redivue [γ³³Ρ] ATP (Amersham каталожен № AH 9968).

3. Поливинилтолуенови SPA гранули, покрити с Amersham стрептавидин (Amesrsham каталожен № RPNQ0007).

Гранулите трябва да се разтворят повторно в PBS без магнезий или калций, 20 mg/ml.

4. Активиран cdk2/pnKnnH А ензимен комплекс, пречистен от Sf9 клетки (SUGEN, Inc.).

5. Биотинилиран пептиден субстрат (Debtide). Пептиден биотин-Х-PKTPKKAKKL се разтваря в dH₂O с концентрация 5 mg/ml.

6. Смес пептид/ATP: за 10 ml се смесват 9.979 ml dH₂O, 0.00125 ml “студен” ATP, 0.010 ml Debtide и 0.010 ml γ³³Ρ ATP. Крайната концентрация в гнездо ще бъде 0.5 цМ “студен” АТР, 0.1 pg Debtide и 0.2 ptCi γ³³Ρ ATP.

7. Киназен буфер: за 10 ml се смесват 8.85 ml dH₂O, 0.625 ml TRIS (pH 7.4), 0.25 ml 1M MgCI₂, 0.25 ml 10% NP40 и 0.025 ml 1M DTT, добавя се прясно приготвен преди употреба.

8. 1 0 тМ АТР в dH₂O.

9. 1 М Tris, pH се довежда до 7.4 с HCI.

10. 1 М MgCI₂.

11. 1 М DTT.

12. PBS (GIBCO каталожен № 14190-144).

13. 0.5 М ЕДТА.

14. Стоп-разтвор: за 10 ml се смесват 9.25 ml PBS, 0.005 ml 100 mM АТР, 0.1 ml 0.5 М ЕДТА, 0.1 ml 10% Triton X-100 и 1.25 ml от 20 mg/ml SPA гранули.

- 243 - ·· 4· ·· ···· ·· ···· · · » · · · • ♦ ·· · · · ·*·· • 9 9 · · · · · · 9 9 9999 • · · · 9 9 · · · ··

4· 99 ·· 9 9 «с9

Процедура:

1. Приготвят се разтвори на опитни съединения с 5х желаната крайна концентрация в 5% ДМСО. Добавят се по 10 ul във всяко гнездо. За отрицателните контроли се използват само 10 ul 5% ДМСО в гнездата.

2. Разреждат се 5 μΙ разтвор на сбк2/циклин А с 2.1 ml 2х киназен буфер.

3. Във всяко гнездо се добавят 20 ul ензим.

4. Добавят се 10 μΙ 0.5 М ЕДТА към гнездата с отрицателна контрола.

5. За да започне киназната реакция се добавят по 20 μΙ смес пептид/ATP във всяко гнездо. Инкубира се, без разклащане 1 час.

6. Във всяко гнездо се добавят по 200 μΙ стоп-разтвор.

7. Държи се поне 10 минути.

8. Паничката се върти с приблизително 2300 об/мин в продължение на 3-5 минути.

9. Отчита се паничкат, като се използва Trilux или подобно отчитащо устройство.

ОПИТ С MET ТРАНСФОСФОРИЛИРАНЕ

Този опит се използва за измерване нивата на фосфотирозин върху поли(глутаминова киселина:тирозин (4:1)) субстрат, като начин за идентифициране на агонисти/антагонисти на met трансфосфорилиране на субстрата. Материали и реагенти

1. Corning 96-гнездови ELISA панички, Corning каталожен № 25805-96.

2. Поли(д1и, tyr) 4:1, Sigma каталожен № Р 0275.

3. PBS, Gibco каталожен № 450-1300ЕВ.

• ·« • ·· · • · ·····

- 244 tt ·· ······ • · · · ·· е • · ·· · · * • ·· ··· · · ···· ···· е· ·* »*··

4. 50 mM HEPES.

5. Блокиращ буфер: разтварят се 25 g волски серумен албумин, Sigma каталожен N2 А-7888, в 500 ml PBS, филтрува се през 4 μηη филтър.

6. Пречистен GST слят протеин, съдържащ Met киназния домен, Sugen, Inc.

7. TBST буфер.

8. 10% воден (MilliQue вода) ДМСО.

9. 10 тМ воден (с1Н₂О) аденозин-5’-трифосфат, Sigma ка- таложен № А-5394.

10. 2Х киназен буфер за разреждане: за 100 ml се смесват ml 1М HEPES с pH 7.5 с 0.4 ml 5% BSA/PBS, 0.2 ml 0.1

М натриев ортованадат и 1 ml 5 М натриев хлорид в 88.4 ml dH₂O.

11. 4Х ATP реакционна смес: за 10 ml се смесват 0.4 ml 1М манганов хлорид и 0.02 ml 0.1 Μ АТР в 9.56 ml dH₂O.

12. 4Х смес от отрицателни контроли: за 10 ml се смесват

0.4 ml 1 М манганов хлорид в 9.6 ml dH₂O.

13. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-об- разно дъно, Applied Scientific каталожен № S-72092.

14. 500 mM ЕДТА.

15. Буфер за разреждане на антитяло: за 100 ml се смесват 10 ml BSA/PBS, 0.5 ml 5% Carnation® разтворимо мляко в PBS и 0.1 ml 0.1 М натриев ортованадат в 88.4 ml TBST.

16. Заешко поликлонално антофосфотирозиново антитяло, Sugen, Inc.

17. Козя анти-заешка пероксидаза от хрян, конюгирана с антитяло, BIOSOURCE, Inc.

- 245 • · · · ·· ·· ··

18. Разтвор на ABTS: за 1 L се смесват 19.21 g лимонена киселина, 35.49 g Na₂HPO₄ и 500 mg ABTS с достатъчно dH₂O, за да се получи 1 L.

19. ABTS/H₂O₂: смесват се 15 ml разтвор на ABTS с 2 μΙ Н₂О₂ пет минути преди използване.

20. 0.2 М HCI.

Процедура:

1. ELISA панички се покриват с 2 цд nonn(Glu-Tyr) в 100 μΙ PBS и се съхраняват една нощ при 4°С.

2. Паничката се блокира със 150 μΙ от 5% BSA/PBS за 60 минути.

3. Паничката се изплаква двукратно с PBS и веднъж с 50 mM Hepes буфер с pH 7.4.

4. Във всички гнезда се добавят по 50 μΙ от разредената киназа. (Пречистена киназа се разрежда с буфер за киназно разреждане. Крайната концентрация трябва да бъде 1 0 ng/гнездо.

5. В паничката се добавят 25 μΙ от опитното съединение (в 4% ДМСО) или само ДМСО (4% в dH₂O) за контролите.

6. Сместа киназа/съединение се инкубира 15 минути.

7. В гнездата с отрицателна контрола се добавят по 25 μΙ от 40 mM MnCI₂.

8. Във всички останали гнезда се добавят по 25 μΙ смес ATP/MnCI₂ (с изключение на отрицателните контроли). Инкубират се 5 минути.

9. Добавят се 25 μΙ 500 mM ЕДТА, за да се спре реакцията.

10. Паничката се изплаква Зх с TBST.

11. Във всяко гнездо се добавят по 100 μΙ заешко поликлонално анти-Ptyr антитяло, разредено 1:10,00 в буфер за • · • е · 9 • 9 9

- 246 -

999 9 9 ·9999

9 999 9 9999999

9 9 99 9 9 99

99 99 99 999 разреждане на антитяло. Инкубират се, с разклащане, при стайна температура 1 час.

12. Паничката се промива Зх с TBST.

13. Разрежда се BIOSOURCE HRP конюгирано анти-заешко антитяло 1:6,000 в буфер за разреждане на антитяло.

Във всяко гнездо се добавят по 100 μΙ и се инкубират, с разклащане, при стайна температура, 1 час.

14. Паничката се изплаква 1Х с PBS.

15.

Във всяко гнездо се добавят по 100 μΙ от разтвор на

ABTS/H₂O₂.

16. Ако е необходимо, се спира продължаването на реакцията с добавяне на 100 μΙ от 0.2М HCI на гнездо.

17. Паничката се отчита на Dynatech MR7000 ELISA отчитащо устройство с опитен филтър с 410 пМ и срав- нителен филтър с 630 пМ.

ОПИТ С IGF-1 ТРАНСФОСФОРИЛИРАНЕ

Този опит се използва, за да се измери нивото на фосфотирозин в поли(глутаминова киселина:тирозин (4:1) за идентифицирането на агонисти/антагонисти на gst-IGF-1 трансфосфорилиране на субстрата.

Материали и реагенти:

1. Corning 96-гнездови ELISA панички.

2. nonn(Glu-tyr) (4:1), Sigma каталожен № Р 0275.

3. PBS, Gibco каталожен № 450-1300ЕВ.

4. 50 mM HEPES.

5. ТВВ блокиращ буфер: за 1 L се смесват 100 g BSA, 12.1 g TRIS (pH 7.5), 58.44 g натриев хлорид и 10 ml 1%

TWEEN-20.

• · • · • · ·· • · ·

6. Пречистен GST слят протеин, съдържащ IGF-1 киназният домен (Sugen, Inc.).

7. TBST буфер: за 1 L се смесват 6.057 g Tris, 8.766 g натриев хлорид и 0.5 ml TWEEN-20 с достатъчно dH₂O, за да се получи 1 литър.

8. 4% ДМСО в Milli-Q Н₂О.

9. 1 0 mM АТР в dH₂O.

10. 2Х буфер за киназно разреждане: за 100 ml се смесват 10 ml 1М HEPES с pH 7.5 с 0.4 ml 5% BSA в dH₂O, 0.2 ml 0.1 М натриев ортованадат и 1 ml 5 М натриев хлорид с достатъчно dH₂O, за да се получат 10 ml.

11. 4Х АТР реакционна смес: за 10 ml се смесват 0.4 ml 1М манганов хлорид и 0.008 ml 0.1 М АТР в 9.56 ml dH₂O.

12. 4Х смес от отрицателни контроли: смесват се 0.4 ml 1 М манганов хлорид в 9.6 ml dH₂O.

13. NUNC 96-гнездови полипропиленови панички с V-образно дъно.

14. 500 mM ЕДТА в dH₂O.

15. Буфер за разреждане на антитяло: за 100 ml се смесват 10 ml 5% BSA в PBS, 0.5 ml 5% Carnation® разтворимо непълномаслено мляко в PBS и 0.1 ml 0.1М натриев ортованадат в 88.4 ml TBST.

17. Козе анти-заешко HRP конюгирано антитяло, BIOSOURCE, Inc.

18. Разтвор на ABTS.

19. ABTS/H₂O₂: смесват се 15 ml разтвор на ABTS с 2 μΙ

Н₂О₂ пет минути преди използване.

20. 0.2 М HCI в dH₂O.

• · · ·

- 248 Процедура:

ELISA паничка се покрива с 2 μg/гнeздo полn(Glu-Tyr) (4:1) (Sigma Р0275) в 100 μΙ PBS и се съхранява една нощ при 4°С.

2.

Паничката се изплаква веднъж с PBS.

3.

Добавят се по 100 μΙ ТВВ блокиращ буфер във всяко гнездо. Инкубира се, с разклащане, при стайна темпе4.

5.

ратура, 1 час.

Паничката се двукратно с

В паничката

4% ДМСО разтвор на изплаква веднъж с

PBS

7.5.

и след това, mM Hepes буфер с pH се добавят 25 μΙ от опитното (получен чрез разреждане тМ опитно съединение съединение в на изходен

100% ДМСО с dH₂O).

6.

Във всички гнезда се добавят 10.0 ng gst-IGF-1 киназа

7.

в 50 μΙ буфер за киназно разреждане.

Киназната реакция се стартира чрез добавяне на 25 μΙ

4Х АТР реакционна смес към всички опитни гнезда и гнезда с положителна контрола.

В гнездата с отрица8.

9.

10.

телна контрола се добавят по 25 телни контроли. Инкубират се 10 μΙ 4Х смес от отрицаминути с разклащане при стайна температура.

Във всички гнезда се добавят 25 μΙ 0.5 М

Паничката се изплаква 4х с TBST буфер.

Във всичкигнезда се добавят заешки

ЕДТА.

поликлонални антисеруми с разреждане 1:10,00 в 100 μΙ буфер за раз реждане на антитяло. Инкубират се, с разклащане, при

11.

стайна температура 1 час.

Паничката се изплаква, както в етап

9.

• · • · ·

- 249 - :·:ί· • · ·· ·· ·· · ·

12. Във всички гнезда се добавят по 100 μΙ BIOSOURCE анти-заешки HRP с разреждане 1:10,000 в буфер за разреждане на антитяло, и се инкубират, с разклащане, при стайна температура, 1 час.

13. Паничката се изплаква, както в етап 9, следвано от едно изплакване с PBS, за да се намалят мехурчетата и излишака от Tween-20.

14.

15.

ОПИТИ С ВКЛЮЧВАНЕ НА BRDU

Следващите опити използват клетки, предназначени да експресират избран рецептор и след това се преценява ефекта от избраното съединение върху действието на индуцирания от лиганд ДНК синтез чрез определяне на включването на BrdU в ДНК.

Материали и реагенти

1. Подходящият лиганд.

2. Съответните приготвени клетки.

3. Реагент за белязане BrdU: 10 mM, в PBS (pH 7.4) (Boehringer Mannheim, Германия).

