CN104583387A

CN104583387A - 粟酒裂殖酵母突变体的转化体、以及克隆载体

Info

Publication number: CN104583387A
Application number: CN201380044077.2A
Authority: CN
Inventors: 小林真弓; 东田英毅; 木村修一郎; 禅院进; 原太志
Original assignee: Asahi Glass Co Ltd
Current assignee: AGC Inc
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2033-08-20
Also published as: CN104583387B; EP2886642A1; EP2886642A4; US20150240250A1; JP6206408B2; EP2886642B1; JPWO2014030644A1; US9765347B2; WO2014030644A1

Abstract

本发明提供一种不需要繁杂的分离工序就可生产、回收β-葡糖苷酶的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，以及对裂殖酵母属酵母的转化有用的载体。本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，是Gsf活性增大且丙酮酸转移酶Pvg1的酶活性下降或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces？pombe)突变体的转化体，其特征在于，在染色体中或者作为染色体外基因，具有来源于丝状真菌的编码β-葡糖苷酶的结构基因序列以及用于表达该结构基因的启动子序列及终止子序列。进一步，本发明涉及以具备hsp9基因所具有的启动子或ihc1基因所具有的启动子为特征的、对裂殖酵母属酵母的转化有用的克隆载体、表达载体、转化体等。

Description

粟酒裂殖酵母突变体的转化体、以及克隆载体

技术领域

本发明涉及具有无性絮凝性，可生产β-葡糖苷酶的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)突变体的转化体，以及对裂殖酵母属酵母的转化有用的载体。

背景技术

为了由木材、稻草、稻壳、杂草等纤维素类生物质生产作为发酵原料的糖，进而生产生物乙醇等生物质燃料，需要对作为植物细胞壁的主要构成成分的纤维素进行分解。纤维素的分解有浓硫酸糖化法、稀硫酸糖化法等酸糖化法，利用酶的酶糖化法等方法，在近年来生物技术的兴盛的背景下，进行了大量酶糖化法的研究开发。

纤维素的酶糖化利用总称为纤维素酶的一类酶。首先，具有随机切割纤维素链的活性的内切葡聚糖酶(EG)分解纤维素的非结晶区域，使葡萄糖末端暴露。利用纤维二糖水解酶(CBH)分解暴露的葡萄糖末端，使纤维二糖游离。接着，利用β-葡糖苷酶(BGL)分解游离的纤维二糖，从而使葡萄糖游离。

由于可生产用于分解、糖化结晶纤维素的各种纤维素酶以及半纤维素酶，且可将这些酶大量分泌至细胞外，因此纤维素的酶糖化广泛使用曲霉属、木霉属等的丝状真菌。

此外，也尝试了使这些丝状真菌的纤维素酶在异株中表达，非专利文献1中公开了通过编码作为丝状真菌的一种的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡糖苷酶I(BGLI)的基因来转化出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在得到的转化体中使这些酶表达。

但是，在酶糖化法的情况下，如果通过酶进行纤维素的水解反应，葡萄糖积蓄在反应体系内，则积蓄的葡萄糖抑制β-葡糖苷酶，纤维二糖积蓄，进而积蓄的纤维二糖抑制内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，其结果是存在纤维素不能完全分解的问题。为此，希望β-葡糖苷酶的高功能化。

另一方面，与曲霉属以及木霉属相比，裂殖酵母属酵母的基因分析不断深入，确立了各种的有用的突变体以及基因导入用载体，有适合工业大量生产蛋白质的优点。但是，裂殖酵母属酵母不具有固有的β-葡糖苷酶基因，不能同化纤维二糖。本发明人用编码β-葡糖苷酶的基因转化裂殖酵母属酵母，在得到的转化体中使这些酶表达(专利文献1)。

另外，非专利文献1中，完全没有涉及出芽酵母所生产的β-葡糖苷酶的葡萄糖抑制。

另一方面，为了回收通过该转化体而分泌的β-葡糖苷酶，需要分离培养基上清和菌体的工序。作为分离工序，可例举离心分离、连续离心分离、膜分离等工序，任一种均为繁杂的工序，需要大量的人力和时间。

进一步，随着β-葡糖苷酶的生产规模的扩大，不难预想该分离工序的繁杂性的增大。

与此相对，由于具有无性絮凝性(无性地进行絮凝的性质)的酵母可以容易地从培养结束后的培养液分离出絮凝的酵母菌体和培养液，因此在β-葡糖苷酶的生产中优选将具有无性絮凝性的酵母作为宿主。

作为具有无性絮凝性的酵母，已知出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中的FLO突变体。此外，在裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(以下也称粟酒裂殖酵母)中也报道了具有无性絮凝性的突变体(例如，参照专利文献2)。

而且另一方面，以粟酒裂殖酵母为首的裂殖酵母属酵母是与出芽酵母Saccharomyces cerevisiae在进化系统上完全不同的酵母。已知染色体结构、基因组复制机制、RNA剪接机制、转录机制、翻译后修饰等各机制与其它酵母差别较大，其一部分与动物细胞类似。因此被广泛用作真核生物的模型(参照非专利文献2)。

粟酒裂殖酵母由于其各种特征，因此被视作更接近高等动物细胞的单细胞真核生物，被认为是作为外源基因、尤其是来源于高等动物的基因的表达用宿主非常有用酵母。已知尤其适合来源于包括人类在内的动物细胞的基因的表达(参照专利文献3～9)。

为了将粟酒裂殖酵母作为宿主使来源于外源结构基因的蛋白质表达，通常需要促进编码该蛋白质的外源结构基因的转录的启动子。作为该启动子，有粟酒裂殖酵母本身具有的基因中的启动子，和其它生物或病毒所具有的启动子。

作为将粟酒裂殖酵母作为宿主的蛋白质表达中所利用的启动子，粟酒裂殖酵母本身具有的基因中的启动子可例举乙醇脱氢酶(adh1)基因启动子、硫胺素代谢相关的nmt1基因启动子、葡萄糖代谢相关的果糖-1，6-二磷酸酶(fbp1)基因启动子、分解代谢物阻抑相关的转化酶(inv1)基因的启动子(参照专利文献7或10)、热休克蛋白基因启动子(参照专利文献11)等。此外还已知hCMV、SV40、CaMV(组成型表达)等病毒的启动子(参照专利文献4、6或12)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2012/060389号

专利文献2：日本专利特开2000－106867号公报

专利文献3：日本专利特许第2776085号公报

专利文献4：日本专利特开平07-163373号公报

专利文献5：国际公开第96/23890号

专利文献6：日本专利特开平10-234375号公报

专利文献7：日本专利特开平11-192094号公报

专利文献8：日本专利特开2000－136199号公报

专利文献9：日本专利特开2000－262284号公报

专利文献10：国际公开第99/23223号

专利文献11：国际公开第2007/26617号

专利文献12：日本专利特开平5-15380号公报

非专利文献

非专利文献1：G.Tanaka等,Biosci.Biotechnol.Biochem.,62(8),1615-1618,1998.

非专利文献2：Giga-Hama和Kumagai,eds.,裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中的外源基因表达(Foreign gene expression infission yeast Schizosaccharomyces pombe),Springer-Verlag,(1997).

发明内容

发明所要解决的技术问题

在酵母的培养中，有时培养液的pH会转为酸性。尤其是，在大量合成分泌性的酸性蛋白质的情况下，多数情况下培养结束时的培养液的pH变为2～5的酸性。此外，在酵母的培养中，在考虑到目标蛋白质的生产性的情况下，有时培养时的最适pH低于5。

为此，例如在虽然在pH大于5的较高pH的培养液中具有絮凝性、但在pH2～5的酸性条件下则不絮凝的情况下，为了使酵母絮凝，必须在培养结束后进行将pH调整为中性附近的中和处理。

专利文献1所记载的酵母为具有无性絮凝性的粟酒裂殖酵母突变体，认为适合作为上述表达系统的宿主。但是，虽然确认了该粟酒裂殖酵母突变体在YPD培养基(通常，pH5.6～6.0)中无性絮凝，但在酸性条件下是否也具有足够的絮凝性尚不明确。

于是本发明提供一种不需要繁杂的分离工序就可生产、回收β-葡糖苷酶的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，以及使用该转化体的β-葡糖苷酶的制造方法。

此外，本发明该提供新型启动子相关的、将裂殖酵母属酵母作为宿主在基因工程中可高效表达的来源于外源基因的蛋白质的表达载体，用于制作该表达载体的克隆载体，该表达载体的制造方法，包含该表达载体的转化体，该转化体的制造方法，以及使用该转化体的蛋白质的制造方法。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，是Gsf活性增大且丙酮酸转移酶Pvg1的酶活性下降或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)突变体的转化体，其特征在于，在染色体中或者作为染色体外基因，具有来源于丝状真菌的编码β-葡糖苷酶的结构基因序列以及用于表达该结构基因的启动子序列及终止子序列。

此外，本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体中，上述β-葡糖苷酶优选BGL1。

此外，本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体中，上述丝状真菌优选曲霉(Aspergillus)属的微生物。

此外，本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体中，上述β-葡糖苷酶优选由序列编号1所示的氨基酸序列构成，或者由在该氨基酸序列内有1个以上的氨基酸发生了缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的β-葡糖苷酶。

而且，本发明β-葡糖苷酶的制造方法的特征在于，对上述转化体进行培养，从得到的菌体或培养液上清中获得β-葡糖苷酶。

以下，将具有上述编码β-葡糖苷酶的结构基因序列的转化体的本发明称为本发明的第一实施方式。

本发明的克隆载体的特征在于，具备：裂殖酵母属酵母的hsp9基因所具有的启动子或者ihc1基因所具有的启动子，位于该启动子的下游且受到该启动子控制的用于导入外源结构基因的克隆位点，以及可在裂殖酵母属酵母内起作用的终止子。

hsp9基因所具有的启动子(以下，也称为hsp9启动子)优选包括hsp9基因的ORF的5’末端的上游1～400bp的区域，更优选由序列编号6所表示的碱基序列或在该碱基序列中有1个以上的碱基发生了取代、缺失或添加的碱基序列构成，且具有启动子活性。

ihc1基因所具有的启动子(以下，也称为ihc19启动子)优选包括ihc19基因的ORF(开放阅读框)的5’末端的上游1～501bp的区域，更优选由序列编号9所表示的碱基序列或在该碱基序列中有1个以上的碱基发生了取代、缺失或添加的碱基序列构成，且具有启动子活性。

本发明的表达载体的制造方法的特征在于，在上述克隆载体中的克隆位点上导入外源结构基因，本发明的表达载体是在上述克隆载体中的克隆位点上导入有外源结构基因的表达载体。

本发明的转化体的制造方法的特征在于，将上述表达载体导入裂殖酵母属酵母，本发明的转化体是含有上述表达载体的转化体。

本发明蛋白质的制造方法的特征在于，对上述转化体进行培养，从得到的菌体或培养液上清中取得上述外源结构基因所编码的蛋白质。

以下，将涉及上述具有hsp9启动子或ihc1启动子的克隆载体、表达载体以及转化体的本发明，以及涉及上述表达载体的制造方法、转化体的制造方法以及蛋白质的制造方法的本发明称为本发明的第二实施方式。

发明的效果

如果采用本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，可在不需要繁杂的分离工序的情况下生产、回收β-葡糖苷酶。

