CN1690195A - 大豆脲酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的大豆脲酶－sUricase蛋白，编码sUricase蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种sUricase蛋白的方法。本发明还公开了编码这种sUricase蛋白的多核苷酸的用途。sUricase蛋白具有将脲酸分解成可溶性尿囊素的功能，是控制多数生物体内脲酸浓度的关键酶。

Description

大豆脲酶及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码大豆(Glycinemax)脲酶(soybean Uricase，简称为sUricase)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的蛋白。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白的用途和制备。

背景技术

脲酶是一种可将脲酸分解成可溶性尿囊素的生化酶，其催化的反应如下：

          

在自然情况下，正常人血中含有40～60mg/L的脲酸，三分之一来自饮食，三分之二来自身体的新陈代谢，正常人的尿酸可经由肾脏排泄和肠内细菌分解代谢排除。若代谢失常，会使血中脲酸量超过100mg/L，脲酸盐就会在关节出沉积而引起痛风。

痛风是一种古老的疾病，民间又称富贵病，今年来随着生活水平的提高和生活方式的改变，通风的发病率在全世界有普遍攀升的趋势，在中国更是剧增且呈年轻化趋势，以往患者以五、六十岁居多，现在则以四十岁左右的青壮年占最大群。目前虽有秋水仙素或类固醇类药物，但副作用大，且有部分病人对现有药物没有反应。

另一种脲酸过高的情况出现在癌症化疗病人中。化疗经常导致的一个严重副作用即肿瘤裂解症，当肿瘤细胞被化疗药物杀死时，肿瘤细胞内大量尿酸释放，血中尿酸浓度增高，肾脏负荷过重，大量尿酸结晶，最终导致肾衰竭。淋巴瘤和白血病人多发肿瘤裂解症，青少年患者中又为多见，乳腺癌和肺癌病人中也常发生。

针对以上两种尿酸过高引起的疾病，脲酶的作用是十分肯定的。早在1975年法国就开始在临床上常规使用天然脲酶以控制淋巴瘤和白血病治疗中的肿瘤裂解症，效果良好。但天然酶在部分病人中易引起过敏反应，且酶的提取纯化困难，因此重组型的脲酶(Rasburicase)即被开发。Rasburicase毒性较天然酶更有改善，疗效显著，故在2001年批准在法国上市，并于2002年七月通过美国FDA批准在美国上市。

更新一代的脲酶将是用PEG修饰的重组型脲酶。美国Duke大学与MountainView Pharmacutical公司联合开发了PEG-Uricase(命名为Puricase)，利用动物细胞来源的脲酶，经PEG化学偶联，具有更安全更长效的优点(WO 00/08196)。Puricase的开发目前由Savient Pharmaceutical公司进行，03年底已成功完成一期临床，药效明显，安全性好，目前正在进行二期临床，并被FDA批准为痛风治疗的孤儿药。

然而，目前的脲酶产品开发进展还远远不能满足需要，基于以往脲酶产品疗效好但免疫毒性过强的不足之处，因此，本领域迫切需要开发新的脲酶来源并对其进行优化改造。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的大豆脲酶sUricase蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些蛋白的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些蛋白的方法以及该蛋白和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的大豆脲酶sUricase蛋白，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有催化尿酸形成尿囊素的功能的由(a)衍生的蛋白。

更佳地，该蛋白是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些蛋白的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性；(a)编码上述sUricase蛋白的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中38-964位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1007位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有sUricase蛋白活性的蛋白的方法，该方法包含：(a)在适合表达sUricase蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有sUricase蛋白活性的蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的sUricase蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗sUricase蛋白活性的化合物，以及抑制sUricase蛋白的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是sUricase蛋白的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在sUricase蛋白的方法，它包括：将样品与sUricase蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在sUricase蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种降解尿酸的组合物，它含有有效量的本发明上述的sUricase蛋白以及可接受的载体。在另一优选例中，该组合物是药物组合物，它含有安全有效量的本发明的sUricase蛋白以及药学上可接受的载体。更佳地，所述的sUricase蛋白是与PEG等形成的偶联物。这些药物组合物可治疗痛风和肿瘤裂解症等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了pET25b/uricase的酶切鉴定图(1％琼脂糖凝胶)。泳道M：DNA标准；泳道1和2：两个克隆的酶切鉴定。质粒DNA用Nde1/EcorI切后得到将近1Kb的插入片段。

