CN1356872A

CN1356872A - 调节蛋白激酶活性和用于癌症化疗的3－亚杂芳基－2－吲哚满酮化合物

Info

Publication number: CN1356872A
Application number: CN99816376A
Authority: CN
Inventors: P·J·兰格克尔; L·K·肖弗; P·C·唐; L·孙
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1998-12-31
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2002-07-03
Also published as: BR9916735A; AU2221500A; AU760964B2; WO2000038519A1; EP1139754A1; KR20010108063A; MXPA01006742A; JP2002533360A; IL143920A0; CA2357042A1; EP1139754A4

Abstract

本发明涉及3－亚杂芳基－2－吲哚满酮化合物,它们调节蛋白激酶活性并因此被期待用于预防和治疗与蛋白激酶相关的细胞疾病例如癌症。而且这些化合物有望增强其它化疗剂,尤其是氟代嘧啶在治疗癌症中的效果。

Description

调节蛋白激酶活性和用于癌症化疗的 3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物

前言

本发明一般涉及化学、生物化学、药理学、医学和癌症治疗。更具体地说，本发明涉及调节蛋白激酶(“PKs”)活性的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物及其用于治疗与异常蛋白激酶活性相关的疾病包括癌症的方法，其中该化合物与其它化学治疗剂联合使用。发明背景

以下仅作为背景资料提供而不认为是本发明的先有技术或对先有技术的描述。

PKs为催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上羟基磷酸化的酶。这个表面上简单的活性的结果是惊人的；细胞的生长、分化和增殖，即细胞生命的所有方面实质上都以一种或另一种方式依赖于PK活性。而且，异常PK活性已涉及到宿主的疾病，范围从相对非威胁生命的疾病例如牛皮癣到极度致命的疾病例如成胶质细胞瘤(脑癌)。

PKs可便利地分为两类，即蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。

PK活性的主要方面之一是它们与生长因子受体有关联。生长因子受体为细胞表面蛋白。当与生长因子配体结合时，生长因子受体转变为活化型，其与细胞膜内表面的蛋白相互作用。这导致受体和其它蛋白的酪氨酸残基上磷酸化并导致在细胞内部与多种细胞质信号分子形成复合物。这些复合物依次影响多种细胞应答例如细胞分裂(增殖)、细胞分化、细胞生长、对细胞外微环境的代谢作用的表达等。对更完全的讨论，参见Schlessinger和Ullrich，Neuron，1992，9：303-391，该文献包括任何附图通过引用结合到本文中作为一个整体。

具有PK活性的生长因子受体称作受体酪氨酸激酶(“RTKs”)。它们包括一个具有多样生物活性的跨膜受体的大家族。目前，已鉴定至少十九(19)种性质截然不同的亚家族的RTKs。这些亚家族的一个实例为称作“HER”RTKs的亚家族，其包括EGFR(上皮生长因子受体)、HER2、HER3和HER4。这些RTKs由细胞外糖基化配体结合域、跨膜域和细胞内细胞质催化域组成，它们能够使蛋白上的酪氨酸残基磷酸化。

另一RTK亚家族由胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)和胰岛素受体相关受体(IRR)组成。IR和IGF-1R与胰岛素、IGF-I和IGF-II相互作用，形成由两个完全细胞外糖基化α亚单位和两个β亚单位组成的杂化四聚物，它们穿过细胞膜并且含有酪氨酸激酶域。

第三个RTK亚家族称作血小板衍生生长因子受体(“PDGFR”)组，其包括PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-kit和c-fms。这些受体由可变化数目的免疫珠蛋白样-环状结构组成的糖基化细胞外域和其中酪氨酸激酶域由不相关的氨基酸序列中断的细胞内域组成。

另一组由于其与PDGFR亚家族的相似性，有时被纳入后一组，这一组是胎肝激酶(“flk”)受体亚家族。该组被认为由激酶插入域-受体胎肝激酶-1(KDR/FLK-1)、flk-1R、flk-4和fms样酪氨酸激酶1(flt-1)组成。

酪氨酸激酶生长因子受体家族的另一个成员是成纤维细胞生长因子(“FGF”)受体组。该组由四种受体FGFR1-FGFR4和七个配体FGF1-FGF7组成。在尚未很好鉴定时，似乎所述受体也由含有可变化数目的免疫珠蛋白样环状结构的糖基化细胞外域和其中PTK序列由不相关的氨基酸序列区中断的细胞内域组成。

Plowman等在DN&P，1994，7(6)：334-339中描述已知的RTK亚家族更完全的条目，该文献包括任何附图作为一整体通过引用结合到本文中。

除了RTKs以外，也存在一个称作“非受体酪氨酸激酶”或“细胞酪氨酸激酶”的完全细胞内PTKs家族。将在此使用后一名称，缩写为“CTK”。CTKs不含有细胞外域和跨膜域。目前，已在11个亚家族(Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes、Fps、Fak、Jak和Ack)中已经鉴定了超过24种CTKs。迄今Src亚家族似乎是最大的一组CTKs并且包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。对CTKs的更详细的讨论，参见Bolen，Oncogene，1993，8：2025-2031，其全文包括任何附图作为一整体提出，通过引用结合到本文中。

像CTKs一样，丝氨酸/苏氨酸激酶或STKs在细胞内占据主导地位，尽管仅有几种STK型受体激酶。STKs是最常见的细胞质激酶；即激酶在细胞质部分而不是在细胞质的细胞器和细胞骨架内发挥它们的功能。细胞溶胶是细胞内一个区域，在这里大多数细胞的中间代谢和生物合成活性发生；例如，蛋白质是在细胞溶胶中的核糖体上合成的。

RTKs、CTKs和STKs全部都明显与宿主的致病状况包括癌症有关。与PTKs有关的其它致病状况包括(但不局限于)牛皮癣、肝硬变、糖尿病、动脉粥样硬化、血管生成、再狭窄、眼科疾病、类风湿性关节炎和其它的炎性疾病、自身免疫疾病和多种肾病。

关于癌症，提出两个主要的假设来解释过度的细胞增殖，该增殖驱动与已知由PK调节的功能有关的肿瘤发展。即人们建议恶性细胞生长是由于控制细胞分裂和/或分化的机制被破坏引起的。已显示多种原癌基因的蛋白质产物参与调节细胞生长和分化的信号传导途径。原癌基因的这些蛋白质产物包括以上讨论的细胞外生长因子、跨膜生长因子PTK受体(RTKs)、细胞质PTKs(CTKs)和细胞质STKs。

癌症仍然是人类的一个主要死因。大多数癌症为实体肿瘤癌，例如(但不限于)，卵巢癌、结肠直肠癌、脑癌、肝癌、肾癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、甲状腺癌、卡波西肉瘤和皮肤癌。在实体肿瘤癌中，结肠直肠癌是特别常见的恶性肿瘤；在美国和大多数西方国家中，大约每20个人就有一个人受大肠的腺癌的影响。在美国，结肠直肠癌占全部新诊断癌症的约15％。同时结肠直肠癌是与癌症-有关的死亡的第三大死因，预后和结果高度依赖于疾病诊断时的阶段。如果在早期阶段即已确诊，则采用多学科的治疗方案时，结肠直肠癌还是具有较高治愈率的。然而，20-25％的诊断为该病的患者将出现转移灶或出现局部复发或转移性疾病；这些患者的大多数最终死于该病。

治疗实体肿瘤癌包括结肠直肠癌的主要方式是手术、放射治疗和化学治疗，这些治疗可以分开进行和联合进行。

尽管肿瘤的最初形成和生长并不需要新血管的形成，但任何进一步的生长却需要新血管生成。即是，对于体积生长超过3-4mm³的肿瘤来说，必需发生新血管的生长；即血管生成，也即从已有的血管中长出新的毛细血管。实际上，对生长中的肿瘤边缘的肿瘤切片的免疫组织化学分析表明其血管占优势，而与肿瘤类型无关。为实现这种新血管生成，血管生成因子从低氧肿瘤细胞中释放出来并迁移至邻近的血管内皮细胞，使这些细胞激活并发生形态学变化，移动并分裂。缺乏足够血管系统的肿瘤将会坏死(Brem，S.等，Cancer Res.，1976，36，2807-12)和/或编程性细胞死亡(apoptotic)(Holmgren，L.等，Nature Med.，1995，1：149-53；Parangi，S.等，Cancer Res.，1995，55：6071-6)，其中经历了新血管生成的肿瘤不仅可进入快速生长期，而且还显示增加的转移的趋势。在人类肿瘤血管生成的重要性的支持方面，有关人的血管生成表型和存活的最新研究表明，在原发性癌中的微血管数量对乳腺癌(Gasparini，G.和Harris，A.L，J.Clin.Oncol.，1995，13：765-82；Toi，M.等，Japan.J.Cancer Res.，1994，85：1045-9)、膀胱癌Dickinson，A.J.等，Br.J.Urol.，1994，74：762-6)、结肠癌(Ellis，L.M.等，Surgery，1996，120(5)：871-8)、口腔肿瘤(Williams，J.K.等，Am.J.Surg.，1994，168：373-80)的预后具有重要意义。在造血器官肿瘤和多发性骨髓瘤的生长中，血管生成也能起一定的作用(Bellamy，W.T等，Proc.Amer.Assoc.Cancer，Res.，1998，Abstract#2566)。

目前，恶性肿瘤血管生成的重要的介质被认为是内皮细胞有丝分裂原、血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是许多类型的小血管和大血管内皮细胞的有丝分裂原。它诱导组织因子、胶原酶和纤溶酶原激活剂和抑制剂的产生。VEGF有时因其通透性促进作用被称作“血管通透因子”(Landriscina，M.等，Brit.J.Cancer，1998，78(6)：765-770)。事实上，VEGF的血管通透因子效力比组胺高约50000倍，后者是熟知的血管通透分子(Dvorak，H.F.等，Am.J.Path.，1995，146：1029-39)。这种增加的通透性引起微分子如fibrogen从循环中的外渗，其提供内皮细胞以及肿瘤细胞迁移和组织的纤维蛋白胶质网眼或基质(Kumar，H等，Clin.Cancer Res.，1998，4：1279-85)。VEGF的表达已在体外被许多人类癌细胞系和手术切除的胃肠道、卵巢、脑、乳腺和肾的肿瘤所证实(Thomas，K.A.，J.Biol.Chem.，1996，271：603-6)。

VEGF也与结肠直肠癌的发生密切相关；即在结肠直肠癌患者的肿瘤组织中已发现VEGF水平增加。事实上，在VEGF的增加和肠壁侵蚀的阶段和深度之间观察到很强的相关关系(C.Barone等，Brit.J.Cancer，1998，78(6)：765-70)。VEGF的血清水平与Dukes阶段和癌胚抗原水平的显著相关及肝和/或淋巴结肿瘤转移患者趋向于比无此种肿瘤转移患者显示出较高的血清VEGF水平的发现与这种结果一致(Fujisaki，K.等.，Am.J.Gastroenterology，1998，93(2)：249-52)。

鉴于新血管生成对实体瘤生长的必要性和VEGF作为一种最重要的血管生成的介质(尤其是在结肠直肠癌中)的作用，人们期待着能够抑制VEGF的生血管作用的化合物，以延缓用基于氟尿嘧啶的结肠直肠癌治疗所观察到的反弹作用，从而在有或亚叶酸的情况下，增强氟尿嘧啶的化疗效果。这种方法的另一个优点可能是使用降低肿瘤产生新血管的能力的生血管抑制剂，因而所述抑制剂将是细胞抑制剂而非细胞毒性剂可给予标准的细胞毒性化疗；即是说，使用不同的作用机制以增强细胞毒性剂的疗效而无另外的毒性。发明概述

寻找调节蛋白激酶介导的信号传导的有机小分子的努力，已导致发现3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物，该类化合物调节蛋白激酶(PKs)，例如，受体酪氨酸激酶(RTKs)、细胞酪氨酸激酶(CTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)活性。其中RTKs包括Flk-1、Flt-1、Tie-1和Tie-2，已发现所有这些的表达均限制在内皮细胞中。涉及本发明的特别重要的是这样一个事实，即Flk-1被认为在血管生成中起至关重要的作用并且这种作用是通过VEGF介导的。这提示当对所述患者不给予化学治疗剂，例如(但不限于)氟代嘧啶时，3-亚杂芳基-2-吲哚满酮应能够抑制在此期间由VEGF-介导的肿瘤的血管生成及由此所致的肿瘤生长，并因此增强化学治疗剂的疗效。

因此，在一个方面，本发明涉及抑制细胞血管生成或血管发生的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物或其药学上可接受的盐或前药，该化合物具有下面的化学结构：

其中：R₁为H或烷基；R₂为O或S；R₃为氢；R₄、R₅、R₆和R₇各自独立选自氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤代甲基、S(O)R、SO₂NRR’、SO₃R、SR、NO₂、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、(CH₂)_nCO₂R和CONRR’；A为选自以下的5元杂芳环：噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰基呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，在一个或多个位置上由下列基团任选取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤代甲基、S(O)R、SO₂NRR’、SO₃R、SR、NO₂、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、(CH₂)_nCO₂R或CONRR’；n为0-3；和R和R’独立选自烷基或芳基。

“烷基”指直链、支链或环状的饱和脂肪烃。所述烷基优选具有1-12个碳原子。更优选其具有1-7个碳原子，最优选其为具有1-4个碳原子的低级烷基。典型的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。所述烷基可以由一个或多个选自下列的取代基任选取代：羟基、-C(O)OR、氰基、未取代的烷氧基、＝O、＝S、NO₂、卤素、NRR’和SR。

“链烯基”指含有至少一个碳-碳双键的烷基基团。

“链炔基”指含有至少一个碳-碳三键的烷基基团。

“烷氧基”指“-O-烷基”，其中烷基基团可以被一个或多个卤素任选取代。

“芳基”指具有至少一个芳环结构的基团，即具有共轭的pi-电子系统的芳环，包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基。所述芳基可以由一个或多个选自以下的取代基任选取代：卤素、三卤代甲基、羟基、SR、硝基、氰基、烷氧基、烷基和NRR’。

“烷芳基”指与芳基基团共价连接的烷基。优选该烷基为未取代的低级烷基。

“碳环芳基”指其中环原子为碳的芳基基团。

“杂环芳基”指具有1-3个杂原子作为环原子，其余的环原子为碳的芳基。杂原子包括氧、硫和氮。所述环可以是5-元环或6-元环。杂环芳基基团的实例包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。

“酰胺”指-C(O)NHR^a，其中R^a为烷基、芳基、烷芳基或氢。

“硫代酰胺”指-C(S)NHR^a。

“氨基”指NRR’，其中R和R’均是氢。

“硫醚”指-SR^b基团，其中R^b为烷基、芳基或烷芳基。

“卤素”指氟、氯、溴或碘。

“磺酰基”指-S(O)₂R^c，其中R^c为芳基、-C(CN)＝C-芳基、-CH₂CN、烷芳基、-SO₂NRR’、-NH(烷基)、-NH(烷芳基)或-NH(芳基)。

3-亚杂芳基-2-吲哚满酮的生理学上可接受的盐和前药也在本发明的范围内。

“生理学上可接受的盐”指对患者给药后，对该患者的健康无害的盐。本发明化合物可形成的生理学上可接受的盐包括带负电荷或正电荷的物质。其中化合物形成带正电荷部分的盐的实例包括(但不限于)季胺盐(本文另外定义)、盐例如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐。乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐，其中季铵基团的氮原子为本发明所选化合物的氮原子，其已与合适的酸反应。其中本发明化合物形成带负电荷物质的盐包括(但不限于)钠盐、钾盐、钙盐和镁盐，其可通过使所述化合物中的羧酸基团与合适的碱(如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)₂)等)反应而形成。

“前药”指的是在体内转化为母体药物的物质。前药经常是有用的，因为在一些情况下，它们可比母体药物更易于给药。例如，它们经口服给药是生物有效的而母体药物则不是生物有效的。前药在药用组合物中也可改善了溶解性来超过母体药物的溶解性。前药不加以限制的实例为本发明化合物，它作为酯(“前药”)给药以有利于穿过细胞膜，在此水溶性对流动性是有害的，但其后代谢水解为羧酸，即活性实体，一旦进入细胞，水溶性就是有益的。前药的另一个实例可为键合于的羧基的短的多肽，其中多肽基团的代谢除去释放出活性化合物

本发明的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物可以作为E或Z异构体或其混合物存在。所有这些构型均在本发明范围内。在本发明的优选实施方案中，3-亚杂芳基-2-吲哚满酮主要为Z-异构体(大于90％)。

“抑制”意指消除、减少、抑制、阻碍、防止、减慢、延缓和/或限制。在本发明优选的实施方案中，抑制指血管生成或血管发生的抑制。

“血管生成”活性意指组织中的新血管的形成。

“血管发生”意指新血管通过组织扩散而形成血管系统。

在另一方面，本发明的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物为3-[4-(2-羧乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构1)。

在本发明的另一个方面，3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物为3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构2)。

在本发明的另一个方面，提供治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的另一种化学治疗剂和治疗有效量的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮给予需要此种治疗的患者，其中3-亚杂芳基-2-吲哚满酮具有下面的化学结构：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和A与上面叙述的相同。

在优选的实施方案中，所述化学治疗剂为氟代嘧啶。

而且，3-亚杂芳基-2-吲哚满酮的生理学上可接受的盐或前药在本发明的联合化疗方面的范围内。

术语“方法”指的是用于完成所给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括(但不局限于)已知的或者通过化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员从已知的方式、手段、技术和步骤易于开发的那些方式、手段、技术和步骤。

对于癌症而言，术语“治疗”仅指的是延长癌症患者的预期寿命，将减少癌症的一种或多种症状和/或提高生命质量。

如在此所用的“给药”或“给予”指的是将本发明化合物、盐或前药或者含有本发明化合物、盐或前药的药用组合物传递给患者，以用于治疗癌症或预防或治疗PK相关疾病的目的。

包含”与“给药”在此联合使用时，意指根据本发明给予的药物可以仅作为3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物和化学治疗剂组合单独给予，或者可以扩大以包括其它药物，例如，当化学治疗剂为氟代嘧啶时，可使用亚叶酸，已知它或期望它能为联合用药提供加合效果。

一般来说，“治疗有效量”指有效预防、缓解、减轻或改善疾病症状或延长所治疗患者存活期的药物或其代谢产物的量。更具体地说，关于癌症的治疗，治疗有效量指的是具有以下作用的量，包括：(1)减少肿瘤的体积(或最好是消除肿瘤)，(2)抑制(即延缓到一定程度，最好是终止)肿瘤转移，(3)将肿瘤生长抑制到一定程度(即延缓到一定程度，最好是生长终止)和/或(4)将与癌症有关的一种或多种症状缓解至某种程度(或者最好是消除)。

除了上面的一般定义外，化学治疗剂的“治疗有效量”意指根据当今医学领域可能认识的水平，或根据将来使用这些药物的发展变化，以任何方式和任何治疗方案给予的量。在本发明的优选实施方案中，化学治疗剂为氟代嘧啶，特别是氟尿嘧啶，对于给予氟尿嘧啶来说，治疗方案为化疗领域已知的那些方案。

“治疗方案”指在确定的时间段内，设定的时间，以设定的方式，给予特定量的选择的化学治疗剂(和任选的其它药物如本发明的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物)。例如(但不限于)，使用氟尿嘧啶/亚叶酸治疗结肠直肠癌的通用治疗方案包括每日通过静脉推注(设定的方式)给予425mg/m²(每平米体表面积的毫克数，测量化学治疗剂的剂量的方法是本领域技术人员熟知的)氟尿嘧啶加20mg/m²亚叶酸(特定量的所选药物)，持续5天(设定的时间)，以4-5周的间隔(确定的时间段)重复进行。

当涉及治疗方案内的给药的“设定的时间”时，“连续天”指连续的日历日，即星期一、星期二、星期三等。“错开的”天指在其之间还有其它日历日的日历日，例如(但不限于)，星期一、星期三、星期六等。

而且，关于“治疗有效量的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮”，该短语指足以在“恢复”期内抑制肿瘤的生长、大小和血管生成，即血管生成和/或血管发生的量，即在该期内的治疗方案中没有其它化学治疗剂给予患者。

“患者”指对PK相关疾病(尤其是癌症)易感的高等有机体。“患者”优先指哺乳动物，尤其是人。

“氟代嘧啶化学治疗剂”是化学治疗领域技术人员熟知的；可以与本发明化合物一起使用的氟代嘧啶的实例(但不限于)卡莫氟、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、加西他滨和尿嘧啶-替加氟(UFT)。

在本发明的优选实施方案中，氟代嘧啶化学治疗剂为氟尿嘧啶。

当氟代嘧啶化学治疗剂为氟尿嘧啶时，上面治疗癌症的方法也包括亚叶酸，这也是本发明的优选实施方案。

在本发明的另一个方面，与其它化学治疗剂联合用于治疗癌症的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮选自5-羟基-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构3)、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(结构4)、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(结构5)、3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(结构6)和4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛(结构7)。

在本发明的另一个方面，与其它化学治疗剂联合用于治疗癌症的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮为3-[4-(2-羧乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构1)。

在本发明的另一个方面，与其它化学治疗剂联合用于治疗癌症的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物为3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构2)。

可以用上述方法治疗的癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。

本发明的另一个方面是治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的氟尿嘧啶和治疗有效量的选自3-[4-(2-羧乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的化合物给予需要此种治疗的患者。

在优选的实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌。

在本发明的另一方面，以上治疗癌症的方法包括使用亚叶酸。

氟尿嘧啶的治疗有效量为约300mg/m²-约800mg/m²，优选为约400mg/m²-约500mg/m²的化合物。

在本发明的另一方面，治疗有效量的氟尿嘧啶可作为静脉大剂量注射或作为连续的静脉输注给予。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的治疗有效量为约4mg/m²-约190mg/m²，优选为72mg/m²-约145mg/m²的化合物。

治疗有效量的亚叶酸包括约20-约500mg/m²，优选约20-约200mg/m²的化合物。

本发明的另一个方面是包括在一天或几天内给予约400-约500mg/m²的氟尿嘧啶的治疗方案，可以是连续的或错开给予，此后在一天或几天内给予约72mg/m²-约145mg/m²的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮，同样，给药日可以是连续的或错开的。