附图说明

图1是表达载体pSL6AaBGL1的结构图。

图2是表达载体pSL6P3AaBGL1的结构图。

图3是表达载体pSL14P3AaBGL1的结构图。

图4是表达载体pUC19-ura4的结构图。

图5是表示试验例8中的通常株以及絮凝株的菌体增殖的图表。

图6(a)是表示试验例8中的通常株以及絮凝株的培养液中的葡萄糖浓度的图表。图6(b)是表示试验例8中的通常株以及絮凝株的培养液中的乙醇浓度的图表。

图7是表示试验例9中的通常株以及絮凝株的AaBGL1的pNPG分解活性的图表。

图8是表示试验例10中的通常株以及絮凝株的菌体增殖的图表。

图9(a)是表示试验例10中的通常株以及絮凝株的培养液中的葡萄糖浓度的图表。图9(b)是表示试验例10中的通常株以及絮凝株的培养液中的乙醇浓度的图表。

图10是表示试验例11中的通常株以及絮凝株的沉淀状态的照片。

图11是表示试验例11中的通常株以及絮凝株的镜检观察结果的照片。

图12是表示试验例12中的30℃以及34℃下的菌体增殖的图表。

图13A是表示试验例12中的30℃以及34℃下的培养液中的葡萄糖浓度的图表。

图13B是表示试验例12中的30℃以及34℃下的培养液中的乙醇浓度的图表。

图14是表示试验例12中的30℃以及34℃下的AaBGL1的pNPG分解活性的图表。

图15是表示试验例13中的SDS-PAGE的结果的照片。

图16是表达载体pSL14-EGFP的结构图。

图17是表达载体pSL6-EGFP的结构图。

图18是表示试验例14中的各培养液的荧光强度(将SL6E株的培养液的荧光强度设为1的情况下的相对值)的测定结果的图。

图19是多克隆载体pSL6的结构图。

图20是多克隆载体pSL12的结构图。

图21是多克隆载体pSL17的结构图。

图22是表达载体pSL12-EGFP的结构图。

图23是表示试验例15中的各培养液的[荧光强度/OD600]的经时变化的测定结果的图。

图24是多克隆载体pSL9的结构图。

图25是多克隆载体pSL14的结构图。

图26是多克隆载体pSL14lacZ的结构图。

具体实施方式

本说明书中“外源结构基因”是指表达载体所具有的、编码蛋白质的基因，可以是导入表达载体的宿主本身具有的结构基因，也可以与宿主异种的生物的结构基因。

本说明书中“来源于外源结构基因的蛋白质”是指转化体所产生的来源于外源结构基因的蛋白质，以下也称为“外源蛋白质”。另外，在外源结构基因为与宿主异种的生物的结构基因的情况下，也称为异种蛋白质。

首先，对本发明的第一实施方式进行说明。

[粟酒裂殖酵母突变体]

本发明中，作为粟酒裂殖酵母突变体的转化体的宿主的粟酒裂殖酵母突变体，是粟酒裂殖酵母的基因的至少一部分发生改变后、Gsf活性增大、且丙酮酸转移酶Pvg1的酶活性下降或失活的突变体。在粟酒裂殖酵母中，如果Gsf活性增大、且Pvg1的酶活性下降或失活，则即使在酸性条件下也可获得无性絮凝的特性。以下，将在酸性条件下进行无性絮凝的性质称为耐酸性无性絮凝性。

即，本发明中的粟酒裂殖酵母突变体是获得了耐酸性无性絮凝性的突变体。

本发明中，“无性絮凝性”是指具有与粟酒裂殖酵母本身具有的有性地絮凝的性质(有性絮凝性)不同的絮凝性的性质。但是，并不意味着丧失本身具有的有性絮凝性。此外，“组成型絮凝性”是指和无性絮凝性相同的性质，但特指在增殖过程中与增殖同时进行(无性地)絮凝的性质。

本发明中，“Gsf活性”是指粟酒裂殖酵母在通常培养的pH(例如，pH5～6)下显示的无性絮凝性。此外，与Gsf活性相关的基因称为絮凝素基因。

gsf2基因在粟酒裂殖酵母中是絮凝素基因。粟酒裂殖酵母的gsf2基因的系统名为SPCC1742.01。

Pvg1为丙酮酸转移酶。编码粟酒裂殖酵母的Pvg1的pvg1基因的系统名为SPAC8F11.10c。

另外，粟酒裂殖酵母的染色体的全碱基序列在Sanger研究所的数据库“GeneDB”中作为“Schizosaccharomyces pombe GeneDB(http://www.genedb.org/genedb/pombe/)”被收录、公开。本说明书记载的粟酒裂殖酵母的基因的序列数据可以通过基因名或系统名在上述数据库中进行检索获得。

粟酒裂殖酵母原本具有信息素诱导的有性絮凝性。例如，在增殖过程中如果引起营养不足则容易产生有性絮凝。但是，在通过槽罐培养等的人工的大量培养中，由于在具有通常而言足量营养的培养液中进行培养，因此很少发生有性絮凝。另一方面，由于本发明中的粟酒裂殖酵母突变体具有无性絮凝性，因此即使在具有足量营养的培养液中进行培养，增殖的同时会也发生絮凝(组成型絮凝)。

粟酒裂殖酵母突变体的Gsf活性例如可通过增大gsf2基因的表达量来使其增大。此外，粟酒裂殖酵母的Pvg1的酶活性可通过使编码Pvg1的pvg1基因缺失、或在该基因上导入使Pvg1的酶活性下降或失活的突变来使其下降或失活。

为此，本发明中的粟酒裂殖酵母突变体可通过基因工程方法，将野生株等不具有耐酸性无性絮凝性的粟酒裂殖酵母作为宿主，利用基因工程方法，整合外源的gsf2基因并使编码Pvg1的基因缺失、或在该基因上导入使Pvg1的酶活性下降或失活的突变进行制造。

gsf2基因的表达量可通过用基因工程方法整合外源的gsf2基因来使其增大。在宿主内重新导入gsf2基因是重要的，导入的gsf2基因可以与宿主的内源性gsf2基因同种，也可以是来源于异种生物的gsf2基因。

作为通过基因工程方法在宿主内导入gsf2基因的方法，可使用公知的方法。作为将粟酒裂殖酵母作为宿主，在其中导入外源的结构基因的方法，例如可使用日本专利特开平5-15380号公报、国际公开第95/09914号文本、日本专利特开平10-234375号公报、日本专利特开2000-262284号公报、日本专利特开2005-198612号公报、国际公开第2010/087344号公报等中记载的方法。

gsf2基因优选被导入粟酒裂殖酵母的染色体中。通过在染色体中导入gsf2基因，可得到传代的维持稳定性优良的转化体。此外，还可以在染色体中导入多个gsf2基因。通过导入多个gsf2基因，可提高gsf2基因的表达效率。粟酒裂殖酵母突变体中，被整合到染色体中的gsf2基因的数量优选1～20，更优选1～8。

作为在染色体中导入gsf2基因的方法，可使用公知的方法。例如，可用上述日本专利特开2000-262284号公报中记载的方法在染色体中导入多个gsf2基因。此外，还可以用该方法在染色体中导入1个gsf2基因。此外，如后所述，还可以在染色体的多处导入1个或多个gsf2基因。

作为将gsf2基因导入粟酒裂殖酵母的染色体中的方法，优选使用具有包含gsf2基因的表达盒和重组位点的载体(以下，称为gsf2载体)、通过同源重组法导入的方法。

gsf2载体具有包含gsf2基因的表达盒以及重组位点。

表达盒是为了表达Gsf2所必需的DNA的组合，包括gsf2基因和在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子和在粟酒裂殖酵母内起作用的终止子。而且，可以包括5’-非翻译区域，3’-非翻译区域的任意1种以上。而且，可以包括营养缺陷型互补标记。优选表达盒是包括gsf2基因、启动子、终止子、5’-非翻译区域、3’-非翻译区域、营养缺陷型互补标记的表达盒。表达盒中也可以存在多个gsf2基因。表达盒中的gsf2基因的数量优选1～8，更优选1～5。

在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子和终止子只要在酸性条件下也能够在转化而得的突变体内起作用并维持Gsf2的表达即可。作为在粟酒裂殖酵母内起作用的启动子，可使用粟酒裂殖酵母本身具有的启动子(优选转录起始活性高的启动子)或粟酒裂殖酵母本身不具有的启动子(来源于病毒的启动子等)。载体内可存在2种以上的启动子。

作为粟酒裂殖酵母本身具有的启动子，例如可例举乙醇脱氢酶基因启动子、硫胺素代谢相关的nmt1基因启动子、葡萄糖代谢相关的果糖-1，6-二磷酸酶基因启动子、分解代谢物阻抑相关的转化酶基因的启动子(参照国际公开第99/23223号文本)、热休克蛋白基因启动子(参照国际公开第2007/26617号文本)等。作为粟酒裂殖酵母本身不具有的启动子，例如可例举日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于动物细胞病毒的启动子等。该启动子中，优选表达效率良好的nmt1基因启动子及其改变启动子(例如，nmt1+、nmt41)、hCMV启动子、SV40启动子。

另外，还优选使用后述的本发明的第二实施方式中的hsp9启动子或ihc1启动子。

作为在粟酒裂殖酵母内起作用的终止子，可使用粟酒裂殖酵母本身具有的终止子或粟酒裂殖酵母本身不具有的终止子。载体内可存在2种以上的终止子。

作为终止子，例如可例举日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于人类的终止子，优选人脂皮质蛋白I的终止子。

载体的重组位点是具有能够与粟酒裂殖酵母的染色体中的同源重组的靶位点进行同源重组的碱基序列的部位。另外，靶位点是在粟酒裂殖酵母的染色体内整合表达盒的目标位点。靶位点可通过将载体的重组位点的碱基序列设为与该靶位点进行同源重组的碱基序列来自由设定。

上述重组位点的碱基序列和靶位点的碱基序列的同源性必须为70％以上。此外，从容易发生同源重组的方面考虑，重组位点的碱基序列和靶位点的碱基序列的同源性优选设为90％以上，更优选设为95％以上。通过使用具有这样的重组位点的载体，通过同源重组将表达盒整合到靶位点。

重组位点的长度(碱基数)优选20～2000bp。如果重组位点的长度在20bp以上，则容易发生同源重组。另外，如果重组位点的长度在2000bp以下，则容易防止载体变得过长而难以发生同源重组的问题。重组位点的长度更优选100bp以上，进一步优选200bp以上。此外，重组位点的长度更优选800bp以下，进一步优选400bp以下。

载体可以在上述表达盒和重组位点以外具有其他的DNA区域。例如可例举在大肠杆菌内的复制所必需的称为“ori”的复制起始区域、抗生素抗性基因(新霉素抗性基因等)等。这些在使用大肠杆菌构建载体的情况下通常而言是必需的基因。但是，如后所述，优选在如后所述将载体整合到宿主的染色体中时除去上述复制起始区域。

载体是具有环状DNA结构或线状DNA结构的载体，在导入到粟酒裂殖酵母的细胞中时优选以线状DNA结构进行导入。即，在为通常使用的质粒DNA等具有环状DNA结构的载体的情况下，优选用限制酶将载体切开为线状后导入粟酒裂殖酵母细胞中。

在该情况下，切开具有环状DNA结构的载体的位置设在重组位点内。藉此，在切开的载体的两端分别部分存在重组位点，通过同源重组将整个载体整合到染色体的靶位点。

如果能够将载体制成两端分别存在重组位点的一部分的线状DNA结构，则也可以用将具有环状DNA结构的载体切开的方法以外的方法进行构建。

作为载体，例如可适当使用pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等来源于大肠杆菌的质粒。

在该情况下，用于同源重组时的质粒载体优选除去在大肠杆菌内的复制所必需的称为“ori”的复制起始区域。藉此，可提高将上述载体整合到染色体时的整合效率。

对除去了复制起始区域的载体的构建方法没有特别限定，优选使用日本专利特开2000-262284号公报中记载的方法。即，优选预先构建在重组位点内的切割位置上插入了复制起始区域的前体载体、在如前所述制成线状DNA结构的同时切除复制起始区域的方法。藉此，可简便地得到除去了复制起始区域的载体。