图2显示了脲酶的诱导表达结果(15％SDS-PAGE)。其中各泳道如下：

泳道M：蛋白质分子量标准；

泳道1：包涵体，37℃诱导；

泳道2：胞内可溶上清，37℃诱导；

泳道3：诱导前，37℃；

泳道4：包涵体，22℃诱导；

泳道5：胞内可溶上清，22℃诱导；

泳道6：诱导前，22℃。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，首次从大豆中分离出了一种大豆脲酶sUricase，并试验证明了该大豆脲酶具有很高的酶活性。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“sUricase蛋白”、“sUricase多肽”或“大豆脲酶sUricase”可互换使用，都指具有大豆脲酶sUricase氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的大豆脲酶sUricase。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的sUricase蛋白或多肽”是指sUricase多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化sUricase蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。sUricase多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括sUricase蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然sUricase蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“sUricase多肽”指具有sUricase蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与sUricase蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括sUricase蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与sUricase DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗sUricase多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含sUricase多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了sUricase多肽的可溶性片段。通常，该片段具有sUricase多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供sUricase蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然sUricase多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“sUricase蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                     表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码sUricase蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的sUricase核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或sUricase蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的sUricase多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码sUricase多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，sUricase多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含sUricase编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的sUricase蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗sUricase蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗sUricase蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组sUricase蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激sUricase蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对sUricase DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于sUricase基因产物或片段。较佳地，指那些能与sUricase基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制sUricase蛋白的分子，也包括那些并不影响sUricase蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的sUricase基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的sUricase基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达sUricase蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断sUricase蛋白功能的抗体以及不影响sUricase蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用sUricase基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与sUricase基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗sUricase蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的sUricase蛋白。

多克隆抗体的生产可用sUricase蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与sUricase蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于痛风方面的治疗。在使用本发明sUricase蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如秋水仙素或类固醇类等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明sUricase多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。一种优选的sUricase多肽是偶联物形式的多肽，例如与可降低脲酶的免疫原性并增长半衰期的不同分子量的PEG所形成的偶联物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的sUricase蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

能与sUricase蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对sUricase蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测sUricase蛋白水平的方法。这些方法是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。一种检测检测样品中是否存在sUricase蛋白的方法是利用sUricase蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与sUricase蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在sUricase蛋白。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从大豆中分离出的。其序列如SEQID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1007个碱基，其开放读框位于38-964位，编码全长为309个氨基酸的sUricase蛋白(SEQ ID NO：2)。本发明的大豆脲酶的核酸与蛋白序列与其他的脲酶完全不同。经PEG偶联后，本发明脲酶将同时具有毒性低，酶活高，半衰期长的优点，可应用于肿瘤裂解症和痛风，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

脲酶sUricase的克隆和表达

从大豆根瘤中提取总RNA，RNA的提取用Trizol试剂盒(购自invitrogen公司)。

用上述抽提的RNA为模板通过逆转录和PCR以获得脲酶基因，方法如下：逆转录反应中以随机引物为引物，用SuperScript II RNase H^-反转录酶(购自Invitrogen公司)反转录得到cDNA，再用特异引物(SEQ ID NO：3和4)及platinumTaq DNA polymerase High Fidelity(购自Invitrogen公司)扩增脲酶基因。

引物1：5’-gactcatatggctaagcaggaagtgg-3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’-gactgaattcctacagctttgaccaaagg-3’(SEQ ID NO：4)