在另一方面，在给予氟尿嘧啶的日子也可给予20mg/m²亚叶酸。

在本发明的优选实施方案中，上述治疗方案为4周的治疗方案，在治疗方案第一周的1、2、3、4和5天，静脉大剂量注射给予氟尿嘧啶(及任选的亚叶酸)，而在治疗方案的第2、3和4周，每周两次静脉大剂量注射给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮。

本发明的另一方面为治疗癌症的方法，该方法包括将治疗有效量的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和治疗有效量的吉西他滨，另一种氟代嘧啶化合物给予需要此治疗的患者。吉西他滨在治疗晚期胰腺癌时已显示出特殊的有效性。而且，在与其它化疗剂如紫杉酚、卡铂、多柔比星(特别是脂质体多柔比星)和托泊替堪的组合中，吉西他滨对其它顽固性的实体肿瘤癌包括晚期卵巢癌、小细胞肺癌和肾癌显示出明显的活性。吉西他滨与3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的组合，单独或与另外的化疗剂例如上文确定的那些治疗剂的进一步组合，对涉及氟代嘧啶的一般讨论的理由而言，应提供对实体瘤的加合抑制活性，而无附加的其它毒性。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与核苷类似物而非吉西他滨的组合也是本发明设计的。

另一个与3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮组合有益的嘧啶类似物为加西他滨，其对转移性的乳腺癌显示出有效性；这样的组合是本发明的另一个方面。

此外，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与嘧啶化疗剂5-FU或UFT或其衍生物、类似物或其有关药物的化疗组合为本发明的一个方面。

本发明的另一方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与卡铂、奥沙利铂、顺铂或有关的化疗剂的组合。卡铂和顺铂是目前最好的治疗晚期卵巢癌的药物而奥沙利铂为治疗转移性的结肠直肠癌的第一线化疗剂。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与卡铂或顺铂联合用药可使这两种治疗癌症必用的极毒的化疗剂的量减少。此外，卡铂或顺铂与紫杉酚的组合在卵巢癌的治疗中显示出良好的前景。将3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮加入化疗剂的这种组合产生涉及以上组合所讨论的相同的优点。优选的化疗组合由3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮、顺铂和吉西他滨组成。

本发明的另一方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与紫杉酚(taxol)、它的合成的类似物docetaxel或聚谷氨酸化紫杉烷的组合。紫杉酚已被FDA批准用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌和AIDS-相关癌症的治疗。紫杉酚/docetaxel通过不同于本发明化合物的机理起作用，即它们阻断细胞在有丝分裂期间破坏有丝分裂纺锤体的能力。因此，这些具有其特殊作用方式的药物，与3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的抗生成血管活性组合，可产生有效的杀肿瘤/抑制肿瘤的联合作用。

本发明的另一方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与CPT11(伊立替康)，一种为拓扑异构酶I抑制剂的喜树碱衍生物组合，已证明其有效抑制结肠直肠癌。本发明也设计了使用与CPT11有关的化疗剂的联合疗法。而且，这些作用的方式的组合可对治疗这一类型的癌症具有显著的益处。

本发明的另一方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与沙利度胺的组合，其尤其对顽固性骨髓瘤显示出明显的化疗用途，而且还抑制多形性成胶质细胞瘤，一种恶性脑癌。对这种组合有反应的其它癌包括前列腺癌、乳腺癌和皮肤癌(卡波西肉瘤)。

本发明的一个方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与COZ-2抑制剂的化疗组合。环加氧酶-2的抑制防止促进血管生成的因子产生。这种组合将对癌细胞活力必需的血管形成提供两种攻击方式。

由3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和他莫昔芬或其衍生物组成的联合疗法为本发明的一个方面。他莫昔芬干扰雌激素的活性，这种活性已表明可促进乳腺癌细胞的生长。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮，一种抗血管生成化合物，与此种“抗雌激素”化合物的组合可提供对乳腺癌的有效的加合治疗。

本发明的一个方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与亮丙瑞林，一种天然存在的促性腺激素释放激素的合成九肽类似物的组合，已证实其特别对睾丸癌，但也对卵巢癌和乳腺癌的抑制有效性。本发明也设计了使用与亮丙瑞林有关的药物的联合疗法。通过将这两种不同作用方式的化合物结合，可获得明显的益处。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与制管张素、endostatin或类似的化学治疗剂(其通过编程性细胞死亡抑制血管生成)的化学治疗剂组合同样为本发明的一个方面。编程性细胞死亡为一种程序性细胞死亡。杀死细胞的抗血管生成与细胞停滞的抗血管生成的组合可以是高效的化学治疗剂组合。

此外，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与基质金属蛋白酶抑制剂的化学治疗剂组合。已显示MMPs涉及许多疾病状态包括癌。MM抑制剂，例如(但不限于)AG3340，已显示出针对实体肿瘤癌如非-小细胞肺癌和激素-难治的前列腺癌的抑制肿瘤(tumoristatic)效果。血管生成抑制剂的加入将提供协同的联合治疗效果。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与干扰素的组合是本发明的另一个方面。干扰素α及其各种亚型(如(但不限于)干扰素αA/2a、α/2b、αB2/a8 )为确定的抑制此类癌症如毛细胞白血病、慢性骨髓白血病、肾癌、黑素瘤、低级淋巴瘤、多发性骨髓瘤和卡波西肉瘤。

本发明的另一个方面是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与多柔比星、柔红霉素和其它蒽环素抗肿瘤的抗生素，及其衍生物和制剂(例如(但不限于)脂质体多柔比星)的化学治疗剂组合。多柔比星被广泛用于治疗恶性淋巴瘤、白血病、头和颈部鳞状细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌。脂质体多柔比星已被批准用于治疗卡波西肉瘤。被3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的抗-血管生成活性削弱的肿瘤细胞可能对多柔比星更加敏感。采用3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和metoxantrone(一种有关的化学治疗剂)的联合疗法也是本发明专门设计的。

为本发明的一个方面的另一种化学治疗组合是3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与雌莫司汀及其有关的化学治疗剂的组合，其在治疗顽固性前列腺癌中显示出特殊的用途。雌莫司汀通过干扰DNA的合成引起细胞死亡。而且不同作用模式的结合，即DNA合成的破坏和抗-血管生成可提供有用的化学治疗组合。

采用3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和长春花碱类，包括(但不限于)长春新碱和长春碱的联合疗法也是本发明设计的。

本发明的另一个方面是选自5-羟基-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(结构3)、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(结构4)、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(结构5)、3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢吲哚-2-酮(结构6)和4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛(结构7)的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮。

以上化合物的生理学上可接受的盐和前药也在本发明范围内。

在另一方面，本发明涉及调节PKs的催化活性的方法，包括使PK与具有上文所示结构之一的化合物接触。

如在此使用的术语“调节”或“调控”指的是改变RTKs、CTKs和STKs的催化活性。调节尤其指的是RTKs、CTKs和STKs催化活性的活化，优选指的是依RTK、CTK或STK所接触的化合物或者盐的浓度而定的RTKs、CTKs和STKs催化活性的活化或者抑制，或者更优选指的是RTKs、CTKs和STKs的催化活性的抑制。

如在此使用的术语“催化活性”指的是在RTKs和/或CTKs直接或间接影响下酪氨酸磷酸化的速率，或者在STKs直接或间接影响下丝氨酸和苏氨酸磷酸化的速率。

如在此使用的术语“接触”指的是使本发明化合物与靶PK结合到一起，所述化合物以这样的方式能够影响PK的催化活性，即或者直接通过与激酶本身相互作用，或者间接通过与另一个激酶的催化活性依赖的分子相互作用。这样的“接触”可在“体外”即在试管、petri盘等中能够完成，在试管中，接触仅包括一个化合物与关注的PK或者可包括整个细胞。细胞也在细胞培养基盘中维持或生长并在该环境中与化合物接触。在本文中，具体化合物影响与PK相关疾病的能力，即如下定义的化合物的IC₅₀在试图在体内用化合物与更复杂的生命有机体之前能够测定。对有机体外部的细胞，存在得到与化合物接触的PKs的多重方法并且这些方法对那些本领域技术人员是熟知的，方法包括(但不局限于)直接的细胞微注射和多种跨膜载体技术。

在本发明的另一方面，上文提及的PK选自RTK、CTK或STK。

而且，本发明的一个方面是，由本发明化合物调节催化活性的受体蛋白激酶选自EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、C-kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R和FGFR-4R。

另外，本发明的一个方面是，由本发明化合物调节催化活性的细胞酪氨酸激酶选自Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAP70、Fes、Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。

本发明另一方面是，由本发明化合物调节催化活性的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶选自CDK2和Raf。

在另一方面，本发明涉及在需要此种治疗的患者中治疗或预防与PK-相关的疾病的方法，包括给予所述患者治疗有效量的一种或多种上述化合物。

如在此使用的“PK相关的疾病”、“PK引起的疾病”和“异常PK活性”全部指以不适当的即低下的，或者更常见地是过度的PK催化活性为特征的疾病，其中具体的PK可以是RTK、CTK或STK。不适宜的催化活性能够作为以下的结果出现：(1)在不能正常表达PKs的细胞中PK表达，(2)导致不合乎需要的细胞增殖、分化和/或生长的增加的PK表达，或者，(3)导致不合乎需要的细胞增殖、分化和/或生长的减少的降低的PK表达。PK的过度活性指的是基因编码具体PK的扩增或者产生PK活性的水平，其可与细胞增殖、分化和/或生长失调(即由于PK水平增加，细胞失调的一种或多种症状的严重性增加)相关。当然，活性低下是相反的，其中细胞失调的一种或多种症状的严重性随着PK活性水平的降低而增加。

涉及与PK-相关的疾病的“治疗”、“治疗的”和“治疗作用”指的是缓解或消除PK-相关的疾病的病因和/或影响。

在此使用的术语“预防”、“预防的”和“预防作用”指的是阻碍有机体在第一个部位获得PK相关疾病的方法。

在本发明的另一方面，PK-相关的疾病选自RTK、CTK和STK相关的疾病。

在本发明的另一方面，以上提及的PK-相关的疾病选自EGFR相关的疾病、PDGFR相关的疾病、IGFR相关的疾病和flk相关的疾病。

在本发明另一方面，以上提及的蛋白激酶相关的疾病为选自鳞状细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、结肠直肠癌、胃肠癌和神经胶质瘤的癌症。

在本发明另一方面，以上提及的与蛋白激酶有关的疾病选自糖尿病、自身免疫性疾病、过度增殖疾病、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎、类风湿性关节炎、炎性疾病和血管生成。

可使用本发明化合物治疗的其它疾病包括(但不限于)免疫性疾病和心血管疾病例如动脉粥样硬化。

本发明的另一方面是以上化合物的药用组合物。

“药用组合物”指的是在此描述的一种或多种化合物或药物或者它们的生理学上可接受的盐或前药，与其它的化学成分例如生理学上可接受的载体和赋形剂的混合物。药用组合物的目的是使得化合物便利地给予有机体。

如在此使用的“生理学上可接受的载体”指的是不会消除所给予的化合物的生物活性和特性，同时通过例如增加该化合物的稳定性或溶解性而便利给药的载体或稀释剂。优选所述载体不引起对有机体的明显刺激作用。

“赋形剂”指的是加入到药用组合物中以进一步便利于给予化合物的物质。赋形剂的实例包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、表面活性剂和聚乙二醇。

本发明的另一方面是在细胞中抑制致瘤活性的方法，该方法包括使该细胞与本发明的3-亚杂芳基2-吲哚满酮接触。

如在此所用的“致瘤”活性，当其涉及细胞时，指造成肿瘤形成的细胞内和细胞外生物化学活性两者。

“肿瘤”为通过比正常更快的细胞增殖所致生长的异常组织，所述异常组织甚至在引发新的生长停止的刺激后仍继续生长。肿瘤部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能的协调性，并且通常形成不同的组织块。这样的块可以是良性的(良性肿瘤)或恶性的(实体肿瘤癌)。恶性肿瘤是局部侵袭性的和破坏性的，并且在许多情况下发生转移(从远离原发部位扩散至受累机体区域的组织，侵入并破坏组织)。肿瘤形成的过程通常称作“瘤形成”，即瘤形成是生化过程，藉此肿瘤得以形成和生长。

在此可互换使用的术语“恶性肿瘤”、“癌”、“肿瘤”和“实体肿瘤癌”指本领域技术人员熟知的疾病，如普通简单称为“癌”的威胁生命的疾病。

对于致瘤活性而言，“抑制”指消除、减退、控制、阻碍、防止、减慢、延缓和/或限制瘤形成。

“化学治疗剂”指用于治疗疾病的化学物质或药物；该术语最常用于主要用来治疗癌症的此类物质或药物。发明详述1.适应症/靶疾病

梗概

由本发明化合物调节催化活性的PKs包括蛋白酪氨酸激酶(其具有两种类型：受体酪氨酸激酶(RTKs)和细胞酪氨酸激酶(CTKs))和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。经细胞外与特异性生长因子(配体)相互作用，随后经受体二聚作用，短暂刺激内在蛋白酪氨酸激酶活性和磷酸化作用引发RTK介导的信号传导。由此产生细胞内信号传导分子的结合位点并导致与一系列细胞质信号分子形成复合物，以利于适宜的细胞应答(例如细胞分裂、对细胞外微环境的代谢作用等)。参见Schlessinger和Ullrich，1992，Neuron，9：303-391。

已显示在生长因子受体上酪氨酸磷酸化作用位点作为对SH2(src同源物)信号分子域的高亲和性接合位点起作用。Fantl等，1992，Cell69：413-423，Songyang等，1994，Mol.Cell.Biol.14：2777-2785)，Songyang等，1993，Cell 72：767-778，和Koch等，1991，Science252：668-678。已鉴定与RTKs有关的几种细胞内底物蛋白质。它们可分为两个主要的组：(1)具有催化域的底物和(2)缺乏这样的域的底物但是其用作接合体并与催化的活性分子相关，Songyang等，1993，Cell 72：767-778。由紧绕着磷酸化酪氨酸残基的氨基酸残基确定受体和它们的底物的SH2域之间的相互作用的特异性。在SH2域和在围绕特殊受体上的磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间的结合亲合性之间的差异与在它们的底物磷酸化作用模式(profiles)中所观察到的差异相一致。Songyang等，1993，Cell 72：767-778。这些观察提示不仅通过其表达的模式和配体可利用性而且通过特殊受体活化的下游信号传导途径的阵列测定每种RTK的功能。因此，磷酸化作用提供重要的调节步骤，其确定经特异性生长因子受体以及分化因子受体募集的信号途径的选择性。

主要是细胞质的STKs经常作为对PTK事件的下线应答来影响细胞内部的生物化学。STKs参与引发DNA合成并随后有丝分裂导致细胞增殖的信号过程。

因此，在其它应答中PK信号传导导致细胞增殖、分化、生长和代谢。异常的细胞增殖可导致广泛的失调和疾病，包括瘤形成例如癌、肉瘤、成细胞胶质瘤和血管瘤的发展，疾病例如白血病、牛皮癣、动脉硬化、关节炎和糖尿病视网膜病和其它的与未控制的血管发生和/或血管形成有关的疾病。

为了实施本发明，并不需要准确理解本发明化合物抑制PKs的机制。然而，并不限制于任何特别的机制或理论，人们确信化合物在PKs的催化区与氨基酸相互作用。PKs一般具有一个两裂片结构，其中ATP似乎结合在氨基酸被保持在PKs之间区域中两裂片之间的裂缝中。相信PKs抑制剂在前述ATP结合于PKs的相同一般区域中经非共价相互作用例如氢键、范德华力和离子相互作用来结合。更详细地说，人们认为本发明化合物的2-吲哚满酮成分通过ATP的腺嘌呤环结合在一般正常占据的空间中。然后特别分子对特定PK的特异性可作为在2-吲哚满酮核上多种取代基和对特定PKs的特异性的氨基酸域之间的另外的相互作用的结果出现。因此，不同的吲哚满酮取代基可有助于优选结合到特定的PKs上。选择在不同ATP(或者其它的核苷酸)结合位点上具有活性的化合物的能力使得本发明化合物用于针对具有这样位点的任何蛋白质。在此公开的化合物可因此具有作为用于这样蛋白的体外试验以及通过与这样的蛋白相互作用呈现体内治疗作用的用途。

另一方面，通过与本发明化合物接触调节其催化活性的蛋白激酶为蛋白酪氨酸激酶，更详细地讲，它是受体蛋白酪氨酸激酶。在其催化活性能够由本发明化合物或者它们的盐调节的受体蛋白酪氨酸激酶当中，包括有(不局限于)EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、C-Kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R和FGFR-4R。

其催化活性通过与本发明化合物或者它们的盐或前药接触调节的蛋白酪氨酸激酶也能够为非受体或细胞蛋白酪氨酸激酶(CTK)。因此，可通过与本发明化合物或盐接触来调节CTKs例如(不局限于)Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAP70、Fes、Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk的催化活性。

可与本发明化合物接触以调节它们的催化活性的另一组PKs为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶例如(不局限于)CDK2和Raf。

在另一方面，本发明涉及通过将治疗有效量的本发明化合物或者它们的盐或前药给予有机体来治疗或预防PK相关疾病的方法。

将含有本发明化合物或者它们的盐或前药的药用组合物给予有机体以用于预防或治疗PK相关疾病也是本发明的一个方面。

本发明因此涉及通过影响RTKs、CTKs和/或STKs的酶活性来调节PK信号传导，进而干扰由这样的蛋白传导的信号的化合物。更详细地讲，本发明涉及调节RTK、CTK和/或STK介导的信号传导途径作为治疗方法以治愈许多种类的实体肿瘤，包括(但不局限于)癌、肉瘤包括卡波西肉瘤、成红细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、黑素瘤和成肌细胞瘤的化合物。本发明也期待治疗或预防非实体肿瘤的癌症例如白血病。适应症可包括(但不局限于)脑癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。

与在此描述的化合物可用于预防、治疗和研究的不适当的PK活性相关的多种类型疾病的另外实例(不局限于)为细胞增殖失调、纤维变性疾病和代谢紊乱。

可由本发明预防、治疗或进一步研究的细胞增殖失调包括癌症、血管增生性疾病和肾小球系膜细胞增殖失调。

血管增生性疾病指的是与异常血管形成(血管形成)和血管发生(血管的扩展)有关的疾病。当血管形成和血管发生在多种正常生理过程例如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生中起重要作用时，它们也在癌症发展中起关键性作用，在那儿它们引起保持肿瘤存活所需的新的毛细血管的形成。血管增生性疾病的其它实例包括其中新的毛细血管侵袭关节并破坏软骨的关节炎和眼科疾病，如其中视网膜中新的毛细血管侵袭玻璃体、出血并引起失明的糖尿病视网膜病。

相反，也涉及与血管皱缩、收缩或闭塞有关的疾病，如再狭窄且可用本发明的方法治疗或预防。

纤维变性疾病指的是细胞外基质的异常形成。纤维变性疾病的实例包括肝硬变和肾小球系膜细胞增殖疾病。肝硬变的特征在于导致肝疤痕形成的细胞外基质成分增加。通过病毒感染如肝炎也能够引起导致肝疤痕的细胞外基质增加。脂细胞在肝硬变中似乎起主要作用。其它有关的纤维变性疾病包括动脉粥样硬化。

肾小球系膜细胞增殖疾病指的是由肾小球系膜细胞的异常增殖引起的疾病。肾小球系膜增殖疾病包括多种人的肾疾病例如肾小球肾炎、糖尿病性肾病和恶性肾硬化以及这样的疾病如血栓性微血管病综合征、移植排斥反应和肾小球病。RTKPDGFR已参与肾小球系膜细胞增殖的维持。Floege等，1993，Kidney International 43：47S-54S。

许多癌症为细胞增殖疾病并且如同先前提到的那样，PKs与细胞增殖疾病有关。因此，PKs如RTK家族的成员与癌症的发展有关是不令人惊奇的。像EGFR(Tuzi等，Br.J.Cancer，1992，63：227-233，Torp等，1992，APMIS 100：713-719)、HER2/neu(Slamon等，Science，1989，244：707-712)和PDGF-R(Kumabe等，Oncogene，1992，7：627-633)一样，这些受体中的一些在许多肿瘤中过度表达和/或经自分泌环持续活化。事实上，在大多数普通的和严重的癌症中，已证实这些受体过度表达(Akbasak和Suner-Akbasak等，J.Neurol.Sci.，1992，111：119-133；Dickson等，Cancer Treatment Res.1992，61：249-273；Korc等，J.Clin.Invest.1992，90：1352-1360)和自分泌环状结构(Lee和Donoghue，J.Cell.Biol.，1992，118：1057-1070；Korc等，同上，Akbasak和Suner-Akbasak，同上)。例如，EGFR与鳞状细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、头和颈癌、肺癌和膀胱癌有关。HER2与乳腺、卵巢、胃、肺、胰腺和膀胱癌有关。PDGFR与成胶质细胞瘤和黑素瘤以及肺、卵巢和前列腺癌有关。RTK c-met也与恶性肿瘤形成有关。例如，在其它的癌症中，c-met与结肠直肠、甲状腺、胰腺、胃和肝细胞癌和淋巴瘤有关。另外，c-met与白血病有关。在患有何杰金氏病和伯基特氏病的患者中也检测到c-met基因的过度表达。

Flk同样与广泛的肿瘤谱，包括(但不限于)乳腺癌、卵巢癌和肺癌以及神经胶质瘤如成胶质细胞瘤有关。

除了涉及营养保持和II型糖尿病以外，IGF-IR也与几种类型的癌症有关。例如，IGF-I作为自分泌生长刺激因子与几种肿瘤类型如人乳腺癌细胞(Arteaga等，J.Clin.Invest.1989，84：1418-1423)和小肺肿瘤细胞有关(Macauley等，Cancer Res.，1989，50：25 11-2517)。另外，在整体参与神经系统的正常生长和分化期间，IGF-I也似乎为人神经胶质瘤的自分泌刺激因子。Sandberg-Nordqvist等，Cancer Res.，1993，53：2475-2478。IGF-IR和它的配体在细胞增殖中的重要性进一步通过以下事实得到支持，即通过IGF-I刺激生长在培养基中的多种细胞类型(成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T-淋巴细胞、骨髓细胞、软骨细胞和成骨细胞(骨髓的干细胞))。Goldring和Goldring，真核基因表达，1991，1：301-326。在一系列最近的出版物中，Baserga提示IGF-IR在转化的机制中起重要作用并且如同这样的转化能够成为优选的靶，用于治疗性介入广谱的人恶性肿瘤。Baserga，Cancer Res。1995，55：249-252。Baserga等，Cell，1994，79：927-930。Coppola，Mol.Cell.Biol.，1994，14：4588-4595。