此外，也可以是如下所述的方法：使用日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、国际公开第96/23890号文本、日本专利特开平10-234375号公报等中记载的表达载体及其构建方法，构建具有表达盒以及重组位点的前体载体，进一步用常规的基因工程手法从该前体载体除去复制起始区域，得到用于同源重组的载体。

整合载体的靶位点可在粟酒裂殖酵母的染色体中仅存在1个，也可以存在2个以上。靶位点存在2个以上的情况下，可在粟酒裂殖酵母的染色体中整合2个以上载体。此外，在表达盒中的gsf2基因为多个的情况下，可在1个靶位点上整合多个gsf2基因。而且，也可以在2种以上的靶位点中使用具有分别对应于各靶位点的重组位点的2种以上的载体，整合表达盒。

在1个靶位点上整合表达盒的情况下，例如可使用日本专利特开2000-262284号公报中记载的靶位点。可使用具有不同的整合部位的2种以上的载体，在不同的靶位点上分别整合载体。但是，在染色体的2个以上位置整合载体的情况下，该方法繁杂。

如果可以将在染色体中存在于多个位置且实质上彼此相同的碱基序列部分作为靶位点，在该多个位置的靶位点上分别整合载体，则可使用1种载体在染色体的2个以上位置整合载体。实质上彼此相同的碱基序列是指碱基序列的同源性在90％以上。优选靶位点之间的同源性在95％以上。此外，实质上彼此相同的碱基序列的长度是包括上述载体的重组位点的长度，优选1000bp以上。与在1个靶位点上整合多个gsf2基因的情况相比，即使gsf2基因的整合数量相同，在存在于多个位置的靶位点上分散整合gsf2基因的情况下，转化体增殖时gsf2基因从染色体上一下子全都脱落的可能性变小，转化体在传代中的维持稳定性提高。

作为在染色体中存在于多个位置的靶位点，优选转座子基因Tf2。Tf2是在粟酒裂殖酵母的3条(单倍体)染色体上分别存在共计13个的转座子基因，长度(碱基数)约4900bp，已知这些基因间的碱基序列同源性为99.7％(参照下述文献)。

Nathan J.Bowen et al,“Retrotransposons and Their Recognition ofpol II Promoters：A ComprehensiveSurvey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”,Genome Res.2003 13：1984－1997

可以仅将载体整合到在染色体中存在于13个位置的Tf2中的1个上。在该情况下，通过整合具有2个以上gsf2基因的载体，可得到具有2个以上gsf2基因的转化体。此外，通过在2个以上的Tf2上整合载体，可得到具有2个以上gsf2基因的转化体。在该情况下，通过整合具有2个以上gsf2基因的载体，可得到具有更多gsf2基因的转化体。如果在13个Tf2上全部整合载体，则对转化体的生存或增殖造成的负担可能会过大。优选在13个Tf2中的8个以下上整合载体，更优选在5个以下上整合载体。

在通过基因工程方法制造本发明中的粟酒裂殖酵母突变体的情况下作为宿主使用的粟酒裂殖酵母，优选具有用于选择转化体的标记。例如，优选使用某基因缺失而在生长中需要特定营养成分的宿主。通过在载体中整合该缺失的基因(营养缺陷型互补标记)，转化体中宿主的营养缺陷消失。

通过该宿主和转化体的营养缺陷型的不同，可区分两者，得到转化体。

例如，将乳清苷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活的尿嘧啶缺陷型粟酒裂殖酵母作为宿主，通过具有ura4基因(营养缺陷型互补标记)的载体进行转化后，通过选择尿嘧啶缺陷型消失的细胞，可得到整合了载体的转化体。由于宿主中缺失而导致营养缺陷的基因只要是可用于转化体的选择即可，不限于ura4基因，也可以是异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。

通常，进行同源重组后，选择得到的转化体。作为选择的方法，例如可例举以下示出的方法。利用可通过上述营养缺陷型标记来选择转化体的培养基进行筛选，从得到的菌落中选择出多个菌落。接着，将这些分别进行液体培养后，考察各自的菌体每单位的gsf2基因的表达量，选择该表达量较多的突变体。此外，通过对这些选择出的突变体进行基于脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察出整合到染色体中的载体数以及表达盒数。

染色体中整合的载体数可通过调整整合条件等进行某种程度的调整，但认为根据载体的大小(碱基数)以及结构，整合效率以及整合数量也会变化。

通过用基因工程方法使pvg1基因缺损、或在pvg1基因中导入使Pvg1的酶活性下降或失活的突变，可使作为宿主的粟酒裂殖酵母的Pvg1的酶活性下降或失活。为了可以确实地使Pvg1的酶活性失活，优选使pvg1基因自身从染色体中缺损。

pvg1基因的缺失或失活可用公知的方法进行。例如，可通过使用Latour法(Nucreic Acids Res杂志，2006年，34卷，e11页，国际公开第2007/063919号文本等中记载)使pvg1基因缺失。

此外，通过使pvg1基因的碱基序列的一部分发生缺失、插入、取代、添加，也可使该pvg1基因失活。由于该基因的缺失、插入、取代、添加而导致的突变可以仅发生这些中的任一种，也可以发生2种以上。

在pvg1基因的一部分中导入上述突变的方法可使用公知的方法。例如可例举采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR的随机突变法(PCR·方法·应用(PCR Methods Appl.)，1992年，第2卷，p.28-33.)等。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体也可例如从不具有无性絮凝性的通常的粟酒裂殖酵母通过人工诱变手段取得。即，可如下制作：通过对不具有无性絮凝性的粟酒裂殖酵母进行诱变处理，从处理后的粟酒裂殖酵母中选择与野生株相比Gsf活性增大、且Pvg1的酶活性下降或失活的菌，进一步从选择的菌中选择Gsf活性增大或Pvg1的酶活性的下降等是显性突变的菌。

对粟酒裂殖酵母的诱变处理可使用EMS(甲基磺酸乙酯)等突变诱发物质，也可照射紫外线等短波长的光。此外，从诱变处理后的粟酒裂殖酵母筛选具有耐酸性无性絮凝性的菌可在钙离子等阳离子的存在下进行。

可将沉淀速度作为指标对粟酒裂殖酵母突变体的Gsf活性进行评价。为此，在将诱变处理后的粟酒裂殖酵母在固体培养基上进行培养、将形成的菌落投入适当的溶剂中的情况下，在比野生株的菌落显著地更早沉淀(沉淀速度快)的情况下，形成该菌落的菌可评价为与野生株相比Gsf活性增大。可将野生株的菌落和诱变处理后的菌的菌落几乎同时投入溶剂，比较沉淀的速度，也可事先测定特定条件下的野生株的沉淀速度，将由得到的结果而定的阈值和诱变处理后的菌的菌落的沉淀速度进行比较。用于菌落的沉淀试验的溶剂只要是酵母能够生存的溶液即可，没有特别的限定，优选含有选自钙离子、锂离子、锰离子、铜离子、以及锌离子的1种以上的阳离子的缓冲液。例如，在干燥菌体的浓度为3.6g/L的情况下，含钙离子的乳酸缓冲液(80mM乳酸，100mM氯化钙，pH6.0)中的沉淀速度为1.0m/h以上的菌可作为Gsf活性增大的突变体筛选出来。

例如，可通过以下的操作得到耐酸性无性絮凝株。首选，对粟酒裂殖酵母使用EMS诱发突变后，将其分离培养。之后，将去除上清回收的菌体按照干燥菌体的浓度为3.6g/L的条件悬浮在乳酸-氢氧化钠缓冲液(80mM乳酸，100mM氯化钙，pH2.0)中，测定沉淀速度，将沉淀速度超过2.0m/h的菌株作为耐酸性无性絮凝株选择。

Gsf活性增大的突变体也可将gsf2基因的表达量作为指标进行筛选。gsf2基因的表达量可通过RT-PCR、使用已标记的探针的RNA印迹等在基因表达分析中通常使用的测定方法进行测定。

如果Pvg1的酶活性下降或失活，则细胞表层的丙酮酸的存在量有显著下降的倾向。为此，可将细胞表层丙酮酸的存在量作为指标，对粟酒裂殖酵母的Pvg1的酶活性进行评价。即，可从诱变处理后的粟酒裂殖酵母中将缺失细胞表层丙酮酸的菌作为Pvg1的酶活性下降或失活的突变体筛选出来。

细胞表层丙酮酸的缺失突变体可参考Andreishcheva等的方法(TheJournal of biological chemistry(《生物化学期刊》)2004年8月20日；279(34)：35644-55)进行制作。首选，对粟酒裂殖酵母使用EMS诱发突变后，将其用适当的液体培养基培养48个小时。之后，使用带正电荷的Q-琼脂糖凝胶将吸附的菌体从培养物中去除，回收上清中残留的菌体。通过利用该Q-琼脂糖凝胶反复进行数次分选后，将得到的培养液上清涂布在板上进行分离培养，由此可得到细胞表层丙酮酸的缺失突变体。

Pvg1的酶活性下降或失活的突变体也可通过测定诱变处理后的各菌的Pvg1的酶活性进行筛选。粟酒裂殖酵母的Pvg1的酶活性可通过使用已标记的底物的测定方法等在其它转移酶的酶活性测定中通常使用的方法进行测定。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体还可将基因工程方法和诱变处理组合进行制造。例如，可以对通过诱变处理增大了gsf2基因的表达量的突变体利用基因工程方法使Pvg1的酶活性下降或失活，也可以对通过诱变处理使Pvg1的酶活性下降或失活的突变体利用基因工程方法使gsf2基因的表达量增大。也可以对通过基因工程方法使Pvg1的酶活性下降或失活的突变体进行诱变处理，筛选gsf2基因的表达量增大了的突变体。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体在可维持耐酸性无性絮凝性的范围内可以在其它基因上存在突变，还可以在染色体中或染色体外导入有外源的结构基因。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体所具备的耐酸性无性絮凝性不受培养液中的酸的种类的影响。即，无论使培养液的pH降为2～5的酸是乳酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等有机酸，还是盐酸以及硫酸等无机酸，该粟酒裂殖酵母突变体都进行无性絮凝。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体所具备的无性絮凝性的强度例如可用沉淀速度作为指标。对于酵母的沉淀速度，例如可通过将分装在试管等透明容器中的酵母菌体悬浮处理后静置，使沉淀开始后，将从液体表面到固液界面(沉淀的酵母菌体和上清的界面)的距离除以沉淀开始后的经过时间而求出。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体具有在含有钙离子的乳酸缓冲液(80mM乳酸，100mM氯化钙，pH2.0)中无性絮凝的性质。本发明中的粟酒裂殖酵母突变体的在该含有钙离子的乳酸缓冲液中的沉淀速度，在干燥菌体的浓度为3.6g/L的情况下，优选2.0m/h以上，更优选4.0m/h以上，进一步优选6.0m/h以上。

此外，本发明中的粟酒裂殖酵母突变体具有在含有钙离子的乳酸缓冲液(80mM乳酸，100mM氯化钙，pH4.0)中无性絮凝的性质。本发明中的粟酒裂殖酵母突变体的在该含有钙离子的乳酸缓冲液中的沉淀速度，在干燥菌体的浓度为3.6g/L的情况下，优选2.0m/h以上，更优选4.0m/h以上，进一步优选8.0m/h以上。

通过使pH4.0中的沉淀速度为8.0m/h以上，与在pH为4及更低的pH中相比，可显示出充分的絮凝性。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体所具备的耐酸性无性絮凝性也可依赖于选自钙离子、锂离子、锰离子、铜离子、以及锌离子的1种以上阳离子。在耐酸性无性絮凝性依赖于钙离子等的情况下，可通过在培养基中添加EDTA等螯合剂来抑制该粟酒裂殖酵母突变体的絮凝。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体所具备的耐酸性无性絮凝性也可以是可利用半乳糖来抑制的性质。在利用半乳糖来抑制耐酸性无性絮凝性的情况下，通过在培养液中按照使最终浓度为5mM以上的条件添加半乳糖，可抑制该粟酒裂殖酵母突变体的絮凝。

