CN1371378A - 28－表雷帕霉素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了涉及28－表雷帕霉素的方法和物质。

Description

28-表雷帕霉素类似物
                     发明背景
雷帕霉素为由吸水链霉菌产生的大环内脂类抗菌素。它与具有高亲合力的FK506-结合蛋白结合，产生雷帕霉素：FKBP配合物。报导的它们相互作用的Kd值低到200pM。雷帕霉素：FKBP配合物对大量细胞蛋白质，FRAP，具有高亲合力，产生三重的配合物[FKBP：雷帕霉]：[FRAP]。在该配合物中雷帕霉素作为连接FKBP与FRAP的二聚因子或接合器。
Figure A0081205100111
                    雷帕霉素
雷帕霉素为有效的免疫抑制剂，临床上用于预防器官移植的排斥。
作为FKBP与FRAP配合物的接合器，雷帕霉素也能够充当多聚化因子适当地编入包括FKBP衍生区域和FRAP衍生区域的嵌合的蛋白质。由于那些活性，雷帕霉素及其各种衍生物或同型物也可用作多聚化因子激活以这样的嵌合的蛋白质为基准的生物学转变。参见，例如，WO96/41865；WO 99/36553；Rivera et al Proc NatI Acad Sci U S A 96，8657-8662；和Ye X et al(1999)Science 283，88-91。就雷帕霉素本身来说，它的显著的生物学活性，包括有效的免疫抑制活性，限制了它在某些生物学转变中的某些应用，特别是那些对雷帕霉素敏感的动物或动物细胞。
大量雷帕霉素的结构类似物已经有报导，它们典型地作为发酵产品替换物，或者从合成方面努力以便提高该化合物作为免疫抑制剂的治疗指数。例如，有广泛的文献报导了在结构上与雷帕霉素相关同系物，类似物，衍生物及其他化合物(“雷帕霉素类似物”)包括具有一个或多个下列修饰的雷帕霉素的一些变体：C7，C42和/或C29甲氧基的脱甲基，消去或置换作用；C13，C43和/或C28羟基的消除，衍生或置换作用；C14，C24和/或C30酮的还原，消除或衍生作用；6-元的-哌啶酸环与5-元脯氨酰环的置换作用；和环己基环上的选择性取代或环己基环与取代的环戊基环置换作用。其他背景资料存在于US专利Nos.5,525,610；5,310,903和5,362,718的背景技术部分，参见US专利No.5,527,907。
具有低的免疫抑制活性和/或有效的药物动力学或生物利用率性能的新的雷帕霉素类似物非常适于用作多聚化药剂或抗真菌药剂。
相对于雷帕霉素具有改进的特性，例如，治疗指数，生物利用率，药物动力学，稳定性，等等的新的雷帕霉素类似物也可用作免疫抑制剂。
                        发明概要
当研究各种路易斯酸的C7亲核取代化学时，我们发现在没有任何亲核试剂的情况下用二氯甲烷中的Ti(OiPr)4处理雷帕霉素时导致一种全新的反应，得到的主要产品为一种未知的化合物。通过NMR分析接着X-ray结晶学分析，我们确实地测定并惊奇的是，我们已经第一次制造出新的雷帕霉素类似物，28-表雷帕霉素：
                     28-表雷帕霉素
这个转变代表一种在极为适度和中性的条件下将雷帕霉素转变为该新化合物，28-表雷帕霉素的有效的和选择性的差向异构化方法。
这个发现开创了以28-表雷帕霉素为基础的一类新的和令人感兴趣的雷帕霉素类似物的领域。这一类新化合物包括28-表雷帕霉素及其除了C28之外一个或多个位置被修饰(关于雷帕霉素的结构)的衍生物和同型物。本发明也提供以这些新的28-表雷帕霉素类似物为基准用于基因改造的细胞中使嵌合蛋白质多聚化，并在某些情况下用于抑制免疫反应或治疗或预防需要治疗的患者中致病真菌感染的组合物和方法。包括本发明28-表化合物的组合物优选基本上排除同源的C28差向异构体(即，排除具有在雷帕霉素中的C28立体化学的差向异构体)。换句话说，优选的组合物包括不超过20％天然存在的在28位上的差向异构体的本发明28表化合物，更优选少于10％，甚至更优选少于5％，最优选少于1％的同源的C28差向异构体(以重量或摩尔计)。
本发明化合物包括28-表雷帕霉素和在C7，C13，C14，C24，C28，C30和带有C43的环己基环上的一个或多个取代基修饰的28-表雷帕霉素类似物。在文献中已知上述位置的各式各样的合成变换，它们适应于本发明，例如，雷帕霉素作为原料合成取代的28-表雷帕霉素。本申请注意到了许多变换。参见WO 99/36553。另外，如本申请描述，在文献中已知许多天然存在的雷帕霉素同型物可在28位差向异构化。本发明化合物还要包括以2-甲基哌啶基或脯氨酰环状系统为基准的28-表雷帕霉素类似物(即，“n”如下列结构所示，可能是1或2)。本发明化合物还包括28-表雷帕霉素类似物的药学上可接受的衍生物。这将在下面的详细地论述。同样，在文献中已知许多另外的结构修饰(即，除位置28差向异构化以外的修饰)和得到雷帕霉素那些变体的方法的例子将在下文列举，可适用于本发明提供全部28-表雷帕霉素类似物。
这样的化合物的一个亚属可以式I表示：
Figure A0081205100131
其中
n为1或2；
R28和R43独立地选自H和取代或未被取代的脂肪族基团，酰基，芳酰基或杂芳酰基部分；
R7a和R7b之一为H以及另一个为卤素，-RA，-ORA，-SRA，-OC(O)RA，-C(O)NRARB，-NRARB，-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB’；或R7a和R7b一起为下列四烯部分中的H：
其中RA为H或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，杂芳基部分以及其中R8为H，OH或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，或杂芳基部分。
该化合物可以是基本上纯的立体异构体或立体异构体的混合物，或其药学上可接受的衍生物。优选化合物为基本上纯的28位的立体异构体，更优选28和43两个位置的基本上纯的立体异构体。
这些化合物可以是以脯氨酰环(n＝1)也可以是2-哌啶酸环(n＝2)为基础的，但后者目前特别令人感兴趣。
一个使人感兴趣的小组是式I的那些化合物，它们在雷帕霉素C7具有取代基，即其中R7a为OMe和R7b为H。该小组包括28-表雷帕霉素本身，相对于雷帕霉素结构除C7以外的一个或多个位置(例如，在位置28和/或43)修饰的衍生物和同型物。
另一个使人感兴趣的小组为包括上述的小组以及如下所述其中R28为除H以外的部分的式I化合物。例如，R28可以是烷基、苄基或其他取代的烷基、烯丙基，等等。
另一个使人感兴趣的小组为包括上述的小组以及如下所述其中R28和R43为H的式I化合物。该小组包括28-表雷帕霉素本身，及其他在C7修饰的化合物。
另一个使人感兴趣的小组为其中C7的一个或两个取代基不同于相应的雷帕霉素C7取代基，即，其中R7a为除-OMe以外的部分和/或R7b为除H以外的部分的式I的28-差向异构化合物。在该小组的某些化合物中，R7a和R7b中的一个为取代或未被取代的芳基或杂芳基，取代或未被取代的不饱和脂肪族基团，芳基或杂芳基醚，取代或未被取代的苄基醚，-NRBCONRARB，-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB。在某些情况下，式I其他化合物中更常见，R8可以是H，OH或烷基。这样的部分的例子包括其-NH-C(O)ORA，-NHC(O)ORA，-NHSO2RA等等，以及N-烷基(例如N-甲基，N-乙基，等等)和其N-羟基衍生物。在某些使人感兴趣的具体方案中，RA为H，而另一些为取代或未被取代的脂族基团，例如烷基部分。通常，该文件包括包含NH-部分(例如，-NHRA，-NHC(O)RA，-NHSO2RA，等等)的化合物，相关的N-烷基和N-羟基化合物(例如-N(RA’)RA，-N(RA’)C(O)RA，-N(RA’)SO2RA，-N(OH)RA，-N(OH)C(O)RA，-N(OH)SO2RA，等等)也包括，其中RA为H或取代或未被取代的脂族基团，杂脂族基团，芳基或杂芳基部分。
作为另外的说明，该小组包括其中C7具有下列类型的取代基的式I的28表雷帕霉素类似物：
文献中的方法可以在雷帕霉素C7位带有这样的取代基，而且那些方法可用来制造相应C7 28-表雷帕霉素类似物。
上述小组包括其中只在C7进一步修饰，即，其中R28和R43为H的28-表雷帕霉素类似物(其中n为1或2)，以及其中除了C7和C28之外还包含一个或多个位置修饰的化合物。该小组更高级衍生的化合物包括其中R28为除H以外基团的化合物。
另一个令人感兴趣的式I化合物小组包括其中R43为除H以外的部分，即有或者没有本申请公开的任何进一步修饰的那些式I的28-表雷帕霉素类似物，包括上下文描述的该小组的化合物。该小组包括其中R43是脂族基团或酰基部分的式I化合物，脂族基团部分的举例包括取代或未被取代的烷基部分如羟基烷基基团如-CH2CH2OH，烷氧基烷基基团如CH3OCH2-，取代或未被取代的苄基等等，或取代或未被取代的烯基或炔基部分如烯丙基或取代的烯丙基部分，酰基部分包括如烷基-CO-，氨基烷基-CO-，取代的氨基烷基-CO-，等等部分，包括取代或未被取代的甘氨酰(例如，RARBN-CH2-CO-)及其他在C43上取代和未被取代的酯。除了C43之外，这样的官能团可用来在28-表雷帕霉素类似物上衍生一种或多种其他的羟基部分。在任何场合，除如下记录之外，C43取代基可以存在立体化学取向，或者该化合物可以存在两个C43立体异构体的混合物。
另一个使人感兴趣的式I化合物的小组包括其中n is 2，R7a为-OMe以及R7b和R28都为H的I化合物。
本发明化合物也包括式II表示的24，30-四氢-28表雷帕霉素类似物：
Figure A0081205100161
其中R基团如上所述。母体化合物，24，30-四氢-28-表雷帕霉素可以使用文献中转换雷帕霉素至24，30-四氢-雷帕霉素的方法制备，但是原料用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素。参见，例如WO 99/36553。
本发明的这些及其他些化合物既以脯氨酰环(n＝1)也可以2-哌啶酸环(n＝2)为基础，但后者目前特别令人感兴趣。该部分-OR43可以是S或R定向。
一个使人感兴趣的小组为在雷帕霉素C7具有取代基，即其中R7a为OMe和R7b为H的式II化合物。该小组包括24，30-四氢28-表雷帕霉素本身，以及相对于雷帕霉素结构(例如，在位置28和/或43)除C7以外的一个或多个位置修饰的衍生物和同型物。
另一个使人感兴趣的小组为包括上述的小组以及如下所述，其中R28和R43为H的式II化合物。该小组包括24，30-四氢28-表雷帕霉素本身，及其他在C7修饰的化合物。
另一个使人感兴趣的小组为其中在C7的一个或两个取代基不同于雷帕霉素相应的C7取代基，即其中R7a为除-OMe的部分和/或R7b为除H以外的部分的式II的24，30-四氢28-表化合物。这样的部分可以选自与C7修饰有关的文件中所论述的基团。
上述小组包括其中只在C7进一步修饰，即，其中R28和R43为H的24，30-四氢28-表雷帕霉素类似物(其中n为1或2)，以及其中除了C7和C28之外还包含一个或多个位置修饰的化合物。该小组更高级衍生的化合物包括相对于雷帕霉素一个或两个R28和R43也被修饰的化合物。
另一个令人感兴趣的式II化合物小组包括其中R43为除H以外的部分，即有或者没有本申请公开的修饰的那些式II的24，30-四氢28-表雷帕霉素类似物，包括上下文描述的小组的化合物。该小组包括其中R43为脂族基团或酰基部分的式II化合物。典型的脂族基团部分包括取代或未被取代的烷基如羟基烷基基团如-CH2CH2OH，等等或取代或未被取代的烯基或炔基部分如烯丙基或取代烯丙基部分。典型的酰基部分包括在C43的部分如烷基-CO-，氨基烷基-CO-，取代氨基烷基-CO-，等等，包括甘氨酰及其他取代和未取代的酯。
另一个使人感兴趣的式II化合物小组包括其中n为2，R7a为-OMe以及R7b和R28都为H的式II化合物。
同样使人感兴趣的化合物为其中包含一种或多种相对于雷帕霉素进一步的修饰，例如雷帕霉素中的C7，C13，C14，C24，C30和环己基环状系统中一个或多个连接-OR43取代基的28，29-二表雷帕霉素类似物。
各种28-表雷帕霉素类似物可以用一种或多种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂配制得到包括一种本发明化合物的药学上可接受的组合物。
我们的差向异构化方法广泛地适用于羟醛，通常可有效地用于药物和非药物的合成。因此本发明进一步提供一种使羟醛部分的羟基差向异构化的新方法，其中包括在适宜条件下用四烷氧基钛试剂与包含羟醛部分的化合物接触并给予充分的时间使其差向异构化。该反应优选地在低于约75C下进行，更优选低于约50C°，并且甚至优选低于30C°。该反应优选不加入碱。合适的四烷氧基钛试剂包括如四异丙醇钛。在很多情况下，差向异构化产品从反应混合物中得到。各个异构体可以分别回收和纯化。尽管反应可以用于各式各样的羟醛，但特别适用于敏感分子如多功能的大环分子及其他天然产物，包括雷帕霉素和雷帕霉素衍生物和同型物中的醛醇进行差向异构化。该方法根据反应时间和条件的不同，可以生产28-表雷帕霉素，28-表雷帕霉素类似物，29-表雷帕霉素，29-表雷帕霉素类似物，28，29-双表雷帕霉素和28，29-双表雷帕霉素类似物。
如同WO 98/02441所述的其他的雷帕霉素类似物(特别是C7-衍生的28-表雷帕霉素类似物)，本发明新的28-表雷帕霉素类似物可以用作抗真菌药。如同科学和专利文献所述的雷帕霉素，例如以下引用的(特别是相对于雷帕霉素具有未修饰的C7取代基，或其中肯定缺乏庞大的替换C7取代基的28-表雷帕霉素类似物)，它们也可用作免疫抑制剂。如WO 96/41865和WO 99/36553所详细描述的雷帕霉素及其他雷帕霉素类似物一样，本发明化合物也可用于许多重要目的的细胞中的嵌合蛋白的多聚化。28-表雷帕霉素类似物在基因工程细胞中嵌合蛋白质多聚化中的应用在下文进一步描述。
以上所述的该基因工程细胞包含一种或多种本发明所述特定的编码嵌合蛋白质的重组体核酸结构。第一嵌合蛋白典型地包含一种或多种能够与本发明28-表雷帕霉素类似物结合FKBP区域。该第一嵌合蛋白也指“FKBP融合蛋白质”并且进一步包括至少一种与其至少一个FKBP区域异源的蛋白质区域。由FKBP融合蛋白质与雷帕霉素类似物结合形成的配合物能够与其中包含一种或多种FRB区域的第二嵌合蛋白(“FRB融合蛋白质”)结合。FRB融合蛋白质进一步包括至少一种与其至少一种FRB区域异源的蛋白质区域。在一些具体方案中，FKBP融合蛋白质和FRB融合蛋白质彼此不同。可是，在其他的具体方案中，FKBP融合蛋白质也为FRB融合蛋白质。在那些具体方案中嵌合蛋白包括一种或多种FKBP区域以及一种或多种FRB区域。在此情况下，第一和第二嵌合的蛋白质可以为相同的蛋白质，可以称为FKBP-FRB融合蛋白质，至少包含一种与FKBP和/或FRB区域异源的区域。
基于适当地选择的异源区域的结合，该嵌合蛋白是容易设计的，以致于它们的多聚化触发了一个或多个各式各样的生物学反应。由雷帕霉素类似物-介导的络合作用触发的生物反应的性质是由融合蛋白质标记物中异源的区域的选择测定。因此异源的区域称为“活性”或“效应因子”区域。应用于实现本发明的基因工程细胞将包含一种或多种编码嵌合蛋白的重组体核酸结构，并在某些应用中，将进一步包含一种或多种辅助核酸结构，如一种或多种靶基因结构。典型的生物学反应中该体系和辅助核酸结构的应用在下文中详细地论述。
一个包括相关材料和方法的体系公开于WO 96/41865和WO 99/36553(Clackson et al)，预期用于许多用途，尤其包括，研究用途和治疗用途。参见Rivera VM，Ye X，Courage NL，Sachar J，Cerasoli F，Wilson JM和Gilman M.(1999)肌内基因转移小鼠中的生长激素的长期可调型表达。Proc Natl AcadSci U S A 96，8657-8662；和Ye X，Rivera VM，Zoltick P，Cerasoli F Jr，SchnellMA，Gao G-p，Hughes JV，Gilman M，和Wilson JM(1999)体内体细胞基因转移后治疗蛋白质的调节释放，Science 283，88-91。
本发明部分是基于类似于公开在上述专利文件和相关的科技出版物中的一个体系，但是包括利用新的28-表雷帕霉素类似物作为多聚化药剂。因此本发明提供一种使细胞中嵌合蛋白质多聚化的方法，其中包括(a)适当地提供包含直接表达所需的嵌合蛋白的核酸结构和任何所需的辅助重组体结构的基因工程细胞，和(b)用本申请描述的28-表雷帕霉素类似物或其药学上可接受的衍生物接触该细胞。该雷帕霉素类似物形成一种包含其本身和至少两个嵌合蛋白分子的配合物。改进的雷帕霉素类似物用于包括下列的本发明。
其中可以用于本发明各种的方法的新的雷帕霉素类似物包括式III表示的亚结构：
Figure A0081205100191
它具有许多各种各样的取代基，和任选具有一个或多个碳碳不饱和键。取代基“a”为具有各种取代基的五或六员环，本申请文件别处所述。某些本发明28-表雷帕霉素类似物，特别是其中C7取代基不同于雷帕霉素的本发明28-表雷帕霉素类似物，同雷帕霉素比较起来具有合乎需要的基本上降低的免疫抑制作用，可以用于实际用途。“基本上降低的免疫抑制作用”指与等摩尔量的雷帕霉素相比，雷帕霉素类似物通过临床或适当的体外或体内的人类免疫抑制活性替代品优选在淋巴系统中来的组织上测量时，观察到或预期具有少于0.1，优选少于0.01，并且甚至更优选少于0.005倍的免疫抑制作用，或者另一个办法，在这样的体外测定中该雷帕霉素类似物产生的EC50值最小为在相同测定中的雷帕霉素所观察到的EC50值的十倍，优选至少100倍，更优选至少250倍。
一种适当的体外替代品的人类患者的免疫抑制作用为哺乳动物T细增殖的体外抑制。这是传统的测定方法可以使用在各种的人类或鼠科动物T细胞细胞系，包括人类PBLs和Jurkat细胞的一些众所周知的变化。因此可以测定雷帕霉素类似物的免疫抑制活性并与雷帕霉素相比较。通过适当的体外测定发现，相对于雷帕霉素免疫抑制活性的降低，预示可减少人类的免疫抑制活性。这样的体外测定可用来评价雷帕霉素类似物的相对的免疫抑制活性。
本申请公开了28-表雷帕霉素类似物各种各样的举例说明。本申请公开的化合物也可能在例如C7，C43，C13，C24和C30等中的一个或多个位置，采用WO 96/41865，WO 98/02441，WO 99/36553及其他本申请引用的专利文件公开的适合的化学变化而被进一步衍生。特别令人感兴趣的28-表雷帕霉素类似物尤其包括那些与人类FKBP12结合，或抑制其旋转异构酶活性，在由雷帕霉素在任何传统的FKBP结合或旋转异构酶测定中得到的在两个，更优选一个绝对值阶以内的28-表雷帕霉素类似物。
其他几种可以用于实施本发明方法的28-表雷帕霉素类似物定义为如下表示的结构：
Figure A0081205100201
其中
Figure A0081205100202
(或另外衍生的5-或6-元环)，其他的取代基定义如前，并且除非另有陈述各取代基可以存在立体化学取向，并其中R8各为H，卤素，-CN，-CORA，-ORA，-NRARB，OSO2CF3，OSO2F，OSO2RB，OCORB，OCONRA′RB，或OCON(ORA)RB。
用于实施本发明的28-表雷帕霉素类似物，包括各种上文公式表示的雷帕霉素类似物，可以(在没有确定立体化学的情况下)包含任何可能的立体异构定向的取代基，可以包含基本上无其他立体异构体的一个立体异构体(＞90％，优选＞95％，除其他的立体异构体外，以摩尔计)或可以包含立体异构体的混合物。本发明新的化合物特别地排除28，29-双-表雷帕霉素或28，43-双-表雷帕霉素本身(即，相对于雷帕霉素结构无另外的修饰)。
同样，本申请描述的28-表雷帕霉素类似物用于基因工程细胞中的嵌合蛋白质多聚化的方法。该方法包括(a)适当地提供包含直接表达所需的嵌合蛋白的核酸结构和任何所需的辅助重组体结构基因工程细胞，和(b)用本申请描述的28-表雷帕霉素类似物或其药学上可接受的衍生物接触该细胞。
在一个具体方案中，至少一个嵌合的蛋白质包含至少一个其肽序列不同于天然存在的FKBP肽序列，例如人类FKBP12肽序列，在该肽序列中至多包含十个氨基酸残基。肽序列变化的优选数目限于5，更优选1，2，或3。
在另一个具体方案中，至少一个嵌合的蛋白质包含至少一个其肽序列不同于天然存在的FRB肽序列例如人类FRAP的FRB区域的FRB区域，在该肽序列中至多包含十个氨基酸残基。肽序列变化的优选数目限于5，更优选1，2，或3。在很多情况下，FRB区域优选地包含单个涉及相应的人类FRAP或其他哺乳动物FRAP/TOR的FRB区域的肽序列的氨基酸替换物。特别令人感兴趣的的突变包括用独立选择的替换氨基酸，例如A，N，H，L，或S替换一个或多个源自人类FRAP的FRB区域的T2098，D2102，Y2038，F2039，K2095的替代。其他使人感兴趣的是用独立选择的替换氨基酸，例如H，L，S，A或V对一个或多个源自酵母TOR1 FRB区域的F1975，F1976，D2039和N2035的替换，或一个或多个源自酵母TOR2的FRB区域的F1978，F1979，D2042和N2038的替换。
在某些具体方案中，在一个或多个FKBP区域和一个或多个FRB区域中，嵌合蛋白包含至少一个，优选至多三个相对于天然存在序列的肽序列中的修饰。
如前所述，在本发明的各种具体方案中，该嵌合蛋白包含一个或多个与FKBP和/或FRB区域异源的“活性”或“效应因子”区域。效应因子区域可以选自各式各样的蛋白质区域，包括DNA结合区域，转录激活作用区域，细胞定位区域和信号区域(即，其中在群集或多聚化时能触发细胞生长，增殖，分化，细胞程序死亡，基因转录等等的区域)。可用于实施本发明的各种各样的典型的效应因子公开于本申请引用的各种科学和专利文件。
例如，在某些具体方案中，一个融合蛋白质包含至少一个DNA结合区域(例如，GAL4或ZFHD1 DNA结合区域)而另一个融合蛋白质包含至少一个转录激活作用区域(例如，VP16或p65转录激活作用区域)。融合蛋白质配体介导缔合表示转录因子配合物的形成，导致与辨认融合蛋白质上的DNA结合域的(即，可与其结合的)脱氧核糖核酸序列有关系的靶基因的转录的开始。
在其他的具体方案中，一个融合蛋白质包含至少一个能够指引融合蛋白质到特别的细胞位置如细胞膜，核，ER或其他的细胞器或细胞组分。其中指向例如细胞膜的目标的定位区域包括如十四酰化位置的区域或受体蛋白或其他的膜-跨越蛋白质的横跨膜的区域。另一个融合蛋白质可以包含能激活细胞信号转导途径实现膜定位和/或群集的信号区域。信号区域的例子包括生长因子或细胞活素受体的胞内区域，细胞程序死亡触发区域如FAS或TNF-R1的胞内区域，和源自其他的胞内信号蛋白质如SOS，Raf，Ick，ZAP-70，等等的区域。一些信号蛋白质公开于PCT/US94/01617(参见例如pp.23-26)。在其他的具体方案中，每一融合蛋白质包含至少一个FRB区域和至少one FKBP区域，以及一个或多个异源的区域。这样的融合蛋白质能够使存在的雷帕霉素类似物实现均二聚化和触发信号。一般说来，包含寄主细胞内生的肽序列的区域优选的应用，包括整体有机体中的应用。因此，对于人类基因治疗的应用源自人类的区域特别令人感兴趣。
作为能够指引其表达的核酸结构，本申请也提供编码融合蛋白质的重组体核酸结构，包含这样的结构的媒介物可以引导他们进入细胞，特别是真核细胞，其中酵母和动物细胞特别令人感兴趣。鉴于融合蛋白质标记物的组分，编码它们的重组DNA分子能够有选择地与(a)编码包括FRB区域或FKBP区域的多肽的DNA分子和(b)编码异源的区域或由其衍生异源蛋白质区域的蛋白质的DNA分子杂交。DNA也包括其中能够杂交而不是退化遗传密码的DNA。