STKs已涉及多种类型的癌症，包括值得注意的乳腺癌(Cance等，Int.J.Cancer，54：571-77(1993))。

异常PK活性与疾病之间的关系并不局限于癌症。例如，RTKs与疾病例如牛皮癣、糖尿病、子宫内膜异位症、血管发生、动脉粥样化斑发展、阿尔茨海默氏病、表皮过度增殖、神经退化疾病、与年龄相关的肌肉退化和血管瘤有关。例如已表明EGFR是角膜和皮肤伤口愈合的原因。表明在胰岛素-R和IGF-1R中的缺陷是II型糖尿病的原因。在Plowman等，DN&P，1994，7：334-339中阐明特异性RTKs与它们的治疗适应症之间更完全的相关性。

如同先前提到的那样，不仅RTKs而且CTKs包括(但不局限于)src、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr和yrk(由Bolen等，FASEB J.，1993，6：3403-3409综述)也与增殖和代谢信号传导途径有关并因此能够被期待，且已显示出参与多种本发明所针对的PTK介导的疾病。例如，突变的src(v-src)已在鸡中显示为一种肿瘤蛋白(pp60^v-src)。此外，它的细胞同源物原癌基因pp60^c-src传递多种受体的致肿瘤信号。在肿瘤中过度表达的EGFR或HER2/neu导致pp60^c-src的构成活化，其为恶性肿瘤细胞的特性但在正常细胞中是不存在的。另一方面，小鼠在c-src表达上的缺陷呈现骨硬化病的表型，表明c-src在破骨细胞功能上的关键参与作用并可能与相关的疾病有联系。

相似地，Zap70涉及与自身免疫失调有关的T-细胞信号。

STKs与炎症、自身免疫疾病、免疫应答和过度增殖疾病如再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎和类风湿性关节炎有关。

PKs也涉及胚胎植入。因此，本发明化合物可提供预防这样的胚胎植入的有效方法并由此用作生育控制药物。

最后，目前猜测RTKs和CTKs两者与超免疫失调有联系。

鉴定调节以上讨论的一种或多种蛋白激酶的催化活性的化合物的方法为本发明另一个方面。该方法包括使表达要求的蛋白激酶的细胞与本发明化合物(或者其盐或前药)接触并监测化合物对细胞的任何作用。可通过裸眼或通过使用仪器观察到该作用，细胞表型的变化或不变化。受到监控的细胞表型上的变化或不变化可为例如(不局限于)细胞中的蛋白激酶催化活性的变化或不变化或者蛋白激酶与自然结合配偶体相互作用的变化或不变化。

血管生成和结肠直肠癌中的VEGF和Flk-1/KDR

肿瘤细胞释放生长因子，其粘附在附近的内皮细胞上(一种旁分泌作用模式)，由此刺激静止的内皮细胞分裂并形成新的血管。血管内皮生长因子(“VEGF”)对其受体之一的粘附启动了调节涉及新血管形成的细胞事件的信号级联放大。

一些受体酪氨酸激酶被认为是直接或间接涉及血管生成。近十年来，对受体的选择性抑制作用将阻止支持肿瘤生长的新血管生长的研究已集中在基础研究上。虽然有许多受体(其表达限于内皮细胞，包括Flk-1、Flt-1、Tie-1和Tie-2)，但相信Flk-1受体在血管生成中起关键作用。

VEGF表达的短暂的和空间的模式及其受体支持这些受体在正常血管生成的胚发育期的作用。VEGF、Flt-1和Flk-1也与支持许多实体瘤生长的病理性血管生成有关，这些实体瘤有神经胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌和其它胃肠道癌。已观察到VEGF表达与乳腺癌、肾细胞癌和结肠癌的血管密度之间的相关性。在高度血管化的成胶质细胞瘤中，对VEGF及其受体的转录物已通过在位杂交技术识别；在较少的血管、低级神经胶质瘤或在正常的脑组织中未检测到转录物。在这种情况下(支持旁分泌作用模式)，在血管的内皮细胞中检测到Flk-1受体，同时VEGF定域于肿瘤细胞中。已显示VEGF及其受体可表达于造血肿瘤细胞系，包括多发性脊髓瘤细胞。

VEGF在体外对内皮细胞是促有丝分裂的。在这样一种体系中，中和抗Flk-1的抗体抑制有丝分裂发生。类似地，裂解flk-1或flt-1mRNAs的核酶减缓人微血管内皮细胞的生长，推测是减少了所述细胞上的受体数目所致。

采用多种体内技术来研究VEGF信号在肿瘤血管生成中的作用。缺乏细胞内激酶域的Flk-1受体阻断培养的细胞的内源性Flk-1受体活性的激活作用，抑制皮下植入到裸鼠的肿瘤的生长。在这种动物模型中形成的任何肿瘤都具有显著减少的血管密度。而且，具有反义构成物的VEGF表达的减少抑制C6大鼠神经胶质瘤细胞在裸鼠(小鼠)中的生长，同时在这些肿瘤中伴有减少的血管密度并抑制人黑素瘤细胞在裸/SCID小鼠中的生长。同样，伴随中和抗体的VEGF水平的减少抑制人横纹肌肉瘤、多形性成胶质细胞瘤和平滑肌肉瘤在裸鼠和纤维肉瘤在BALBc/裸鼠中的生长。

总之，这些结果提供了VEGF信号通过Flk-1在实体瘤生长中的血管生成中的重要作用的强有力的证据。在癌症患者中，Fkl-1的抑制剂可具有治疗的益处。2.药理学

在基于细胞的分析中，已发现3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮抑制在VEGF与其受体相互作用后通常出现的受体磷酸化。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的体外研究已经证实其抑制Flk-1自身磷酸化的能力，其IC₅₀值约1μM。此外，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮抑制由具有约0.07μM的IC₅₀值的VEGF诱导的内皮细胞的体外增殖。在这种分析中，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的效力出现时间依赖性增加，其在接触药物5分钟后首次观察到可检测到的活性。接触3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮1小时后，在体外产生抗增殖活性3-4天。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在最高可达50μM的浓度下，对各种肿瘤细胞系没有直接的抑制作用。

在3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的体内研究中，将各种肿瘤细胞系皮下植入免疫受损的小鼠中，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮显示对广谱的肿瘤类型的肿瘤生长的明显抑制作用，这些肿瘤的生长受各种生长因子如PDGF、EGF和Her2的驱动。每日腹膜内给药(范围为12.5-25mg/kg/天，持续28天)引起30-80％肿瘤生长的抑制。在初步研究中，在肿瘤植入后的第一天，开始给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮。在随后的研究中，延迟给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮，直至肿瘤生长至体积约50mm³，结果证实抑制肿瘤生长的相同效果。

用皮下植入无胸腺小鼠中的人黑素瘤细胞进行3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(剂量在6.25-25mg/kg/天之间)的剂量反应研究。每日给予剂量低至1mg/kg/天的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮引起对这些细胞的剂量依赖性抑制。在另外的研究中，较少次数的腹膜内给予(包括每周两次，持续4周)无胸腺小鼠3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与每日腹膜内给药比较时，也引起相同的肿瘤生长抑制(每周两次给予为77％对每日给予为68％)。

每日给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮(25mg/kg/天)也表明明显抑制在结肠绒膜下经手术植入的肿瘤细胞的生长。用3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮处理导致肿瘤体积减小和减少血管生成，如在3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮-处理过的动物中肿瘤的苍白外观所证实的。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的药代动力学

体外的洗出试验证实96小时的目标半衰期，提示3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与受体酪氨酸激酶的ATP结合位点存在非常紧密的竞争性结合。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在小鼠、大鼠和狗的体内静脉内药代动力学以循环血中母体化合物的迅速消除为特征。在大鼠与小鼠和狗的比较试验中，确定了有稍长的消除半衰期。(数据未示出)。

在大鼠中的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的药代动力学在较高的静脉剂量时为剂量依赖性的。在剂量为29.5-97.9mg/m²时，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的消除半衰期随剂量增加呈线性增加；在剂量仅增加3倍时，AUC增加10倍。

在大鼠和狗中的亚慢性毒物动力学研究(28天毒性研究)表明，药物重复给予时在血浆中无蓄积。

使用[¹⁴C]-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的全身放射自显影图证实，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在静脉注射后在组织中广泛分布，随后被迅速清除，并伴有存在于小肠内容物和尿中的最高水平(其余的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在肝、肾、皮肤、睾丸、褐脂组织、副泪腺和鼻甲中观察到)。在24小时内回收的总剂量等于给药总剂量的92％，有72％从粪便排出，16％从尿中排出。胆汁排出被认为是消除的主要的途径。

采用非标记的和[¹⁴C]-标记的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的研究证明，对大鼠静脉给药后，该化合物被迅速代谢。放射代谢物分布表明，90％以上的[¹⁴C]-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在静脉给药后3小时内被代谢。对代谢物鉴定的数据提示，一种代谢物在吡咯环的一个甲基上加入了羧基，而第二个代谢物在羧基上加入了甲基。

在晚期恶性肿瘤患者(其中患者接受了剂量4.4-190mg/m²的治疗)中进行的1期研究所得到的初步药代动力学数据表明，该药物在人体内具有约60分钟的半衰期。α半衰期是迅速的，平均为5.8±1.9分钟。β半衰期或消除期的平均值为43.4±21.9分钟，其范围为10-111分钟。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮从系统循环中的清除是迅速的，每日清除3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的血浆的均值为1857±1016升。在这些水平上，清除是不依赖剂量的。基于BSA计算的个体清除率等于41.8±22.1L/小时/m²。在输注8次3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮后，所有患者的清除率增加50-300％。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的总的分布体积(通过一区室模型计算)为53.6±11.3升，表明该药物分布于全身体液中。到目前为止，在人的试验剂量下，AUC和C_MAX与剂量呈线性增加。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮代谢的主要途径是通过吡咯环5位上的甲基的后续氧化反应。四种代谢物在血清中是可测量到的，这四种代谢物均参与吡咯环上的该甲基的序列氧化反应。从体外代谢研究获得的数据显示，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮是通过P-450肝酶代谢的，最有可能是通过CYP1A2和CYP3A4代谢的，两者均为可诱导的酶。特别是CYP3A4被多种异生素诱导，包括在所有的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮注射前作为前药给予的地塞米松。氟尿嘧啶和氟尿嘧啶/亚叶酸-梗概

氟尿嘧啶的化学结构为5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮。虽然氟尿嘧啶作用的精确模式还不清楚，但认为该药物以至少3种方式作为抗代谢物发挥其功能。在一个方面，作为它的脱氧核苷酸衍生物，5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-磷酸(F-dUMP)抑制胸苷酸合成酶，该酶产生对脱氧尿苷酸甲基化为胸苷酸的抑制作用。这种抑制作用又依次干扰DNA的合成。在第二个方面，发现氟尿嘧啶在某种程度上掺入到RNA中，这种程度虽然很小，但足以对RNA的加工和功能有重要影响。最后，在第三个方面，已表明氟尿嘧啶阻断尿嘧啶磷酸酶，因而抑制RNA合成中预形成尿嘧啶的利用(Goodman和Gilman，“治疗剂的药理学基础”，1985，1268-1271页)。

氟尿嘧啶可以单独或以其它药物联合给予。最常见的组合包括亚叶酸的使用。据认为亚叶酸通过增加还原的叶酸的细胞外浓度加强氟尿嘧啶的细胞毒性作用，而还原的叶酸又依次似乎稳定由(F-dUMP)、5，10-亚甲基四氢叶酸盐和胸苷合成酶形成的共价三元复合物。该复合物的稳定作用增强该合成酶的抑制作用，由此增加氟尿嘧啶的效果。

被用来治疗晚期直肠结肠癌的其它与氟尿嘧啶的化疗剂组合包括，但不限于，氟尿嘧啶与下列药物的组合：甲氨蝶呤，单独(Blijham，G.等，J.Clin.Oncol.，1996，14(8)：2266-73)和与亚叶酸的组合(Romero，A.O.等，Am.J.Clin.Onocol.，1998，21(1)：94-8)；α干扰素2a(Greco，F.A.等，J.Clin.Oncol.，1996，14(10)：2674-81)；α干扰素2b加亚叶酸(Kohne，C.H.Oncology，1997，54(2)：96-101)：铂化合物，例如顺铂和奥沙利铂，与亚叶酸组合(Scheithauer，W.等，Cancer，1994，73(6)：1562-68)；卡铂加甲氨蝶呤(在氟尿嘧啶之前给予)(Pronzato，P.，J.Chemother.，1998，10(3)：254-57)；以及Bleiberg，H.和Gramont，A.，Semin.Oncol.，1998，25(2增刊5)：32-39)；lavamisole(Bandealy，M.T.，Clin.Cancer Res.，1998，4(4)：935-38)；甲基洛莫司汀和亚叶酸(Jones，Jr，D.V.，Cancer，1995，76(10)：1709-14)；和伊立替康，一种拓扑异构酶-I抑制剂，(用氟尿嘧啶/亚叶酸预处理后给予)(Rougier，P.等，J.Clin.Oncol.，1997，15(1)：251-260)。

尽管以上的组合的使用正在增加，目前，它们中似乎未有一种组合提供超过氟尿嘧啶单独或氟尿嘧啶与亚叶酸组合的明显的优点；后者仍然是转移性直肠结肠癌患者的常规初步治疗手段。作为单一药物，它产生约15％的应答率，伴有6个月的半数存活时间。而在与亚叶酸的组合中，氟尿嘧啶的活性增加，因而在晚期(阶段D)直肠结肠癌患者中观察到约20％的应答率和11-13个月的半数存活时间(Wolmark，N.等，J.Clin.Oncol.，1993，11：1879-1887)。

氟尿嘧啶可提供静脉内大剂量注射或连续滴注。分布的体积略大于细胞外空间。静脉内大剂量给予370-720mg/m²产生8-14分钟的消除半衰期，伴有在2小时内血浆水平低于1μM，细胞毒性作用的大约阈值。低于10％药物从尿中排泄，而剩余的量通过代谢途径清除。

经常使用的给药方案包括每3-4周进行的3-5天短期-大剂量注射(short-bolus injections)，每4周连续静脉输注96-120小时，每8周中用6周进行每周的输注。严重的临床毒性的发生率趋向于随较高的系统接触而增加(例如，在恒定输注期间维持较高的稳态血浆浓度和用大剂量给药时产生较高的AUC)。

值得注意的是，以上治疗方案的每一种均包括不给予氟尿嘧啶的实际的间歇期。这主要是由于氟尿嘧啶的固有的毒性的原因，这种毒性因加入亚叶酸而加重。不幸的是，这种时间间隔大大减小氟尿嘧啶的效果。即是说，使用氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸的初步治疗在肿瘤数目和大小方面产生约3个对数单位(3个数量级或1000倍)的减少。然而，在非治疗“恢复”期间，肿瘤的数目和大小反弹至约2个对数单位(100倍)。因此，每次给予氟尿嘧啶时，使用氟尿嘧啶的疗程的总效果仅为约1个对数单位(肿瘤数目和大小约减少10倍)。使用氟尿嘧啶的延长的治疗不仅引起涉及治疗成本、患者的生活质量等问题，它还可产生对该药物的继发性耐药性。本发明的方法涉及在恢复期间维持每次给予氟尿嘧啶的效果的更重要部分。因此，在全程治疗时的随后给药将面临已减少了大小和数目的肿瘤，因此，改善了氟尿嘧啶的总效果。氟尿嘧啶和氟尿嘧啶/亚叶酸在晚期直肠结肠癌中的临床试验

频繁使用的连续输注方案包括每3-4周进行的3-5天短期-大剂量注射，每4周连续静脉输注96-120小时，每8周中用6周进行每周的输注。严重的临床毒性的发生率趋向于随较高的系统接触而增加(例如，在恒定输注期间维持较高的稳态血浆浓度和用大剂量给药时产生较高的AUC)。

在由Mayo Clinic and the North Central Cancer Treatment Group(Mayo/NCCTG)进行的对晚期转移性直肠结肠癌患者的随机临床研究中，比较了3种治疗方案：亚叶酸200mg/m²和氟尿嘧啶370mg/m²对比亚叶酸20mg/m²和氟尿嘧啶425mg/m²对比氟尿嘧啶500mg/m²。每日将所有的药物通过静脉缓慢输注给予，每28-35天重复给药5天。对高剂量亚叶酸、低剂量亚叶酸和单用氟尿嘧啶各组的反应率分别为26％(p＝0.04，与单用氟尿嘧啶比较)、43％(p＝0.001，与单用氟尿嘧啶比较)和10％。各自的半数存活时间为12.2个月(p＝0.037)、12个月(p＝0.050)和7.7个月。低剂量的亚叶酸方案在增加体重(5％以上)、消除症状和行为表现状态的改善方面得到满意的显著改善。

在第二种Mayo/NCCTG随机临床研究中，单用氟尿嘧啶组被随后给予的甲氨蝶呤(MTX)、氟尿嘧啶和亚叶酸替代。使用亚叶酸200mg/m²和氟尿嘧啶370mg/m²对比亚叶酸20mg/m²和氟尿嘧啶425mg/m²对比随后的MTX和氟尿嘧啶和亚叶酸的反应率分别为31％(p＝＜.01)、42％(p＝＜.01)和14％。各自的半数存活时间为12.7个月(p＝＜.04)、12.7个月(p＝＜.01)和8.4个月。在各治疗组之间，未发现在增加体重(5％以上)和行为表现状态的改善方面有统计学上的显著性差异。

在比较低剂量(20mg/m²)和高剂量(200mg/m²)亚叶酸的后果和毒性的第三种研究中，患者除每4周接受亚叶酸外，还接受1小时的400mg/m²/天氟尿嘧啶的输注。对两组进行比较，使在性别比、原发性肿瘤的大小、行为表现状态和肿瘤的严重程度上无统计学上的显著性差异。两种方案的毒性都很低且两组之间无显著性差异。两组之间的总的半数存活时间无显著性差异：对接受低剂量的亚叶酸的患者为346天，而对接受高剂量的亚叶酸的患者为323天。在1年时等效试验是显著的(P＜0.01)，显示对高剂量方案来说，在1年存活时，没有超过20％的益处。在5天的治疗方案中，联合使用高剂量亚叶酸和氟尿嘧啶未能明显改善转移性直肠结肠癌患者的总存活率。

最后，在第四个大的随机研究中，对两种最常用的氟尿嘧啶/亚叶酸的方案在晚期直肠结肠癌的治疗上进行比较，结果显示这些剂量给予方案中的每一个均优于先前的对照试验中的单一药物的大剂量氟尿嘧啶。根据行为表现状态以及任何可测量到的指示剂损害的存在和部位，对372个转移性直肠结肠癌患者进行分组，并随机接受采用两种方案中的一种方案进行化学治疗：(1)加强剂量-疗程的氟尿嘧啶加低剂量亚叶酸(氟尿嘧啶425mg/m²加亚叶酸20mg/m²，每日静脉[IV]推注，每4-至5-周重复疗程5天)，或(2)每周给予氟尿嘧啶加高剂量亚叶酸(氟尿嘧啶600mg/m² IV推注加亚叶酸500mg/m²，每周输注2小时，疗程6周，每8周重复该过程)。用下列参数测试的两种氟尿嘧啶/亚叶酸方案之间的治疗效果无显著性差异：目标肿瘤反应(35％对31％)、存活(半数存活，9.3个月对10.7个月)和治标效果(如通过症状的缓解、改善的行为表现状态和体重增加来评价)。在毒性方面有显著性差异(p＜.05)，采用加强剂量-疗程方案(1-5天)可发现更严重的白细胞减少和口炎，而采用每周的方案可发现更严重的腹泻和增加的对住院的需要以控制毒性。采用应用于基于类似的治疗效果的本研究的剂量给予方案时，加强剂量-疗程氟尿嘧啶加低剂量亚叶酸与每周氟尿嘧啶加高剂量亚叶酸相比，似乎具有优良的治疗指数，而且降低了对住院以控制化疗毒性的需要。3.药用组合物和用途

可以将本发明化合物、其前药或者所述化合物或它的前药两者中任何一种的生理上可接受的盐直接给予病人或以其中前述物质与适宜的载体或赋形剂混合的药用组合物的形式给予病人。用于配制和给予药物的技术可在“Remington’s Pharmacological Sciences”，Mack出版公司，Easton，PA，最新一版中发现。给药途径

梗概

适宜的给药途径可包括(不局限于)口服、直肠、透过粘膜或肠道给药或者肌内、皮下、髓内、鞘内、直接室内、静脉、腹膜内、鼻内或眼内注射。给药的优选途径为口服和非肠道。

或者，人们可以局部而非全身的方式给予所述化合物，例如，经常以贮库或缓释制剂的形式将化合物直接注射到实体瘤中。

此外，人们可以靶向药物传递系统例如以肿瘤特异性抗体包被的脂质体给予药物。这些脂质体将选择性靶向于肿瘤并由肿瘤吸收。组合物/制剂

梗概

可通过本领域熟知的方法例如借助常规混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或冷冻干燥的方法制备本发明的药用组合物。

使用一种或多种生理学上可接受的载体，包括有利于将活性化合物加工成为药学上可使用的制剂的赋形剂和辅剂，可以常规方法配制用于本发明的药用组合物。依所选择的给药途径来确定适当的制剂。

对注射而言，将本发明化合物配制成水溶液剂，优选在生理学上相容的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对透过粘膜给药，可在制剂中使用适于穿过屏障的渗透剂。这样的渗透剂一般为本领域已知的。