本发明中的粟酒裂殖酵母突变体在酸性(例如，pH2～5)条件下显示强烈的无性絮凝性。为此，该粟酒裂殖酵母突变体尤其适合作为用于合成酸性蛋白质的表达系统的宿主。此外，考虑到目标蛋白质的生产性，其结果是即使在培养时的最适pH低于5的情况下，也适合作为表达系统的宿主。

为了将本发明中的粟酒裂殖酵母突变体作为宿主，大量制造β-葡糖苷酶，可制作后述的本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，在将该转化体用槽罐培养等进行培养的情况下，即使在培养结束时培养液的pH为2～5的情况下，也可不进行离心分离、过滤等固液分离处理或中和反应等就使菌体絮凝，藉此可容易地分离菌体和培养液。另外，本发明中的粟酒裂殖酵母突变体不仅在酸性条件下，在弱酸性～碱性(例如，pH5～10)条件下也能够无性絮凝。

[粟酒裂殖酵母突变体的转化体]

本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体将上述的粟酒裂殖酵母突变体作为宿主，在染色体中或作为染色体外基因具有表达盒，该表达盒包含来源于丝状真菌的编码β-葡糖苷酶的结构基因序列以及用于表达该结构基因的启动子序列及终止子序列。在染色体中具有上述表达盒是指表达盒整合在裂殖酵母属酵母的染色体中的1处以上，作为染色体外基因具有上述表达盒是指在细胞内具有含有表达盒的质粒。从转化体的传代培养容易的方面出发，优选在染色体中具有上述表达盒。

另外，表达盒与[粟酒裂殖酵母突变体]中所述相同，是为了表达β-葡糖苷酶所必需的DNA的组合，包括β-葡糖苷酶结构基因和在裂殖酵母属酵母内起作用的启动子和终止子。

此外，从向裂殖酵母属酵母的细胞外分泌的β-葡糖苷酶增多、β-葡糖苷酶的回收、纯化容易的方面来看，在β-葡糖苷酶结构基因的5’末端侧优选具有在裂殖酵母属酵母内起作用的编码分泌信号序列的碱基序列(分泌信号的结构基因)。β-葡糖苷酶结构基因的5’末端侧是指在β-葡糖苷酶结构基因的5’末端侧上游，与β-葡糖苷酶结构基因的5’末端相邻的位置。此外，可以除去不影响β-葡糖苷酶的活性的、编码N末端侧的数个氨基酸的碱基序列，在该位置上导入编码信号序列的基因。

启动子和终止子只要是能在作为宿主的粟酒裂殖酵母突变体内起作用的、可表达来源于丝状真菌的β-葡糖苷酶的启动子和终止子即可。作为在粟酒裂殖酵母突变体内起作用的启动子，可例举与[粟酒裂殖酵母突变体]中所述相同的启动子。

(β-葡糖苷酶)

β-葡糖苷酶(EC.3.2.1.21)被用作特异性催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的酶的总称。尤其是由于可将纤维二糖分解为葡萄糖而被称为纤维二糖酶，广泛分布于细菌、丝状真菌、植物以及动物内。在各种的物种内，常常存在多个编码β-葡糖苷酶的基因，例如，在作为丝状真菌的1种的米曲霉(Aspergillus oryzae)中报道了bgl1～bgl7的存在(Soy protein Research(《大豆蛋白研究》),日本12,78-83,2009，日本专利特开2008-086310号公报)。其中，从活性高等方面来看，优选编码BGL1的bgl1。

本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体所具有的β-葡糖苷酶的结构基因来源于丝状真菌。

丝状真菌是指在菌类中，由被称为菌丝的管状细胞构成的真核细胞微生物。作为丝状真菌，例如可例举曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)属、镰孢属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)以及枝顶孢属(Acremonium)等。本发明中的β-葡糖苷酶的结构基因可以是来源于任一种丝状真菌的β-葡糖苷酶的结构基因，只要该丝状真菌是产生β-葡糖苷酶的丝状真菌即可，从酶活性高等方面来看，优选来源于曲霉属的丝状真菌的β-葡糖苷酶。作为曲霉属的丝状真菌，例如可例举构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、粉状曲霉(Aspergillus pulverulentus)。从分解结晶纤维素能力高、生成单糖能力优良的方面来看，优选来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的编码β-葡糖苷酶的基因，更优选来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的编码BGL1(以下，也称为AaBGL1)的基因。

根据坂本礼一郎博士论文(关于Aspergillus aculeatus No.F-50的纤维素酶类的研究，大阪府立大学，1984年)，来自Aspergillus aculeatus的纯化的野生型AaBGL1的分子量约133KDa，最适pH为4.0，稳定pH范围为3～7(25℃，24小时)。

AaBGL1的氨基酸序列用序列编号1表示。本发明中编码β-葡糖苷酶的基因序列优选由序列编号1所表示的氨基酸序列构成的、编码β-葡糖苷酶的基因序列。此外，也可以是由在序列编号1所表示的氨基酸序列中有1～几十个、优选1～几个、进一步优选1～9个的氨基酸发生了缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的、编码具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的β-葡糖苷酶的基因序列。

由序列编号1所表示的氨基酸序列构成的β-葡糖苷酶即使存在1～几十个的氨基酸的缺失、取代或添加，也具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性。

另外，上述的来源于丝状真菌的编码β-葡糖苷酶的基因可直接使用，但为了使裂殖酵母属酵母内的表达量增大，优选将上述基因序列更改为在裂殖酵母属酵母的高表达基因中使用频率高的密码子。

本发明中，作为用于表达β-葡糖苷酶的载体(以下，也称为bgl载体)，可例举与上述的用于表达Gsf2的gsf2载体相同的载体。

而且，bgl载体优选具有在粟酒裂殖酵母突变体内起作用的分泌信号基因。分泌信号基因的位置为β-葡糖苷酶结构基因的5’末端侧。在粟酒裂殖酵母突变体内起作用的分泌信号基因是编码具有使表达的外源蛋白质分泌到宿主细胞外的功能的氨基酸序列的基因。由结合了分泌信号基因的外源结构基因来表达在N末端上添加了分泌信号的外源蛋白质。在宿主内的内质网或高尔基体等中该外源蛋白质上的分泌信号被切割，之后，去除了分泌信号的外源蛋白质被分泌至细胞外。分泌信号基因(以及分泌信号)必须要在粟酒裂殖酵母突变体内起作用。作为在粟酒裂殖酵母突变体内起作用的分泌信号基因，可以使用例如记载于国际公开第1996/23890号的基因。

本发明中，通过在β-葡糖苷酶的结构基因的5’末端侧导入该分泌信号的结构基因，可表达在N末端上添加了上述分泌信号的β-葡糖苷酶，使β-葡糖苷酶分泌到裂殖酵母属酵母的菌体外。作为在裂殖酵母属酵母内起作用的分泌信号，特别优选国际公开第1996/23890号中记载的P3信号。

使用上述bgl载体，转化作为宿主的粟酒裂殖酵母突变体。向该粟酒裂殖酵母突变体内导入β-葡糖苷酶的结构基因可以与导入gsf2基因相同的方式进行。此外，转化体的选择方法也相同。

本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体的培养液可使用公知的酵母培养培养基，只要是含有裂殖酵母属酵母可同化的碳源、氮源、无机盐类等，可效率良好地进行裂殖酵母属酵母的培养即可。作为培养液，既可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。

作为碳源，例如可例举葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。

作为氮源，例如可例举氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、蛋白胨、酪蛋白氨基酸等。

作为无机盐类，例如可例举磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。

培养可以采用公知的酵母培养方法，例如可以通过振荡培养、搅拌培养等进行。

另外，培养温度较好是23-37℃。培养时间可适当决定。

此外，培养可以是分批培养(batch培养)或补料分批培养(fed-batch培养)，也可以是连续培养。

作为本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，在使用具有与分泌信号基因结合的β-葡糖苷酶结构基因的转化体的情况下，β-葡糖苷酶分泌在培养液中。于是，在为了大量制造β-葡糖苷酶而将该转化体用槽罐培养等进行培养的情况下，即使在培养结束时培养液的pH为2～5的情况下，也由于该转化体具有耐酸性无性絮凝性，而可不进行离心分离、过滤等固液分离处理或中和反应等就使菌体絮凝，藉此可将菌体和培养液容易地分离。

此外，作为本发明的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，在使用具有不与分泌信号基因结合的β-葡糖苷酶结构基因的转化体的情况下，作为β-葡糖苷酶的分离方法，可使用公知的蛋白质分离方法。

例如，可以在培养后，将沉淀的菌体从培养液中分离，破坏菌体，得到含有β-葡糖苷酶的细胞粉碎液，从该细胞粉碎液中使用盐析、柱纯化、色谱法、免疫沉淀等公知的蛋白质分离方法得到β-葡糖苷酶。

接着，对本发明的第二实施方式进行说明。

[克隆载体]

本发明的第二实施方式的克隆载体是为了表达外源蛋白质而在裂殖酵母属酵母中导入的用于制作表达载体的克隆载体，其特征是，调控外源蛋白质的表达的启动子是裂殖酵母属酵母的hsp9启动子或ihc1启动子。另外，以下也将本发明的第二实施方式的克隆载体称为本发明的克隆载体。

<hsp9启动子>

裂殖酵母属酵母的hsp9基因是编码作为裂殖酵母属酵母所具有的热休克蛋白(heatshock protein，hsp)的一种的Hsp9蛋白质的基因。粟酒裂殖酵母的基因序列数据库(S.pombe GeneDB；http://www.genedb.org/genedb/pombe/)中登录的hsp9基因的系统名为SPAP8A3.04c。

热休克蛋白是指，细胞或个体在受到急剧的高于平常温度5～10℃的温度变化(热休克)时其合成被诱导，通过分子伴侣作用来抑制蛋白质的热变性和絮凝的蛋白质的总称。热休克蛋白的生物体内合成除了热休克之外，也可通过各种化学物质，例如电子传递链的抑制剂、过渡金属、SH试剂、乙醇等进行诱导。

因此，在导入了具有hsp9启动子的表达载体的转化体中，与Hsp9蛋白质的表达相同，可通过热休克或各种化学物质的刺激来调控外源蛋白质的表达。

hsp9启动子在裂殖酵母属酵母内的表达效率非常高。为此，通过使用该启动子，可由裂殖酵母属酵母的转化体制作能够生产前所未有的大量的外源蛋白质的表达载体。

hsp9启动子可以是裂殖酵母属酵母所具有的hsp9基因的启动子，可以来源于任一种裂殖酵母属酵母，但由于较为通用而优选使用粟酒裂殖酵母的hsp9启动子。粟酒裂殖酵母的hsp9启动子是包含在hsp9基因的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～400bp内的区域(参照序列编号6)。

作为具有hsp9启动子的粟酒裂殖酵母以外的裂殖酵母属酵母，可例举日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)等。此外，用于克隆载体的hsp9启动子，可以与导入由该克隆载体制作的表达载体的裂殖酵母属酵母是相同物种来源，也可以是不同物种来源。

hsp9启动子除了与野生型的裂殖酵母属酵母本身具有的启动子(野生型的hsp9启动子)相同的碱基序列以外，也可以是由该碱基序列中缺失、取代、或者添加1个以上、优选1～几十个、更优选1～十几个、进一步优选1～9个、更进一步优选1～几个碱基的碱基序列构成、且与野生型的hsp9启动子相同地具有启动子活性的区域。

此外，本发明的克隆载体所使用的hsp9启动子也可以是由与野生型的hsp9启动子相同的碱基序列的同源性在80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的碱基序列构成、且与野生型的hsp9启动子相同地具有启动子活性的区域。