4. FixDenat: фиксиращ разтвор (готов за използване) (Boehringer Mannheim, Германия).

5. Анти-BrdU-POD: мишо моноклонално антитяло, конюгирано с пероксидаза (Boehringer Mannheim, Германия).

6. Разтвор на ТМВ субстрат: тетраметилбензидин (ТМВ, Boehringer Mannheim, Германия)

7. PBS изплакващ разтвор: 1Х PBS, pH 7.4.

• · ·

- 250 - : : : · ·· ·· ·· · · · ·

8. Албумин, волски (BSA), фракция V прахообразна (Sigma Chemical Co., САЩ).

Основна процедура:

1. Посяват се клетки при 8000 клетки/гнездо в 10% CS, 2 mM Gin в DMEM, в 96-гнездова паничка. Клетките се инкубират една нощ при 37°С в 5% СО₂.

2. След 24 часа, клетките се изплакват с PBS и след това се освобождават от серум в свободна от серум среда (0% CS DMEM с 0.1% BSA) в продължение на 24 часа.

3. На третия ден, към клетките се добавят едновременно съответният лиганд и опитното съединение. Гнездата с отрицателна контрола получават DMEM без серум, само с 0.1% BSA; клетките от положителната контрола получават лиганда, без опитно съединение. Опитните съединения се подготвят в DMEM без серум с лиганд в 96-гнездова паничка и се разреждат серийно за 7 опит

ни концентрации.

4. След 18 часа активиране на лиганда, се добавя разреденият реагент за белязане на BrdU (1:100 в DMEM, 0.1% BSA) и клетките се инкубират с BrdU (крайна концентрация 10 μΜ) в продължение на 1.5 часа.

5. След инкубирането с реагента за белязане, средата се отстранява чрез декантиране и потупване на обърнатата паничка върху книжна салфетка. Добавя се FixDenat разтвор (50 μΙ/гнездо) и паничките се инкубират при стайна температура 45 минути върху клатачка.

6. FixDenat разтворът се отстранява напълно чрез декантиране и потупване на обърнатата паничка върху книжна салфетка. Добавя се мляко (5% дехидратирано мляко в PBS, 200 μΙ/гнездо) като блокиращ разтвор и па• · · · · ·

- 251

ничката се инкубира 30 минути при стайна температура върху клатачка.

7. Блокиращият разтвор се отстранява чрез декантиране и гнездата се изплакват веднъж с PBS. Анти-BrdU-POD разтвор (1:200 разреждане в PBS, 1% BSA) се добавя (50 μΙ/гнездо) и паничката се инкубира 90 минути при стайна температура върху клатачка.

8. Конюгатът на антитялото се отстранява напълно чрез декантиране и изплакване на гнездата 5 пъти с PBS и паничката се суши чрез обръщане и потупване върху книжна салфетка.

9. Добавя се разтвор на ТМВ субстрат (100 μΙ/гнездо) и се инкубира 20 минути при стайна температура върху клатачка докато се получи достатъчно оцветяване за фотометрично откриване.

10. Абсорбцията на пробите се измерва при 410 пМ (в “двойна дължина на вълната”) в модел с филтър, отчитащ при 490 пМ, като сравнителна дължина на вълната) на Dynatech отчитащо устройство за ELISA панички.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от EGF

Материали и реагенти:

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Япония).

2. 3T3/EGFRC7.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от EGF, управляван от Нег-2

Материали и реагенти:

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Япония).

2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr c Her-2 киназен домен).

· • · • ·

- 252 - ·· ·· ·« · · · ·

Опит с включване на BrdU, индуцирано от EGF, управляван от Нег-4

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Япония).

2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr с Нег-4 киназен домен).

Опит с включване на BrdU, индуцирано от PDGF

Материали и реагенти:

1. Човешки PDGF В/В (Boehringer Mannheim, Германия).

2. 3T3/EGFRC7.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от FGF

Материали и реагенти:

1. Човешки FGF2/bFGF (Gibco BRL, САЩ).

. 2. 3T3c7/EGFr.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от IGF1

Материали и реагенти:

1. Човешка рекомбинантна (G511, Promega Corp., САЩ).

2. 3T3/IGF1r.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от инсулин

Материали и реагенти:

1. Инсулин, кристален, волски, Zinc (13007, Gibco BRL, САЩ).

2. ЗТЗ/Н25.

Опит с включване на BrdU, индуцирано от HGF

Материали и реагенти:

1. Рекомбинантна човешка HGF (каталожен № 249-HG, R&D Systems, Inc. САЩ).

2. ВхРС-3 клетки (ATCC CRL-1687).

Процедура:

1. Посяват се клетки при 9000 клетки/гнездо в RPMI 10% FBS в 96-гнездова паничка. Клетките се инкубират една нощ при 37°С в 5% СО₂.

• ♦ · · ♦ ·

2. След 24 часа, клетките се изплакват с PBS и след това се освобождават от серум в 100 μΙ свободна от серум среда (RPMI с 0.1% BSA) в продължение на 24 часа.

3. На третия ден, към клетките се добавят 25 μΙ, съдържащи лиганд (получен с 1 дд/т1 RPMI с 0.1% BSA; крайната концентрация на HGF е 200 ng/ml) и опитни съединения. Гнездата с отрицателна контрола получават 25 μΙ RPMI без серум, само с 0.1% BSA; клетките с положителна контрола получават лиганда HGF), без опитно съединение. Опитните съединения се подготвят с 5-кратна крайна концентрация в RPMI без серум, с лиганд в 96-гнездова паничка и се разреждат серийно, за да се получат 7 опитни концентрации. Обикновено, най-високата крайна концентрация на опитното съединение е 100 μΜ и се използва разреждане 1:3 (т.е., крайната концентрация на опитното съединение е в границите 0.137-100 μΜ).

4. След 18 часа активиране на лиганда, се добавят по 12.5 μΙ във всяко гнездо от разредения реагент за белязане на BrdU (1:100 в RPMI, 0.1% BSA) и клетките се инкубират с BrdU (крайна концентрация 10 μΜ) в продължение на 1.0 час.

5. Също, както в основната процедура.

6. Също, както в основната процедура.

7. Блокиращият разтвор се отстранява чрез декантиране и гнездата се изплакват веднъж с PBS. Анти-BrdU-POD разтвор (1:100 разреждане в PBS, 1% BSA) се добавя (50 μΙ/гнездо) и паничката се инкубира 90 минути при стайна температура върху клатачка.

8. Също, както в основната процедура.

• ·

- 254 -

9.

Също, както в основната процедура.

10.

Също, както в основната процедура.

HUV-EC-C опит

Този опит се използва за измерване на действието на съединенията по отношение на

PDGF-R

FGF-R, VEGF, aFGF или Flk-1/KDR, всеки от които е естествено експресиран от

HUV-EC клетки.

ДЕН 0

1. Изплакват се и се трипсинизират HUV-EC-C клетки (човешки умбиликални венозни ендотелиални клетки, American

Type Culture Collection, каталожен N9 1 730 CRL). Изплакват се с фосфатно-буфериран солев разтвор на Dulbecco (D-PBS, получен от Gibco BRL, каталожен N° 14190-029) два пъти при около 1 ml/10 cm² от колба за клетъчна тъкан. Трипсинизира се с 0.05% трипсин-ЕДТА в разтвор с неензимна клетъчна дисоциация (Sigma Chemical Company, каталожен № С-1544). 0.05% трипсин се приготвя чрез разреждане 0.25% трипсин/1 тМ ЕДТА (Gibco, каталожен N° 25200-049) в разтвор с клетъчна дисоциация. Трипсинизира се с около 1 ml/25-30 cm² на колба за клетъчна тъкан за около 5 минути при 37°С. След като се отделят клетките от колбата, се добавя равен обем от опитната среда и се прехвърля в 50 ml стерилна центрофужна епруветка (Fisher Scientific, каталожен N9 05-539-6).

2. Клетките се изплакват с около 35 ml опитна среда в 50 ml стерилна центрофужна епруветка чрез добавяне на опитната среда, центрофугира се 10 минути при приблизително 200х д, супернатантата се аспирира и се ресуспендира с 35 ml D-PBS. Изплакването се повтаря още два пъти с D-PBS, ресуспендират се клетките в около 1 ml опитна среда/15 cm² от колба

- 255 за тъканна култура. Опитната (Gibco BRL, каталожен № инактивиран преброяват с добавя трация

3.

•··· ·· · • · · ·· • · · · · · • · · · · ··«· • · · · ·· * · · · · ·· ·· • · · ·· ·♦ среда се състои от F12K среда

21227-014) и 0.5% топлинноембрионален

Counter® (Coulter Electronics, Inc.) и се волски серум. Клетките се

Coulter опитна среда от 0.8-1.0 х 10⁵

Добавят се към клетките, за да се получи конценклетки/ml.

клетки в 96-гнездови плоскодънни па-

нички с 10 μΙ/гнездо или 0.8-1.0 х 10⁴ клетки/гнездо, инкубират се приблизително 24 часа при 37°С, 5% СО₂.

ДЕН 1

1. Правят се две титрувания на опитно съединение в отделни 96-гнездови панички, обикновено 50 μΜ низходящо до 0 μΜ. Използва се същата опитна среда, както е спомената за ден 0, етап 2 по-горе. Правят се титрувания чрез добавяне на 90 μΙ/гнездо от опитно съединение с 200 μΜ (4Х крайната концентрация за гнездо) в най-първото гнездо в определена колона на паничката. Тъй като изходното опитно съединение е обикновено 20 mM в ДМСО, 200 μΜ лекарствена концентрация съдържа 2% ДМСО.

Разредител с до 2% ДМСО в опитна среда (F12K + 0.5% ембрионален волски серум) се използва като разредител за титруванията на опитното съединение, за да се разреди опитното съединение, но да се запази концентрацията на ДМСО постоянна. Този разредител се добавя към останалите гнезда в колоната при концентрация 60 μΙ/гнездо. Вземат се 60 μΙ от 120 μΙ на 200 μΜ разреждане на опитно съединение в найпървото гнездо на колоната и се смесват с 60 μΙ във второто гнездо на колоната. Вземат се 60 μΙ от това гнездо и се смесват с 60 μΙ в третото гнездо на колоната и така нататък, докато завършат двукратните титрувания. Когато се смеси предпос- 256 • · ·« · ♦ ···· · · · • · · · ·· · ··· • · ·· · · · ···· • ·· · · · * · · · 9 9999

9 99 99 9 9 9 9 9 ледното гнездо се вземат 60 μΙ от 120-те μΙ в това гнездо и се изхвърлят. Оставя се последното гнездо с 60 μΙ от разредителя

ДМСО/среда, като контрола, несъдържаща опитно съединение. Правят се 9 колони от титрувани опитни съединения, достатъчни за трикратни опити с гнездата, като всеки е за: (1)

VEGF (получен от Pepro Tech Inc., каталожен № 100-200, (2) ендотелиално клетъчен растежен фактор ((ECGF) (известен също като киселинен фибробластен растежен фактор, или aFGF) (получен от Boehringer Mannheim, Biochemica, каталожен № 1439 600) или (3) човешки PDGF В/В (1276-956, Boehringer Mannheim, Германия) й контролна опитна среда. ECGE се използва като препарат с натриев хепарин.

2. Прехвърлят се по 50 μΙ/гнездо от разрежданията на опитното съединение в 96-гнездови опитни панички, съдържащи 0.8-1.0х10⁴ клетки/100 μΙ/гнездо от HUV-EC-C клетките от ден 0 и се инкубират приблизително 2 часа при 37°С, 5% СО₂

3. В три успоредни проби се добавят 50 μΙ/гнездо от 80 ug/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF или контролна среда за всяко условие на опитно съединение. Както и при опитните съединения, концентрациите на растежния фактор са 4Х желаната крайна концентрация. Използва се опитната среда от ден 0 етап 2, за да се получат концентрациите на растежните фактори. Инкубират се приблизително 24 часа при 37°С, 5% СО₂. Всяко гнездо ще има по 50 μΙ от разреждане на опитното съединение, 50 μΙ растежен фактор или среда и 100 μΙ клетки, които се изчисляват общо като 200 μΙ/гнездо. Така, 4Х концентрациите на опитното съединение и растежните фактори става 1X, след като всичко е добавено към гнездата.

- 257 -

&ΕΗ.2

1. Добавя се ³Н-тимидин (Amershsm, каталожен № TRK

686) с концентрация 1 цСИ/гнездо (10 μΙ/гнездо от 100 μθί/ml разтвор, приготвен в

RPMI среда + 10% топлинно-инактивиран ембрионален волски серум) и се инкубира приблизително 24 часа при 37°С, 5% СО₂. RPMI е получен от Gibco BRL, каталожен № 11875-051.

ДЕН 3

1. Паничките се замразяват една нощ при -20°С.

ДЕН 4

Размразяват се паничките и клетките гнездов колектор на търни мрежи (Wallac клетки (Tomtec Harvester се събират

96®) върху с 96филкаталожен № 1205-401), върху Wallac Betaplate™ течен сцинтилационен отчита се брояч.

броя

В Таблица 2 са дадени резултатите от биологичното изследване на някои примерни съединения с формула (I). Резултатите са дадени по отношение на 1С₅₀, микромоларната (μΜ) концентрация на изследваното съединение, което предизвиква 50% изменение в активността на изследваната РКТ, в сравнение с активността на РТК в контрола, в която не е добавено опитно съединение. По-точно, представените резултати показват концентрацията на опитно съединение, която е необходима за да се получи 50% понижаване на активността на въпросната РТК. Биоанализи, които са или могат да бъдат използвани за преценяване на съединенията, са описани подробно по-долу.