用Nde1和EcoRI酶切上述PCR产物和质粒pET25b(购自Novagen公司)，然后连接，获得质粒pET25b-sUricase、转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒、经酶切鉴定得到正确构建的含脲酶基因的表达质粒(见图1)。对插入片段进行DNA测序，获得sUricase的核苷酸序列。

sUricase cDNA为1007bp(SEQ ID NO：1)，含有完整的开放性读框(38-964位)，编码含309氨基酸残基的多肽(SEQ ID NO：2)。

实施例2：sUricase蛋白重组表达

将实施例1中制备的质粒pET25b-sUricase转入常规的大肠杆菌BL21菌，挑表达sUricase的阳性BL21克隆接种于10ml LB培养基中，37℃250rpm振荡培养12-15hr，1∶100稀释于预热的LB培养基继续振荡培养2.5hr，加IPTG至终浓度0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，经离子交换和分子筛纯化得到sUricase。

结果如图2所示，在30KD左右的有一蛋白表达带。为增加表达蛋白中的可溶部分，对诱导温度进行了优化，结果发现在26℃诱导时可溶部分可占一半左右(图2)。

实施例3抗sUricase蛋白抗体的产生

将实施例2中获得的重组sUricase蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀sUricase蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，制备的抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例4

酶活测定

在293nm处监测尿酸吸光度的最大变化率，每隔20～30s记录一个数据。反应体系如下：PBS(pH7.4)，适当体积(40～80μl)粗酶溶液，尿酸终浓度0.13mmol/l，总体积3ml。

a.计算酶活

酶活定义：1分钟内催化尿酸为尿囊素的微摩尔数

C.测定结果，本发明的sUricase脲酶比活大于10U/ml。

实施例5

PEG化的大豆脲酶

按WO00/08196中实施例3中所述的方法制备PEG化的大豆脲酶，纯化的脲酶溶解于200mM磷酸钠缓冲液中(PH8.5)，用PEG20,000进行偶联，将PEG20,000与脲酶以30∶1(wt/wt)的比例混合，室温搅拌2小时，通过切向流渗透将未偶联的PEG去除，所得PEG-Uricase可在4℃稳定保存，并在实施例4相同方法测定其酶活。

结果表明，与实施例4相比，PEG化的大豆脲酶保留了80％的酶活性。

实施例6

降解尿酸的组合物

用常规的混合法，将1mg PEG-sUricase(实施例5制备)与10.5mg甘露醇，15.9mg L-丙氨酸，12.6mg Na₂HPO₄配制成单元制剂，经冰冻干燥以干粉形式保存，用1ml无菌水重组后可被用作静脉注射剂。

用常规的混合法，将1mg sUricase蛋白(实施例2制备)与10.5mg甘露醇，15.9mg L-丙氨酸，12.6mg Na₂HPO₄配制成单元制剂，经冰冻干燥以干粉形式保存，用1ml无菌水重组后可被用作静脉注射剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

文献：

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5.BRUCE A.BAETHGE，JACK WORK，MICHEL D.LANDRENEAU，and JOHN C.McDONALD.Tophaceous Gout in Patients with Renal Transplants Treated withCyclosporine A.The Journal of Rheumatology 1993；20：4.

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7.SUSAN J.KELLY，MARIELLE DELNOMDEDIEU，MICHAEL I.OLIVERIO，L.DAVIDWILLIAMS，MARK G.P.SAIFER，MERRY R.SHERMAN，THOMAS M.COFFMAN，G.ALLANJOHNSON，and MICHAEL S.HERSHFIELD.Diabetes Insipidus in Uricase-Deficient Mice：A Model for Evaluating Therapy with Poly(Ethylene Glycol)-Modified Uricase.J Am Soc Nephrol 12：1001-1009，2001.