对口服给药而言，通过使活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体混合，能够配制化合物。这样的载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、糖锭剂、糖衣丸、胶囊剂、溶液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等，它们由患者用于口服摄取。使用固体赋形剂，任选将生成的混合物研磨，并加工颗粒混合物，加入其它适宜的辅料(如果需要)后，得到片剂或糖衣丸芯，能够制备用于口服用途的药用制剂。有用的赋形剂尤其为填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉和其它的材料例如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸。也可使用盐如藻酸钠。

提供带有适当的包衣的糖衣丸芯。为此目的，可使用浓的糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖衣丸包衣中，以用于鉴定或区别不同的活性化合物剂量的组合物。

能够口服使用的药用组合物包括以凝胶制成的推入配合的胶囊剂以及用明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂能含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于适宜的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。也可将稳定剂加入到这些制剂中。

对吸入给药，使用加压容器或雾化器和适宜的抛射剂例如(不局限于)二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，以气溶胶喷雾剂的形式便利地传递本发明用途的化合物。在加压的气溶胶情况下，可通过提供传递计算量的阀来控制该剂量单位。例如用于吸入剂或吹入剂的明胶的胶囊和药筒可配制成含有化合物和适宜的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

也可将化合物配制成用于非肠道给药的制剂，例如，通过大剂量注射或者持续输注。用于注射的制剂可以单位剂型的形式存在，例如以安瓿或以含有加入的防腐剂的多剂量容器形式存在。这些组合物可采取这样的形式如在油或水媒介物中的混悬液、溶液剂或乳液，并可含有制剂材料如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于非肠道给药的药用组合物包括水溶性形式的水溶液，例如(不局限于)活性化合物的盐。另外，在亲脂性媒介物中可制备活性化合物的混悬液。适宜的亲脂性媒介物包括脂肪油如芝麻油，合成脂肪酸酯如油酸乙酯和甘油三酯或材料例如脂质体。含水注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。该混悬液也可任选含有适宜的稳定剂和/或增加化合物溶解性的试剂以用于制备高浓度溶液。

或者，所述活性成分可以在临用前与适宜的媒介物如灭菌、无热原水构成溶液的粉末形式存在。

使用例如常规栓剂基质如可可豆脂或其它的甘油酯，也可将所述化合物配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂。

除了先前描述的制剂以外，也可将化合物配制成贮库制剂。可经植入(例如，皮下或肌内)或者经肌内注射给予这类长效作用的制剂。对于这种给药途径，本发明化合物可与适宜的聚合性或疏水性材料(例如，以与药学上可接受的油一起的乳剂形式)一起，与离子交换树脂一起配制而成，或配制成微溶性的衍生物例如(不局限于)微溶的盐。

用于本发明疏水性化合物的药用载体的非限制性实例为共溶剂系统，包括苄醇、非极性表面活性剂、可与水混溶的有机聚合物和水相如VPD共溶剂系统。VPD为3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂Polysorbate 80^TM和65％w/v聚乙二醇300的溶液，用无水乙醇加至体积。VPD共溶剂系统(VPD：D5W)由用5％葡聚糖水溶液以1∶1稀释的VPD组成。该共溶剂系统很好溶解疏水性化合物，并在全身给药时其本身产生低的毒性。可在较大范围内改变这样的共溶剂系统的比例而不会破坏其溶解性和毒性性质。此外，可改变该共溶剂的组分：例如，其它的低毒性非极性表面活性剂可被用来替代Polysorbate 80^TM，可改变聚乙二醇的分数大小，其它的生物相容的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮可替代聚乙二醇，并且其它的糖类或多糖可替代葡聚糖。

或者，可使用用于疏水性药用化合物的其它传递系统。脂质体和乳剂为用于疏水性药物的传递媒介物或载体的熟知的实例。另外，尽管经常以更高的毒性为代价，也可使用某些有机溶剂如二甲基亚砜。

另外，使用缓释系统如含有治疗药物的固体疏水聚合物的半渗透基质可传递化合物。多种缓释材料已被确定并且为本领域技术人员熟知。依它们的化学性质而定，缓释胶囊剂可释放化合物几周直到超过100天。依治疗药物的化学性质和生物稳定性而定，可使用另外的用于稳定蛋白质的策略。

在此药用组合物也包含适宜的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括(但不局限于)碳酸钙、磷酸钙、多种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮组合物

该化合物可以配制为上述的任何组合物和制剂。然而，本发明的优选的制剂包含在足够的无菌胃肠外溶液中的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮，以提供4.5mg/ml的终浓度。该制剂的其它组分包括聚乙二醇400、聚烃氧基-35-蓖麻油(Cremophor^)、苄醇和无水乙醇。应该注意到，由于该制剂含有Cremopho^，因而与标准PVC-衬里的注射器、静脉袋(intravenous bag)和给药装置不相容。氟尿嘧啶/亚叶酸组合物

组合物和制剂中的氟尿嘧啶是市售可获得的，其为化疗领域技术人员已知并可以按本发明的方法作为这些组合物和制剂给予。这样的组合物/制剂的实例示于市售氟尿嘧啶所附的包装插页上，其全部内容在此通过引用被结合到本文中。可以进行开发或在将来成为可利用的任何其它的或不同的组合物/制剂本身的用途也在本发明范围内。

同样，为化疗领域技术人员已知的组合物和制剂中的亚叶酸也是市售可获得的，并可以按本发明的方法作为这些组合物和制剂给予。这样的组合物/制剂的实例示于市售亚叶酸所附的包装插页上，其全部内容在此通过引用被结合到本文中。如上所述，可以进行开发或在将来成为可利用的任何其它的或不同的组合物/制剂本身的用途也在本发明范围内。剂量

梗概

适宜用于本发明的药用组合物包括其中包含足以达到预期目的，即调节PK活性或治疗或预防PK相关疾病的量的活性成分的组合物。

更详细地讲，治疗有效量意指有效预防、缓解或改善疾病症状或者延长受治疗者的存活率的一定量的化合物。

治疗有效量的确定处于该领域技术人员的能力范围内，尤其按照在此提供的详细的公开。

对在本发明方法中使用的任何化合物而言，由细胞培养测定能够初步估算治疗有效量或剂量。然后，配制该剂量用于动物模型，以得到循环的浓度范围，该循环的浓度范围包括如在细胞培养基上测定的IC₅₀(即达到PK活性的半数最大抑制的受试化合物的浓度)。然后，这样的信息能够用于更准确的测定对人有用的剂量。

通过在细胞培养基或实验动物中的标准药用方法，例如通过测定目标化合物的IC₅₀和LD₅₀(两者于本文中另外讨论)，能够确定在此描述的化合物的毒性和治疗效果。从这些细胞培养试验和动物研究中得到的数据能够用于配制用于人的一定范围的剂量。依使用的剂型和使用的给药途径而定，可改变剂量。根据患者的疾病，医师能够选择准确的制剂、给药途径和剂量。(参见例如Fingl等，1975，在“治疗学的药理学基础”中，第1章第1页)。

可各自调整剂量和间隔的时间，以提供足以维持激酶调节作用的活性物质的血浆水平。这些血浆水平称作最小有效浓度(MECs)。对每个化合物而言，所述MEC将是不同的，但是从体外数据能够估计，例如可使用在此描述的试验，确定达到激酶50-90％抑制所必需的浓度。达到MEC必需的剂量将依个体性质和给药途径而定。HPLC测定或生物测定能够用于确定血浆浓度。

使用MEC值也可确定剂量间隔。应使用维持血浆水平高于MEC10-90％，优选为30-90％之间，并且最优选为50-90％之间的时间方案给予化合物。

在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可与血浆浓度无关并且本领域其它的已知的方法可用来测定正确的剂量和间隔。

当然，所给予的组合物的量将依受治疗者、疾病的严重性、给药方式、主治医师的判断等而定。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮剂量

根据获得的有关3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的药理学数据(参见上文)，可以以范围在约4mg/m²-约195mg/m²的剂量给予该化合物。在本发明的优选实施方案中，剂量在约72.5mg/m²-约145mg/m²之间。

在上面组合物部分描述的稀释物可以以约50-约350cc/小时的速率给予患者。优选所述速率为约150-约250cc/小时。最优选速率为约175-约225cc/小时。

在此出现的术语“约”意指±10％，即约175cc/小时意为157.5cc/小时-192.5cc/小时等等。

在本发明的优选实施方案中，当不给予患者氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸时，在静止期给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的剂量。通过上面药理学部分的实例可明显得知，氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸可以以多种治疗方案给予，其选择在临床医师的知识和技能的范围内。氟尿嘧啶和氟尿嘧啶/亚叶酸剂量

如可从上述采用氟尿嘧啶和氟尿嘧啶/亚叶酸的临床研究中所见到的，目前有许多方案用于在晚期直肠结肠癌中给予氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸。然而，采用氟尿嘧啶和氟尿嘧啶/亚叶酸的各种给药剂量和方案在后果上缺乏明显的差别，大多数方案伴有不同程度的白细胞减少、腹泻和粘膜炎。因此，虽然可给予剂量范围约300mg/m²-约800mg/m²的氟尿嘧啶，但提供约400-500mg/m²/周的加强剂量的氟尿嘧啶的方案目前被认为是最佳疗法。当在该治疗中包括亚叶酸时，对低剂量和高剂量亚叶酸的临床后果的差别是最小的，但其产生高剂量方案的另外的毒性，低剂量方案目前似乎是最合适的。

因此，虽然氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸可以在本发明范围内以任何目前已批准的方式或以任何在将来发现为有效的方式给予(给出以上数据)，本发明目前优选的实施方案却是以约400-500mg/m²的剂量作为大剂量静脉注射给予氟尿嘧啶，每4周一个循环，其中用药1-5天。若有必要，可以重复所述4-周循环或直至发生进行该治疗的临床医师所察觉到的不利副作用为止。

亚叶酸可以与氟尿嘧啶一起给予。亚叶酸可以以约20-约500mg/m²，优选以约20-约200mg/m²的剂量给予，而在本发明目前优选的实施方案中，作为约20mg/m²的低剂量给予，也可作为大剂量注射，与各次氟尿嘧啶一起给予。氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸与3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮组合

本发明的一个方面是，当3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基)-2-吲哚满酮与氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸组合给予时，可根据计算好的能发挥各组分特性的最大优点的治疗方案，同时、依次、连续、间歇等方式给予该化合物。在目前优选的实施方案中，在不给予氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸的情况下，给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮数天。因此，在本发明的一个实施方案中，可以以任何需要的方式，例如，不加限制地在每日、每隔一日、每隔两日等的选择用于氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸的治疗方案中给予上述剂量的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮，在此期间不给予氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸。3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮可作为大剂量静脉注射或作为连续静脉输注给予。然而，根据体外资料，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮可以在一相对短的时间段(5-30分钟)内给予并在此后3-4天内对内皮细胞发挥抗增殖活性。同样，体内资料证明，以3-4天的间隔给予3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮足以抑制肿瘤生长而无毒性。而且，在用长达52周的治疗处理的患者的I期剂量逐步提高的研究中，未观察到蓄积毒性。因此，在本发明目前优选的实施方案中，在每4周治疗方案的2-4周内，每周两次给予指定剂量的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮。

根据在此的公开内容，也可以期望3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与其它化疗剂联合发挥作用。例如，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与其它烷化剂组合可以提供协同活性而无伴随增加的毒性。这样的烷化剂可包括(但不限于)磺酸烷基酯例如白消安(用于治疗慢性粒细胞白血病)、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；吖丙啶类和甲基蜜胺类例如六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基密胺；氮芥类例如苯丁酸氮芥(用于治疗慢性淋巴细胞白血病、原发性巨球蛋白血症和非何杰金氏淋巴瘤)、环磷酰胺(用于治疗何杰金氏病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维耳姆斯氏瘤和横纹肌肉瘤)、雌莫司汀、异环磷酰胺、新氮芥、泼尼莫司汀和乌拉莫司汀(用于治疗原发性血小板增多、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和卵巢癌)、三嗪类例如达卡巴嗪(用于治疗软组织肉瘤)。

同样，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮可在与以下其它的抗代谢化学治疗药物的组合中具有有益的作用，包括：例如(但不限于)叶酸类似物如甲氨蝶呤(用于治疗急性淋巴细胞白血病、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿、乳腺癌、头、颈和肺癌、骨原性肉瘤)和蝶罗呤，嘌呤类似物例如已发现用于治疗急性粒细胞、急性淋巴细胞和慢性粒细胞白血病的巯基嘌呤和硫鸟嘌呤。

3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮在与以下天然产物的化学治疗药物的组合中证明是有效的，包括：例如(但不限于)长春花生物碱(长春碱(用于治疗乳腺和睾丸癌)、长春新碱、长春地辛)、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷(两者都用于治疗睾丸癌和卡波西肉瘤))、抗生素类化学治疗药(柔红霉素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素(用于治疗胃、宫颈、结肠、乳腺、膀胱和胰腺的癌症)、放线菌素D、普卡霉素、博来霉素(用于治疗皮肤癌、食管和泌尿生殖道癌))和酶化学治疗药物例如L-天冬酰胺酶。

根据本发明的公开内容，3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮也可以有益于以下化疗剂的活性：例如，铂配位络合物(顺铂等)、取代的脲(羟基脲)、甲基肼衍生物(丙卡巴肼)、肾上腺皮质激素抑制剂(米托坦、氨鲁米特)以及激素和拮抗剂例如肾上腺皮质激素(例如泼尼松)、孕酮(例如己酸羟孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素例如他莫昔芬、雄激素例如丙酸睾酮。

最后，可以期望3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与米托蒽醌或紫杉酚的组合在治疗实体肿瘤癌症或者白血病例如(但不限于)急性骨髓性(非淋巴细胞)白血病中显示出特别有益的结果。

应该理解，虽然以上描述涉及3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸的联合使用，本发明的其它化合物，特别是3-[4-(2-羧乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸的组合也在本发明的范围和精神内。包装

如果要求，所述组合物可用包装或分配装置例如FDA批准的药剂盒存在，其可包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如所述包装可包括金属或塑料箔，如起泡包装。包装或分配装置可附有服药方法的说明书。所述包装或分配器也可附有与该药有关的、由管理药品制造、使用或销售的政府机构提出的注意事项，该注意事项反映所述政府机构对该组合物形式或人或兽给药形式的批准意见。这样的注意事项例如可以为经美国食品与药品管理局批准的标签，以作为处方药或批准的产物的插页。也可制备含有配制在相容的药用载体中的本发明化合物的组合物，放置在适当的容器中，并贴上所治疗适应症的标签。在标签上指明的适宜疾病可包括治疗肿瘤、抑制血管发生、治疗纤维变性、糖尿病等。4.合成

使用化学领域的熟知技术，可易于合成本发明化合物以及前体2-羟基吲哚类和醛类。本领域技术人员将意识到用于形成本发明化合物的其它合成途径是可以利用的，并通过实施例(但不限于此)提供如下。1.4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯

于0℃，将磷酰氯(0.186ml，1.44mmol)滴加到二甲基甲酰胺(0.15ml，1.44mmol)的二氯甲烷(4ml)溶液中。使混合物温热至室温，搅拌30分钟，然后冷却至0℃。分次加入4-甲基-2-吡咯羧酸甲酯(100mg，0.72mmol)，然后于40-50℃将混合物搅拌4小时。加入氢氧化钠(10％水溶液，2ml)，将该反应混合物搅拌30分钟。然后用乙酸乙酯(3X)提取碱性溶液，用盐水洗涤有机层至pH 6-7，经无水硫酸钠干燥，真空浓缩得到115.9mg(96％)为黄色油状物的4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸甲酯。

于90℃，将羟吲哚(105mg，0.79mmol)、4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸甲酯(110mg，0.67mmol)和哌啶(2滴)在乙醇(2ml)中的混合物搅拌3小时。真空过滤收集沉淀，用乙醇洗涤，真空干燥得到153.2mg(81％)的4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。

¹HNMR(360MHz，DMSO-d₆)：13.98(s，br，1H，NH)，10.97(s，br，1H，NH)，7.82(d，J＝7.6Hz，1H)，7.67(s，1H，H-乙烯基)，7.2(dt，J＝1.2，7.7Hz，1H)，7.01(dt，J＝1.2，7.7Hz，1H)，6.90(d，J＝7.6Hz，1H)，6.77(d，J＝2Hz，1H)。

MS(ES)283[M+1](100％)。2.4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸

将磷酰氯(0.66ml，7.2mmol)滴加到冰冷却的二甲基甲酰胺(0.6ml，7.2mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。于室温下将该混合物搅拌30分钟，然后在冰浴上冷却。将4-甲基-2-吡咯羧酸乙酯(919mg，6mmol)，缓慢加入到反应混合物中。然后于室温下搅拌得到的反应混合物2.4小时。再将该混合物在冰浴上冷却，加入2N氢氧化钠，将该混合物搅拌30分钟。用乙酸乙酯(2X)提取含水混合物，用盐水洗涤合并的有机层，然后经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。于室温下真空干燥得到的粉红色固体3天，得到1.05g(96％)的4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸乙酯。该产物未经进一步纯化而使用。

MS(APCI)[M-1]⁺180(80％)，[M-34]⁺146(100％)。

将4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸乙酯(543.57mg，3mmol)在2N氢氧化钠(1.2g，在15ml水中)中的混合物回流半小时。使该反应混合物冷却至室温并倾入冰水中。用2N盐酸酸化至pH～3.5，用乙酸乙酯(2X)提取。用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。于40℃真空干燥得到的固体2小时，得到410mg(89％)为白色固体的4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸。

将羟吲哚(133.15mg，1mmol)、4-甲基-5-甲酰基-2-吡咯羧酸(153.14mg，1mmol)、哌啶(2滴)在乙醇(2ml)中的混合物回流3小时。真空过滤收集沉淀，用乙醇洗涤，用2N盐酸中和，用水洗涤，干燥得到268.5mg(100％)的4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸，为橙色/红色固体。

¹NMR(360MHz，DMSO-d₆)：13.84(s，br，1H，NH)，12.84(s，br，1H，COOH)，10.98(s，br，1H，NH)，7.82(d，J＝7.5Hz，1H)，7.67(s，1H，H-乙烯基)，7.18(t，J＝7.5Hz，1H)，7.01(t，J＝7.5Hz，1H)，6.88(d，J＝7.5Hz，1H)，6.71(d，J＝2.2Hz，1H)，2.32(s，3H，CH₃)。

MS(负性方式)266.8(M-1)⁺。3.3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1，3-二氢吲哚-2-酮和4.4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛

于0℃，向4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸(4.02g，15mmol)在四氢呋喃(50ml)中的悬浮液中缓慢加入草酰氯(3.80g，30mmol)。加入完毕后，在室温下，将产生的悬浮液搅拌2小时。然后将硼氢化钠(1.14g，30mmol)分次加入该混合物中，于室温下再搅拌该悬浮液1天。此时，加入第二份1.14g硼氢化钠，接着加入10ml二甲基甲酰胺以溶解该固体，于室温下再搅拌该反应混合物1天。将冰水加入到冰冷却的反应混合物中，直至再没有气体放出。用乙酸乙酯提取水层。过滤在有机层和水层之间形成的沉淀，用水和乙酸乙酯洗涤，干燥得到2.5g(60％)红色固体。用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥，浓缩并经硅胶柱纯化，用乙酸乙酯-己烷洗脱，得到340mg(9％)为黄色固体的3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基甲基酮)-1，3-二氢吲哚-2-酮和540mg(14％)为橙色固体的4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛。

3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢吲哚-2-酮：¹HNMR(360MHz，DMSO-d₆)13.39(s，br，1H，NH)，10.69(s，br，1H，NH)，7.70(d，J＝7.6Hz，1H)，7.56(s，1H，H-乙烯基)，7.09(t，J＝7.6Hz，1H)，6.96(t，J＝7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝7.6Hz，1H)，6.06(d，J＝2.1Hz，1H)，5.33(t，J＝5.6Hz，1H，OH)，4.51(d，J＝5.6Hz，2H，CH₂OH)，2.31(s，3H，CH₃)。

MS251[M-1]⁺(100％)

M.p.＞350℃

4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛：¹HNMR(360MHz，DMSO-d₆)δ：13.87(s，br，1H，NH)，11.05(s，br，1H，NH)，9.61(s，1H，CHO).7.85(d，J＝7.5Hz，1H)，7.71(s，1H，H-乙烯基)，7.23(t，J＝7.5Hz，1H)，7.03(t，J＝7.5Hz，1H)，6.97(d，J＝2.2Hz，1H)，6.9(d，J＝7.5Hz，1H)，2.36(s，3H，CH₃)。

MS237.4[M-OH]⁺9100％)。

M.p.267.3-268.4℃5.生物学评价

人们将意识到在任何给出的系列化合物中，将提供广泛的生物活性。在它的优选实施方案中，本发明涉及证实有调节RTK、CTK和STK活性能力的新的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮。以下测定法用于选择那些证实有最适程度的所要求的活性的化合物。A.测定方法

以下体外试验可用于测定本发明不同化合物对一种或多种PKs上的活性和作用的水平。使用本领域熟知的技术，根据相同系的任何PKs能够设计相似的试验。

以ELISA形式进行在此描述的细胞/催化测定。一般方法如下：将化合物引入天然或重组表达受试激酶的细胞，在一个选择的时间期间之后，如果受试激酶为受体，则加入激活所述受体的已知配体。将细胞溶解并把溶胞产物转移至预先用识别酶磷酸化反应的底物的特异性抗体包被的ELISA板的孔中。将细胞溶胞产物的非底物成分洗去并用特异性识别与不接触受试化合物的对照组细胞相比较的磷酸酪氨酸的抗体检测底物上磷酸化的量。在此描述的细胞/生物测定可测量应答于受试激酶中活化作用产生的DNA的量，该方法为增殖应答的通用测量方法。用于该测定的通用方法如下：将化合物引入天然或重组表达受试激酶的细胞，在一个选择的时间期间之后，如果受试激酶为受体，则加入活化所述受体的已知配体。温育至少过夜后，加入DNA标记的试剂如溴代脱氧尿苷(BrdU)或3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。用抗BrdU抗体或通过测量放射活性来检测标记DNA的量并与不和受试化合物接触的对照组细胞相比较。细胞/催化测定