通过使用编码融合蛋白质的核酸，在真核细胞中引导其表达的核酸结构，和引导这样的结构进入细胞，特别是动物细胞的媒介物或其他试剂，人们可以将一些重要的用途使细胞，优选哺乳动物细胞，最优选人类细胞进行基因改造。为了实现上述目标，首先要提供在所需的嵌合蛋白的真核生物(优选动物)细胞中引导表达的表达载体或核酸结构，然后以DNA摄取许可的方式引导重组DNA进入该细胞，在至少一部分该细胞中引导DNA的表达。人们可以使用任何方法和材料引导DNA进入细胞进行异源基因表达，这些方法和材料为大家所熟知和/或在市场上可买到的。
因此如本申请描述，本发明的一个目的是在细胞，优选动物细胞中多聚化融合蛋白质的方法。扼要说明，一个融合蛋白质能够与本发明的28-表雷帕霉素类似物结合，包含至少一个FKBP区域和至少一个异源的区域。第二个融合蛋白质包含至少一个FRB区域和至少一个异源的区域，能够与第一个融合蛋白质和28-表雷帕霉素类似物一个或多个分子形成三重配合物。在一些具体方案中，存在于该融合蛋白质上的一个或多个异源的区域也存在于另一个融合蛋白质，即，两个融合蛋白质具有一个或多个共同的异源的区域。在其他的具体方案中，各个融合蛋白质包含一个或多个不同的异源的区域。
该方法包括通过在其中存在该细胞的培养基中加入雷帕霉素类似物，或对其中存在该细胞的有机体使用雷帕霉素类似物给药，使适当的基因工程细胞与28-表雷帕霉素类似物接触。该细胞优选真核细胞，更优选动物细胞，最优选哺乳动物细胞。灵长类细胞，特别是人类细胞特别令人感兴趣。将28-表雷帕霉素类似物对人类或非人类动物给药可以使用任何药学上可接受的剂型和给药途径。目前最令人感兴趣的是口服包含28-表雷帕霉素类似物和一种或多种药学上可接受的载体，缓冲液或其他赋形剂的药学上可接受的组合物。
如上面另外的描述，本发明的一个目的是提供一种以雷帕霉素类似物依赖的方式诱导靶基因转录的方法。该细胞典型地包含编码两个融合蛋白质的重组体DNA，和包含一个靶基因的靶基因构造，该靶基因是与处理其中对存在的该融合蛋白质与28-表雷帕霉素类似物配合物起反应的脱氧核糖核酸序列有联系的。该靶基因结构可以为重组体，并且该靶基因和/或与其连接的控制核酸序列可以与寄主细胞是异源的。在某些具体方案中，该细胞对与FKBP融合蛋白质结合的雷帕霉素类似物起反应，参与FRB融合蛋白质的配合物，可检测出其优选与包含内源性FKBP和/或FRB的寄主细胞蛋白质结合。
如上面另外的描述，本发明的另一个特殊的目的是提供一种以雷帕霉素类似物依赖的方式诱导细胞死亡的方法。在这样的细胞中，在至少一个融合蛋白质，通常两个融合蛋白质上的至少一个异源的区域为如FAS或TNF-R1的胞内域的区域，它们群集、触发该细胞的细胞程序死亡。
如上面另外的描述，本发明的另一个特殊的目的是提供一种以雷帕霉素类似物依赖的方式，诱导细胞生长，分化或增殖的方法。在这样的细胞中，至少一个融合蛋白质的至少一个异源的区域为信号区域，例如，介导细胞生长，分化或增殖的激素的受体的胞内区域，或这样的受体的下游介质的胞内区域。随着这样的信号区域的群集，细胞生长，分化和/或增殖。这样的群集随着激素结合，以及与28-表雷帕霉素类似物接触后，在本发明基因改造的细胞中自然出现。
人类来源的细胞优选人类基因治疗的应用，虽然可以使用各种来源的细胞类型(人类或其他的物种)，但是如果需要，可以装入生物相容的材料的胶囊内供受试验的人使用。
本申请也提供制造上述基因工程细胞的材料和方法。这个目的需要提供重组体核酸，典型地为DNA分子；编码融合蛋白质，与任何所需的辅助重组体核酸如靶基因结构一起；以及在容许通过细胞摄取核酸条件下，引导该重组体核酸进入寄主细胞。这样的转染可以使用培养物维持的寄主细胞在体外作用。随后可以将培养物中的基因工程细胞引入寄主有机体，例如体外基因治疗应用。因此构成一种提供(如本申请描述)响应本申请提供的28-表雷帕霉素类似物存在的寄主有机体优选人类或非人类哺乳动物的方法。或者，使用存在于人类或非人类寄主有机体的寄主细胞，转染可以体内作用。在此情况下，在容许核酸一个或多个寄主有机体细胞摄取条件下，核酸分子立即被引导进入该寄主有机体。因此该途径构成一种提供(如本申请描述)响应本申请提供的28-表雷帕霉素类似物存在的寄主有机体优选人类或非人类哺乳动物的选择性的方法。引导DNA和RNA进入培养物或整个有机体中的细胞的各种材料和方法在本领域是已知的，并且可以在本发明实践中改进。
使用本申请描述的基因工程细胞可以实现其他的目的。例如，通过用有效量的容许雷帕霉素类似物与融合蛋白质形成配合物的28-表雷帕霉素类似物接触本申请描述的基因工程细胞，提供了一种本发明融合蛋白质多聚化的方法。在具体方案中，融合蛋白质的多聚化触发靶基因的转录，这构成了一种激活靶基因表达的方法。在具体方案中，融合蛋白质包含一个或多个信号区域，这构成了激活细胞信号转导途径的方法。在特定的具体方案中，信号区域的选择以它们的能力为基准信号区域，接着群集触发细胞生长，增殖，分化或细胞死亡，视情况而定，28-表雷帕霉素类似物-介导的群集构成了一种驱动细胞生长，增殖，分化或细胞死亡的方法。这些方法可以在细胞培养物或整个有机体包括人类患者中进行。在前一种情况下，雷帕霉素或雷帕霉素类似物加入培养基。在后一种情况下，雷帕霉素或雷帕霉素类似物(可以是药物或兽医组合物形式)以例如，口服，胃肠外等方式对整个有机体给药。优选地，28-表雷帕霉素类似物对动物给药的剂量低于该接受者过度的免疫抑制的剂量水平。
如本申请描述，公开了用于人类或非人类动物细胞基因工程的试剂盒。一个这样的试剂盒包含一种或多种本发明的编码融合蛋白质的重组体核酸结构。该重组体核酸结构通常由适用于引导进入动物细胞并且能够在其中引导该融合蛋白质表达的真核生物的表达媒介物形成。这样的媒介物可以是本申请在别处描述的病毒载体。该试剂盒也可包含能够与该编码的融合蛋白质形成配合物的本发明28-表雷帕霉素类似物样品。该试剂盒可进一步包含多聚化拮抗剂如FK506，FK506M，已知的许多合成(非免疫抑制性的)FKBP配位体或能够与融合蛋白质结合但不能与两个形成配合物的其它化合物中的一种。在某些具体方案中，编码融合蛋白质的重组体核酸结构将包含代替编码一个或多个异源的区域的DNA的克隆位点，因此可容许引导编码选择的异源区域的DNA。如下文更详细的描述，在一些具体方案中，该试剂盒可能也包含一种靶基因结构该结构含有与对配合的融合蛋白质的存在起反应的有关靶基因或克隆位点。该试剂盒可以包含与所包装的核酸结构一致的包装说明书，和/或引导该结构进入寄主细胞或有机体的说明书。发明的详细说明定义
下文定义和定位资料有助于完整了解本申请。
FRB区域为多肽区域(蛋白质“区域”)，典型地具有至少约89个氨基酸残基，能够与FKBP蛋白质和雷帕霉素(或本发明28-表雷帕霉素类似物)形成三重的配合物。FRB区域存在于一些天然存在的蛋白质，包括人类及其他物种的FRAP蛋白质(在文献中也称为“RAPT1”或“RAFT”)；包括Tor1和Tor2的酵母蛋白质；和念珠菌属(Candida)FRAP同系物。关于该蛋白质的核苷酸序列，克隆，及其他方面的信息在本领域为已知的，例如，使用众所周知的方法和以公开的序列为基准的PCR引物，可以合成或克隆编码所需的FRB肽序列的DNA。
    蛋白源               参考文献/序列登录号
人FRAP Brown et al，1994，Nature 369，756-758；GenBank accession#L34075，NCBI Seq ID 508481；Chiu et al，1994，PNAS USA 91，12574-12578；Chen et al，1995，PNAS USA 92，4947-4951
鼠RAPT1 Chiu et al，supra.
酵母Tor1 Helliwell et al，1994，Mol Cell Biol 5，105-118；EMBL Accession#X74857，NCBI Seq Id#468738
酵母Tor2 Kunz et al，1993，cell 73，585-596；EMBL Accession#X71416，NCBI Seq ID 298027
念珠菌属TOR WO95/33052(Berlin)
本发明使用的FRB区域通常包含至少约89-100氨基酸残基。上述Chiuet al的图2显示了包含保存的FRB区域的160-氨基酸跨度人类FRAP，鼠科动物FRAP S.cerevisiae TOR1和S.cerevisiae TOR2。本发明使用的典型的FRB序列将跨越至少89-氨基酸序列，Glu-39到Lys/Arg-127，如那个图中的一些序列。可以参考Chen et al或Sabitini et al使用的编号，89-氨基酸序列的编号对于人类FRAP为Glu-2025到Lys-2113，以及对于Tor2为Glu-1965到Lys-2053，以及对于Tor1为Glu-1962到Arg-2050。用于本发明融合蛋白质的FRB区域能够与结合雷帕霉素的一种FKBP蛋白质的配合物或与本发明的一种28-表雷帕霉素类似物结合(可以任何直接或间接的方式测定，这样的结合测定包括，例如，使用本申请引用的FRAP/RAFT/RAPT和Tor-相关的资料测定这样的结合)。这样一个FRB区域的肽序列包括(a)跨越至少上面记录显示的蛋白质89-氨基酸区域或相应的蛋白质的相应区域的天然存在的肽序列；(b)一种天然存在的FRB序列的变体，其中至多约十个(优选1-5，更优选1-3个，在一些具体方案中仅一种)已经缺失，插入或用取代氨基酸替换的天然存在肽序列的氨基酸；或(c)通过能够有选择地杂交到编码天然存在的FRB区域的DNA分子上的脱氧核糖核酸序列编码的或通过能，如果没有遗传密码退化，有选择地杂交到编码天然存在FRB区域的DNA分子的脱氧核糖核酸序列编码的肽序列。人类FRB的2098L突变株为目前优选地用于C7具有修饰的28-表雷帕霉素类似物。Seee.g.WO99/36553。
FKBPs(FK506结合蛋白质)对于大环内酯如FK506 FK520和雷帕霉素为胞质受体，可跨越种界保存。对于本发明的目的，FKBPs为能够与雷帕霉素或本发明28-表雷帕霉素类似物结合进一步与FRB-包含的蛋白质形成三重配合物的蛋白质或蛋白质区域。FKBP区域也可称为“雷帕霉素结合区域”。关于该蛋白质的核苷酸序列，克隆，及其他各种FKBP方面的信息在本领域为已知的，例如，使用众所周知的方法和以公开的序列为基准的PCR引物，可以合成或克隆编码所需的FRB肽序列的DNA。参见例如Staendart et al，1990，Nature 346，671-674(人类FKBP12)；Kay，1996，Biochem.J.314，361-385(review)。其他的哺乳动物，酵母，和其他有机体中相应的FKBP蛋白质在本领域也是已知的，可以用于本申请公开的融合蛋白质。参见例如Kay，1996，Biochem.J，314，361-385(review)。用于本发明变化的FKBP区域的大小取决于所使用的FKBP蛋白质。本发明融合蛋白质的FKBP区域能够与雷帕霉素或本发明28-表雷帕霉素类似物结合，参与与含FRB蛋白质的三重配合物(可以任何直接或间接的用于测定这样的结合的方式测定)。本发明FKBP融合蛋白质的FKBP区域的肽序列包括(a)天然存在的FKBP肽序列，优选源自人类FKBP12蛋白质(下文举例说明)的肽序列或源自另一个人的，鼠科动物其他的哺乳动物FKBP或其他动物，酵母或真菌的FKBP的肽序列的FKBP肽序列；(b)其中至多约十个，(优选1-5，更优选1-3个，在一些具体方案中仅一种)已经缺失，插入或用取代氨基酸替换的天然存在肽序列的氨基酸的天然存在的FRB序列的变体；或(c)通过能够有选择地杂交到编码天然存在的FKBP的DNA分子上的脱氧核糖核酸序列编码的或通过，如果没有遗传密码退化，能有选择地杂交到编码天然存在FKBP的DNA分子的脱氧核糖核酸序列编码的肽序列。
“能够有选择地杂交”作为本申请使用的短语表示尽管存在其他的DNA分子，两个DNA分子能彼此杂交，杂交条件可以选择或通过本领域普通的专业人员凭经验容易地测定。这样的处理包括高严格条件如在从室温到65-75C°的温度下用包含0.2到6xSSC，和/或包含0.1％到1％SDS的缓冲液充分洗涤。参见FM.Ausubel et al.，Eds，Short Protocols in Molecular Biology，Units 6.3 and 6.4(John Wiley和Sons，New York，3d Ed，1995)。
术语“蛋白质”，“多肽”和“肽”在本申请中可替交地使用。
“核酸结构”，作为本申请使用的术语，表示用于实施本发明的核酸(通常为DNA，而且包括RNA，例如在逆转录病毒输送系统)，通常是重组体，作为下文定义的术语，可能处于自由形式(不以共价键联系到其他的核酸序列)或可以存在于较大的分子如基因工程寄主细胞的DNA媒介物，逆转录病毒或其他病毒载体或染色体内部。特别令人感兴趣的核酸结构是编码本发明融合蛋白质或包含靶基因和表达控制元件的那些。该结构可以进一步包括由一个或多个与转录，翻译，和/或其他编码区或其基因产物的处理有关的核酸部分：转录促进剂和/或增强剂序列，核糖体结合位点，基因内区，等等。
“重组体”，“嵌合体”和“融合体”，作为本申请使用的术语，表示包括各种的组分域，序列或其他组分的材料，它们是互相异源的，本质上不以相同排列共同存在。更具体地说，该组分部分不能在性质上相同的连续的多肽或核苷酸序列中发现，至少不在相同的细胞或序列或方向，或不具有存在于本发明的嵌合蛋白或重组DNA中的相同间隔。
“转录控制元件”表示控制的脱氧核糖核酸序列，如起始信号，增强剂，和促进剂，它们通过控制连接从而诱导或控制蛋白质编码序列的转录。术语“增强剂”包括能够从促进剂提高，刺激，或增强转录的调节元素。这样的转录控制组分可以存在于上游的编码区，或在某些情况下(例如，增强剂)，也在其他位置，如基因内区，外显子，编码区，3′旁侧序列。
“二聚化”，“寡聚化”和“多聚化”在本申请可交替使用指通过一种药剂与至少一种蛋白质结合介导的两个或更多蛋白质分子的缔合或群集。在优选方案中，多聚化通过两个或更多这样的蛋白质分子与设计为二价的或多价的共同的药剂结合而介导。这样的缔合或群集的例子为包括两个或更多蛋白质分子，每个蛋白质分子包含一个或多个FKBP区域，和一个或多个其中最小为二价的FKBP配位体分子(例如FK1012或AP1510)的配合物的形成。当其中至少一种蛋白质包含超过一种药剂结合区域，例如，其中至少一种蛋白质包含三个FKBP区域时，二价药剂的存在导致超过两个蛋白质分子的群集。在其中能与(具有与药剂结合区域的)蛋白质结合的药剂大于二价(例如三价)的具体方案中，也可以导致超过两个蛋白质分子的群集。这样的蛋白质群集的另一个例子为包括包含至少一种FRB区域的蛋白质，包含至少一种FKBP区域的蛋白质和一分子雷帕霉素的三重配合物的形成。在本发明某些具体方案中，融合蛋白质包含多个FRB和/或FKBP区域。这样的蛋白质的复合物可以包含超过一种的雷帕霉素分子或其衍生物(例如，28-表雷帕霉素类似物)或其他二聚化药剂和超过一种的一个或多个蛋白质组分的一个拷贝。同样，这样的多聚化配合物在此被称为三重配合物，表示存在三种分子组分，甚至包含一个或多个多拷贝。包含至少一种二价药剂和至少两个蛋白质分子每个至少包含一个药剂结合区域的配合物的形成，可以称为“寡聚化”或“多聚化”，或简单地称为“二聚化”，“群集”或“缔合”。
“二聚体”表示本发明28表雷帕霉素类似物连接两个或更多蛋白质形成的多聚化配合物。28-表雷帕霉素类似物可以是相对于雷帕霉素具有另外的结构修饰的28-表雷帕霉素或28-表雷帕霉素类似物。
“激活”在此用于基因的表达或转录，表示基因产物的产生直接或间接可观察到的增加。
“基因工程细胞”表示已经被重组体或异源的核酸(例如一种或多种DNA结构或它们的RNA对应物)引导修饰(“转导”)的细胞，进一步包括其中保持部分或所有这样的遗传的修饰的细胞的子代。
本发明28-表雷帕霉素类似物的“治疗有效剂量”表示对于适当地基因工程细胞的人类或非人类动物的治疗或预防的有效剂量，例如，在接受者产生可检测出的靶基因转录或细胞生长，增殖，分化，死亡，等等的剂量或从动物或细胞培养物模型推测得到的治疗或预防有效剂量。治疗有效剂量通常优选地用于人类或非人类的哺乳动物的治疗。
本发明包括使用28-表雷帕霉素类似物的基因工程细胞中的多聚化嵌合蛋白质的方法和材料连同其它的应用和材料。基于生物学转变的各种设计和实施已经被报导，特别是，Spencer et al的文献和本申请引用的各种国际性专利。其他一般的方法的成功的应用也已被报导。包含与效应因子区域融合的FRB区域的嵌合蛋白质也被公开于Rivera et al，1996，Nature Medicine 2，1028-1032和WO 96/41865和WO99/36553(Clackson et al)以及WO 95/33052(Berlin et al)。如前所述，融合蛋白质被设计用于效应因子区域的缔合，通过配位体介导包含它们的融合蛋白质的“二聚化”或“多聚化”，触发所需的生物学现象如所需的基因的转录，细胞死亡，细胞增殖，等等。例如，在从其中衍生的IL-2促进剂或启动元素的转录控制下，包含源自T细胞受体CDSξ区域胞内部分的作用区域的嵌合蛋白质的群集触发基因的转录。在其他具体方案中，该作用区域包括源自蛋白质如FAS或TNF-α受体(TNFalpha-Rl)胞内部分的区域，可在低聚化时触发该细胞的细胞程序死亡。在其他具体方案中，该作用区域包含DNA结合域DNA结合区域如GAL4或ZFHDl以及转录激活作用区域如VP16或p65，相互配对，该嵌合蛋白质的寡聚化表示转录因子配合物的集合，触发了与通过DNA结合区域辨认(可相互作用实现特定的结合)的脱氧核糖核酸序列有关的基因的转录。
包含一个或多个配位体-结合区域和一个或多个作用，例如靶基因转录的激活作用，触发细胞死亡或其他信号转导途径，细胞定位，等等的区域的嵌合蛋白质，公开于上述PCT/US94/01617，PCT/US94/08008以及Spencer et al的文献。用于配位体-介导的基因-剔除实验和用于配位体-介导的基因表达的阻断或基因产物功能的抑制的嵌合蛋白质的设计和使用公开于PCT/US95/10591。在包括靶基因的调节转录的具体方案中，使用的新DNA结合区域和与其结合的脱氧核糖核酸序列公开于例如，Pomeranz et al，1995，Science267：93-96。那些参考文献提供了与编码类似的嵌合体的DNA结构，靶基因结构，及其他方面有关的重要信息，指导和实施例，可能对本发明的专业人员有用。
通过适当地选择嵌合蛋白质，本发明容许它所需基因的转录；启动细胞生长，增殖，分化或细胞程序死亡；或在基因工程细胞中触发其他类似于上文引用的专利文件及其他参考文献描述的依赖于28-表雷帕霉素类似物生物学转变。基因工程细胞，优选动物细胞，可以在培养物中生长或维持，或可以存在于有机体整体内部，用于人类基因治疗，转基因动物，及其他这样的应用。根据具体情况，将FKBP融合蛋白质和FRB融合蛋白质多聚化有效量的28-表雷帕霉素类似物对细胞培养物或包含工程师细胞的有机体给药(可通过监视靶基因转录，细胞程序死亡或其他生物学方法间接地观察该触发)。对有机体整体给药时，28-表雷帕霉素类似物可以存在于包含28-表雷帕霉素类似物和一种或多种兽医学或药物上可接受的稀释剂和/或赋形剂的组合物。
与一种嵌合蛋白质结合但不形成具有两个嵌合蛋白质的三重配合物的化合物可以用作多聚化拮抗剂。同样可以阻断或反转28-表雷帕霉素类似物预防，抑制或瓦解嵌合体多聚化有效量的上述化合物对基因工程细胞或包含它们的有机体给药(优选如上所述的对于整体动物给药的组合物)。例如，不与FKBP和FRAP形成三重配合物的FK506，FK520或任何合成FKBP配位体都可以用作拮抗剂。
本发明的一个重要的方面是提供依赖28-表雷帕霉素类似物类似物的、所需的基因的转录的直接活化的材料和方法。在一个这样的具体方案中提供一组两个或更多不同的嵌合蛋白质，相应的能够直接表达它们的DNA结构。这样的一种嵌合蛋白包含作为其作用区域的一种或多种转录激活区域。另一个嵌合蛋白包含作为其作用区域的一种或多种DNA结合域。本发明28-表雷帕霉素类似物能够与两个嵌合体结合得到包含至少一个DNA结合区域和至少一个转录的激活区域的二聚的或多聚的配合物。在转录控制下，形成这样的配合物导致与能够结合DNA结合域的DNA序列有关系的靶基因的转录的激活作用，通过直接或间接地监视该靶基因产品的浓度可以观察该反应。
优选DNA结合区域和包含它的嵌合体，与它的具有充分的选择性的辨认DNA序列结合，所以尽管常常存在许多的其他DNA序列，但可以观察(直接或间接地)到与该选择DNA序列的结合。优选地，当结合研究体外测量或与任何选择性的DNA序列比较的选择DNA序列有关的基因转录相对速率或水平测量时，包括DNA结合域的嵌合体与选择DNA序列的结合与任何一个的选择性的DNA序列的结合最少大两个，更优选三个并且甚至更优选超过四个数量级。
已经基因改造含有这样的一组结构的细胞，与任何所需的辅助结构一起，可以用于包括配位体-介导，所需的生物学转变的调节作用，它可调节所需的基因的转录，调节信号转导通道的触发如细胞程序死亡的触发，或另一个转变。用于靶基因的可调表达的细胞基因工程，例如，能被用于调节通过靶基因编码的所需蛋白质(或其他基因产物)的生产。这样的细胞可以通过传统方法生长在培养物中。将28-表雷帕霉素类似物加入包含该细胞的培养基导致通过该细胞的靶基因的表达和通过那些基因编码的蛋白质产生。通过抑制媒介中药剂的进一步多聚化，通过从媒介中除去剩余的多聚化药剂，或通过在媒介中加入多聚化拮抗剂试剂，可以终止该基因的表达和该蛋白质的产生。
本发明基因工程细胞还可以体内制造和/或用于体内，修饰有机体整体，优选动物，特别是人类，例如该细胞制造所需的蛋白质或动物内部包含它们的其他产物。这样的应用包括基因治疗应用。
包括细胞程序死亡调节作用的具体方案包括提供使28-表雷帕霉素类似物易诱导细胞死亡的基因工程细胞。如果它们具有或产生不需要的性质，或如果它们不再为有用的，安全的或所需的，在完成它们的预定目的后(例如产生所需的蛋白质或其他产品)，这样的基因工程细胞可以从细胞培养物或寄主有机体中消除。通过在媒介中加入或对寄主有机体使用28-表雷帕霉素类似物可以发生消除作用。在此情况下，该嵌合体的作用区域是如FAS或TNF-Rl的胞内区域的蛋白质区域，它们的信号通道的下游组分或其他寡聚化时触发细胞程序死亡的蛋白质区域。
因此本发明提供了为实现响应本发明28-表雷帕霉素类似物的加入而使细胞中产生生物效应的材料和方法。该方法包括提供本申请描述的基因工程细胞以及使该细胞与28-表雷帕霉素类似物接触。
例如，本发明提供一种用于在细胞中激活靶基因转录的方法。该方法包括提供这样的一些细胞，它们包含(a)编码能开始转录靶基因引导本发明28-表雷帕霉素类似物介导的多聚化的一组嵌合蛋白质的DNA结构和(b)连接与对该多聚化转变反应的关联的同源DNA序列连接的靶基因(例如辨认DNA序列，即，能够与在前的嵌合蛋白的DNA结合域结合的DNA序列)。该方法包括使该细胞与能够以导致该靶基因表达有效量的嵌合蛋白质结合的28-表雷帕霉素类似物接触。当细胞生长在培养物中时，使细胞与28-表雷帕霉素类似物的接触可以通过在该培养基中加入28-表雷帕霉素类似物实现。当该细胞处于寄主有机体内部时，它们与28-表雷帕霉素类似物的接触可以通过将28-表雷帕霉素类似物对该寄主有机体给药而实现。例如，当该寄主有机体是人类或非人类时，可以通过口服的，颊服，舌下，透皮，皮下，肌内，静脉内，关节内或适当的容器的吸入给药的方式将28-表雷帕霉素类似物对寄主有机体给药。同样，嵌合蛋白质的结构和任何辅助的结构取决于该设计，28-表雷帕霉素类似物介导的生物学转变可以激活细胞的功能如导致细胞生长、细胞增殖、基因转录、细胞程序死亡的信号转导；使人感兴趣的基因的删除，使人感兴趣的基因表达的阻断，或使人感兴趣的基因产物功能的抑制；使人感兴趣的基因的直接转录；等等。
本发明进一步包括一种药物组合物，它包括本发明28-表雷帕霉素类似物与药学上可接受的载体，选择性地与一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物。这样的药物组合物可用于，例如在实现本申请公开的任何目的的人类基因治疗应用中，促进动物整体的基因工程细胞中本发明嵌合体的多聚化。