• · ···· • · ·· ·· ···· ·· · · ···· ·· · ···· • · · ··· · · · · ····· ···· · · · · ·· · • · ·· ·· · · · · ·

- 258 ТАБЛИЦА 2

Пример	Био FlkGST 1С₅₀ (μΜ)	Био FGFR 1 IС₅₀ (μΜ)	Био EGF IС₅₀ (μΜ)	Био FlkGST IC5Q (μΜ)	Клетъчна EGF IC50 (μΜ)	Her2 Киназа IС ₅₀ (μΜ)	cdk2- spa IC50 (μΜ)	Био Pyk2 IC50 (μΜ)
1	57.68	15.16	>100	>100	>100			>100
2	>100		>100	>100	>100
3	9.85	9.62	>100	>100	>100			>100
4	3.57	>20	>100	>100	>100	>100
5	8.3	1 6.06	>100	>100	>100	>100
6	4.04		>100	3.26	7.82	2.43
7	7.74		>100	5.07	9.8	4.24
8	12.1		>100	51 .34	20.08	5.5
9	0.96		>100	>100	>100	16.38
10	5.72		>100	94.04	15.86	8.06
11	9.77		>100	>100	>100	>100
12	>20		21 .46	>100		27.73
13	>20		81 .92	8.17		2.66
14	13.01		42.41	>100		66.02
15	>20		>100	>100		98.61
16	>20		98.06	>100		23.32
17	8.25	2.47	94.35	0.83	1 1 .47	15.94	>10
18	2.67			2.57	9.23	4.99
19	7.5			6.86	34.1 8	8.37
20	11.53			>100	41 .16	8
21	7.18		>100	40.34		27.69
22	>20		>100	>100		87.67
23	>20		>100	36.64		4.05
24			>100	16.84		5.31

• · ····

- 259 • * · · ·· · · « · • · ·· · · · · · · · • ·· · · · · ··« · · · · ·

Пример	Био FlkGST I С50 (μΜ)	Био FGFR 1 IС₅₀(μ Μ)	Био EGF IC₅₀(μΜ)	Био FlkGST ic₅₀ (μΜ)	Клетъчна EGF IC_5O (μΜ)	• · · Her2 Киназа IС50 (μΜ)	» Fl F Γ cdk2- spa IC50 (μΜ)	-------y,--- Био Pyk2 IC50 (μΜ)
25	12.55		>100	23.48		7.9
26	16.03		66.87	34.67		10.04
27			>100	26.5		3.91
28	4.5		71 .27	53.66		2.67
29	10.12		>100	26.72		3.98
30	9.4		>100	18.69		4.1
31	>50		>100	9.83		47.19
32	45.74		5.94	>100		>100
34	>50		>100	>100		>100
35	>20		>100	80.4		54.14
36	>20		>100	>100		>100
37	0.22 '		3.06	1 0.78	9.84	1 .4
38	4.17		3.06	6.04	8.97	2.16
39	3.38		4.69	3.67	14.54	3.53
40	4.5		7.9	6.52		6.27
42	0.1		0.12	1 1.95	74.55	20.43
43	1 .12		8.38	>100	37.33	53.37
44	<0.05		0.02	20.73	67.46	6.99
45	1 .71		>100	>100	29.95	>100
46	30.62		6.18	>100	>100	>100
47	0.08	1.56	0.06	11.42	41.54	8.4	>20	1.05
48	0.006	0.3	<0.78	17.88	21 .58	7.93		0.09
49			<0.78	>100	43.86	>100
50			<0.78	>100	20.34	>100
51	0.006	1 .66	0.01	18.1	21 .61	23.24	16.69	0.35
52	0.08	1 .26	<0.78	12.53	>100	>100	10.66	0.45

• · ·· · ♦ · ··· · · • · · · ·· · · · · ···· · · · · · · · • ·· ··· · 9 9 9 · ····

Пример	Био FlkGST IC50 (μΜ)	Био FGFR 1 IC50 (μΜ)	Био EGF IC50 (μΜ)	I— 0 и ° ζ? ^s 0 n LQ — <5 LL	Клетъчна EGF IC₅₀ (μΜ)	He?2 * Киназа IC₅₀(μΜ)	‘ cdk’Sspa IC50 (μΜ)	r- ·· Био Pyk2 IC₅₀ (μΜ)
53			<0.78	>100	>100	>100
54	1.98		<0.78	23.88	9.76	7.02
55	0.27		0.53	6.03	35.99	77.82
56	2.32		3.19	>100	10.03	7.1 1
57	0.06		7.98	>100	9.97	6.94
58			21.14	>100	>100	>100
59			<0.78	>100	>100	>100
60			<0.78	>100	>100	>100
61			<0.78	>100	>100	>100
62	8.00		8.32	>100	>100	>100
63	0.21		<0.78	8.59	>100	>100
64	0.55		<0.78	30.49	>100	>100
65	0.37		<0.05	>100	74.36	15.97
66	<0.05			>100	11.84	2.76
67	0.39		24.77	31.38	19.79	2.56
68	1.16		0.03	>100	23.52	34.13
69	0.3		56.55	>100	97.54	>100
70	0.09	1 .50	0.0030	10.57	6.42	7.99	1 2.62	0.63
71	15.21		22.5	>100		9.91
72	6.06		10.54	>100	39.94	9.65
73	5.95		14.12	>100	39.5	8.59
74	1.2		0.09	46.75		>100
75	2.7		61 .55	>100		>100
76	3.33		19.18	5.11		3.01
77	0.49		25.01	>100		>100
78	1.94		70.62	9.33		4.25

Μ »·»·

- 261

·· · · 4 · · · ··· • · ·· ·· « · · · · • · · 4 · 4 · 4 4 4 · ···· « » · 4 4 4 4 4 ·· ·

Пример	Био FlkGST IC50 (μΜ)	Био FGFR 1 ic₅₀(μΜ)	Био EGF IC50 (μΜ)	Био FlkGST IC₅₀ (μΜ)	Клетъчна EGF IC₅₀ (μΜ)	------------------------------------j Her2 Киназа IC50 (μΜ)	-4----------4-4------4- cdk2spa IC50 (μΜ)	>------4-4— Био Pyk2 IC₅₀(μΜ)
79	1.49		>100	27.39		>100
80	0.13	4.29	0.001	>100		50.19	17.19	0.28
81	0.21		0.18	>100		>100
82	2.03	7.69	6.88	>100		>100		0.31
83	0.34	0.41	9.46	2.18		86.9		0.008
84	1.38		12.51	67.2		5.86		0.006
85	0.2	0.8	2.59	>100		3.76
86	1 .45	1 .3	19.6	41 .8		>100	•	3.58
87	3.27	7.56	6.46	>100		9.1		0.17
88	0.35	1 .18	8.06	2.36		>100		0.09
89	7.84		47.58	8.53	9.67	15.97
115	7.3		7.48	>100		>100	0.006
116	>20		>100	>100		>100	<0.0005
117	0.91		12.9	>100		>100	0.006
118	1.93		1 .2	>100		>100	0.002
119	1 .38		61 .63	>100		>100	<0.0005

IN VIVO МОДЕЛИ C ЖИВОТНИ

ЖИВОТИНСКИ МОДЕЛИ С КСЕНОТРАНСПЛАНТАТ

Способността на човешки тумори да нарастват като ксенотрансплантати в атимични мишки (например, Balb/c, nu/nu) дава полезен in vivo модел за изследване на биологичния отговор към лечение на човешки тумори. Първата успешна ксенотрансплантация на човешки тумори в атимични мишки (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand.

77:758-760), много различни човешки туморни клетъчни линии

- 262 ·* ·· ·· --···· ·· · ···· ф · · · · · * ··· ····· • · · · · · · · · · · ·· ·· ·· · · ·· · (например, гръден, белодробен, урогенитален, стомашно-чревен меланом, меланом на главата и врата, глиобластом, костен и злокачествен меланоми) са трансплантирани и успешно се развиват у голи мишки. Следващите опити мотаг да се изспецифичността степента на действие, ползват за определяне и ефекта на различните

Три основни типа съединения с формула (I).

опити се използват за преценяване на съединения с формула (I):

клетъчно/каталитичен, клетъчно/биологичен и in vivo. Целта на клетъчно/каталитичните опити е на съединение с формула (I) върху да се определи влиянието способността на ТК да фосфорилира тирозини върху известен субстрат в клетка. Целта на клетъчно/биологичните опити е да се определи влиянието на съединение с формула (I) върху биологичния отговор, предизвикан от ТК в клетка. Целта на in vivo влиянието на съединение с формула опитите е да се определи (I) в животински модел на определено заболяване, като рак.

Подходящи клетъчни линии за експерименти със са С6 клетки (глиома, АТСС № CRL 1619), А431 субку№ CCL клетки клетки клетки (простатни, АТСС № танен ксенотрансплантат

107), А375 клетки (меланом, АТСС (епидермоиден карцином, АТСС N° (белодробни, АТСС № НТВ 56), РСЗ

CRL 1435), SKOV3TP5 клетки и NIH ЗТЗ фибробласти, генетично създадени да свръхекспресират EGFR, PDGFR, IGF-1R или всяка друга опитна киназа. Следващият протокол може да се из ползва за провеждане

Женски атимични

Simonsen Laboratories на опитите с ксенотрансплантат:

мишки (BALB/c, nu/nu) се доставят от (Gilroy, СА). Всички животни се държат в условия на чисто помещение в микроизолаторни клетки с Alpha-dri постеля. Те получават стерилна храна за гризачи и вода, колкото е необходимо.

- 263 9 9 9 999

Клетъчни

9 · · • · · · · • · · · · • · · 9 · · • · · · · • · · · линии се посяват в подходяща среда (като наDMEM, Ham’s

F10 или

Ham’s F12 плюс

5%-10% ембрионален волски серум (FBS) и mM глутамин (GLN)).

Всички клетъчни хранителни среди глутаминът и ембрионалният волски серум се доставят от

Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), ако не е казано друго. Всички клетки се култивират във влажна атмосфера с 90-95% въздух и 5-10% СО₂ при 37°С. С всички клетъчни линии рутинно се правят пасажи два пъти в седмицата и са отрицателни за микоплазма, както е определена по метода Mycotech (Gibco).

Клетките се събират при или'близо до сливане с 0.05% трипсин-ЕДТА и се утаяват с 450 х g в продължение на 10 ми нути. Плътните утайки се ресуспендират в стерилен PBS или хранителна среда (без FBS) до определена концентрация и клетките се имплантират в задния хълбок на мишките (8-10 мишки в група, 2-10 х 10⁶ клетки/животно). Туморното нарастване се измерва за период от 3 до 6 седмици, като се използват дебеломери за вени. Туморните обеми се изчисляват като резултат от дължина х широчина х височина, ако не е ка-

зано друго. Р-стойности се изчисляват, като се използва tтеста на Стюдънт. Опитни съединения с формула (I) в 50-100 ,uL пълнител (ДМСО или VPD:D5W) могат да се дозират чрез интраперитонеално (i.p.) инжектиране с различни концентрации, като обикновено се започва на следващия ден след имплан тирането.

МОДЕЛ НА ТУМОРНА ИНВАЗИЯ (ТУМОРНО НАРАСТВАНЕ)

Следващият модел на туморно нарастване е разработен и може да се използва за преценяване на терапевтична стой • · · * · · ност и ефикасност на съединенията с формула (I), за които е установено, че инхибират селективно KDR/FLK-1 рецептор.

Процедура

Като опитни животни се използват голи мишки (женски) на възраст 8 седмици (Simonsen Inc.). Имплантирането на ту морни клетки може да стане в ламинарен аспирационен поток. За анестезия се прилага интраперитонеално ксилазин/кетамин коктейл (100 mg/kg и 5 mg/kg ксилазин). Прави се разрез по средната линия, за да се открие коремната кухина (приблизително 1.5 cm дълъг) и да се инжектират 10⁷ туморни клетки в обем от 100 μι среда. Клетките се инжектират или в дуоденалния дял на панкреаса или под сероза на колона. Перитонеумът и мускулите се затварят с 6-0 непрекъснат копри нен шев и кожата се затваря с използване на щипки за рани. Животните се наблюдават през деня.

Анализ

След 2-6 седмици, в зависимост от продължителността на наблюденията на животните, мишките се умъртвяват и локалните туморни метастази на различни органи (бял дроб, черен дроб, мозък, стомах, далак, сърце, мускул) се изрязват и анализират (измерва се туморния размер, степента на нарастване, имунохимия, определя се in situ хибридизация и други).

С KIT опит

Този опит се използва, за да се определи степента на сkit тирозиново фосфорилиране.

М07Е (мъжка остра миелоидна левкемия) клетки се оставят с недостиг на серум една нощ в 0.1% серум. Клетките се обработват предварително със съединението с формула (I) (едновременно с прилагането на серумен недостиг), преди стимулирането с лиганд. Клетките се стимулират с 250 ng/ml е» · · « ·

- 265 rh-SCF за 15 минути. След стимулирането, клетките се лизират

и имуноутаяват с анти-с-kit антитяло. Определя се съдържанието на фосфотирозин и протеин посредством Westernблотинг.