酶联免疫吸附测定法(ELISA)可用于检测和测量PK活性的存在。按照已知方案，可进行ELISA，该方案在例如Voller等，1980，“酶联免疫吸附测定法”，在：临床免疫学操作指南(第2版，由Rose和Friedman编辑，第359-371页，美国微生物学学会，华盛顿特区)中有描述。

公开的方案可适于测定与特异性PK有关的活性。即如下提供进行用于特异性PKs的ELISA实验的优选方案。然而，适合用于测定化合物对其它的RTK族成员以及CTKs和STKs活性的这些方案都在本领域技术人员知识的范围内。

FLK-1测定

进行ELISA测定以测量FLK-1受体的激酶活性，更详细地讲，是抑制或活化在FLK-1受体上的TK活性。具体地说，进行以下测定用于测量在基因工程表达Flk-1的细胞中FLK-1受体的激酶活性。

材料与试剂

a.Coming96孔ELISA板(Coming目录25805-96号)，

b.Cappel山羊抗兔IgG(目录55641号)，

c.PBS缓冲液(Gibco目录450-1300EB号)，

d.TBSW缓冲液(50mM Tris(pH 7.2)、150mM NaCl和0.1％吐温-20)，

e.乙醇胺贮存液(10％乙醇胺(pH 7.0)，在4℃下贮存)

f.HNTG缓冲液(20mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、150mM NaCl和0.2％Triton X-100和10％甘油)，

g.EDTA(0.5M(pH7.0)，为100X贮存液)，

h.原钒酸钠(0.5M，为100X贮存液)，

i.焦磷酸钠(0.2M，为100X贮存液)，

j.NUNC96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录AS-72092号)，

k.NIH3T3 C7#3细胞(FLK-1表达细胞)，

1.含有1X的高葡萄糖L-谷氨酰胺的DMEM(目录11965-050号)，

m.FBS，Gibco(目录16000-028号)，

n.L-谷氨酰胺，Gibco(目录25030-016号)，

o.VEGF，PeproTech公司(目录100-20号)，(作为在Milli-Q dH₂O中的1μg/100μl贮存液保持，并在-20℃下贮存，

p.亲和纯化的抗FLK-1抗血清，

q.特异性用于磷酸酪氨酸的UB40单克隆抗体(参见Fendley等，1990，Cancer Research 50：1550-1558)，

r.EIA级山羊抗小鼠IgG-POD(BioRad目录172-1011号)，

s.2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)溶液(100mM枸橼酸(无水)，250mM Na₂HPO₄(pH 4.0)，0.5mg/ml ABTS(Sigma目录A-1888号))，溶液应在4℃下贮存于暗处直到备用。

t.H₂O₂(30％溶液)(Fisher目录H325号)，

u.ABTS/H₂O₂(15ml ABTS溶液，2μl H₂O₂)临用前5分钟制备并在室温下放置，

v.在H₂O中0.2M HCl贮存液，

w.二甲基亚砜(100%)(Sigma目录D-8418号)，

和

y.胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL目录25200-049号)。

方案。

1.用每孔1.0μg在0.1M Na₂CO₃(pH 9.6)中的Cappel抗兔IgG抗体包被Corning96孔ELISA板。使最终体积为每孔150μl。在4℃下贮存板过夜。当在4℃下贮存时，使板能够保持最长可达2周。

2.在适宜的培养基盘上，于生长培养基(DMEM，用2.0mM的L-谷氨酰胺、10％FBS补充)中生长细胞直到在37℃、5％CO₂下汇合。

3.经胰蛋白酶消化收获细胞并在Corning25850聚苯乙烯96孔圆底细胞板上，在200μl生长培养基中以25,000个细胞/孔接种。

4.在37℃和5％CO₂下，将细胞生长至少一天。

5.用D-PBS 1X洗涤细胞。

6.加入200μl/孔的饥饿培养基(DMEM，2.0mM 1-谷氨酰胺，0.1％FBS)。在37℃和5％CO₂下，温育过夜。

7.使用饥饿培养基，在聚苯乙烯96孔板上按1∶20稀释化合物。稀释二甲基亚砜1∶20用于对照孔中。

8.从96孔细胞培养板上除去饥饿培养基并将162μl新鲜饥饿培养基加入到每孔中。

9.将18μl按1∶20稀释的化合物稀释液(来自步骤7)加入到每孔中并把1∶20二甲基亚砜稀释液加入到对照组的孔(+/-VEGF)中，在细胞刺激后最后的稀释比为1∶200。最后的二甲基亚砜为0.5％。在37℃和5％CO₂下，将板温育2小时。

10.通过把板翻转除去液体以从ELISA板上除去未结合的抗体。用TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)洗涤3次。在纸巾上板轻拍板以除去过量的液体和气泡。

11.用每孔150μl的TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)封闭板。温育板30分钟，其间在微滴定板振摇器上振摇。

12.如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。

13.加入0.5μg/孔亲和纯化抗FLU-1多克隆兔抗血清。用TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)加至每孔150μl的最后的体积。温育板30分钟，其间振摇。

14.将180μl饥饿培养基加入到细胞中并在37℃和5％CO₂下用20 μl/孔的10.0mM原钒酸钠和500ng/ml VEGF(生成最后浓度为每孔1.0mM原钒酸钠和50ng/ml VEGF)刺激细胞8分钟。阴性对照组孔仅接受饥饿培养基。

15.8分钟后，应去除细胞的培养基并用200μl/孔PBS洗涤一次。

16.在室温下振摇5分钟期间，在150μl/孔HNTG中溶解细胞。HNTG的配方包括原钒酸钠、焦磷酸钠和EDTA。

17.如同在步骤10中描述的那样，将ELISA板洗涤3次。

18.将细胞溶胞产物从细胞板转移至ELISA板并伴随振摇下温育2小时。为转移细胞溶胞产物，在刮孔期间上下吸取。

19.如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。

20.用在TBSW+0.5％乙醇胺中的0.02μg/孔UB40温育ELISA板。加至最后体积150μl/孔。伴随振摇下温育30分钟。

21.如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。

22.用1∶10,000稀释的接合有TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)中的辣根过氧化物酶的EIA级山羊抗小鼠IgG温育ELISA板。加至最后体积150μl/孔。伴随振摇下温育30分钟。

23.如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤。

24.将100μl的ABTS/H₂O₂溶液加入到孔中。伴随振摇下温育10分钟。

25.将100μl的0.2M HCl加至最后浓度0.1M HCl以停止显色反应。在室温下，振摇1分钟。用缓慢的气流除去气泡并以ELISA板读出器于410nm下读取ELISA板。

在全细胞上的EGF受体-HER2嵌合受体测定

如同以下描述的那样，测量在全EGFR-NIH3T3细胞中的HER2激酶活性：

材料与试剂.

a.EGF：贮存液浓度：16.5ILM；EGF201，TOYOBO有限公司，日本。

b.05-101(UBI)(识别EGFR细胞外结构域的单克隆抗体)。

c.抗磷酸酪氨酸抗体(抗Ptyr)(多克隆)(参见Fendley等，上述)。

d.检测抗体：山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶缀合物，TAGO公司，Burlingame，CA。

e.TBST缓冲液：

Tris-HCl，pH 7.2 50mM

NaCl 150mM

Triton X-100 0.1

f HNTG 5X贮存液

HEPES 0.1M

NaCl 0.75M

甘油 50％

Triton X-100 1.0％

g.ABTS贮存液

枸橼酸 100mM

Na₂HPO₄ 250mM

HCl，浓 0.5mM

ABTS^* 0.5mg/ml

^*(2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))。在4℃下将溶液贮存于暗处直到使用。

h.贮存液试剂：

EDTA 100mM pH 7.0

Na₃VO₄0.5M

Na₄(P₂O₇)0.2M

方法。

预包被的ELISA板

1.用在PBS中的05-101抗体以每孔0.5μg包被ELISA板(Corning，96孔，目录25805-96号)、最后体积为100μl/孔，并在4℃下过夜贮存。当在4℃贮存时，将包被的板保持良好最长可达10天。

2.使用当天，除去包被缓冲液并用100μl封闭缓冲液(在PBS中的5％Carnation速溶脱脂奶粉)替代。在室温(大约23-25℃)下，温育板30分钟，振摇。临用前，除去封闭缓冲液并用TBST缓冲液将板洗涤4次。

接种细胞

1.可将过度表达含有EGFR细胞外域和细胞内HER2激酶域的嵌合受体的NIH3T3细胞系用于该测定。

2.选择具有80-90％汇合的盘用于实验。通过加入10％小牛血清使细胞经胰蛋白酶消化并终止反应。在DMEM培养基(10％CSDMEM培养基)上悬浮细胞并在室温下于1500rpm下离心一次5分钟。

3.在接种培养基(DMEM，0.5％牛血清)上重悬浮细胞，并使用台盼蓝计数细胞。大于90％的生存力为可接受的。在96孔微滴定板上，以每孔10,000细胞，每孔100μl的密度，在DMEM培养基(0.5％牛血清)上接种细胞。在37℃下，5％CO₂中，将接种的细胞温育40小时。

测定方法

1.使用倒置显微镜，用于检查接种细胞的污染情况。在DMEM培养基中，按1∶10稀释药物贮存液(10mg/ml在DMSO中)，然后将5μl转移至TBST孔中使最终药物稀释液为1∶200和最终DMSO浓度1％。对照组孔单独接受DMSO。在37℃下，于5％CO₂中温育2小时。

2.制备EGF配体：在DMEM中，稀释贮存液EGF以便得到10μl稀释的EGF转移液(1∶12稀释)，最终浓度100nM。

3.制备足以得到每孔100μl新鲜的HNTG^*，并放置在冰上。

HNTG^*(10ml)：

HNTG贮存液 2.0ml

milli-Q H₂O 7.3ml

EDTA，100mM，pH 7.0 0.5ml

Na₃VO₄(0.5M) 0.1ml

Na₄(P₂O₇)(0.2M) 0.1ml

4.在用药物温育120分钟后，将已制备的SGF配体以每孔10μl加入到细胞中，直到最终浓度为100nM。对照组孔单独接受DMEM。在室温下，伴随振摇下温育5分钟。

5.除去药物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞两次。将HNTG^*转移至细胞中，每孔100μl。在冰上放置5分钟。同时，从其它的ELISA板上除去封闭缓冲液并如同以上描述的那样用TBST洗涤。

6.将吸移管管尖小心安装到微量移液管上，从板上刮下细胞并通过重复吸入和放出HNTG^*溶解缓冲液使细胞材料匀化。将溶胞产物转移至包被、封闭和洗涤后的ELISA板。在室温、振摇下温育1小时。

7.除去溶胞产物并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的抗Ptyr抗体转移至ELISA板中。在抗Ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下，于室温下振摇温育30分钟。

8.除去抗Ptyr抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的TAGO抗兔IgG抗体转移至ELISA板。在室温下，振摇温育30分钟(抗兔IgG抗体：在TBST中1∶3000稀释)。

9.除去TAGO检测抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜制备的ABTS/H₂O₂溶液转移至ELISA板。在室温下，振摇温育20分钟。(ABTS/H₂O₂溶液：在10ml ABTS贮存液中1.0μl 30％H₂O₂)。

10.通过加入50μl的5N H₂SO₄(任选)终止反应，并在410nm下测定O.D.。

11.通过从阳性对照组中减去阴性对照组的值，确定最大磷酸酪氨酸信号。然后在减去阴性对照组后，计算对含有提取液的孔的磷酸酪氨酸内容物的百分比抑制率。

PDGF-R测定

除非另外指明，所有的细胞培养基、谷氨酰胺和小牛血清能够从Gibco Life Technologies(长岛，NY)购买。在37℃下，所有的细胞在90-95％空气和5-10％CO₂的潮湿气氛中生长。每周所有细胞系常规传代培养两次并如同Mycotect方法(Gibco)测定那样对支原体呈阴性。

对ELISA测定，在生长培养基(含有10％FBS、NEAA、1mM NaPyr和2mM GLN的MEM)中，细胞(U1242，从Joseph Schlessinger，NYU得到)生长至80-90％汇合，并在0.5％血清中的96孔组织培养板上以每孔25,000-30,000细胞接种。在含有0.5％血清的培养基中温育过夜后，将细胞更换至无血清的培养基中并在5％CO₂、37℃下的温育器中用受试化合物处理2小时。然后用配体刺激细胞5-10分钟，随后用HNTG(20mM，Hepes，150mM NaCl和10％甘油，5mM EDTA，5mM Na₃VO₄，0.2％Triton X-100和2mM NaPyr)溶解。将细胞溶胞产物(0.5mg/孔在PBS中)转移至预先用受体特异性抗体包被并已在室温下用在TBST(50mM Tris-HCl，pH 7.2，150mM NaCl和0.1％TritonX-100)中的5％牛奶封闭ELISA板30分钟。在室温下，伴随振摇将溶胞产物温育1小时。用TBST将板洗涤四次并然后在室温下与多克隆抗磷酸酪氨酸抗体一起温育30分钟。通过用TBST冲洗板四次除去过量的抗磷酸酪氨酸抗体。在室温下，将山羊抗兔IgG抗体加入到ELISA板上30分钟随后用TBST冲洗另外四次。将ABTS(100mM枸橼酸，250mM的Na₂HPO₄和0.5mg/mL的2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))+H₂O₂(1.2mL 30％H₂O₂至10ml ABTS)加入到ELISA板上以开始显色。在加入ABTS后，用630nm的参比波长，在410nm下记录吸收度大约15-30分钟。

IGF-1受体测定

以下方案用于测量在IGF-1受体上的磷酸酪氨酸水平，该方案表明IGF-1受体酪氨酸激酶活性。

材料与试剂

a.用于该测定的细胞系为3T3/IGF-1R，其为一种基因工程过度表达IGF-1受体的细胞系。

b.在37℃下，NIH3T3/IGF-1R在含有5％CO₂的温育器中生长。该生长培养基为DMEM+10％FBS(热灭活的)+2mM L-谷氨酰胺。

c.亲和纯化的抗IGF-1R抗体17-69。

d.D-PBS：

KH₂PO₄ 0.20g/l

KH₂PO₄ 2.16g/l

KCl 0.20g/l

NaCl 8.00g/l(pH 7.2)

e.封闭缓冲液：TBST+5％牛奶(Carnation速溶脱脂奶粉)。

f.TBST缓冲液：

Tris-HCl 50mM

NaCl 150mM(pH 7.2/HCl10N)

Triton X-100 0.1％

制备TBS贮存液(10X)，并在稀释期间将Triton X-100加入到该缓冲液中。

g.HNTG缓冲液：

HEPES 20mM

NaCl 150mM(PH 7.2/HCl1N)

甘油 10％

Triton X-100 0.2％

制备贮存液(5X)，并在4℃下保存。

h.EDTA/HCl：0.5M pH 7.0(NaOH)作为100X贮存液。

i.Na₃VO₄：0.5 M作为100X贮存液并在80℃下保存等分试样。

j.Na₄P₂O₇：0.2 M作为100X贮存液。

k.来自Promega的胰岛素样生长因子-1(目录G5111号)

1.兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清。

m.山羊抗兔IgG，POD缀合物(检测抗体)，Tago(目录4520号，批号1802)：Tago公司，Burlingame，CA。

n.ABTS(2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))溶液：

枸橼酸 100mM

Na₂HPO₄ 250mM(pH 4.0/1N HCl)

ABTS 0.5mg/ml

ABTS溶液应保存在暗处和4℃下。当其转变为绿色时该溶液应丢弃。

o.过氧化氢：30％溶液保存在暗处和4℃下。

方法。

除非另外特别指明，所有以下步骤在室温下进行。通过将该板用自来水冲洗三次随后TBST冲洗一次来进行所有ELISA板的洗涤。用纸巾轻拍板进行干燥。

细胞接种：

1.用胰蛋白酶-EDTA(0.25％，0.5ml/D-100，GIBCO)收获在组织培养基盘(Corning 25020-100)中生长至80-90％汇合的细胞。

2.在新鲜的DMEM+10％FBS+2mM L-谷氨酰胺中重悬浮细胞，并以20,000个细胞/孔(100μl/孔)转移至96孔组织培养板(Corning25806-96)。温育一天并然后将培养基替换为无血清培养基(90/μl)并在5％CO₂和37℃下温育过夜。

ELISA板的包被和封闭

1.用在100μl PBS中的抗IGF-1R抗体以0.5μg/孔将ELISA板(Corning 25805-96)包被至少2小时。

2.除去包被溶液，用100μl封闭缓冲液替代，且振摇30分钟。除去封闭缓冲液并在加入溶胞产物前洗涤板。

测定方法：

1.在无血清条件下，测定药物。

2.在96孔聚丙烯板上，用DMEM以1∶10稀释药物贮存液(在100％DMSO中)，并将10μl/孔的该溶液转移至细胞中以得到最终药物稀释浓度1∶100，及最终DMSO浓度1.0％。在37℃下，于5％CO₂中，将细胞温育2小时。

3.制备新鲜的细胞溶解缓冲液(HNTG^*)

HNTG 2ml

EDTA 0.1ml

Na₃VO₄ 0.1ml

Na₄(P₂O₇) 0.1ml

H₂O 73ml

4.在药物温育2小时后，将在PBS中的200nM IGF-1配体以10μl/孔转移至细胞(最终浓度为20nM)，并在37℃下，于5％CO₂中，温育10分钟。

5.除去培养基并加入100μl/孔HNTG^*并振摇10分钟。在显微镜下观察细胞以观察它们是否充分溶解。

6.使用12通道移液器从板上刮取细胞，并通过反复吸入和放出匀化所述溶胞产物。将所有的溶胞产物转移至抗体包被的ELISA板，并振摇1小时。

7.移出溶胞产物，洗涤板，转移抗pTyr(1∶3,000含有TBST)100μl/孔，并振摇30分钟。

8.除去抗pTyr，洗涤板，转移TAGO(1∶3,000含有TBST)100μl/孔，并振摇30分钟。

9.除去检测抗体，洗涤板，并转移新鲜的ABTS/H₂O₂(加1.2μ1 H₂O₂至10ml ABTS)100μl/孔到板上并开始显色。

于Dynatec MR5000上，在410nm下，用630nm的参比波长测量OD。

EGFR测定

如同以下描述的那样，能够测量在细胞上基因工程表达人EGF-R的EGF受体激酶活性：

材料与试剂

a.EGF配体：贮存液浓度＝16.5μM，EGF201，TOYOBO有限公司，日本。

b.05-101(UBI)(识别EGFR细胞外域的单克隆抗体)。

c.抗磷酸酪氨酸抗体(抗Ptyr)(多克隆)。

e.TBST缓冲液：

Tris-HCl，pH 7 50mM

NaCl 150mM

Triton X-100 0.1

f.HNTG 5X贮存液：

HEPES 0.1M

NaCl 0.75M

甘油 50

Triton X-100 1.0％

g.ABTS贮存液：

枸橼酸 100mM

Na₃VO₄ 250mM

HCl，浓 4.0pH

ABTS^* 0.5mg/ml

将溶液在4℃下保存于暗处直到使用。

h.贮存试剂：

EDTA 100mM pH 7.0

Na₃VO₄ 0.5M

Na₄(P₂O₇) 0.2M

方法。

预先包被的ELISA板

1.用在PBS中的05-101抗体以每孔0.5μg包被ELISA板(Corning，96孔，目录25805-96号)、最终体积为150μl/孔，并在4℃下过夜贮存。当在4℃贮存时，将包被的板保持良好最长可达10天。

2.使用当天，除去包被缓冲液并用封闭缓冲液(在PBS中的5％Carnation速溶脱脂奶粉)替代。在室温(大约23-25℃)下，伴随振摇下温育板30分钟。临用前，除去封闭缓冲液并用TBST缓冲液将板洗涤4次。

接种细胞

1.可将NIH 3T3/C7细胞系(Honegger等，Cell 51：199-209，1987)用于该试验。

2.选择具有80-90％汇合的盘用于实验。通过加入10％CS DMEM培养基使细胞经胰蛋白酶消化并终止反应。在DMEM培养基(10％CSDMEM培养基)中悬浮细胞并在室温下于1000rpm下离心一次5分钟。

3.在接种培养基(DMEM，0.5％牛血清)上重悬浮细胞，并使用台盼蓝计数细胞。大于90％的生存力为可接受的。在96孔微滴定板上，以每孔100μl，每孔10,000个细胞的密度，在DMEM培养基(0.5％牛血清)上接种细胞。在37℃下，在5％CO₂中，将接种的细胞温育大约40小时。

测定方法

1.使用倒置显微镜，用于检查接种细胞的污染情况。在DMEM培养基中，将受试化合物贮存液(10mg/ml在DMSO中)以1∶10稀释，然后将5μl转移至试验组孔，使受试化合物药物稀释至1∶200并达到最终DMSO浓度1％。对照组孔仅接受DMSO。在37℃下，于5％CO₂中温育1小时。

2.制备EGF配体：将在DMEM中的贮存液EGF稀释以便得到10μl稀释的EGF转移液(1∶12稀释)，得到25nM最终浓度。

3.制备足以用于每孔100μl的新鲜的10ml HNTG^*，其中HNTG^*包括：HNTG贮存液(2.0ml)，milli-Q H₂O(7.3ml)，EDTA，100mM，pH 7.0(0.5ml)，Na₃VO₄ 0.5M(0.1ml)和Na₄(P₂O₇)，0.2M(0.1ml)。

4.置于冰上。

5.用药物温育2小时后，将已制备的EGF配体加至细胞，每孔10μl，得到最终浓度25nM。对照孔仅接受DMEM。在室温下，伴随振摇下温育5分钟。

6.除去受试化合物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞2次。将HNTG^*转移至细胞，每孔100μl。放置于冰上5分钟。同时，从其它ELISA板上除去封闭缓冲液并如同以上描述的那样用TBST洗涤。

7.将吸移管管尖小心地安装到微量移液管上，从板上刮下细胞并通过重复吸入和放出HNTG^*溶解缓冲液匀化细胞材料。将溶胞产物转移至包被、封闭和洗涤后的ELISA板上。在室温、振摇下温育1小时。

8.除去溶胞产物并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的抗Ptyr抗体转移至ELISA板。在抗Ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下，于室温下振摇温育30分钟。

9.除去抗Ptyr抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的TAGO30抗兔IgG抗体转移至ELISA板。在室温下，振摇温育30分钟(抗兔IgG抗体：在TBST中1∶3000稀释)。