换句话说，本发明提供一种实现任何上述目的的方法，该目的例如在需要和包含本发明基因工程细胞的动物，优选人类患者中的靶基因转录的激活作用(典型地为治疗蛋白质的异源基因)，细胞生长或增殖，细胞死亡或其它选择的生物学转变的激活作用。该方法包括通过给药途径对该动物给予包含至少导致一部分基因工程细胞中的嵌合蛋白质多聚化有效量的28-表雷帕霉素类似物的药物组合物。通过观察靶基因表达的出现；细胞生长，增殖或死亡；或其他为被设计的嵌合体和基因工程细胞的目标可以间接地测定多聚化。
本发明进一步包括一种药物组合物，它包含本发明多聚化拮抗剂与药学上可接受的载体和任选含或不含一种或多种药学上可接受的赋形剂的混合物它可完全或部分抑制或者降低患者中的本发明基因工程细胞中嵌合蛋白质的多聚化的范围，并使靶基因的转录失活，或产生本发明的另一个生物学效果。因此，本发明包括通过利用28-表雷帕霉素类似物多聚化和多聚化拮抗剂试剂以制备药物组合物和达到它们的药理学的效果。
本发明也公开一种使寄主有机体，优选动物，典型地为非人类的哺乳动物或人类患者能对本发明28-表雷帕霉素类似物起反应的方法。该方法包括将其引入按照本发明已经进行的基因改造，即包含一种或多种编码嵌合蛋白质的核酸结构，等等的有机体细胞。在被引入寄主有机体之前，基因工程细胞可以使用任何材料和方法装入胶囊。或者，在容许其结合进入一种或多种寄主哺乳动物细胞，例如使用病毒载体通过注射或通过导管，等等引导DNA的条件下，可以引导本发明核酸结构进入有机体，例如哺乳动物。
本发明也提供产生对本发明28-表雷帕霉素类似物起反应的细胞的试剂盒。这样的试剂盒包含一种或多种核酸结构，其可编码以及能够直接表达嵌合体，在28-表雷帕霉素类似物介导的寡聚化时，触发所需的生物反应。该试剂盒可以包含一些能够通过该试剂盒的结构编码嵌合蛋白分子实现多聚化的28-表雷帕霉素类似物，以及可以包含另外一些多聚化拮抗剂。该试剂盒可以进一步包含编码与同源的DNA序列有关系的靶基因(或克隆位点)的核酸结构，该DNA序列通过容许与多聚化嵌合蛋白分子中存在的同源的DNA序列有关系的基因转录的嵌合蛋白质二聚化辨认。该结构可以与一种或多种便于选择转染子以及其他用于真核生物中的表达的原核生物中的复制的传统的载体元素的选择标识物有关。该选择标识物可以是相同的或各具有不同的结构，容许包含各种这样的结构的细胞的选择。
用于与同源的DNA序列相联系的靶基因引入细胞的辅助结构可以包含一个代替靶基因的克隆位点。包含这样的结构试剂盒容许专业人员提供的基因可调的表达细胞的基因改造。
本发明的其他试剂盒可以包含一或二(或更多)种嵌合蛋白质的核酸结构，其中一种或多种核酸结构包含代替转录激活因子或DNA结合蛋白的克隆位点，容许使用者插入任何他希望的区域。这样的试剂盒可以选择性地包括其他如上所述的元素，例如有或者没有预先选择的DNA结合区域的同源的DNA序列的靶基因的核酸结构。
任何试剂盒可能同时包含被本发明结构稳定地转化的阳性对照细胞，因此该细胞暴露于28-表雷帕霉素类似物时表达报导基因(对于CAT，β-半乳糖苷酶或任何可方便地检测出的基因产物)。也可被提供测定和/或定量该报导基因的表达的试剂。
关于适于本发明实施中使用的体系或组分的设计、结构以及使用的更加详尽的资料，可查阅下列出版物：Spencer et al，1993，supra；Rivera et al 1996，supra；Spenceret al，1996，Current Biology 6，839-847；Luo et al，1996，Nature，383，181-185；Ho et al，1996，Nature 382，822-826；Belshaw et al，1996，ProcSci.USA 93，4604-4607；Spencer，1996，TIG 12(5)，181-187；Spencer     1995，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA 92，9805-9809；Holsinger et al，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，9810-9814；Pruschyetal，1994，Chemistry & Biologyl(3)，163-172；以及公开的申请WO 94 18317，WO 95/02684，WO 95/33052，WO 96/20951和WO96/41865。
本发明的焦点是使用28-表雷帕霉素类似物作为使用如本申请上文与其他处描述的FKBP和FRB融合蛋白质中的蛋白质与蛋白质相互作用的介质。28-表雷帕霉素类似物可以用于隐性二聚化-定位技术，包括触发生长或维持在培养物中的或存在于有机体整体，包括人类及其他哺乳动物中的基因工程细胞中的生物学转变。因此28-表雷帕霉素类似物可以用于体外生物学试验，包含该基因工程细胞的动物实验中的研究试剂，以及作为包含基因工程细胞的人和动物的预防剂或治疗剂。
28-表雷帕霉素类似物
本申请使用的术语“28-表雷帕霉素类似物”表示包括在C28具有与雷帕霉素相反的立体化学的雷帕霉素及其他在结构上与雷帕霉素相关的化合物(总起来说，“雷帕霉素类似物”)的各种的类似物，同系物以及衍生物的一类化合物。除非本申请特别指定，可用于实施本发明方法的“28-表雷帕霉素类似物”包括其中包含显示如下的亚结构，具有许多各种各样的取代基，以及选择性地具有一个或多个不饱和碳-碳键的化合物。
Figure A0081205100351
化合物典型地包含至多三个C1和C7之间的双键；在本文件其它地方论述的各种型式的C7取代基；在一个或多个的C14，C24和C30上的非强制的以及独立地选择的酮基，卤素，羟基或衍生的羟基(例如酯，酰胺，脲，氨基甲酸酯，醚，等等基团)；烷氧基(通常为MeO)，在C29上的羟基或H，本申请其它地方公开的“a”部分；以及本申请其它地方定义的R28部分。
那些化合物的典型的小组包括下列亚结构：
Figure A0081205100352
在其它地方，R43O-取代基可以按上面描述的定向，或，与相对于雷帕霉素的28-表雷帕霉素的其他修饰基团结合，可以存在相反的立体化学，或者该化合物可能表示两个C43异构体的混合物。
可以用于实施本发明方法的28-表雷帕霉素类似物尤其包括28-表雷帕霉素和具有一个或多个相对于雷帕霉素的下列修饰的各种衍生物：在C7，C42和/或C29甲氧基上的脱甲基，消除或替换；在C13，C43和/或C28羟基上的消除，衍生或替换；在C14，C24和/或C30酮基上的还原，消除或者衍生作用；具有5-元脯氨酰环的6-元2-哌啶酸环上的替换；以及环己基环上的一个或多个取代基的消除，衍生或者替换或者具有取代或未被取代的环戊基环的环己基环的替换。以前报导的雷帕霉素类似物的说明的例子公开在列在表I上的文件中。以前报导的在C7上修饰的雷帕霉素类似物的实例显示于表II。
                                 表I
 WO9710502WO9641807WO9635423WO9603430WO9600282WO9516691WO9515328WO9507468WO9504738WO9504060  WO9425022WO9421644WO9418207WO9410843WO9409010WO94/04540WO9402485WO9402137WO9402136WO9325533  WO9318043WO9313663WO9311130WO9310122WO9304680WO9214737WO9205179US5604234US5597715US5583139  US5563172US5561228US5561137US5541193US5541189US5534632US5527907US5484799US5457194US5457182  US5362735US5324644US5318895US5310903US5310901US5258389US5252732US5247076US5225403US5221625  US5210030US5208241US5200411US5198421US5147877US5140018US5116756US5109112US5093338US5091389
Figure A0081205100371
Figure A0081205100381
其他典型的雷帕霉素类似物包括于表III：
Figure A0081205100401
可用于本发明各方面实施的其他使人感兴趣的化合物包括包含一个或多个下列相对于雷帕霉素的修饰的28-表雷帕霉素类似物：
(a)正如已知的雷帕霉素类似物一样，环己基环是由5-元环状体系衍生的或替换的(虽然43-表羟基(hydoxyl)仅仅包括与另外的修饰，例如在C7的结合，与24，30-四氢化修饰的结合，与一种或多种另外的变化的结合)；
(b)烷基化(包括，例如，苄基化)，芳基化，酰化，芳酰基化，或一个或多个羟基部分与卤素的替换；
(c)一个或两个在C24和C30的羰基转化为＝NRA＝NORA，＝NNHRA，-NHORA，-NHNHRA，-ORA(尤其包括，-OH)，-OCO)RA或-OC(O)NRA，卤素或-H；
(d)C13和C28的一个或两个羟基转化为H，卤素，-ORA，-SRA，-OC(O)RA或-OC(O)NRARB或C28和C30桥合的环部分(例如碳酸酯)，-SC(O)RA，-SC(O)NRARB，-NRARB或-N(RB)(CO)RA(尤其包括其中-ORA是H，-OCH2苯基，或-OCH2Ar的上述具体方案)；
(e)C14的羰基转化为-ORA，-NRA，-H，＝NC(O)RA，-NRBC(O)RA，-C(O)RA或-OC(O)NRARB；
(f)C43羟基转化为H，卤素，-CN，＝O，-OH，-NRARB，OSO2CF3，OSO2F，OSO2RA，OCORA，OCONRARB，或OCON(ORA)RB。
用于实施本发明的28-表雷帕霉素类似物，可以包含任何可能的立体异构定向的取代基，除非另外指定，可以包含基本上无其他立体异构体的一种立体异构体(＞90％，优选＞95％，除其他的立体异构体外，以摩尔计)或可以包含立体异构体的混合物。
本发明也包括上述化合物的药学上可接受的衍生物，其中短语“药学上可接受的衍生物”表示任何这样的化合物的药学上可接受的盐，酯，氨基甲酸酯，或这样的酯或氨基甲酸酯的盐，或任何其他加合物或衍生物，它对患者给药时能够直接或间接地提供本申请描述的28-表雷帕霉素类似物，或其代谢物或残余物。因此药学上可接受的衍生物尤其包括雷帕霉素类似物的前体药物。前体药物是化合物的衍生物，通常具有显著地降低的药理学活性，包含容易在体内除去产生作为药理学活性中心的母体分子的另外的部分。前体药物的一个例子是在体内分解生产使人感兴趣的化合物的一种酯。雷帕霉素和其他化合物的各种前体药物，衍生母体化合物产生前体药物的原料和方法，是已知的可以适应于本发明。
本申请使用的术语“脂族基团”包括两个饱和和不饱和的，直链的(即，无支链的)，支链的，环状的，或多环的脂肪族烃，它选择性地被一种或多种官能团取代。除非另作说明，烷基，其他脂族基团，烷氧基和酰基基团优选地包含1-8个，在很多情况下1-6个，连接的脂族碳原子。因此典型的脂族基团包括，例如，甲基，乙基，正丙基，异丙基，环丙基，-CH2-环丙基，烯丙基，正丁基，仲丁基，异丁基，叔丁基，环丁基，-CH2-环丁基，正戊基，仲戊基，异戊基，叔戊基，环戊基，-CH2-环戊基，正己基，仲己基，环己基，-CH2-环己基等等，它们还可以连接一种或多种取代基。
取代基的例子包括：-OH，-OR2′，-SH，-SR2′，-CHO，＝O，-COOH(或其酯，氨基甲酸酯，脲，肟或碳酸盐)，-NH2(或其取代的胺，酰胺，脲，氨基甲酸酯或胍衍生物)，卤素，三卤烷基，氰基，-SO2-CF3，-OSO2F，-OS(O)2R11，-SO2-NHR11，-NHSO2-R11，硫酸盐，磺酸盐，芳基和杂芳基。芳基和杂芳基取代基本身可以是被取代或未被取代的(例如，单，二和三烷氧基苯基；亚甲基二氧基苯基或亚乙基二氧基苯基；卤代苯基；或-苯基-C(Me)2-CH2-O-CO-[C3-C6]烷基或烷基氨基)。
此处使用的术语“脂族”包括烷基，烯基，炔基，环烷基，环烯基，和环炔基。
本申请使用的术语“烷基”包括直链，支链和环状的烷基。其他通用的术语如“烯基”，“炔基”等等也类似。此外，本申请使用的术语“烷基”，“烯基”，“炔基”等等包括取代和未被取代的基团。
术语“烷基”通常指具有一到八，优选一到六个碳原子的基团。例如，“烷基”可为甲基，乙基，正丙基，异丙基，环丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，环丁基，戊基，异戊基，叔戊基，环戊基，己基，异己基，环己基，等等。合适的取代烷基包括，但不限于，氟甲基，二氟甲基，三氟甲基，2-氟乙基，3-氟丙基，羟甲基，2-羟乙基，3-羟丙基，苄基，取代苄基等等。
术语“烯基”通常指具有二到八，优选二到六个碳原子的基团。例如，“烯基”可为丙-2-烯基，丁-2-烯基，丁-3-烯基，2-甲基丙-2-烯基，己-2烯基，己-5-烯基，2，3-二甲基丁-2-烯基，等等。术语“炔基”也指具有二到八，优选二到六个碳原子的基团，包括，但不限于，丙-2-炔基，丁-2-炔基，丁-3-炔基，戊-2-炔基，3-甲基戊-4-炔基，己-2-炔基，己-5-炔基，等等。
本申请使用的术语“环烷基”特别地指具有三到七，优选三到十个碳原子的基团。合适的环烷基包括，但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基等等，在其他脂族或杂脂族或杂环族的部分可能选择性地被取代。
本申请使用的术语“杂脂族”指其中包含一个或多个，例如，氧，硫，氮，磷或硅原子代替碳原子的脂族部分。杂脂族部分可以是支链，无支链的或环状的，包括杂环如吗啉代基，吡咯烷基，等等。
本申请使用的术语“杂环”指环状的杂脂族基团，优选三到十个环原子，包括，但不限于，螺[4.4]二氧己烷(oxetane)，四氢呋喃，四氢吡喃，氮丙啶，氮杂环丁烷，吡咯烷，哌啶，吗啉，哌嗪等等。
本申请使用的术语“芳基”和“杂芳基”指具有3-14个碳原子的可以取代或未被取代的稳定的单或多环的，杂环的，多杂环的不饱和部分。取代基包括以前提到的任何取代基。有用的芳基环基团的非限制性例子包括苯基，卤代苯基，烷氧基苯基，二烷氧基苯基，三烷氧基苯基，亚烷基二氧基苯基，萘基菲基，蒽基，菲并等等，典型的杂芳基环的例子包括5-元单环基团如噻吩基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，呋喃基，异噻唑基，呋咱基，异恶唑基，噻唑基等等；6-元单环基团如吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，哒嗪基，三嗪基等等；和多环的杂环基团如苯并[b]噻吩基，萘并[2，3-b]噻吩基，噻蒽基，异苯并呋喃基，色烯基，占吨基，phenoxathienyl，中氮茚基，异氮茚基，吲哚基，吲唑基，嘌呤基，异喹啉基，喹啉基，2，3-二氮杂萘基，naphthyridinyl，喹喔啉基，喹唑啉基，苯并噻唑基，苯并咪唑基，，四氢喹啉1，2-二氮杂萘基，喋呤基，咔唑基，β-咔啉基，菲啶基，吖啶基，萘嵌二氮苯基，菲咯啉基，吩嗪基，异噻唑基，吩噻嗪基，苯并恶嗪基，等等(参见例如Katritzky，Handbook of Heterocyclic Chemistry)。芳基或杂芳基部分可以被一到五个选自羟基，C1-C8烷氧基，C1-C8支链或直链烷基，酰氧基，甲氨酰，氨基，N-酰胺基，硝基，卤素，三卤甲基，氰基，和羧基的基团取代。因此芳基部分包括，例如苯基；具有一个或多个选自下列取代基的取代苯基：卤素如氯或氟，羟基，C1-C6烷基，酰基，酰氧基，C1-C6烷氧基(如甲氧基或乙氧基，尤其包括二烷氧基苯基如2，3-，2，4-，2，5-，3，4-或3，5-二甲氧基或二乙氧基苯基或如亚甲基二氧基苯基，或3-甲氧基-5-乙氧苯基；或三元取代的苯基，如三烷氧基苯基(例如，3，4，5-三甲氧基或乙氧苯基)，3，5-二甲氧基-4-氯-苯基，等等)，氨基，SO2NH2，-SO2NH(脂基)，-SO2N(脂基)2，-O-脂基-COOH，和-O-脂基-NH2(它可以包含一或二个N-脂基或N-酰基取代基)。
本发明的“卤素”取代基可以是氟，氯，溴或碘取代基。氟常常是优选的卤素。
28-表雷帕霉素类似物可以在一个，两个，三个，四个，五个，六个或七个取代基部分不同于28-表雷帕霉素。这类化合物尤其包括相对于雷帕霉素在下列位置修饰的28-表雷帕霉素类似物：在C7和C13；C7和C14；C7和a；C7和C43；C7和C24；C7和C28；C7和C30；C7C13和C14；C7，C13和a；C7，C13和C43；C7，C13和C24；C7，C13和C28；，C13和C30；C7，C14和a；C7，C14和C43；C7，C14和C24；C7，C14和C28；C7，C14和C30；C7，a和C24；C7，a和C28；C7，a.和C30；C7，C24和C30；C7，C24C30和a；C7 C24，C30和C13；C7，C24，C30和C14；C24，C30和C13；C24，C30和a；C24，C30和C14；以及，C30，C13和a。雷帕霉素类似物的结构修饰因一些以前已知的雷帕霉素类似物而众所周知(参见例如WO 99/36553，Table III and Liberles et al，1997，ProcNatI Acad Sci USA 94：78257830 and infra)并可容易地适应于本发明。
对于本发明方法特别令人感兴趣的28-表雷帕霉素类似物的小组是那些其中RC7a是除OMe以外的基团的28-表雷帕霉素类似物(或其药学上可接受的衍生物)。该小组(“C7 28-表雷帕霉素类似物”)包括其中R7a和R7b中的一个是H另一个选自-RA，-Z-RA，-Z-(CO)RA，-Z-(CO)Z′RA，-NRASO2RA′和-NSO2RA的化合物，其中Z和Z′独立地为O，S或NRA。该小组中的28-表雷帕霉素类似物具有选自下列基团的C7取代基：芳基；杂芳基；芳基，杂芳基或苄基醚；和-NH(CO)ORA，-NH(CO)RA，-NH(SO2)RA或-NH(SO2)NHRA(其中RA为取代或未被取代的低级烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、苄基等，或者是取代或未取代的苯基(例如，对-甲苯基)。在该小组的某些具体方案中，R7a和R7b独立地选自下列基团：H；取代或未被取代的二到八个碳的直链，支链或环状的烯基，烷氧基或烷巯基；和取代或未被取代的芳基，杂芳基，芳氧基或杂芳氧基，芳巯基或杂芳巯基。该小组的化合物尤其包括其中R7a为H；(与R7b一起)＝O；烷氧基；烷巯基；氨基(1°，2°或3°)；酰胺基；氨基甲酸酯基；芳基或取代芳基；苯基或取代苯基；取代或未被取代的杂芳基如取代或未被取代的噻吩基，呋喃基，吲哚基，等等；或苄氧基或取代的苄氧基的化合物。可以用于实施本发明方法的其他典型的C7 28-表雷帕霉素类似物包括其中R7a和R7b之一为H和另一个选自-OEt，-O-丙基，-O-丁基，-OCH2CH2-OH，-O-苄基，-O-取代的苄基(包括例如，3-硝基，4-氯，3-碘-4-偶氮基，3，4-二甲氧基，和2-甲氧基-)，-S-Me，-S-苯基，-O(CO)Me，-烯丙基，-CH2C(Me)＝CH2，-OCH2-CCH，-OCH2-CC-Me，-OCH2-CC-Et，-OCH2-CC-CH2OH，或-2，4-二甲氧基苯基，2，4，6-三甲氧基苯基，呋喃基，噻吩基，甲基噻吩基，吡咯基和吲哚基的化合物。特别令人感兴趣的C7修饰的28-表雷帕霉素类似物为在C7具有取代或未被取代的芳香醚，取代或未被取代的二苄醚或氨基甲酸酯部分的化合物。在C7-修饰具体方案中，C43的羟基取代基可以存在任何一个立体化学取向(或作为异构体的混合物)或者按本申请其它地方描述的修饰。C7 28-表雷帕霉素类似物可以进一步在一，二，三，四，五个或更多的其他位置变化。
式I，II和III 28-表雷帕霉素和C7 28-表雷帕霉素类似物特别令人感兴趣，本质上作为物质的组分包括于本发明中。
实施本发明各种方法中特别令人感兴趣的28-表雷帕霉素类似物的另一个小组为其中取代基在除C24和C30以外的式I，II or III化合物(＝O)。具有C30和C24取代基的令人感兴趣的化合物公开于WO 99/36553。该小组尤其包括其中RC30和RC24为OH以及RC7a和RC7b包括式II指定位置的任何替换取代基，包括与表II或III的化合物一致的任何C7取代基的所有的28-表雷帕霉素类似物。该小组尤其包括其中基团a不同于雷帕霉素的28-表雷帕霉素类似物。例如，该小组包括下式化合物：其中至少一个RC7a和RC7b不是-OMe。RC7a和/或RC7b的选择性的取代基公开于本申请其它地方。特别令人感兴趣的化合物是其中一个RC7a和RC7b为可以选择性地取代的环状脂族基团，芳基，杂环基或杂芳基的化合物。该小组内的其他化合物包括其中一，二，三，四或五个羟基被差向异构化，氟化，烷基化，酰化或者经过其他酯，氨基甲酸酯，碳酸盐或尿素修饰的化合物。一个典型的化合物为其中C43羟基被差向异构化和C28和C30的羟基被烷基化，酰化或形成碳酸盐连接的28-表雷帕霉素类似物。
另一个特别令人感兴趣的28-表雷帕霉素类似物的小组为其中在C13，C43，和C28的一个或多个包含F的单，二和三氟-28-表雷帕霉素类似物，公开于WO 99/36553，在28-表雷帕霉素类似物分子中有或者没有其它地方的另外的变化。
另一个使人感兴趣的的28-表雷帕霉素类似物小组为其中RC24不是＝O的式II化合物，同样，在其他相对于雷帕霉素的其他有或者没有一种或多种其他修饰。
其他使人感兴趣的28-表雷帕霉素类似物包括其中RC14为OH的28-表雷帕霉素类似物。
此外，本发明包括其中雷帕霉素中的1，2，3，4或5，6位置的一个或多个碳碳双键为饱和的、单独的或与本分子其他位置修饰的组合，例如在一个或多个C7，C13，C43，C24，C28和/或C30修饰的28-表雷帕霉素类似物。同时也包括其中使用本领域已知的方法使C3，C4双键环氧化；C6甲基被-CH2OH或-CH2OMe替换；C43羟基变为F，Cl或H或其他取代基；以及C42甲氧基脱甲基的本申请公开的任何化合物。同样地，基团a可以替换为下列任何基团
合成指导
通过发酵和全合成生产雷帕霉素是已知的。一些作为发酵产品的雷帕霉素类似物的生产也是已知的。尤其包括具有雷帕霉素的环己基环或2-哌啶酸环特征的选择性的基团的雷帕霉素类似物，以及C7-脱甲基-雷帕霉素，C29-脱甲基-雷帕霉素和C29-脱甲氧基-雷帕霉素。
在室温下，在二氯甲烷中，使用Ti(OiPr)4可以容易地使雷帕霉素转化为28-表雷帕霉素。如此生产的28-表雷帕霉素可以进一步使用已经被用于雷帕霉素及其他雷帕霉素类似物的方法和原料进一步修饰。或者，在某些情况下(不包括C30酮基的修饰)所需的变换可以用雷帕霉素或其衍生物进行，并将前末基(penalfimate)的产品进行C28差向异构化以及通过本申请公开的方法可以从反应混合物的其他产品中分别回收所需的产品，尽管这样做常常不是优选的。
如同通过发酵得到雷帕霉素和各种雷帕霉素类似物的方法，雷帕霉素和结构上相关的大环内酯的各种化学变化的方法和原料在领域是已知的。雷帕霉素和各种雷帕霉素类似物的许多这样的化学变化公开于上述表I中的专利文件中，用来说明可以应用于本发明的实施中的化学合成和产品回收，提纯和制剂的领域中的技术和知识的水平。以下是可以用于所需的雷帕霉素类似物的生产的典型变换和/或参考文献：
环修饰位置 参考文献
C7  Luengo，et al.JOC 59，6512(1995)；Chem & Biol 2(7)，471-481(1995)
C-13  C13→F：protect C28 and C43，rxn at O*
C-14  Schubert，et al.Angew Chem Int Ed Engl 23，167(1984).