ОПИТ С МТТ ПРОЛИФЕРАЦИЯ

М07Е клетки се оставят бедни на серум и се обработват предварително със съединение с формула (I), както е описано за опитите с фосфорилирането. Клетки се посяват @ 4Х10⁵клетки/гнездо в 96-гнездова паничка, в 100 μΙ_ RPMI + 10% серум. Добавя се rh-SCE (100 ng/mL) и паничката се инкубира в продължение на 48 часа. След 48 часа, се добавят 10 μΙ_ от 5 mg/ml МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил] тетразолиев бромид) и се оставя да се инкубира 4 часа. Добавя се киселинен изопропанол (100 μΙ_ 0.04Ν HCI в изопропанол) и се измерва оптичната плътност при дължина на вълната 550 nm. ОПИТ С АПОПТОЗА

М07Е клетки се инкубират +/-SCF и +/- съединение с формула (I) в 10% FBS с rh-GM-CSF (10 ng/mL) и rh-IL-3 (10 ng/mL). Пробите се изследват на 24-тия и 48-тия час. За да се измери активираната caspase-З, пробите се промиват с PBS и се правят проницаеми с ледно-студен 70% етанол. След това, клетките се оцветяват с РЕ-конюгирана поликлонална заешка анти-активна caspase-З и се анализират чрез FACS. За да се определи разцепена PARP, пробите се лизират и се анализират чрез western-блот с анти-PARP антитяло.

Допълнителни опити

Допълнителни опити, които могат да се използват за оценяване на съединенията с формула (I), включват, без ограничение, био-flk-l опит, опит с EGF рецептор-НЕВ2 химерен рецептор в цели клетки, био-src опит, био-lck опит и опит, опре• · • · · 4 · • «

- 266 • · · · ·· · · · · делящ фосфорилиращата функция на raf. Протоколите за всеки от тези опити могат да се намерят в заявка за патент на САЩ сер.№ 09/099,842, която е цитирана тук, включително и чертежи.

Измерване на клетъчна токсичност

Терапевтичните съединения трябва да бъдат по.ефикасни за инхибиране активността на рецепторна тирозинкиназа, в сравнение с цитотоксичния ефект, който проявяват. Измерването на ефективността и клетъчната токсичност на съединение може да стане чрез определяне на терапевтичния индекс, т.е., IC50/LD50. 1С₅₀, дозата, необходима, за да се постигне 50% инхибиране, може да се определи по стандартни методи, като тези, описани тук. LD₅₀, дозата, която води до 50% токсичност, може да се определи, както чрез стандартни методи, така и (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), чрез измерване на количеството освободен LDH (Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), или чрез

измерване на леталната доза в животински модели. Предпочитат се съединения с по-висок терапевтичен индех. Терапевтичният индекс трябва да бъде над 2, за предпочитане наймалко 10 и още по-добре, най-малко 50.

Пример с резултати от клетъчен опит с използване на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетилами но-етил)амид (Съединение 80)

За да се потвърди силата на действие на 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил и денметил)-2,4-ди метил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение • · • · · ·

- 267 -

80), установена в биохимични опити (виж по-долу), се преце нява способността на съединението да инхибира лиганд-за висимо RTK фосфорилиране, с използване на NIH-3T3 миши клетки, предназначени да свръхекспресират Flk-1 или човешки

PDGFRp. 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино етил)-амид (Съединение 80) инхибира VEGF-зависимо Flk-1 ти розиново фосфорилиране със стойност за 1С₅₀ приблизително 0.03 μΜ. Тази стойност е подобна на 0.009 μΜ К< стойност, определена за инхибиране на Flk-1 от 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидроиндол-3-ил иденметил)-2,4-диметил-1 Н-п и рол-3-карбок силна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80), определено в биохимични опити. Това показва, че 5-(5-флуоро-

3- карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) бързо прониква в клетки. В съответствие с биохимичните резултати (виж по-долу), показващи, че 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) има сравнима активност по отношение на Flk-1 и PDGFRp, е намерано още, че съединението инхибира PDGF-зависимо рецепторно фосфорилиране в клетки със стойност за 1С₅₀ приблизително 0.03 μΜ. Способността на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2д ихи дрои ндо л-3-и л иден метил)-2,4-ди метил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) да инхибира c-kit, много близката RTK, която свързва стволов клетъчен фактор (SCF), се определя, като се използват М07Е клетки, които експресират този рецептор. В тези клетки, 5-(5флуор о-2-о кс о-1,2-дихи дрои ндол-3-и ли ден метил )-2,4-д и мети л1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид • » · · (Съединение 80) инхибира SCF-зависимо c-kit фосфорилиране със стойност за 1С₅₀ 0.01 -0.1 μΜ. Това съединение инхибира, също, SCF-стимулирано c-kit фосфорилиране в бластни клетки на острамиелоидна левкемия (AML), изолирани от периферната кръв на болни.

В допълнение към изследването на способността на 5-(5флуоро-2-оксо-1,2-д и хи д рои н дол-3-и ли ден метил)-2,4-ди метил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) да инхибира лиганд-зависимо рецепторно

фосфорилиране в клетки, е изследвано също in vivo неговото влияние върху лиганд-зависим пролиферативен отговор на клетки (виж Таблица 4). В тези изследвания, клетки, станали латентни чрез престояване една нощ с недостиг на серум, се индуцират да претърпят ДНК синтез при добавяне на подходящия митогенен лиганд. Както е показано в Таблица 3, 5-(5 флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) инхибира PDGF-индуцираната пролиферация на NIH-3T3 клетки, свръхекспресиращи PDGFR|3 или PDGFRa със стойности за 1С₅₀ 0.031 и 0.069 μΜ, съответно, и SCF-индуцираната пролиферация на М07Е клетки със стойност за 1С₅₀0.007 μΜ.

• 4 • · · ···

- 269 • · ··· · · · · · · ··· ·· · · · · · • · · · · · ♦ · » · · · · • ·· · · ·· ·

ТАБЛИЦА 3

Рецептор	Биохимичен	Ю50
Ki (μΜ)	Рецепторно фосфорилиране (μΜ)	Лиганд-зависима Пролиферация (μΜ)
Flk-1/KDR	0.009	0.03²	0.004³
PDGFRcz	0.008	0.03⁴	0.031⁴
PDGFRp	ND	ND	0.069⁵
FGFR	0.83	ND	0.7³
c-kit	ND	0.01-0.1⁶	0.007⁶

’Определена с използване на рекомбинантен ензим ²Определена с използване на бедни на серум

ΝΙΗ-3Τ3 клетки експресиращи

Flk-1.

³Определена с използване на HUVE клетки.

⁴Определена с използване на бедни на серум

NIH-3T3 клетки експресиращи

PDGFR.

⁵Определена с използване на бедни на серум клетки експресиращи

PDGFR.

⁶Определена с използване на М07Е клетки.

Както е показано в Таблица 3, има принципно съответствие между биохимичното и клетъчното действие на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80), подкрепящо извода, че това съединение преминава през клетъчни мембрани. Освен това, прави заключение, че клетъчните отговори действието на съединение 80 по отношение на може да се наса резултат от посочената цел.

· •Г ···· ···· · · · · ···· ·· · · · · ·

- 270 - :··:· •· ·· ·· ·· ·· ·

Обратно, когато изследването е в присъствието на пълна хранителна среда in vitro, са необходими значително по-високи концентрации от 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-2,4-диметил-1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2диетиламино-етил)амид (Съединение 80) (>10 μΜ), за да се инхибира развитието на различни човешки туморни клетки (виж Таблица 4). Тя показва, че съединението не инхибира директно развитието на тези клетки при концентрации, необходими за инхибиране на лиганд-зависимо рецепторно фосфорилиране и клетъчна пролиферация.

ТАБЛИЦА 4

Клетъчна линия	Произход	IС₅₀ (μΜ)	ld₅₀ (μΜ)
НТ29	Карцином на колона	10	22
А549	Белодробен карцином	9.5	22
NCI-H460	NSC белодробен карцином	8.9	20
SF767T	Глиом	7.9	14
А431	Епидермоиден карцином	6.0	18

Накратко, резултатите, дадени в Таблица 4, се получават чрез инкубиране на клетки за 48 часа в пълна хранителна среда в присъствието на серийни разреждания на 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 /7-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид. В края на растежния период се определя сравнителен брой клетки. 1С₅₀ ·· · · ···· · · ···· · · · · · · ···· ·· · · · · ·

- 271 - ··:· • · · · ·· ·· ·· · стойности се изчисляват като концентрацията на съединение, което инхибира развитието на клетки с 50% в сравнение с неретирани контроли. LD₅₀ стойности се изчисляват като конценрацията на съединение, която причинява 50% намаляване на броя на клетки в сравнение с този в началото на опита.

По-релевантен клетъчен опит, в който за преценяването на анти-ангиогенния потенциал на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-ил иден метил )-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) се прилага in vitro опит с митогенезис, с използване на човешки умбил.икални венозни ендотелиални клетки (HUVECs) като моделна система за ендотелиалната клетъчна пролиферация, критична за ангиогенния процес. В този опит, митогенен отговор, измерен като усилване на ДНК синтеза, се индуцира в HUVECs, които са бедни на серум, при добавяне на VEGF или FGF. В тези клетки, 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-Зилиденме-тил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетил-амино-етил)амид (Съединение 80) инхибира VEGF- и FGF- провокирания митогенен отговор по начин, зависещ от дозата, с 1С₅₀ стойности 0.004 μΜ и 0.7 μΜ, съответно, когато съединението присъства през цялото време на 48-часовия опит.

Накратко, по-горе споменатите резултати се получават, като се използват клетки HUVE, бедни на серум, които се инкубират с митогенни концентрации от VEGF (100 ng/ml) или FGF (30 ng/ml) в присъствието на серийни разреждания на 5(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихид рои ндол-3-и ли ден метил )-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) в продължение на 24 часа. Митогенният отговор през следващите 24 часа, в присъствието на

- 272 лиганд и инхибитор ване на ДНК синтез ·· ·· ·· ···· ·9 ···· ·· · · · · • · ·· · · 9···· * ·· ··· · · · · · ···· • · · · · · · · · · · ·· ·9 99 · · ··· се определя количествено чрез измер базиран върху включване на бромодеоксиуридин в клетъчна

ДНК.

В отделни опити, съединение 80 инхибира VEGF-зависимо фосфорилиране на ERK 1/2 (р42/44МАР киназа) в ранна downstream мишена на хибиращото действие продължително в тази пролиферация на ERK

Flk-1/KDR в зависимост от дозата. Ин на съединение 80 се установи, че е система; инхибирайки VEGF-зависима

1/2 в продължение на 48 часа след от страняване на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиден тиламино-етил)амид (Съединение 80) от средата, след кратко микромоларни концентрации на съединението.

Установено е, че VEGF е важен фактор за жизнеспособността на ендотелиални клетки. Тъй като 5-(5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 /7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) инхибира VEGF-зависимия митогенен отговор на HUVECs, се изследва влиянието на съединението върху жизнеспособността на HUVEC. В тези опити, разцепването на caspase 3 субстрат поли-АОР-рибозилполимераза (PARP) се използва за разчитане на апоптоза. HUVECs, култивирани в условия без серум в продължение на 24 часа показват значително разцепване на PARP, както се установява чрез акумулирането на 23kDa PARP фрагмент от разцепването. Това до голяма степен се предотвратява чрез добавянето на VEGF в клетъчната среда, показвайки, че VEGF действа като фактор на жизнеспособност в този опит. Установено е, че 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихид рои н дол-3-и ли ден метил)-2,4-д и метил-1 /7-пирол-З-карбок• · · ·♦·

- 273 - силна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) ин хибира KDR сигнализиране. Следователно, 5-(5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 /-/-пирол-3-кар боксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) инхибира VEGF-медиирана жизнеспособност на клетки HUVE в зависимост от дозата. Тези данни показват че съединение 80

индуцира апоптоза в ендотелиални клетки в култура в присъствието на VEGF.

С. In vivo изследвания за ефикасност

i. Ефикасност по отношение на установени туморни ксенотрансплантати

In vivo ефикасността на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 /-/-пирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) се изследва с модели на подкожен (SC) ксенотрасплантат с използване на човешки туморни клетки, имплантирани в областта на тирането, mm³ преди да туморите се оставят да достигнат размер 100-550 започне лечението през устата със съединението.

Ежедневно перорално прилагане на съединение 80 води дозата инхибиране развитието на тумор А431, когато третирането започне след като туморът е нарастнал до

400 mm³. Статистически значимо (Р<0.05) инхибиране на ту морно развитие се наблюдава при дози от 40 mg/kg/дневно (74% инхибиране) и 80 mg/kg/дневно (84% инхибиране) (виж Таблица 6). В предварителни опити, по-висока (160 mg/kg/дневно) доза от съединението не е била по-ефикасна срещу установени А431 тумори, в сравнение с доза от 80 mg/kg/дневно. Освен това, мишки, третирани с доза от 160 mg/kg/• ·

- 274 - • ··· 9'9 · · ·· • ·· 9 9 9 · 9 · 9 · · 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· • 9 99 99 99 99 дневно от съединението, губят телесно тегло, което показва, че по-високата доза не се понася добре. Подобни резултати се получават в опит, в който А431 тумори са оставени само да достигнат размер 100 mm³ (виж Таблица 4). В този втори опит, пълна регресия на туморите настъпва при 6 от 8 животни, третирани с 80 mg/kg/дневно в продължение на 21 дни. При тези шест животни, туморите не са възстановили размера си през период на наблюдение от 110 дни, след края на третирането. При двете животни, у които туморите са нарастнали значително повторно (2000-3000 mm³), туморите регресират в отговор на втора серия третиране със съединение 80. От значение за всички опити за ефикасност е, че 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидроиндол-З-ил иденметил)-2,4-диметил-1 /7-пирол-Зкарбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80), приложено в доза 80 mg/kg/дневно се понася добре, дори когато дозирането продължава непрекъснато повече от 100 дни.