粟酒裂殖酵母的hsp9启动子是包含在hsp9基因的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～400bp内的区域。该区域的碱基序列示于序列编号6中。即，作为本发明的克隆载体，优选具备由序列编号6所表示的碱基序列构成的区域。此外，下述序列也适合用作本发明的克隆载体所使用的hsp9启动子：由序列编号6所表示的碱基序列中缺失、取代或添加1个以上、优选1～几十个、更优选1～十几个、进一步优选1～9个、更进一步优选1～几个碱基的碱基序列，或与序列编号6所表示的碱基序列的同源性为80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的碱基序列构成，且与野生型的hsp9启动子相同地具有启动子活性的区域。

<ihc1启动子>

ihc1基因是编码分子量15400的蛋白质Ihc1的基因。ihc1基因广泛保留在以裂殖酵母属酵母为首的真菌类中。

Ihc1蛋白质在增殖开始时等菌体密度低的状态下被抑制表达，在菌体密度高的状态下被诱导表达。该Ihc1蛋白质的表达通过ihc1基因的启动子进行调控。因此，ihc1启动子可在增殖开始时等菌体密度低的状态下抑制表达的诱导，在菌体密度高的状态下强烈地诱导表达。为此，通过使用该启动子，可在裂殖酵母属酵母的转化体中制作能够根据菌体密度来调整外源蛋白质的表达的表达载体。

ihc1启动子只要是裂殖酵母属酵母所具有的ihc1基因的启动子即可，可以来源于任一种裂殖酵母属酵母，但由于较为通用而优选使用粟酒裂殖酵母的ihc1启动子。

粟酒裂殖酵母的ihc1基因是公知的，在粟酒裂殖酵母的基因序列数据库(粟酒裂殖酵母GeneDB；http://www.genedb.org/genedb/pombe/)中登录的ihc1基因的系统名为SPAC22G7.11c，该ihc1启动子是包含在ihc1基因的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～501bp内的区域(参照序列编号9)。

本发明的克隆载体中使用的ihc1启动子可以是裂殖酵母属酵母所具有的ihc1基因的启动子，也可以来源于任一种裂殖酵母属酵母。作为裂殖酵母属酵母，可例举粟酒裂殖酵母、日本裂殖酵母、八孢裂殖酵母等。此外，用于克隆载体的ihc1启动子，可以与导入由该克隆载体制作的表达载体的裂殖酵母属酵母是相同物种来源，也可以是不同物种来源。在本发明中，由于较为通用而优选使用粟酒裂殖酵母的ihc1启动子。

本发明的克隆载体中所使用的ihc1启动子除了与野生型的裂殖酵母属酵母本身具有的启动子(野生型的ihc1启动子)相同的碱基序列以外，也可以是由该碱基序列中缺失、取代、或者添加1个以上、优选1～几十个、更优选1～十几个、进一步优选1～9个、更进一步优选1～几个碱基的碱基序列构成、且与野生型的ihc1启动子相同地具有启动子活性的区域。

此外，本发明的克隆载体所使用的ihc1启动子也可以是由与野生型的ihc1启动子相同的碱基序列的同源性在80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的碱基序列构成、且与野生型的ihc1启动子相同地具有启动子活性的区域。

粟酒裂殖酵母的ihc1启动子是包含在ihc1基因的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～501bp内的区域(序列编号9)。该区域的碱基序列示于序列编号9中。即，作为本发明的克隆载体，优选具备由序列编号9所表示的碱基序列构成的区域。此外，下述序列也适合用作本发明的克隆载体所使用的ihc1启动子：由序列编号9所表示的碱基序列中缺失、取代或添加1个以上、优选1～几十个、更优选1～十几个、进一步优选1～9个、更进一步优选1～几个碱基的碱基序列，或与序列编号9所表示的碱基序列的同源性为80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的碱基序列构成，且与野生型的ihc1启动子相同地具有启动子活性的区域。

<克隆载体>

本发明的克隆载体在上述hsp9启动子以及ihc1启动子的任一种之外，还具有位于该启动子的下游且受到该启动子控制的用于导入外源结构基因的克隆位点、以及可在裂殖酵母属酵母内起作用的终止子。

克隆载体所具备的克隆位点是在克隆载体中仅在该克隆位点上存在的、存在限制酶识别位点的区域。本发明的克隆载体所具备的克隆位点可以具有被1种限制酶识别的限制酶识别位点，也可以具有能够被2种以上限制酶识别的限制酶识别位点的多克隆位点。作为该多克隆位点，可直接使用公知的克隆载体所具备的多克隆位点，此外，可以将公知的多克隆位点进行适当改变后使用。另外，本发明的克隆载体可在克隆位点内的下游端侧区域或该克隆位点的下游具备终止密码子。

作为在裂殖酵母属酵母内起作用的终止子，可使用裂殖酵母属酵母本身具有的终止子或裂殖酵母属酵母本身不具有的终止子。另外，在载体内可以存在两种以上的终止子。作为裂殖酵母属酵母本身具有的终止子，例如可例举裂殖酵母属酵母的inv1基因的终止子等。此外，作为裂殖酵母属酵母本身不具有的终止子，例如可例举专利文献2、4或10中记载的来源于人类的终止子等，优选人脂皮质蛋白I的终止子。

本发明的克隆载体中优选在上述启动子的下游、克隆位点的上游包括5’-非翻译区域，此外，优选在克隆位点的下游包括3’-非翻译区域。此外，本发明的克隆载体优选具有用于识别在克隆位点上导入了外源结构基因的表达载体的标记。作为该标记，例如可例举氨苄青霉素抗性基因等可在大肠杆菌内起作用的抗药性基因等。

而且，本发明的克隆载体优选具有用于选择转化体的标记。作为该标记，例如可例举ura4基因等营养缺陷型互补标记、异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。

本发明的克隆载体除了在该克隆位点上导入外源结构基因时构成表达盒的区域之外，还可以具有转化体的制造所必需的DNA区域。例如，在将表达盒导入染色体的情况下优选具有重组位点。为了直接将具有外源结构基因(不限于gsf2基因)的表达盒导入染色体，可使用上述本发明的第一实施方式中将gsf2载体的表达盒导入染色体的情况下所使用的重组位点。在具有gsf2基因以外的外源结构基因的表达盒的情况下，将该表达盒导入染色体的方法也可直接使用本发明的第一实施方式所记载的基因工程方法。

在制作由本发明的克隆载体制作的表达载体的表达盒在宿主细胞内作为染色体外基因保持的转化体的情况下，本发明的克隆载体优选含有用于在裂殖酵母属酵母内进行复制的序列，即自主复制序列(Autonomously ReplicatingSequence：ARS)。另外，在将表达盒整合在染色体中的情况下，优选将ARS从表达载体中删除后导入宿主。

本发明的克隆载体可通过从为了制作用于在宿主中表达外源蛋白质的表达载体所使用的公知的克隆载体中，以hsp9启动子或ihc1启动子取代该公知克隆载体所具备的启动子区域来进行制作。例如，可通过用hsp9启动子或ihc1启动子取代上述日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报、日本专利特开平11-192094号公报、日本专利特开2000-136199号公报等中记载的多克隆载体的启动子部位来进行制作。

作为用于构建本发明的克隆载体的具体操作方法，可使用公知的方法。例如，可使用文献[J.Sambrook等.,"Molecular Cloning 2nded(《分子克隆第二版》).",Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)(1989)]中记载的操作方法。另外，也可用基于PCR的酶扩增法或化学合成法进行构建。

[表达载体及其制造方法]

本发明的第二实施方式的表达载体可通过在本发明的克隆载体中的克隆位点导入外源结构基因来进行制造。向克隆位点导入外源结构基因可与克隆载体的制作相同地使用公知方法。

被导入本发明的表达载体的外源结构基因只要是编码蛋白质的结构基因则没有特别限定，可以是与作为宿主的裂殖酵母属酵母原本具有的基因同种的基因，也可是来源于异种生物的结构基因。由使用含有裂殖酵母属酵母的编码内源性蛋白质的结构基因(例如上述gsf2基因)的表达载体而得的裂殖酵母属酵母的转化体，可更大量地生产该内源性蛋白质。此外，由使用含有来源于异种生物的结构基因的表达载体而得的裂殖酵母属酵母的转化体，可生产大量的异种蛋白质。

被导入本发明的表达载体的外源结构基因所编码的蛋白质优选异种蛋白质，更优选作为多细胞生物的动物或植物所产生的蛋白质，进一步优选哺乳动物(包括人类)产生的蛋白质。在使用大肠杆菌等原核细胞微生物宿主来制造这样的蛋白质的情况下，大多不能得到活性高的蛋白质，并且在将CHO细胞等动物细胞作为宿主使用的情况下，通常而言产生效率低。在使用本发明的表达载体、使用裂殖酵母属酵母作为宿主的异种蛋白质表达体系的情况下可解决这些问题。

被导入本发明的表达载体的外源结构基因只要是编码蛋白质的基因即可，可以是野生型的结构基因，也可以是将野生型的结构基因进行了改变的基因，也可以是人工合成的基因。作为野生型以外的结构基因，例如可例举编码融合了野生型的多个蛋白质的嵌合蛋白质的基因、编码在野生型蛋白质的N末端或C末端上结合了其它的肽等的蛋白质的基因等。作为该其它的肽，可例举分泌信号、向特定的细胞内细胞器的转移信号等信号、His标签、FLAG标签等标签等。各种信号必须是在裂殖酵母属酵母内起作用的信号。分泌信号是通过存在于N末端而具有使表达了的蛋白质分泌至宿主细胞外的功能的肽。作为在裂殖酵母属酵母内起作用的分泌信号，特别优选国际公开第1996/23890号中记载的P3信号。

[转化体及其制造方法]

本发明的第二实施方式的转化体的特征是包含上述本发明的第二实施方式的表达载体。本发明的第二实施方式的转化体通过在裂殖酵母属酵母中导入上述表达载体进行制造。

本发明的第二实施方式的转化体的宿主为裂殖酵母属酵母。本发明所使用的裂殖酵母属酵母可以为野生型，根据用途也可以为使特定基因缺失或失活的突变型。作为使特定基因缺失或失活的方法，可采用公知的方法。具体而言，可通过采用拉图尔法(Nucreic Acids Res，2006年，第34卷第e11号，以及国际公开第2007/063919号等中记载)来使基因缺失。也可通过采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR的随机突变法(PCR Methods Appl.(PCR方法及应用)，1992年，第2卷，p.28-33.)等向基因的一部分中引入突变，藉此使该基因失活。作为使特定基因缺失或失活的裂殖酵母属酵母宿主，例如记载于国际公开第2002/101038号、国际公开第2007/015470号等中。

并且，作为宿主的裂殖酵母属酵母优选使用具有用于选择转化体的标记的宿主。例如，优选使用某基因缺失而在生长中需要特定营养成分的宿主。利用包含目标基因序列的载体进行转化来制作转化体的情况下，通过预先在载体中整合该缺失的基因(营养缺陷型互补标记)，使转化体的宿主的营养缺陷消失。通过该宿主和转化体的营养缺陷型的不同，可区分两者，得到转化体。作为营养缺陷型互补标记，例如可例举ura4基因(营养缺陷型互补标记)、异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。

作为宿主使用的裂殖酵母属酵母可利用上述例举的品种。在上述裂殖酵母属酵母中，从可利用各种有用的突变株的方面来看，优选粟酒裂殖酵母。作为本发明所使用的粟酒裂殖酵母的菌株，例如可例举ATCC38399(leu1-32h-)或ATCC38436(ura4-294h-)等，这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得。