C-20  Nelson，US Patent 5,387,680
C-24  US Patent 5,373,014；5,378,836Lane，et al.Synthesis 1975，p136.
C-30  Luengo et al.Tet.Lett.35，6469(1994)
不同的位置 Or et al，US Patent Nos.5,527,907 and 5,583,139；Luengo，WO 94/02136；Cottens et al，WO 95/16691；Clackson et al，WO 96/41865 and WO99/36553
另外，用于本发明的28-表雷帕霉素类似物以及生产这样的28-表雷帕霉素类似物的中间体可以通过直接的生物合成制备，例如按照Katz et al，WO 93/13663和Cane et al，WO 9702358所述。也参见Khaw et al，1998，J.Bacteriology 180(4)：809-814的另外的生物学方法。
按本申请公开的指导，使用本领域已知的方法和原料，本领域普通的技术人员可以制备本发明新的28-表雷帕霉素类似物。例如，由上述引用的文件中陈列或引用的已知的方法可以得到的方法和原料。上述引用的文件的全部内容作为参考编入本申请。本申请提供的另外的指导和例子作为对专业人员的说明和进一步指导。显然，本领域普通的化学工作者可以容易地对上述进行改变，例如在合成期间在敏感的基团上添加适当的保护基，不再需要或要求时除去该保护基，可以容易地确定其他的合成方法。
FKBP区域和融合蛋白质
FKBP融合蛋白质包括至少一个包含全部或部分FKBP区域肽序列的FKBP区域和至少一个异源的作用区域。该嵌合蛋白必须能够与本发明28-表雷帕霉素类似物结合，按直接结合测量(例如荧光猝灭)，竞争结合测量(例如与FK506比较)，FKBP酶活性的抑制(旋转异构酶)，或其他测定方法，优选的Kd值低于约100nM，更优选低于约10nM并且甚至更优选低于约1nM。例如如国际专利申请PCT US94/01617所述，嵌合蛋白典型地将包含一个或多个蛋白质区域，包括选自天然存在的FKBP蛋白质如人类FKBP12。通常通过替换，插入或删除10个或更少，优选5个或更少氨基酸残基，可以整修那些肽序列，调整结合专一性。在某些具体方案中，选择这样的修饰产生一个或两个下列结合方式：(a)28-表雷帕霉素类似物与修饰的FKBP区域，或包含优选至少一个，更优选至少两个，并且甚至更优选三或四个或更多的修饰的FKBP区域的嵌合体的结合，结合量值大于与FKBP12或基因改造的寄主细胞的内源的FKBP的结合；和(b)FKBP：28-表雷帕霉素类似物配合物与，优选至少一个，更优选至少两个，并且甚至更优选至少三个FRB融合蛋白质的结合，结合量值大于与FRAP或其他的基因改造寄主细胞的内源的包含蛋白质的FRB的结合。
FKBP嵌合体也可包含至少一个异源的作用区域，即，包含非FKBP肽序列的蛋白质区域。该作用区域可以是DNA结合域，转录激活作用区域，细胞定位区域，胞内信号转导区域，等等，如本申请其它地方或PCT/US94/01617或引用的其他参考文献所述。一般说来，该作用区域能够引导嵌合蛋白选择细胞位置或启动与另一个作用区域的缔合或聚集，例如，包含相同的或不同的作用区域的蛋白质的多聚化，的生物效应。
这样的编码融合蛋白质的重组体核酸能够有选择地与母体FKBP蛋白质，例如人类FKBP12编码的DNA杂交，或这样的杂交能够不产生遗传密码的退化。所以这些嵌合蛋白质包含源自另一个蛋白质，例如Ga14，VP16，FAS，CD3ξ链，等等的作用区域，该嵌合蛋白编码的重组DNA也能够有选择地与其他编码蛋白质的DNA杂交，或者这样的杂交能够不产生遗传密码的退化。
本发明FKBP融合蛋白质，以及下文更详细论述的FRB融合蛋白质，可以包含一个或多个不同的配体结合区域的一种或多种拷贝和一个或多个作用区域的一种或多种拷贝。该配体结合区域(s)(即FKBP和FRB区域)可以是N-末端，C-末端，或可被散布于该作用区域(s)。包括配体结合区域多拷贝的具体方案通常具有2，3或4个这样的拷贝。例如，FKBP融合蛋白质可以包含2，3或4个FKBP区域。该FKBP融合蛋白质(以及下文论述的FRB融合蛋白质)的各种的区域通过连接源自相邻区域或异源的肽区域而选择性地分离。
可用于实施本发明的FKBP融合的典型的例子包括PCT/US94/01617(Stanford & Harvard)，PCT/US94/08008(Stanford & Harvard)，Spencer et al(supra)，PCT/US95/10591(ARIAD)，PCT/US95/06722(Mitotix，Inc.)及其他本申请引用的参考文献公开的FKBP融合蛋白质；FKBP融合蛋白质公开于随后的例子中；所有上述FKBP融合蛋白质的变体包含至多10个(优选1-5)氨基酸插入，删除或替换一个或多个FKBP区域，仍然能够与雷帕霉素或28-表雷帕霉素类似物结合；所有上述FKBP融合蛋白质的变体包含一种或多种通过DNA序列编码的FKBP区域的拷贝，能够有选择地与编码天然存在的FKBP区域的DNA序列杂交，并仍然能够与雷帕霉素或28-表雷帕霉素类似物杂交；所有上述变体中一种或多种异源的作用区域删除，替换或补充以不同的异源的作用区域；所有上述FKBP融合蛋白质的变体能够与雷帕霉素或28-表雷帕霉素类似物结合，并包含源自非人类来源的FKBP区域；以及所有上述FKBP融合蛋白质的变体包含一种或多种与人类FKBP12的Tyr26，Phe36，Asp37，Arg42，Phe46，Phe48，Glu54，Val55，或Phe99相应的氨基酸残基，其中一个或多个上述氨基酸残基被不同的氨基酸替代，该变体能够与雷帕霉素或28-表雷帕霉素类似物结合。
例如，在一些情况下，FKBP融合蛋白质包含FKBP区域的多个拷贝，该FKBP区域包含人类FKBP12氨基酸1-107，通过由ACTAGA编码的接头Thr-Arg2-氨基酸分离，DNAs连接产品分别由限制酶Spel和Xbal消化。下表提供以上述FKBP12序列为基准的突变体FKBP区域的典型的小组：典型的突变体FKBPs
 F36A  Y26V  F46A  W59A
 F36V  Y26S  F48H  H87W
 F36M  D37A  F48L  H87R
 F36S  I90A  F48A  F36V/F99A
 F99A  I91A  E54A  F36V/F99G
 F99G  F46H  E54K  F36M/F99A
 Y26A  F46L  V55A  F36M/F99G
注解：这些条目是通过单字母代码和序列位置确定天然的氨基酸，接着在该突变体中替换的氨基酸。因此，F36V指定为其中位置36的苯基丙氨酸由缬氨酸替代的人类FKBP12序列。F36V/F99A显示其中位置36和99的苯基丙氨酸分别由缬氨酸和丙氨酸替代的双突变体。
FRB区域和融合蛋白质
FRB融合蛋白质包括至少一个FRB区域(如其它地方描述，其中可以包含全部或部分FRAP蛋白质或其变体的肽序列)和至少一个异源的效应因子区域。
一般说来，FRB区域，或包括它的嵌合蛋白，由能够有选择地与将包括天然存在的FRB区域编码的DNA分子，例如编码人类或其他哺乳动物FRAP蛋白质或酵母蛋白质，Tor-1或Tor-2或以前提到的包含Candida FRB的蛋白质中的一个DNA分子杂交。本发明FRB区域能够与FKBP蛋白质和本发明28-表雷帕霉素类似物的配合物结合。
FRB融合蛋白质必须能够与由FKBP融合蛋白质与本发明28-表雷帕霉素类似物形成的配合物结合。优选地，FRB融合蛋白质与具有按常规方法测量的低于200uM，更优选低于10uM的Kd值的配合物结合。FRB区域应具有足够长度和组成，可以对28-表雷帕霉素类似物与FKBP融合蛋白质的配合物维持高亲合力。在一些具体方案中，FRB区域跨越少于约150个氨基酸的长度在某些情况下少于约100个氨基酸。一个这样的区域包括从Val2012到Tyr2144的133个人类FRAP氨基酸区域。参见Chiu etal，1994，Proc.Natl.AcadSci.USA 91：12574-12578。一个特别令人感兴趣的FRB区域跨越人类FRAP的Glu2025到Gln2114，对于FKBP12雷帕霉素配合物或对于FKBP-28-表雷帕霉素类似物配合物保持亲合力。在一些具体方案中，从90-氨基酸序列中除掉Q2214，得到89-氨基酸FRB区域。通常通过替换，插入或删除10个或更少，优选5个或更少氨基酸，FRB肽序列可以被修饰，调整结合专一性。在某些具体方案中，这样的修饰使得形成包括一种或多种FKBP融合蛋白质，FRB融合蛋白质和28表雷帕霉素类似物的配合物的趋势超过形成内源的FKBP和FRAP蛋白质与雷帕霉素类似物的配合物的趋势。那样的趋势优选最少一个，更优选至少两个，并且甚至更优选三个大小级次(通过任何测量)。
编码这样的蛋白质的重组DNA能够有选择地与编码FKBP蛋白质的DNA杂交，或这样的杂交能够不产生遗传密码的退化。此外，因为这些嵌合蛋白质包含源自另一个蛋白质，例如Ga14，VP16，FAS，CD3ξ链，等等的效应因子区域，该编码嵌合蛋白的重组DNA也能够有选择地与编码其他蛋白质的DNA杂交，或者这样的杂交能够不产生遗传密码的退化。
用于上述本发明的FRB嵌合体的典型的例子包括随后的实施例公开那些，其中一个或多个异源的区域被选择性的异源的区域替换或一种或多种另外的异源的区域补充的变体，其中一个或多个FRB区域为非人类肽序列来源的区域(如Tor 2或Candida)的变体，以及其中FRB区域按本申请描述被氨基酸取代，替换或插入的变体，条件是该嵌合体能够与FKBP蛋白质和本发明28-表雷帕霉素类似物形成的配合物结合。典型的FRB融合蛋白质包含一种或多种FRB，该FRB至少具有89-氨基酸，包含至少跨越人类FRAP残基2025-2113的序列，通过按先前提到的Spel-Xbal位置的连接形成的接头Thr-Arg分离开。显然，本发明任何融合蛋白质中的这样的限制性位点或接头可以被使用常规方法如定位诱变来删除，置换或伸展。
混合的嵌合蛋白质
第三类型的嵌合蛋白包括一个或多个FKBP区域，一个或多个异源的效应因子区域，和一个或多个如FRB融合蛋白质所述的FRB区域。
混合的嵌合蛋白分子能够在可与它们结合的28-表雷帕霉素类似物的存在下形成同源二聚体或同源多聚体蛋白配合物。具体方案包括将具有需要引入单一重组体核酸结构代替二重组体核酸结构的细胞的，否则需要引导FKBP融合蛋白质和FRB融合蛋白质表达的嵌合体混合。
编码混合嵌合蛋白的重组DNA能够有选择地与编码FKBP蛋白质的DNA，编码FRAP的DNA，和编码从中能够衍生一个或多个效应因子区域的DNA序列(例如Ga14，VP16，Fas，CD3ξ链，等等)杂交，或者这样的杂交能够不产生遗传密码的退化。
异源的区域
如上所述，FKBP和FRB融合蛋白质的异源的效应因子区域为蛋白质区域，结合它们的嵌合蛋白质相互关联，它们能够触发(或者抑制)靶基因的DNA-结合和/或转录；启动细胞生长，分化，增殖或者细胞程序死亡；引导蛋白质到一个特殊的细胞位置；或者启动其他生物学转变。
在包括可调基因转录的具体方案中，在对第一和第二嵌合蛋白质的异源的区域的缔合或多聚化起反应的DNA元素的转录控制下，使用其中包含靶基因(编码使人感兴趣的多肽，反义RNA，核糖酶，等等)的靶基因结构。
在包括转录的直接活化的本发明的具体方案中，第一和第二嵌合蛋白质的异源的区域包含DNA结合区域如Ga14或嵌合DNA结合区域如ZFHD1，论述如下，和转录激活区域如分别源自VP16或p65的那些。包含这样的转录激活区域的嵌合蛋白与包含DNA结合区域的嵌合蛋白的多聚化将转录激活因子导向启动子元件，因此DNA结合区域结合，从而激活与那些启动子元件有关系的靶基因的转录。放弃转录激活作用区域或使用阻抑区域代替转录激活作用区域(参见PCT/US94/01617)可提供用于靶基因转录的抑制。复合材料DNA结合区域和与它们结合的DNA序列公开于Pomerantz et al，1995，supra，其内容作为参考收编在此。这样的复合材料DNA结合区域，与包含结合复合材料DBD的同源的DNA序列的靶基因结构一起，可以用作本发明实施中的DNA结合区域，
在包括转录的间接激活的具体方案中，嵌合体的异源的区域为在响应促进剂的控制下转录激活作用的引发剂聚集或多聚化的信号蛋白质的效应因子区域。例如，该信号区域可以为T细胞受体ξ亚基的胞内区域，聚集时，引发与IL-2促进剂或其衍生物有关系的基因的转录(例如重复NF-AT结合部位)。
在本发明的另一个方面，该异源的区域为其中相互关联能够引发细胞死亡的蛋白质区域。这样的区域的例子为Fas抗原或TNF R1的胞内区域。通过类似于PCT/US94/01617公开的方法，可以被设计和制备包含Fas区域的嵌合蛋白质。
基因改造的受体区域
如先前注解，FKBP和FRB区域可包含选自天然存在的FKBP和FRB区域的一些肽序列的一种肽序列。天然存在的序列包括人类FKBP12和人类FRAP的FRB区域的肽序列。或者，该肽序列可以源自这样的天然存在的肽序列，但通常也包含一个或两个这样的肽序列中至多10个，优选1-5个的突变。如本申请别处更详细的公开，这样的突变可以给予一些重要的特征。例如，可以修饰FKBP区域使它能够优先地结合28-表雷帕霉素类似物，即比未修改的结合28-表雷帕霉素类似物的FKBP区域多至少一，优选二，并且甚至更优选三或四或更多的数量级。可以修饰FKBP区域使它能够优先地结合(修饰或未修饰)FKBP：28-表雷帕霉素类似物配合物，即比未修饰的FRB区域多至少一，优选二，并且甚至更优选三的数量级。可以修饰FKBP和FRB区域使它们能够优先地与28-表雷帕霉素类似物得到三重配合物，即比未修饰的FKBP和FRB区域多至少一，优选二，并且甚至更优选三的数量级。
(a)FKBP
确定增强与包含各种的取代基(“隆起块”)的FK506衍生物结合的能力的FKBP突变的方法公开于PCT/US94/01617。相似的策略可用于修饰优先地结合凸形的雷帕霉素衍生物，即，28-表雷帕霉素类似物的FKBP。雷帕霉素和FKBP12的配合物的结构是已知的(参见，例如Van Duyne et al.，J.Am.Chem.Soc.(1991)113，7433-7434)。这样的数据可用于显示与各种的28-表雷帕霉素类似物取代基不匹配的氨基酸残基。在该方法中，分子模型用来确定容纳28-表雷帕霉素类似物取代基的FKBP区域中的候选的氨基酸取代基。该突变体通过标准方法表达，如果该突变体保持适当的活性/亲合力。以及通过例如抑制旋转异构酶活性，通过与一个分子如FK506结合的竞争，可测量它们对于28-表雷帕霉素类似物结合的亲合力。
更特别地，我们预期本发明的某些28-表雷帕霉素类似物，例如相对于雷帕霉素在C-13或C-14修饰的28-表雷帕霉素类似物优先地与其中一个或多个残基，Tyr26，Phe36，Asp37，Tyr82和Phe99被具有较小侧链的氨基酸(如Gly，Ala，Val，Met和Ser)取代的FKBP结合。在位置26或36修饰的突变体FKBP的例子如上述的“典型的突变体FKBPs”表。同样地，我们预期在C20修饰(即，其中R4不是H)的28-表雷帕霉素类似物优先地与其中Tyr82和/或lle56被其他氨基酸，特别是具有较小侧链的氨基酸代替的FKBP结合。在另一个例子中，我们预期在C24修饰(即，其中W不是＝O)的28-表雷帕霉素类似物优先地与其中一个或多个Phe46，Phe48和Val55T被其他氨基酸，特别是具有较小侧链的氨基酸代替的FKBP结合。另外，我们预计在C28和/或C30修饰的28-表雷帕霉素类似物优先地与其中Glu54被另一个氨基酸，特别是具有较小侧链的氨基酸替代的FKBP结合。在所有上述例子中，可以产生单个或多个氨基酸取代作用。同样，特定的例子如上述的表。
重复的基因改造试验和单或多突变体的试验的取舍将在结构确定的残基共随机化，该残基是接触或接近28表雷帕霉素类似物或雷帕霉素取代基的残基。使用常规的合成或基因工程法可制备许多包含随机法确定位置(如上述段落所述)的FKBP区域的多肽的集合。这样的集合表示一组包含在一个或多个位置替换氨基酸的FKBP区域。筛选该集合并选择具有所需的28-表雷帕霉素类似物结合性质的FKBP变体。一般说来，如果把侧链之间有益的协同作用的可能性增加到最大限度，将几个残基同时随机化可以生产对于撞击雷帕霉素类似物具有高亲合力和专一性的补偿突变体。在不连续位置随机法制备基因库的技术是已知的，包括使用简并寡核苷酸引物-定向诱变，具有简并寡核苷酸的PCR，和具有简并寡核苷酸的盒式诱变(参见，例如Lowman，H.B，和Wells，J.A.Methods：Comp.Methods Enzymol.1991.3，205-216；Dennis，M.S.和Lazarus，R.A.1994.J.Biol.Chem.269，22129-22136；以及其中的参考文献)。
我们进一步预期，在很多情况下，仅仅雷帕霉素中的给定位置中的或与其接近直接接触的少数残基的随机化不能完全探测可以最佳地容纳28-表雷帕霉素类似物取代基(隆起块)的FKBP构象中的全部可能的变化。因此该结构也预计不偏离包含不以结构的原因为基准的随机的取代作用的基因库，与优先与凸起的28-表雷帕霉素类似物结合的敏感的突变或结合一致。几个合适的诱变方案已经被公开，包括丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells(1989)Science 244，1081-1085)，PCR错误参入诱变(参见例如Cadwell和Joyce，1992，PCR Meth.Applic.2，28-33)，和′DNA改组′(Stemmer，1994，Nature 370，389-391和Crameri et al，1996，Nature Medicine 2，100-103)。这些技术生产随机的突变体的基因库，或单突变体的集合，然后通过筛选或选择方法探测。
在很多情况下，鉴定优先结合隆起块的最好突变体的有效策略为结构-定位和无偏置的途径的结合。参见Clackson和Wells，1994，Trends Biotechnology12，173-184(review)。例如，我们预期基因库的结构中的关键联络残基通过具有简并寡核苷酸的PCR随机化，但是使用误差-启动条件在随机位置引导进一步的突变进行扩增。另一个例子为使用DNA改组的结构决定的和无偏见的随机基因库的组分DNA碎片的结合。
基因库对于合乎需要的突变的筛选可以通过利用酵母2-混杂系统进行(Fields和Song(1989)Nature 340，245-246)。例如，FRB-VP 16融合可以被引入一个媒介物，随机化的FKBP序列的基因库克隆进入分离的GAL4融合媒介物。用28-表雷帕霉素类似物处理酵母共同转化体，那些包含互补的FKBP突变体可通过(例如根据使用的媒介物)β-半乳糖苷酶或荧光素酶的生产(筛选)，或缺乏必需营养素的板上的幸存者(选择)测定。桥接FKBP-FRAP相互作用的凸起的雷帕霉素的必要条件可用于筛选消除假阳性。
从FKBP(或FRB)突变体的基因库分离修饰的配位体-结合区域的进一步策略使用Hu et.al.描述的对于功能性的二聚物形成的遗传选择(Hu，J.C.，etal.1990.Science.250：1400-1403；for review see Hu，，J.C.1995.Structure.3：431-433)。这些策略利用噬菌体λ阻抑物cl与作为同型二聚体结合，以及这样的同型二聚体与操纵基因DNA的结合可预防涉及噬菌体生活周期的裂解途径的噬菌体基因的转录。因此，表达功能性的λ阻抑物的细菌细胞通过超感染噬菌体λ对裂解免疫。阻抑物蛋白质包括氨基末端DNA结合区域(氨基酸1-92)，通过40氨基酸柔韧性的接头与羧基末端二聚化区域连接。由于形成效率低的二聚物，分离的N-末端区域与具有低亲合力的DNA结合。异源的二聚化区域如GCN4“亮氨酸拉链”可以修复高亲合力DNA的结合。Hu etal已经公开了其中噬菌体免疫性用于遗传选择分离能够从大量序列中介导λ阻抑物二聚物形成的GCN4亮氨酸拉链突变体的体系(Hu et.al.，1990)。
例如，为了使用λ阻抑物体系鉴定与凸起的28-表雷帕霉素类似物互补的FRAP突变体，具有突变体FRAP序列的λ阻抑物-FRAP基因库被改造成表达天然λ阻遏物-FKBP蛋白质的大肠杆菌细胞。从在包含高滴定度λ噬菌体和“隆起的”雷帕霉素化合物的细菌板上幸免于裂解的菌落分离表达FRAP突变体的质粒。或者，为了分离FKBP突变体，上述策略是用其中突变体FKBP序列被转化成表达天然λ阻抑物-FRAP蛋白质大肠杆菌细胞的λ阻抑物-FKBP基因库重复。
进一步的选择是将随机化的FKBP序列克隆进入噬菌体展示媒介物，进行与28-表雷帕霉素类似物良好地结合的变体的体外选择。可以以很多方法进行亲合力体外选择。例如，在用亲合力处理(例如六-组氨酸标记，或GST)标记的重组体FRAP的存在下，将28-表雷帕霉素类似物与溶液中的基因库噬菌体集合体混合，在富集包含互补突变的噬菌体展示FRBP的适当的亲合力基质上捕捉所得配合物。噬菌体展示技术已经公开，还可以预期其他离体选择系统(例如λ噬菌体展示，质粒展示，杆状病毒展示)。此外，选择和筛选策略还可以用来改进其他有益于本发明实施的性质，如增强在体内稳定性。综述参见Clackson，T，& Wells，J.A.1994.Trends Biotechnol.12，173-184。
(b)FRAP
相似的原因致力于优先地与包含相对于大环分子的FRAP-结合部分中的雷帕霉素的修饰(即，′隆起′)的28-表雷帕霉素类似物结合的突变体FRB区域的产生。例如，使用在C7位置具有除-OMe以外的取代基的28-表雷帕霉素类似物与以人类FRAP FRB肽序列为基准但具有一个或多个Tyr2038，Phe2039，Thr2098，Gln2099，Trp2101和Asp2102残基的氨基酸取代基的FRBs，可以得到优先的结合。典型的突变包括Y2038H，Y2038L，Y2038V，Y2038A，F2039H，F2039L，F2039A，F2039V，D2102A，T2098A，T2098N，和T2098S。在C28具有除-OH以外的取代基和/或在C30具有除＝O以外的取代基的28-表雷帕霉素类似物可用来获得与具有氨基酸取代基Glu2032的FRAP蛋白质的优先的结合。突变的例子包括E2032A和E2032S。使用上面描述的方法确定优先地与隆起的28-表雷帕霉素类似物结合的突变体FRAPs，制备包括在上述位置包含一种或多种氨基酸置换的FRB的蛋白质，在那些位置随机化(即，在那些残基包含各种各样的取代氨基酸)的蛋白质或肽的基因库，全部蛋白质区域随机化的基因库，或突变体的这些集合的结合。
FKBP蛋白质与28-表雷帕霉素类似物的配合物的试验对象突变体FRBs的可以通过一些技术测定；例如在药物存在下将FRB突变体体外转化为GST-FKBP的结合(Chen et al.1995.Proc.Natl.Acad Sci.USA 92，4947-4951)；或用酵母二杂种测定中的适当的FKBP融合蛋白质参与28-表雷帕霉素类似物-依赖的转录激活配合物的能力。
使用各种各样的分类策略可以从噬菌体上展示的基因库分离具有所需的结合性质的FRB突变体。例如，在用亲合力处理(例如六-组氨酸标记，或GST)标记的重组体FRAP的存在下，将28-表雷帕霉素类似物与溶液中的基因库噬菌体集合体混合，在富集包含互补突变的噬菌体展示FRBP的适当的亲合力基质上捕捉所得配合物。
可以在本发明各种具体方案中变化的FRB融合蛋白质的辅助特征为FRB区域使用的正确序列。在一些应用中，较大的FRB部分比最小的(89氨基酸)FRB区域优选使用。这些包括延长的残基Glu2025的N-末端(优选至少延伸到Arg2018或lle2021)，以及延伸超过位置2113的C末端(例如到位置2113，2141或2174或更远)，其中在某些情况下可以改进折叠的FRB区域的稳定性和/或表达效率。可以使用不同的FRB序列末端的其他应用包括其中该FRB区域的一或两边具有空间因素需要的长接头，例如容纳在细胞膜或DNA上FRB-介导的蛋白质相互结合需要的多肽链的变形。相反地，在其他FRB区域一或两边的短接头的应用可以优选或要求存在具有适当生物学功能的异源的效应因子区域(s)。在通过利用天然存在的人类FRAP序列的人类基因治疗应用中，这样的接头通常优选异源序列的引导，或降低在寄主有机体引起免疫反应的风险。
一些28-表雷帕霉素类似物，特别是在被认为接近FKBP结合区域和FRAP结合区域之间的界限的位置，如C28，C30，C7和C24，具有修饰或取代基(相对于雷帕霉素)的雷帕霉素类似物，相对于雷帕霉素能力降低，与哺乳动物FKBP和FRB区域，特别是，与包含天然存在的人类肽序列的区域形成配合物。按本申请提到任何直接或间接的测定方法测定，能力降低表示结合亲合力的降低，或者按适当的测定如T cell增殖测定能力降低表示免疫抑制活性的降低。在此情况下，重复法可用来确定能够比包含天然存在的人类肽序列的相应的区域更有效地与雷帕霉素类似物配合的突变体FKBPs和突变体FRBs对。例如，可以首先确定能够按上述与雷帕霉素类似物结合的互补修饰FKBP区域，然后使用突变体FKBP区域作为具有雷帕霉素类似物的配合物中的亲合力基质，选择能够与那些配合物联合的互补修饰FRB区域。几个这样的诱变和筛选周期可以完成该蛋白质配对的优化。