ТАБЛИЦА 5

Начален обем на тумора (mm³)	Съединение¹ (mg/kg/дневно)	% Инхибиране (дневно)	Р-стойност
400	80	84 (36)	0.001
40	74 (36)	0.003
20	51 (36)	0.130
100	80	93 (40)	0.002
40	75 (40)	0.015
10	61 (40)	0.059
'Съединение 80

·· ·9 ···· · · • · · · ·· · ··· ГЧ-, Г- ···♦ ··· ····

- 275 - ....... ·♦::··:

• · · · · · · · ·· · • ••· ·· · · ·· ·

Накратко, резултатите, дадени в Таблица 5, са получени с използване на А431 клетки (0.5 х 106 клетки/мишка), които са имплантирани подкожно (SC) в областта на задния хълбок на атимични мишки. Ежедневно перорално прилагане на 5-(5флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил1/7-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80) във вехикулум на база Cremophore или контролен вехикулум, започва, когато туморите достигнат посочения среден обем. Туморите се измерват с венозен дебеломер и туморният обем се изчислява като резултат от дължина х широчина х височина. Р-стойностите’се изчисляват чрез сравнение на размера на туморите за животни, третирани със съединение 80 (п = 8) с такива животни, които са третирани с вехикулум (п = 16) през последния ден от опита, като се използва t-теста на Стюдънт с две отклонения.

Ефикасността на съединение 80 по отношение на установени човешки тумори с различен произход се определя, като се използват Colo205 (карцином на колона), SF763T (глиом) и NCI-H460 (едроклетъчен белодробен карцином) ксенотрансплантати (виж Таблица 6). Тези опити са проведени с 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Нпирол-3-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид (Съединение 80), приложено през устата в доза 80 mg/kg/дневно; доза, която е ефикасна и се понася добре.

♦ ♦ ···· ·· ·· • · · · ·· • · ·· · · • · · · · ·· • · · · ·· ·· ·· ··

- 276 ТАБЛИЦА 6

	Туморен тип	Начален обем на тумора (mm³)	% Инхибиране (дневно)	Р- стойност
А431¹	Епидермоиден	100	93 (40)	0.002
А431¹	Епидермоиден	400	84 (36)	0.001
Colo205	На колона	370	77 (54)	0.028
NCI-H460	Белодробен	300	61 (54)	0.003
SF763T	Глиом	550	53 (30)	0.001
¹Данните са от опита, даден в таблица 5.

В гореспоменатите опити, съединение 80 се прилага веднъж дневно в доза 80 mg/kg във вехикулум на база Cremophor, след като туморите достигнат указания размер. Процентното инхибиране в сравнение с контролната група, третирана с вехикулум, се изчислява в края на опитите. Рстойностите се изчисляват чрез сравнение на туморни размери на животните, третирани със съединението с туморни размери на тези животни, които са третирани с вехикулума, като се използва t-теста на Стюдънт с две отклонения.

Въпреки, че 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-З-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2диетиламино-етил)амид (Съединение 80) инхибира развитието на всички типове тумор, показани в Таблица 7, има разлика в отговора на различните модели на ксенотрансплантат. Поконкретно, развитието на тумори NCI-H460 и SF763T се спира или в голяма степен се забавя, докато Colo205 тумори, като А431 тумори, регресират при третиране с 5-(5-флуоро-2-оксо• · ··»♦ ·· ·· • · · · · · · ··· ···· · · · ··· ”277- · 5 * J ί· ί ’ ί Г ·· ·· ·· · · ··

1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 /-/-пирол-3карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид.

За да се определи молекулната база за разликата в отговора между ксенотрансплантатните модели се изследват SF763T туморите. Следователно, SF763T тумори, които са с послаб отговор към третирането с 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-диетиламино-етил)амид, се преценяват на молекулно ниво с използване на имунохистологични методи за определяне на ефекта от третиране със съединението. Тези изследвания се провеждат първоначално с този туморен тип, тъй като SF763T тумори са силно васкулозни с микросъдове, които силно експресират ендотелиалния клетъчен маркер CD31 и от тук са подходящи за изследване на туморна микросъдова плътност (MVD). Имунохистологична преценка на SF763T тумори показва, че тумори от третирани животни имат понижена микросъдова плътност в сравнение с контролите, третирани с вехикулум, което е в съответствие с анти-ангиогенния механизъм на действие за съединение 80; MVD е 24.2 ± 4.1 за животни, третирани със съединение 80, в сравнение с 39.3 ± 5.7 за животни, третирани само с вехикулум. Както се очаква от свързаното спиране на туморното развитие, подчертано инхибиране на туморно-клетъчна пролиферация е очевидно за тумори, които са третирани със съединение 80. Тези тумори имат половината от митотичния индекс на такива тумори, кои то са третирани с вехикулум (няма показани данни). Влиянието на съединение 80 върху MVD и туморно-клетъчна пролиферация показва, че съединението има силно анти-ангиогенно и анти-туморно действие, дори при условия, в които туморите не регресират.

- 278 -

Способността на съединение 80 да инхибира PDGFR фос форилиране и следващо сигнализиране in vivo, също, се пре ценява в SF763T туморите, които експресират високи нива на

PDGFRp. Третиране на SF763T туморите със съединение 80 силно инхибира PDGFR|3 тирозиново фосфорилиране в уста новени SF763T тумори. Съединение 80, също, понижава нивата на фосфорилирана (активирана) фосфолипаза С гама (PLC-γ), непосредствен downstream индикатор на PDGFR активиране. Тези данни доказват, че пероралното прилагане на съединение 80 води до директно влияние върху насоченото (PDGFR) действие в тумори in vivo.

Въз основа на доказаната способност на съединение 80 да инхибира VEGF-зависимо сигнализиране в HUVECs in vitro продължително време ефикасността на съединението се преценява, когато то се прилага рядко в Со1о205 е показано в

Таблица туморния модел. Както инхибиране) и 40 mg/kg (84% инхибиране)

7, са постигнати с ежедневно прилагане, а не когато се прилага два пъти седмично. Точно обратното, за от съединение 80 (160 mg/kg) не инхибира ране) развитието на установени Со!о205 тумори mg/kg 91% ефикасности, съединението по-висока до(52% инхибипри прилагане два пъти седмично, което предполага, че това съединение може да е ефикасно при рядко прилагане във висока доза. Трябва да се отбележи, че схемите на дозиране могат да се определят от специелиста в тази област, без да е необходимо експериментиране.

• · 9 9 9 9 9 9 9 9 ·9 ···· 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 · 9 9 99

99 999 9 99999999

9999 9999 999

99 99 99·

- 279 ТАБЛИЦА 7

Доза (mg/kg)	Честота	% Инхибиране	-стойност
160	два пъти седмично	52	0.085
	веднъж седмично	17	NS
80	ежедневно	91	0.039
	два пъти седмично	19	NS
	веднъж седмично	0	NS
40	ежедневно	84	0.028
	два пъти седмично	36	NS
NS: незначимо (Р<0.05)

Накратко, резултатите, дадени в Таблица 7, се получават като се използват Со1о205 клетки (0.5 х 10⁶ клетки/мишка), които са имплантирани подкожно в областта на задния хълбок на атимични мишки. Прилагането на съединение 80 през уста та, съгласно посочената схема, започва, когато тумори достигнат 400 mm³. Туморите се измерват с венозни дебеломери и туморният обем се изчислява, като резултат от дължина х широчина х височина. Р-стойности се изчисляват чрез сравнение на размера на туморите на животни, които са третирани със съединение 80 с размера на тумори на животни, които са третирани само с вехикулум в последния ден от опита, като се използва t-теста на Стюдънт с две отклонения.

И. Ефикасност на съединение 80 в модел с дисеминирано заболяване

В допълнение към поддържането на продължително раз витие на твърди първични тумори, ангиогенезът, също, е съ

- 280 ществен компонент, поддържащ развитието на дисеминирано заболяване, дължащо се на метастази от първичния тумор.

Влиянието на съединение 80 върху развитието на дисеми нирано заболяване се изследва в модел на колонизация на

B16-F1 миши белодробен меланом. В този модел, B16-F1 клет ки, инокулирани интравенозно през опашната вена на атимични мишки, колонизират белите дробове и образуват тумори. Както е дадено в Таблица 7, пероралното прилагане на съединение 80 в доза 80 mg/kg/дневно ефективно редуцира натоварването на B16-F1 клетки в белия дроб, както е определено чрез измервания на общото белодробно тегло. Тези данни подсказват, че съединение 80 може да инхибира дисеминирано заболяване in vivo.

ТАБЛИЦА 8

	белодробно тегло (д)	% инхибиране	-стойност
Вехикулум	0.83 ± 0.07	-
Съединение¹	0.41 ± 0.04	50	<0.001
¹съединение 80

Резултатите, дадени в Таблица 8, се получават с използване на атимични мишки, инокулирани с B16-F1 туморни клетки (5 х 10⁵ клетки/мишка) през опашната вена. Мишките се третират ежедневно чрез перорално прилагане на съединение 80 при доза 80 mg/kg/дневно (п = 10) или на вехикулум (п = 18) в продължение на 24 дни след инокулирането с туморни клетки. В края на периода на третиране, мишките се умъртвяват и белите им дробове се отделят и се претеглят. Процентно инхи99 ····

- 281 биране се изчислява чрез сравнение на белодробното тегло на тези животни, които са третирани със съединение 80, с бе лодробното тегло на животните, третирани само с вехикулум. Р-стойности се определят с помощта на t-теста на Стюдънт с две отклонения.

II. Инхибитори на СОХ-2

Способността на инхибитори на СОХ-2 да забавят развитието на тумори се изследва с използване на белодробния модел на Lewis, описан по-долу.

Мишките се инжектират подкожно в лявата лапа (1 х 10⁶туморни клетки, суспендирани в 30% Matrigel) и туморният обем се определя с използване на флетисмометър два пъти в седмицата в продължение на 30-60 дни. Два пъти се изтегля кръв по време на опита в 24-часов протокол, за да се прецени плазмената концентрация и общото въздействие чрез AUC анализ. Данните се изразяват като средните +/- SEM. Из ползват се тестове на Стюдънт и Ман-Уитни, за да се преценят разликите между средните стойности, като се използва InStat софтуерна програма. В храната се дава целекоксиб в дози между 160-3200 ppm, който забавя развитието на тези тумори. Инхибиращото действие на целекоксиба е зависимо от дозата и е в границите от 48% до 85% в сравнение с контролните тумори. Прави се анализ на белодробна метастаза във всички животни чрез отчитане на метастаза в стереомикроскоп и чрез хистохимичен анализ на последователни белодробни сегменти. Целекоксиб не повлиява белодробна метастаза в по ниска доза от 160 ppm, въпреки че повърхностна метастаза се редуцира с повече от 50%, когато се прилага в дози между 480-3200 ppm. Освен това, хистопатологичен анализ показва,

- 282 • to ·· • ·· • ·· · • ·· ·· ···· • to ·

• to to to · to ···· ··

че размерът на метастазните лезии в белия дроб се редуцира в зависимост от дозата на целекоксиба.

2. НТ-29 модел:

Мишки се инжектират подкожно в лявата лапа (1 х 10⁶туморни клетки, суспендирани в 30% Matrigel) и туморният обем се определя с използване на плетисмометър два пъти в седмицата в продължение на 30-60 дни. Два пъти се изтегля кръв по време на опита в 24-часов протокол, за да се прецени плазмената концентрация и общото въздействие чрез AUC анализ. Данните се изразяват като средните +/- SEM. Използват се тестове на Стюдънт и Ман-Уитни, за да се преценят разликите между средните стойности, като се използва InStat софтуерна програма.

А. Мишки, инжектирани с НТ-29 ракови клетки, се третират със цитоксин i.p. с дози от 50 mg/kg на 5-тия, 7-мия и 9тия дни в присъствието или отсъствието на целекоксиб в храната. Ефикасността на двете средства се определя чрез измерване на туморния обем. Третиране със сроден на целекоксиба инхибитор на СОХ-2 (SC-58236) редуцира туморния обем с 89%. В същиото изследване, индометацин, прилаган с приблизително максималната допустима доза от 2 mg/kg/дневно в питейната вода, инхибира образуването на тумор със 77%. Освен това, селективният инхибитор на СОХ-2 напълно инхибира образуването на белодробна метастаза, докато неселективният NSAID индометацин не е ефикасен. Резултатите от тези изследвания показват, че целекоксиб, приложен в храната на мишки с тумор, може да забави развитието на тумори и метастази, когато се прилага като единствена терапия. Освен това, положително предимство се наблюдава, когато се • ·

- 283 прилага целекоксиб в комбинация със цитотоксично средство, като циклофосфамид.

В. Във втори опит, мишки, инжектирани с НТ-29 ракови клетки от колона, се третират със целекоксиб (10, 40 или 160 ppm) в храната, като се започва от 10-тия ден. Наблюдава се ефект, който е приблизително зависим от дозата. (Таблица 9).