                        序列表

<110>上海单抗制药技术有限公司

<120>大豆脲酶及其应用

<130>042142

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1007

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<221>CDS

<222>(38)..(964)

<223>

<400>1

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacat atg gct aag cag gaa gtg    55

                                         Met Ala Lys Gln Glu Val

                                         1               5

gtg gaa ggg ttc aag ttc gag cag agg cac ggg aaa gaa cgc gtg aga    103

Val Glu Gly Phe Lys Phe Glu Gln Arg His Gly Lys Glu Arg Val Arg

            10                  15                  20

gtg gcg cgc gtg tgg aag acg agg cag ggg cag cac ttc att gtg gag    151

Val Ala Arg Val Trp Lys Thr Arg Gln Gly Gln His Phe Ile Val Glu

        25                  30                  35

tgg cgc gtg ggg atc act ctc ttt tcg gat tgc gtc aac tcg tac ctc    199

Trp Arg Val Gly Ile Thr Leu Phe Ser Asp Cys Val Asn Ser Tyr Leu

    40                  45                  50

cgc gat gac aac tct gac atc gtt gct act gat acc atg aaa aac acc    247

Arg Asp Asp Asn Ser Asp Ile Val Ala Thr Asp Thr Met Lys Asn Thr

55                  60                  65                  70

gtg tat gca aaa gca aag gaa tgc tct gac ata ctt tct gcc gag gag    295

Val Tyr Ala Lys Ala Lys Glu Cys Ser Asp Ile Leu Ser Ala Glu Glu

                75                  80                  85

ttt gct att ctg ctt gct aag cac ttt gta tca ttt tac cag aag gtt    343

Phe Ala Ile Leu Leu Ala Lys His Phe Val Ser Phe Tyr Gln Lys Val

            90                  95                  100

act ggt gct att gtg aat att gtg gaa aaa cca tgg gag cgt gtc act    391

Thr Gly Ala Ile Val Asn Ile Val Glu Lys Pro Trp Glu Arg Val Thr

        105                 110                 115

gtg gat ggt caa cct cat gaa cat ggt ttc aaa ctt ggg tct gag aag    439

Val Asp Gly Gln Pro His Glu His Gly Phe Lys Leu Gly Ser Glu Lys

    120                 125                 130

cat aca aca gag gcg ata gta caa aag tct ggt tca ctt cag ttg act    487

His Thr Thr Glu Ala Ile Val Gln Lys Ser Gly Ser Leu Gln Leu Thr

135                 140                 145                 150

tct ggt att gaa gga ttg tca gtg ttg aag aca acc cag tct ggt ttt    535

Ser Gly Ile Glu Gly Leu Ser Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe

                155                 160                 165

gtg aat ttc ata aga gac aag tac aca gca ctt cct gat acc cgt gaa    583

Val Asn Phe Ile Arg Asp Lys Tyr Thr Ala Leu Pro Asp Thr Arg Glu

            170             175                     180

agg atg gta gca aca gaa gta acc gca ctg tgg agg tat tcg tat gaa    631

Arg Met Val Ala Thr Glu Val Thr Ala Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Glu

        185                 190                 195

tcg ctg tat agc ctc cct cag aag ccg ctt tac ttt aca gaa aag tat    679

Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Gln Lys Pro Leu Tyr Phe Thr Glu Lys Tyr