对于一些具体方案，可以使用包含可以影响蛋白质相互作用的突变的FRB和/或FKBP区域。例如，令人特别感兴趣的是，与给定的雷帕霉素类似物结合时，突变体FKBP区域能适度地与内源的FRB配合，小于与突变体FRB结合时。同样使人感兴趣的是突变体FKBP区域与突变体FKBP和给定的雷帕霉素类似物的配合物的联合，比与内源的FKBP和雷帕霉素类似物的配合物的联合更有效。可使用与前述相似的选择和筛选(i)确定氨基酸对FKBP区域的取代、删除或插入，适度地减弱该区域与给定的雷帕霉素类似物和内源的FRB形成三重配合物的能力；(ii)确定氨基酸对FKBP区域的取代、删除或插入，适度地减弱该区域与给定的雷帕霉素类似物和内源的FKBP形成三重配合物的能力；以及(iii)在配对蛋白质中选择和/或确定补偿突变(s)。有效减弱三重配合物形成的突变体FKBP的合适的例子包括哺乳动物，优选人类的FKBP，其中一个或两个His87和lle90被包含庞大的侧链基团的氨基酸如Arg，Trp，Phe，Tyr或Lys代替；优选哺乳动物更优选人类肽序列的FRB区域，该肽序列可能如上所述突变产生能够与突变体FKBP和给定的雷帕霉素类似物形成三重配合物的互补变体。典型的可用于H87W或H87R hFKBP12s的FRB突变包括其中Y2038由V，S，A或L替代；F2039由A替代；和/或R2042由L，A或S替代的人类FRBs。典型的可用于I90W或I90R hFKBP12s的FRB突变包括其中K2095由L，S，A或T代替的人类FRBs。
另外，显然，本发明的受体区域的优化中，多肽序列的免疫原性被认为需要通过MHC蛋白质结合肽，通过内源的T细胞受体识别作为外源的肽存在。至少在人类基因治疗应用中优选改编给定的外源肽序列，包括连接肽序列，使存在于人类中的免疫的概率最小化。例如，与人类MHC类别I分子结合的肽严格要求在结合肽中的关键′锚′位置存在某种残基：例如HLA-A2在位置2需要亮氨酸，甲硫氨酸或异亮氨酸以及在C-末端需要亮氨酸或缬氨酸(参见Stern和Wiley(1994)Structure 2，145-251)。因此在实施本发明中的基因改造蛋白质中，特别是人类基因治疗应用中，优选地避免这些残基的周期性。前述事项应用于本发明全部蛋白质改造方面，包括无限制的点突变进入受体区域的基因工程，以及应用于各种的蛋白质区域之间的边界的选择或设计。其他组分，设计特点和应用
嵌合蛋白质可以包含作为异源的区域的细胞定位区域如膜保留区域。参见例如PCT/US94/01617，特别是26-27页。简要地，膜保留区域可以从任何便于膜-结合的蛋白质中分离，无论是否为寄主细胞内源的。膜保留区域可以为跨膜的保留区域，即，氨基酸序列延伸横跨膜到达细胞表面蛋白质，授与许多受体。横跨膜肽序列可以延伸跨越部分或全部细胞外的和/或胞内的区域。选择性地，膜保留区域可以为类脂膜保留区域如容许缔合细胞表面膜脂质的十四酰化或棕榈酰化位置位点。对于与膜结合的N-末端，类脂膜保留区域通常添加在编码序列的5′末端，对于结合的C末端，邻近的3′端。包括翻译后加工的提供类脂膜结合的肽序列公开于Carr，et al.，PNAS USA(1988)79，6128；Aitken，et al，FEBS Lett.(1982)150，314；Henderson，et al.，PNAS USA(1983)80，319；Schuiz，et aL，Virology(1984)，123，2131；Dellman，et al.，Nature(1985)314，374；和Ann.Rev.of Biochem.(1988)57，69的综述。使人感兴趣的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。各种DNA序列可用于本发明各种的嵌合蛋白质中的这样的序列的编码。其他定位区域包括细胞器-目标域和序列如-K-D-E-L和-H-D-E-L，它们将具有它们的蛋白质定向到内质网，以及核定位序列，它们对嵌合蛋白质对于(直接)转录的规则的设计特别有用。各种的细胞定位序列和信号在本领域是已知的。
可用于实施本发明的更详细的资料涉及包含各种包括细胞质信号引发区域如CD3ξ链的效应因子区域，核转录因子区域尤其包括VP16和GAL4，包括Fas细胞质区域的能够引发细胞程序死亡的区域的编码嵌合蛋白质的结构的设计，装配和使用公开于PCT/US94/01617和PCT/US95/10591。后一个国际申请进一步公开了适用于产生可用作生物药理学中的疾病模型遗传工程动物的附加特征。那些特征包括在表达嵌合蛋白质的结构中使用组织特定的调节元件和将调节转录作为导致loxP序列侧面的使人感兴趣的基因的消除的靶基因应用于Cre重组酶的表达。选择性地，flp和它的同源识别序列可以代替Cre和lox使用。那些特征适应于本发明。
在各种情况中，特别是在包括包含按照本发明基因工程设计的细胞的整体动物的具体方案中，嵌合蛋白质的区域源自于同种寄主细胞的蛋白质常常是优选的，在某些情况下是必要的。因此，对于人类细胞的基因工程，异源的区域(以及FKBP和FRB区域)常常优选人类来源的，而不是细菌，酵母或其他非人类来源的。
我们也注意到抗原表位标记物也可能并入本发明嵌合蛋白质以便于检测。
组织特异性的或细胞类型特异性的表达
在某些具体方案中，嵌合蛋白质优选地以细胞特异性或组织特异性的方式表达。适当地使一个或多个编码嵌合蛋白(s)的DNA序列与细胞类型特定的转录调节序列(例如促进剂/增强剂)连接可以实现这样的特异性的表达。许多细胞类型特定的转录调节序列是已知的。其它的可以从以细胞特定的方式表达的基因中获得。参见例如PCT/US95/10591，特别是36-37页。
例如，表达嵌合蛋白质的结构可以包含源自选择组织中的特定的表达的已知基因的调节序列。典型的例子列表如下：
  组织   基因 参考文献
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肝 酪氨酸氨基转移酶，白蛋白，载脂蛋白
靶基因结构
在本发明的具体方案中，设计嵌合蛋白质使其多聚化激活靶基因的转录，适当的靶基因结构也被用于基因改造的细胞。适当的靶基因结构包含靶基因和转录控制元件如对嵌合蛋白质多聚化起反应的促进剂和/或增强剂。在包括直接活化转录的具体方案中，通过由本发明嵌合蛋白的DNA结合域辨认的一种或多种DNA序列(即，与嵌合蛋白结合的DNA序列)靶基因结构的存在可以实现那些响应。在这样的具体方案中，靶基因结构典型地包含由下列组成的合成转录单位：(1)具有高-亲合力的通过融合蛋白质的一个组分DNA结合区域辨认DNA序列的一个或多个拷贝；(2)最低限度地组成TATAbox的促进剂序列和选择性地包括其他转录因子结合部位的引发剂序列；(3)编码所需产品的序列，如果合适的话，包括启动翻译的引发和结束的序列；(4)由剪接供体，剪接受体，和插入内含子DNA组成的非强制的序列；以及(5)引导RNA转录物裂解和聚腺苷酸化的序列。基因结构典型地包含表达靶基因的拷贝，适当地与包含最小的促进剂和一种或多种对转录因子起反应的DNA识别序列的拷贝的转录控制序列关联。在包括转录间接激活的具体方案中，通过由嵌合蛋白质多聚化产生的胞内信号激活的促进剂和/或增强剂序列的靶基因结构的存在可以实现响应。例如，嵌合蛋白质包含TCRξ链胞内区域时，靶基因连接并且处于IL-2促进剂区域的表达控制之下。
各式各样的基因可以作为靶基因使用，包括使人感兴趣的编码治疗蛋白质的基因，反义序列或核糖酶。靶基因可以为提供所需的表型的任何使人感兴趣的序列。它可以编码表面膜蛋白，分泌性蛋白质，胞浆蛋白，或可为编码不同产品的多元靶基因。靶基因可以是反义序列，它可通过抑制转录调节蛋白质或调节特别通道或通过抑制通道的抑制剂的翻译打开特别通道。靶基因可以编码核糖酶，该核糖酶可以在RNA水平通过干涉相应的转录调节剂的表达或特别通道的抑制剂的表达调节特别通道。单独或结合表达的蛋白质可以参与归航，细胞毒性，增殖，免疫反应，炎症性反应，凝块或溶解凝块，激素调节，等等。表达的蛋白质可以是天然存在的蛋白质，天然存在蛋白质的突变体，单一序列，或其组合。
各种分泌产品包括激素，如胰岛素，人生长激素胰高血糖素，垂体释放因子，ACTH，促黑激素，松弛肽，等等；生长因子，如EGF，IGF-1，TGF-α，-β，PDGF，G-CSF，M-CSF，GM-CSF，FGF，红细胞生成素，促血小板生成素，巨核细胞刺激因子和生长因子，等等；白细胞介素，如IL-1到-13；TNF-α和-β，等等；以及酶和其他因子，如组织纤溶酶原激活物，补体串联的单元，穿孔素，过氧化物歧化酶，凝血因子，抗凝血酶-III，因子Vlllc，vWF，Factor IX，α-抗胰蛋白酶，蛋白质C，蛋白质S，内啡肽，强啡肽，骨形态发生蛋白，CFTR，等等。
该基因可以通过引导合适的信号肽和横跨膜序列编码天然存在的表面膜蛋白或蛋白质。各种这样的蛋白质包括归巢受体，例如L-选择蛋白(Mel-14)，血液-相关的蛋白质，特别是具有kringle结构的，例如因子Vlllc，因子VlllvW，造血细胞标识物，例如CD3，CD4，CD8，B细胞受体，TCR亚单位α，β，γ或δ，CD10，CD19，CD28，CD33，CD38，CD41，等等，受体，如白细胞介素受体IL-2R，IL-4R，等等，离子流入或流出的通道蛋白质，例如H+，Ca+2，K+，Na+，Cl-，等等，等等；CFTR，酪氨酸激活基元，zap-70，等等。
蛋白质可以修饰转运到胞吐作用小泡。通过从定向小泡的蛋白质添加序列，该序列修饰邻近的一个或其他末端，或位于该蛋白质来源的类似位置，该修饰蛋白质指向包装在小泡中的高尔基体。该方法结合胞吐作用嵌合蛋白质的存在，可将该蛋白质迅速转移到细胞外的媒介并且可保持比较高的定位浓度。
同样，胞内蛋白质也可令人感兴趣，如代谢途径中的蛋白质，调节蛋白质，类固醇受体，转录因子，等等，取决于寄主细胞的性质。如上所述的一些蛋白质也可充当胞内蛋白质。
作为进一步说明，在T细胞中，它可以引导基因编码一个或两个T细胞受体链。对于B细胞，它可以提供免疫球蛋白分泌的重链和轻链。对于皮肤细胞，例如角质化细胞，特别是干细胞角化细胞，它可以通过分泌α，β或γ干扰素，抗趋化因子，特定的细菌细胞壁蛋白质蛋白酶，等等，提供感染预防。
除了提供具有治疗价值的基因的表达之外，在许多情况下，它可以引导细胞到特别的位点。该位点可以包括解剖学的位点，如淋巴结，粘膜组织，皮肤，滑膜，肺或其他内脏或功能性的位点，如凝块，损伤位点，外科手术位点，炎症位点，感染位点，等等。通过提供寄主目标区域与天然存在的抗原表位的结合，表面膜蛋白质引导寄主细胞到特别的位点，通过提供该蛋白质的表达，可以达到分泌产品的定位浓度。使人感兴趣的蛋白质包括归巢受体，例如L-选择蛋白，GMP140，CLAM-1，等等，或地址素，例如ELAM-1，PNAd，LNAd，等等，凝块结合蛋白质，或响应趋化因子的定位梯度细胞表面蛋白质。在许多情况下，它将引导细胞到特别的位点，有效释放治疗的产品。
本发明包括各种各样的嵌合蛋白质构型。可是，在任何涉及靶基因转录激活的情况下，嵌合蛋白质分担重要的特征：多聚化配位体存在下，包含编码嵌合体的结构和表达靶基因的靶基因结构的细胞比该配位体缺乏时多至少一个，优选至少二，更优选至少三或四个或更多大小级次。最佳地，除非该细胞被暴露或已经暴露于多聚化配位体，不必观察选择基因的表达。
扼要说明，将细胞暴露于28表雷帕霉素类似物时，即，随着嵌合体多聚化，基因工程细胞内靶基因转录的可探测水平。嵌合蛋白质能够启动暴露因此，将细胞暴露于能够多聚化嵌合蛋白分子的28-表雷帕霉素类似物后，本发明的基因工程细胞中的靶基因转录被激活。换句话说，本发明基因工程细胞包含如上所述的嵌合蛋白质，对能够多聚化嵌合蛋白分子的28-表雷帕霉素类似物的存在和/或浓度起反应。该效应被靶基因转录的激活证明。这样的转录的活性可以通过靶基因转录的任何常规分析容易地测定。在其他具体方案中，配位体-介导的嵌合体多聚化的生物反应为细胞死亡或其他生物学转变而不是靶基因转录的直接活化。
DNA结构的设计和装配
结构可以按照公开于本申请引用的专利文件和科学文献中的原则，说明的例子和原料和方法设计，它们作为参考编入本申请，如本申请所述它们具有改进和进一步的例证。该结构的组分可以常规方式制备，其中编码序列和调节区可以酌情分离，连接，在合适的克隆寄主中克隆，通过限制或定序，或其他常规的方式。特别地，使用PCR，可以分离包括全部或部分功能单元的个体碎片，其中可以酌情使用引物修补”，连接，体外诱变，等等引导一种或多种突变。对于编码融合蛋白质的DNA结构，编码个体区域的DNA序列和子域相连以致于它们构成编码能够在细胞或溶解产物中被翻译的融合蛋白质的单一开放读框，进入包含全部分量域的单一多肽。编码该融合蛋白质的DNA结构可被投入媒介物，引导合适的细胞类型(s)中的蛋白质的表达。对于编码嵌合体的生化分析，结构质粒需要引导细菌或网状红血细胞-溶解产物体系中的蛋白质的表达。为了在哺乳动物细胞中生产蛋白质，该蛋白质-编码序列被引入引导这些细胞中的表达的表达载体。适用于这样的运用的表达载体在本领域是已知的。各种的的类型媒介物为市场上可买到的。
编码本发明嵌合蛋白质和靶基因的结构作为一种或多种DNA分子或结构可以被引入细胞，在很多情况下与允许选择包含该结构(s)的寄主细胞的一种或多种标识物相联系。只要完成该结构(s)并且证明具有合适的定序，该结构可通过任何适当的方式被引入寄主细胞。结构可以被并入能够游离型复制的媒介物(例如BPV或EBV媒介物)或进入被设计整合进入寄主细胞染色体的媒介物。该结构可以被整合包装进入非复制，有缺陷的病毒的基因组如腺病毒(Adenovirus)，腺病毒相关病毒(AAV)，或单纯疱疹病毒(HSV)或其它的病毒，感染或转导进入细胞。病毒的释放系统将在下面的详细地论述。选择性地，可以通过原生质体融合，电穿孔法，生物排列，磷酸钙转染，脂转染，DNA的显微注射等等引导该结构。在某些情况下，寄主细胞将在该结构(s)引导之前生长并且扩张培养物，接着合适地处理，引导该结构(s)以及整合该结构(s)。然后该细胞膨胀，依靠存在于该结构中的标识物筛选。可以成功地使用的各种标识物包括hprt，新霉素阻抗，胸苷激酶，潮霉素阻抗，等等，以及各种的细胞表面标识物如Tac，CD8，CD3，Thy1以及NGF受体。
在有些情况下，它可具有源重组目标区域，其中要求结构以特别的基因座整合。例如，它可以删除和/或用本发明重组体靶结构替换内源的基因(在相同的基因座或其它地方)。对于源重组，通常使用Ω或O-媒介物。参见，例如，Thomas和Capecchi，Cell(1987)51，503-512；Mansour，et al.，Nature(1988)336，348-352；以及Joyner，et al.，Nature(1989)338，153-156。
该结构可以引导编码全部基因的单个的DNA分子，具有一种或多种基因的不同的DNA分子。该结构可以同时或连续地引导，各使用相同的或不同的标识物。
包含有用的元件如细菌或酵母复制源，可选择的和/或可扩增的标识物，在原核生物或真核生物中表达的促进剂/增强子元件，和哺乳动物表达控制元件，等等，它可用来制备结构DNAs的原种并且进行转染，这些媒介物在本领域是已知的，其中许多为市场上可买到的。
核酸的释放：体外和体内
任何引导异源的核酸进入寄主细胞，特别是真核细胞，特别是动物细胞，优选人类或非人类哺乳动物细胞的方法都可适应于本发明的实施。为了论述，本申请公开的各种核酸结构可以共同称为转基因。DNA释放的体外途径包括磷酸钙沉淀，电穿孔法，脂转染和经病毒载体的感染。两种一般的体内基因治疗途径包括(a)DNA的“裸”制剂，脂质配合物或脂质体制剂或者相反的制剂的释放和(b)异源的核酸经病毒载体的释放。在前述方法中，在，例如用脂质DNA配制之前，首先用实验方法完善包含具有所需的DNA结构的质粒的表达(例如，5非翻译区中的内含子的包含和不必要的序列的消除(Feigner，et al.，Ann NY Acad Sci 126-139，1995))。然后使用已知的方法和原料，例如用各种脂质或脂质体原料配制，对哺乳动物接受者给药。
在可以用于实施本发明的各种病毒载体中，逆转录病毒-，AAV-和腺病毒定位的方法特别令人感兴趣。参见，例如，Dubensky et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7529-7533；Kaneda et al.，(1989)Science 243，375-378；Hiebert et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，3594-3598；Hatzoglu et al.(1990)J.Biol.Chem.265，17285-17293和Ferry，et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8377-8381。下列关于病毒载体的选择和使用的附加指导有助于专业人员。逆转录病毒载体
反向病毒为一类RNA病毒，其中RNA反向地转录到受感染细胞中的DNA。逆转录病毒基因组可以整合进入寄主细胞基因组，必要三个病毒的基因，gag，pol和env，以及病毒的长末端重复(LTRs)。LTRs也作为病毒基因的增强剂和促进剂。病毒的包装序列，(Y)，允许病毒RNA与该细胞中的其他RNAs不同(Verma et al.，Nature 389：239-242，1997)。为了表达异体基因，病毒蛋白质被病毒载体中使人感兴趣的基因代替，然后翻译进入包含病毒包装组分的包装线。包装病毒从包装线分泌进入培养基，然后应用培养物中的细胞感染。因为反向病毒不能感染非分裂细胞，因此它们主要应用体外基因治疗。AAV载体
腺病毒相关病毒(AAV)定位的媒介物主要用作各种组织，包括肌肉和肺的运载工具。AAV媒介物感染并且经常稳定地整合进入细胞基因组。AAV可以感染并且整合进入生长抑制的细胞(如肺上皮细胞)，并且是不致病的。
用于AAV定位的表达载体典型地包括145核苷酸AAV末端反向重复序列(ITRs)侧翼限制性位点，它可用于转基因的亚克隆化，既可直接使用有用的限制性位点，也可用限制性内切酶切除该转基因，接着钝化该末端，连接合适的DNA接头，限制消化，并且连接进入ITRs之间的位点。AAV媒介物的载量大约4.4kb。下列蛋白质已经被使用各种AAV定位媒介物，和各种各样的促进剂/增强剂表达：新霉素磷酸转移酶，氯霉素乙酰转移酶，先天性全血细胞减少症，囊性纤维化跨膜传导调节蛋白，和粒细胞巨噬细胞集群-刺激因子(Kotin，R.M.，Human Gene Therapy 5：793-801，1994，Table I)。编入本发明各种DNA结构的转基因同样可以被归入AAV定位媒介物。AAV促进剂能被作为包含组成型促进剂如CMV驱动编码融合蛋白质(s)的重组DNA表达的替换物使用(ITR本身或AAV p5(Flotte，et al.J，Biol.Chem.268：3781-3790，1993)。
这样的媒介物可以通过公开的方法包装进入AAV病毒粒子。例如，在内源的AAV促进剂或异源的促进剂的控制下，人类细胞系如293可以被AAV定位表达载体和另一个包含编码AAV rep和cap的开放读框共同翻译。在没有辅助病毒的情况下，rep蛋白质Rep68和Rep78防止复制形式的累积，但是用腺病毒或疱疹病毒超感染，这些蛋白质容许从ITRs(仅仅存在于包含该转基因的结构)复制和病毒衣壳蛋白质的表达。这些体系导致转基因DNA包装进入AAV病毒粒子(Carter，BJ.，Current Opinion in Biotechnology 3：533-539，1992；Kotin，R.M，Human Gene Therapy 5：793-801，1994))。改进AAV滴度的方法也可用来表达AAV病毒粒子中的转基因。这样的策略包括，但是不局限于：稳定地表达细胞系中的ITR侧翼转基因，接着用第二质粒转染引导病毒包装；使用诱导地表达AAV蛋白质，如温度敏感的诱导型表达或药理学的诱导型表达的细胞系。另外，如Wilson et al.，W096/39530所述通过用促进双链形式向单链形式转化的药剂处理细胞，可以提高AAV转导的效率。
通过公开的方法如氯化铯梯度使集结成可以浓缩和提纯病毒，如用于体内AAV向量表达式的初始报道(Flotte，et al.J.Biol Chem.268：3781-3790，1993)或层析提纯，如O′Riordan et al.，WO97/08298所述。
至于可以用于实施本发明的AAV技术另外的详细指导，包括掺入转基因的方法和原料，包含该转基因的重组体AAV媒介物的繁殖和提纯，以及转染细胞和哺乳动物中的使用，参见例如Carter et al，US Patent No.4,797,368(10Jan 1989)；Muzyczka et al，US Patent No.5,139,941(18 Aug 1992)；Lcbkowskiet al，US Patent No.5,173,414(22 Dec 1992)；Srivastava，US Patent No.5,252,479(12 Oct 1993)；Lebkowski et al，US Patent No.5,354,678(11 Oct1994)；Shenk et al，US Patent No.5,436,146(25 July 1995)；Chatterjee et al，USPatent No，5,454,935(12 Dec 1995)，Carter et al WO 93/24641(公开于9 Dec1993)，以及Flotte et al.，US Patent No.5,658,776(19 Aug 1997)。腺病毒载体
各种腺病毒媒介物已经被证明可用于哺乳动物，包括人类基因的转移。复制缺损的腺病毒媒介物已经用于表达肺中的标识物蛋白质以及CFTR。第一代Ela缺损的腺病毒媒介物已经由第二代产品改进，其中包括温度敏感的E2a病毒蛋白质，用来表达较小的病毒蛋白质，从而制造比免疫系统更小的病毒感染细胞(Goldman et al.，Human Gene Therapy 6：839-851，1995)。近年来，删除所有病毒开放读框的病毒载体已经公开(Fisher et al.，Virology 217：11-22，1996)。而且，已经显示病毒IL-10抑制腺病毒抗原的免疫反应(Qin et al.，Human Gene Therapy 8：1365-1374，1997)。
一些腺病毒类型的DNA序列可以从Genbank得到。腺病毒DNA序列可以从任何目前确定的41人类腺病毒类型中获得。各种腺病毒菌株从AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland得到或从一些商业以及学会会员来源得到。通过与用于在媒介物插入CFTR或其他基因相同的方法(限制性内切酶酶切消化，接头连接或装入末端，以及连接)，本申请公开的转基因可以并入任何腺病毒媒介物安德释放流程。由包含选择的腺病毒序列序列的部分的腺病毒衣壳代表的杂种腺病毒AAV媒介物，5′和3′AAV ITR序列侧翼转基因及其他常规的媒介物调节元件也可被使用。参见例如Wilson et al，国际专利申请公开No.WO 96/13598。可以应用于本发明的腺病毒和杂种腺病毒-AAV技术的另外的详细指导包括掺入转基因的方法和原料，包含转基因的重组病毒的繁殖和提纯，以及在转染细胞和哺乳动物中的用法，也参见Wilson etal，WO 94/28938，WO 96/13597和WO 96/26285，和本申请引用的参考文献。
通常DNA或病毒颗粒被转入生物学上兼容的溶液或药学上可接受的载体，如无菌盐水，或其他含水的或无水的等渗无菌的注射溶液或悬浮液，其中许多例子在本领域是已知的，包括Ringer′s，磷酸盐缓冲盐水，或其他相似的载体。
优选地，在基因治疗应用中，DNA或重组病毒以足以转染细胞的量给药，其水平为提供治疗，不产生过度的副作用。如其它地方论述，DNA或病毒的最佳剂量取决于各种各样的因素，因此患者与患者之间可以有所变化。此外，病毒的治疗有效剂量可在20到约50毫升约1×107到约1×1010pfu病毒/毫升，例如1×108到1×109病毒/毫升的浓度的盐溶液的范围之内。寄主细胞
本发明对基因工程动物细胞和涉及这样的基因工程动物细胞的应用是特别有用的。该动物细胞可以是昆虫，蠕虫或哺乳动物或其他动物的细胞。尽管可以使用各种哺乳动物细胞，例如包括马，牛，绵羊，犬科动物，猫科动物，鼠科动物，和非人类灵长类动物细胞，但是人类细胞是特别令人感兴趣的。在各种种类中，可以使用各种型式的细胞，如造血的，，神经的，神经胶质的，间质的，皮肤的，粘膜的，基质的，肌肉的(包括平滑肌细胞)，脾的，网状内皮组织的，上皮的，内皮的，肝脏的，肾的，胃肠的，肺的，成纤维细胞，及其他细胞类型。特别令人感兴趣的是造血细胞，其中可以包括任何与红细胞，淋巴或骨髓瘤系谱有关的有核细胞，以及成肌细胞和成纤维细胞。使人感兴趣的还有茎和祖细胞，如造血的，神经的，基质的，肌肉的，肝脏的，肺的，胃肠的和间质的干细胞
细胞可以是自体同源的细胞，同种同基因的细胞，异源的细胞并且甚至在某些情况下是，预定的寄主有机体的异种的细胞。该细胞可以通过下列方法修饰：改变主要组织相容性复合体(“MHC”)轮廓，钝化β2-微球蛋白防止形成功能性的Class I MHC分子，钝化Class II分子，提供一种或多种MHC分子的表达，通过增强或抑制与细胞毒素活性有关的基因的表达增强或钝化细胞毒素的性能，等等。