Таблица 9. Целекоксиб инхибира НТ-29 карцином на човешки колон

ДНИ	вехикулум	1 0 ppm	40 ppm	160 ppm
14	0.114	0.124	0.125	0.120
22	0.25	0.25	0.19	0.14
28	0.45	0.36	0.27	0.21
35	0.79	0.57	0.4	0.3
42	1.38	0.89	0.68	0.49
50	1.9	1.49	1 .04	0.8

Обем (mL)

III. In vivo опити c използване на протеинкинази в комбинация със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2 за лечение на рак

Способността на протеинкиназен инхибитор да забави развитието на тумори в комбинация със селективен инхибитор на СОХ-2 може да бъде изследвана в 1483 ксенотрансплантатен модел, описан по-долу.

1483 ксенотрансплантат е животински ксенотрансплантат, който моделира човешки плоскоклетъчен рак, експресиращ циклооксигеназа-2 (СОХ-2) в туморните клетки и в съдовата система.

- 284 Човешки туморен ксенотрансплантат в гола мишка модел на плоскоклетъчен рак на главата и врата (1483 клетъчна линия), който експресира СОХ-2 в туморните клетки и в съдовата система, подобно на човешки епителиален рак. Предполага се, че този модел представя човешки епителиален рак и е добър модел за установяване на съотношението между ефикасността на противоракови лекарства, включително инхибитори на СОХ-2 и ефикасността при хора.

Материали и методи:

Клетъчна култура:

1483 клетки от човешки плоскоклетъчен рак на главата и врата (HNSCC) се съхраняват замразени флакони, съдържащи 3 х 10⁶ клетки, 90% ембрионален волски серум (FBS) и 10% диметилсулфоксид (ДМСО). Взема се замразена ампула и бързо се разтопява при 37°С и се поставя в Т-162 cm²(Corning) колба, съдържаща D-MEM/F12 среда (GibcoBRL) с 15 mM Hepes буфер, L-глутамин, пиридоксин хидрохлорид и 10 % FBS. Клетките се култивират в инкубатор с 5 % СО₂ и с температура 37°С. Средата се сменя всеки ден и клетките се пасират с 80-90% сливане. За пасиране на клетки, колба се изплаква с 10 ml фосфатно буфериран солев разтвор (PBS), аспирира се и се добавят 2 ml трипсин/ЕДТА (0.25%/1 mM, GibcoBRL), връща се в инкубатор, след 5 минути се отделят клетки. Добавят се 8 ml от горната среда в колбата, изплаква се и се прехвърля в стерилна 50-милилитрова центрофужна епруветка. Добавят се още 30 ml от средата, смесват се и клетките се преброяват с помощта на хемацитометър, клетките се посяват в Т-162 cm², съдържаща 3-4 х 10⁶ клетки.

- 285 • · «· •· •· •· • · • · •* • · •· •· • ·· • · ·· • · · ·· · • ·· ♦ · ·

1483 животински модел:

Средата се сменя 24 ки, преди инжектиране в низират, както е описано часа преди събирането на 1483 клет голи мишки. 1483 клетки се трипси по-горе в клетъчна среда. Клетките се преброяват и се определя броя им. Клетките се центрофугират утаително с 1000 об/мин в продължение на 5 минути при стайна температура. Клетъчните утайки се ресуспендират и се събират (като се обединяват 50 ml центрофужни епруветки) в една 50 ml центрофужна епруветка с буфериран солев разтвор на Hank (HBSS, GibcoBRL) и се центрофугират, както преди. Трябва да се стремим да имаме около 25% повече клетки, отколкото тези, от които се нуждаем в действителност за инжектиране, за да имаме допълнителни клетки. Ако трябва да се инжектират 72 мишки и имаме 100 х 1 0⁶ клетки, се приготвят всички клетки за инжектиране в мишките. Инжектират се 1483 клетки, дозирани 1 х 1 0⁶ клетки в 0.3 ml/мишка.

Клетки се инжектират с 30% Matrigel (Collaborative Biomedical Products) и 70% HBSS. Събраната утайка се ресуспендира с 2.1 ml (70%) студен HBSS, след което се добавят 0.9 ml (30%) размразен втечнен студен Matrigel и се смесва добре върху лед. Този клетъчен препарат се държи върху лед винаги преди инжектиране в мишките. В тези изследвания се използват мъжки голи мишки на възраст 4-6 седмици (Harlen). Миш ките се анестезират с СО₂/О₂ газ и след това се инжектират в средата на дясната задна лапа, като се използва 0.5 сс туберкулинова спринцовка (Beckerson & Dickerson). Мишките се претеглят, за да се определи телесното им тегло в деня на инжектирането (ден 0) и да се използва като изходно тегло за началото на опита. Мишките се претеглят на 7-мия ден и се измерва дясната задна лапа, за да се определи обемът на ту9 ·

- 286 - ’..··..··* :. :·: ··’···.

·· ·· ..· :

мора в лапата, като се използва плетисмометър (Stoelting Co.). Плетисмометърът е машина, която измерва обема на лапа чрез изместване на вода. Измерват се няколко леви неинжектиране лапи и се осредняват за основно измерване, което се вади от дясната лапа с тумор.

Животните се поставят на опитни съединения в мека храна, когато туморите са с размер 100-200 ul и след това про дължават на смесена храна по време на изследването. На някои мишки се дава само инхибитор на протеинкиназа или селективен инхибитор на циклооксигеназа-2. На някои мишки се дава, както инхибитор на протеинкиназа, така и селективен инхибитор на циклооксигеназа-2 ежедневно с подходяща доза, определена въз основа на резултатите от in vitro опит.

Мишките се теглят и измерват по време на изследването на 7-мия, 10-тия, 14-тия, 17-тия, 21-вия, 24-тия и 28-мия ден. Третирането на животните със съединение може да започне в ден 0 (профилактично) или веднага след установяване на ту мор около ден 7 (терапевтично). Около ден 30 мишки, на които

се дава само вехикулум (контрола), ще имат големи тумори (~1.0-1.5 ml) и ще започнат да губят тегло, като по това време умират животните, които са били на вехикулум. Ако се наблю дава инхибиране на тумора в третираните групи и те са в добро здраве, на половината от третираните групи се прилага евтаназия, а половината от третираната група се запазва жива, за да се определи забавяне на туморното развитие.

За специалиста в тази област е лесно разбираемо, че изобретението е добре приспособено, за да осъществи целите си и да се получат резултатите и споменатите предимства. Мо лекулните комплекси и методите, процедурите, третиранията, молекулите, конкретните описани съединения, са по-скоро

- 287 - ·..·’· :··:· ·· · · · представителни за предпочитани изпълнения, са примерни, и не са предназначени да ограничават обхвата на изобретението. Специалистът в областта ще се сети за изменения и други използвания, които се включват в духа на изобретението и са определени от обхвата на претенциите.

Очевидно е за специалиста в тази област, че могат да се правят различни замествания и модификации на изобретението, както е описано тук, без да се излиза от обхвата и духа на изобретението.

Всички патенти и публикации, споменати в описанитео са само показателни за специалиста’ в областта, за който е предназначено изобретението. Всички патенти и публикации са включени чрез цитат в същата степен, както ако всяка от делна публикация беше конкретно и самостоятелно посочена.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използване на комбинация от инхибитор на протеинкиназа с формула (I):

в която:

R е избран от групата, състояща се от водород, пиперазин-1-илметил, 4-метилпиперазин-1-илметил, пиперидин-1илметил, 2-хидроксиметилпиролидин-1-илметил, 2-карбоксипиролидин-1-илметил и пиролидин-1-илметил;

R¹ е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, циклоалкил, заместен циклоалкил, арил, хетероарил, хетероалициклен, хидрокси, алкокси, -C(O)NR⁸R⁹, -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵, -(CH₂)_rR¹⁶;

R² е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, циано, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -(CO)R¹⁵, арил, хетероарил и

-S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, арил, хетероарил, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³S(O)2R’⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴,

-NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ и -SO₂R¹⁹;

заместваща страница

- 289 -

R⁴ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, заместен алкил, хидрокси, алкокси и -NR¹³R¹⁴;

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и -C(O)R¹⁰;

R⁶ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и -C(O)R¹⁰;

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил, арил, хетероарил, -C(O)R¹⁷ и -C(O)R¹⁰, при условие, че когато R е водород, тогава най-малко един от R⁵, R⁶ и R⁷ е -C(O)R¹⁰; или

R⁶ и R⁷ могат заедно да образуват група, избрана от групата, състояща се от -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, и -(СН₂)₆-,

R⁸ и R⁹ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и арил;

R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, алкокси, арилокси, -N(R¹¹)(anKnneH)_nR¹², като алкиленовата група е заместена по желание с хидроксигрупа и —NR¹³R¹⁴;

R¹¹ е избран от групата, състояща се от водород, алкил и © заместен алкил;

R¹² е избран от групата, състояща се от -NR¹³R¹⁴, хидрокси, -C(O)R¹⁵, арил, хетероарил, -N ⁺ (O)R¹³R¹⁴, -N(OH)R¹³ и -NHC(O)R¹⁸ (където R¹⁸ е алкил, заместен алкил, халолакил или аралкил);

R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил, нисш алкил, заместен с хидроксиалкиламино, цианоалкил, циклолакил, заместен циклоалкил, арил и хетероарил; или

R¹³ и R¹⁴ могат заедно да образуват хетероцикло група;

R¹⁵ е избран от групата, състояща се от водород, хидрокси, алкокси и арилокси;

- 290 R¹⁶ е избран от групата, състояща се от хидрокси, -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ и -C(O)NR¹³R¹⁴;

R¹⁷ е избран от групата, състояща се от алкил, заместен алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

R¹⁹ е избран от групата, състояще се от алкил, заместен алкил, арил, аралкил, хетероарил или хетероалкил; и п и г са поотделно 1, 2, 3 или 4;

и инхибитор на циклооксигеназа или негова фармацевтично приемлива сол за получаване на лекарствено средство за © лечение или профилактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бозайник, нуждаещ се от такова лечение, на терапевтично ефективно количество от комбинацията.
2. Използване на инхибитор на протеинкиназа с формула

R' (·) в която:

R е избран от групата, състояща се от водород, пиперазин-1-илметил, 4-метилпиперазин-1-илметил, пиперидин-1илметил, 2-хидроксиметилпиролидин-1-илметил, 2-карбоксипиролидин-1-илметил и пиролидин-1-илметил;

R¹ е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, циклоалкил, заместен циклоалкил, арил, хетероарил, хетероалициклен, хидрокси, алкокси, -C(O)NR⁸R⁹, -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵, -(CH₂)_rR¹⁶;

^..чо птпанина

- 291 R² е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, циано, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -(CO)R¹⁵, арил, хетероарил и

-S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, заместен алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, арил, хетероарил, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴,

-NR¹³C(O)R¹⁴, -NR¹³C(O)OR¹⁴, -(CO)R¹⁵ и -SO₂R¹⁹;

R⁴ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, заместен алкил, хидрокси, алкокси и -NR¹³R¹⁴;

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и -C(O)R¹⁰; R⁶ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и -C(O)R¹⁰; R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил, арил, хетероарил, -C(O)R¹⁷ и -C(O)R ¹⁰, при

условие, че когато R е водород, тогава най-малко един от R⁵, R⁶ и R⁷ е -C(O)R¹⁰; или

R⁶ и R⁷ могат заедно да образуват група, избрана от груата, състояща се от —(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, и -(СН₂)₆-,

R⁸ и R⁹ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил и арил;

R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, алкокси, арилокси, -М(Р¹¹)(алкилен)_пР¹², като алкиленовата група е заместена по желание с хидроксйгрупа и -NR¹³R¹⁴;

R¹¹ е избран от групата, състояща се от водород, алкил и заместен алкил;

R¹² е избран от групата, състояща се от -NR¹³R¹⁴, хидрокси, -C(O)R¹⁵, арил, хетероарил, -N ⁺ (O')R¹³R¹⁴, -N(OH)R¹³ и заместваща страница

- 292 -

-NHC(O)R¹⁸ (където R¹⁸ е алкил, заместен алкил, халолакил или аралкил);

R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, заместен алкил, нисш алкил, заместен с хидроксиалкиламино, цианоалкил, циклолакил, заместен циклоалкил, арил и хетероарил; или

R¹³ и R¹⁴ могат заедно да образуват хетероцикло група;

R¹⁵ е избран от групата, състояща се от водород, хидрокси, алкокси и арилокси;

R¹⁶ е избран от групата, състояща се от хидрокси, -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ и -C(O)NR¹³R¹⁴;

R¹⁷ е избран от групата, състояща се от алкил, заместен алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

R¹⁹ е избран от групата, състояще се от алкил, заместен алкил, арил, аралкил, хетероарил или хетероалкил; и η и г са поотделно 1, 2, 3 или 4;

в комбинация със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2, избран от групата, състояща се от:

(i) съединение с формула (II):

G е избран от групата, състояща се от О, S, и -NR^a-, като R^a е водород или алкил;

R^10a е избран от групата, състояща се от водород и арил;

R^11a е избран от групата, състояща се от карбоксил, алкил, аралкил, аминокарбонил, алкилсулфониламинокарбонил и ал коксикарбонил;

Заместваща птпанипа

- 293 -

R^12a е избран от групата, състояща се от халолакил, алкил, аралкил, циклолакил и арил, по желание заместен с един или повече радикали, избрани от алкилтио, нитро и алкилсулфонил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани поотделно от групата, състояща се от водород, хало, алкил, аралкил, алкокси, арилокси, хетероарилокси, аралкилокси, хетероаралкилокси, халоалкил, халоалкокси, алкиламино, ариламино, аралкиламино, хетероариламино, хетероарилалкиламино, нитро, амино, аминосулфонил, алкиламиносулфонил, ариламиносулфонил, хетероариламиносулфонил, аралкиламиносулфонил, хетероаралкиламиносулфонил, хетероциклосулфонил, алкилсулфонил, хидроксиарилкарбонил, нитроарил, по желание заместен арил, по желание заместен хетероарил, аралкилкарбонил, хетероарилкарбонил, арилкарбонил, аминокарбонил и алкилкарбонил;

или R^13a заедно с пръстен Е образува нафтилов пръстен; или (и) съединение с формула (III):

о.