10.除去检测抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜制备的ABTS/H₂O₂溶液转移至ELISA板。在室温下，温育20分钟。(ABTS/H₂O₂溶液：在10ml ABTS贮存液中1.2μl 30％H₂O₂)。

11.通过加入50μl的5N H₂SO₄(任选)终止反应，并在410nm下测定O.D.。

12.通过从阳性对照组中减去阴性对照组的值，确定最大磷酸酪氨酸信号。然后在减去阴性对照组后，计算对含有提取液的孔的磷酸酪氨酸内容物的百分比抑制率。

Met自动磷酸化测定

通过在Met受体上分析Met蛋白酪氨酸激酶水平，该测定法测定Met酪氨酸激酶活性。

试剂

a.HNTG(5X贮存液)：将23.83g HEPES和43.83g NaCl溶于大约350ml dH₂O中。用HCl或NaOH调节pH至7.2，加入500ml甘油和10ml Triton X-100，混合，加dH₂O至1L总体积。为制备1L的1X工作液，将200ml的5X贮存液加至800ml dH₂O中，检查并必要时调节pH，在4℃下贮存。

b.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号(1X溶液)。

c.封闭缓冲液：在500ml的dH₂O中放入100g BSA、12.1gTris-pH 7.5、58.44g NaCl和10ml吐温-20，稀释至总体积1L。

d.激酶缓冲液：向500ml的dH₂O中加入12.1g TRIS(PH 7.2)、58.4g NaCl、40.7g MgCl₂和1.9g EGTA，用dH₂O加至1L总体积。

e.PMSF(苯基甲基磺酰氟)，Sigma目录P-7626号，至435.5mg，用100％乙醇加至25ml总体积，涡动。

f.ATP(细菌来源)，Sigma目录A-7699号，在-20℃下贮存粉末，制备溶液备用，将3.31mg溶于1ml dH₂O中。

g.RC-20H HRPO结合的抗磷酸酪氨酸，Transduction实验室目录E120H号。

h.Pierce 1-Step^TM Turbo TMB-ELISA(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，Pierce目录34022号。

i.将1ml浓H₂SO₄(18N)加入到35ml dH₂O中。

j.将TRIS HCL，Fischer目录BP152-5号加入到121.14g物料中，加入600ml MilliQ H₂O，用HCl将pH调至7.5(或7.2)，用MilliQ H₂O加至体积为1L。

k.NaCl，Fischer目录S271-10号，组成5M溶液。

1.吐温-20，Fischer目录S337-500号。

m.Na₃VO₄，Fischer目录S454-50号，向1.8g物料中加入80mlMilliQ H₂O，用HCl或NaOH将pH调至10.0，用微波煮沸，冷却，检查pH，重复过程直到pH稳定在10.0，将MilliQ H₂O加至100ml总体积，制备1ml等分试样并在-80℃下贮存。

n.MgCl₂，Fischer目录M33-500号，制备1M溶液。

o.HEPES，Fischer目录BP310-500号，向200ml MilliQ H₂O中加入59.6g物料，将pH调至7.5，总体积加至250ml，灭菌过滤。

p.白蛋白，牛(BSA)，Sigma目录A-4503号，向30克物料中加入灭菌蒸馏水以使总体积至300ml，在4℃下贮存。

q.TBST缓冲液：向在1L刻度量筒中的大约900ml dH₂O中加入6.057g TRIS和8.766g NaCl，当溶解时，用HCl将pH调至7.2，加入1.0ml Triton X-100并用dH₂O加至1L总体积。

r.山羊亲和纯化抗体兔IgG(总分子)，Cappel目录55641号。

s.抗h-Met(C-28)兔多克隆IgG抗体，Santa Cruz Chemical目录SC-161号。

t.瞬时转染EGFR/Met嵌合细胞(EMR)(Komada等，Oncogene，8：2381-2390(1993)。

u.碳酸钠缓冲液，(Na₂CO₃，Fischer目录S495号)：向10.6g物料中加入800ml MilliQ H₂O，当溶解时，用NaOH将pH调至9.6，用MilliQ H₂O加至1L总体积，过滤，在4℃下贮存。

方法

除非另外特别指明，所有以下步骤均在室温下进行。通过用TBST将所有ELISA板冲洗4次。

EMR溶胞作用

开始受体捕集之前一天夜间或者刚好之前进行该操作。

1.迅速将溶胞产物投入到37℃下进行涡流运动的水浴中，直到最后结晶消失。

2.用含有1mM PMSF的1X HNTG溶解细胞沉淀。使用每15cm盘细胞的3ml HNTG。加入1/2计算体积的HNTG，使试管涡动1分钟，加入剩余量的HNTG，涡动另外1分钟。

3.平衡试管，在4℃下，将其在10,000xg下离心10分钟。

4.收集上清液，移出等分试样用于蛋白质测定。

5.在干冰/乙醇浴上快速冷冻收集的样品。无论溶胞产物贮存过夜还是按照蛋白质测定方法立即使用，都要进行该步骤。

6.使用标准双辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)方法(来自PierceChemical目录23225号的BCA测定试剂盒)，进行蛋白质测定。

ELISA方法

1.用每孔5μg山羊抗兔抗体包被在总孔体积50μl的碳酸盐缓冲液中的Corning 96孔ELISA板。在4℃下贮存过夜。

2.通过翻转板倒出液体以除去未结合的山羊抗兔抗体。

3.将150μl的封闭缓冲液加入到每孔中。伴随振摇温育30分钟。

4.用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

5.每孔加入在TBST中稀释的1μg兔抗Met抗体以使总孔体积达到100μl。

6.在HNTG中稀释溶胞产物(90μg溶胞产物/100μl)。

7.将100μl稀释的溶胞产物加入到每孔中。振摇60分钟。

8.用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

9.每孔加入50μl的1X溶胞产物缓冲液。

10.在聚丙烯96孔板上，于1X激酶缓冲液中稀释化合物/提取液1∶10。

11.将5.5μl稀释的化合物转移至ELISA板孔中。在室温下，伴随振摇下温育20分钟。

12.每孔加入5.5μl的60μM ATP溶液。阴性对照组不接受任何ATP。伴随振摇下温育90分钟。

13.用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

14.每孔加入100μl的RC20(在封闭缓冲液中1∶3000稀释)。伴随振摇下温育30分钟。

15.用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

16.每孔加入100μl的Turbo-TMB。伴随振摇下温育30-60分钟。

17.每孔加入100μl的1M H₂SO₄以终止反应。

18.在Dynatech MR7000 ELISA读出器上读取测定值。试验滤光片＝450nm，参比滤光片＝410nm。

生物化学src测定

如同读出的那样，该测定方法通过测量磷酸化生物素化肽，来确定src蛋白激酶活性。

材料与试剂：

a.用src转化的酵母(Sugen公司，Redwood城，加里福尼亚)。

b.细胞溶胞产物：将表达src的酵母细胞沉淀，用水洗涤一次，再次沉淀并在-80℃下贮存直到使用。

c.按照本领域技术人员熟知的标准方法，制备N-端基生物素化的EEEYEEYEEEYEEEYEEEY。

d.DMSO：Sigma，St.Louis，MO。

e.96孔ELISA板：Corning96孔易洗、改进平底板，Corning目录25805-96号。

f.用于稀释化合物的NUNC96孔V形底聚丙烯板：AppliedScientific目录A-72092号。

g.Vecastain ELITE ABC试剂：Vector，Burlingame，CA。

h.抗src(327)mab：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)用于表达重组Src(Superti-Furga等，EMBO J.，12：2625-2634，Superti-Furga等，Nature Biochem.，14：600-605)。如同描述的那样，使粟酒裂殖酵母株SP200(h-s leul.32ura4 ade210)生长并且通过乙酸锂方法(Superti-Furga，上述)，用pRSP表达的质粒进行转化。在1μM维生素B1存在下，使细胞生长以阻遏来自nmtl启动子的表达或者在维生素B1不存在下诱导表达。

i.单克隆抗磷酸酪氨酸，UBI 05-321(可用UB40替代)。

j.Turbo TMB-ELISA过氧化物酶底物：Pierce Chemical。

缓冲液

a.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)：GIBCO PBS，GIBCO目录450-1300EB号。

b.封闭缓冲液：在PBS中的5％脱脂牛奶(Carnation)。

c.碳酸盐缓冲液：来自Fischer目录S495号的Na₂CO₃，制备100mM贮存液。

d.激酶缓冲液：1.0ml(来自1M贮存液)MgCl₂、0.2ml(来自1M贮存液)MnCl₂、0.2ml(来自1M贮存液)DTT、5.0ml(来自1M贮存液)HEPES、0.1ml TX-100，用MilliQ H₂O加至10ml总体积。

e.溶解缓冲液：5.0HEPES(来自1M贮存液)、2.74ml NaCl(来自5M贮存液)、10ml甘油、1.0ml TX-100、0.4ml EDTA(来自100mM贮存液)、1.0ml PMSF(来自100mM贮存液)、0.1ml Na₃VO₄(来自0.1M贮存液)，用MilliQ H₂O加至100mL总体积。

f.ATP：Sigma目录A-7699号，制备10mM贮存溶液(5.51mg/ml)。

g.TRIS-HCl：Fischer目录BP 152-5号，向600ml MilliQ H₂O中加入121.14g物料，用HCl调pH至7.5，用MilliQ H₂O制备1L总体积。

h.NaCl：Fischer目录S271-10号，用MilliQ H₂O制备5M贮存液。

i.Na₃VO₄：Fischer目录S454-50号，向80ml的MilliQ H₂O中加入1.8g物料，用HCl或NaOH调pH至10.0，在微波上煮沸，冷却，检查pH，反复调节pH直到pH在加热/冷却循环后保持稳定，用MilliQ H₂O加至100ml总体积，制备1ml等分试样并在-80℃下贮存。

j.MgCl₂：Fischer目录M33-500号，用MilliQ H₂O配制1M贮存液。

k.HEPES：Fischer目录BP 310-500号，向200ml的MilliQ H₂O中加入59.6g物料，将pH调至7.5，用MilliQ H₂O加至250ml总体积。灭菌过滤(1M贮存液)。

1.TBST缓冲液：TBST缓冲液：向900ml的dH₂O中加入6.057gTRIS和8.766g NaCl，用HCl调pH至7.2，加入1.0ml Triton-X 100，用dH₂O加至1L总体积。

m.MnCl₂：Fischer目录M87-100号，用MilliQ H₂O配制1M贮存液。

n.DTT：Fischer目录BP172-5号。

o.TBS(TRIS缓冲盐水)：向900ml的MilliQ H₂O中加入6.057gTRIS和8.777g NaCl，用MilliQ H₂O加至1L总体积。

p.激酶反应混合物：每测定板(100孔)的量：1.0ml激酶缓冲液、200μg GST-ζ、用MilliQ H₂O加至最终体积8.0ml。

q.生物素标记的EEEYEEYEEEYEEEYEEEY：临用前在水中新鲜制备肽贮存液(1mM，2.98g/ml)。

r.Vectastain ELITE ABC试剂：为制备14ml的工作试剂，将1滴试剂A加入到15ml TBST中并倒转试管几次以混合。然后加入1滴试剂B。在室温下，将试管放入轨道振摇器上并混合30分钟。

方法：

制备src包被的ELISA板

1.用在100μl的pH 9.6的碳酸钠缓冲液中的0.5μg/孔抗srcmab包被ELISA板，在4℃下保持过夜。

2.用PBS将孔洗涤一次。

3.在室温下，用在PBS中的0.15ml的5％牛奶封闭板30分钟。

4.用PBS将板洗涤5X。

5.以10μg/孔加入溶解缓冲液(每孔0.1ml总体积)中稀释的src转化的酵母溶胞产物。(溶胞产物的量可在这些批号之间变化)。在室温下，振摇板20分钟。

制备磷酸酪氨酸抗体包被的ELISA板。

1.4G10板：在4℃下，将0.5μg/孔的4G10在100μl的PBS中包被过夜并在室温下用在PBS中150μl的5％牛奶封闭30分钟。

激酶测定方法。

1.从板上除去未结合的蛋白并用PBS洗涤板5X。

2.每孔加入0.08ml激酶反应混合物(含有10μl的10X激酶缓冲液和在水中稀释的每孔10μM(最终浓度)生物素-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY。

3.加入在含有10％DMSO的水中稀释的10μl化合物并在室温下预先温育15分钟。

4.通过加入10μl/孔的在水中的0.05mM ATP(5μMATP最终)，开始激酶反应。

5.在室温下，振摇ELISA板15分钟。

6.通过每孔加入10μl的0.5M EDTA终止激酶反应。

7.将90μl上清液转移以封闭4G10包被的ELISA板。

8.温育30分钟，这期间在室温下振摇。

9.用TBST洗涤板5X。

10.在室温下，用Vectastain ELITE ABC试剂(100μl/孔)温育30分钟。

11.用TBST洗涤孔5X。

12.用Turbo TMB显色。

生物化学lck测定

通过测量作为示值读数的GST-ζ的磷酸化，该测定方法用于测定lck蛋白激酶活性。

材料和试剂

a.用lck转化的酵母。粟酒裂殖酵母用于表达重组Lck(Superti-Furga等，EMBO J，12：2625-2634，Superti-Furga等，Nature Biotech.，14：600-605)。通过乙酸锂方法(Superti-Furga，上述)，如同描述的那样，使粟酒裂殖酵母株SP200(h-s leul.32 ura4 ade210)生长并用p^RSP表达的质粒进行转化。在1μM维生素B1存在下，使细胞生长以诱导表达。

b.细胞溶胞产物：将酵母细胞表达的lck沉淀，以水洗涤一次，再次沉淀并在-80℃下冷冻贮存直到使用。

c.GST-ζ：在从旧金山加利福尼亚大学的Howard Hughes医学研究所的Arthur Weiss得到的细菌上表达对GST-ζ融合蛋白的DNA编码。在25℃下振摇期间，转化的细菌生长过夜。经谷胱甘肽亲和层析法(Pharmacia，Alameda，CA)纯化GST-ζ。

d.DMSO：Sigma，St.Louis，MO。

f.用于稀释化合物的NUNC96孔V形底聚丙烯板：AppliedScientific目录AS-72092号。

g.纯化兔抗GST抗血清：Amrad公司(澳大利亚)目录90001605号。

h.山羊抗兔-IgG-HRP：Amersham目录V010301号。

i.绵羊抗小鼠IgG(H+L)：Jackson实验室目录5215-005-003号。

j.抗Lck(3A5)mab：Santa Cruz Biotechnology目录sc-433号。

k.单克隆抗磷酸酪氨酸UBI 05-321(可用UB40替代)。

缓冲液

a.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)1X溶液：GIBCO PBS，GIBCO目录450-1300EB号。

b.封闭缓冲液：100g BSA、12.1g TRIS(pH 7.5)、58.44g NaCl、10ml吐温-20，用MilliQ H₂O加至1L总体积。

c.碳酸盐缓冲液：来自Fischer目录S495号的Na₂CO₃，用MilliQH₂O配制100mM溶液。

d.激酶缓冲液：1.0ml(来自1 M贮存液)MgCl₂、0.2ml(来自1M贮存液)MnCl₂、0.2ml(来自1 M贮存液)DTT、5.0ml(来自1M贮存液)HEPES、0.1ml TX-100，用MilliQ H₂O加至10mL总体积。

e.溶解缓冲液：5.0 HEPES(来自1M贮存液)、2.74ml NaCl(来自5M贮存液)、10ml甘油、1.0ml TX-100、0.4ml EDTA(来自100mM贮存液)、1.0ml PMSF(来自100mM贮存液)、0.1ml Na₃VO₄(来自0.1M贮存液)，用MilliQ H₂O加至100mL总体积。

f.ATP：Sigma目录A-7699号，配制10mM贮存溶液(5.51mg/ml)。

g.TRIS-HCl：Fischer目录152-5号，向600ml MilliQ H₂O中加入121.14g物料，用HCl调pH至7.5，用MilliQ H₂O加至1L总体积。

h.NaCl：Fischer目录S271-10号，用MilliQ H₂O配制5M贮存液。

j.MgCl₂：Fischer目录M33-500号，用MilliQ H₂O配制1M贮存液。

k.HEPES：Fischer目录BP310-500号，向200ml的MilliQ H₂O中加入59.6g物料，将pH调至7.5，用MilliQ H₂O加至250ml总体积。灭菌过滤(1M贮存液)。

1.白蛋白，牛的(BSA)，Sigma目录A4503号，向150ml的MilliQH₂O中加入30g物料，用MilliQ H₂O加至300ml总体积，经0.22μm滤膜过滤，在4℃下贮存。

m.TBST缓冲液：向900ml的dH₂O中加入6.057g TRIS和8.766g NaCl，用HCl调pH至7.2，加入1.0ml Triton-X 100，用dH₂O加至1L总体积。

n.MnCl₂：Fischer目录M87-100号，用MilliQ H₂O配制1M贮存液。

o.DTT：Fischer目录BP172-5号。

p.TBS(TRIS缓冲盐水)：向900ml的MilliQ H₂O中加入6.057gTRJS和8.777g NaCl，用MilliQ H₂O加至1L总体积。

q.激酶反应混合物：每测定板的量(100孔)：1.0ml激酶缓冲液、200μg GST-ζ，用MilliQ H₂O加至最终体积8.0ml。

方法：

制备Lck包被的ELISA板

1.在4℃下，将在100μl碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中用2.0μg/孔绵羊抗小鼠IgG包被过夜。

2.用PBS洗涤孔一次。

3.在室温下，用0.15ml的封闭缓冲液封闭板30分钟。

4.用PBS洗涤板5X。

5.在室温下，于1-2小时内加入在0.1mlPBS中的0.5μg/孔的抗lck(单克隆抗体3A5)。

6.用PBS洗涤板5X。

7.加入在溶解缓冲液(每孔0.1ml总体积)中稀释的20μg/孔的lck转化的酵母溶胞产物。在4℃下，振摇板过夜以阻止活性丧失。

制备磷酸酪氨酸抗体包被的ELISA板

1.UB40板：在4℃下，将在100μl PBS中的1.0μg/孔UB40过夜并用150μl封闭缓冲液封闭至少1小时。

激酶测定方法

1.从板上除去未结合的蛋白并用PBS洗涤板5X。

2.每孔加入0.08ml激酶反应混合物(含有10μl的10X激酶缓冲液和用水稀释的每孔2μgGST-ζ)。

4.通过加入在水中的10μl/孔的0.1mM ATP开始激酶反应(10μM ATP最终)。

5.在室温下，将ELISA板振摇60分钟。

6.通过每孔加入10μl的0.5 MEDTA终止激酶反应。

7.将90μl上清液转移至来自以上B部分的封闭的4G10包被的ELISA板。

8.在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

9.用TBST洗涤板5X。

10.在室温下，用在100μl TBST中以1∶5000稀释的兔抗GST抗体温育30分钟。

11.用TBST洗涤孔5X。

12.在室温下，将在100μl TBST中以1∶20,000稀释的山羊抗兔-IgG-HRP温育30分钟。

13.用TBST洗涤孔5X。

14.用Turbo TMB显色。

测量RAF磷酸化功能的测定方法

以下测定报道RAF催化其靶蛋白MEK以及MEK的靶MAPK的磷酸化的量。RAF基因序列在Bonner等，1985，Molec.Cell.Biol.，5：1400-1407中描述并易于在多基因序列数据库中得到。用于本发明该部分的核酸载体的构成和细胞系在Morrison等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8855-8859中充分描述。

材料与试剂

1.Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞，GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD。

2.RIPA缓冲液：20mM Tris/HCl pH 7.4、137mM NaCl、10％甘油、1mM PMSF、5mg/L Aprotenin、0.5％Triton X-100。

3.硫氧还蛋白-MEK融合蛋白(T-MEK)：按照制造商的方法，进行T-MEK的表达并经亲和层析法纯化。目录K350-01号和R350-40号，Invitrogen公司，San Diego，CA。

4.His-MAPK(ERK 2)，在用pUC18载体编码的His-MAPK转化的XL1蓝细胞中表达His标记的MAPK。经Ni-亲和层析法纯化His-MAPK。如同在此描述的那样，目录27-4949-01号，Pharmacia，Alameda，CA。

5.绵羊抗小鼠IgG：Jackson实验室，West Grove，PA。目录515-006-008号，批号28563。

6.RAF-1蛋白激酶特异性抗体：来自UBI的URP2653。

7.包被缓冲液：PBS，磷酸盐缓冲盐水，GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD。

8.洗涤缓冲液：TBST(50mM Tris/HCL pH 7.2，150mM NaCl，0.1％Triton X-100)。

9.封闭缓冲液：TBST，0.1％乙醇胺(pH 7.4)。

10.DMSO，Sigma，St.Louis，MO。

11.激酶缓冲液(KB)：20mM HEPES/HCl(pH 7.2)、150mMNaCl、0.1％Triton X-100、1mM PMSF、5mg/L Aprotenin、75mM原钒酸钠、0.5MM DTT和10mM MgCl₂。

12.ATP混合物：100mM MgCl₂、300mM ATP、10mCiγ³³PATP(杜邦-NEN)/mL。

13.终止溶液：1％磷酸，Fisher，匹兹堡，PA。

14.Wallac纤维素磷酸盐滤垫，Wallac，Turku，芬兰。

15.滤膜洗液：1％磷酸，Fisher，匹兹堡，PA。

16.Tomtec板收获器，Wallac，Turku，芬兰。

17.Wallacβ板读出器1205号，Wallac，Turku，芬兰。

18.用于化合物的NUNC96孔V形底聚丙烯板：AppliedScientific目录AS-72092号。

方法

除非另外特别指明，所有以下步骤在室温下进行。

1.ELISA板包被：在4℃下，用100ml绵羊抗小鼠亲和纯化抗血清(1mg/100mL包被缓冲液)将ELISA孔包被过夜。当在4℃下贮存时，ELISA板能够使用2周。