在有些情况下，使人感兴趣的是特定的克隆或寡克隆细胞，该细胞具有特别的特异性，如T细胞和B细胞具有特定的抗原特异性或归航目标区域特异性。
编码嵌合转录因子或其他融合蛋白质的结构和包含靶基因的结构作为一种或多种DNA分子或结构可以被引入细胞，在很多情况下与允许选择包含该结构(s)的寄主细胞的一种或多种标识物相联系。只要完成该结构(s)并且证明具有合适的定序，该结构可通过任何适当的方式被引入寄主细胞。结构可以被并入能够游离型复制的媒介物(例如BPV或EBV媒介物)或进入被设计整合进入寄主细胞染色体的媒介物。该结构可以被整合包装进入非复制，有缺陷的病毒的基因组如腺病毒(Adenovirus)，腺病毒相关病毒(AAV)，或单纯疱疹病毒(HSV)或其它的病毒，感染或转导进入细胞。病毒的释放系统将在下面的详细地论述。或者，可以通过原生质体融合，电穿孔法，生物排列，磷酸钙转染，脂转染，DNA的显微注射等等引导该结构。在某些情况下，寄主细胞将在该结构(s)引导之前生长并且扩张培养物，接着合适地处理，引导该结构(s)以及整合该结构(s)。然后该细胞膨胀，依靠存在于该结构中的标识物筛选。可以成功地使用的各种标识物包括hprt，新霉素阻抗，胸苷激酶，潮霉素阻抗，等等，以及各种的细胞表面标识物如Tac，CD8，CD3，Thy1以及NGF受体。
在有些情况下，它可具有源重组目标区域，其中要求结构以特别的基因座整合。例如，它可以删除和/或用本发明重组体靶结构替换内源的基因(在相同的基因座或其它地方)。对于源重组，通常使用Ω或O-媒介物。参见，例如，Thomas和Capecchi，Cell(1987)51，503-512；Mansour，et al.Nature(1988)336，348-352；以及Joyner，et al..Nature(1989)338，153-156。
该结构可以引导编码所有基因的单个的DNA分子，具有一种或多种基因的不同的DNA分子。该结构可以同时或连续地引导，各使用相同的或不同的标识物。
包含有用的元件如细菌或酵母复制源，可选择的和/或可扩增的标识物，在原核生物或真核生物中表达的促进剂/增强子元件，和哺乳动物表达控制元件，等等，它可用来制备结构DNAs的原种并且进行转染，这些媒介物在本领域是已知的，其中许多为市场上可买到的。
引导结构进入动物
在选择性的条件下，已经用DNA结构体外修饰的细胞可以在培养物中生长，然后被选择具有所需的结构(s)的细胞可被膨胀和进一步分析，使用，例如，用于测定该结构在寄主细胞和/或中的存在和/或分析所需的基因产物(s)的生产。只要寄主细胞已经确定，它们就可用于，例如在培养物中生长或被引入寄主有机体。
取决于细胞的性质，该细胞可以各式各样的方法被引入寄主有机体，例如哺乳动物。造血细胞可以通过注射给药进入血管系统，通常至少约104细胞，通常至多约1010细胞。使用的细胞的数目取决于一些环境，引导的目的，细胞的生存期，使用的方案，例如，给药的数量，细胞繁殖的能力，治疗剂的稳定性，治疗剂的生理需要，等等。通常，例如对于成肌细胞或成纤维细胞，细胞的数目至少约104，至多约109，可以分散使用，通常注入在使人感兴趣的位点上或附近。该细胞通常在生理学可接受的媒介中。
本发明基因工程细胞也可在植入寄主有机体或患者以产生治疗的蛋白质之前，例如使用常规的生物相容的原料和方法，被装入胶囊。参见例如Hguyen et al，Tissue Implant Systems and Methods for Sustaining viable High CellDensities within a Host(寄主体内维持有活力的高细胞密度的组织植入体系和方法)，US Patent No.5,314,471(Baxter Intemational，Inc.)；Uludag和Sefton，1993，J Biomed.Mater.Res.27(10)：1213-24(HepG2细胞/甲基丙烯酸羟乙酯-异丁烯酸甲酯膜；Chang et al，1993，Hum Gene Ther 4(4)：433-40(小鼠Ltk-细胞表达hGH/免疫保护perm-选择性的藻朊酸盐微胶囊)；Reddy et al，1993，J Infect Dis 168(4)；1082-3(alginate)；Tai和Sun，1993，FASEB J 7(11)：1061-9(小鼠成纤维细胞表达hGH/藻朊酸盐-poly-L-赖氨酸-藻朊酸盐膜)；Ao et al，1995，Transplanataion Proc.27(6)：3349，3350(alginate)；Rajotte et al，1995，Transplantation Proc.27(6)：3389(alginate)；Lakey et al，1995，Transplantation Proc.27(6)：3266(alginate)；Korbutt et al，1995，Transplantation Proc.27(6)：3212(alginate)；Dorian et al US Patent No5,429,821(alginate)；Emerich et al，1993，Exp Neurol 122(1)：37-47(聚合体-装入胶囊PC12细胞)；Sagen et al，1993，J Neurosci 13(6)：2415-23(装入半渗透性的聚合体膜的胶囊牛嗜铬细胞以及植入鼠脊髓蛛网膜下腔)；Aebischeret al，1994，Exp Neurol 126(2)：151-8(装入胶囊的聚合体鼠PC12细胞植入猴子)；也参见Aebischer，WO 92/19595)；Savelkoul et al，1994，JImmunol Methods 170(2)：185-96(装入胶囊的杂交瘤产生的抗体；装入胶囊的表达各种细胞活素的转染细胞系)；Winn et al，1994，PNAS USA 91(6)：2324-8(表达人类神经生长因子的基因工程BHK细胞在免疫分离聚合的装置中装入胶囊以及移植大鼠)；Emerich et al，1994，ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18(5)：935-46(装入胶囊的聚合体PC12细胞植入大鼠)；Kordower et al，1994，PNAS USA 91(23)：10898-902(装入胶囊的聚合体的表达hNGF的基因改造BHK细胞植入猴子)和Butleret al WO 95/04521(装入胶囊的装置)。然后可将微囊剂中的细胞引入动物寄主，优选哺乳动物，更优选需要的治疗的人。优选的胶囊材料半渗透性的，容许释放进入通过装入胶囊的细胞产生分泌的蛋白质的寄主。在许多具体方案中，半渗透性的胶囊化作用使装入胶囊的细胞与引入装入胶囊的细胞的寄主有机体免疫地分离。在那些具体方案中，装入胶囊的细胞可以表达一种或多种含源自寄主种类蛋白质和/或源自病毒蛋白质的分量域的蛋白质或寄主以外的种类的病毒蛋白质。例如，在此情况下，该嵌合体可以包含源自GAL4和VP16的元件。该细胞可以源自一种或多种除接受者以外的个体，可以源自除接受者有机体或患者以外的种类。
在许多情况下，人们希望体内细胞修饰代替体外细胞修饰。为了这个目的，已经发展了体内遗传修饰靶组织和细胞的各种技术。已经发展一些允许转导以及，在某些情况下，整合病毒进入寄主的病毒载体，如腺病毒，腺伴随病毒，和反向病毒。参见，例如，Dubensky et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7529-7533；Kaneda et al.，(1989)Science 243，375-378；Hiebert et al.(1989)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 86，3594-3598；Hatzoglu et al.(1990)J.Bid.Chem.265，17285-17293和Ferry，et al.1991)Proc.Natl Acad.Sci.USA 88，8377-8381。媒介物可以通过注射，例如血管内注射或肌内注射，吸入，或其他肠胃外的方式给药。也可使用非病毒释放方法如经与脂质体的配合物的DNA的给药或通过注射，导管或生物排列给药，参见e.g.WO 96/41865，PCT/US97/22454和USSN 60/084819，例如，关于重组体核酸向细胞和有机体给药的配制和释放的附加指导。那些参考文献以及先前引用的参考文献，包括有关的tetR-定位体系，黄体酮-r-定位体系和蜕皮激素-定位体系，提供了关于各种配位体向体外细胞和向有机体给药的制剂，配制和释放的详细的附加指导。如其它地方所述，引用文件的那些内容作为参考编入本申请。
根据体内遗传修饰，修饰方式取决于组织的性质，细胞修饰需要的效率，修饰特别的细胞的机会的数目，组织对被引入的DNA组合物的可及性，等等。如果需要，通过使用稀释的或修饰的传送靶转录的引发区域的反向病毒，人们可以使用患者转录因子结构激活该病毒，该病毒可以产生和转染邻近的细胞。
DNA引导不必在任何情况下导致整合。在某些情况下，瞬时维持足以引入DNA。因此，它可具有短时效应，其中细胞可以被引入寄主，预定时间后(例如细胞已能在特别的位点安家后)闭合。
结合性质，测定
雷帕霉素与人类蛋白质FKBP12结合，得到hFKBP12和FRAP的三重配合物，酵母蛋白质TOR1和TOR2.的人类配对物是已知的。可以鉴定雷帕霉素类似物，比较其与雷帕霉素的与人类FKBP12结合的能力和/或与人类FKBP12和人类FRAP(或包含其FRB区域的融合蛋白质或碎片)形成三重配合物的能力。参见WO 96/41865(Clackson et al)。该申请公开了可用于分别测定与人类FKBP12结合或与包含人类FKBP12和人类FRAP的FRB区域的蛋白质形成三重配合物(即，“heterodimerize”)的能力的方法。这样的测定包括测量结合的荧光偏振测定。也包括细胞定位转录测定，其中通过对比该化合物存在下基因工程哺乳动物细胞产生的指示基因产品的的观察水平间接地测量化合物形成三重配合物的能力。相应的细胞-定位测定也可在酵母细胞中引导。参见例如WO 95/33052(Berlin et al)。
常常优选生理学可接受的(即，对于将其使用的细胞或有机体没有过度的毒性)本发明雷帕霉素类似物，可以被动物口服(即，在动物整体应用中，包括基因治疗，是口服活性的)，和/或可以跨越细胞膜及特别应用中必须的其他膜。
另外，在某些情况下，优选的雷帕霉素类似物是其中优先地与天然的突变体亲免素或天然存在的亲免素结合的雷帕霉素类似物(作为非限制性的例子，亲免素为其中Phe36被不同的氨基酸，优选具有较小R基闭的氨基酸如缬氨酸或丙氨酸，代替的人类FKBP)。例如，这样的化合物可以优先地与突变体FKBPs结合，至少超过它们与人类FKBP12的结合，在某些情况下，按照系统有效的或领域接受的测定方法测定，与突变体FKBPs的超过它们与人类FKBP12的结合2以至3或更多大小级次。
本发明各种雷帕霉素类似物对于人类FKBP12，其变体或其他亲免素蛋白质的结合亲合力可以通过合适的用于FKBP的已知方法测定。例如，专业人员可以测量本发明化合物与已知的配位体竞争结合使人感兴趣的蛋白质的能力。参见例如Sierkierka et al，1989，Nature 341，755-757(试验化合物与标记的FK506衍生物对FKBP结合的竞争)。
与人类FKBP12，与如以上讨论的其突变体，与包含这样的FKBP区域的融合蛋白质结合的本发明的一类优选的雷帕霉素类似物，按照直接结合测量(例如荧光猝灭)，竞争结合测量(例如与FK506比较)，FKBP酶活性的抑制旋转异构酶)，或其他测定方法，其Kd价值低于约200nM，更优选低于约50nM，甚至更优选低于约10nM，并且甚至更优选低于约1nM。在这样的化合物的一个小组中，FKBP区域中位置36的苯基丙氨酸已经被具有较小侧链的氨基酸，例如丙氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸或丝氨酸代替。
竞争性结合FP测定详细描述于WO99/36553和WO96/41865。那些测定可为给定的化合物的IC50的体外测量，它反映与标记FKBP配位体，如FK506，竞争结合FKBP蛋白质的能力。
一类优选地本发明化合物为，相对于荧光标记的FK506标准，对于具有至多10，优选至多5个氨基酸置换的给定的FKBP区域和配位体配对，例如人类FKBP12或其变体，的竞争性结合FP测定的IC50值好于1000nM，优选好于300nM，更优选好于100nM，并且甚至更优选好于10nM的雷帕霉素类似物。
在细胞-定位测定中，雷帕霉素类似物多聚化嵌合蛋白质的能力可以通过测量这样的多聚化引发的信号计数而测量。例如，可以使用包含并且能够表达编码包含一种或多种FKBP区域和一种或多种效应因子区域的第一嵌合蛋白的DNA以及编码包含FRB区域和一种或多种能够在多聚化中启动生物反应的效应因子区域的第二嵌合蛋白的DNA的细胞。我们优选使用其中进一步包含对嵌合蛋白质多聚化起反应的调节元件(即，促进剂)的转录控制中的指示基因的细胞。典型的组分的设计和制剂以及它们在基因工程细胞中的用途公开于WO99/36553和WO96/41865以及相当于本申请和上述部分的另一个国际专利申请中。(也参见WO99/10510关于对使人感兴趣的雷帕霉素类似物起反应的细胞和动物释放的核酸的设计，装配和释放的附加指导和应用这样的体系的附加指导。)该细胞在培养物中生长或维持。雷帕霉素类似物加入培养基，合适的潜伏期后(容许基因表达和分泌，例如几个小时或过夜)测量指示基因产品的存在。通过指示基因产品的外观观察，阳性结果，即，多聚化，与指示基因的转录有关。指示基因产品可以是方便检测的蛋白质(例如通过ELISA)或可以催化方便检测的产品的产生(例如颜色)。产生引导这样的测定的合适的细胞系的原料和方法公开于本节上述引用的国际专利申请。典型地使用的靶基因包括，例如SEAP，hGH，β-半乳糖苷酶，绿色荧光的蛋白质和荧光素酶，它们便于测定，是市场上可买到的。
本发明另一类优选的化合物是在以包含FKBP区域的融合蛋白质为基准的2-杂种转录测定中能够诱导可检测信号的化合物。优选地，该FKBP区域是除野生型的人类FKBP12以外的FKBP区域。
如同细胞-定位转录测定，测量雷帕霉素类似物多聚化嵌合蛋白质的能力的另一测定为测量这样的多聚化引发的信号计数的细胞-定位。在这种情况下，使用持续表达可检测的产品的细胞。该细胞也包含并且能够表达编码包含一种或多种亲免素衍生的配体结合区域和一种或多种效应因子区域，如FAS胞内区域，多聚化时能引发细胞死亡的嵌合蛋白质的DNAs。典型的组分的设计和制剂以及它们在工程细胞中的用途公开于WO95/02684。也参见WO96/41865。细胞在容许细胞生长或延续生存能力的培养基中维持或培养。测定该细胞或媒介中的组成的细胞产品的存在，并且由此建立指示器的基线水平。可以使用hGH组成的生产的基因工程细胞或any其他方便的可检测的产品作为指示器。将试验化合物加入培养细胞的，在一个或多个时点检验细胞溶解产物或媒介中的指示器的存在。融合蛋白质多聚化的间接的测量中，指示器产生的减少显示细胞死亡。
另一类优选的本发明化合物为能够在这样的FKBP/FRB-定位细胞程序死亡测定中诱导可检测信号的化合物。优选地，该FKBP区域是除野生型的人类FKBP12以外的FKBP区域。正如以上的讨论，在某些情况下，FKBP区域被修饰。优选地，该FRB区域是除人类FRAP的野生型FRB以外的FRB区域。如上所述，在某些情况下，FRB区域在位置2098被修饰。
这样的测定容许专业人员选择具有所需的IC50值的雷帕霉素类似物和/或比优先结合突变体FKBP而不是野生型人类FKBP12的雷帕霉素类似物。竞争性结合FP测定容许人们选择具有所需的IC50值的雷帕霉素类似物和/或相对于控制组，如FK506优先结合突变体FKBP或野生型FKBP的雷帕霉素类似物。
应用
如WO94/18317，WO95/02684，WO96/20951，WO95/41865，和WO99/36553所述，除了用作免疫抑制剂和抗真菌药之外，28-表雷帕霉素类似物可用于，例如在生长在培养中的基因工程细胞或有机体整体中调节所需的基因转录的激活，删除靶基因，启动细胞程序死亡或引发其他生物学转变，包括基因治疗应用。下列为本发明的非限制性应用实例。
1.调节基因治疗。在许多情况下，断断续续地随意转变治疗的基因的能力或滴定精确表达能力对于治疗效能是重要的。本发明特别适于实现人类基因治疗前后治疗的靶基因的可调型表达。作为一个运用嵌合蛋白质对(一个至少一个FRB区域，另一个包含至少一个FKBP区域)的例子，本发明28-表雷帕霉素类似物能够使嵌合体，和被表达的靶基因结构聚合成二聚物。一个嵌合蛋白质包含DNA结合域，优选如Pomerantz et al，supra，所述的作为异源的效应因子区域的复合DNA结合域。第二个嵌合蛋白包含作为异源的效应因子区域的转录区域。28-表雷帕霉素类似物能够与两个嵌合体结合，由此有效地与该嵌合体，编码DNA分子嵌合体，并且能够引导被引入基因工程的细胞的嵌合蛋白质的表达。被引入的细胞也是与DNA结合域能够对此结合的DNA序列有关系的靶基因。用28-表雷帕霉素类似物接触基因工程细胞或其子代(通过将其向动物或患者给药)导致转录因子配合物的集会，由此表达该靶基因。相似的组分的设计和使用公开于PCT/US93/01617和WO 96/41865(Clackson et al)。实施中，靶基因表达的水平应该是嵌合转录因子配合物的数目或浓度的函数，它也是28-表雷帕霉素类似物浓度的函数。剂量(28-表雷帕霉素类似物的)-效应的基因表达典型地被观察。
28-表雷帕霉素类似物可以依照要求向患者给药激活靶基因的转录。取决于28-表雷帕霉素类似物结合的亲合力，要求的反应，给药的方式，雷帕霉素类似物和/或靶基因mRNA的生物半衰期，存在的基因工程细胞的数目，各种方案都可以使用。28-表雷帕霉素类似物可以通过各种途径给药，包括胃肠外或口服。的数目取决于上面描述的因素。28-表雷帕霉素类似物可以作为药丸，粉末，或分散体口服；颊服；舌下给药；血管内，腹膜下，肌内，皮下注射；吸入给药，等等。28-表雷帕霉素类似物(和单体拮抗剂化合物)可以使用本领域众所周知的常规方法和原料制备用于各种给药途径的制剂。给药的精确剂量和特别方法取决于上述因素，可通过主治医师或者人或动物保健供应者测定。在很大程度上，给药方式凭经验测定。
通过28-表雷帕霉素类似物转录激活被反转或者终止时，28-表雷帕霉素类似物的给药被终止。此外，如果需要，可以将与28-表雷帕霉素类似物竞争的单体化合物给药。因此，如果产生有害反应或者希望终止治疗作用，可以以任何方便的方式将二聚化药剂的拮抗剂给药，如果需要迅速的反转特别优选血管内注射。选择性地，可以在配体结合区域提供钝化区域(或者转录的失活剂)。在另一个途径中，可以通过提供其它地方公开的Fas或TNF受体的信号通过细胞程序死亡消除细胞。参见国际专利申请PCT/US94/01617和PCT/US94/08008。
根据用于治疗的剂量监视的方法可以测定28-表雷帕霉素类似物在任何应用中的特殊的剂量，表达的特殊的水平的维持需要一个延长期，例如，大于约两周，或者短时间内用单独或重复doses28-表雷帕霉素类似物重复治疗时，需要延伸的间隔，例如，两周或更多。预定范围内的28-表雷帕霉素类似物剂量被给定并且监控反应，以致获得时间-表达水平的相互关系，以及观察治疗的反应。取决于周期水平观察和治疗的反应，反应后，下一次可以提供较大的或者较小的剂量。重复该方法，直到获得治疗的范围内的剂量。28-表雷帕霉素类似物长期给药时，首先测定28-表雷帕霉素类似物的维持剂量，然后测定疏开间隔，确定细胞系统提供合适的反应和表达产物的水平。
显然，本系统受许多变量支配，如细胞对28-表雷帕霉素类似物的反应，表达的效率，视情况而定，分泌的水平，表达产物的活性，患者的特殊的需要，可以随时间和情况变化，作为细胞损失结果的细胞活动损失率或个体细胞的表达活性，等等。
2.重组体蛋白质和病毒的产生商业和研究目的的重组体治疗蛋白质的产生常常通过使用基因工程哺乳动物细胞线高水平表达蛋白质而实现。使用哺乳动物细胞，而不是细菌或酵母，显示需要翻译后修饰的蛋白质的正常功能一般不通过异源的细胞完成。这样大批产生的蛋白质的例子包括红细胞生成素，组织纤溶酶原激活物，凝血因子如因子Vllhc，抗体，等等。用这种方式产生的蛋白质的成本与基因工程细胞实现的表达的水平有直接的关系。生产这样的蛋白质的第二个限制是对寄主细胞的毒性：蛋白质表达可以防止细胞变得高密度，急剧地减少生产水平。因此，作为所述调节基因治疗，紧紧地控制蛋白质表达的能力容许在没有蛋白质生产的情况下，细胞逐渐高密度。只是在最佳的细胞密度达到以后，表达激活的基因，随后收获蛋白产品。
在生产商业使用的(例如，基因治疗)和实验使用的重组病毒的“包装”的结构和使用中遭遇相似的问题。这些细胞系经基因工程改造产生包含有缺陷的重组体基因组的传染性的病毒颗粒的集合需要的病毒蛋白质。取决于这样的包装线的病毒载体包括反向病毒，腺病毒，和腺病毒相关病毒。在后面的情况下，从包装线中获得病毒原种的滴度与病毒rep和核心蛋白质的生产水平直接有关系。但是这些蛋白质对寄主细胞是高毒性的。因此，难以产生高-滴度重组体AAV病毒。本发明提供解决这些问题的答案，即允许在这里公开的可调转录因子的控制下放置rep和核心基因的包装线的结构。包装细胞系可以变得高密度，用辅助病毒感染，以及用重组体病毒基因组转染。然后，通过加入二聚剂诱导包装细胞编码的病毒蛋白质，允许在高滴度生产病毒。
3.生物学研究本发明适用于各种各样的需要精确的控制靶基因的生物学试验。其中包括：(1)用于生化净化的使人感兴趣的核糖核酸的蛋白质或RNA的表达；(2)用于评价生物学功能的目的的组织培养细胞中的(或体内，经基因工程细胞)使人感兴趣的蛋白质或RNA的可调型表达；(3)用于评价其生物学功能的目的的转基因动物中的使人感兴趣的蛋白质或RNA的可调型表达；(4)用于那些基因的生物学功能的评价的目的的作用于内源的基因的编码另一个调节蛋白的基因的表达的调节。本发明组分可以适应的转基因动物模型及其他申请公开于PCT/US95/10591。
本发明进一步提供可用于上述应用的试剂盒。这样的试剂盒包含编码以及能够引导本发明嵌合蛋白质的DNA结构(以及可以包含如以上讨论的附加区域)以及，在涉及调节基因转录的具体方案中，包含与一种或多种通过嵌合蛋白质多聚化激活的转录控制元件有关系的靶基因的靶基因结构。选择性地，该靶基因结构可以包含用于专业人员插入需要的靶基因的克隆位点。这样的试剂盒也可包含能够使两个重组体蛋白质二聚化并且激活靶基因的转录的二聚剂的样品。配制，剂量和用法
根据其启动蛋白质相互作用的能力，本发明雷帕霉素类似物可以用于在包含本发明基因改造细胞的人或非人哺乳动物中促进形成本发明嵌合蛋白质的配合物的药物组合物和方法。
这样的治疗或预防的优选的方法为对哺乳动物给予有效量的化合物来启动在基因工程细胞中的这样的配合物的形成，或优选地，启动通过这样的络合作用，例如靶基因的转录，基因改造细胞的细胞程序死亡，等等，测量需要的生物学信号计数的作用。
治疗/预防给药与药物组合物
雷帕霉素类似物可以处于游离形式或，合适的话，处于盐形式。许多化合物类型的药学上可接受的盐和它们的制剂对于本领域技术人员是已知的。本发明化合物的药学上可接受的盐包括由，例如，无机的或有机的酸形成的这样的化合物的常规的无毒盐或季铵盐。
本发明化合物可以形成水合物或溶剂化物。本领域技术人员已知用水冷冻干燥时带电荷的化合物形成水合物，浓缩合适的有机溶剂的溶液形成溶剂化物。
本发明也涉及包含治疗(或预防)有效量的本化合物，和一种或多种药学上可接受的载体和/或其他赋形剂的药物组合物。载体包括例如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，和它们的结合，下文更详细地论述。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体溶液，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂，或粉末。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如三酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，和碳酸镁，等等。视需要制剂而定，配制可以涉及混合，粒化和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒(nanoparticles)。
使用的药物载体可以为，例如，固体或者液体。
典型的固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等等。固体载体可以包括一种或多种可能同时作为增香剂，润滑剂，增溶剂，悬浮剂，填料，助流剂，压缩助剂，粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是包封材料。在粉末中，载体为精细粉碎的固体，它是与精细粉碎的活性成分的混合物。在片剂中，活性成分与具有必要的压缩性质的载体以合适的比例混合，以需要的形状和大小压缩。粉末和片剂优选包含至多99％活性成分。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙，硬脂酸镁，滑石，糖，乳糖，糊精，淀粉，凝胶，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，低熔点蜡和离子交换树脂。