в която:

А е избран от групата, състояща се от частично ненаситен или ненаситен хетероциклилов и частично ненаситен или ненаситен карбоциклен пръстени;

(III)

- 294 R^1b е избран от групата, състояща се от хетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил и арил, като R^1b е по желание заместен при заместваема позиция с един или повече радикали, избрани поотделно от алкил, халоалкил, циано, карбоксил, алкоксикарбонил, хидроксил, хидроксиалкил, халоалкокси, амино, алкиламино, ариламино, нитро, алкоксиалкил, алкилсулфинил, хало, алкокси и алкилтио;

R^2b е избран от групата, състояща се от метил и амино; и

R^3b е избран от групата, състояща се от радикал, избран © от водород, хало, алкил, алкенил, алкинил, оксо, циано, карбоксил, цианоалкил, хетероциклилокси, алкилокси, алкилтио, алкилкарбонил, циклоалкил, арил, халоалкил, хетероциклил, циклоалкенил, аралкил, хетероциклилалкил, ацил, алкилтиоаларилкарбонил, аралкил, хидроксиалкил, алкоксикарбонил, килкарбонил, аралкенил, алкоксиалкил, арилтиоалкил арилоксиалкил, аралкилтиоалкил, аралкоксиалкил, алкоксиаралкоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонил, аминокарбонилалкил, алкиламинокарбонил, N-ариламинокарбонил, N-алкил-М-ариламинокарбонил, алкиламинокарбонилалкил, карбоксиалкил, алкиламино, N-ариламино, N-аралкиламино, Nалкил-N-apanкиламино, N-алкил-^ариламино, аминоалкил, киламиноалкил, N-ариламиноалкил, алкил-N-аралкиламиноалкил, алилокси, аралкокси, арилтио, килсулфонил, аминосулфонил аминосулфонил, арилсулфонил

N-аралкиламиноалкил N-алкил-М-ариламиноалкил, аралкилтио, алкилсулфинил, алкиламйносулфонил, N-арилNарали N-алкил-М-ариламиносулфонил; или негова фармацевтично приемлива сол, средство за лечение или проза получаване на лекарствено филактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бо- 295 - зайник, нуждаещ се от такова лечение на терапевтично ефективно количество от комбинацията.
3. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е съединение с формула (II), в което:

G е избран от групата, състояща се от кислород и сяра;

R^11a е избран от групата, състояща се от карбоксил, нисш алкил, нисш аралкил и нисш алкоксикарбонил;

R^12a е избран от групата, състояща се от нисш халолакил, нисш циклолакил и фенил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани от групата, състояща се от водород, хало, нисш алкил, нисш алкокси, нисш халоалкил, нисш халоалкокси, нисш алкиламино, нитро, амино, аминосулфонил, нисш алкиламиносулфонил, 5-членен хетероарилалкиламиносулфонил, 6-членен хетероарилалкиламиносулфонил, нисш аралкиламиносулфонил, 5-членен азотсъдържащ хетероциклосулфонил, 6-членен азотсъдържащ хетероциклосулфонил, нисш алкилсулфонил, по желание заместен фенил, нисш аралкилкарбонил и нисш алкилкарбонил; или R^13aзаедно с пръстен Е образува нафтилов радикал.
4. Използване съгласно претенция 3, при което:

R^11a е карбоксил;

R^12a е нисш халоалкил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани от групата, състояща се от водород, хало, нисш алкил, нисш халоалкил, нисш халоалкокси, нисш алкиламино, амино, аминосулфонил, нисш алкиламиносулфонил, 5-членен хетероарилалкиламиносулфонил, 6-членен хетероарилалкиламиносулфонил, нисш аралкиламиносулфонил, нисш алкилсулфонил, 6-членен азотсъдържащ хетероциклосулфонил, по желание заместен фенил,

- 296 нисш аралкилкарбонил и нисш алкилкарбонил; или R^13a заедно с пръстен Е образува нафтилов радикал.
5. Използване съгласно претенция 4, при което:

R^12a е избран от групата, състояща се от флуорометил, хлорометил, дихлорометил, трихлорометил, пентафлуороетил, хептафлуоропропил, дифлуороетил, дифлуоропропил, дихлороетил, дихлоропропил, дифлуорометил и трифлуорометил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани от групата, състояща се от хидридо, хлоро, флуоро, бромо, йодо, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, бутил, изобутил, пентил, хексил, метокси, етокси, изопропилокси, трет.-бутилокси, трифлуорометил, дифлуорометил, трифлуорометокси, амино, Ν,Ν-диметиламино, Ν,Ν-диетиламино, N-фенилметиламиносулфонил, Nфенилетиламиносулфонил, 1\1-(2-фурилметил)аминосулфонил, нитро, Ν,Ν-диметиламиносулфонил, аминосулфонил, N-метиламиносулфонил, N-етилсулфонил, 2,2-диметилетиламиносулфонил, Ν,Ν-диметиламиносулфонил, ^(2-метилпропил)аминосулфонил, N-морфолинилсулфонил, метилсулфонил, бензилкарбонил, 2,2-диметилпропилкарбонил, фенилацетил и фенил; или R^13a заедно с пръстен Е образува нафтилов радикал.
6. Използване съгласно претенция 5, при което:

R^12a е избран от групата, състояща се от трифлуорометил и пентафлуороетил; и

R^13a е един или повече радикали, избрани от групата, състояща се от хидридо, хлоро, флуорд, бромо, йодо, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, метокси, трифлуорометил, трифлуорометокси, N-фенилметиламиносулфонил, N-фенилетиламиносулфонил, ^(2-фурилметил)аминосулфонил, Ν,Ν-диметиламиносулфонил, N-метиламиносулфонил, ^(2,2-диметилетил)аминосулфонил, диметиламиносулфонил, 2-метилпро

- 297 пиламиносулфонил, N-морфолинилсулфонил, метилсулфонил, бензилкарбонил и фенил; или R^13a заедно с пръстен Е образува нафтилов радикал.
7. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е избран от групата, състояща се от:

6-хлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-7-тметил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;
8-(1 -мети л етил)-2-трифлуорометил-2Н-1-бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-7-(1,1 -диметилетил)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6- хлоро-8-(1 -метилетил)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3карбоксилна киселина;

2-трифлуорометил-ЗН-нафтопиран-З-карбоксилна киселина;

7- (1,1 -диметилетил)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-бромо-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

8- хлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-трифлуорометокси-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3карбоксилна киселина;

5,7-дихлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

8-фенил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бе н зоп и ран-3-карбоксилна киселина;

- 298 -

7.8- диметил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6.8- бис(диметилетил)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензолиран-3карбоксилна киселина;

7-(1 -метилетил)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензолиран-3-карбоксилна киселина;

7- фенил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-7-етил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-8-етил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол иран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-7-фенил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензолиран-3-карбоксилна киселина;

6.7- дихлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6.8- дихлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

2-трифлуорометил-ЗН-нафто[2,1 - Ь]пиран-3-карбоксил на киселина;

6-хлоро-8-метил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина;

8- хл оро-6-мети л-2-три флуоро метил-2 Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

8-хл оро-6-метокси-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензоли ран-3-карбоксилна киселина;

6-бромо-8-хлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

8-бромо-6-флуоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бе изолиран-3-карбоксилна киселина;

- 299 8-бромо-6-метил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина;

8-бромо-5-флуоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бе нзоп и ран-3-карбоксилна киселина;

6-хлоро-8-флуоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол иран-3-карбоксилна киселина;

6-бромо-8-метокси-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина;

6-[[(фенилметил)амино]сулфонил]-2-трифлуорометил-2Н-1 -бенβ зопиран-3-карбоксилна киселина;

6-[(диметиламино)сулфонил]-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-[(метил амино) сул фон ил]-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензолиран-3-карбоксилна киселина;

6-[(4-морфолино)сулфонил]-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол иран-3-карбоксилна киселина;

6-[(1,1 -диметил етил) ам и носул фон ил ]-2-трифлуорометил-2Н-1 бензопиран-3-карбоксилна киселина;

ф 6-[(2-метпропил)аминосулфонил]-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-метилсулфонил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бе нзоп и ран-3-карбоксилна киселина;

8-хлоро-6-[[ (фенил метил) ами но] сул фон ил ]-2-трифлуоро метил 2Н-1 -бензолиран-3-карбоксилна киселина;

6-фенилацетил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина;

6,8-дибромо-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

8-хлоро-5,6-диметил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензоли ран-3-карбоксилна киселина;

заместваща стоаница

- 300 -

6,8-дихлоро-(£)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбок- силна киселина;

6-бензилсулфонил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензол иран-3-карбоксилна киселина;

6-[[М-(2-фурил метил) амино] сулфонил]-2-трифлуорометил-2 Н-1 бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6-[[1\1-(2-фен и л етил) амино] сулфонил]-2-трифлуорометил-2Н-1 бензопиран-3-карбоксилна киселина;

6- йодо-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина;

7- (1,1 -диметилетил)-2-пентафлуороетил-2Н-1 -бензол и ран-3-карбоксилна киселина; и

6-хлоро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензотиопиран-3-карбоксилна киселина; или негова фармацевтично приемлива сол.

8. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е съединение, избрано от групата състояща се от:

он

6-нитро-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина заместваща страница

- 301

b)

6-хлоро-8-метил-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина ((в)-6-хлоро-7-(1,1 -диметилетил)-2-(трифлуорометил)-2Н-1 бензопиран-3-карбоксилна киселина

d)

2-трифлуорометил-2Н-нафто[2,3-Ь]пиран-3-карбоксилна киселина

е) заместваща страница

Λ

- 302 6-хлоро-7-(4-нитрофенокси)-2-трифлуорометил-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина

f) ((8)-6,8-дихлоро-2-(трифлуорометил)-2Н-1 -бензолиран-3-карбоксилна киселина

д)

6-хлоро-2-(трифлуорометил)-4-фенил-2Н-1 -бе изолиран-3карбоксилна киселина

h)

6-(4-хидроксибензоил)-2-(трифлуорометил)-2Н-1 -бензол и ран-3карбоксилна киселина заместилшя стпянипа

- 303 i) киселина

2- (трифлуорометил)-6-[(трифлуорометил)тио]-2Н-1 -бензопиран-

3- карбоксилна

j)

6,8-дихлоро-2-(трифлуорометил)-2H-1 -бензотиопиран-3карбоксилна киселина

к)

6-(1,1 -ди мети лети л )-2-(трифлуорометил)-2 Н-1 -бензотиопиран-3карбоксилна киселина

I) заместваща страница

- 304 6,7-дифлуоро-1,2-дихидро-2-(трифлуорометил)-3-хинолинкарбоксилна киселина

т)

СН₃

6-хлоро-1,2-дихидро-1 -метил-2-(трифлуорометил)-3-хинолинкарбоксилна киселина

п)

6-хлоро-2-(трифлуорометил)-1,2-дихидро[1,8]нафтилпиридин-3карбоксилна киселина

о) ((S)-6-xnopo-1, 2-дихидро-2-(трифлуорометил )-3-хинол и нкарбоксилна киселина или негова фармацевтично приемлива сол; и всяка негова комбинация.

заместваща страница

- 305 -
9. Използване съгласно претенция 2, при което селектив ният инхибитор на циклооксигеназа-2 е съединение с формула (III), избрано от групата състояща се от:

а)

Ь) заместваща страница

- 306 - или негова фармацевтично приемлива сол;

и всяка негова комбинация.
10. Използване съгласно претенция 3, при което селектив ният инхибитор на циклооксигеназа-2 е избран от групата, със тояща се от:

яямдптяяша стоаница»

- 307 a)

b) негова фармацевтично или приемлива сол; и всяка негова помбинация.
11.

Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е:

приемлива сол.

или негова фармацевтично
12.

Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е:

заместваща страница (

- 308 - или негова фармацевтично приемлива сол.
13. Използване съгласно претенция 1, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 4-[4-(метилсулфонил)фенил]-3-фенил-2(5Н)-фуранон или негова фармацевтично при емлива сол.
14. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 4-[(5-метил-3-фенил)-4изоксазолил]фенилсулфонамид или негова фармацевтично приемлива сол.
15. Използване съгласно претенция 1, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 2-(6-метилпирид-3-ил)3-(4-метилсулфонилфенил)-5-хлоропиридин или негова фарма цевтично приемлива сол.
16. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 4-[5-(4-метилфенил)-3(трифлуорометил)-1 Н-пиразол-1-ил]фенилсулфонамид или негова фармацевтично приемлива сол.
17. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 4-[(2-метил-4-циклохексил)-5-оксазолил]фенилсулфонамид или негова фармацевтично приемлива сол.
18. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е 4-[5-(3-флуоро-4-метокзаместваша стоанииа

- 309 сифенил)-3-(дифлуорометил)-1 Н-пиразол-1 -ил]-бензенсулфонамид или негова фармацевтично приемлива сол.
19. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е (8)-6,8-дихлоро-2-(трифлуорометил)-2Н-1 -бензопиран-3-карбоксилна киселина или нейна фармацевтично приемлива сол.
20. Използване съгласно претенция 2, при което селективният инхибитор на циклооксигеназа-2 е съединение с формула: в която:

X е О или S;

R^12b е нисш халоалкил;

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо и хало;

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо, хало, нисш алкил, нисш халоалкокоси, нисш алкокси, нисш аралкилкарбонил, нисш диалкиламиносулфонил, нисш алкиламиносулфонил, нисш аралкиламиносулфонил, нисш хетероаралкиламиносулфонил, 5-членен азотсъдържащ хетероциклосулфонил и 6-членен азотсъдържащ хетероциклосулфонил;

R^13b” е избран от групата, състояща се от хидридо, нисш алкил, хало, нисш алкокси и арил; и

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо, хало, нисш алкил, нисш алкокси и арил; или негова фармацевтично приемлива сол.

заместваща стоаница

- 310 -
21. Използване съгласно претенция 20, при което:

R^12b е избран от групата, състояще се от трифлуорометил и пентафлуороетил;

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо, хлоро и флуоро;

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо, хлоро, бромо, флуоро, йодо, метил, трет.-бутил, трифлуорометокси, метокси, бензилкарбонил, диметиламиносулфонил, изопропиламиносулфонил, метиламиносулфонил, бензиламиносулфонил, фенилетиламиносулфонил, метилпропиламиносулфонил, метилсулфонил и морфолиносулфонил;

R^13b е избран от групата, състояща се от хидридо, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, хлоро, метокси, диетиламино и фенил; и

R^13b” е избран от групата, състояща се от хидридо, хлоро, бромо, флуоро, метил, етил, трет.-бутил, метокси и фенил.
22. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което:

R¹ е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, циклоалкил, арил, хетероарил, хетероалициклен, хидрокси, алкокси, -C(O)NR⁸R⁹, -NR¹³R¹⁴, -(CO)R¹⁵, -(CH₂)_rR¹⁶;

R² е избран от групата, състояща се от водород, хало, алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, -NR¹³R¹⁴, -NR¹³C(O)R¹⁴, -(CO)R¹⁵, арил, хетероарил и -S(O)₂NR¹³R¹⁴;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, трихалометил, хидрокси, алкокси, -(CO)R¹⁵, -NR¹³R¹⁴, арил, хетероарил,-NR¹³S(O)2R¹⁴, -S(O)2NR¹³R¹⁴, -NR^,3C(O)R¹⁴ и

-NR¹³C(O)OR¹⁴;

R⁴ е избран от групата, състояща се от водород, халоген, алкил, хидрокси, алкокси и -NR¹³R¹⁴;

- 311 R⁵ е избран от групата, състояща се от водород, алкил и -C(O)R¹⁰;

R⁶ е избран от групата, състояща се от водород, алкил и -C(O)R¹⁰;

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, арил, 3-карбоксипропил, хетероарил, -C(O)R¹⁷ и -C(O)R¹⁰;

R⁶ и R⁷ могат заедно да образуват група, избрана от групата, състояща се от -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, и -(ΟΗ₂)₆-,

R⁸ и R⁹ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил и арил;

R¹⁰ е избран от групата, състояща се от хидрокси, алкокси, арилокси, -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹² и -NR¹³R¹⁴;

R¹¹ е избран от групата, състояща се от водород и алкил;

R¹² е избран от групата, състояща се от -NR¹³R¹⁴, хидрокси, -C(O)R¹⁵, арил и хетероарил;

R¹³ и R¹⁴ са избрани поотделно от групата, състояща се от водород, алкил, циклолакил, арил и хетероарил;

R¹³ и R¹⁴ могат заедно да образуват група, избрана от групата, състояща се от -(СН₂)₄-, -(СН₂)₅-, -(СН₂)₂О(СН₂)₂- и -(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-;

R¹⁵ е избран от групата, състояща се от водород, хидрокси, алкокси и арилокси;

R¹⁶ е избран от групата, състояща се от хидрокси, -NR¹³R¹⁴, -C(O)R¹⁵ и -C(O)NR¹³R¹⁴;

R¹⁷ е избран от групата, състояща се от алкил, циклоалкил, арил и хетероарил; и η и г са поотделно 1, 2, 3 или 4;

или негова фармацевтично приемлива сол.
23. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което:

- 312 -

R⁶ e -C(O)R¹⁰, като R¹⁰ e -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹², като

R¹¹ е водород или нисш алкил;

η е 2 или 3; и

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ са поотделно нисш алкил.
24. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което:

R⁶ е -C(O)R¹⁰, като R¹⁰ е -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹², като

R¹¹ е водород или нисш алкил;

η е 2 или 3; и

-.© R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ заедно образуват група, избрана от — (СН₂)4-, -(СН₂)5-, -(GH₂)₂O(CH₂)₂- или

-(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-;
25. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е N(2-диметиламино-етил)аминокарбонил, М-(2-диетиламиноетил)N-метиламинокарбонил, 1\1-(3-диметиламино-пропил)аминокарбонил, М-(2-диетиламиноетил)аминокарбонил, М-(2-етиламиноетил)аминокарбонил, М-(3-етиламинопропил)аминокарбонил или М-(3-диетиламинопропил)аминокарбонил.
26. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е N(2-диетиламиноетил)аминокарбонил или 1\1-(2-етиламиноетил)аминокрабонил.
27. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е 3пиролидин-1 - илпропиламинокарбонил, З-морфолин-4-илпропиламинокарбонил, 2-пиролидин-1-илетиламинокарбонил, 2-морфолин-4-илетиламинокарбонил, 2-(4-метилпиперазин-1 - ил)етиламинокарбонил, 2-(3,5-диметил пиперазин-1 -И Л) еТИЛ аМИ HO Kap aa ллостваша птпаиииа

- 313 - бонил, 3-(4-метилпиперазин-1 -ил)пропиламинокарбонил или 3(3,5-диметилпиперазин-1 - ил) пропил аминокарбонил.
28. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е -COR¹⁰, като R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ е водород, a R¹⁴ е нисш алкил, заместен с хидрокси, арил, хетероалициклен, хетероарил или карбокси.
29. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е 2триазин-1 -ил пропил аминокарбонил, 2-триазин-1 -и л етил аминокарбонил, З-имидазол-1 -илпропиламинокарбонил, пиридин-4илметил-аминокрабонил, 2-пиридин-2-ил етил аминокарбонил или 2-имидазол-1 -илетиламинокарбонил.
30. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което

R⁶ е -C(O)R¹⁰, като R¹⁰ е -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹², като

R¹¹ е водород или нисш алкил;

η е 2 или 3; и

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ заедно образуват хетероцикъл.
31. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което

R⁶ е -C(O)R¹⁰, като R¹⁰ е -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹², като

R¹¹ е водород или нисш алкил;

η е 2 или 3; и

R¹² е -NR¹³R¹⁴, където R¹³ и R¹⁴ заедно образуват 5-, 6- или

7-атомен хетероцикъл, съдържащ карбонилна група и един или два азотни атома в пръстена.
32. Използване съгласно претенция 2, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което R⁶ е 2

- 314 (оксопиперазин-1 -ил) етиламинокрабонил, 2-(имидазолидин-1 ил-2-он)етил аминокарбонил, 2-(тетрахидропиримидин-1 - ил-2он)етиламинокарбонил, 2-(2-оксопиролидин-1 -ил) етил аминокарбонил, 3-(3-оксопиперазин-1 -ил)пропиламинокарбонил, 3(имидазолидин-1 -ил-2-он)пропиламинокрабонил, 3-(тетрахидропиримидин-1 -ил-2-он)пропиламинокарбонил или 3-(2-оксопиролидин-1 -ил)пропиламинокарбонил.
33. Използване съгласно претенции 22-32, при което инхибиторът на протеинкиназа е съединение с формула (I), в което:

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород и нисш алкил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -(CO)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, нисш алкил или арил.
34. Използване съгласно претенция 33, при което:

R¹ е водород, нисш алкил, -C(O)NR⁸R⁹, циклоалкил или арил;

R² е водород, хало, нисш алкокси, циано, арил, -SO2R²⁰или -S(O)2NR¹³R¹⁴, като R¹³ е водород и R¹⁴ е водород, арил или алкил;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкокси, -(CO)R¹⁵, -NR¹³C(O)OR¹⁴, арил и хетероарил; и

R⁴ е водород.
35. Използване съгласно претенция 34, при което:

R¹ е водород или фенил;

R² е водород, хлоро, бромо, флуоро, метокси, етокси, фенил, диметиламиносулфонил, циано, метилсулфонил, етилсулфонил, бензилсулфонил, 3-хлорофениламиносулфонил, карбокси, метокси, аминосулфонил, метиламиносулфонил, фенилзаместваша страница

- 315 - аминосулфонил, пиридин-3-ил-аминосулфонил, диметиламиносулфонил или изопропиламиносулфонил;

R³ е водород, метокси, карбокси, фенил, пиридин-3-ил, 3,4-дихлорофенил, 2-метокси-5-изопропилфенил, 4-н.-бутилфенил, 3-изопропилфенил; и

R⁴ е водород.
36. Използване съгласно претенция 35, при което:

R¹ е водород;

R² е водород, циано, флуоро, хлоро или бромо;

R³ е фенил; и

R⁴ е водород.
37. Използване съгласно претенция 2, при което:

R¹ е водород, нисш алкил, - C(O)NR⁸R⁹, циклоалкил или арил; R² е водород, , хало, нисш алкокси, циано, арил или -S(O)₂NR¹³R¹⁴, като R¹³ е водород и R¹⁴ е водород, арил или

алкил;

R³ е избран от групата, състояща се от водород, нисш алкокси, -(CO)R¹⁵, -NR¹³C(O)OR¹⁴, арил и хетероарил; и

R⁴ е водород.
38 Използване съгласно претенция 2, при което:

R¹ е водород или метил;

R² е водород, циано, хлоро, флуоро или бромо;

R³ е избран от групата, състояща се от водород или фенил; и

R⁴ е водород.
39. Използване съгласно претенция 2, при което R⁶ е -COR¹⁰, където R¹⁰ е -NR¹³R¹⁴, като R¹³ е водород и R¹⁴ е нисш алкил, заместен с хидрокси, нисш алкил, заместен с хидроксиал

- 316 - киламино, карбокси или -NR¹⁸R¹⁹, като R¹⁸ и R¹⁹ са поотделно водород или нисш алкил.
40. Използване съгласно претенция 2, при което R⁶ е [2(диетиламино)-2-хидрокси]етил аминокарбонил, 2-(Ν-θτπη-Ν-2хидрокси)етиламинокрабонил.
41. Използване съгласно претенция 2, при което R⁶ е -COR¹⁰, като R¹⁰ е -N(R¹¹)(CH₂)_nR¹², където R¹² е -N ⁺ (O )NR¹³R¹⁴ или -N(OH)R¹³, като R¹³ и R¹⁴ са поотделно избрани от групата, състояща се от нисш алкил.
42. Използване съгласно претенция 2, при което R⁶ е 2-(Nхидрокси-М-етиламино)етиламинокарбонил или 2-[N ⁺ (O)(С₂Н₅)₂]етил аминокарбонил.
43. Използване съгласно претенция 41 или 42, при което:

R⁵ е избран от групата, състояща се от водород или метил; и

R⁷ е избран от групата, състояща се от метил, водород или фенил.
44. Използване съгласно претенция 2, при което:

R¹ е водороод;

R² е водород, циано, хлоро, флуоро или бромо;

R³ е водород; и

R⁴ е водород.
45. Използване съгласно претенция 2, при което киназният инхибитор е избран от групата, състояща се от:

заместваща страница

- 317 - или негова L-сол.
46.

Използване съгласно претенция 2, при което киназният инхибитор е съединение с формула:
47. Използване на протеинкиназен инхибитор с формула (I) aaMArtTRAma гтпанииа

- 318 - в комбинация със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2 с формула:

или негова фармацевтично приемлива сол за получаване на лекарствено средство за лечение или профилактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бозайник, нуждаещ се от такова лечение, на терапевтично ефективно количество от комбинацията.
48. Използване на протеинкиназен инхибитор с формула (I) в комбинация със селективен инхибитор На циклооксигеназа-2 с формула:

- 319 - или негова фармацевтично приемлива сол за получаване на лекарствено средство за лечение или профилактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бозайник, нуждаещ се от такова лечение, на терапевтично ефективно количество от комбинацията.
49. Използване на протеинкиназен инхибитор с формула (I) в комбинация със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2 с формула: или негова фармацевтично приемлива сол за получаване на лекарствено средство за лечение или профилактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бозайник, нуждаещ се от —ч Λ I I IA I I Q

- 320 такова лечение, на терапевтично ефективно количество от комбинацията.
50. Използване на протеинкиназен инхибитор с формула (I) в комбинация със селективен инхибитор на циклооксигеназа-2 с формула:

или негова фармацевтично приемлива сол за получаване на лекарствено средство за лечение или профилактика на ракови заболявания, чрез прилагане към бозайник, нуждаещ се от такова лечение, на терапевтично ефективно количество от комбинацията.