此外，在导入具有β-葡糖苷酶基因以外的外源结构基因的表达载体的情况下，也可将上述本发明的第一实施方式中的粟酒裂殖酵母突变体作为宿主使用。

使用表达载体来转化作为宿主的裂殖酵母属酵母的转化方法可使用任一种公知的裂殖酵母属酵母的转化方法。作为这样的转化方法，例如可例举乙酸锂法[K.Okazaki等，Nucleic Acids Res.,18,6485-6489(1990)]、电穿孔法、原生质体法、玻璃珠(glass beads)法等以往众所周知的方法或日本专利特开2005-198612号公报记载的方法等。此外，也可使用市售的酵母转化用试剂盒。

进行转化后，通常而言对得到的转化体进行筛选。作为进行筛选的方法，例如可例举以下示出的方法。利用可通过上述营养缺陷型标记来选择转化体的培养基进行筛选，从得到的菌落中选择出多个菌落。另外，通过对这些选择出的转化体进行基于脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察出整合到染色体中的载体数或表达盒数。

(培养方法)

本发明的第二实施方式的转化体可以与天然的裂殖酵母属酵母相同地培养。作为该培养方法，可例举与上述第一实施方式的转化体的培养方法相同的方法。具体而言，可使用YPD培养基等营养培养基(M.D.Rose等.,"Methods InYeast Genetics(酵母遗传学方法)",Cold Spring Harbor Labolatory Press(冷泉港实验室出版社)(1990))或MB培养基等基本培养基(K.Okazaki等.,NucleicAcids Res.,vol.18,p.6485-6489(1990))等。

另外，培养温度较好是23-37℃。培养时间可适当决定。

此外，培养既可以是分批培养，也可以是补料分批培养或连续培养。

[外源蛋白质的生产方法]

本发明的第二实施方式的蛋白质的生产方法的特征是，对上述本发明的第二实施方式的转化体进行培养，从得到的菌体或培养液上清中取得上述外源结构基因所编码的蛋白质。

培养条件可考虑所生产的目标外源蛋白质的种类等而进行适当设定。例如以16～42℃、优选25～37℃，进行8～168小时、优选48～96小时。振荡培养和静置培养的任一种均可，可根据需要加以搅拌或透气。

在本发明的第二实施方式的转化体为导入了具有hsp9启动子的表达载体的转化体的情况下，如果将该转化体在给予热压力等诱导刺激的条件下进行培养，则hsp9启动子由于该压力而活化，受其控制的外源结构基因的转录被促进，该外源蛋白质进行表达。在该诱导刺激条件下的培养中，与常规条件下的培养相比，通常裂殖酵母属酵母的增殖量变少。为此，在培养开始时以常规条件进行培养，在培养液中的菌体浓度有了一定程度的升高的时刻给予热压力等诱导刺激。藉此，通过利用前期的培养使细胞量变多，作为培养系统整体产生大量的异种蛋白质。此处的热压力是诱导刺激的一种，通过确认各种效果，诱导刺激也可以使用其它方法。作为诱导刺激的方法，可适当地通过添加热、镉、渗透压上升剂、过氧化氢、乙醇等实现。

在利用热的情况下，给予热压力的温度上限为裂殖酵母属酵母能够生存的最高温度。因此，作为热压力时的培养温度，是比给予热压力前的培养温度高出优选为2～20℃、更优选3～12℃、最优选4～6℃的温度，且为15～55℃、优选25～45℃、更优选30～40℃。对给予热压力的时间没有特别限制，在数分钟以上即可确认效果，为1～29小时，适合的是1～15小时。

在利用镉添加的情况下，以镉离子的形式进行添加。镉的最终浓度为0.1～1.5mM为止，更优选0.5～1.0mM为止。培养时间适合的是5小时以下，更优选3小时以下。

在利用渗透压上升剂的情况下，可添加高浓度的电解质或山梨糖醇等渗透压上升剂来提高渗透压。在利用高浓度的氯化钾的情况下，钾的最终浓度为0.1～2.0M为止，更优选0.5～1.5M为止。对添加的时间没有特别的限制，适合的是1～12小时为止，更优选1～10小时左右。

在利用过氧化氢的情况下，其最终浓度为0.1～1.5mM为止，更优选0.5～1.0mM为止。对培养的时间没有特别的限制，适合的是1～15小时为止，更优选1～12小时左右。

在利用乙醇的情况下，其最终浓度为5～20V/V％为止，更优选5～15V/V％为止。对培养的时间没有特别的限制，适合的是1～20小时为止，更优选1～15小时左右。

上述的条件可单独或将多个组合进行处理。组合效果能够通过比较表达量容易地确认。

在本发明的第二实施方式的转化体为导入了具有ihc1启动子的表达载体的转化体的情况下，如果在培养开始时点这样的菌体密度低的状态下进行培养，则外源蛋白质不表达或者仅表达非常少的量。即，由于该转化体可在菌体密度低的状态下以没有外源蛋白质的表达的负担(或者负担小)的状态进行增殖，因而与存在负担的情况相比，增殖效率高，可高效地增大细胞量。另一方面，随着菌体密度的升高，表达被诱导，其结果是，可生产大量的外源蛋白质。

培养结束后，可通过超声波粉碎或机械粉碎来由菌体制备含有目标外源蛋白质的细胞提取液，从该细胞抽出液中分离、纯化外源蛋白质。此外，在外源蛋白质被分泌至细胞外的情况下，可从培养液上清中分离、纯化外源蛋白质。作为用于获得这些生产的蛋白质的分离、纯化方法，可例举公知的盐析或溶剂沉淀法等利用溶解度差别的方法，透析、超滤或凝胶电泳法等利用分子量差别的方法，离子交换色谱法等利用电荷差别的方法，亲和层析法等利用特异亲和性的方法，反相高效液相色谱法等利用疏水性差别的方法，等电点电泳法等利用等电点差别的方法等。

作为确认分离、纯化的蛋白质的方法，可例举公知的蛋白质印迹法或活性测定法等。纯化的蛋白质可通过氨基酸分析、氨基末端分析、一级结构分析等明确其结构。

实施例

下面示出实施例和比较例，对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。

[试验例1]表达载体的制作1

由已知的AaBGL1的肽序列，设计用粟酒裂殖酵母的高表达型密码子进行取代的基因序列(参照序列编号2。以下，称为AaBGL1基因)。在起始密码子前添加KpnI，BspHI识别序列。在终止密码子后添加XbaI，SacI识别序列。用限制酶BspHI，XbaI酶切含有该序列的质粒(由GeneArt(ジーンアート)公司，德国雷根斯堡合成)。

另一方面，另外用限制酶AarI，XbaI酶切pSL6lacZ，进行碱性磷酸酶处理。在该处理后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，从琼脂糖凝胶中切出载体pSL6片段和上述AaBGL1基因片段，进行连接(l igation)后，导入大肠杆菌DH5α(宝生物公司(タカラバイオ社)制)进行转化。通过得到的转化体制备载体，获得目标表达载体pSL6AaBGL1(图1，参照序列编号3)。通过制作限制酶图谱确认是目标载体。

此外，为了制作在N末端上添加了分泌信号P3信号的AaBGL1，将pSL6AaBGL1作为模板使用In-fusion引物利用PCR法对AaBGL1基因片段进行扩增。另一方面，用限制酶AflII，XbaI对pSL6P3lacZ进行酶切。将该片段和通过PCR而得的上述AaBGL1基因片段利用In-fusion法进行环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过得到的转化体制备载体，获得目标表达载体pSL6P3AaBGL1(图2，参照序列编号4)。通过制作限制酶图谱和确认部分碱基序列确认是目标载体。

[试验例2]表达载体的制作2

此外，为了制作使用hsp9启动子的AaBGL1表达载体，将pSL6P3AaBGL1作为模板使用In-fusion引物利用PCR法对P3AaBGL1基因片段进行扩增。另一方面，用限制酶AarI，Xba1酶切具有hsp9启动子的下述pSL14lacZ。将该片段和通过PCR而得的上述P3AaBGL1基因片段利用In-fusion法进行环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过得到的转化体制备载体，获得目标表达载体pSL14P3AaBGL1(图3，参照序列编号5)。通过制作限制酶图谱和确认部分碱基序列确认是目标载体。

<多克隆载体的制作>

通过用粟酒裂殖酵母的hsp9启动子(序列编号6)取代多克隆载体pSL9(图24，7038bp)的启动子区域(图24中“inv1pro.”)，制作多克隆载体pSL14(图25，6282bp)。

具体而言，首先，将来源于粟酒裂殖酵母的野生株(ARC032株，ATCC38366，相当于972h-)的基因组DNA作为模板，使用在5’末端上具备SacI的限制酶位点的正向引物和在5’末端上具备PciI的限制酶位点的反向引物，利用PCR，对粟酒裂殖酵母的hsp9基因中的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～400bp的区域(序列编号6)进行扩增，得到在该区域的5’末端上具备SacI、在3’末端上具备PciI的限制酶位点的片段。

对pSL9的启动子部分用限制酶AarI以及SacI进行双酶切，并进行连接，接着转化大肠杆菌DH5后，提取质粒，进行碱基序列的确认。其结果是，确认得到的质粒虽然在3’末端上多添加了1个腺嘌呤，但具有包含序列编号6所表示的碱基序列的启动子区域。将该质粒记作pSL14。

接着，通过用含有卡那霉素抗性基因以及pUCori的区域取代pSL14的含有氨苄青霉素抗性基因以及pBR322ori的区域，在克隆位点上整合编码lacZ'的结构基因，制作多克隆载体pSL14lacZ(图26，6675bp，参照序列编号7)。

[试验例3]转化体的制作(对裂殖酵母的转化)

使作为宿主的粟酒裂殖酵母的亮氨酸缺陷株(基因型：h-，leu1-32，东京大学大学院理学系研究科附属基因实验设施·饭野雄一教授提供)(ATCC38399)在YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×10⁸个细胞/mL的条件悬浮在0.1M乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入将上述得到的载体pSL14P3AaBGL1用限制酶SwaI进行酶切的产物1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于基础琼脂培养基。3天后，可得到转化体(AaBGL1表达株)。将该转化体记作ASP3660株(以下，也称为通常株)。

[试验例4]Δpvg1株(pvg1基因缺损株)的制作

将粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型株(ARC010，基因型：h-leu1-32ura4-D18，东京大学大学院理学系研究科附属基因实验设施·饭野雄一教授提供)根据拉图尔法(Nucreic Acids Res，2006年，34卷e11页，国际公开第2007/063919号文本中记载)进行转化，制作删除了pvg1基因的Δpvg1株。培养得到的突变体，利用脉冲场凝胶电泳法进行基因组分析，确认pvg1基因缺损。

在删除片段的制作中，将基于粟酒裂殖酵母的野生株ARC032株(基因型：h-，东京大学大学院理学系研究科附属基因实验设施·饭野雄一教授提供)通过DNeasy(凯杰公司(キアゲン社)制)制备的全基因组DNA作为模板，通过PCR法进行。

更具体而言，将删除片段分为UP区域、OL区域、以及DN区域，将各区域的DNA片段分别通过使用KOD-Dash(东洋纺株式会社(東洋紡社)制)的PCR法进行制作后，进一步将其作为模板，通过相同的PCR法制作全长删除片段。

[试验例5]Δpvg1gsf2+株(pvg1基因缺损+gsf2基因表达增大株)的制作

使上述Δpvg1株在YES(0.5％酵母提取物，3％葡萄糖，0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×10⁸个细胞/mL的条件悬浮在0.1M乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入下述含有ihc1启动子和gsf2基因的基因片段(参照序列编号8)1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于含有亮氨酸的基础琼脂培养基。3天后，可得到转化体(pvg1基因缺损+gsf2基因表达增大株)。之后进行FOA处理，使其再度具有尿嘧啶缺陷型。将该突变体记作IGF799株。

如下制作上述的含有ihc1启动子和gsf2基因的基因片段。首先，将在ihc1启动子(参照序列编号9)的5’-末端侧含有gsf2启动子序列和Ura4序列、在3’-末端侧含有gsf2-ORF的序列作为模板，利用PCR扩增上述基因片段。