典型的液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，水，等等。液体载体用于制备溶液，悬浮液，乳剂，糖浆，酏剂和密封的组合物。活性成分可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体如水，有机溶剂，二者的混合物或药学上可接受的油类或脂肪。液体载体可以包含其他合适的药物添加剂如增溶剂，乳化剂，缓冲剂，防腐剂，增甜剂，增香剂，悬浮剂，增稠剂，颜料，粘度调节剂，稳定剂或渗透压-调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体载体的合适的例子包括水(部分地包含如同上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠盐溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，和油类(例如分馏椰子油和花生油)。用于肠胃外给药的载体还可以为油酯如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸盐。无菌的液体载体用于肠胃外给药的无菌的液态组合物。用于加压组合物的液体载体可以为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或悬浮液液体药物组合物可以用来，例如，肌内，腹膜内或皮下注射。无菌溶液还可以静脉内给药。该化合物还可以以液体或者固体组合物的形式口服给药。
载体或赋形剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单独的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲脂等等。当制剂用于口服时，公认PHOSAL PG-50(phospholipidconcentrate with 1，2-propylene glycol，A.Nattermann & Cie.GmbH)中的0.01％吐温80用于其他化合物的可接受的口服制剂的配制，可以适应于本发明各种化合物的配制。
可以使用各式各样的药物形式。如果使用固体载体，制剂可以片剂，被放入硬胶囊中的粉末或小药丸形式或锭剂或糖锭形式。固体载体的量在很大程度上变化，但是优选从约25mg到约1g。如果使用液体载体，制剂可为糖浆，乳剂，软胶胶囊，在安瓿或小瓶或非水的液体悬浮液中的无菌注射溶液或悬浮液。
为了获得稳定的水溶性的剂型，可以将多聚化剂的药学上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。选择性地，酸性的衍生物可以溶于合适的碱性溶液。如果得不到可溶盐形式，可将化合物溶于合适的共溶剂或它们的结合。这样的合适的共溶剂的例子包括，但是不局限于，浓度范围从0-60％总体积的，醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羟脂肪酸酯等等。
各种释放系统是已知的并且可用于多聚化剂的给药，或它们的各种制剂，包括片剂，胶囊，可注射的溶液，脂质体中的胶囊，微粒，微胶囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮肤的，皮内，肌内，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻腔内的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常优选的)口服途径。化合物可以通过任何方便的或者相反适当的途径给药，例如通过注入或快速浓注，通过上皮的或粘膜线路(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等等)吸收以及可以与其他生物活性剂一起给药。可以全身或局部给药。用于鼻，支气管或肺疾病的治疗或预防时，优选的给药途径为口服，鼻给药或支气管烟雾剂或喷雾器。
在某些具体方案中，化合物对需要治疗的区域局部给药也许合乎需要；实现这样的给药可以通过，例如，而不是作为限制，外科手术局部注入，局部施用，通过注射，通过导管，通过栓剂，或依靠蒙皮补片或植入物，上述的植入物为多孔的，无孔的，或凝胶状的材料，包括膜，sialastic膜，或纤维。
在特定的具体方案中，组合物根据常用方法制剂，用作适合于向人静脉内的给药的药物组合物。典型地，用于静脉内的给药的组合物为无菌的等渗的含水的缓冲剂中的溶液。在必要时，组合物也可能包括增溶剂和在注射位点镇痛的局部麻醉剂。一般地，成分被分别或混合地提供于单位剂型，例如，冷冻干燥粉末或无水的浓缩物在密闭容器如显示活性剂的数量的安瓿或sachette中。组合物通过注入给药时，它可以分装于包含无菌的药物级的水或盐水的输液瓶。组合物通过注射给药上，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿，可以在给药之前混合各成分。
将有效量的化合物向个体给药还可以通过将化合物(s)直接向个体皮肤的受影响的区域局部地给药而实现。对于这个目的，化合物给药或应用的组合物包括药理学可接受的局部给药载体，如凝胶，油膏，洗液，奶油，其中包括，无限制的，这样的载体如水，甘油，醇，丙二醇，脂肪醇，甘油三酯，脂肪酸酯，或矿物油。
其他局部给药的载体包括液体石油产品，异丙基棕榈酸酯，聚乙二醇，乙醇(95％)，水中的聚氧化乙烯单月桂酸酯(5％)，或水中的十二烷基硫酸钠(5％)。其他原料如抗氧化剂，湿润剂，粘度稳定剂，和相似的药剂可以根据需要添加。也可能包括经皮渗透增强剂如Azone。
另外，某些情况下，预计该化合物可以安排在装置内，放置于皮肤的上面，里面或下面。这样的装置包括补片，植入物，和注射液，通过钝态的或者活性的释放机制，将化合物释放到皮肤内。
产生各种制剂的原料和方法在本领域是已知的，可以适合于实施本发明。参见例如US Patent Nos.5,182,293和4,837,311(片剂，胶囊及其他口服的制剂以及静脉内的制剂)和European Patent Application Publication Nos.O649 659(published April 26，1995；IV给药的的典型制剂)和0 648 494(published April 19，1995；口服的典型制剂)。
化合物的有效剂量典型地在about 0.01到约50mg kgs，优选约0.1到约10mg/kg哺乳动物体重的范围之内，以单或多剂量给药。一般地，对需要这样的治疗的病人的给药的日剂量范围为每位患者约1到约2000mg。
有效治疗或预防特殊的紊乱或症状的化合物的量部分地取决于多聚化剂融合蛋白质的特性，基因工程细胞的特性和位置，以及紊乱或症状的性质，可以通过标准的临床技术测定。另外，可以选择性地使用体外或体内测定帮助确定最佳的剂量范围。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。主治医师其他卫生保健提供者可测定精确的剂量水平，它取决于众所周知的因素，包括给药途径，个体的年龄，体重，性别和总的健康状态；疾病的性质，严重程度和临床阶段；伴随治疗的使用(与否)；以及患者的基因工程的性质和范围。
本发明也提供具有包含一个或多个本发明药物组合物成分的包装物的药物包装或试剂盒。与这样的包装物选择性地关联的技术可以为政府机构规定的布告形式，药物或生物制品的制造，使用或销售，该布告反映政府机构批准用于人给药的制造，使用或销售。该布告或包装说明书可能包含与本申请公开的一致的本发明28-表雷帕霉素类似物的使用说明书。
下列实施例包含重要的附加信息，例证和指导，可以适应本发明各种具体方案及其同等物的实施。实施例提供说明，不应该被理解为以任何方式的限制。本发明的许多修饰和变化对本领域技术人员显而易见。这样的修饰和变化，包括28-表雷帕霉素类似物选择，制备，制剂和给药的设计选择，以及异源的作用区域的选择，融合蛋白质设计，DNA配制，病毒载体或其他DNA的释放方法，转基因给药的方式和途径等等包括于本发明的范围和附加的 的范围内。
所有引用的包括参考文献包括本文件引用的参考文献书目，发布的专利，以及公开专利申请，特此作为参考编入。除非另有陈述，本发明的实施将使用合成有机化学的常规方法，包括产品回收，提纯和及配制，以及细胞生物学，细胞培养物，分子生物学，转基因的生物学，微生物学，重组DNA，以及免疫学，都在本领域技术人员已知的范围之内。这样的技术完全在专利和科学文献中说明。参见，例如，下列生物技术：Molecular Cloning+A Laboratory+Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，)；OligonucleotideSynthesis(低聚核苷酸合成)(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No：4,683，195；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(转录和翻译)(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(动物细胞的培养)R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells Immobilized Cells And Enzymes(固定细胞和酶)(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Guide ToMolecular Cloning(分子扩增的实际的指导)(1984)；论文，Methods InEnzymology(酶学中的方法)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，美国冷泉港实验室)；Methods In Enzymology(酶学中的方法)，vols.154和155(Wu et al eds.)，Immunochemical MethodsIn Cell And Molecular Biology(细胞中的免疫化学方法和分子生物学)(Mayer和Walker，eds.Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology(实验免疫学手册)Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo(小鼠胚胎的操作)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1986)。
                        实施例实施例1.28-表雷帕霉素的探索和分析
当研究选择性的路易斯酸的C7亲核取代化学时，我们发现在没有任何亲核试剂的情况下用二氯甲烷中的Ti(OiPr)4处理雷帕霉素时导致全新的反应，得到的主要产品为一种分子量与雷帕霉素相同的未知的化合物2(分离的产率超过60％)(流程1)。
初步的NMR分析显示C26，C28和C29质子共振改变，暗示在C28，C29或C28和C29二者可能差向异构化。化合物2和雷帕霉素1分别地处于相同的逆向醛醇(retroaldol)反应条件(ZnCl2，THF，50-OC，4hr)。如HPLC(反相，85∶15 MeOH∶H20)和1H NMR分析所示，两个反应均产生开环的开环雷帕霉素3，证明C28和/或C29立构中心被差向异构化。流程1
对化合物2和雷帕霉素进行了进一步NMR分析(COSY，ROESY，TOCSY，NOESY，HETCOR和HMBC)。雷帕霉素NMR谱带归属与文献报导的非常吻合。2的HMBC和NOESY数据均显示C28的立体化学已经反向。
结晶化合物2用甲醇/水重结晶，进行X射线晶体结构测定。它清楚地证实新分离的产品为雷帕霉素的C28差向异构体。
除2和残余的雷帕霉素之外，也从本反应分离出一些较少的副产品(通过HPLC分析各少于5％)。通过类似于28-表雷帕霉素进行的NMR分析测定，发现它们为开环雷帕霉素3，29-表雷帕霉素4和28，29-二表雷帕霉素5。
Figure A0081205100832
粗反应混合物中存在微量开环雷帕霉素3暗示受Ti(OiPr)4的影响可能存在雷帕霉素的反向羟醛(retroaldol)和反羟醛(realdol)大环内酯化(macrolization)的反应途径。
在五当量苯甲醛存在下进行差向异构化反应时可以通过苯甲醛来截留钛(IV)配合的反向羟醛中间体。苯甲醛和反向羟醛中间体之间的醛醇缩合得到高产率的非对映体6的混合物(流程2)。流程2
Figure A0081205100841
通过HPLC(正常的和反向的相)可以严密监视反应过程。引入Ti(OiPr)4后立即可检测到开环雷帕霉素3，它在反应全部过程中保持恒量然而为最低的水平(-1％)而雷帕霉素变为它的各种非对映体。当纯的28-表雷帕霉素2，29-表雷帕霉素4和28，29-二表雷帕霉素5分别处于差向异构化条件时，可以观察相同的产品与雷帕霉素的比率。这些实验证明钛(IV)配合的雷帕霉素的反向羟醛限制该反应的速度。与钛(IV)配合的开环中间体一旦产生便迅速地重羟醛化。反向羟醛和重羟醛步骤继续进行直到反应达到平衡。最终产品分布显示28-表雷帕霉素2是热力学最稳定的非对映体。
这些中和状态下的通过Ti(OiPr)4介导的β-羟基酮的新的反向羟醛和重羟醛平衡不是这里公开的雷帕霉素特定的。原始数据证实它也适用于非环的系统中的β-羟基酮。1-羟基-1-苯基-2-甲基3-戊酮与Ti(OiPr)4的2∶1混合物(syn/anti)的处理导致4∶5(syn/anti)混合物，证实反向异构体热力学更稳定。由金属如Zn(11)，Mg(11)和Ba(11)平衡的羟醛已经在文献中报导。可是，该平衡需要强碱条件，常常产生如Hayward在雷帕霉素全合成中证明的反向羟醛产品。
将28-表雷帕霉素进行与雷帕霉素比较的生物检定。按荧光偏振竞争测定计算，28-表雷帕霉素对FKBP的亲合力比雷帕霉素弱大约5倍，按照与FKBP结合的雷帕霉素的X射线晶体结构可以想象，也许由于C28羟基与FKBP上的Glu54主链羰基之间氢键作用的损失。与对FKBP结合的亲合力降低一致，在脾细胞增殖测定中，2的免疫抑制活性雷帕霉素减少一定数值。比较数据显示于实施例5。
因此已经发现免疫抑制的天然产物雷帕霉素的新的选择性的差向异构化反应，差向异构化产品的结构已经通过NMR和X射线结晶学分析证实。体外测定28-表雷帕霉素，发现具有较小效力的免疫抑制活性。这些非常温和的和有效率的反向羟醛和反羟醛差向异构化条件还可以被用于无环的β-羟基酮而产生热力学更稳定的立体异构体。这些方法应该广泛地适用于具有β-羟基酮的其他天然产物和化合物。实施例2.28-表雷帕霉素和C43-修饰的28-表雷帕霉素类似物的合成2.0  28-表雷帕霉素
一般方法所有的试剂和溶剂为分析纯的，市场购买未进一步提纯。使用Bruker ARX-300或DRX600仪器记录1H和13C NMR光谱。化学位移单位为从四甲基硅烷向低场的ppm。如果存在旋转异构体混合物，仅仅记录主要的旋转异构体的化学位移。低分辨率质谱(LRMS)由Micromass Platform II四极质谱仪以电喷射方式获得。闪式层析法使用硅胶(Merck，230-400 mesh)进行。分析TLC使用硅胶60 F254板(Merck)进行。由正常相位和反向相位分析HPLC在280nm波长监控雷帕霉素的相关反应。该正常相位HPLC使用Kromasil硅胶柱(4.6mm×25cm)，在室温下以1.0mL/min的流速用4.0/42,5/50/200：MeOH/EtOAc/己烷/CH2C12洗脱。反向相位HPLC使用Kromasilc18柱(4.6mm×25cm)，在50℃的温度下以1.0mL/min的流速用80/20：MeOH/H2O洗脱。制备HPLC分离使用Kromasil硅胶柱(21.4mm×25cm)以20mL/min的流速进行。
雷帕霉素差向异构化的一般程序在室温下，在雷帕霉素(510mg，0.56mmol)在CH2Cl2(35.2mL)中的溶液中，滴加Ti(OiPr)4(494uL，1.67mmol)。反应混合物变为浅黄色。30分钟后，将该溶液倒入包含1N HCl和EtOAc的不均匀混合物的分液漏斗。随后将该有机层用NaHCO3饱和水溶液，H2O，盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。所有产品的保留时间列于如下。
    化合物     正常相     反相
保留时间(分) 保留时间(分)
28-开环雷帕霉素(3) 15.19  13.80
28，29-二表雷帕霉素(5) 24.51  14.24
29-表雷帕霉素(4) 25.88  13.11
雷帕霉素(1) 30.95  11.60
28-表雷帕霉素(2) 33.21  13.80
雷帕霉素互变异构体 39.68  14.79
28-表雷帕霉素互变异构体 43.26  14.54
2.1 C43-O-烯丙基C28差向异构化方法(一罐法)
在室温及搅拌下，将雷帕霉素(219mg，0.240mmoles)溶于二氯甲烷(12.3ml)。加入Ti(OiPr)4(212mL，0.720mmoles)产生浅黄色溶液。在室温放置75分钟后，将该溶液冷却到-78℃，接着加入2，6-二甲基吡啶(156mL，1.2mmoles)和烯丙基三氟乙酸酯。将该反应物在-78℃搅拌100分钟，然后温热到O℃。2小时后，将该溶液倒入包含1N HCl和CH2Cl2的不均匀溶液的分液漏斗猝灭。将有机层用NaHCO3，盐水和水洗涤，用NaSO4干燥，过滤并且在真空下浓缩物至大约2mL。用硅胶闪式层析法提纯(3/1己烷/丙酮)，接着通过半制备HPLC(4.0∶42.5∶50∶200/MeOH∶EtOAc∶己烷∶CH2Cl2)，得到清洁的28epi-表-43-O-烯丙基雷帕霉素(14％∶41％以转化为基准)。MS：(M-H)-：952.44。2.2 C43 O-烯丙基C28差向异构化方法(从纯的28-表雷帕霉素)
在-78℃下，将烯丙醇(15.5mL 0.228mmoles)和2，6-二-叔丁基吡啶(46mg，0.225mmoles)在CH2Cl2(1.12mL)中的溶液加入三氟乙酸酐(38.0mL，0.229mmoles)溶于CH2Cl2(546mL)形成的第二溶液。90分钟后，将28-表雷帕霉素(101mg，0.111mmoles)，和2，6-二-叔丁基吡啶(46mg，0.225mmoles)在CH2Cl2(7.0mL)中的溶液加入烯丙基三氟乙酸酯溶液。将该反应  物在-78℃搅拌30分钟，然后温热到0℃，再搅拌7小时。将该溶液加入包含用NaSO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶闪式层析法提纯(梯度为2/1到3/2的己烷/乙酸乙酯)得到白色固体装28-表43-O-烯丙基雷帕霉素(59％，以回收的原料为基准)。MS：(M-H)-：952.44。2.3 C43 O-O-甲基C28差向异构化方法(一罐法)
将雷帕霉素(1.39g 1.52mmoles)溶于CH2Cl2。迅速地滴加异丙氧基钛(1.35mL，4.57mmoles)。将该溶液在室温下搅拌30分钟，然后冷却到0℃。同时加入2，6二甲基吡啶(994mL，7.61mmoles)和三氟乙酸甲酯(861mL，7.61)。将该反应物搅拌110分钟，通过加入包含1N HCl和CH2Cl2的多相混合物的分液漏斗猝灭，提取，用NaHCO3，盐水和水洗涤，用NaSO4干燥，过滤并且浓缩。经硅胶闪式层析法(3/1到1/1己烷烷/丙酮)及随后的制备HPLC(4.0/42.5/50.0/200：MeOH/EtOAc/Hex/CH2Cl2)提纯，得到白色固体状28-表雷帕霉素-43-O-烯丙基(24％，以回收的原料为基准)。MS：(M-H)-：926.71。2.4其他C-43-修饰的28-表雷帕霉素类似物
使用28-表雷帕霉素作为原料，使用已知的变化，可以制备43-O-苄基-28-表雷帕霉素，43-O-甲氧基亚甲基-28-表雷帕霉素，以及43-N，N-二甲基甘氨酰(dimethylgylcinate)-28-表雷帕霉素。用与要求的产品相关的C7 28-表雷帕霉素类似物作为原料(参见实施例4，下文)，可以类似地制备在C7和C43修饰的28-表雷帕霉素类似物。
2.5几个C-43-修饰的28-表雷帕霉素类似物的比较特性
化合物 FKBPblnding1IC50(nM) txn 2098L2EC50(nM) Splenocyte3IC50(nM)
雷帕霉素 1.7 7-10 0.1-0.3
28-表雷帕霉素 8，17 8 0.9-3.5
43-O-MOM-表雷帕霉素 27 7 0.6-1.6
43-O-甲基-28-表雷帕霉素 34 3 20-31
43-O-烯丙基-28-表雷帕霉素 65 8 641-684
43-O-苄基-28-表雷帕霉素 63 12 -1200
1.使用先前报导的以荧光偏振(FP)为基准的竞争性结合测定方法可以测定雷帕霉素类似物与FKBP的亲合力。在包含亚饱和FKBP和作为竞争者的可变量雷帕霉素类似物的平衡结合实验中，使用荧光素标记的FK506探针(AP1491)，其荧光极化的增加直接读出探针的％结合。参见例如，WO 99/36553，实施例11，119-120页。
2.在使用结构上表达分别包含FKBP和2098L突变体FRB区域的转录的转换组分，调节地表达转换组分多聚化的化合物中的分泌碱性磷酸酶(SEAP)的基因改造的HD1080细胞的转录测定中，测量各种化合物的EC50值。该测定是用文献中的测定方法。参见WO 99/36553，例如实施例12，120-121页(&Fig2D)。
3.常规的鼠科动物脾细胞对于免疫抑制活性的测定。实施例3.典型的C-24修饰的28-表雷帕霉素类似物的合成
E和Z形式的C-24肟的雷帕霉素的制备方法是已知的。参见例如WO96/41865和WO99/36553。使用那些方法，但是用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素，得到28表雷帕霉素的相应的肟，：
Figure A0081205100881
其中，为了这些实施例中使用的目的，RB为-OH，-OMe，-OEt，-OisoBu，OtBu-Obenzyl，-OCH2CO2H，-OCH2CONH2。实施例4.C7 28表雷帕霉素类似物的合成
WO96/41865和WO99/36553公开了使用除注解外的文献的所述的一般化学方法，合成一系列包含各种C7取代基，尤其包括，支链和无支链的烷氧基，芳基烷氧基，-NHCO-OalkyI，-NHSO2alkyl和取代的芳基和杂芳基基团的一系列C7同型物(参见例如，Luengo et al 1995 Chemistry and Biology 2，471-481，和附加背景技术的表II中引用的参考文献)。使用相同的方法，除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素，得到相应的28-表雷帕霉素的C7衍生物，例如，下列结构的化合物：
Figure A0081205100891
其中一个R7a和R7b为H，另一个为-OEt，-OiPr，-Obenzyl，-NH-CO-OMe，-NH-SO2-Me，-呋喃基，-甲基噻吩，-乙基噻吩，-叔丁基噻吩，-o.p-二甲氧基苯基，-吲哚基，-o.p-二甲氧基苯基，-甲基噻吩，-N-甲基吡咯等等。实施例5.几个C-7-修饰的28-表雷帕霉素类似物的比较特性
按实施例4所述制备不同基团的C7-修饰的28-表雷帕霉素类似物。典型的实施例列在下两页的表上，具有与FKBP结合的比较数据，细胞转录测定中的活性，和使用上述实施例2.5论述的方法的小鼠脾细胞(splenocyte)测定中的活性。
种  类     FKBPIC50(nM)   TXN2098LEC50(nM) SplenocyteIC50(nM)
雷帕霉素     1.7     7-10     0.1-0.3
28-表族
28-表雷帕霉素     8.17     8     0.9-3.5
7-烷基/芳基
28-表-7S-二甲氧基苯基     31     50     598-1064
28-表-7R-二甲氧基苯基     54     26     22-28
28-表-7R-甲硫基苯基     120     22     394-424
28-表-7S-甲硫基苯基     86     25     170-242
28-表-7S-二甲硫基苯基     87     30     1242-1541
7-醚
28-表-7S-烯丙氧基     18     8     1802
28-表-7R-烯丙氧基     11     25     3402
28-表-7S-苄氧基     70     18     93
28-表-7R-苄氧基     9.1     14     313