2.翻转板并除去液体。加入100mL封闭溶液并温育30分钟。

3.除去封闭溶液并用洗涤缓冲液洗涤4次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。

4.向每孔中加入1mg的RAF-1特异性抗体并温育1小时。如同在步骤3中描述的那样洗涤。

5.从RAS/RAF感染的Sf9细胞解冻溶胞产物并用TBST稀释至10mg/100mL。向这些孔中加入10mg稀释的溶胞产物并温育1小时。温育期间，将板振摇。阴性对照组不接受溶胞产物。对每种病毒以MOI为5，用重组杆状病毒感染细胞后，从RAS/RAF感染的Sf9昆虫细胞制备溶胞产物，并于48小时后收获。用PBS洗涤细胞一次并在RIPA缓冲液中溶解。经离心(在10,000xg下5分钟)除去不溶的物料。在干冰/乙醇中冷冻溶胞产物的等分试样并在-80℃下贮存直到使用。

6.除去未结合的物料并如同以上概述的那样(步骤3)洗涤。

7.每孔加入2 mg的T-MEK和2mg的His-MAEPK并用激酶缓冲液将体积调至40ml。通过实施例在此提供从细胞提取液中纯化T-MEK和MAPK的方法。

8.在TBST+1％DMSO中预先将化合物(贮存液10mg/ml DMSO)或提取液稀释20倍。向在步骤6中描述的孔中加入5ml所述预先稀释的化合物/提取液。温育20分钟。对照组不接受药物。

9.通过加入5ml ATP混合物开始激酶反应。在温育期间，在ELISA板振摇器上振摇板

10.60分钟后，通过向每孔中加入30mL终止溶液来终止激酶反应。

11.放入磷酸纤维素垫并把ELISA板放入Tomtec板收获器中。按照制造商的介绍收获并用滤膜洗涤溶液洗涤滤膜。干燥滤垫。密封滤垫并将它们置于固定器中。将该固定器插进放射活性检测仪器上并测定在滤垫上放射活性的磷(phosphorous)的量。

或者，能够将来自测定板的各自孔的40mL等分试样转移到磷酸纤维素滤垫上的相应位置。空气干燥滤膜后，将滤膜放于盘中。轻轻摇动该盘，以15分钟间隔变换洗涤溶液达1小时。空气干燥滤垫。密封滤垫并将它们置于适宜于测量样品中放射活性的磷的固定器上。将该固定器插进检测仪器中并测定在滤垫上放射活性的磷的量。

CDK2/细胞周期蛋白A-抑制测定

该测定分析在内源性底物中的CDK2的蛋白激酶活性。

试剂

A.缓冲液A：(80mM Tris(pH 7.2)，40mM MgCl₂)，4.84g.Tris(F.W.＝121.1g/mol)，4.07g.MgCl₂(F.W.＝203.31g/mol)溶于500ml H₂O中。用HCl调pH至7.2。

B.组蛋白H1溶液(0.45mg/ml组蛋白HI和20mM HEPES pH 7.2：5mg组蛋白H1(Boehinger Mannheim)在溶于100ml ddH₂O中的11.111ml的20mM HEPES pH 7.2(477mg HEPES(F.W.＝238.3g/mol)中，在-80℃下贮存1ml的等分试样。

C.ATP溶液(60μM ATP，300μg/ml BSA，3mM DTT)：120μl10mM ATP，600μl10mG/ml BSA至20ml，在-80℃下贮存1ml的等分试样。

D.CDK2溶液：cdk2/细胞周期蛋白A在10mM HEPES pH 7.2、25mM NaCl、0.5mM DTT、10％甘油中，在-80℃下以9μl等分试样贮存。

方案

1.制备为要求的最终测定浓度三倍的在ddH₂O/15％DMSO(体积)中的抑制剂溶液。

2.将20μl抑制剂分配在聚丙烯96孔板的孔中(或20μl的15％DMSO用于阳性和阴性对照组)。

3.解冻组蛋白H1溶液(1ml/板)、ATP溶液(1ml/板+用于阴性对照组的1等分试样)和CDK2溶液(9μl/板)。将CDK2保持在冰上直到使用。将CDK2溶液适当等分以避免重复冷冻-解冻循环。

4.将9μl CDK2溶液稀释到2.1ml缓冲液A(每板)中。混合。将20μl分配进入每孔。

5.将1ml组蛋白H1溶液与1ml ATP溶液(每板)混合进入10ml旋转盖的管中。加入γ³³p ATP以达到浓度0.15μCi/20μl(在测定中0.15μCi/孔)。小心混合以避免BSA发泡。向适当的孔中加入20μl。在板振摇器上混合这些板。对阴性对照组，将ATP溶液与等量的20mM HEPES pH 7.2混合并将γ³³p ATP加入到浓度为0.15μCi/20μl的溶液中。向适当孔中加入20μl。

6.使反应进行60分钟。

7.向每孔中加入35μl的10％TCA。在板振摇器上混合板。

8.在P30方型滤垫(filter mat squares)上每一个样品点样40μl。使滤垫干燥(大约10-20分钟)。

9.用250ml的1％磷酸(每升ddH₂O 10ml磷酸)洗涤滤垫4×10分钟。

10.用β板读出器计数滤垫。

细胞/生物测定

PDGF诱导的BrdU结合测定

材料与试剂：

(1)PDGF：人PEGF B/B，1276-956，Boehringer Mannheim，德国。

(2)BrdU标记试剂：10mM，在PBS(pH 7.4)中，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。

(3)FixDenat：固定溶液(备用)，目录1647229号，BoehringerMannheim，德国。

(4)抗BrdU-POD：与过氧化物酶缀合的小鼠单克隆抗体，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。

(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，备用，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。

(6)PBS洗涤液：1XPBS，pH 7.4(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。

(7)白蛋白，牛的(BSA)：分级V粉末，A-8551，Sigma化学公司，USA。

(8)基因工程表达人PDGF-R的3T3细胞系。

方案

(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO₂中，在37℃下，温育细胞过夜。

(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿(serum starved)24小时。

(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(PDGF，3.8nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照细胞接受配体(PDGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。

(4)在配体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度＝10μM)温育所述细胞1.5小时。

(5)在用标记试剂温育后，通过倾析除去培养基并在纸巾上轻拍翻转的板。加入FixDenat溶液(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育板45分钟。

(6)通过倾析来彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为封闭溶液的牛奶(在PBS中5％奶粉，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育板30分钟。

(7)通过倾析除去封闭溶液并用PBS洗涤这些孔一次。加入(100μl/孔)抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，1％BSA)并在室温下于板振摇器上温育板90分钟。

(8)通过倾析彻底除去抗体缀合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥该板。

(9)加入TMB底物溶液(100μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育板20分钟直到显色足以用于光度检测。

(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm下(以具有在作为参比波长的490nm下的滤光片读数的“双波长”方式)测量样品的吸光度。

EGF诱导的BrdU结合测定

材料与试剂

(1)EGF：小鼠EGF，201，Toyobo有限公司，日本。

(6)PBS洗涤液：1XPBS，pH 7.4(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。

(8)基因工程表达人EGF-R的3T3细胞系。

方案

(1)在96孔板上，在DMEM中的10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO₂中，在37℃下温育细胞过夜。

(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿24小时。

(3)在第3天，向该细胞中同时加入配体(EGF，2nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(EGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。

(4)在配体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度＝10μM)温育细胞1.5小时。

(6)通过倾析彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为封闭溶液的牛奶(在PBS中的5％奶粉，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育板30分钟。

(8)通过倾析彻底除去抗体缀合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转和在纸巾上轻拍干燥所述板。

(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm(以具有在作为参比波长的490nm下的滤光片读数的“双波长”方式)下测量样品的吸光度。

EGF诱导的Her2-驱动BrdU的结合

材料与试剂

(1)EGF：小鼠EGF，201，Toyobo有限公司，日本。

(6)PBS洗涤液：1XPBS，pH 7.4，自制。

(8)工程表达具有EGF-R细胞外域和Her2细胞内域的嵌合受体的3T3细胞系。

方案

(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO₂中，在37℃下温育细胞过夜。

(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(EGF＝2nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(EGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。

(6)通过倾析彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为封闭溶液的牛奶(在PBS中5％奶粉，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育板30分钟。

(8)通过倾析彻底除去抗体缀合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。

IGF1诱导的BrdU结合测定

材料与试剂

(1)IGF1配体：人重组G511，Promega公司，USA。

(5)TMB底物溶液：四甲基联苯胺(TMB)，备用，目录1647 229号，Boehringer Mannheim，德国。

(6)PBS洗涤溶液：1XPBS，pH 7.4(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。

(8)基因工程表达人IGF-1受体的3T3细胞系。

方案

(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS的DMEM)中进行血清饥饿24小时。

(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(IGF1＝3.3nM，在含有0.1％BSA的DMEM中制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(IGF1)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。

(4)配体活化16小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度＝10μM)温育细胞1.5小时。

(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm下(以具有在490nm作为参比波长的滤光片读数的“双波长”方式)测量样品的吸光度。

FGF诱导的BrdU结合测定

该测定法测量在表达内源性FGF受体的3Tc7/EGFr细胞中FGF诱导的DNA合成。

材料与试剂

1.FGF：人FGF2/bFGF(Gibco BRL，13256-029号)。

2.BrdU标记试剂，(10mM PBS(pH 7.4)，Boehringer Mannheim目录1647229号)。

3.Fixdenat固定溶液(Boehringer Mannheim目录1647229号)。

4.抗BrdU-POD(与过氧化物酶缀合的小鼠单克隆抗体，Boehringer Mannheim目录1647229号)。

5.TMB(四甲基联苯胺，Boehringer Mannheim目录1647229号)。

6.PBS洗涤溶液，pH 7.4(Sugen公司)。

7.白蛋白，牛的(BSA)：分级V粉末(Sigma化学公司目录A-8551号)。

方法

1.3T3工程化细胞系：3T3c7/EGFr。

2.在96孔板上，在DMEM、10％CS和2mM Gln中以8,000细胞/孔接种细胞。在5％CO₂中，在37℃下温育24小时。

3.在24小时后，用PBS洗涤细胞，然后在无血清的培养基(0％DMEM，0.1％BSA)中进行血清饥饿24小时。

4.同时加入配体(在含有0.1％BSA的DMEM中的FGF2(1.5nM))和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组孔接受FGF2配体但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释制备七个试验浓度。

5.20小时后，向细胞中加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100BrdU：DMEM，0.1％BSA，最终浓度为10μM)并温育1.5小时。

6.倾析培养基。用纸巾除去痕量物料。加入FixDenat(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上温育45分钟。

7.除去Fixdenat溶液。加入封闭溶液(在PBS(200μl/孔)中的5％奶粉)并在室温下于板振摇器上温育板30分钟。

8.倾析封闭溶液，用PBS洗涤孔一次。加入抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，0.1％BSA)，在室温下于板振摇器上温育90分钟。

9.倾析抗体缀合物，用PBS冲洗孔5次。通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。

10.加入TMB溶液(100μl/孔)，在室温下于板振摇器上温育板20分钟直到显色足以用于光度检测。

11.使用具有490nm滤光片的“双波长”方式，在Dynatech ELISA板读出器上，于410nm下测量吸光度。

生物化学EGFR测定法

使用ELISA，该测定法测量EGFR的体外激酶活性。

材料与试剂

1.Corning96孔Elisa板(Corning目录25805-96号)。

2.SUMO1单克隆抗EGFR抗体(生物化学实验室，SUGEN公司)。

3.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，Gibco目录450-1300EB号)。

4.TBST缓冲液：

试剂分子量工作浓度每L的量

Tris 121.14 50mM 6.057g

NaCl 58.44 150mM 8.766g

Triton X-100 NA 0.1％ 1.0ml

5.封闭缓冲液：

试剂分子量工作浓度每100 ml的量

Carnation速溶 5％ 5.0g

脱脂牛奶

PBS NA NA 100ml

6.A431 细胞溶胞产物(筛选实验室，SUGEN公司)。

7.TBS缓冲液

试剂分子量工作浓度每L的量

Tris 121.14 50mM 6.057g

NaCl 58.44 150mM 8.766g

8.TBS+10％DMSO

试剂分子量工作浓度每L的量

Tris 121.14 50mM 1.514g

NaCl 58.44 150mM 2.192g

DMSO NA 10％ 25ml

9.腺苷-5′-三磷酸(ATP，来自马的肌肉，Sigma目录A-5394号)。

在dH₂O中制备1.0mM溶液。临用前配制该试剂并保持在冰上。

10.MnCl₂。

在dH₂O中制备1.0M贮存液。

11.ATP/MnCl₂磷酸化混合物

试剂贮存溶液每10ml量工作浓度

ATP 1.0mM 300μl 30μM

MnCl₂ 1.0M 500μl 50mM

dH₂O 9.2ml

临用前制备该试剂并保持在冰上。

12.NUNC96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录AS-72092号)。

13.乙二胺四乙酸(EDTA)

在dH₂O中制备200mM工作溶液。用10N NaOH将pH调节至8.0。

14.兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(生物化学实验室，SUGEN公司)。

15.山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(生物来源目录ALI0404号)。

16.ABTS(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Sigma目录A-1888号)。

试剂分子量工作浓度每L的量

枸橼酸 192.12 100mM 19.21g

Na₂HPO₄ 141.96 250mM 35.49g

ABTS NA 0.5mg/ml 500mg首先在大约900ml dH₂O中混合两种组分，用磷酸将pH调节至4.0。加入ABTS，覆盖，放置大约0.5小时，过滤。溶液应在4℃下保持于暗处直到使用。

17.过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。

18.ABTS/H₂O₂

将15ml ABTS溶液与2.0μl H₂O₂混合。使用前5分钟制备。

19.0.2M HCl。

方法

1.在100μl PBS中，每孔用0.5μg SUMO1包被Corning96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。

2.通过翻转板以除去液体，从这些孔中除去未结合的SUMO1。用dH₂O洗涤1X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。

3.向每孔中加入150μl封闭缓冲液。在室温下，伴随振摇温育30分钟。

4.用去离子水洗涤板3X，然后用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

5.在PBS中稀释溶胞产物(7μg溶胞产物/100μl PBS)。

6.向每孔中加入100μl稀释的溶胞产物。在室温下，振摇60分钟。

7.如以上在4中所述洗涤板。

8.向含有捕获EGFR的ELISA板中加入120μl TBS。

9.在96孔聚丙烯板上以TBS稀释受试化合物1∶10(即10μl化合物+90μl TBS)。

10.向ELISA板中加入13.5μl稀释的受试化合物。向对照组孔(这些孔不接受任何受试化合物)中加入13.5μl TBS+10％DMSO。

11.在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

12.除了阴性对照组孔不接受ATP/MnCl₂以外，直接向所有的孔加入15μl磷酸化混合物(最后孔体积应为大约150μl，最终浓度为每孔中3μM ATP/5mM MnCl₂)。伴随振摇下温育5分钟。

13.5分钟后，通过在持续振摇下，向每孔中加入16.5μl的200mM EDTA(pH 8.0)终止反应。在加入EDTA后，振摇1分钟。

14.用去离子水洗涤4X，用TBST洗涤2次。

15.向每孔中加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中稀释1∶3000)。在室温下，伴随振摇下温育30-45分钟。

16.如同以上在4中描述的那样洗涤。

17.向每孔中加入100μl生物来源的山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(在TBST中稀释1∶2000)。在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

18.如同以上在4中描述的那样洗涤。

19.向每孔中加入100μl的ABTS/H₂O₂溶液。

20.伴随振摇下温育5-10分钟。除去任何气泡。

21.如果必要，向每孔中加入100μl的0.2M HCl终止反应。

22.在Dynatech MR 7000 ELISA读出器上读取测定值。受试滤光片：410nM，参比滤光片：630nm。

生物化学PDGFR测定法

使用ELISA，该测定法测量PDGFR的体外激酶活性。

材料与试剂

除非另外指明，与以上生物化学EGFR测定法一样，制备以下试剂的工作溶液。

1.Corning96孔Elisa板(Corning目录25805-96号)。

2.28D4C10单克隆抗PDGFR抗体(生物化学实验室，SUGEN公司)。

3.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，Gibco目录450-1300EB号)。

4.TBST缓冲液。

5.封闭缓冲液。

6.表达NIH3T3细胞溶胞产物的PDGFR-β(筛选实验室，SUGEN公司)。

7.TBS缓冲液。

8.TBS+10％DMSO。

9.腺苷-5′-三磷酸(ATP，来自马的肌肉，Sigma A-5394号)。

10.MnCl₂。

11.激酶缓冲磷酸化混合物。

试剂贮存溶液每10ml的量工作浓度

Tris 1M 250μl 25mM

NaCl 5M 200μl 100mM

MnCl₂ 1M 100μl 10mM

TX-100 100mM 50μl 0.5mM

12.NUNC96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录AS-72092号)。

13.乙二胺四乙酸(EDTA)。

14.兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(生物化学实验室，SUGEN公司)。

15.山羊抗兔IgG过氧化物酶缀合物(生物来源目录ALI0404号)。

16.2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Sigma目录A-1888号)。

17.过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。

18.ABTS/H₂O₂。

19.0.2M HCl。

方法

1.在100μl PBS中，用每孔0.5μg 28D4C10包被Corning96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。

2.通过翻转板以除去液体，从这些孔中除去未结合的28D4C10。用dH₂O洗涤1X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。

3.向每孔中加入150μl封闭缓冲液。在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

5.在HNTG中稀释溶胞产物(10μg溶胞产物/100μl HNTG)。

7.如同以上在4中描述的那样洗涤板。

8.向含有捕集PDGFR的ELISA板中加入80μl工作激酶缓冲液混合物。

10.向ELISA板加入10μl稀释的受试化合物。向对照组孔(这些孔不接受任何受试化合物)加入10μl TBS+10％DMSO。

11.在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

12.除了阴性对照组孔以外，直接向所有的孔中加入10μl ATP(最后孔体积应为大约100μl，在每孔中含有20μM ATP)。伴随振摇下温育30分钟。

13.30分钟后，通过向每孔中加入10μl的200mM EDTA(pH 8.0)终止反应。

14.用去离子水洗涤4X，用TBST洗涤2次。

16.如同以上在4中描述的那样洗涤。

18.如同以上在4中描述的那样洗涤。

19.向每孔中加入100μl ABTS/H₂O₂溶液。

20.伴随振摇下温育10-30分钟。除去任何气泡。

21.如果必要，经向每孔中加入100μl的0.2M HCl终止反应。

生物化学FGFR测定

该测定使用ELISA测量Myc-GyrB-FGFR融合蛋白的体外激酶活性。

材料和试剂

1.HNTG

试剂分子量 5x贮存液浓度每L的量 1x工作液浓度

HEPES 238.3 100mM 23.83g 20mM

NaCl 58.44 750mM 43.83g 150mM

甘油 NA 50％ 500ml 10％

TritonX-100 NA 5％ 10ml 1.0％

为制备1升5x贮存溶液，将HEPES和NaCl溶于大约350ml dH₂O中，用HCl或NaOH(取决于所使用的HEPES)把pH调至7.2，加入甘油、Triton X-100并然后以dH₂O加足体积。

2.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号)。

3.封闭缓冲液。

4.激酶缓冲液。

试剂分子量 10x贮存液浓度 1x工作液浓度

HEPES(pH 7.2) 238.3 500mM 50mM

MnCl₂ 20mM 2mM

MgCl₂ 203.32 200mM 10 mM

Triton-X-100 1％ 0.1％

DTT 380.35 5mM 0.5mM

5.苯基甲基磺酰氟(PMSF，Sigma目录P-7626号)

工作溶液：在乙醇中100mM。

6.ATP(细菌来源，Sigma目录A-7699号)。

对于贮存液浓度6mM而言，使用每ml的MilliQ H₂O 3.31mg。

7.生物素缀合的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(克隆4G10，Upstate生物技术公司目录16-103号，系列号14495)

8.Vectastain Elite ABC试剂(抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物，Vector实验室目录PK-6100号)。

9.ABTS溶液。

10.过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。

11.ABTS/H₂O₂。

12.0.2M HCl。

13.TRIS HCl(Fisher目录BP152-5号)。

在MilliQ H₂O中制备1.0mM溶液，用HCl将pH调至7.2。

14.NaCl(Fisher目录S271-10号)。

在MilliQ H₂O中制备5M溶液。

15.MgCl₂(Fisher目录M33-500号)。

在MilliQ H₂O中制备1M溶液。

16.HEPES(Fisher目录BP310-500号)。

在MilliQ H₂O中制备1M溶液，将pH调至7.5，灭菌过滤。

17.TBST缓冲液。

18.碳酸钠缓冲液(Fisher目录S495号)。

在MilliQ H₂O中制备0.1M溶液，用NaOH将pH调至9.6，过滤。

19.二硫苏糖醇(DTT，Fisher目录BP172-25号)。

临用前在MilliQ H₂O中制备0.5mM工作溶液。在-20℃下贮存直到使用，弃去任何剩余物。

20.MnCl₂，

21.Triton X-100。

22.山羊α-兔IgG(Cappel)。

23.亲和纯化兔αGSTGyrB(生物化学实验室，SUGEN公司)。

方法

除非另外指明，所有以下步骤均在室温下进行。

1.在碳酸盐缓冲液中，用每孔2μg山羊α-兔抗体包被Corning96孔ELISA板，以达到总孔体积为100μl，在4℃下过夜贮存。

2.通过翻转板倒出液体来除去未结合的山羊α-兔抗体。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

3.向每孔中加入150μl封闭缓冲液(在PBS中5％低脂牛奶)。温育30分钟，其间在微滴定板振摇器上振摇。

4.用TBST洗涤4x。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。

5.每孔加入0.5μg兔a-GyrB抗体。在DPBS中将抗体稀释至最终体积每孔100μl。在室温下，伴随在微滴定板振摇器上振摇温育1小时。

6.如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4x。

7.向每孔中加入在HNTG中的2μg COS/FGFR细胞溶胞产物(Myc-GyrB-FGFR源)，得到最终体积每孔100μl。伴随在微滴定板振摇器上振摇温育1小时。

8.如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。

9.每孔加入80μl的1x激酶缓冲液。

10.在聚丙烯96孔板上，在1x激酶缓冲液+1％DMSO中稀释受试化合物1∶10。

11.从聚丙烯板的孔中将10μl稀释的受试化合物溶液和对照组孔溶液转移至相应的ELISA板的孔中，伴随在微滴定板振摇器上振摇温育20分钟。

12.向阳性对照组和试验组孔中加入在激酶缓冲液中稀释的10μl的70μM ATP(最终ATP浓度为7μM/孔)。向阴性对照组孔中加入10μl的1x激酶缓冲液。伴随在微滴定板振摇器上振摇温育15分钟。