    200                 205                 210

cag gaa gtg aaa aaa gtt ctg gct gac act ttt ttt ggc cca cca aaa    727

Gln Glu Val Lys Lys Val Leu Ala Asp Thr Phe Phe Gly Pro Pro Lys

215                 220                 225                 230

ggg gga gtc tat acg cca tct gtt caa aac aca ctc tac ctg atg gca    775

Gly Gly Val Tyr Thr Pro Ser Val Gln Asn Thr Leu Tyr Leu Met Ala

                235                 240                 245

aag gcc aca ctg aac aga ttt cct gac ata gct tat gtc agt cta aag    823

Lys Ala Thr Leu Asn Arg Phe Pro Asp Ile Ala Tyr Val Ser Leu Lys

            250                 255                 260

ttg cca aat ctt cat ttc ata cct gtc aat atc tca aac cag gat ggc    871

Leu Pro Asn Leu His Phe Ile Pro Val Asn Ile Ser Asn Gln Asp Gly

        265                 270                 275

cct att gtg aag ttt gag gat gat gtg tac ttg cca acg gat gag cca    919

Pro Ile Val Lys Phe Glu Asp Asp Val Tyr Leu Pro Thr Asp Glu Pro

    280                 285                 290

cat ggg tca att caa gct agt ttg agc cgc ctt tgg tca aag ctg    964

His Gly Ser Ile Gln Ala Ser Leu Ser Arg Leu Trp Ser Lys Leu

295                 300                 305

taggaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gag                1007

<210>2

<211>309

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>2

Met Ala Lys Gln Glu Val Val Glu Gly Phe Lys Phe Glu Gln Arg His

1               5                   10                  15

Gly Lys Glu Arg Val Arg Val Ala Arg Val Trp Lys Thr Arg Gln Gly

            20                  25                  30

Gln His Phe Ile Val Glu Trp Arg Val Gly Ile Thr Leu Phe Ser Asp

        35                  40                  45

Cys Val Asn Ser Tyr Leu Arg Asp Asp Asn Ser Asp Ile Val Ala Thr

    50                  55                  60

Asp Thr Met Lys Asn Thr Val Tyr Ala Lys Ala Lys Glu Cys Ser Asp

65                  70                  75                  80

Ile Leu Ser Ala Glu Glu Phe Ala Ile Leu Leu Ala Lys His Phe Val

                85                  90                  95

Ser Phe Tyr Gln Lys Val Thr Gly Ala Ile Val Asn Ile Val Glu Lys

            100                 105                 110

Pro Trp Glu Arg Val Thr Val Asp Gly Gln Pro His Glu His Gly Phe

        115                 120                 125

Lys Leu Gly Ser Glu Lys His Thr Thr Glu Ala Ile Val Gln Lys Ser

    130                 135                 140

Gly Ser Leu Gln Leu Thr Ser Gly Ile Glu Gly Leu Ser Val Leu Lys

145                 150                 155                 160

Thr Thr Gln Ser Gly Phe Val Asn Phe Ile Arg Asp Lys Tyr Thr Ala

                165                 170                 175

Leu Pro Asp Thr Arg Glu Arg Met Val Ala Thr Glu Val Thr Ala Leu

            180                 185                 190

Trp Arg Tyr Ser Tyr Glu Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Gln Lys Pro Leu

        195                 200                 205

Tyr Phe Thr Glu Lys Tyr Gln Glu Val Lys Lys Val Leu Ala Asp Thr

    210                 215                  220

Phe Phe Gly Pro Pro Lys Gly Gly Val Tyr Thr Pro Ser Val Gln Asn

225                 230                 235                 240

Thr Leu Tyr Leu Met Ala Lys Ala Thr Leu Asn Arg Phe Pro Asp Ile

                245                 250                 255

Ala Tyr Val Ser Leu Lys Leu Pro Asn Leu His Phe Ile Pro Val Asn

            260                 265                 270

Ile Ser Asn Gln Asp Gly Pro Ile Val Lys Phe Glu Asp Asp Val Tyr

        275                 280                 285

Leu Pro Thr Asp Glu Pro His Gly Ser Ile Gln Ala Ser Leu Ser Arg

    290                 295                 300

Leu Trp Ser Lys Leu

305

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gactcatatg gctaagcagg aagtgg                                       26

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gactgaattc ctacagcttt gaccaaagg                                      29

Claims (10)

1.一种分离的大豆脲酶sUricase蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有分解尿酸形成尿囊素的功能的由(a)衍生的蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(a)编码如权利要求1所述蛋白的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中38-964位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1007位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出大豆脲酶sUricase蛋白。

9.一种能与权利要求1所述的大豆脲酶sUricase蛋白特异性结合的抗体。

10.一种降解尿酸的组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的蛋白以及药学上可接受的载体。