[试验例6]转化体的制作(对无性絮凝性裂殖酵母的转化)

使作为宿主的具有无性絮凝性的粟酒裂殖酵母的上述IGF799株在YES(0.5％酵母提取物，3％葡萄糖，0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×108个细胞/mL的条件悬浮在0.1M乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入将上述得到的载体pSL14P3AaBGL1用限制酶SwaI进行酶切的产物1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于含有尿嘧啶的基础琼脂培养基。3天后，可得到转化体(AaBGL1表达株)。将该突变体记作ASP4106株。

[试验例7]转化体的制作(补充尿嘧啶缺陷型)

使上述所制作的ASP4106株在YES(0.5％酵母提取物，3％葡萄糖，0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×10⁸个细胞/mL的条件悬浮在0.1M乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入将载体pUC19-ura4(图4，参照序列编号10)用限制酶BsiwI进行酶切的产物1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于基础琼脂培养基。图4中，A以及B的序列表示载体的重组位点。3天后，可得到转化体。将该补充了ASP4106株的尿嘧啶缺陷型的转化体记作ASP4150株(以下，也称为絮凝株)。

[试验例8]转化体的分批培养

将上述所得的AaBGL1表达株(通常株以及絮凝株)用YES培养基在试管中以32℃培养24小时。将该培养液2mL在50mL的YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中进行传代培养，在500mL的三角烧瓶中以32℃进行48小时正式培养。

为了对转化体的菌体增殖进行评价，对培养液的OD660nm处的吸光度使用分光光度计(Spectrophotometer U-1500)进行测定。在培养液原液的浓度高的情况下,利用RO(Reverse Osmosis；反渗)水进行稀释并测定。在测定絮凝株的OD660时，悬浮于100～500mM的EDTA，解除絮凝性后进行测定。

菌体增殖的结果示于图5。在通常株以及絮凝株中，培养中的OD660值的经时变化表现为大致相同的变化，最终OD660值为通常株23.4，絮凝株20.3。

培养液中的残存葡萄糖浓度及作为其代谢产物的乙醇浓度以生物传感器BF5进行测定。将采集的培养液放入微量离心管(eppendorf tube)，使用高速微量离心机进行离心分离，得到培养上清。将该培养上清300μL放入BF5样品杯中，放入事先做好测定准备的BF5自动进样器内。

在以下示出的生物传感器运行条件下运行BF5，进行分析。

使用仪器：生物传感器BF5(王子计量仪器(王子計測機器))

流速：1.0mL/分钟

注入量：5μL

恒温槽温度：37℃

计量时间：90秒

浓度定量法：检出由于葡萄糖以及乙醇的酶分解而产生的过氧化氢，以标准液的峰高为基准求出。

培养液中的残存葡萄糖浓度的结果示于图6(a)，作为该葡萄糖的代谢产物的乙醇浓度的结果示于图6(b)。在通常株以及絮凝株中，培养中的葡萄糖浓度以及乙醇浓度的经时变化表现为大致相同的变化。

通常株以及絮凝株中，培养中的OD660值，葡萄糖浓度以及乙醇浓度的经时变化在各菌株中也以相同的方式变化。由此，推测在相同的培养条件下，通常株以及絮凝株以大致相同的速度进行糖的代谢以及菌体的增殖。认为利用基因操作给予絮凝性对菌体增殖性的影影响小。

[试验例9]利用活性测定确认AaBGL1的表达

使用上述所得的AaBGL1表达株的培养上清，制备酶稀释样品，根据下述方法进行活性测定。

(活性测定法)

在20mM对硝基苯基-β-D-葡糖苷(以下，简记为pNPG)10μL中，加入1M乙酸钠缓冲液(pH4.5)10μL和水130μL，添加酶稀释样品50μl，在37℃下反应10分钟。在2％碳酸钠溶液100μL中加入反应液100μL使反应停止，在波长450nm下对游离的对硝基苯酚的量进行比色定量。

将每1分钟生成相当于1μmol的对硝基苯酚的酶的量作为1U。每1mL的通常株以及絮凝株中的培养上清的pNPG分解活性(以下，也称为pNPG活性)示于图7。

如图7所示，关于pNPG分解活性值，培养15.5小时即葡萄糖刚刚枯竭之后，絮凝株显示出通常株的1.38倍活性值，培养48小时后，絮凝株显示出通常株的1.27倍活性值。

[试验例10]转化体的补料分批培养

在5mL YES培养基中接种通常株或絮凝株，在试管中以32℃进行24小时预培养1。进一步，在200mL YES培养基中加入预培养1所得的培养液4mL，在1L坂口烧瓶中以30℃进行24小时的预培养2。

接着，使用5L发酵罐，在由表1所示的成分构成的初始培养基1800mL中加入预培养2所得的培养液200mL，开始在30℃下进行培养。此外，表1的各成分的浓度表示预培养2接种后的浓度。在培养开始起14.0小时后，确认培养液中的残存葡萄糖浓度低于1.0g/L，开始补料。之后，持续补料81小时，补料表2所示的组成的补料培养基1450mL，以30℃培养95小时(表示从培养开始时起的培养时间)。通过控制12.5％氨水的添加，将pH保持为4.5。

[表1]

成分	浓度
		酵母提取物	10g/L
葡萄糖(含水)	33g/L
		(NH₄)₂SO₄	15g/L
KH₂PO₄	8g/L
		MgSO₃·7H₂O	5.34g/L
Na₂HPO₄	0.04g/L
		CaCl₂·2H₂O	0.2g/L
氯化胆碱	15.00mg/L
		叶酸	0.08mg/L
吡哆醇	2.16mg/L
		疏胺素	26.49mg/L
胸腺嘧啶脱氧核苷	8.75mg/L
		核黄素磷酸钠	7.97mg/L
对氨基苯甲酸	38.16mg/L
		泛酸钙	15.70mg/L
烟酸	49.00mg/L
		肌醇	27.00mg/L
生物素	0.08mg/L
		FeC₆H₅O₇·nH₂O	28.40mg/L
ZnSO₄·7H₂O	25.40mg/L
		MnCl₂·4H₂O	4.10mg/L
CuSO₄·5H₂O	3.80mg/L
		H₂BO₃	2.90mg/L
Na₂MoO₄·2H₂O	0.68mg/L
		KI	0.20mg/L
NiSO₄·6H₂O	0.44mg/L
		CoCl₂·6H₂O	0.40mg/L

(葡萄糖含水率：8.8％)

[表2]

	浓度
		酵母提取物	10g/L
葡萄糖(含水)	550g/L
		CaCl_z2H₂O	0.20g/L
KH₂PO₄	9.00g/L
		MgSO₄7H₂O	4.45g/L
K₂SO₄	3.50g/L
		Na₂SO₄	0.14g/L
Na₂HPO₄	0.04g/L
		氯化胆碱	15.00mg/L
叶酸	0.08mg/L
		吡哆醇	2.16mg/L
疏胺素	26.49mg/L
		胸腺嘧啶脱氧核苷	8.75mg/L
核黄素磷酸钠	7.97mg/L
		对氨基苯甲酸	38.16mg/L
泛酸钙	82.37mg/L
		烟酸	715.70mg/L
肌醇	693.70mg/L
		生物素	0.74mg/L
FeC₆H₅O₇·nH₂O	473.4mg/L
		ZnSO₄·7H₂O	423.4mg/L
MnCl₂·4H₂O	68.4mg/L
		CuSO₄·5H₂O	63.4mg/L
H₂BO₃	48.4mg/L
		Na₂MoO₄·2B₂O	11.4mg/L
KI	3.4mg/L
		NiSO₄·6H₂O	7.4mg/L
CoCl₂·6H₂O	6.7mg/L

(葡萄糖含水率：8.8％)

为了对转化体的菌体增殖进行评价，对培养液的OD660nm处的吸光度使用分光光度计(Spectrophotometer U-1500)进行测定。在培养液原液的浓度高的情况下，利用RO水进行稀释并测定。在测定絮凝株的OD660nm时，悬浮于100～500mM的EDTA，解除絮凝性后进行测定。

菌体增殖的结果示于图8。在通常株以及絮凝株中，培养中的OD660值的经时变化表现为大致相同的变化。最终OD660值为通常株376，絮凝株395，通过使用将作为来源于天然物质的酵母提取物(Yeast Extract)添加在合成培养基中的半合成培养基实现了高菌体浓度。

培养液中的残存葡萄糖浓度及作为其代谢产物的乙醇浓度以与试验例8相同的方法进行测定。

培养液中的残存葡萄糖浓度的结果示于图9(a)，作为该葡萄糖的代谢产物的乙醇浓度的结果示于图9(b)。在通常株以及絮凝株中，培养中的葡萄糖浓度以及乙醇浓度的经时变化表现为大致相同的变化。补料开始后的葡萄糖浓度以1g/L以下的低值进行变化。在分批培养的阶段中产生的乙醇在开始补料后减少，培养中的乙醇浓度最终以1g/L以下的低值进行变化。作为补料开始后到补料分批培养结束为止的乙醇生产阶段，没有发生葡萄糖效应。

通常株以及絮凝株中，培养中的OD660值，葡萄糖浓度以及乙醇浓度的经时变化在各菌株中以相同的方式变化。由此，推测在相同的培养条件下，通常株以及絮凝株以大致相同的速度进行糖的代谢以及菌体的增殖。认为利用基因操作给予絮凝性对菌体增殖性的影影响小。

[试验例11]沉淀速度的测定

在1L量筒中对试验例10所得到的补料分批培养结束时的样品各1L比较沉淀速度。使各量筒充分悬浮后，静置使沉淀开始。通过将从液体表面到固液界面(沉淀的酵母菌体和上清的界面)的距离除以沉淀开始后的经过时间，算出沉淀速度。结果示于图10中。

如图10所示，确认与通常株相比，絮凝株沉淀速度快。絮凝株的沉淀速度在沉淀开始2小时后的时刻为30mm/小时，在又过了10小时后(沉淀开始12小时后)的时刻为6.7mm/小时。另一方面，通常株的沉淀速度在沉淀开始12小时后的时刻为1.5mm/小时。

此外，图11表示补料分批培养结束时的样品的镜检观察结果(台盼蓝染色结果)。如图11所示，由补料分批培养结束时样品的镜检观察结果确认絮凝株中大量的菌体集合、絮凝的状态，通过补料分批培养，菌体的絮凝性没有消失。通常株中，没有观察到菌体的絮凝，呈分散的状态。

[试验例12]培养温度优化讨论(补料分批培养)

在5mL YES培养基中接种通常株(ASP3660株)，在L型试管中以30℃进行24小时预培养1。进一步，在120mL YES培养基中加入预培养1所得的培养液2.4mL，在500mL坂口烧瓶中以30℃进行24小时的预培养2。

接着，使用3L发酵罐，在初始培养基1080mL中加入预培养2所得的培养液120mL，开始进行培养。在双基培养槽中分别以温度条件30℃以及34℃这两个条件实施。初始培养基组成使用从表1所示的组成中除去酵母提取物、氯化胆碱、叶酸、吡哆醇、硫胺素、胸腺嘧啶脱氧核苷、核黄素磷酸钠以及对氨基苯甲酸的培养基。此外，表1的各成分的浓度表示预培养2接种后的浓度。从培养开始11.8小时后开始补料。之后，持续补料84.2小时，补料表2所示的组成的补料培养基685mL，以30℃以及34℃培养96小时(表示从培养开始时起的培养时间)。补料培养基也相同地使用从表2所示的组成中除去酵母提取物、氯化胆碱、叶酸、吡哆醇、硫胺素、胸腺嘧啶脱氧核苷、核黄素磷酸钠以及对氨基苯甲酸的培养基。通过控制12.5％氨水的添加，将pH保持为4.5。