28-表-7S-(3′-甲基)-丁-4′-烯基氧基     27     16     718
28-表-7R-(3′-甲基)-丁-4′-烯基氧基     13     35     3156.3
28-表-7S-苯氧基     36     8(-)     478-2502
28-表-7R-苯氧基     19     9(-)     200-1954
28-表-7S-2′-甲氧基苄氧基     33     15     25
28-表-7R-2′-甲氧基苄氧基     4.6     24     653
28-表-7S-2′-甲基苯氧基     17     14     710.1700
28-表-7R-2′-甲基苯氧基     8.1     8(+)     802.3113
28-表-7S--环己基乙氧基     76
28-表-7S-异丙氧基     49     29
28-表-7R-异丙氧基
28-表-7S-乙氧基     15     801.3
28-表-7R-乙氧基     33
28-表-7R-甲氧基     46(+)
硫醚
28-表-7S-异丙基硫醚     15     31(+)
28-表-7S-异丙基硫醚     21     15
7-氨基甲酸酯
28-表-7S-乙基氨基甲酸酯     13     10     ＞5000
28-表-7R-乙基氨基甲酸酯     7.5     9(+)     ＞5000
28-表-7S-苄基氨甲酸酯     40     15     3448
28-表-7R-苄基氨甲酸酯     12     9(+)     2256
28-表-7S-苯基氨甲酸酯     18     14(+)     ＞5000
28-表-7R-苯基氨甲酸酯     9     10(+)     ＞5000
 28-表-7S-异丁基氨基甲酸酯
 28-表-7R-异丁基氨基甲酸酯
 7-N-烷基氨基甲酸酯
 28-表-7R-N-甲基-乙基氨基甲酸酯     120     9     255
 28-表-7S-N-甲基-乙基氨基甲酸酯     30     12(-)     2292
 28-表-7S-N-Me-异丁基氨基甲酸酯     19     40     1381
 28-表-7R-N-Me-异丁基氨基甲酸酯     109     15     587
 28-表-7S-N-Me-苄基氨基甲酸酯     40     9     158
 28-表-7R-N-Me-苄基氨基甲酸酯     163     8(-)     1154
 28-表-7S-N-Me-p-甲苯基氨基甲酸酯     54     25     50
 28-表-7R-N-Me-p-甲苯基氨基甲酸酯     119     70     393
 7-氨磺酰胺
 28-表-7S-丁氨磺酰     9.2     11(+)     152
 28-表-7R-丁氨磺酰     11     20     0.16
 28-表-7S-甲氨磺酰胺     16     24     7
 28-表-7R-甲氨磺酰胺     7.2     24     91
 7-N-烷基氨磺酰胺
 28-表-7R-N-Me-p-甲苯氨磺酰胺     34     8     12
 28-表-7S-N-Me-甲氨磺酰胺     21     27(+)     140
 28-表-7R-N-Me-甲氨磺酰胺     37     8     166
 28-表-7S-N-Et-甲氨磺酰胺     31     8(+)     1362
 28-表-7R-N-Et-甲氨磺酰胺     31     8(+)     189
 28-表-7S-N-Me-丙氨磺酰胺     19     35(+)     2629
 28-表-7R-N-Me-丙氨磺酰胺     148     9     1372
 7-氨磺酰胺
 28-表-7S-甲苯基磺酰胺     11     28     564
 28-表-7R-甲苯基磺酰胺     38     27     22
 28-表-7S-二甲基磺酰胺     13     20(+)     879
 28-表-7R-二甲基磺酰胺     29     20(+)     1844
 28-表-7-N-烷基磺酰胺
 28-表-7S-N-Me-甲苯基磺酰胺     26
 28-表-7R-N-Me-甲苯基磺酰胺     74     8
 28-表-7R-N-Me-二甲基磺酰胺     8     653
(+)峰＞125％雷帕霉素峰(-)峰＜80％雷帕霉素峰实施例6 24(S)，30(S)-四氢-和30-二氢-28-表雷帕霉素的制备
WO99/36553公开了24(S)，30(S)-四氢化雷帕霉素的合成和特征。使用相同的方法，除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素，得到24(S)，30(S)-四氢-28-表雷帕霉素。
Figure A0081205100921
除了用28-表雷帕霉素代替雷帕霉素作为原料，使用常规方法也可制备28-表-30-二氢雷帕霉素。实施例7在C24，C30和C7修饰的28-表雷帕霉素类似物的制备使用在先的C7雷帕霉素类似物实施例中说明的方法，在C7可以修饰实施例6中制备的24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素。例如：7(S)-(2′，4′-二甲氧基苯基)-7-去甲氧基-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素
Figure A0081205100922
将24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素(20mg，0.022mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)。加入1，3-二甲氧基苯(0.20mL，1.5mmol)，并将该溶液冷却到-60℃。加入三氟乙酸(0.030mL，0.39mmol)，将该反应混合物在60℃搅拌1小时，然后在乙酸乙酯(10mL)和碳酸氢钠饱和水溶液(1mL)之间分配。将有机相用水(2mL)和盐水(1mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，并且浓缩。使用闪式层析法(硅胶，15∶75∶50∶200甲醇∶乙酸乙酯∶己烷∶二氯甲烷)回收产品-lit.ref.Luengo，J.I.；Konialian-Beck，A.；Rozamus，L.W.；Holt，D.A.J.Org.Chem.1994，59，6512-6513。
通过相似的方法，可以产生如本申请其它地方公开的，具有其他C7取代基，例如，选择性地包含取代的芳基基团，杂芳基，--脂族基，硫醚，或先前对于RC7a或RC7b指定的任何其他类型的基团的24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素。通过在C24和C30还原合适的C7 28-表雷帕霉素类似物，或通过变化C24，C30-四氢化-28-表雷帕霉素的C7可以得到这些化合物。说明的例子如下。
在C24 C30和C7修饰的雷帕霉素类似物也可能在本申请论述的各种位置不同于雷帕霉素，例如，关于一个或多个RC13，RC43，RC28，RC29，R4，”a”等。例如，用13-氟-雷帕霉素代替雷帕霉素得到相应的13-氟代类似物。
可以相似地制备的其他典型的化合物包括：7-乙氧基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-异丙氧基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-苄氧基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-甲基氨基甲酸酯(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-甲氨磺酰胺7-呋喃基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-甲基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-乙基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-t叔丁基噻吩-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-吲哚基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-o，p-二甲氧基苯基-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-(N-甲基吡咯)-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素7-(2，4，6-三甲氧基苯基)-(7-去甲氧基)-24(S)，30(S)-四氢化-28-表雷帕霉素
实施例8
关于对如本申请公开的雷帕霉素类似物起反应的基因改造细胞或动物的核酸结构的设计的详细信息，和关于这样的核酸的集合，向细胞和动物的释放，和评价，参见例如WO99/36553，其内容特别地编入本申请。该文件实施例8-10公开了使用雷帕霉素在细胞和动物中激活靶基因转录的实例，而其实施例14公开了使用雷帕霉素在基因改造细胞中激活信号转导的用途。那些实施例也特别地作为参考编入本申请。那些指导可以适合于类似地使用本发明的28-表雷帕霉素类似物。

Claims (77)

1.下式化合物：
Figure A0081205100021
其中n为1或2；R28和R43独立地选自H和取代或未被取代的脂肪族基团或酰基基团；一个R7a和R7b是H而另一个是卤素，-RA，-ORA，-SRA，OC(O)RA，-OC(O)NRARB，-NRARB，-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB′；或R7a和R7b，合起来，是四烯基团中的H：其中RA为H或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，杂芳基部分以及其中RB为H，OH或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，或杂芳基部分；
该化合物为基本上纯的立体异构体或立体异构体的混合物，并且作为其药学上可接受的衍生物。
2.权利要求1的化合物，其中n是2。
3.权利要求1或2的化合物，其中R7a是OMe而R7b是H。
4.权利要求1-3中任何一项的化合物，其中R28是H。
5.权利要求1-4中任何一项的化合物，其中R43是H。
6.权利要求1，2，4或5中任何一项的化合物，其中或者R7a是除-OMe以外的基团或者R7b是除H以外的基团。
7.权利要求6的化合物，其中一个R7a和R7b是-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB′。
8.权利要求7的化合物，其中RB是H，OH或烷基。
9.权利要求1-4和6-8中任何一项的化合物，其中R43是脂族基团。
10.权利要求9的化合物，其中R43选择性地被烷基基团取代。
11.权利要求10的化合物，其中烷基基团是羟基烷基基团。
12.权利要求9的化合物，其中R43选择性地是取代的烯基基团。
13.权利要求12的化合物，其中烯基基团是烯丙基或取代的烯丙基。
14.权利要求1-4和6-8中任何一项的化合物，其中R43是酰基基团。
15.权利要求14的化合物，其中R43阿是取代的酰基基团。
16.权利要求15的化合物，其中R43是式RARBN-烷基-C(O)-。
17.权利要求2的化合物，其中R28和R43是H，R7a是OMe，而R7b是H。
18.权利要求6-8中任何一项的化合物，其中n是2，而R28和R43是H。
19.权利要求9-18中任何一项的化合物，其中n是2，R28是H，R7a是OMe，而R7b是H。
20.下式化合物：
Figure A0081205100031
其中n为1或2；R28和R43独立地选自H和取代或未被取代的脂肪族基团或酰基基团；一个R7a和R7b是H而另一个是卤素，-RA，-ORA，-SRA，OC(O)RA，-OC(O)NRARB，-NRARB，-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或NRBSO2NRARB′；或R7a和R7b，合起来，是四烯基团中的H：其中RA为H或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，或杂芳基部分以及其中RB为H，OH或取代或未被取代的脂肪族基团，杂脂肪族基团，芳基，或杂芳基部分；
该化合物为基本上纯的立体异构体或立体异构体的混合物，并且作为其药学上可接受的衍生物。
21.权利要求20的化合物，其中n是2。
22.权利要求20或21的化合物，其中-OR43为S定向。
23.权利要求20或21的化合物，其中OR43为R定向。
24.权利要求20-24中任何一项的化合物，其中R7a是OMe而R7b是H。
25.权利要求20-24中任何一项的化合物，其中R28是H。
26.权利要求20-25中任何一项的化合物，其中R43是H。
27.权利要求20-23或25-26中任何一项的化合物，其中或者R7a是除-OMe以外的基团或者R7b是除H以外的基团。
28.权利要求27的化合物，其中一个R7a和R7b是-NRBC(O)RA，-NRBC(O)ORA，-NRBSO2RA或-NRBSO2NRARB′。
29.权利要求28的化合物，其中RB是H，OH或烷基。
30.权利要求20-25或27-29中任何一项的化合物，其中R43是脂族基团。
31.权利要求30的化合物，其中脂族基团选择性地被取代的烷基基团取代。
32.权利要求31的化合物，其中烷基基团是羟基烷基基团。
33.权利要求30的化合物，其中脂族基团选择性地被取代的烯基基团取代。
34.权利要求33的化合物，其中烯基基团是烯丙基或取代的烯丙基。
35.权利要求20-25或27-29中任何一项的化合物，其中R43是酰基。
36.权利要求35的化合物，其中R43是取代的酰基基团。
37.权利要求36的化合物，其中R43是式RARBN-烷基-C(O)-。
38.权利要求26的化合物，其中R28和R43是H，R7a是OMe，而R7b是H。
39.权利要求27-29中任何一项的化合物，其中n是2，而R28和R43是H。
40.权利要求30-39中任何一项的化合物，其中n是2，R28是H，R7a是-OMe，而R7b是H。
41.包含权利要求1-40中任何一项的化合物和一种或多种药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的组合物。
42.一种醛醇部分羟基差向异构化的方法，其中包括在适宜条件下用四烷氧基钛试剂与包含羟醛部分的化合物接触并给予充分的时间使其差向异构化。
43.权利要求42的方法，其中钛四烷氧基试剂是四异丙醇钛。
44.权利要求42或43的方法，其中进一步包含差向异构化产品的回收。
45.权利要求42-44中任何一项的方法，其中包含羟醛的化合物是雷帕霉素或雷帕霉素衍生物或类似物。
46.在细胞中多聚化嵌合蛋白质的方法，其中包含：(a)提供包含下列物质的细胞：(i)编码与雷帕霉素或其衍生物结合并且包含至少一个FKBP区域和至少一个与其异源的蛋白质区域的第一嵌合蛋白的第一重组体核酸，其中FKBP区域包含选自下列的肽序列：
(1)天然存在的FKBP
(2)其中至多10个氨基酸残基已经被删除，插入，或用取代的氨基酸代替的天然存在的FKBP的变体
(3)通过能够有选择性地与编码FKBP(i)或(ii)的DNA序列杂交的DNA序列编码的FKBP；(ii)编码第二嵌合蛋白的第二重组体，该第二嵌合蛋白形成具有(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)第一嵌合蛋白的配合物，并且包含至少一个FRB区域和至少一个与其异源的区域，其中FRB区域包含选自下列的肽序列：
(1)天然存在的FRB区域，
(2)其中至多10个氨基酸残基已经被删除，插入，或用取代的氨基酸代替的天然FRB区域的变体，
(3)通过能够有选择性地与编码FRB(iv)或(v)的DNA序列杂交的DNA序列编码的FRB区域；以及(b)用形成包含本身以及第一和第二嵌合蛋白质每种的至少一个分子配合物的28-表雷帕霉素类似物接触该细胞，其中28-表雷帕霉素类似物具有少于雷帕霉素0.01倍的免疫抑制作用并包含式I的亚结构：具有一种或多种非强制的取代基，在1到8碳之间非强制地具有一个或多个不饱和的碳-碳键，该结构是基本上纯的立体异构体或立体异构体的混合物，或其药学上可接受的衍生物。
47.在细胞中多聚化嵌合蛋白质的方法，其中包含：(a)提供包含下列物质的细胞：(i)编码与雷帕霉素或其类似物结合并且包含至少一个FKBP区域和至少一个与其异源的蛋白质区域的第一嵌合蛋白的第一重组体核酸，其中FKBP区域包含选自下列的肽序列：
(1)天然存在的FKBP
(2)其中至多10个氨基酸残基已经被删除，插入，或用取代的氨基酸代替的天然存在的FKBP的变体
(3)通过能够有选择性地与编码FKBP(i)或(ii)的DNA序列杂交的DNA序列编码的FKBP；(ii)编码第二嵌合蛋白的第二重组体，该第二嵌合蛋白形成具有(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)第一嵌合蛋白的配合物，并且包含至少一个FRB区域和至少一个与其异源的区域，其中FRB区域包含选自下列的肽序列：
(1)天然存在的FRB区域，
(2)其中至多10个氨基酸残基已经被删除，插入，或用取代的氨基酸代替的天然FRB区域的变体，
(3)通过能够有选择性地与编码FRB(iv)或(v)的DNA序列杂交的DNA序列编码的FRB区域；以及(b)用形成包含本身以及第一和第二嵌合蛋白质每种至少一个分子的配合物的28-表雷帕霉素类似物接触该细胞，其中28-表雷帕霉素类似物为下式化合物：其中
Figure A0081205100072
RC7a和RC7b中一个是H而另一个是，卤素，-R2，-OR1-SR1，-OC(O)R1，-OC(O)NHR1，NHR1，-NHR1R2，-NHC(O)R1，或-NH-SO2-R1，其中R2＝脂族基团，杂脂族基团，芳基，杂芳基或烷基芳香基，RC30是卤素，-OR3或(＝O)，RC24是＝O，＝NR4，＝NOR4或＝NNHR4，-NHOR4或-NHNHR4，-OR4，-OC(O)R4，OC(O)NR4，卤素或-H，RC14是＝O，-OR6，-NR6，-H，-NC(O)R6，-OC(O)R6或-OC(O)NR6R30是H，-R7，-C(O)R7或-C(O)NHR7或桥接C28和C30的环状基团RC28是卤素或-OR3RC29是H，OH或OMe其中除非另有陈述，各取代基存在于任何立体化学取向，并其中R1，R4，R5，R6，R7，R9，R10和R11独立地选自H，脂族基团，杂脂族基团，芳基或者杂芳基；R8是H，卤素，-CN，＝O，-OH，-NR9R10，OSO2CF3，OSO2F，OSO2R4′，OCOR4′，OCONR4′R5′，或OCON(OR4′)R5′；其中RC13和RC28中一个或两个是卤素取代基；RC24和RC30均是除＝O以外的基团；一个RC7a和RC7b是H而另一个是苯基，二或三取代苯基或单或二取代的杂环基团；n是1；和/或基团“a”是除下式以外的基团该化合物为基本上纯的立体异构体或立体异构体的混合物，或其药学上可接受的衍生物。
48.权利要求47的方法，其中RC13是卤素。
49.权利要求48的方法，其中RC13是氟。
50.权利要求47，48或49的方法，其中RC28是卤素。
51.权利要求50的方法，其中RC28是氟。
52.权利要求47-51中任何一项的方法，其中RC24和RC30是除(＝O)以外的基团。
53.权利要求52的方法，其中一个或两个的RC24和RC30是-OH，-OR1或卤素。
54.权利要求47-53中任何一项的方法，其中至少一个RC7a和RC7b是除-OMe以外的基团。
55.权利要求54的方法，其中RC7a和RC7b一个是H而另一个是苯基，二或三取代的苯基或单或二取代的杂环基团。
56.权利要求54的方法，其中RC7a和RC7b一个是H而另一个是邻、对二烷氧基苯基或三烷氧基苯基。
57.权利要求54的方法，其中一个RC7a和RC7b是H而另一个是邻、对二甲氧基苯基，邻-甲氧基-对-乙氧苯基，邻-乙氧基-对-甲氧苯基，邻、对-二乙氧基苯基，三甲氧基苯基或三乙氧基苯基。
58.权利要求46-57中任何一项的方法，其中28-表雷帕霉素类似物的免疫抑制作用比雷帕霉素小0.01倍。
59.权利要求46-49，51，53或55-58中任何一项的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含至多三个相对于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置换。
60.权利要求50的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含一个相对于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置换。
61.权利要求52的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含一个相对于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置换。
62.权利要求54的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含一个相对于天然存在FKBP肽序列的氨基酸置换。
63.权利要求59的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含一个对于天然存在FKBP肽序列的苯丙氨酸-36的替换氨基酸。
64.权利要求60-63中任何一项的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FKBP区域的第一重组体核酸编码，该FKBP区域的肽序列包含一个对于天然存在FKBP肽序列的苯丙氨酸-36的替换氨基酸。
65.权利要求46-49，51，53，55-58或60-63中任何一项的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FRB的第二重组体核酸编码，该FRB的肽序列包含至多三个相对于天然存在FRB肽序列的氨基酸置换。
66.权利要求50的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FRB的第二重组体核酸编码，该FRB的肽序列包含一个相对于天然存在FRB肽序列的氨基酸置换。
67.权利要求52的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FRB的第二重组体核酸编码，该FRB的肽序列包含一个相对于天然存在FRB肽序列的氨基酸置换。
68.权利要求54的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FRB的第二重组体核酸编码，该FRB的肽序列包含一个相对于天然存在FRB肽序列的氨基酸置换。
69.权利要求59的方法，其中嵌合蛋白通过包含至少一个FRB的第二重组体核酸编码，该FRB的肽序列包含天然存在的FRB肽序列中的一个或多个Tyr2038，Phe2039，Thr2098，Gln2099，Trp2101或Asp2102的替换氨基酸。
70.权利要求46-69中任何一项的方法，其中至少一个嵌合蛋白质包含一个如下作用区域：DNA结合域，转录激活区域或与另一个包含至少一个这样的信号区域的蛋白二聚化时引发生长，增殖，分化或细胞程序死亡的细胞信号区域。
71.权利要求46-69中任何一项的方法，其中细胞生长在培养基中并通过在该培养基中加入28-表雷帕霉素类似物而与该28-表雷帕霉素类似物接触。
72.权利要求46-69中任何一项的方法，其中细胞存在于整体有机体中并通过使用28-表雷帕霉素类似物对该整体有机体给药而与该28-表雷帕霉素类似物接触。
73.权利要求72的方法，其中细胞是哺乳动物细胞而有机体是哺乳动物。
74.权利要求73的方法，其中细胞为灵长类来源的细胞而有机体为灵长类。
75.权利要求74的方法，其中灵长类是人。
76.权利要求73-75中任何一项的方法，其中28-表雷帕霉素类似物是口服给药。
77.产生包含式IV亚结构的28表，29表，或28，29双表化合物的方法，其中包括使式IV化合物处于合适的差向异构化条件并从反应混合物中回收需要的差向异构体
Figure A0081205100101
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