13.通过向所有的孔中加入5μl的0.5M EDTA终止激酶反应。

14.如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4x。

15.向每孔中加入在TBST中稀释的100μl生物素缀合α-磷酸酪氨酸单克隆抗体(b4G10)，伴随在微滴定板振摇器上振摇温育30分钟。

16.制备VectastainABC试剂。向15ml TBST中加入1滴试剂A。通过翻转试管几次来混合。加入1滴试剂B并再次混合。

17.如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。

18.向每孔中加入100μl ABC HRP试剂。伴随在微滴定板振摇器上振摇温育30分钟。

19.如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。

20.向每孔中加入100μl ABTS/H₂O₂溶液。

22.伴随振摇下温育5-15分钟。除去任何气泡。

23.如果必要，通过加入100μl的0.2M HCl/孔终止反应。

24.在Dynatech MR 7000 ELISA板读出器上读取测定值。受试滤光片：410nm，参比滤光片：630nm。

生物化学FLK-1测定

使用ELISA，该测定评价flk-1自动磷酸化体外活性。

材料和试剂

1.15cm组织培养盘。

2.Flk-1/NIH细胞：过度表达人flk-1克隆3的NIH成纤维细胞系(SUGEN公司，从MPI，Martinsried，德国得到)。

3.生长培养基：DMEM+热灭活的10％FBS和2mM谷氨酰胺(Gibco-BRL)。

4.饥饿培养基：DMEM+0.5％热灭活的FBS、2mM谷氨酰胺(Gibco-BRL)。

5.Corning96孔ELISA板(Corning目录25805-96号)。

6.对flk-1特异性的L4或E38单克隆抗体，经蛋白质-A琼脂糖亲和层析法(SUGEN公司)纯化。

7.PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)Gibco目录450-1300EB号)。

8.HNTG(参见用于制备的BIOCHEMICAL FGFR)。

9.Pierce BCA蛋白质测定试剂盒。

10.封闭缓冲液。

11.TBST(pH 7.0)。

12.激酶缓冲液。

13.激酶终止溶液：200mM EDTA。

14.对磷酸酪氨酸特异性的生物素化4G10(UBI目录16-103号)。

15.AB试剂盒(Vector实验室目录PK4000号)。

16.DMSO。

17.NUNC96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录AS-72092号)。

18.Turbo-TMB(Pierce)。

19.Turbo-TMB终止溶液：1M H₂SO₄。

20.ATP(Sigma目录A-7699号)。

21.在TBS中的20％DMSO(pH 7.0)。

方法

细胞生长和溶胞产物制备

1.将细胞接种到生长培养基中并在37℃和5％CO₂下生长2-3天以达到90-100％汇合。不超过传代20次。

2.除去培养基并用PBS洗涤细胞两次。用HNTG溶解缓冲液来溶解。收集所有溶胞产物并将它们进行涡流混合20-30秒。

3.经离心(在大约10,000xg下5-10分钟)除去不溶的物料。

4.使用BCA试剂盒，测定蛋白质浓度。

5.将溶胞产物分配成1mg等分试样，在-80℃下贮存。

测定方法

1.在100μl PBS中，用2μg/孔纯化的L4(或E38)包被Corning96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。

2.通过翻转板以除去液体，从这些孔中除去未结合的蛋白。用dH₂O洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。

3.用每孔150μl封闭缓冲液封闭板。在4℃下，伴随振摇下温育45-60分钟。

4.除去封闭缓冲液并用dH₂O洗涤ELISA板三次并用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。

5.在PBS中稀释溶胞产物以得到最终浓度50μg/100μl。向每孔中加入100μl稀释的溶胞产物。在4℃下，伴随振摇下温育过夜。

6.通过翻转板，从这些孔中除去未结合的蛋白。如同在步骤4中那样洗涤。

7.向孔中加入80μl激酶缓冲液(向阴性对照组孔加入90μl)。

8.将受试化合物稀释(正常稀释10倍)到在TBS中的含有20％DMSO的聚丙烯板的孔中。

9.向含有固定化的flk-1的ELISA孔中加入10μl稀释的化合物并振摇。对照组孔不接受化合物。

10.从贮存液1mM ATP中，制备在dH₂O中的0.3mM ATP溶液(或者可使用激酶缓冲液)。

11.除了阴性对照组以外，向所有孔中加入10μl的0.3mMATP。在室温下，伴随振摇下温育60分钟。

12.1小时后，通过加入11μl的200mM EDTA终止激酶反应。振摇1-2分钟。

13.用dH₂O洗涤ELISA板4次并用TBST洗涤两次。

14.向所有孔中加入100μl的1∶5000生物素化的4G10：TBST。在室温下，伴随振摇下温育45分钟。

15.在以上温育期间，向10ml的TBST中加入来自ABC试剂盒的50μl的溶液A和B。临用前大约30分钟，必须合并这些溶液。

16.如同在步骤4中那样洗涤板。

17.向所有孔中加入100μl预先形成的A和B复合物。在室温下，伴随振摇下温育30分钟。

18.如同在步骤4中那样，洗涤板。

19.加入100μl turbo-TMB。在室温下，振摇10-15分钟。

20.当阳性对照组孔中的颜色达到大约0.35-0.4的吸光度时，用100μl的turbo-TMB终止溶液来终止反应。

21.在Dynatech MR 7000 ELISA读出器上读取板。受试滤光片：450nm，参比滤光片：410nm。

HUV-EC-C测定

以下方案也可用于测量化合物的抗PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF或Flk-1/KDR的活性，所有这些经HUV-EC细胞天然表达。

第0天

1.洗涤并经胰蛋白酶消化HUV-EC-C细胞(人脐静脉内皮细胞，(American Type Culture Collection目录号1730CRL)。在大约1ml/10cm²的组织培养基烧瓶中，用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，从Gibco BRL得到，目录14190-029号)洗涤两次。在非酶促细胞解离溶液(Sigma化学公司，目录C-1544号)中，用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化。通过在细胞解离溶液中稀释0.25％胰蛋白酶/1mMEDTA(Gibco，目录25200-049号)，制备0.05％胰蛋白酶。在37℃下，用大约1ml/25-30cm²的组织培养基烧瓶进行胰蛋白酶消化大约5分钟。在细胞从烧瓶中脱离后，加入等体积的测定培养基并转移至50ml灭菌离心试管(Fisher Scientific，目录05-539-6号)中。

2.在50ml灭菌离心试管中，通过加入测定培养基用大约35ml测定培养基洗涤细胞，在大约200xg下离心10分钟，抽出上清液，并用35ml D-PBS再悬浮。用D-PBS重复洗涤另外两次，在大约1ml测定培养基/15cm²的组织培养基烧瓶中重悬浮这些细胞。测定培养基由F12K培养基(Gibco BRL，目录21127-014号)和0.5％热灭活的小牛血清组成。用Coulter计数器^(Coulter Electronics公司)计数细胞并向细胞中加入测定培养基，得到浓度0.8-1.0×10⁵细胞/ml。

3.以100μl/孔或0.8-1.0×10⁴细胞/孔向96孔平底板上加入细胞，在37℃，5％CO₂下温育～24小时。

第1天

1.在另外的96孔板上，制备两倍的受试化合物的滴定液，一般从50μM降至0μM。如同在以上第0天步骤2中提及的那样，使用相同的测定培养基。通过向特殊板柱(plate column)的顶端孔中加入在200μM(4X最终孔浓度)下的90μl/孔的受试化合物来制备滴定液。因为贮存的受试化合物通常为在DMSO中的20mM，所以200μM药物浓度含有2％DMSO。

为稀释受试化合物但保持DMSO浓度的恒定，使用在测定培养基(F12K+0.5％小牛血清)中含有最高可达2％DMSO的稀释液作为受试化合物滴定液的稀释液。在60μl/孔下，将该稀释液加入到在所述柱的剩余的孔中。在柱的顶端孔中，从120μl的200μM受试化合物稀释液中取60μl并与柱的第二个孔中的60μl混合。从该孔中取60μl并与柱的第三个孔中的60μl混合，并且如此进行下去直到完成两倍的滴定。当进行到倒数第一个孔的混合时，在该孔的120μl中取60μl并将它丢弃。留下最后一个含有60μl DMSO/培养基稀释液的孔作为不含有受试化合物的对照组。制备9个柱的滴定的受试化合物，使每孔足以重复三次，用于：(1)VEGF(从Pepro Tech公司得到，目录100-200号)，(2)内皮细胞生长因子(ECGF)(也称作酸性成纤维细胞生长因子或aFGF)(从Boehringer MannheimBiochemica得到，目录1439600号)，或(3)人PDGF B/B(1276-956，Boehringer Mannheim，德国)和测定培养基对照组。ECGF成为含有肝素钠的制备液。

2.从第0天开始，将50μl/孔受试化合物的稀释液转移至含有0.8-1.0×10⁴细胞/100μl/孔的HUV-EC-C细胞的96孔测定板，并在37℃，5％CO₂下温育～2小时。

3.重复三次，向每个受试化合物情况下加入50μl/孔的80μg/ml VEGF、20ng/ml ECGF或对照培养基。对受试化合物而言，生长因子浓度为4X要求的最终浓度。使用来自第0天步骤2的测定培养基制备生长因子的不同浓度溶液。在37℃，5％CO₂下温育大约24小时。每孔将含有50μl受试化合物稀释液、50μl生长因子或培养基和100μl细胞，其计算至200μl/孔总数。因此，受试化合物和生长因子的4X浓度一次性变成1X，每一种物质已加入到所述孔中。

第2天

1.在1μCi/孔(在RPMI培养基+10％热灭活的小牛血清中制备的10μl/孔的100μCi/ml溶液)中加入³H-胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham，目录TRK-686号)并在37℃，5％CO₂下温育～24小时。从Gibco BRL，目录11875-051号得到RPMI。

第3天

1.在-20℃下，将板冷冻过夜。

第4天

解冻板并用96孔板收获器(Tomtec Harvester 96^)收获至滤垫(Wallac，目录1205-401号)上，在Wallac Betaplate^TM液体闪烁计数器上读数。

体内动物模型

异种移植动物模型

人肿瘤在无胸腺小鼠(例如Balb/c，nu/nu)上作为异种移植物的生长能力提供一个研究对用于人肿瘤疗法的生物应答的有用的体内模型。因为首先成功异种移植人肿瘤到无胸腺小鼠中，(Rygaard和Povlsen，1969，Acta Pathol.Microbial.Scand.77：758-760)，许多不同的人肿瘤细胞系(例如，乳房、肺、泌尿生殖、胃-肠道、头和颈、成胶质细胞瘤、骨和恶性黑素瘤)已被移植并且在裸鼠上成功地生长。以下测定可用于测定不同的本发明化合物的活性、特异性和作用水平。三个一般类型的测定用于评价化合物：细胞/催化、细胞/生物学和体内类型。细胞/催化测定的目的是测定化合物对TK使细胞中已知底物上酪氨酸磷酸化的能力的影响。细胞/生物测定的目的是测定化合物对经细胞中的TK刺激的生物学应答的影响。体内测定的目的是测定化合物在具体疾病如癌症的动物模型中的作用。

用于皮下异种移植实验的适宜的细胞系包括基因工程过度表达EGFR、PDGFR、IGF-1R或任何其它的受试激酶的C6细胞(神经胶质瘤，ATCC#CCL 107)、A375细胞(黑素瘤，ATCC#CRL 1619)、A431细胞(表皮样癌，ATCC#CRL 1555)、Calu6细胞(肺，ATCC#HTB56)、PC3细胞(前列腺，ATCC#CRL 1435)、SKOV3TP5细胞和NIH3T3成纤维细胞。以下方案能够用于进行异种移植实验：

从Simonsen实验室(Gilroy，CA)得到雌性无胸腺小鼠(BALB/c，nu/nu)。在具有α-dri床(bedding)的微隔离器笼子中的洁净房间条件下，维持所有动物。它们接受灭菌啮齿动物食物和自由饮水。

使细胞系在适宜的培养基(例如，MEM、DMEM、Ham氏F10或Ham氏F12加上5％-10％小牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN))中生长。除非另外指明，从Gibco Life Technologies(长岛，NY)购买所有细胞培养基、谷氨酰胺和小牛血清。在37℃下，于90-95％空气和5-10％CO₂的潮湿气氛中生长所有细胞。每周所有细胞系常规传代培养两次并如同Mycotect方法(Gibco)测定那样对支原体呈阴性。

在或接近具有0.05％胰蛋白酶-EDTA的汇合下收获细胞并在450xg下沉淀10分钟。将沉淀重悬浮于灭菌的PBS或培养基(不含有FBS)中，达到特定的浓度并将细胞植入小鼠(每组8-10只小鼠，2-10×10⁶细胞/动物)的后胁腹。使用游标卡尺于3-6周内测量肿瘤生长。除非另外指明，用长×宽×高作为结果计算肿瘤体积。使用斯氏(students)t-检验计算P值。经在不同浓度下IP注射给予在50-100μL赋形剂(DMSO或VPD：D5W)中的受试化合物，一般在植入后第一天开始。

肿瘤侵袭模型

已确立以下肿瘤侵袭模型并可用于评价已鉴定选择性抑制KDR/Flk-1受体的化合物的治疗值和效力。

方法

8周龄裸鼠(雌性)(Simonsen公司)用作实验动物。在层流罩超静台内进行肿瘤细胞植入。腹膜内给予甲苯噻嗪/氯胺酮合剂(100mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪)用于麻醉。做一正中切口(大约1.5cm长度)以暴露腹腔，注射在100μL培养基体积中的10⁷肿瘤细胞。将细胞注射到胰的十二指肠叶(lobe)或结肠的浆膜中。用6-0丝线连续缝合来封闭腹膜和肌肉并经使用伤口夹封闭皮肤。每天观察动物。

分析

2-6周后，依肉眼观察动物而定，处死小鼠，切除转移到多种器官(肺、肝、脑、胃、脾、心、肌肉)的局部肿瘤并进行分析(测量肿瘤体积、侵袭等级、免疫化学，原位杂交测定等)。

细胞毒性的测量

治疗化合物在抑制受体酪氨酸激酶活性方面应比产生的细胞毒作用更有效。通过测定治疗指数即IC₅₀/LD₅₀，能得到化合物的有效性和细胞毒性的测量。使用标准技术例如那些在此描述的技术，可测量获得50％抑制率需要的剂量IC₅₀。也通过使用标准技术(Mossman，1983，J.Immunol.Methods，65：55-63)、经测量释放LDH的量(Korzeniewski和Callewaert，1983，J.Immunol.Methods，64：313，Decker和Lohmann-Matthes，1988，J.Immunol.Methods，115：61)或测量动物模型的致死剂量，也能够测量导致50％毒性的剂量LD₅₀。具有大的治疗指数的化合物为优选。所述治疗指数应大于2，优选至少为10，更优选至少为50。

结论

因此，应该意识到，3-亚杂芳基-2-吲哚满酮有望对各种化疗剂，尤其是对氟代嘧啶化合物的化疗效果具有有益作用。而且，期望3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮与氟尿嘧啶或氟尿嘧啶/亚叶酸一起为治疗直肠结肠癌的有效的化疗组合。

还应该意识到，本发明的化合物、方法和药用组合物有望调节RTK和CTK活性，因而作为抗RTK-和CTK-相关疾病的治疗剂是有效的。

本领域技术人员将易于意识到，本发明非常适宜于实施所述目的并获得所提到的结果及优点以及那些在此固有的优点。在此描述的分子复合物和方法、步骤、治疗、分子、特殊化合物为目前优选实施方案的代表，是举例说明的，并不打算限制本发明的范围。对那些本领域的技术人员而言，将出现其它的变化和用途，这些变化和用途包括在本发明精神范围内，其通过权利要求书的范围定义。

对本领域技术人员显而易见的是对在此公开的发明可做变化的替代和改进而不背离本发明的范围和精神。

在本说明书中提及的所有专利和出版物处于与本发明有关领域的技术人员的水平范围内。在此所有专利和出版物通过引用结合到本文中，引用程度就好象每一个单独的出版物是专门和独立地通过引用结合到本文中。

在此适宜于举例说明的本发明可在不存在任何要素、在此未特别公开的限制的情况下实施。因此，例如，在此每一个例子中，术语“包括”、“基本包括”和“由…组成”中任何一个可由其它两个中的任何一个替代。已使用的术语和表达可用作描述而非限制的术语，并且不打算在使用这样的术语和表达中排除显示和描述特征的任何等价物或其部分，但是人们认识到各种修改可能处于本发明权利要求的范围之内。因此，人们应理解尽管已通过优选的实施方案和任选的特征详细公开了本发明，在此公开的概念的改进和变化形式可由本领域技术人员采用，并且认为如同所附的权利要求定义的那样，这样的改进和变化形式处于本发明范围内。

另外，按照Markush基团描述本发明特征或方面，本领域技术人员将意识到本发明也因此根据Markush基团的任何单个成员或亚基团成员来描述。例如，如果将X描述为选自溴、氯和碘，对X为溴的权利要求和对X为溴和氯的权利要求得以充分描述。

其它实施方案处于以下权利要求书的范围内。

Claims

1.一种治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的氟代嘧啶化学治疗剂和治疗有效量的具有以下化学结构的化合物或其生理学上可接受的盐或前药给予需要此种治疗的患者：其中：R₁为H或烷基；R₂为O或S；R₃为氢；R₄、R₅、R₆和R₇各自独立选自氢、烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤代甲基、S(O)R、SO₂NRR’、SO₃R、SR、NO₂、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、(CH₂)_nCO₂R和CONRR’；A为选自以下的5元杂芳环：噻吩、吡咯、吡唑、咪唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、2-磺酰基呋喃、4-烷基呋喃、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，2，5-噁二唑、1，3，4-噁二唑、1，2，3，4-噁三唑、1，2，3，5-噁三唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，2，5-噻二唑、1，3，4-噻二唑、1，2，3，4-噻三唑、1，2，3，5-噻三唑和四唑，在一个或多个位置上由下列基团任选取代：烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、烷芳基、烷基芳氧基、卤素、三卤代甲基、S(O)R、SO₂NRR’、SO₃R、SR、NO₂、NRR’、OH、CN、C(O)R、OC(O)R、(CH₂)_nCO₂R或CONRR’；n为0-3；和R和R’独立选自H、烷基或芳基。

2.权利要求1的方法，其中所述化合物选自5-羟基-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯、3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢吲哚-2-酮和4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛或其生理学上可接受的盐或前药。

3.权利要求1的方法，其中所述化合物为3-[4-(2-羧乙基-3，5-二甲基吡咯-2-基)亚甲基]-2-吲哚满酮。

4.权利要求1的方法，其中所述化合物为3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮。

5.权利要求1的方法，其中所述氟代嘧啶化学治疗剂选自卡莫氟、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、替加氟、加西他滨和尿嘧啶-替加氟。

6.权利要求1的方法，其中所述氟代嘧啶化学治疗剂是氟尿嘧啶。

7.权利要求6的方法，该方法还包括将治疗有效量的亚叶酸给予所述患者。

8.权利要求1的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和结肠直肠癌。

9.一种治疗结肠直肠癌的方法，该方法还包括将治疗有效量的氟尿嘧啶和治疗有效量的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮给予需要此种治疗的患者。

10.权利要求9的方法，该方法还包括将治疗有效量的亚叶酸给予所述患者。

11.权利要求9的方法，其中所述氟尿嘧啶的所述治疗有效量为约400mg/m²-约500mg/m²。

12.权利要求9的方法，其中所述治疗有效量的所述氟尿嘧啶经胃肠外给予。

13.权利要求9的方法，其中所述3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的所述治疗有效量为每次治疗约4mg/m²-约190mg/m²。

14.权利要求9的方法，其中所述3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮的所述治疗有效量为每次治疗约72mg/m²-约145mg/m²。

15.一种治疗癌症的方法，该方法包括3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮和至少一种其它化学治疗剂的组合。

16.权利要求15的方法，其中所述其它化学治疗剂选自加西他滨、5-FU、UFT、卡铂、顺铂、奥沙利铂、紫杉酚、docetaxel、聚谷氨酸化紫杉烷、伊立替康、沙利度胺、COX-2抑制剂、他莫昔芬、亮丙瑞林、制管张素、endostatin、基质金属蛋白酶抑制剂、干扰素、多柔比星、脂质体多柔比星、柔红霉素、metoxantrone、estramucine和长春花碱或其组合。

17.选自下列化合物的3-亚杂芳基-2-吲哚满酮化合物：5-羟基-3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸、4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯、3-(5-羟甲基-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢吲哚-2-酮和4-甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯-2-甲醛或其生理学上可接受的盐或前药。

18.一种用于调节蛋白激酶催化活性的方法，包括使所述蛋白激酶与权利要求17的化合物、盐或前药接触。

19.权利要求18的方法，其中所述蛋白激酶选自受体蛋白酪氨酸激酶、细胞酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。

20.一种药用组合物，包含权利要求17的化合物、盐或前药和药学上可接受的载体或赋形剂。

21.一种用于治疗或预防患者中蛋白激酶相关疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求17的化合物、盐或前药给予所述患者。

22.权利要求21的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自受体蛋白酪氨酸激酶相关的疾病、细胞酪氨酸激酶疾病和丝氨酸-苏氨酸激酶相关的疾病。

23.权利要求21的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自EGFR相关的疾病、PDGFR相关的疾病、IGFR相关的疾病和flk相关的疾病。

24.权利要求21的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病为选自以下的癌症：鳞状细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤。

25.权利要求21的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自糖尿病、自身免疫性疾病、过度增殖性疾病、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎、类风湿性关节炎、炎性疾病和血管生成。

26.一种治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的吉西他滨和治疗有效量的3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚满酮给予需要此种治疗的患者。

27.权利要求26的方法，其中所述癌症为胰腺癌。

28.权利要求26的方法，该方法还包括治疗有效量的紫杉酚、卡铂、脂质体多柔比星或托泊替堪。

29.权利要求28的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、小细胞肺癌和肾癌。