为了评价转化体的菌体增殖，以与试验例8相同的方法测定培养液的OD660nm的值。菌体增殖的结果示于图12。在30℃以及34℃下，培养中的OD660值的经时变化表现为大致相同的变化。最终OD660值分别在30℃下为295，在34℃下为271，实现高菌体浓度。

培养液中的残存葡萄糖浓度及作为其代谢产物的乙醇浓度以与试验例8相同的方法进行测定。培养液中的残存葡萄糖浓度的结果示于图13A，作为该葡萄糖的代谢产物的乙醇浓度的结果示于图13B。在30℃以及34℃下，培养中的葡萄糖浓度以及乙醇浓度的经时变化表现为大致相同的变化。培养24小时后的葡萄糖浓度以1g/L以下的低值进行变化。在分批培养中产生的乙醇在开始补料后减少，培养中的乙醇浓度最终以2g/L以下的低值进行变化。

培养液中的pNPG分解活性以与试验例9相同的方法进行测定。30℃以及34℃下的每1mL培养上清的pNPG分解活性的结果示于图14。pNPG分解活性值在培养结束时的培养96小时后，34℃下的活性值显示为30℃下的活性值的2.26倍。

[试验例13]利用SDS-PAGE分析确认AaBGL1的表达

将试验例12所得的补料分批培养结束时的培养上清样品各5μL溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中，使用4-12％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝进行染色。所得的结果示于图15。SDS-PAGE的结果显示：培养结束时的培养96小时后，与30℃相比,在34℃下，被看作分子量120kDa以上的AaBGL1的条带强度强，AaBGL1的分泌表达量增加。通过在AaBGL1上添加糖链，可确认拖尾条带。

[试验例14]利用hsp9启动子的蛋白质生产

<表达载体的制作>

将含有GFP基因的pEGFP-N1(CLONTECH公司(CLONTECH社)制)作为模板，使用In-fusion引物通过PCR法扩增EGFP基因的ORF片段。另一方面，用限制酶AflII以及XbaI对pSL14进行双酶切。将获得的片段和通过PCR而得的上述EGFP基因的ORF片段利用In-fusion法进行环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过得到的转化体制备载体，获得目标表达载体pSL14-EGFP(图16)。通过制作限制酶图谱和确认部分碱基序列确认是目标载体。

相同地，制作在pSL6中整合了EGFP基因的ORF片段的载体pSL6-EGFP(图17)，作为对照。

<转化体的制作>

使作为宿主的粟酒裂殖酵母的亮氨酸缺陷株(基因型：h-，leu1-32，东京大学大学院理学系研究科附属基因实验设施·饭野雄一教授提供)(ATCC38399)在YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×10⁸个细胞/mL的条件悬浮在0.1m乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入将上述得到的表达载体pSL14-EGFP用限制酶NotI进行酶切的产物1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于基础琼脂培养基。

将3天后得到的转化体记作ASP3395株。

相同地，导入pSL14-EGFP而得到转化体SL14E株，导入pSL6-EGFP而得到转化体SL6E株。

<EGFP表达>

将得到的ASP3395株接种在试管内的5mL的YES培养基中，在32℃下培养70小时。对培养结束后的培养液在488nm下激发的情况下的荧光强度进行测定。

作为对照，在相同的条件下培养SL14E株以及SL6E株，测定培养结束后的培养液的荧光强度。

测定结果示于图18。其结果是，在将SL6E株的培养液的荧光强度作为1的情况下，SL14E株的荧光强度(相对值)仅为0.50，而ASP3395株的荧光强度(相对值)非常高，为17.17。

培养液的荧光强度为荧光蛋白EGFP的表达量的指标，可知hsp9启动子在裂殖酵母属酵母内表达效率非常高，利用本发明的表达载体而得的转化体，与使用其它启动子的情况相比，可更大量地生产外源蛋白质。

[试验例15]利用ihc1启动子的蛋白质生产

<多克隆载体的制作>

按照以下示出的工序制作单座整合型重组载体pSL17。即，首先，通过用粟酒裂殖酵母的ihc1基因的启动子(ihc1启动子)取代公知的裂殖酵母用重组型多克隆载体pSL6(图19，5960bp，序列编号11)的hCMV启动子区域，制作多克隆载体pSL12(图20，5847bp)。

具体而言，首先，将来源于粟酒裂殖酵母的野生株(ARC032株，ATCC38366，相当于972h-)的基因组DNA作为模板，使用在5’末端上具备BlnI的限制酶识别序列的正向引物(ihc1-启动子-F：参照表3)和在5’末端上具备KpnI的限制酶识别序列的反向引物(ihc1-启动子-R：参照表3)，利用PCR，对粟酒裂殖酵母的ihc1基因中的ORF的5’末端(起始密码子ATG的A)的上游1～501bp的区域(序列编号9)进行扩增，得到在该区域的5’末端上具备BlnI、在3’末端上具备KpnI的限制酶识别序列的片段(ihc启动子片段)。

在用限制酶BlnI以及KpnI双酶切pSL6后的片段上，通过连接(ligation)将ihc启动子片段整合在用限制酶BlnI以及KpnI双酶切后的片段上，得到裂殖酵母用整合型载体pSL12(序列编号14)。

接着，通过用粟酒裂殖酵母的ihc1基因的终止子(ihc1终止子)取代pSL12的LPI终止子区域，制作多克隆载体pSL17(图21，5831bp)。

具体而言，首先，将来源于粟酒裂殖酵母的野生株(ARC032株，ATCC38366，相对于972h-)的基因组DNA作为模板，使用In-fusion引物(ihc1-终止子-F和ihc1-终止子-R：参照表3)利用PCR对粟酒裂殖酵母的ihc1基因中的ORF的3’末端(终止密码子的第三个字母)的下游1～200bp的区域(序列编号15)进行扩增，得到含有ihc终止子区域的片段(ihc终止子片段)。

将作为pSL12模板，使用In-fusion引物(pSL12-F和pSL12-R：参照表3)通过PCR进行扩增，得到从pSL12的全长中缺损了LPI终止子区域的片段，在该片段上使用In-fusion克隆试剂盒(产品名：In-Fusion HD Cloning Kit w/CloningEnhancer，宝生物株式会社制)整合ihc终止子片段，制作多克隆载体pSL17(序列编号20)。

[表3]

<表达载体的制作>

将含有GFP基因的pEGFP-N1(CLONTECH公司(CLONTECH社)制)作为模板，使用In-fusion引物通过PCR法扩增EGFP基因的ORF片段。另一方面，用限制酶AflII以及XbaI对上述pSL12进行双酶切。将该片段和通过PCR而得的上述EGFP基因的ORF片段利用In-fusion法进行环化后，导入大肠杆菌DH5α进行转化。通过得到的转化体制备载体，获得目标表达载体pSL12-EGFP(图22)。通过制作限制酶图谱和确认部分碱基序列确认是目标载体。

相同地，制作在上述pSL6中整合了EGFP基因的ORF片段的载体pSL6-EGFP(图17)，作为对照。

<转化体的制作>

使作为宿主的粟酒裂殖酵母的亮氨酸缺陷株(基因型：h-，leu1-32，东京大学大学院理学系研究科附属基因实验设施·饭野雄一教授提供)(ATCC38399)在YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/mL SP补充物)培养基中生长至0.6×10⁷个细胞/mL。收集、清洗后按照1.0×10⁸个细胞/mL的条件悬浮在0.1m乙酸锂(pH5.0)中。之后，在悬浊液100μL中加入将上述得到的表达载体pSL12-EGFP用限制酶NotI进行酶切的产物1μg，进一步加入50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液290μL并充分搅拌后，依次以30℃下60分钟、42℃下5分钟、室温下10分钟的顺序进行培养。通过离心去除PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水中，涂布于基础琼脂培养基。

将3天后得到的转化体记作277G株。

相同地，导入pSL6-EGFP，得到转化体SL6E株。

<EGFP表达>

将得到的277G株接种在试管内的5mL的YES培养基中，在32℃下培养72小时。对从培养开始到培养结束后为止，培养液的在488nm下激发的情况下的荧光强度以及600nm的吸光度进行经时测定。

作为对照，将SL6E株也在相同的条件下进行培养，对培养液的荧光强度以及600nm的吸光度进行经时测定。

图23示出了各株的培养液的“荧光强度/OD600”(荧光强度除以600nm的吸光度的值)的经时变化。其结果是，277G株(图中为“ihc1p”)的“荧光强度/OD600”在从培养开始经过24小时的时刻比使用hCMV启动子的SL6E株(图中为“hCMVp”)低，但在从培养开始经过48小时后比SL6E株高，每单位酵母的EGFP的表达量高。

这里引用2012年8月20日提出申请的日本专利申请2012-181865号的说明书、权利要求书、附图和摘要的全部内容作为本发明的说明书的揭示。

Claims

1.一种粟酒裂殖酵母突变体的转化体，是Gsf活性增大且丙酮酸转移酶Pvg1的酶活性下降或失活的粟酒裂殖酵母、即Schizosaccharomyces pombe突变体的转化体，其特征在于，在染色体中或者作为染色体外基因，具有来源于丝状真菌的编码β-葡糖苷酶的结构基因序列以及用于表达该结构基因的启动子序列及终止子序列。

2.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，其特征在于，所述β-葡糖苷酶为BGL1。

3.如权利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，其特征在于，所述丝状真菌为曲霉属、即Aspergillus属的微生物。

4.如权利要求1～3中任一项所述的粟酒裂殖酵母突变体的转化体，其特征在于，所述β-葡糖苷酶是由序列编号1所示的氨基酸序列构成，或者由在该氨基酸序列中有1个以上的氨基酸发生了缺失、取代或添加的氨基酸序列构成，且具有催化β-D-吡喃葡萄糖苷键的水解反应的活性的β-葡糖苷酶。

5.一种β-葡糖苷酶的制造方法，其特征在于，培养权利要求1～4中任一项所述的转化体，从得到的菌体或培养液上清中取得β-葡糖苷酶。

6.一种克隆载体，其特征在于，具备：裂殖酵母属、即Schizosaccharomyces属酵母的hsp9基因所具有的启动子或者ihc1基因所具有的启动子，位于该启动子的下游且受到该启动子控制的用于导入外源结构基因的克隆位点，以及可在裂殖酵母属酵母内起作用的终止子。

7.如权利要求6所述的克隆载体，其特征在于，所述hsp9基因所具有的启动子为包括hsp9基因的ORF、即开放阅读框的5’末端的上游1～400bp的区域。

8.如权利要求7所述的克隆载体，其特征在于，所述启动子由以序列编号6表示的碱基序列，或在该碱基序列中有1个以上的碱基发生了取代、缺失或添加的碱基序列构成，且具有启动子活性。

9.如权利要求6所述的克隆载体，其特征在于，所述ihc1基因所具有的启动子为包括ihc1基因的ORF、即开放阅读框的5’末端的上游1～501bp的区域。

10.如权利要求9所述的克隆载体，其特征在于，所述启动子由以序列编号9表示的碱基序列，或在该碱基序列中有1个以上的碱基发生了取代、缺失或添加的碱基序列构成，且具有启动子活性。

11.一种表达载体的制造方法，其特征在于，在权利要求6～10中任一项所述的克隆载体中的克隆位点上导入外源结构基因。

12.一种表达载体，其特征在于，在权利要求6～10中任一项所述的克隆载体中的克隆位点上导入有外源结构基因。

13.一种裂殖酵母属酵母的转化体的制造方法，其特征在于，将权利要求12所述的表达载体导入裂殖酵母属酵母。

14.一种裂殖酵母属酵母的转化体，其特征在于，含有权利要求12所述的表达载体。

15.一种蛋白质的制造方法，其特征在于，培养权利要求14所述的转化体，从得到的菌体或培养液上清中取得所述外源结构基因所编码的蛋白质。